CN1197482A - 向真核细胞运送的外源dna的改良整合方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种实现将完整形式的外源DNA片段稳定地整合到真核细胞,特别是植物细胞的基因组中的改良方法。该方法包括提供外源DNA连同一种或多种蛋白质,其中蛋白质促进外源DNA整合到定向转化的真核细胞中并以能够在真核细胞中表达的嵌合基因或可翻译RNA的形式提供。该方法特别适用于植物细胞,以利用衍生于农杆菌的整合促进性蛋白实现邻接T－DNA边缘的完整形式的外源DNA片段的稳定整合。可从按照本发明的方法转化的细胞再生转基因培养物、组织和整个生物体,特别是转基因植物。

Description

向真核细胞运送的外源DNA的改良整合方法
本发明总地涉及用外源DNA转化真核细胞，特别是植物细胞，以及由这样的细胞产生的转基因生物体、组织或培养物。
为了应用重组DNA技术生产转基因植物以获取广泛利益，已发展了几种将外源DNA分子导入植物细胞的方法。这些方法包括例如由农杆菌介导的向植物细胞内转移T-DNA的改良的生物学系统，以及电穿孔、微注射、磷酸钙或聚乙二醇(PEG)介导的DNA摄入或细胞融合及微粒轰击等物理学、非生物学系统(有关一般性的和多少有些过时的评述可参见由Blackwell Scientific Publication出版社出版(1988)，由Draper，J.等人编著的《植物遗传转化和基因表达实验室手册》(Plant Genetic Transformation and Gene Expression，A Laboratory Manual)一书的第2和3章；也可参见Potrykus等人，“基因的直接转移：现状和展望”，植物分子生物学报告(Plant Mol.Biol. Rep)3：117-128(1985))。
使用这些已建立的方法，得以用外源DNA稳定地转化各种植物。具体地说，物理学技术的建立已克服了因使用生物学系统所带来的明显的宿主范围限制。然而，这些物理学方法的共同缺陷在于，它们不能为将被输送的DNA有序整合到植物细胞基因组中提供任何有效手段。因此这些方法必须依赖于尚不完全清楚的机制，不受控制地整合所传送的DNA，通常使外源DNA作为随机片段的多个拷贝被整合到植物细胞基因组的单个位点上。如能改善向植物细胞内物理导入外源DNA所引起的稳定转化过程的可预测性，将会显著改善这些方法的实用性和总体效率，从而能生产出可稳定地表达转基因的遗传上稳定的被转化植物。已为此目的而采用的一种手段是将生物学系统中促进转化和/或整合的蛋白质与非生物学运送技术结合使用。为了达到预期的效果，已考虑有必要在转化靶细胞之前将这些蛋白质本身与外源DNA分子联系起来，从而尽可能地模拟衍生这些蛋白质的生物学系统(WO 95/05471和WO 95/34647)。
已知有许多促进外源基因稳定地整合性转化真核细胞的蛋白质是在真核细胞外产生的并且是与外源基因联合传送的。本发明是基于这样的发现，即为了促进稳定地整合性转化，这些蛋白不一定象天然状态一样在真核细胞外产生并与外源DNA结合。相反，向真核转化靶细胞输送编码这种蛋白质的可翻译的RNA或嵌合基因，也可有效地促进共运送的外源DNA稳定地整合性转化。
本发明的主要目的之一是提供一种用外源DNA转化真核细胞以稳定地整合目的DNA的改良方法。该改良方法总地包括向作各转化靶的真核细胞提供至少一种能产生一种或多种促进整合的蛋白质的嵌合基因或RNA，同时一并提供欲被整合的外源DNA。
根据本发明的方法，用(a)由两边接有T-DNA边缘序列的目的DNA组成的DNA片段，和(b)至少一种能在所说的真核细胞中表达一种或多种可促进接有T-DNA边缘序列之DNA整合的蛋白质的嵌合DNA或RNA分子来转化真核细胞。
根据本发明，定向整合的目的外源DNA片段可以是本领域技术人员希望以完整形式整合到真核细胞基因组中的任何DNA片段，例如设计使之在植物细胞或所得植物或植物细胞培养物中表达特殊生物学活性RNA(如反义RNA或核酶)或有用蛋白质的嵌合基因。
能够促进所说外源DNA整合的蛋白质，特别是由农杆菌Ti或Ri质粒的侵入性(virulence)区域编码的蛋白质，可用于指导与T-DNA边缘序列邻接的目的DNA整合到真核细胞基因组中。
具体地说，本发明提供了用外源基因稳定地转化植物细胞的改善方法，其联合利用了根癌农杆菌介导的T-DNA转移和整合，与非生物学传送方法这两方面的积极贡献。该改良方法包括为植物细胞提供期望整合到植细胞基因组中的邻接T-DNA边缘的外源DNA片段，连同至少一个能够在植物细胞中表达用于促进外源基因整合之农杆菌衍生的蛋白质的嵌合基因或RNA。依据本发明所提供的农杆菌衍生的蛋白质特别相应于VirD1、VirD2、VirC1、VirC2或VirE2。优选使用VirD2和VirD1、VirC1、VirC2、VirE2之一或其亚组合的组合。最优选单独使用VirD2、合用VirD1与VirD2、或合用VirD1、VirD2和VirE2。农杆菌衍生的蛋白质在植物细胞中的表达可使外源DNA作为有可预知终点的完整片段进行整合。
依据本发明，邻接T-DNA边缘序列的外源DNA片段可借助电穿孔、微注射、诱导摄入及微粒轰击等非生物学手段运送到植物细胞内。
依据本发明，农杆菌衍生的蛋白质也可借助非生物学手段以DNA(可在植物细胞中表达的嵌合基因)或RNA(可在植物细胞中表达的RNA)的形式被传送到植物细胞内。
瞬时传送外源DNA片段和DNA或RNA形式的农杆菌衍生的蛋白质，这样即在已传送外源DNA之后和外源DNA被整合之前使农杆菌衍生的蛋白质存在于植物细胞中。优选以单一步骤经同时传送这些成分达到这一目的。或者，也可以从在预先已用能够表达农杆菌衍生之蛋白的嵌合基因稳定转化的植物或细胞培养物中得到用于定向转化的植物细胞。
在本发明的另一个方面，可再生用分立的DNA片段稳定转化的植物细胞，以产生可稳定地表达所需转基因的可育转基因植物，并作为孟德尔性状将稳定表达转基因的遗传特征传给后代。
给出下列定义旨在帮助理解本发明：
整合：文中所使用的术语“整合”一般是指使传送到真核细胞内的外源DNA分子稳定地整合到真核细胞的基因组DNA中的过程。
微粒轰击：文中所使用的术语“微粒轰击”是指经在微粒上包被核酸并将被包被的微粒推进到活细胞内，以将包括DNA和RNA在内的核酸传送到活细胞中的一般方法(如参见美国专利No.5,036,006的实施例1-4；WO 91/02071(描述该方法在转化植物和其细胞方面的应用)；另外参见美国专利No.5,302,523；Koziel等，生物技术(Biotechnology)11：194-200(1993)(描述以颗粒轰击法转化Elite近交系玉米)；Vasil等，生物技术11：1553-1558(1993)；Weeks等，植物生理学(Plant Physiol)102：1077-1084(1993)；Tanaka，T.等“由微粒轰击引入的体外合成的mRNA在各种植物花粉中的成功表达”植物分子生物学(Plant Mol. Biol.)28：337-341(1995)；Vasil等，生物技术10：667-674(1992)；R.等，Walker. L.等，“GUS信使RNA通过微粒轰击在植物细胞中的输送和表达”，InVitro Cell Dev. Biol. 26：70A-#218(1990)；lida，A.等，应用微生物学和生物技术(Appl. Microbiol. Biotechnol)33：560-563(1990)；Grordon-Kamm等，植物细胞(Plant Cell)2：603-618(1990)；Fromm等，生物技术8：833-839(1990)；Morikawa，H.等，应用微生物学和生物技术31：320-322(1989))。
气溶胶束注射：文中所使用的术语“气溶胶束注射”是指以气溶胶束的形式向活细胞内物理传送核酸的方法(参见美国专利No.5,240,842)。
电穿孔：文中所使用的术语“电穿孔”是指在生物分子存在下，使细胞经受电脉冲或放电，以向活细胞内运送生物分子，特别是核酸(如DNA和RNA)的方法(例如参见美国专利No.5,231,019；“植物遗传转化和基因表达实验室手册”一书的第3.3章，Draper，J.等人编著；Blackwell Scientific Publications出版(1988)；Saul，M. W.等，“在有无或有电穿孔下向原生质体直接转移DNA”，植物分子生物学手册(Plant Molecular Biology Manual)Al：1-16(1988)；J.等，Oka-da，K.等，“经电穿孔向植物原生质体中引入功能RNA”，植物细胞生理学(Plant Cell Physiol.)27(4)：619-626(1986)；Shillito，R.D.等，“对植物的高效直接基因转移”，生物技术3：1099-1103(1985)；EP-292 435(Ciba-Geigy所有)，EP-392225和WO 93/07278(均为Ciba-Geigy公司所有)。
微注射：文中使用的术语“微注射”是指将生物学物质特别是DNA和RNA直接机械注射到活细胞中的方法(例如参见上述“植物遗传转化和基因表达实验室手册”一书的第3.4章；Graessmann，M.等，“组织培养细胞的微注射”，酶学方法(Methods in Enzymology)101：482-492(1983))。
诱导摄入：文中使用的术语“诱导摄入”一般是指诱导的由活细胞摄入生物学物质特别是核酸的方法(例如参见美国专利No.5,036,006的背景部分)。这类方法具体包括聚乙二醇(PEG)介导的摄入(例如参见上述“植物遗传转化和基因表达实验室手册”一书的第3.2章；Negrutiu等，植物分子生物学8：363-373(1987))和热休克处理(见美国专利No.5,231,019)。
VirD：文中使用的术语“VirD”是指由Ti-或Ri质粒的侵入性(Vir)D操纵子衍生的基因或蛋白质，用于提供T-DNA转移所需的功能(有关评述参见Zambryski P. C.，“农杆菌植物细胞转移的编年史”(Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.)43：465-490(1992))。来自该区域中的特定基因和相应蛋白质按照它们在VirD操纵子上出现的位置以数字表示。例如，侵入性D操纵子中的第一个基因定名为“VirD1”，第二个定名为“VirD2”，等等。
正常情况下，在农杆菌介导的T-DNA转移期间，侵入性区域DNA并不被转移到植物细胞，也不整合到植物基因组内。而代之以Vir基因产物在转运中起作用，将T-DNA元件从细菌Ti或Ri质粒中调动到植物基因组中。可在没有丧失功能的情况下，分离不同质粒上的T区域和Vir区域(De Framond，A. J.等，生物技术(Bio/Technology)1：262-269(1983)；Hoekerna等，自然(Nature)303：179-180(1983)；Bevan，M.核酸研究(Nucleic Acids Res.)12：8711-8721(1984))。
由VirD座的5′侧编码的两个多肽，即VirD1和VirD2在启动T-DNA从农杆菌向植物细胞内转移所需的DNA加工中起到关键性作用。VirD1和VirD2蛋白质是分别由VirD操纵子的第一个基因和第二个基因编码的(Stachel S. E.和Nester E. W.“根癌农杆菌A6 Ti质粒的Vir区的遗传及转录结构”EMBO J. 5：1445-1454(1986))。遗传学研究证明，T链形成是由VirD操纵子的产物介导的(Yanofsky等，细胞(Cell)47：471-477(1986)；Stachel等，EMBOJ. 6：857-863(1987))。特别是已显示VirD操纵子的第一和第二个基因编码T-DNA边缘切割所需的多肽(De Vos & Zambryski，Mol. Plant Microbe Inter. 2：43-52(1989)；Filichkin & Gelvin，分子微生物学(Mol. Microbiol.)8：915-926(1993)；Jayaswal等，细菌学杂志(J.Bacteriol.)169：5035-5045(1987)；Porter等，核酸研究15：7503-7515(1987)；Stachel等，EMBO J. 6：857-863(1987))。这一活性导致T-DNA边缘序列内单链裂解(切口)的产生(Stachel S. E.等，“在T-DNA从根癌农杆菌向植物细胞转移的启始阶段中单链DNA分子的产生”，自然(London)322：706-712(198)；Yanofsky等，细胞47：471-477(1986)；Wang等，科学(Sci-ence)235：587-591(1987)；Albright等，细菌学杂志169：1046-1055(1987))。VirD1/VirD2在序列的第三和第四个碱基之间切割T-DNA边缘序列。一旦产生出这些有切口的分子，即观察到有T-DNA下面链(T链)的游离线性ssDNA拷贝的生成(Stachel等，自然(London)322：706-712(1986)；Stachel等，EMBO J. 6：857-863(1987))。VirD2仍保持与T-DNA 5′末端的共价连接(参见Zupan J.R. & Zambryski，P.“T-DNA从农杆菌向植物细胞中的转移”植物生理学107：1041-1047(1995))。
对已丢失VirD2之C末端50％的VirD2突变体的研究证明，只有VirD2的N末端50％才是切割T-DNA边缘所必需的。但该突变体不能在被感染的植物上引发肿瘤。因此C末端似乎在T-DNA于植物细胞中的转移上具有作用(参见Zambryski P. C.，“农杆菌植物细胞DNA转移的编年史”Ann. Rev. Plant Physiol. PlantMol. Biol. 43：465-490(1992))。该区域含有二分核定位信号(NLS)(Howard等，细胞68：109-118(1992))。观察到当从VirD2中缺失二分NLS的2碱基结构时，农杆菌的致癌性显著低降，从而进一步证明NLS序列的生物学关联(Shurvinton，美国国家科学院院报(Proc. Natl. Acad. Sci.(VSA))89，11837-11841(1992))。
在体外实验中，单一VirD2可影响单链DNA上的位点特异性DNA切割—连接反应，表明该蛋白具有DNA切割所需要的催化活性(Pansegrau等，美国国家科学院院报90：11538-11542(1993))。已报导结合pTiC58的VirD1和VirD的共同作用，足以在体外催化T-边缘特异性裂解(Scheiffle等，生物化学杂志(J. Biol. Chem-istry)270：1269-1276(1995)；Jasper等，美国国家科学院院报91：694-698(1994))。
已描述了含VirD1提取物的I型拓扑异物酶活性(Ghai & Das，美国国家科学院院报86：319-3113(1989))。这一活性归功于VirD1，并提出其为使DNA被VirD2裂解而松弛所必需的。然而，更进一步高度纯化的VirD1蛋白质并没有显示出拓扑异构酶活性(Scheiffle等，生物化学杂志270：1269-1276(1995))。
对VirD2的序列分析显示，在携带章鱼氨酸、胭脂氨酸、或毛根(rhizogenes)型质粒的农杆菌菌株中，N末端有85％是保守的(Hi-rayama等，分子普通遗传学(Mol. Gen. Genet.)213：229-237(1988)；Wang等，细菌学杂志172：4432-4440(1990)；Yanofsky等，细胞47：471-477(1986))。C末端只有25％是保守的，但在后30个氨基酸中与NLS信号有最高相似性(参见Zambryski的综述文章(1992))。
VirE：文中使用的术语“VirE”是指从为T-DNA转移提供所需功能的Ti-和Ri质粒的侵入性(Vir)E操纵子衍生的基因或相应蛋白质。本文使用的术语“VirE2”是指已被认定为VirE操纵子的VirE2基因产物的单链DNA(ssDNA)结合蛋白质(Gielt，C.等，美国国家科学院院报84：9006-9010(1987)；Citoysky等，科学240：501-504(1988))。据信VirE2沿其全长度包被T链。该蛋白质与单链DNA的相互作用是非特异性的。胭脂氨酸VirE2蛋白质(Hi-rooka等，细菌学杂志169：1529-1536(1987))和章鱼氨酸VirE2蛋白质(Winans等，核酸研究15：825-837(1987))含有核定位信号。据信VirE2蛋白质是T复合物的主要部分并且其可帮助核运输(参见Zupan & Zambryski，植物生理学107：1041-1047(1995))。表达VirE2基因的转基因植物能够补充农杆菌的VirE突变体，从而为VirE2蛋白质在植物细胞中起重要作用提供了证据(参见Zupan & Zambryski，植物生理学107：1041-1047(1995))。
VirC：本文所用的术语“VirC”是指Ti-和Ri质粒中编码两种多肽，即VirC1和VirC2的VirC座(Yanofsky M. F. & Nester E.W.“根癌农杆菌中宿主范围决定性基因座的分子鉴定”，细菌学杂志168：237-243(1986))。已显示该座位可增强农杆菌中T-DNA边缘切割能力(Toro N.等，“超驱动序列在农杆菌中T-DNA边缘切割中的作用”，美国国家科学院院报85(22)：8558-8562(1988))。也已显示当VirD1和VirD2基因的产物为限制性时，VirC1可提高异源大肠杆菌系统中T链产生量(De Vos G. & Zam-bryski P.“农杆菌胭脂氨酸特异性VirD1、VirD2和VirC1的表达和在大肠杆菌中产生T-链对它们的需求”，Molec. Plant Microbe In-ter. 2：42-52(1989))。虽然已用DNA亲和层析法证明VirC1与章鱼氨酸超驱动序列相互作用，但有关VirC1的准确功能尚不明了。其可与VirD1和VirD2，或与边缘重复序列和/或与超驱动序列相联系，以促进切割和T链产生(Toro N.等，“根癌农杆菌VirC1基因产物与超驱动序列结合，一种T-DNA转移增强子”，细菌学杂志171：6845-6849(1989))。
T-DNA边缘：本文使用的术语“T-DNA边缘”是指约25bp的不完全同向重复DNA序列，借助它们在DNA片段之两末端的存在，使该片段被识别为T-DNA并使农杆菌蛋白质作用其上。为方便起见，出现于T-DNA之各末端的T-DNA边缘分别定名为“左”和“右”。右边缘的共有序列是5′-GNNT-GNCAGGATATATNNNNNNGTNAN-3′(SEQ ID NO：1)，左边缘的共有序列是5′-GGTGGCAGGATATATNNNNNNTGTAAA-3′(SEQ ID NO：2)(Jouanin等，植物分子生物学12：75-85(1989))。这些边缘之间的任何DNA均从农杆菌中被转移到植物细胞内(参见Zambryski P. C.，“农杆菌-植物细胞DNA转移的编年史”，Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43：465-490(1992))。
对不同的被转化植物细胞系中T-DNA包含物的研究揭示，T-DNA向植物基因组内的整合常常发生在(对于右边缘而言)或接近于(对于左边缘而言)这些边缘重复区(Slightom等，EMBO J. 4：3069-3077(1985)；Gheysen等，Genes & Dev. 5：287-297(1991)；Mayerhofer等，EMBO J. 10：697-704(1991)；Ohta等，植物杂志(Plant J.)7：157-164(1995)；Koncz等，美国国家科学院院报86：8467-8471(1989))。
尽管左和右边缘之间存在结构相似性，但对边缘功能的研究却显示T-DNA边缘的应用是有差异的。右边缘序列的缺失和倒位导致T-DNA转移几乎完全丧失，而缺失左边缘重复区则几乎没有影响(Shaw C.H.等，“胭脂氨酸Ti质粒的右侧拷贝25bp重复序列是肿癌形成所必需的；核酸研究12：6031-6041(1984)；Jen G.C.& Chilfon M-D，“pTiT37 T-DNA的右侧区在促进T-DNA转化中固有活性大于左侧区，美国国家科学院院报83：3895-3899(1986))。遗传学研究显示，T-DNA转移是有极性的，并且极性是由边缘重复区的方向决定的(Wang等，细胞38：455-462(1984)；Peralta和Ream，美国国家科学院院报82：5112-5116(1985))。这可能是由于T-链是按右至左的方向产生的(Albright等，“根癌农杆菌T-DNA的加工产生边缘切口和线性单链T-DNA”，细菌学杂志，16：1046-1055(1987))。
T-DNA边缘的序列环境在很大程度上影响其活性。围绕右边缘的序列增强极性DNA转移，而左边缘周围的序列则消弱极性DNA转移(Wang K.等，“T-DNA边缘重复单元的序列环境决定其在T-DNA向植物细胞转移中的相对活性”，分子普通遗传学210：338-346(1987))。称为“超驱动”的24bp顺式活性序邻近于章鱼氨酸质粒的右边缘(Peralta等，EMBO J. 5：1137-1142(1986)；Shurviton & Ream，细菌学杂志173：5558-5563(1991))。甚至当定位于远离边缘几千个碱基对时，超驱动仍刺激T-DNA转移(VanHaaren M. J. J.等，“超驱动是T-区转移增强子，其刺激根癌农杆菌中T-链的产生”，核酸研究15：8883-8997(1987))。但其自身不能介导T-DNA转移(Peralta，E. G.等，“超驱动，根癌农杆菌诱癌质粒中的一种T-DNA转移增强子”，EMBO J. 5：1137-1142(1986)；Van Haaren M. J. J.等，“根癌农杆菌章鱼氨酸Ti-质粒左和右侧T区边缘片段的功能分析”，植物分子生物学8：95-104(1987))。超驱动序列原来定位在章鱼氨酸Ti质粒TL-DNA右边缘重复的右侧区域中。靠近章鱼氨酸pTi TR区域及农杆氨酸pRiTL和TR区域的右边缘重复序列存在有相似序列(Slightom等，“TL-DNA毛根农杆菌类质粒的核苷酸分析，开放读框的鉴定”，生物化学杂志，261：108-121(1986)；Jouanin等，毛根农杆菌株A4转化的Convolvulus arvensis克隆的基因组中TR-DNA/植物接头的分析”，植物分子生物学，12：75-85(1989))。比较右边缘附近的序列揭示出一个称为核心序列的8bp区域(5′-TGTTTGTT-3′)，该核心序列以离开各个右边缘重复区之右侧的不同距离出现。甘露氨酸型pRi8196 T-DNA右边缘不含任何与超驱动序列相关的序列，但含有一个重复6次的不同8bp序列(5′-ATTAGTTC-3′)(Hansen G.等，“毛根农杆菌pRi8196 T-DNA：具有甘露氨酸合成和毛根分化相关功能的DNA序列和定位”，美国国家科学院院报88：7763-7767(1991))。该序列在功能上确实等同于超驱动序列(Hansen G等，“与毛根农杆菌pRi8196的右边缘相邻的T-DNA转移增强序列”，植物分子生物学20：113-122(1992))。靠近胭脂氨酸T-DNA边缘没有密切相似于超驱动序列的序列(Wang K.等，“T-DNA边缘重复单元的序列环境决定其在T-DNA向植物细胞转移中的相对活性”，分子普通遗传学：338-346(1987))，但这不排除有些存在于该区域中的序列也起到相类似的作用。
实施例中使用的25bp右边缘序列衍生于pTiAch5(VanHaaren，M. J. J.，植物分子生物学13：523-531(1989))。存在于质粒pNeoRBluc上的左边缘衍生于pTiT37(Bevan，核酸研究12：8711-8721(1984))。
虽然已显示相邻于右边缘的序列能增进DNA向植物细胞转移，但为了尽可能小地破坏荧光素酶基因的表达，实施例中所描述的实验中还是选择最小长度的右边缘序列。然而，可以使用含有增强子样序列如超驱动的较长的右边缘序列。
可使用如实施例举例描述的常规基因工程技术来构建能够在真核细胞产生用于促进目标DNA整合的蛋白质的嵌合基因。这样的嵌合基因将由可操作地连接到适当调节信号(例如启动子、前导序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点)上的蛋白质编码DNA序列组成，所说的调节信号指导可操作地连接的编码序列在真核细胞中的表达。现有技术中充分描述了这样的编码序列和调节信号。为了改善整合促进性蛋白质的表达，可以使用在靶真核细胞中最佳化表达之编码序列的合成变体。
如实施例所述，可以使用制备编码所需蛋白质的可翻译加帽poly-A mRNA的标准系统，制备能够在真核细胞中产生整合促进性蛋白质的mRNA。
本领域技术人员很容易理解到，可以使用本领域现有的标准技术，以各种方式向植物细胞提供编码用于促进外源基因稳定整合之蛋白质的外源DNA或嵌合基因或RNA。对于将这些成分传送到真核细胞内的确切方式没有严格限制，只要在下述相关时间内，在带有外源DNA片段的同一细胞中产生能促进外源DNA稳定整合的蛋白质即可。
为了达到促进完整形式的外源DNA片段稳定整合的有利效果，不一定要在将外源DNA片段提供给真核细胞之前，或在外源DNA已整合到真核细胞中之后，于真核细胞中产生可提供这种效果的蛋白质。相反，只要使这些蛋白质在植物细胞中产生，从而使之在外源DNA片段被提供给真核细胞之后和外源DNA已被整合之前，在瞬时间内以足够量存在。可使用向真核细胞提供嵌合基因或可翻译RNA的任何方法，以使所编码的蛋白质在此相关时间内产生。
作为本文提供的说明性实施例，实现在相关时间内以足够量产生这些蛋白质的一种方法是，向真核细胞中连同外源DNA片段一起导入编码该蛋白质的嵌合基因或可翻译RNA(即同时运送各成分)。优选这一方法是因为它只涉及向待转化真核细胞的一次性运送核酸分子(DNA或DNA和RNA)。这种方法的另一个潜在的有利方面是，可将其用于实现在相关时间内瞬时产生促进整合性蛋白质，而不是可对真核细胞的正常生长和发育带来不利的稳定地产生这些蛋白质。
一个方面，本发明被用于以邻接了T-DNA边缘的完整外源DNA片段稳定地转化植物细胞，达到模拟农杆菌介导的T-DNA转化的目的。依据本发明的这一方面，向待转化的植物细胞提供以下成分：
(a)期望整合到植物细胞中去的感兴趣的外源DNA片段，所说的片段邻接有一个或多个T-DNA边缘(单一T-DNA边缘即足以影响T-DNA转移，具体地说一个环形T-DNA中的一个边缘即可具有右和左边缘功能)；以及
(b)至少一个嵌合基因或RNA，每个这样的嵌合基因或RNA都能在植物细胞中产生农杆菌衍生的蛋白质，每种蛋白质单独或与其他这种蛋白质联合可促进完整形式的外源DNA片段的稳定整合。
按照本发明的这个方面，在植物细胞中产生的农杆菌衍生的蛋白质包括但不仅限于由农杆菌的Ti或Ri质粒的侵入性区域衍生的蛋白质。其中特别是包括VirC1、CirC2、VirD1、VirD2和VirE2。所产生的蛋白质最好是VirD2蛋白质或VirD2与VirD1或VirE2的组合体，或者与VirD1和VirE2两者的组合。农杆菌衍生的蛋白质在植物细胞中的表达可使外源DNA作为有可预测的终点的完整的片段发生整合。所得到的被转化的植物细胞具有被整合到其基因组中的相似于农杆菌T-DNA的外源DNA片段。
可使用如实施例中举例描述的标准基因工程技术构建能够在植物细胞中产生本发明的农杆菌衍生蛋白质的嵌合基因。这样一个嵌合基因将包括可操作地连接到适当调节信号(如启动子、前导序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点)上的编码农杆菌衍生蛋白质的DNA序列，所说的调节信号指导可操作地连接的编码序列在植物细胞中的表达。这样的编码序列和调节信号是本领域很容易得到的。GenBank中以登记号No. M14762提供实施例中使用的VirD1和VirD2编码序列。
如实施例中举例描述的，可使用制备编码所需蛋白质之可翻译加帽polyA mRNA转录本的标准系统制备能在植物细胞中产生本发明的农杆菌衍生蛋白质的RNA。
按照本发明的这个方面，待整合的外源DNA片段可以是本领域技术人员想要以完整形式整合到植物细胞基因组中的任何DNA片段，例如设计以能在植物细胞中或所得植物或植物细胞培养物中表达特定生物学活性RNA(反义RNA或核酶)或有用蛋白质的嵌合基因。要求只是该片段是与一个或多个T-DNA边缘邻接的，这样其可被识别并经受VirD1和VirD2蛋白质的作用。实施例1中描述这些T-DNA边缘与外源性DNA片段的结合。
任何对通过一种或多种本领域现有的不同机制传送核酸敏感的真核细胞均可被用作本发明转化方法的靶细胞。其中包括真菌、酵母、动物细胞，特别是植物细胞。已描述了有关酵母的T-DNA转移(参见Piers等，美国国家科学院院报93：1613-1618(1996))。就动物细胞来说，已显示了VirD2和VirE2(修饰其定位信号之后)进入细胞核中的定位(参见Guralnick等，植物细胞(Plant Cell)8：363-373(1996))。向各种动物细胞运送核酸的方法是本领域已知的(如参见“分子生物学现代方法”(Current Protocols in MolecularBiology)，Vol. 1-3；Ausubel，F. M等人编著；John Wily & Sons，Inc出版(1995)；具体参见第9章“向哺乳动物细胞中引入DNA”)。
所述的转化方法产生完整的一组或一群通常根据标志基因的表达所鉴定出的被转化的细胞。然后细胞再生成植物，从而提供整个被转化植物的组群。可根据其整合过程的性质鉴定完整一组被转化的植物细胞及再生之被转化植物的特征。根据本发明的一群细胞或植物的特征在于，有5％以上的个别植物细胞或植物如同使用农杆菌感染使它们被转化一样，含有借助农杆菌右边缘T-DNA序列连接到基因组DNA上的目的DNA。这一百分数较好是大于10％。实际观察到的百分数一般为5-70％，最好为10-50％。正常情况下，一个组群的被转化植物细胞或植物是基于10个或更多个独立的转化事件。单一物理转化实验优选产生20、30、40或50个以上的独立转化事件。这一组群被转化的植物细胞和植物，以及个别植物细胞或植物的子代构成了本发明的另一个主题。
潜在的植物靶包括单子叶和双子叶植物或各自的植物细胞，特别是农业上重要的农作物如玉米或其他谷类作物如小麦、燕麦、黑麦、高梁、稻米、大麦、谷子、草炭和饲料草等，以及棉花、糖甘蔗、油菜、香蕉、杨树、胡桃、烟草和大豆。
任何类型或来源的，作为可按本领域已知的任何一种或多种不同的生物学和非生物传送机制进行转化的靶的植物细胞，也都可以作为按照本发明进行转化的靶。其中包括但不只限于未成熟和成熟的胚胎、花粉、原生质体、悬浮培养细胞、愈伤组织细胞、子叶或其他种子及籽苗部分，以及叶子或叶片。
按本发明的方法得到的被转化的植物细胞将含有被整合的完整的目标外源DNA。该被整合的外源DNA可包括在经过一个T-DNA插入事件后通常保留在被整合之DNA上的部分T-DNA边缘序列。可按照本领域已知的标准方法，使用以本发明的方法制得的被转化植物细胞产生转基因植物细胞培养物和能育的转基因植物。
因此本发明的再一个方面是产生能育的转基因植物的方法，其中所说的转基因植物具有以完整形成稳定地整合到其基因组中的T-DNA边缘序列邻接的外源性DNA片段，该方法包括：
a)按照本发明的方法，将所说的外源基因转化或整合到植物细胞的基因组中；并且
b)再生步骤(a)的植物细胞以产生所说的能育的转基因植物。
所说的能育转基因植物较好选自烟草、棉花、油菜、大豆、玉米、小麦和稻米。
工程化导入到所说转基因植物和由之产生的种子中的遗传性质，可通过有性再生或营养性生长传递下去，并因而可在子代植物中保留和繁殖。一般所说的保留和繁殖是指利用为适合特殊目的而发展的已知农业方法，例如耕作，播种或收获。也可应用专门化的方法，如液体培养或温室技术。因为生长的作物容易受到因昆虫或感染以及杂草植物的竞争，所以应采取控制杂草、植物病害、昆虫、线虫及其他有害条件的措施，以改善产量。
这些措施包括土壤耕作或去除杂草和受感染的植物，以及施用除草剂、杀真菌剂、杀配子剂、杀线虫剂、生长调节剂、促成熟剂和杀昆虫剂等农药。
利用根据本发明的转基因植物和种子的优越遗传性质，可进一步在植物繁殖中发展有改善性质的植物，这些性质包括对病虫害、除草剂或压力的耐受性、改善营养价值、增加产量、或改善因倒伏或落花引起的结构丢失等性质。各种繁殖步骤的特征在于人们熟知的选择待杂交系、对亲本系直接授粉，或选择适当的子代植物等人为干预过程。依据所要求的性质的不同，采取不同的繁殖手段。有关技术是本域技术人员已知的，其中包括但不只限于杂交、近亲繁殖、回交育种、多系繁殖、变种融合、种间杂交、非整倍性技术等。杂交技术还包括植物不育化，以借助机械、化学或生物化学手段产生雄性或雌性不育植物。雄性不育植物用不同品系的花粉进行异花授粉可保证使雄性不育但雌性能育植物的基因组均匀地获得亲本品系的遗传性质。因此，可使用根据本发明的转基因种子和植物来培育改良的植物品系，例如该品系增加了除草剂或杀虫剂处理等常规方法的效力，或者由于它们的改善的性质而得以省去所说的方法。或者，因具有最佳化的遗传“装备”而获得具有改善之压力耐受性的新作物，产生出与那些不能耐受差不多的不良发育条件的产品有良好品质的收获产品。
在种子生产中，种子的萌芽质量和均一性是基本产品特征，而收获的和农民出售的种子的发芽质量和均一性则不是重要的。因为很难保证一种作物种子中没有其他作物和杂草种子，所以，为了控制种生病害和产生有良好发芽率的种子，一些在培育、条件控制及出售纯种子方面有经验的种子生产者已发展了相当深入的和充分确定的种子生产实践。因此，农民的共同作法是购买符合特定品质标准的经认定的种子，而不是使用由他自家的作物收获的种子。作为种子使用的繁殖材料通常是用保护剂包被材料如除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀菌剂、杀线虫剂、杀配子剂或其混合物处理的。常用的保护剂包被物包括captan、carboxin、thiram(TMTDR)、methalaxyl(ApronR)，和pirimiphos-methyl(ActellicR)等化合物。必要时，可将这些化合物与本领域常用的其他载体、表面活性剂或施用促进佐剂配在一起，以提供对由于细菌、真菌或动物害虫所引起损害的保护作用。可以通过用液体配方浸渍繁殖材料，或通过合用湿或干燥配方包被来施用保护剂涂敷物。其他的应用方法还可包括在芽或果实上进行定向处理。
本发明的再一个方面是提供新的农艺方法，例如上面举例的，以使用本发明的转基因植物、转基因植物材料，或转基因种子为特征的方法。
本领域技术人员很容易理解到，可利用本领域内的标准技术，以各种方式为植物细胞提供该方法的各个成分(即外源DNA和用于编码那些促进外源DNA整合所需之蛋白质的嵌合基因或RNA)。对向植物细胞提供这些成分的确切方式没有严格限制，只要在如上文叙述的相关时间内产生能促进外源DNA稳定整合的蛋白质即可。
提供给植物细胞的各种成分的确切剂量也并不严格，并且可依据传送方式及被传送之成分的剂型而改变。必要时，技术人员可按常规改变所提供之各成分的量，以确定使用特定传送系统传送的各成分的最适剂量。实施例1中描述了一种成功地组合方式，并可以其作为进一步实现最佳化的起始点。
可借助向植物细胞运送核酸的各种已知方法完成向植物细胞运送本发明各成分的操作，这些已知方法包括但不只限于例如农杆菌介导的T-DNA转化等生物学机制(如参见WO 95/35388，其发明名称为“植物遗传转化方法和转基因植物”)，以及微粒轰击、电穿孔、微注射、诱导摄入、及气溶胶束注射等非生物学机制。在一优选的途径中，使用单一方法向受体植物细胞运送本方法的所有成分(即外源DNA和用于编码那些促进外源DNA整合之蛋白质的嵌合基因或RNA)。
按照本发明传送的、编码整合促进性蛋白质的mRNA，可望在其被降解之前的限定时间里在植物细胞中产生所编码的蛋白质。从该mRNA产生的蛋白质可望在其通过正常细胞加工过程被降解之前的确定时间里保留在植物细胞中。因此，可将这些蛋白质根据本发明的方法，以RNA的形式瞬时传送给植物细胞。在持续存在这些蛋白质可能带来不利影响的情况下，瞬时传送这些蛋白质可能是优选方式。为达到这一相同效果，可以以某种使之不能很容易地以功能形式整合到植物细胞内的形式，转送某编码整合促进性蛋白质的嵌合基因。
在通过嵌合基因向植物细胞提供整合促进性蛋白质的情况下，较好是将相应的嵌合基因连同作为分立的DNA分子的外源DNA片段一起共传送，但可以联合不同的成分并作为单一DNA分子传送之。作为分离的DNA分子传送，便可得以改变和优化嵌合基因与外源DNA片段的比例。这也可能更便于在分立的分子上操纵这些构建体。可望能够以与邻接有T-DNA边缘之外源DNA定向整合相关的可检测频率，通过随机整合将这些嵌合基因稳定地掺入到基因组中。为了便于将这种随机整合过程与外源DNA的定向整合分开，较好是将其作为与外源DNA分离的单一DNA分子，传送编码整合促进性蛋白质的嵌合基因。使用这种办法，有可能在与定向整合T-DNA边缘邻接之外源DNA的不同座位上整合嵌合基因的拷贝。这样，就很容易通过继后培育由被转化植物衍生的植物，将涉及外源DNA的定向整合与随机整合的VirD1和VirD2基因分离开。
在一优选实施方案中，使用植物病毒载体作为向植物细胞运送编码整合促进性蛋白质之嵌合DNA基因或RNA的载体。
可以从植物DNA病毒复制子，例如双粒病毒组复制子(Ugaki，M.，核酸研究19：371-377(1994))和RNA病毒载体(Sablowski，R. M.，美国国家科学院院报92：6901-6904(1995))来设计构建这样的载体以在植物细胞中掺入并表达所需DNA或RNA。因为这些载体一般都可在靶植物细胞中复制，所以可以扩增工程化构建到这些载体中的嵌合基因或RNA，并增加由之产生的蛋白质量。另外，这种类型的病毒载体预期不整合到植物细胞的基因组中，因为其来源病毒复制子不发生这样的整合。因此，这种方法具有瞬时大量产生整合促进性蛋白质，同时又减小编码这些蛋白质之嵌合基因整合危险这两方面的优点。系统性使用这种病毒载体预先感染待转化的植物细胞也可能是有利的。这种方法因不必共传送编码整合促进性蛋白质的DNA或RNA，从而允许传送欲以较高量整合的外源性DNA。
也可以使用植物病毒载体作为向植物细胞运送定向整合之外源DNA片段的载体。因为这些载体一般均可在靶植物细胞中复制，所以可以以这种方式用它们扩增供整合外源DNA片段模板的数目。
当使用植物病毒载体向植物细胞运送待整合的外源DNA片段和编码整合促进性蛋白质的嵌合基因时，可使用同样的病毒载体运送两种成分或可利用两种分立的病毒载体。当以农杆菌介导的转化作为用来向植物细胞传送病毒载体的技术时，该方法被称为“农杆菌感染法”(参见Grimsley等，自然325：177-179(1987))。
作为共传递编码整合促进性蛋白质的嵌合基因和外源DNA的一种替代方法，也可以向已经含有这些稳定地掺入到其基因组中之嵌合基因的转基因植物细胞内运送外源DNA。可以使用以标准技术用包括编码整合促进性蛋白质的嵌合基因在内的DNA分子转化产生的转基因植物或转基因植物细胞培养物作为这种转基因植物细胞的来源。在使用这种办法时，可经继后培育由被转化的植物细胞衍生的植物，将涉及外源DNA的定向整合事件与稳定整合的嵌合基因分离开(例如参见Peerbolte，R.等，“用DNA转化植物原生质体：非选定的小牛胸腺载体DNA的共转化和转化DNA序列的减数分裂分离”，植物分子生物学5(4)：235-246(1985))。
虽然本文是从转化单个植物细胞来描述本发明的，但本领域技术人员会理解到，本发明所依据的传送方法(除微注射外)一般都可应用于以细胞培养物愈伤组织或从整体植物上切下的组织的形式存在的植物细胞群体。这样，即可结合使用已建立的各种技术和这些传送方法，以从被转化和未被转化的植物细胞的混合群体中鉴别和/或选择出已被稳定转化的植物细胞(如参见Dekeyser，R.等，“稻转化选择标记的评述”，植物生理学90(1)：217-223(1989))。这些技术也可按同样方式与本发明合用。就外源DNA成分来说，预期按照本发明的方法经非生物传送手段转化植物细胞可造成两种基本类型的整合事件：(1)由促进整合的蛋白质的存在指引的邻接T-DNA边缘之完整外源DNA片段的简单插入；以及(2)外源DNA的各个部分的随机插入和所使用的非生物学运送方法所特有的外源DNA的变换。可以利用标准的分子分析工具分析被转化植物细胞的基因组DNA，可以很容易地将这两种类型的整合区分开，分析方法包括使用外源性DNA片段或其亚片段作为探针，对限制性酶切的基因组DNA进行Southern印迹杂交；设计以聚合酶链反应(PCR)为基础的技术以检测完整形式的外源DNA片段的存在。对于包含两种类型插入的植物细胞来说，可以用传统的培育方法分离开由之衍生的转基因植物中的这些插入事件。如使用这些手段，即可鉴定出利用本发明产生的、简单插入了接有T-DNA边缘之完整外源DNA片段的转基因植物细胞或植物，并用于产生转基因植物细胞培养物和/或转基因植物及子代。
应明确的是，本发明不只限于改善的基于农杆菌T-DNA转移系统的整合系统。可以根据本发明修饰那些利用整合促进性蛋白质和类似于Vir蛋白及T-DNA边缘的识别序列的其他系统，以改善定向转化的真核细胞中简单整合事件的发生频率。例如，所收集到的数据提示，在从农杆菌向植物转移T-DNA与质粒介导的细胞接合之间存在着密切关联。已发现了(1)T-边缘的切口区和incP转移起点之间；(2)VirD操纵子和松弛酶(relaxase)操纵子(Tral/TraJ)的基因族之间的序列关联性。Tra1和VirD2以及它们的靶，即RP4oriT切口区和T边缘重复区享有显著的相似性(参见WO 88/03564，其发明名称为“植物转化”)。在体外，Tra1和VirD2各自足以在带有其各自的相应切口位点的单链寡核苷酸中产生缺口(参见Pansegrau等，美国国家科学院院报90：11538-11542(1993))。在过量切割产物存在下，Tra1和VirD2也可催化连接两个单链DNA小片段这种对立反应。VirD2还能够催化裂解oriT。也已发现双粒病毒组Rep蛋白或参予细菌噬菌体和质粒的滚环复制的蛋白质，以及另一方面参予细菌接合DNA转移或参予将T-DNA从农杆菌转移并整合到植物基因组中的蛋白质之间的功能相似性(Heyraud-Nitschke F，等，核酸研究910-916(1995))。
附图说明
图1(A-B)：显示用于实施例1中所述实验的质粒结构。实施例1的材料和方法部分中描述了这些质粒的构成成分。RB相当于25bp边缘序列。其中所示限制性位点如下：E＝EcoRI；P＝PstI。
图2：提供质粒pNeoRBLuc的图解说明。LB，左边缘；RB，右边缘。图中上方方框指示用于转化子Southern印迹分析的探针。所指出的限制性位点为：E＝EcoRI；P＝Pst；X＝XbaI；H＝HindIII。“NOS”表示胭脂氨酸合酶启动子。“NPT II”表示新霉素磷酸转移酶II开放读框。“NOS T”表示胭脂酸合酶终止子。“CaMV35S”表示来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子。“LUS”代表荧光素酶的开放读框。“35S T”代表CaMV35S转录物的终止子。
图3：提供用pNeoRBluc、p35SD1和p35SD2转化后对植物DNA靶点的序列分析。数字是靶克隆指定序号。pNeoRBluc携带的右边缘序列用小写字母写出(Rb.接头行)。片段1、2a、3和5的植物靶序列各自显示与烟草的PS II(X62426，nt908)有100％同源性；与烟草的Ntp II 10(X70088，nt573)有100％同源性，与烟草的核酮糖1，5-二磷酸羧化酶(X02353，nt2174)有100％同源性，并与矮牵牛花的叶绿素结合蛋白(M21317，nt1013)有80％同源性。
图4(A-J)：提供用于实施例3和4中的质粒图。实施例3的“材料和方法”部分中描述了所用的缩写字。
图5(A-B)：图示实施例5中所用的质粒pwAdhD1、pwAdhD2、pwBarRBLuc、和pBARRBLuc。
图6：图解显示质粒pC1B1711(见实施例1)。
图7：图解显示质粒pC1B1711δB(见实施例7)。
图8：图解显示质粒pC1B1711δB-H，N(见实施例7)。
图9：图解显示质粒pC1B1711-H，N-B(见实施例7)。
图10：图解显示质粒pC1B1711-H，N(见实施例7)。
图11：图解显示质粒pBS-NC(见实施例7)。
图12：图解显示质粒pBS-NC-RB(见实施例7)。
图13：图解显示质粒UbiPATdI(见实施例7)。
图14：图解显示质粒LB.UbiPATdI(见实施例7)。
图15：图解显示质粒pAVMl(见实施例7)。
图16：图解显示质粒p35SD2(见实施例8)。
图17(A-B)：图解显示由含有VirD2开放读框之p35SD2的EcoRI片段制备片段A-C(见实施例8)。
图18：图解显示质粒pTC182(见实施例8)。
图19：图解显示质粒pTc182-A(见实施例8)。
图20：图解显示质粒ptC182-A-B(见实施例8)。
图21：图解显示质粒pUC21(见实施例8)。
图22：图解显示质粒PC21-X(见实施例8)。
图23：图解显示质粒ppUC21-C(见实施例8)。
图24：图解显示质粒pUC21-VirD2(见实施例8)。
图25：图解显示质粒T7polyA(见实施例8)。
图26：图解显示质粒T7virD2 poly A(见实施例8)。
实施例
这里使用的是J. Sambrook，E. F. Fritsch和T. Maniatis，分子克隆实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory manual，ColdSpring Harbor laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989))和T. J.Silhavy，M. L. Berman，和L. M. Enquist，基因融合实验(Experi-ments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratoy，ColdSpring Harbor，WY(1984))描述的，本领域已知的标准重组DNA和分子克隆技术。
实施例1：植物细胞的“农杆菌轰击”(agrolistic)转化：生物轰击(biolistic)运送VirD1和VirD2基因和T-DNA邻接的可选择标记基因后在植物中产生的T链整合
A.摘要
在传送到宿主植物细胞中，并将T-DNA插入到植物DNA中之前，须有从根癌农杆菌Ti质粒中切割T链所需的侵入性基因VirD1和VirD2。我们利用了质粒DNA的生物轰击传送来试验在植物中借助VirD1和VirD2对T-DNA边缘序列的结合和/或位点特异性切割。用3种质粒的混合物包被金微粒，三种质粒分别含有在CaMV35S启动子控制下的VirD1和VirD2编码区、以及含有插入到CaMV35S启动子和荧光素酶编码区之间的右边缘序列的试验基因。我们检测了荧光素酶瞬时表达，以检验试验基因的完整性和转录可行性。在烟草和玉米细胞中，荧光素酶基因瞬时表达受到VirD1和VirD2质粒共传送的强有力抑制。当VirD质粒对试验基因质粒的比例增加时抑制作用更大。边缘序列只取一种方向时出现显著抑制作用，即所取方向应导致VirD2切割作为荧光素酶mRNA之模板的DNA链。单独VirD1或单独VirD2的作用较小。带有可选择标志和荧光素酶试验基因的转化载体加上VirD质粒的混合物进行的生物轰击传送产生了中等频率的“农杆菌轰击”插入段，其与植物DNA的右接点正好有预期的T-DNA插入所预期的序列。我们在某些转化子品系中同时发现生物轰击和“农杆菌轰击”事件。
B.引言
经颗粒轰击进行基因传送在植物转化中已成为有广泛应用的被普遍接受的技术(参见Ahl Goy和Duesing，1995)。例如，已用这一技术开发了对欧洲谷物钻蛀虫有抗性的玉米(Koziel等，1993)。在产品开发过程中，必须确认转基因的结构和拷贝数及它们的稳定性。最合乎需要的产物应是有单一的简单插入段并且没有外加质粒载体DNA。但在以颗粒轰击法进行植物转化中，有一种包含质粒载体所导入基因的多拷贝整合的倾向(Klein等，1988；Klein等，1989；Gor-don-Kamm W. J.等，1990；Vasil等，1992；Wan Y.和Lemaux P，1994)。这个过程似乎在整合之前或整合期间促进质粒多联体化。在生物轰击转化期间插入的多个拷贝一般是遗传上连锁的，并且在继后繁殖期不能被分离。
转基因的多拷贝可通过几种机制致使它们表达不稳定(参见Matzke M.和Matzke A.，1995)：转基因的多拷贝可相互作用通过称为“共抑制”或“基因沉默”的后遗传机制彼此失活相关的宿主基因。此外，同源重组可引起多拷贝的遗传不稳定性。鉴于这些理由，减少被插入之转基因的拷贝数，对于维持导入之基因的精确度应是有利的。
通过农杆菌介导的转化所导入的外来基因的整合模式一般明显不同于经颗粒轰击植物细胞所造成的整合(Chilton，1993)。经生物轰击传递所产生的完整和重排的转基因的拷贝数，通常大大超过借助农杆菌系统导入植物中的转基因的拷贝数。农杆菌已逐渐形成一种使被转移基因定位在质粒，即所谓肿瘤诱导(Ti)或毛根诱导(Ri)质粒上的机制(参见kado，1993)。Ti或Ri质粒DNA的称为T-DNA(被转移DNA)的特定片段，借助25bp同向重复的边缘序列侧接到Ti/Ri质粒上，使该片段从细胞中移向植物细胞核并逐渐被整合到植物的染色体DNA中。DNA转移的一个精细机制是由一系列侵入性(vir)基因编码的(参见Zambryski，1992)。vir基因的激活导致在T-DNA边缘重复区内产生位点物异性缺口，并产生相应于T-DNA底链的线性单链DNA分子(T链)。切割需要由VirD操纵子编码的两种多肽：VirD1和VirD2(Stachel和Nester，1986；Stachel等，1987；Herrera-Estrella等，1988；DeVos和Zambryski，1989；Dur-renberger等，1989；Howard等，1989；Koukolikova-Nicola等，1993)。VirD1表现有DNA松弛活性(Ghai和Das，1990；Filichkin和Gelvin，1993)，而VirD2则具有裂解边缘序列下链的内切核酸酶活性(Stachel等，1986；Yanofsky等，1986；Wang等，1987；Albright等，1987)。体外实验也已证明，纯化的VirD2特异性地裂解单链DNA(Pansegrau等，1993；Jasper等，1994)。超螺旋DNA和松弛的双链DNA都不是单独用VirD2体外裂解的底物(Jasper等，1994)。
VirD2通过酪氨酸残基29(Durrenberger等，Vogel和Das，1992；Pansegrau等，1993)共价连接到带缺口DNA的5′末端上(Ward和Barnes，1988；Young和Nester，1988；Howard等，1989)。在左边缘序列处的第二次裂解导致T链的释放。另外，T链还沿着其长度被单链结合蛋白VirE2包被。VirD2和VirE2含有据信可将T链导入植物细胞核中的核定位信号(NLS)(Herrera-Estrella，1990；Howard等，1992；Shurvinton等，1992；Tinland等，1992；Rossi等，1993)。在烟草中和玉米中，VirD2和VirE2的NLS已被识别(Citovsky等，1994)，但它们的效率则取决于组织的发育阶段。最近资料支持这样的观点，即VirD2可能参予T链之5′末端与植物DNA的连接(Tinland等，1995)。
在目前的研究中，我们已建立了一种新的植物转化技术，其中结合了农杆菌系统和已证明有高效率的生物轰击和用于各种农作物植物的其他传送系统的某些优点。其被设计用于整合不带有载体序列的、作为T-DNA插入物的目的基因，并用于控制拷贝数。我们的办法是使用与转化质粒共传送的VirD1和VirD2的植物表达盒，其中所说的转化质粒含有邻接可选择标志的T-DNA边缘序列。我们发现，瞬时表达的VirD1和VirD2基因产物确实可在植物中切割T-DNA边缘序列，并在生物轰击传送后产生T-DNA型插入事件(“农杆菌轰击”事件)。
C.材料和方法
1.质粒：图1中给出了用于本研究的所有质粒插入片段的结构。pC1B1711是含有花椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)启动子驱动的萤火虫荧光素酶基因的pUC衍生物。
pC1B1711的构建
pC1B1711含有连接到35S表达信号上的荧光素酶基因。在插入荧光素酶基因之前，去掉单一的限制性位点Pstl和Narl修饰亲本载体pClB710(Rothstein等，1987)。在相邻的SalI和Sphl限制性位点处切割除去位于CaMV启动子上游的Pstl位点，并连接合成的接头[5′-TCGACATG-3′]以造成Sall位点并除去Sphl和Pstl位点。用Narl和Ndel切割掉位于CaMV聚腺苷酸化序列3′侧的Narl位点，即切掉一个52bp片段，然后进行Klenow消化和平端连接。质粒pJD204(Ow等，科学234：856-859(1986))和pDO0432(De Wet等，分子细胞生物学(Mol. Cell. Biol.)7(2)：725-737(1987))分别由Donald Helinski博士和Steve Howell博士提供。将含有荧光素酶基因、22bp荧光素酶5′UTL和约130bp3′末端的pJD204中的1826bp Hind III-Bam HI片段与从寡聚物5′-GATCCCTGCAGA-3′(SEQ ID NO：3)和5′-AGCTTCTGCAGG-3′(SEQ ID NO：4)制得的合成接头连接到pClB710的BamHI位点中，以使之在35S启动子和聚腺苷酸化信号之间。
将荧光素酶基因片段插入到修饰的pClB710载体中得到pClB1701。用Pst和Narl消化pClB1701，并将所得质粒与含有基因前导序列和5′末端的接头R5B1连接以构建pC1B1711。
接头R5B1含有从下列互补寡聚体制得的片段：5′-ATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCT
ATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGATCCCTGCAGGACACGCTGAAATCACCAG
TCTCTCTCTACAAATCTATCTCTCTCTATG-3′(SEQ ID NO：5)和5′-GATCCATAGAGAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACTGGTGATTTCAGCGTGTCCTGCAGG
GATCCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCGAAGGATAGT
GGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGAT-3′(SEQ ID NO：6).
为了导入T-DNA边缘，将两个相应于LBA5269(Van Haaren等，1989)之右边缘序列的合成寡核苷酸退火以产生双链体：5′-ATCCGGCAGGATATATACCGTTGTAATTCTGCA-3′(SEQ IDNO：7)。将此侧翼有BamHI-PstI位点的双链体插入pC1B1711启动子和荧光素酶编码序列之间的相应位点中，得到pRB(+)Luc。在pRB(-)Luc中，以相对于启动子来说相反的方向引入右边缘序列。设计用来稳定地转化烟草悬浮细胞并含有左边缘序列、新霉素磷酸转移酶基因(nptII)和荧光素酶基因的pNeoRBLuc，其中右边缘被插入在pRB(+)Luc的启动子和荧光素酶编码之间(图2)。从质粒pBin19中切掉作为2.2Kb SacII-Hind III片段的由nos(胭脂氨酸合酶)启动子控制的nptII基因(Bevan，1984)。从pBin19中切掉作为Bgl II-EcoRI片段的左边缘序列。将这两个片段插入到pRB(+)Luc的Xba I-Hind III位点中。pNeoLuc是在CaMV35S启动子和荧光素酶编码区之间没有插入右边缘序列的pNeoRBluc的等同物。
将得自pTiA6的VirD1和VirD2亚克隆到由CaMV35S启动子(0.5Kb)、Adh1第一内含子(0.5Kb)，和胭脂氨酸合成酶(nos)聚腺苷酸化区域(0.25Kb)组成的(图1)表达载体pMF6(Callis等，1987)中。将得自pAD1187(Ghai和Das，1989)的相当于VirD1编码序列的0.6Kb EcoRI-Pst1克隆到pMF6中产生p35SAdhD1。从pAD1190(Ghai和Das，1989)切下作为1.8Kb EcoR I片段的VirD2编码序列，并克隆在pMF6中。所得到的质粒p35SAdhD2和p35SAdhD2(rev)以有义和反义方向上携带VirD2编码区。从p35SAdhD1、p35SAdhD2和p35SAdhD2(rev)删除Adh1内含子以分别产生用于烟草组织实验的p35SD1、p35SD2和p35SD2(rev)。
pGUS是含有处于CaMV35S启动子控制下的β-葡糖醛酸酶(GUS)编码序列GUS基因和蓖麻子过氧化氢酶基因内含子的pUC衍生物(Ohta等，1990)。
2.植物材料
玉米悬液细胞：玉米(Zea mays L.)悬液培养物最初是从选自B73相关优秀品系的未成熟胚的冷冻保存的胚发生II型愈伤组织制得的。将大约1g冷冻保存的愈伤组织(DiMaio和Shillito，1992)加到50ml添加有30g/L蔗糖和2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的N6液体培养基(Chu等，1975)(2N63S)中。于25℃暗处，在轨道振荡器上以150rpm保温培养物。每隔7天将1ml填充容积的细胞移入50ml新鲜2N63S液体培养基中，以传代培养悬液培养物。
从迅速生长3天的培养物中取出用于轰击实验的玉米细胞悬液。轰击前，在7cm滤纸(Whatman，N°4)上真空过滤约0.5ml堆积体积的细胞。然后将滤纸移到含有120g/L蔗糖的脱乙酰吉兰糖胶固化的N6培养基上。使铺敷的细胞在25℃下保持4小时，然后用于轰击实验。轰击后，将平皿于25℃下保温24小时。
烟草悬液细胞：使Nicotiana tabacum细胞系NT-1(An，1985)生长于添加了2mg/L 2，4-D和蔗糖(30g/L)的Murashige-Skoog培养基(Murashige and Skoog)(MS3S)中。每周取5ml细胞接种物加于500ml培养瓶内的100ml新鲜培养基中进行传代培养。将培养瓶置于125rpm旋转振荡器上，27℃保温。分取0.5ml的4天培养物分散于无菌滤纸(Whatman N°4)上，然后移至添加了12％蔗糖的MS培养基上，并于室温下保持4小时后用于轰击实验。
3.轰击植物细胞：
用沉积有质粒混合物的金微粒轰击组织。所有情况下均以pGUS质粒DNA作为玉米和烟草实验的内部对照。为进行共转化实验，所用金颗粒分别携带有等质量的各种质粒DNA(每个靶平皿上各加0.5μg质粒DNA)，或者摩尔比例为2∶1的携带VirD1和VirD2基因的质粒与底物质粒。为进行稳定转化实验，所用转化混合物含有5∶1摩尔比例的携带VirD1和VirD2基因的质粒对nptII选择质粒。轰击每个靶平皿的每一等份质粒混合物由0.1μg选择标志物和0.5μg p35SD1或p35SD2质粒DNA组成。以10μl的总体系混合适当量的每种DNA，并用50μl 2.5M CaCl2和20μl 0.1M亚精胺游离碱沉淀之，以使之沉淀于50μl 1.0μm金微粒(60μg/ml)上。用PDS-1000He基因枪装置(Dupout)进行微粒轰击，其中使用在制动屏蔽架下方8cm处带有样品的1500psi破裂盘。
4.稳定地转化烟草悬液细胞
轰击后24小时，将烟草细胞移至带有300μg/ml卡那霉素的MS3S平皿上。将轰击后约3周出现的独立微小愈伤组织移至加有300μg/ml卡那霉素的新鲜平皿上。在同样培养基上进行两次再培养后，将大约100mg烟草细胞接种于加有300μg/ml卡那霉素的25ml液体培养基中。
5.瞬时表达试验：
按照供应商(Luciferase assay system，Promega)推荐的方法检测组织提取物中的荧光素酶。使用GUS-Light试剂盒(Tropix)，以化学发光检测法测定β-葡糖醛酸酶活性。使用2001型AnalyticalLuminescence发光计于25℃下积分10秒测定以光单位表示的荧光素酶和β-葡糖醛酸酶活性。
6.DNA提取和Southern印迹杂交
接种后10天过滤收获细胞培养物并在液氮中冷冻。按已述方法(Hall等，1991)分离DNA。取大约5μg基因组DNA进行EcoRI消化。在0.7％琼脂糖凝胶上分离后，将DNA转移到加有膜的基因筛上，并按照制造商所述的条件(NEN Research Products，DuPont)进行杂交。使用Pharmacia的寡标记试剂盒，用[a-32P]dCTP标记DNA探针。neo探针相当于nptII基因的2Kb PstI片段(图2)。luc探针相当于荧光素酶基因的0.7Kb Xba-EcoRI片段(图2)。用0.1％SDS于100℃下冲洗5分钟以去除膜上的探针。
7.T-DNA/植物DNA接合区的克隆
用EcoRI消化转基因烟草愈伤组织的DNA(30μg)并在1％Sea-plague琼脂糖凝胶(FMC)上进行制备性电泳。从凝胶上切下相当于待克隆片段大小的琼脂糖凝胶片，并用QlAquick Gel Extraction试剂盒(Qiagen)从琼脂糖中提取DNA。然后将所得片段克隆到pUC19的去磷酸化EcoRI位点中。以电穿孔法用连接混合物转化大肠杆菌HB101细胞。使用0.5Kb CaMV35S启动子片段作为探针，以菌落滤膜杂交法鉴定含有正确插入片段之质粒的菌落。使用定位在CaMV35S启动子中(距右边缘序列106 bp处)的引物5′-CCACTATCCTTCGCAAGACC-3′(SEQ ID NO：8)分析带植物DNA与供体质粒DNA接头处的序列。
D.结果
1.实验设计
为了研究在植物细胞中表达时，是否VirD1和VirD2基因产物能切割T-DNA边缘序列，我们构建了在启动子和荧光素酶基因的编码区之间含有底物T-DNA边缘序列的试验质粒pRB(+)Luc。在CaMV35S启动子和荧光素酶编码区之间插入右边缘序列并不干扰荧光素酶基因在植物组织中的表达(数据未出示)。以通过VirD1和VirD2基因产物引入位点特异性切割这种方式安排边缘序列的位置，应导致作为荧光素酶mRNA之模板的DNA链的断裂，并降低荧光素酶转录物及酶的产生量。用pRB(+)Luc和携带VirD基因的质粒共轰击植物细胞后，在边缘序列处的任何切割都可经检测荧光素酶活性而定量检测出来。然而，也可以根据VirD1和VirD2基因产物在位于启动子和编码序列之间的边缘序列处的结合(该结合可抑制荧光素酶基因的转录)来解释荧光素酶活性的降低。因此可试验在与启动子相反的方向上含有边缘序列的质粒pRB(-)Luc，以在这两种可能性间作出区别。如果荧光素酶活性的降低是因VirD基因产物与边缘序列结合所造成的，则既使以相反方向带有边缘序列时也可能观察到这种降低。
因为必须在VirD1和VirD2蛋白能切开边缘序列之前就要在被轰击的植物细胞中瞬时产生这些蛋白质，所以推测这种切割应在荧光素酶基因已开始转录之后发生。因此荧光素酶活性检测可能会低估植物细胞中的VirD1和VirD2活性。
为了在植物细胞中表达VirD1和VirD2基因，应将其各自的开放读框(ORF)放在CaMV35S启动子的控制之下。也以相对于启动子的反义方向引入VirD2 ORF作为对照。因为已发现当存在玉米醇脱氢酶1内含子1时可增加基因在玉米中的表达(Callis等，1987)，我们还构建了用于玉米中瞬时表达实验的p35SAdhD1和p35SAdhD2(分别含有插入到启动子和VirD1及VirD2编码序列之间的内含子)。每次轰击中均包括有表达β-葡糖醛酸酶(GUS)基因的质粒pGUS，以其作为内部标准，以监控DNA转移的效率。在所有情况下，均以荧光素酶对GUS活性的比例来表示报导分子的活性，以校正DNA传送效率的变异性。
2.检测植物中VirD1和VirD2基因产物裂解边缘序列的瞬时
表达检测法
首先用我们的与VirD1和VirD2基因共传送的试验质粒分别瞬时转化玉米和烟草细胞，以试验它们各自通过T-DNA边缘序列影响传录的能力。在将p35SD1 DNA或p35S AdhD1 DNA各自与pRB(+)LUC DNA共传送后，在烟草和玉米组织中观察到荧光素酶对GUS活性的80％对照水平(参见下列表1和表2)。p35SD2DNA(烟草)或p35SAdhD2 DNA(玉米)与pRB(+)LUC DNA共传送后可见荧光素酶对GUS活性分别有50％和80％的对照水平(见表1和表2)。
表1：VirD1和VirD2在烟草悬液细胞中的活性
质粒+pGUS                         均值      ±SD   ％对照pRB(+)LUC                             1.36     ±0.06     -pRB(+)LUC+p35SD1                      0.98     ±0.03    72pRB(+)LUC+p35SD2                      0.69     ±0.07    50pRB(+)LUC+p35SD1+p35SD2(1∶1∶1)      0.27     ±0.05    20pRB(+)LUC+p35SD1+p35SD2(1∶2∶2)      0.14     ±0.05    10pRB(+)LUC+p35SD1+p35SD2(rev)(1∶1∶1) 1.08     ±0.13    80pRB(+)LUC+p35SD1+p35SD2(rev)(1∶2∶2) 1.13     ±0.08    83pRB(-)LUC                             1.40     ±0.14     -pRB(-)LUC+p35SD1                      1.33     ±0.13    95pRB(-)LUC+p35SD2                      1.19     ±0.12    85pRB(-)LUC+p35SD1+p35SD2               1.56     ±0.38    112
表1.烟草细胞中VirD1和VirD2的活性。质粒构建体如图1中所述，并用基因枪装置运送到烟草细胞中。括号间的数目表示质粒的摩尔比。保温24小时后，进行组织匀浆化并检测酶活性。活性以荧光素酶(Luc)对β-葡糖醛酸酶(Glu)的比例来表示。分析每次独立的轰击并且数据以6次重复的平均值加减标准差给出。根据荧光素酶对β-葡糖醛酸酶活性的比例，对使用对照质粒观察到的那些活性确定出百分(％)对照值。
表2：玉米悬液细胞中VirD1和VirD2基因的活性
质粒+pGUS                               均值    ±SD   ％对照pRB(+)LUC                                   1.26    ±0.27   -pRB(+)LUC+p35SAdhD1                         1.32    ±0.28   105pRB(+)LUC+p35SAdhD2                         1.02    ±0.15   81pRB(+)LUC+p35SAdhD1+p35SAdhD2(1∶1∶1)      0.11    ±0.03   8.7pRB(+)LUC+p35SAdhD1+p35SAdhD2(1∶2∶2)      0.006   ±0.007  0.5pRB(+)LUC+p35SAdhD1+p35SAdhD2(rev)(1∶1∶1) 0.99    ±0.20   78.6pRB(+)LUC+p35SAdhD1+p35SAdhD2(rev)(1∶2∶2) 0.96    ±0.26   76
表2.玉米细胞中VirD1和VirD2的活性。按表1的脚注中所述方式表示活性。
两种vir基因一起似乎具有协同效应。用基因枪装置共传送等量的pRB(+)LUC DNA与携带VirD1和VirD2基因的质粒(比例1∶1∶1)，在烟草中使荧光毒酶活性减低为约对照组的20％(表1)，而在玉米细胞中则降低至10％(表2)。在高VirD1和VirD2质粒对试验质粒比例(2∶2∶1)时，烟草细胞中荧光素酶活性进一步降低至约10％(表1)，玉米细胞中至约1％(表2)。使用以反义方向携带VirD2编码序列的对照质粒p35SD2(rev)(烟草)或p35SAdhD2(玉米)所作的类似实验与单带VirD2者所得的结果相似(表1和表2)。这证明我们的内部标准GUS基因是改变所传送的总DNA浓度时所产生影响的有效对照物。
颠倒T-DNA边缘在试验质粒中的朝向可消除或大大降低VirD1和/或VirD2基因对荧光素酶基因瞬时表达的影响。当将pRB(-)Luc与p35SD1和p35SD2质粒DNA共轰击到烟草植物中时，没有观察到荧光素酶活性的明显降低。pRB(-)Luc分别与p35SD1或p35SD2进行共传送同样没有显示出荧光素酶活性的明显降低(表1)。这些研究结果强有力地说明，用pRB(+)Luc试验质粒加VirD1和VirD2基因观察到的荧光素酶活性的降低，与在农杆菌中观察到的结果相似，也是由Vir基因产物在右边缘序列处进行链特异性切割所致(参见Zambryski，1992)。
3.稳定转化的分析
然后进行烟草悬液细胞的稳定转化，以估计在用基因枪装置共传送VirD1和VirD2基因与其底物DNA后，这些基因的表达产物对DNA整合模式的活性。使用pNeoRBLuc进行这些实验，该质粒含有左T-DNA边缘、作为可选择标志的npt II及带有插入启动子和荧光素酶编码区之间的右T-DNA边缘。在下文的结果和讨论部分中，我们称为“农杆菌轰击事件”的是发生在VirD1和VirD2活性作用于边缘序列，产生T链之后的那些烟草基因组中的DNA插入。相反，我们指定为“生物轰击事件”是代表正常出现在基因经基因枪装置传送到植物细胞中之后发生的DNA插入。区别生物轰击事件和推定的农杆菌轰击事件的最初标准是被转化的克隆中没有荧光素酶活性，这起因于从pNeoRBLuc中切下T-DNA而排除Luc编码区。在分子水平上，代表农杆菌轰击事件的转基因应与neo探针杂交，而不与luc探针杂交。此外，在农杆菌轰击事件中，被导入的DNA和植物DNA之间接合的序列应确切相当于T链的右边缘末端。两种事件可发生在同一植物细胞中，但这样的克隆应总地被归为基于有荧光素酶活性存在的生物轰击事件。用Southern杂交法研究生物轰击和推测的农杆菌轰击事件，以检测每种类型插入的频率。用pNeoRBLuc质粒DNA连同p35SD1和p35SD2 DNA以1∶5∶5的比例混合包被的微粒轰击烟草悬液细胞。作为对照，也单独用pNeoRBLuc轰击，并用无边缘对照质粒pNeoLuc与p35SD1和p35SD2共轰击。根据在含卡那霉素培养基上的生长情况来选择稳定的转化子。每个被轰击的滤膜平均出现40个卡那霉素抗性克隆，但每个平皿只进一步分析了一个或两个愈伤组织。在单用对照质粒pNeoRBluc DNA或pNeoLuc DNA加p35SD1 DNA和p35SD2 DNA轰击后，回收到相似数目的卡那霉素抗性愈伤组织。
可根据所分析的不表达荧光素酶的卡那霉素抗性愈伤组织总数对总卡那霉素抗性愈伤组织总数的比例来粗略估计农杆菌轰击事件的发生率。按照这个标准，农杆菌轰击事件的发生率约为10％；在所分析的32个愈伤组织品系中，3个没有表达荧光素酶活性。如上面所讨论的，因为在同样植物细胞中农杆菌轰击事件和生物轰击事件均可发生，所以这个数目可能低估了农杆菌轰击事件。
4.对照“生物轰击”事件的Southern印迹分析
对(i)单用pNeoRBLuc轰击，和(ii)pNeoLuc质粒与p35SD1和p35SD2 DNA共轰击后得到的对照卡那霉素抗性愈伤组织品系的DNA进行Southern印迹杂交。用EcoRI消化基因组DNA，结果从pEoRBLuc质粒产生与neo和Luc探针同源的3.9Kb片段(图2)。当基因组DNA消化产物与neo探针杂交时，所有泳道都展现出有预期大小(9.3Kb)和完整片段拷贝数目的杂交带。基于与拷贝对照泳道的比较，可见每个核有1至10个以上的拷贝。从用p35SD1和p35SD2 DNA连同用作探针的无边缘对照质粒pNeoLuc共轰击而转化的细胞系，对其DNA进行Southern印迹分析后表明，在这些细胞系中存在完整的和重排的nptII基因的拷贝。在用基因枪装置得到的转化子中常常观察到这种重排。
5.候选生物轰击事件的Southern印迹分析
还对使用p35SD1和p35SD2质粒DNA作为杂交探针，与pNe-oRBLuc共轰击后得到的16个卡那霉素抗性愈伤组织的DNA进行Southern印迹分析。为进行Southern印迹分析，在32个荧光素酶活性呈阳性试验结果的愈伤组织系中随机选出13个，同时还有3个发现不表达荧光素酶的克隆。荧光素酶阳性愈伤组织系的DNA含有一条与neo探针杂交的有预期大小(3.9Kb)的带。基于与拷贝对照泳道的杂交强度的比较，可见完整nptII基因拷贝的数目为每个核1到10个。在用pNeoLuc DNA和p35SD1及p35SD2 DNA转化的愈伤组织中观察到的拷贝数要低得多。
我们观察了所用p35SD1和p35SD2 DNA连同pNeoRBLuc轰击的转基因愈伤组织的DNA中的3.4Kb带。发现这个大小的片段与这些细胞系中的VirD2探针杂交。neo探针所用的片段含有一段也存在于p35SD1和p35SD2构建体中的终止子序列，但它只代表被标记探针的1.2％，可能有许多VirD基因插入片段的拷贝并可给出大小可见的信号。
当印迹与luc探针杂交时，可区分出3组转基因愈伤组织品系：(1)有与neo探针和luc探针杂交之插入片段的愈伤组织品系；(2)其中某些插入片段只与neo探针杂交，某些插入片段与neo和Luc探针杂交的愈伤组织品系；(iii)插入片段只与neo探针杂交的愈伤组织品系。第一组愈伤组织可能不包含农杆菌轰击事件。第二组愈伤组织可能含有两种类型的事件：根据与neo探针杂交的4.8Kb、4.6Kb和5Kb片段的存在所证明的农杆菌轰击事件，以及根据与luc探针杂交的3.9Kb片段的存在所证实的生物轰击事件。根据其能够只与neo探针杂交，第三组愈伤组织只表现有推测的农杆菌轰击事件。有三个愈伤组织细胞系落入这一组中：一个含有3.2Kb杂交带；第二个含有3.8Kb和5Kb这两个杂交带；第三个只含有一条5.5Kb带。这三种杂交模式是独特的、清楚地代表独立的单一细胞转化事件。
在用Southern杂交法分析的16个烟草细胞系中，有10个表现为生物轰击事件，3个表现为推测的农杆菌轰击事件，3个兼有两者。
6.推定的农杆菌轰击事件的分子分析
推定的农杆菌轰击插入事件的性质最终是经确定表现出与这样的推定事件相一致的杂交模式的愈伤组织品系中植物细胞与被整合DNA间接合处的序列证实的。克隆包括这些接合点的愈伤组织细胞系中的DNA片段并由内向外测定T-DNA边缘区的序列(见方法部分)。核苷酸序列揭示，其中各个片段均含有指示右边缘/植物DNA接头特征的序列。T-DNA的右终点与T-DNA之右边缘序列的切割位点完全相同。
以前有人报导了呈cDNA形式的5例完全配对的烟草接头序列中4个的植物核苷酸序列。令人感兴趣的是，所有这4例中，就接近基因之5′未翻译区中聚腺苷酸化位点的高AT区中的植物基因来说，T-DNA的右边缘与CaMV35S启动子是按反义方向插入的。在右接合位点处未见到附加核苷酸和重复序列。因为未测定插入片段的左边缘，所以不可能推断出是否已发生了靶位点的任何缺失。
作为对照，还从表现有与生物轰击DNA片段相一致杂交模式的愈伤组织品系中克隆在每一侧含有右边缘序列和相邻区域的DNA片段。来自这些过程的核苷酸序列未显示有任何右边缘序列—植物DNA接头，而是全长度右边缘序列和其后的预期荧光素酶编码序列。
E. 结论
Ti质粒编码的侵入性蛋白质VirD1和VirD2是在农杆菌中形成T链所必需的。在此我们提出有关在借助基因枪装置导入两个处于CaMV35S启动子控制下的侵入性基因VirD1和VirD2连同载有边缘序列的质粒之后，在植物中形成T-DNA和整合在植物细胞中的证据。大约10％的被转化烟草愈伤组织呈现有农杆菌轰击插入片段，即只在VirD1和VirD2基因产物的作用后整合的DNA。被转化愈伤组织的相似级份含有农杆菌轰击和生物轰击事件。农杆菌轰击事件中的转基因∷植物DNA接头证明了在右边缘序列内位点特异性切割，这与所收集到的显示右边缘T-DNA正好在25bp重复区的前3个核苷酸之后的数据(Gheysen等，1991；Mayerhofer等，1991；Ohba，1995)相符。整合事件的精确度被解释为VirD2直接卷入植物细胞核中的重组过程(Tinland等，1995)。
在被转录区域中鉴定了农杆菌轰击事件的整合位点，这支持有关在不同的植物品种中T-DNA优先被整合到潜在被转录的基因组座位中(Koncz等，1989；Herman等，1990，Kertbundir等1991)，同时T-DNA插入随机分布在植物染色体中的资料(Chyi等，1986；Wallroth等，1986)。虽然T-DNA整合通常与植物DNA中的大的重排无关，但在T-DNA转化期间可发生靶植物DNA序列的缺失、颠换及复制。就这里检查的农杆菌轰击事件来说，在植物靶细胞中未观察到大的重排。
在接近已知的烟草光诱导的和/或光合成的基因之聚腺苷酸化信号附近进行农杆菌轰击整合，与右边缘处的CaMV35S启动子以反义方向指向开放读框这一相符模式正在引起人们的兴趣。在这个方向上，T-DNA结构的插入可以产生能灭活相应烟草基因表达的反义转录物。但这种光合成的基因不是那些非光合成的培养NT1细胞所需要的。
基于其中在右边缘序列上似乎以高频率发生的瞬时表达实验，显然有高百分比例的底物分子被裂解。令人惊奇的是，这一比例没有在稳定转化中得以保持。这种情况可以解释为在被VirD2切割后右边缘序列处发生连接反应所致，因为体外试验已显示VirD2催化含有T-DNA边缘序列之单链寡核苷酸内的位点特异性切割一连接反应(Pansegrau，等，1993)。另一种解释是可能没有有效的农杆菌介导的转化所需的单链结合性VirE2。虽然可以假定植物细胞中有一个可结合并保护T-链的非特异性单链结合蛋白VirE2的等同物，但连同VirD1和VirD2一起加入VirE2基因可以改善农杆菌轰击事件的回收效率。我们也注意到伴随VirD1和VirD2基因与转化质粒共传送可能以高频率生物轰击或整合到同一被转化细胞系中的缺点：使用基因枪装置的共转化是非常有效的。这些不需要的基因代表了一种不同类型的外来DNA。但鉴于它们的独特插入机制，我们推测它们并不与“农杆菌轰击”插入片段相连，并且可因继后培育转基因植物而被除去。不能用这些不可再生的转基因NT1细胞来检验这一假设。
农杆菌轰击转化系统有几个方面的不同优点：(i)它不应直接应用于对生物轰击转化方法敏感的任何植物靶组织；(ii)被插入的DNA并不携带外来的载体DNA；(iii)被插入的目标基因的拷贝比在没有VirD1和VirD2基因时传送的DNA的拷贝数少。这样便可以尽可能地减小可导致不稳定的同源性区域。
农杆菌轰击方法结合了生物轰击传送的最佳特征和农杆菌T-DNA插入机制的精细和准确度，从而为生产有农业价值的转基因农作物提供一种新的、广泛适用的技术。
实施例2：植物表达盒的构建
首先在表达盒中适当启动子的后面和适当终止子的上游组装欲在转基因植物或植物细胞中表达的基因序列，以产生嵌合基因。然后可以很容易地按实施例3中所述方法将这些表达盒转入植物转化载体中。
启动子选择
对用于表达盒或嵌合基因中的启动子的选择将决定转基因在转基因植物中的时空表达模式。所选择的启动子将在特定类型细胞(例如叶表皮细胞、叶肉细胞、根皮质细胞)或特定组织或器官(例如根、叶或花)中表达转基因，并且这种选择将影响转基因表达的所需定位。此外，所选择的启动子也可驱动基因在光诱导的或其他瞬时调节的启动子控制下的表达。再者，所选择的启动子也可以是受到化学调节的。这样可以为只在需要时，并在用化学诱导物处理后诱导转基因的表达提供可能性。
转录终止子
有多种不同的转录终止子可用于表达盒中。这些终止子负责在转基因后面终止转录，和其正确聚腺苷酸化。适当的转录终止子和在植物中的功能是已知的，其中包括CaMV35S终止子、tml终止子、胭脂氨酸合成酶终止子、豌豆rbcS E9终止子。这些终止子可用于单子叶和双子叶植物中。
增强或调节表达的序列
已发现有许多序列增强转录单位内的基因表达，并且这些序列可与本发明的基因接合使用以提高它们在转基因植物中的表达。
已显示各种内含子序列可增进表达，特别是在单子叶植物细胞中。例如，已发现玉米Adh1基因的内含子当被导入玉米细胞中时，显著增强处于其同源启动子控制下的野生型基因的表达。发现内含子1是特别有效的，并增强带有氯霉素乙酰转移酶基因的融合构建体中的表达(Callis等，Genes Develop.1：1183-1200(1987))。在同样的实验系统中，来自玉米bronze 1基因的内含子在增强表达上具有相似的作用(Callis等，文献同上)。已常规地将内含子序列掺入到植物转化载体中，典型的是掺入非翻译前导区内。
已知许多衍生于病毒的非翻译前导序列也增强表达。特别是已发现来自烟草花叶病毒(TMV，“ω序列”)，玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)，和首蓿花叶病毒(AIMV)的前导序列在增强表达上是有效的(如参见Gallie等，核酸研究15：8693-8711(1987)；Skuzeski等，植物分子生物学15：65-79(1990))。
实施例3：影响生物轰击传递的DNA中位点特异性重组的“断
续”法：重组酶mRNA的共传递
A.摘要
我们描述一种使用基因枪装置向植物细胞共传递DNA和mR-NA的方法。借助凝胶电泳，我们已证明在各种条件下沉积于微粒上的DNA和RNA的稳定性与回收率。为了传送活性的mRNA，单用CaCl2或CaCl2加亚精胺加Tris缓冲液进行沉淀是有效的，同时未缓冲的亚精胺裂解RNA。
经使用有效的沉淀方法并向玉米和烟草细胞生物轰击传送，我们证明了体外合成的编码萤火虫荧光素酶的加帽聚腺苷酸化mR-NA的表达。动力学研究证明，荧光素酶mRNA表达比同时传送的35S/荧光素酶DNA的瞬时表达较早达到峰值。
为了证明生物轰击运送的编码R-Zygosaccharomyces rouxii的位点特异性重组酶—的mRNA的活性，我们向玉米细胞共传送含有侧接RS之反向拷贝的反向35S启动子、重组酶的31bp特异靶位点，然后是35S前导序列、荧光素酶基因及35S终止区的底物质粒。虽然单用底物质粒没有出现明显地荧光素酶表达，但与RmRNA共传送时，其35S启动子被重组酶倒转并产生了荧光素酶。
下面讨论位点特异性重组酶系统控制转基因插入和表达的潜在应用，以及作为mRNA瞬时导入重组酶活性的优点。
B.引言
在使用颗粒轰击法向植物细胞进行基因传送时，转基因DNA一般在含有多拷贝的单位点随机插入基因组中(Klein等，1988；Klein等，1989；Gordon-Kamm W. J.等，1990；Vasil等，1992；WanY.和Lemaux P.1994)。转基因的排布、插入位置和常常出现的高拷贝数可通过几种机制导致表达的不稳定：例如，转基因的多个拷贝可通过反义或甲基化机制或其目前还不完全清楚的“沉默”机制相互作用而彼此失活(参见Matzke M.和Matzke A.，1995)。因为转基因的多个拷贝是在单一插入位点连接的，所以不可能通过继后植物繁殖中的分离来减少拷贝数。对于转基因表达的基础研究和有农业应用价值的转基因农作物的商业生产来说，如何改善被导入之基因的排布和表达是应特别优先考虑的。位点特异性重组系统可作为简化转基因的插入模式，甚至将其导向植物基因组中的预定位点的有用工具(Albert等，1995)。
已证明有几种位点特异性重组酶在植物细胞中是有活性的(如参见Odell和Pussell，1994)：噬菌体P1的Cre/lox系统、酿酒酵母2μ质粒中的FLP/FRT重组系统，以及Zygosaccharomyces rouxii之pSR1质粒中的R/RS系统(Matsuzaki等，1988)。由于这些系统简单、可充分操作、只需要单一重组酶蛋白(Cre，FLP，R)及其相应的靶，短的限定的重组位点(分别是lox，FLP，RS)，故有着潜在的实用性。此外，它们的重组频率是相当高的。重组酶可依据识别位点的位置和朝向，通过其重组反应介导三种类型的DNA重排。如果DNA片段边上接有两个彼此颠倒的识别位点，则可发生间隔DNA的倒转。如果两个识别位点是在同一方向上，则发生间隔DNA的切除和环化。当识别位点是在分立的DNA分子上时，会发生遗传交换，并且如果是环形的，则该分子可线性整合到其他分子中。
可使用位点特异性重组酶活性简化导入到植物中的靶转基因。但如果这种活性持续存在，其可致使重组体结构不稳定。因此希望只是瞬时表达重组酶活性。这一点在最近的一项研究中已经实现，该研究证明含lox的转基因定向整合到表达Cre之转基因植物的lox位点中(Albert，等，1995)。因为lox位点处在启动子和Cre基因编码区之间，所以位点特异性重组作用导致Cre表达的失活，使产物得以稳定。基于Southern杂交分析，检查的所有整合事件都是单一拷贝的。在最近的研究中，我们已采纳了R/RS位点特异性重组酶系统，用于生物轰击基因传送。已显示R/RS系统可在烟草中有效地发挥其功能：当R基因瞬时转化到原生质体中时，其基因产物借助位点特异性颠倒或切掉DNA而打开隐蔽性葡糖醛酸酶(GUS)基因(Onouchi等，1992)。在此我们证明，通过生物轰击传送的R重组酶对玉米和烟草有相似的功能，即通过倒转其启动子而开启隐蔽性荧光素酶基因，不过其效率很低(可经完善有关参数来提高效率)。另外，使用mRNA而不是DNA产生重组酶可确保其在向细胞内导入DNA底物后很快产生。靶RS位点含有由14bp倒转的被3bp不对称核心分开的重复区组成的31bp回文核苷酸序列(Matsuzaki，等，1988)。为了生产转基因植物，可望利用重组酶mRNA而不是DNA，以避免R基因插入植物基因组中，从而确保重组酶只在转化的早期阶段瞬时表达。我们下面描述一种共导入编码R重组酶的mRNA连同含靶RS的隐蔽性荧光素酶DNA构建体，从而产生用于激活荧光素酶基因表达的瞬时重组酶活性。
C.材料和方法：
1.植物材料：
玉米细胞：玉米(Zea mays L.)悬液培养物起始于冷冻保存的胚发生II型愈伤组织，该愈伤组织则选自与B73相关之优秀品系的未成熟胚。迅速融解冷冻的愈伤组织(DiMaio和Shillito，1992)，取大约1g加到补充有30g/L蔗糖和2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的50mL N6液体培养基(2N63S)(Chu，等，1975)中。在暗处，于150rpm轨道振荡器上，25℃保温培养物。每隔7天将2ml堆积体积细胞移入50ml 2N63S液体培养基中，以传代培养悬液培养物。
将200mg等分的细胞均匀分散于无菌durapore滤纸上并置于添加有12％蔗糖(作为渗压剂)的2N6培养基上。轰击前将铺敷的细胞在室温下放置4小时，直到轰击后24小时。
烟草细胞：
使Nicotiana tabacum细胞系NT-1(An，1985)生长在添加2mg/L 2，4-D和蔗糖(30g/L)的Murashige和Skoog培养基(Murashige & Skoog，1962)中，每周向500ml培养瓶内的100ml新鲜培养基中加5ml培种物以传代培养细胞。在旋转振荡器上，以125rpm，27℃保温培养瓶。传代培养后4天取0.5ml等分细胞分散于无菌滤纸(Whatman No.4)上。然后将滤纸移到加有12％蔗糖的MS培养基上，并于轰击前在室温下放置4小时，直到轰击后24小时。
2.质粒
首先将luc连接到T7启动子上，然后将T7/luc片段插入带polyA插入片段的pUC18衍生物中，以构建用于体外转录萤火虫荧光素酶mRNA的T7LUCA50模板(图4A)。为了将T7启动子连接到luc编码区上，从pET3(Rosenberg，等，1987)中切下作为Bgl II片段的T7启动子，并克隆到pUC19的BamHI位点中以形成pAT26。以PCR介导的缺失法用BamHI位点取代从+9到+26的序列以形成pAT27。作为BamHI/Asp718片段从pC1B1711(图4C，见下文)中切下35S前导区—荧光素酶片段，并导入pAT27中以形成T7Luc。将该质粒中的T7/luc插入段作为Xbal/Asp718片段移入pUC18A50X中。pUC18A50X是含有一寡核苷酸对的pUC18衍生物，其中50A残基侧接有Asp718(5′)和Hind III(3′)突出端，用合成的寡核苷酸将其EcoRI位点转变成XbaI位点。
pT7RecA50(图4B)是含T7启动子、35S前导区和重组酶编码区及其PolyA编码区的pUC18A50X衍生物。从pRec(见下文)上切下作为BamHI/Asp718片段的35S前导区/重组酶片段并连接到pAT27中，以形成pT7Rec。然后将pT7Rec中的XbaI/KpnI片段插入到pUC18A50X中以形成pT7Rec A50。
pClB1711(图4C)是pClB710(Rothstein等，1987)的衍生物，在pClB710中，来自pJD204(de Wet，等1987)的荧光素酶编码区作为Hind III-BamHI片段被导入在5′末端带有BamHI/Pstl/Mind III寡衔接头的载体的HamHI位点中，以形成pClB1701。经用pDO435(Ow，等，1986)的片段取代其EcoRV-BamHI片段，将所得质粒的35S启动子/前导区裁剪使其BamHI位准确地位于转录起始点，以形成pClB1700。通过luc基因中的NarI在PstI位点处从pClB1700除去杂合体35S前导区(50bp)/荧光素酶前导区(22bp)，并用相应于58bp 35S前导区和luc ORF之起始区(该构建的细节见Carozzi等，待出版)的合成寡核苷酸置换之。
pRec(图4D)是保留35S启动子、前导区和终止子序列，并具有被重组编码区取代之荧光素酶编码区的pC1B1711的衍生物。为得到该质粒，将来自pGAHR(Onouchi等，1991)的重组酶基因的5′端作为BamHI/Bgl II片段克隆到pSP72(Promega)的相应位点中，并用寡核苷酸5′-TCGAGTTGCATGCAG-3′(SEQ ID NO：9)取代载体Xho1和插入片段Pvu II位点间的DNA，这样重组酶的起始密码子(划下线处)就转变成SphI位点。同样按下述方法修饰pClB1711载体，以在35S前导区的末端加入一个Sph1位点：将含有35S启动子/前导区的Pst1/EcoRI片段亚克隆到pSGpoly11载体中以使其BamHI位点成为单一位点。用BamHI/Xbal消化后，导入含SphI位点的接头：5′-GATCGCAGCATGC(CTAG)-3′(SEQ IDNO：10；括号内部分表示寡核苷酸互补链上的序列)。经3途径连接将所得修饰的Pst1/EcoRI片段回复至pClB1711骨架中。因内部SphI位之故，以两次相继连接导入重组酶基因以代替luc基因。
p1RSLuc(图4E)是pClB1711的衍生物。后者中，已在荧光素酶基因的35S启动子和35S前导区之间导入了31bp RS位点。首先将HindIII和PstI位点间的启动子片段亚克隆到pSGpoly7中，以形成pSG35S，并将相应于下列带RS(黑体)和HindIII位点(划下线)序列的寡核苷酸对连接到单一的BamHI位点中：5′-GATCAAGCTTTTGATGAAAGAATACGTTATTCTTTCATCAA(GATC)-3′  (SEQ IDNO：11)
选择经测序确定其插入的寡核苷酸为顺时针方向的克隆，并经3途径连接将其含RS的XbaI/PstI亚片段回复至pC1B1711的骨架中，以形成p1RSLuc。
p2RSLuc(图4F)是pC1B1711的衍生物。后者中，已在35S启动子的两侧以相反方向导入了合成的RS位点，并且其中整个35S启动子被倒转为与Luc基因的其余部分相反的方向。用Hind III/XbaI消化上述35S启动子亚克隆pSG35S，并导入相应于下列带RS(黑体)和PstI位点(划下线)之序列的寡核苷酸对：5′-AGCTACTGCAGTTGATGAAAGAATACGTTATTCTTTCATCAA(CTAG)-3′(SEQ IDNO：12)
用BamHI消化所得克隆，经连接在上述括号中所述的寡核苷酸对中，导入RS的第二个拷贝。选择其中第二个RS位点的方向与第一个的方向相反的克隆(即5′-GATCAAGCTTTTGATGAAAG-AATACGTTATTCTTTCATCAA(GATC)-3′(SEQ ID NO：13)是呈反时针方向的)。由划下线的非中心对称三核苷酸CGT(或另一链上的ACG)限定回交RS序列的方向。从所得2RS启动子克隆中切下HindIII/PstI片段，并经2途径连接回复到pClB1711骨架中，倒转35S启动子片段的方向以形成p2RSLuc。
3.mRNA合成：
用Hind III在poly(A)延伸部的紧下游将T7luc A50和T7RecA50质粒(图4A和4B)切成线性。用苯酚/氯仿提取并用乙醇沉淀线性化的DNA。用含有[m7G(5′)ppp(5′)]的T7Cap-Scribe试剂盒(Boehringer)中的T7聚合酶体外转录线性化的DNA。对于某些实验，于RNasin(1u/ml，Promega)存在下，用无DNase的NRase(0.03u/ml，Worthington Biochemical)直接处理转录产物(37℃，5分钟)，并在最后用苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀。用琼脂糖电泳法测定mRNA的完整性和浓度。
4.生物轰击工具的消毒
将60mg金颗粒(1.0μm-Biorad，0.3μm-Heraeus)放在100％乙醇和0.1％DEPC中进行消毒。用无RNase水将颗粒冲洗3次，然后重悬于1ml无RNase水中或1ml无RNase50％甘油溶液中。用50μl等分的已制好的颗粒进行6次射击。将微载体浸于100％乙醇和0.1％DEPC中，然后在100％乙醇中淋洗3次并风干。高压消毒制动屏板。
5.核酸沉淀：
按照BioRad的说明书将DNA沉淀到50μl金颗粒的悬液上(60mg/ml)。于下面指出的各种条件下，将mRNA沉淀到50μl金颗粒的悬液上。所有沉淀试剂都是无RNase的，并且在4℃下连续涡旋期间加到金颗粒悬液中。加入所有试剂后，继续涡旋3分钟，然后经简单的微量离心(1分钟)沉降颗粒。去除上清并用冷的100％乙醇将颗粒洗1次，并重悬于60μl100％乙醇中。涡旋该混合物，将10μl等分的混合物用吸管移至微载体园盘上，并在层流罩中风干。
6.向植物细胞微粒递送
使用在离发射组件5.5cm位置有样品的1100-1550psi破裂盘，用颗粒加速器(PDS-1000/He装置)将微粒运送到植物细胞中。将100μm目不锈钢筛放在制动板和组织正中间。轰击靶板1次(烟草细胞)或2次(玉米细胞)。
7.荧光素酶检测：
按照供应商推荐的方法，用Promega的荧光素酶检测系统检测组织提取物中的荧光素酶。于25℃下用Analytical Luminescence2001型发光计检测10秒钟并以光单位表示荧光素酶活性。为了计算比活性，使用Rio-Rad蛋白质检测试剂盒测定蛋白质浓度。
D.结果
1.完整mRNA在金颗粒上的沉淀
为了达到mRNA传送和继后表达的最佳化，试验了几种在金颗粒沉积mRNA的方法，并经琼脂糖凝胶电泳分析沉淀物和上清中mRNA的条件与回收率。各部分别指示“上清”(从初始沉淀部分中直接抽吸的)、“金”(mRNA沉淀后悬浮于水中的金颗粒)和“水洗脱物”(离心悬浮于水中的mRNA包被的金颗粒后的上清)。检查水洗脱物以确定在传送到植物细胞上之后，如何可容易地再溶解已沉淀的mRNA。
当经受加有1.0M CaCl2和16mM亚精胺的DuPont DNA沉淀方法时，mRNA受到严重降解(数据未示出)。亚精胺游离碱很可能引起RNA的碱水解。因此，试验了不加亚精胺的各种不同浓度的CaCl2(1.0M，0.3M和0.07M)能否将mRNA沉淀到金颗粒上。1.0M CaCl2得到良好效果，发现在1.0M CaCl2中，于-20℃下过夜保温带RNA的金颗粒可改善效率达90-100％。经两次乙醇淋洗后比只洗1次，可能由于除掉了CaCl2，所以更容易将mRNA从颗粒溶解到水中。
2.生物轰击传送后荧光素酶mRNA的瞬时表达
为了确定以这种方式沉淀到金颗粒上的mRNA是否能经受得住生物轰击传送过程并可在植物细胞内瞬时发挥功能，将体外合成的荧光素酶mRNA传送到植物细胞中。将CaMV35S前导序列和带有50个腺苷酸残基的poly(A)尾掺入到T7Luc A50模板构建体中，以努力提高荧光素酶在植物细胞中的表达。用1.0M CaCl2将加帽的荧光素酶mRNA沉淀到金颗粒上并用-20℃下保温过夜，然后将颗粒轰击到玉米和烟草悬液细胞中。传送后2.6和24小时进行荧光素酶检测。结果示于下列表3中。到2小时，检到明显的荧光素酶活性。到第6小时活性增加，但到24小时时活性则降低。相反，用Rio-Rad DNA体系沉淀到金颗粒上的，含有35S-荧光素酶基因的DNA质粒的瞬时表达则在24小时为最高。
轰3：用荧光素酶RNA轰击后烟草细胞和玉米细胞中荧光素酶活性的证明。显示轰击后2小时、6小时和24小时荧光素酶活性检测的结果(光单位/μg蛋白)
                说明             时间    烟草      玉米荧光素酶RNA         RNA             2小时    980       2100
                                6小时    5300      2400
                                24小时   700       400pClB1711DNA     荧光素酶DNA         2小时    78500     1000
                                6小时    198000    6900
                                24小时   1034600   14800T7-Luc A50DNA     模板          6小时     30     300无RNA-DNA                       24小时     0     100
3.玉米中R/RS重组酶系统之功能的证明：颠倒反向的启动子
  以打开荧光素酶瞬时表达
为了试验得自Z. rouxii的位点特异性重组酶系统R/RS是否可在玉米中如已报导的如其在烟草中(Onouchi等，1991)一样发挥功能，使用双重瞬时表达检测法，其中需要存在玉米细胞中瞬时表达的R-重组酶来颠倒启动子，以打开共传送的隐蔽性荧光素酶基因的瞬时表达。作为阳性对照，则在烟草细胞中试验双重瞬时表达检测法。借助微粒轰击，将含有35S-重组酶基因的pRec质粒(图4D)与隐蔽性荧光素酶质粒p2RSLuc(图4F)共传送到玉米细胞中。倒转p2RS的启动子应在启动子和luc基因之间留下一个RS(31bp)的拷贝(其对luc表达的影响尚不明确)。因此我们还构建了一个阳性对照质粒p1RSLuc(图4E)，以刺激由重组酶反转p2RSLuc的预期产物。p1RSLuc含有正确定向的但被前导区中的单一RS位点分开的CaMV35S启动子和荧光素酶编码序列。发现p1RSLuc在烟草和玉米中以与pClB1711相似的水平被表达(数据未示出)；因此基因中的RS“足迹”对luc表达只有很小的影响。
用BioRad方法将质粒p2RSLuc和pRec的混合物，以及单独对照质粒p2RSLuc，p1RSluc和p1RSLuc加pRec沉淀到金颗粒上，并轰击到烟草和玉米细胞中(表4)。虽然R-重组酶以到24小时达到至少4％的效率(26,000对597,000光单位/μg蛋白)开启了烟草中的Luc基因，但该方法似乎在玉米中的效率很小，只有0.27％(53对20,000光单位/μg蛋白)。确实发现在玉米中检测到的很低活性是明显的和可再现的。本实验中发现的玉米中的特征限制性重组酶活性可能是核(慢转录、错误切接位点、没有从核中引出mRNA)或胞浆过程(翻译障碍、稀有密码子使用、mRNA不稳定性等)。如果问题出在核中，我们预测可通过生物轰击传送重组酶mRNA回避之，推测可直接向胞浆内导入转录物。
表4：轰击后烟草和玉米细胞中的重组酶活性。由6份烟草细
     胞和3份玉米细胞测得的荧光素酶活性(光单位/μg蛋白)
     结果以平均值和标准差表示
                         烟草            玉米
无DNA                      16            ＜1
p2RSLuc            1300±2300           4±1
p2RS+pRec         26100±2600          53±4
p1RSLuc         852000±91000    15700±4100
p1RSluc+pRec   597000±122000    20700±2600
先前已将Z. rouxii重组酶的靶位点缩窄到包括本文所用31bp回文序列在内的58bp区域(Matsuzaki等，分子和细胞生物学8，955-962(1988))。我们的结果显示，31bp回文序列足可使R基因介导的我们的隐蔽性荧光素酶构建体的启动子倒转。因此，该简短的RS序列对于烟草和玉米中的位点特异性重组是足够的。
4.通过重组酶mRNA活性瞬时表达荧光素酶DNA
在有利于RNA回收的条件下，将p2RSLuc DNA与重组酶mR-NA共沉淀到金颗粒上：1.0M CaCl2并于-20℃下保温过夜。将颗粒轰击到玉米细胞中并在2小时和24小时后检测荧光素酶活性。结果如下列表5中所示。轰击后2小时的荧光素酶表达量小到可忽略不计。到24小时，荧光素酶表达对mRNA重组酶处理和35S-重组酶DNA作用于2RS隐藏性荧光素酶质粒来说都是很明显的。当倒转反应接近平衡时，即以50％“接通”和50％“断开”启动子的方向达到稳态。因此预期荧光素酶表达的最大水平应是p1RSLuc活性的50％。mRNA驱动的倒转达到最大理论值的67％这一极高效率。DNA驱动的倒转的效率也得到显著改善，但p1RSLuc表达的水平却极低，这表明为mRNA建立的沉淀方法对于DNA是很不够的。因此进一步尝试其他沉淀条件，以寻求对DNA和RNA都有效的最适折衷方案。
表5：玉米细胞中重组酶RNA活性的证明。用每μg蛋白质的
光单位表示荧光素酶活性，并在轰击后2小时和24小时检测
                            说明         2小时   24小时p2RSluc                       仅用靶          5.3     6.4p2RSluc+T7-RecA50             仅用靶+模板     4.5     7.8p2RSluc+RecRNA                靶+rec RNA      6.7    34.8p2RSluc+RecDNA                靶+rec DNA      5.0    15.6p1RSluc                       阳性对照       37.4    89.6
5.在金颗粒上有效地共沉淀mRNA和DNA
在改善DNA与mRNA共传送效率的尝试中，我们在沉淀混合物中使用亚精胺进行重复试验，但也包括加入Tris缓冲液以降低pH和尽可能地避免RNA降解。在50mM Tris缓冲液(pH7.5)存在下，使用1.0M CaCl2和2、4、10或16mM亚精胺将DNA和mRNA共沉淀到颗粒上。按上述方法用琼脂糖凝胶电泳法检查核酸沉淀的效率。在所有亚精胺浓度下，完整的DNA和mRNA被有效地沉降在颗粒上(数据未示出)。瞬时表达和稳定转化的一个可能的优点是，以最低浓度可使更多的DNA和mRNA从颗粒上重新溶解到水中。
在最后的完善中，我们改变了Tris缓冲液的浓度并按生物学活性判定法进行效率试验：使用加有5mM(处理A)或50mM(处理B)Tris缓冲液(pH7.5)的2mM亚精胺沉淀Luc mRNA，并轰击到玉米细胞中。在轰击后5小时，处理A和B的瞬时表达水平分别为1，091和8,000光单位/μg蛋白质。使用50mM Tris获得较高的mR-NA活性，这代表了比以前使用1.0M CaCl2和-20℃过夜保温的沉淀条件下效率改善了3-4倍(表1)。
用处理A和B沉淀重组酶mRNA与p2RSLuc DNA，然后将其轰击到玉米和烟草细胞中。于24小时测荧光素酶活性，结果如下列表6中所示。使用5mM和50mM Tris改善了DNA表达，但水平并未达到使用BioRad沉淀方法所达到的水平(表4)。有利于mRNA表达的条件，即使用50mM Tris，则使玉米和烟草中重组酶活性分别达到18.9％和9.4％的最高效率。虽然重组酶效率比表5中所看到的低些，但对于稳定转化DNA表达的较高水平才是重要的。我们的结论是，沉淀RNA可使用Tris缓冲的低浓度亚精胺，并可改善DNA表达。
表6：烟草和玉米细胞中的重组酶mRNA表达。将mRNA
(4μg/6次发射)、p2RSLuc DNA(2μg/6次发射)和p1RSLuc
DNA(2μg/6次发射)轰击到烟草和玉米细胞中。对照实验中
使用从β-葡糖醛酸基因合成的mRNA。在轰击后24小时检
测荧光素酶活性，并以光单位数/μg蛋白表示之。
                 烟草                         玉米
        5mM             50mM            5mM         50mM
p2RSLuc+139±2.8       311±18        19±1.7      20±0.07
RecmRNA
p2RSLuc+57±10         34±2          3.5±0.2     3.8±0.9
mRNA
p1RSLuc+16683±1460    6644±1565     426±5       211±40
mRNA
E.讨论
本文中我们报导了通过颗粒轰击共运送mRNA和DNA的方法，其可使mRNA编码的蛋白质瞬时作用于DNA分子。共运送mRNA和DNA允许将反式作用功能导入细胞内，而没有因稳定转化所造成的持续表达可能性。在短暂的运送期间内，mRNA编码的重组酶只是瞬时有活性的。可用这种方法将供体DNA位点特异性地导入植物基因组的RS位点中，而在所得植物中不伴有重组酶表达的问题。
琼脂糖凝胶电泳和荧光素酶表达研究表明，有利于DNA传送的条件对于mRNA不是最佳的，且反之亦然。经选择不同的沉淀条件，可优化其中之一使靶植物细胞中达到最适水平的重排DNA。沉淀后电泳分析金颗粒上的核酸，证明这是一种对不同沉淀条件的效率进行定性和定量估测的精细手段。可用这种方法进一步改进通过颗粒轰击进行核酸传送的条件。然后，最终的条件判定必须是生物学活性水平，因为凝胶电泳只能查验大体损失。
就已知在有效的转录物表达中起作用的三个特征来设计本研究中外源导入的mRNA分子。在5′末端加帽为结合真核抑制因子这一翻译过程中的早期和基本的步骤提供了识别位点。在体外转录期间，在3′末端上合成有50个腺苷酸残基的poly(A)尾部，因为未腺苷酸化的mRNA在电穿孔的烟草、胡萝卜、玉米和水稻原生质体中翻译效率要比其腺苷酸化的对应物低100-200倍(Gallie等，1989，植物细胞)。也已显示在有5′帽时聚腺苷酸化mRNA的效率提高一个数量级(Gallie，1991)。分子中包括有CaMV35S的非翻译前导序列，并已显示其可提高烟草和玉米中的表达水平(Gallie等，1989植物细胞；Dowson Day等，1993)。
直接向植物细胞运送mRNA为研究细胞功能提供了便利条件。可不依赖于转录因子、加工和向胞浆的运输于体内检查mRNA稳定性和翻译效率。已证明电穿孔(Higgs & Colbert，1993)和聚乙二醇(Gallie，1993植物细胞报告(Plant cell reports))是向植物原生质体中导入mRNA的有用和有效的方法。但这些运送方法只限于原生质体，而生物轰击传送则对许多种植物细胞和器官都是适用的。在转基因植物中稳定地表达的蛋白质可能是不利的或很有害的，这时可从借助生物轰击传送的mRNA瞬时表达这些蛋白质。例如，在R/RS植物中的重组酶表达可导致切割的镶嵌模式，这正象含重组酶基因的植物和含靶位点的植物间的遗传杂交一样，常常导致F1植物中的嵌合重组活动和镶嵌表达(Russell等，1992，Onouchi等，1995)。
为了在作物植物中产生成功改良的转基因构建体，可以使用R/RS系统在旧基因的确切位置上置换新的基因。因此可用带有不同的可选择标志的第二个转基因盒取代第一个转基因盒和其可选择标志(侧翼接有RS位点)。而第二个最终又可被第三个转基因盒取代(其中再次使用第一个可选择标志)。这种方法可减少所需的可选择标志的数目并可避免转基因盒上发生位置效应变异。
在植物中使用位点特异性重组系统为更大程度地控制转基因插入和表达提供了可能。重组酶系统已可使插入发生在基因组中的预定位置，并可绕过所谓的“位置效应”(Fukushige和Sauer，1992；Lakso等，1992；O’Gorman等，1991)。重组酶介导的转基因缺失和颠倒过程得以控制基因表达并除去可选择标志基因(如参见Odell& Russell，1994)。以mRNA的形式导入重组酶活性可通过强制在转化过程中早期重组事件的发生，减少镶嵌的危险来扩展这一应用。此外，mRNA传送可在设计位点特异性整合中提供更大程度的灵活性，以避免向基因组中导入重组酶遗传信息。
实施例4：向烟草和玉米细胞内共轰击编码整合促进性蛋白质
          VirD1和VirD2的mRNA与DNA
如在本发明的详细描述中指出的，可期望在可翻译RNA被降解之前的有限时间里产生通过可翻译RNA传送到待转化真核细胞中的整合促进性蛋白质。
预期从该RNA产生的蛋白质能在其通过正常细胞加工被降解前的有限时间里保留在植物细胞中。因此以可翻译RNA的形式运送整合促进性蛋白质代表了运送这种瞬时作用蛋白质的一种方式。在持续存在这些蛋白可能有不利影响的情况，瞬时运送这些蛋白质可能是有益的。下列实施例描述这种向植物细胞运送VirD1和VirD2蛋白质连同周边接有T-DNA边缘序列之DNA片段的方法。所报告的结果表明。产生了这些Vir蛋白质并为DNA片段提供它们的相关整合促进活性。
所用的植物材料：
玉米细胞：
玉米(Zea mays L.)悬液培养物起始于冷冻保存的胚发生II型愈伤组织，该组织选自于与B73相关的良种(2717)的未成熟胚。使细胞生长于加有30g/L蔗糖和2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的N6液体培养基(2N63S)(Chu等，1975)中。在25℃下暗处，于轨道振荡器上以150rpm保温培养物。每7天取1ml堆积体积细胞移入50ml新鲜2N63S液体培养基中。从迅速生长3天的培养物中取出用于轰击实验的玉米细胞。轰击前，取大约0.5ml堆积体积细胞在7cm滤纸(Whatman，N°4)上真空过滤。
烟草细胞：
使Nicotiana tabacum细胞系NT-1(An，1985)生长于加有2mg/L 2，4-D和蔗糖(30g/L)的Murashige和Skoog培养基中。每周向装在500ml培养瓶中的100ml新鲜培养基内加入5ml接种物以传代培养细胞。27℃下，在旋转振荡器上以125rpm保温培养瓶。传代培养后每4天取0.5ml细胞悬液散布于无菌滤纸(WhatmanNo.4)上。然后将滤纸移到MS培养基上。
质粒构建
1-含有T7启动子和poly A尾的载体的构建
将多接头(SphI-EcoRI-NheI-ClaI-Bgl II-Asp718-HindIII-XhoI-Hind* III，失活Hind III位点)插入pT7RecA50(见实施例3)的SphI-Mind III位点中。然后将寡聚Asp718-A(50)-DraI-Hind III片段插入相应位点，得到pT7-A50。
2-pT7D1A50的构建
将含有预先克隆到pSG5(得自p35SAdh1D1的EcoRI-BamHI片段)之EcoRI-BamHI中的VirD1编码区的EcoRI-BgI II片段插入到用EcoRI和Bg1 II消化的pT7A50中。
3-pT7D2A50的构建：
将VirD2编码区的两个片段，即EcoRI-BamHI(5′末端)和Ba-mI-ClaI(3′末端)克隆到pTA-A50的EcoRI-ClaI中。首先将3′末端作为BamHI-Hae III片段克隆到pBluescript质粒pSK的BamHI-EcoRV中，以将其转变为BamHI-Clal片段。
mRNA合成：
用直接切割poly(A)段紧下游的XhoI将T7D1A50和T7D2A50质粒切成线性。用酚/氯仿提取并用乙醇沉淀切成线性的DNA。使用含有[m7G(5′)ppp(5′)]的T7Cap-Scribe试剂盒(Boehringer)中的T7聚合酶于体外转录线性化的DNA。用琼脂糖凝胶电泳法检测编码VirD1和VirD2的mRNA的完整性与浓度。
生物轰击工具的消毒
将60mg金颗粒(0.3μm-Heraeus)放在100％乙醇和0.1％DE-PC中进行消毒。用无核酸酶的水将颗粒淋洗3次，然后重悬于1ml无核酸酶的50％甘油溶液中。用每等分50μl制备好的颗粒进行6次发射。将微载体浸入100％乙醇中0.1％DEPC中，然后在100％乙醇中冲洗3次并风干。高压消毒制动屏。
核酸沉淀
连续加入0.5μl Tris缓冲液(1M)、50μl CaCl2(2.5M)和2.5μl0.1M亚精胺，以将DNA(1μg)和mRNA(约8μg：4μg virD1和4μgVirD2或8μg作为对照的非特异性mRNA)沉淀到50μg金颗粒悬液(60μg/ml；0.3μm)上。加入所有试剂后，连续涡旋3分钟，然后经短时微量离心(1分钟)沉淀出颗粒。去掉上清并再用冷100％乙醇将颗粒洗1次，然后重悬于60μl 100％乙醇中。涡旋该混合物，将10μl等分的混合物吸移到微载体园盘上，并在层流罩中风干。
微粒运送到植物细胞内
使用在离发射组件5.5cm处置有样品的1100psi破裂盘，用颗粒加速器(PDS-He 1000；DuPont)将微粒运送到植物细胞内。将100μm目不锈钢筛放在制动板和组织正中间。轰击靶板2次。
荧光素酶检测：
按照供应商推荐的方法，用Promega的荧光素酶检测系统检测组织提取物中的荧光素酶。于25℃下用Analytical Luminescence2001型发光计检测10秒钟并以光单位表示荧光素酶活性。为了计算比活性，使用Bio-Rad蛋白质检测试剂盒测定蛋白质浓度。
结果：
于轰击后24小时进行荧光素酶检测。用VirD1和VirD2的mRNA与在35S启动子和荧光素酶编码序列间插入有右边缘序列的p35SRBLuc一起共轰击。在对照实验中，用p35SRBLuc与非特异性mRNA一起轰击。下列表7中示出了初始实验的结果。实施例8中描述继后实验的结果并示于表14中。
表7：用VirD1和VirD2 mRNA轰击植物细胞。插号内的数字指示质粒对mRNA的摩尔比。各实验中也用pGUS共轰击。保温24小时后，制备组织匀浆并检测酶活性。以荧光素酶(Luc)对β-葡糖醛酸酶(Glu)的比例表示活性。分析各独立的轰击结果并将所得数据表示为3次重复的平均值加或减标准差。
                                   烟草           玉米
                                   均值±SD       均值±SDpRB(+)Luc                             9.3  ±0.4    8.6    ±1.0pRB(+)Luc+D1 mRNA                     7.6  ±0.5    8.6    ±0.2pRB(+)Luc+D2 mRNA                     8.4  ±0.1    8.3    ±0.1pRB(+)Luc+D1 mRNA+D2 mRNA(1∶1∶1)    5.6  ±0.1    6.5    ±0.9pRB(+)Luc+D1 mRNA+D2 mRNA(1∶2∶2)    4.3  ±0.2    4.7    ±0.4pCIB1711                              8.8  ±0.8    10.5   ±1.4pCIB1711+D1 mRNA+D2 mRNA(1∶1∶1)     9.2  ±0.5    8.9    ±0.3pCIB1711+D1 mRNA+D2 mRNA(1∶2∶2)     8.6  ±0.4    11.8   ±1.9
结论：
本实验中，将VirD1 mRNA和VirD2 mRNA与pRB(+)LucDNA共运送后，可见荧光素酶活性降低50％(表7)。作为mRNA向植物细胞运送的两种Vir基因似乎有协同作用。这些观察强有力地表明，所见荧光素酶活性的降低是由VirD1和VirD2蛋白质在右边缘序列处进行链特异性切割的结果。
实施例5：植物内产生的玉米基因组中的T链整合
摘要
建立了一种本文中称为“农杆菌轰击”的新的植物转化技术，该技术得以只整合如在T-DNA插入片段中那样不带载体序列的有用基因，并可控制拷贝数。该方法是使用植物表达盒，用以表达通过基因枪装置与含有T-DNA边缘序列(其侧翼接有一可选择标志)的载体共传送的侵入性基因。在目前的研究中，选择小麦矮化病毒(WDV)作为复制载体，以将植物可表达的侵入性基因(VirD1、VirD2和VirE2)和侧接左和右边缘序列的可选择标志基因导入玉米细胞中。发现VirD1和VirD2基因确实可在植物中切割T-DNA边缘序列，并在生物轰击传送后产生T-DNA型插入(“农杆菌轰击”事件)。
引言
农杆菌被广泛用作遗传操作或经转化对植物细胞进行工程改造的工具。转移其病原质粒的特定区域；即T-DNA，并稳定地整合到植物基因组中。T-DNA是由25bp称为边缘序列的同向重复序列定界的(参见Zupan & Zambryski，1995)。定位在两边缘之间的任何DNA序列都可从农杆菌有效地转入植物细胞中。然而，T-DNA转移和整合却受到细菌的宿主范围的限制，其可有效地转化大多数双子叶植物，而只转化很少数单子叶植物(参见Chilton，1994)。
为了填充因农杆菌的有限宿主范围造成的缺口，期望找到一种对单子叶植物进行遗传转化的有效方法。一种可能的方法包括为植物细胞提供重建复合物所需的所有工具，以在植物体内产生T复合物。这些工具是：1)侧翼接有边缘序列的目的基因，和2)处在植物表达盒控制下的侵入性基因。VirD1和VirD2基因产物对于T-DNA加工的关键性步骤是必不可少的(如参见Zupan & Zambryski，1995)。VirD2是链特异性核酸内切酶，其在VirD1的帮助下特异性地识别边缘序列。切割后，VirD2仍共价连接到单链DNA或T-链的5′末端上。T-链受到单链结合蛋白VirE2的保护。所得核蛋白复合物被输出到植物细胞。VirD2含有核定位信号，供以将T-链导向植物细胞的核内。 VirD2可参予T链5′端与植物基因组的连接(Tinland等，1995)。
在本研究中，选择小麦矮化病毒(WDV；Ugaki等，1987)作为植物中的复制载体，以研究植物中T链的形成及其向植物基因组内的整合。使用这样一种载体的目的是为了使双粒病毒组在植物细胞中以高拷贝数增殖，并以高水平表达之。
材料和方法
质粒(有关图解说明参见图5)
pC1B1711是含有由花椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)启动子驱动的萤火虫荧光素酶基因的pUC衍生物。实施例3中已对其作了描述。
pwiBarRBLuc是为稳定地转化玉米悬液细胞而设计的，并含有左边缘序列、由CaMV35S启动子驱动的Bar基因(Thompson等，1987)和荧光素酶基因及插入到启动子和荧光素酶编码区之间的右边缘序列。从pC1B3064(Koziel等，1993)切下作为Hind III-EcoRI片段的bar基因。从pBin19上切下作为B91 II-EcoRI片段的左边缘序列(Bevan，1984)。
首先将来自pTiA6的VirD1和VirD2亚克隆到由CaMV35S启动子(0.5Kb)、Adh1第一内含子(0.5Kb)和胭脂氨酸合酶(nos)聚腺苷酸化区(0.25Kb)组成的表达载体pMF6(Callis et al.，1987)中。将得自pAD1187(Vogel和Das，1992)中的0.6Kb EcoRI-PstI片段和得自pAD1190中的1.8Kb片段克隆到pMF6中，分别产生p35SAdhD1和p35SAdhD2。将含有处于35S启动子控制下之VirD1基因的p35SAdhD1中的XbaI-NotI片段亚克隆到经修饰的pwi-11的NheI-NotI位点中。在pwi-11(Ugaki等，1987)的单-BamHI-Sa1位点中导入一个多接头(NheI-NotI-SpeI-KnpI-Bg1 II)。将含有处于35S启动子控制下之VirD2编码序列的p35SAdhD2中的NatI片段亚克隆到pwi-11的单一NotI位点中。
从含有农杆菌Ti质粒pTiA6(登记号X04784)(Winans等，1987)之3Kb XhoI片段的pW108中切下VirE2编码区。首先将pw108的687bpSacI-SmaI片段克隆到pBluescript KS-(Strata-gene，Inc)的相应位点中，得到pKS3′E2。使得自pw108中的924bpHaeIII-SacI与来自pKS3′E2中的SacI-PstI片段和侧接EcoRI粘端及平端的退火的DNA寡核苷酸对(5′-AATTCATG-GATCTTTCTGGCAATGAGAAATCCAGG-3′，SEQ ID NO：14)相结合，并克隆到pBluescript KS-的EcoRI-PstI位点中，得到pKSE2。然后将复盖整个VirE2编码区的XhoI-PstI片段亚克隆到pMF6的XhoI-PstI中，得到p35SAdhE2。将含有35S启动子、Adh1内含子、VirE2编码区和Nos终止子的NotI-XbaI片段克隆到pwi-11的NotI-NheI位点中。pGUS是含有处于CaMV35S启动子控制下之β-葡糖醛酸酶(GUS)编码序列和蓖麻子过氧化氢酶基因内含子(Ohta等，1990)的pUC衍生物。
玉米悬液细胞：
将玉米(Zea Mays cv. Black Mexican Sweet(BMS))的悬液培养物维持在加有30g/L蔗糖和2mg/L 2，4二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的N6培养基(2N63S)(Chu等，1975)中。从迅速生长3天的培养物中取玉米细胞悬液，用于轰击实验。轰击前，在7cm滤纸上真空过滤(Whatman，N°4)约0.5ml堆积保积的细胞。轰击前将铺敷的细胞在含有120g/L蔗糖的植物琼脂固化的2N6培养基上保留4小时。为了稳定地转化，于轰击后24小时将滤纸移到2N63S固化培养基上。然后以8天间隔期随增加Basta浓度在新鲜培养基上转移滤膜，直到培养物中的大部分细胞停止生长。这种现象是在含8-10mg/L Basta的平皿上经过4-6周选择后逐渐出现的。然后将滤膜上发育的单独的愈伤组织移至加有Basta(10mg/L)的植物琼脂固化的培养基上。在同样培养基上进行两次传代培养后，将大约100mg玉米细胞接种到25mL添加了Basta(10mg/L)的液体培养基中，从中产生用于DNA分离的悬浮培养物。
轰击植物细胞
用上面已沉积了质粒混合物的金微粒轰击组织。在瞬时表达实验中使用pGUS质粒DNA作为内部对照。为进行共转化实验，金颗粒应携带等质量的所有各质粒DNA(每个靶平板有0.5μg各质粒DNA)。为进行稳定地转化实验，共转化混合物含有分别携带侵入性基因的质粒和bar选择质粒，这些质粒的摩尔比为1∶1或2∶1。轰击每个靶平板的每一等份质粒混合物分别含有0.4μg选择标志和0.4μg或0.8μg pwi35SAdhD1和pwiAdh35SD2，和/或pwiAdh35SE2质粒DNA。以10μl的总容积混合适当量的每种DNA，用50μl 2.5M CaCl2和20μl 0.1M亚精胺游离碱沉淀，以使DNA沉积在50μl 0.3μm金微载体上(60mg/ml)。使用在制动屏板下方8cm处置有样品的1100psi破裂盘以PDS-1000He基因枪装置(DuPont)进行微粒轰击。
瞬时表达试验：
按照供应商(Luciferase assay system，Promega)推荐的方法检测组织提取物中的荧光素酶。用GUS-Light试剂盒(Tropix)以化学发光法测定β-葡糖醛酸酶活性。使用Analytical Luminescence2001型发光计于25℃下积分10秒种测定荧光素酶和β-葡糖醛酸酶活性，并以光单位数表示之。
DNA提取和Southern印迹杂交
接种后10天，经过滤收获细胞培养物，并放在液氮中冷冻保存。按已述方法(Hall等，1991)分离DNA。
用EcoRI消化约10μg基因组DNA。在0.7％琼脂糖凝胶上分离后，将DNA转移到Amersham Hybonel膜上并按照制造商(Amer-sham)所述的条件进行杂交。使用Pharmacia的Oligo标记试剂盒，用[α-32P]dCTP标记DNA。Bar探针相当于Bar基因的0.5KbBg1 II片段。luc探针相当于荧光素酶基因的0.7Kb XbaI-EcoRI片段。为了除去探针，于100℃下用0.1％SDS溶液将膜洗提5分钟。
T-DNA/植物DNA接头的克隆
用EcoRI消化得自转基因玉米愈伤组织中的DNA(30μg)，并在0.8％琼脂糖凝胶上进行制备性电泳。从凝胶上切掉相应于欲克隆之片段大小的琼脂糖凝胶片，并用基因清除(gene clean)试剂盒从中提取DNA。然后将这些片段克隆到pUC18的去磷酸化EcoRI位点中。以电穿孔法用连接混合物转化大肠杆菌HB101细胞。使用0.5Kb Bar片段作为探针，以菌落滤膜杂交法鉴定有正确插入片段的质粒。然后用BamHI-EcoRI消化得自阳性克隆的DNA。BamHI在距离右边缘序列3bp处有一个切割位点。将此片段重新克隆到pUC18的相应位点中。使用通用引物分析供体质粒DNA与植物DNA接合处的序列。
结果
试验植物中由VirD1和VirD2基因产物切割边缘序列的瞬时表达检测法
为了研究VirD1和VirD2基因产物在植物中表达时是否能切割T-DNA边缘序列，对试验质粒pwiRBLuc和pRBLuc进行检测分析。它们都含有位于启动子和荧光素酶基因编码区之间的底物T-DNA边缘序列。pRBLuc是pUC衍生物，而pwi是小麦矮化病毒(WDV)衍生的载体，其可在玉米细胞中复制，并由两个互补性有义ORF，即病毒复制所需的C1和C2，及大肠杆菌中的p15A复制原点组成。该载体不含有参予病毒传播和病状发展的ORFV1和OR-FV2(Ugaki等，1991)。由VirD1和VirD2基因产物引入位点特异性切口将导致作为荧光素酶mRNA之模板的DNA链断裂，并因此而减少荧光素酶转录物和酶的产生。用pRBLuc或pwiRBLuc与携带VirD基因(其处于CaMV35S启动子的控制下)的质粒共轰击后，在边缘序列上的任何缺口都应能通过检测荧光素酶活性而定量检测出来。
用pRBLuc DNA或用pwiRBLuc DNA轰击的玉米细胞中实现了荧光素酶基因的高水平表达。将pwiD1 DNA和pwiD2 DNA与pRBLuc DNA或与pwiRBLuc DNA一起共运送到玉米细胞中，可使荧光素酶对GUS活性降低10倍(表8)。共运送pwiD2 DNA与pwiRBLuc DNA也可使荧光素酶对GUS活性降低10倍。这一结果可解释为WDV具有由一个环形单链DNA构成的基因组，它们通过一个居中的双链在被感染细胞核中扩增，前者继后被用作病毒链DNA滚环复制的模板(Saunders等，1991；Stenger等，1991)。已证明VirD2可在体外切割单链寡核苷酸(Pansegrau等，1993，Jasper等，1994)切割双粒病毒组中的ssDNA并不需要VirD1。
对稳定转化体的分析
稳定地转化玉米悬液细胞，以估测在使用基因枪装置共输送VirD1和VirD2基因与其底物DNA之后，VirD2和VirD2基因产物对DNA整合模式的作用。为进行这些实验，我们使用了含有左T-DNA边缘、作为可选择标志的Bar基因，及在启动子和荧光素酶编码区之间插入了右T-DNA边缘的35SRBLuc基因的pwiBarRBluc和pBBarRBLuc。对VirD介导的整合事件的筛分是基于被转化克隆中没有荧光素酶活性，这是因为从pwiBarLuc中或从pBarRBLuc上切断T-DNA进而排除Luc编码区而产生的。这种在Vir基因产物作用于边缘序列产生T-链后出现事件被称为“农杆菌轰击”事件。相反，“生物轰击事件”则是玉米基因组中的插入片段，其代表了借助生物轰击工具将基因传送到植物细胞内之后正常出现的事件。
用比例为1∶1∶1或1∶2∶2的pBarRBLuc或pwiBarRBLuc质粒DNA连同pwiD1和pwiD2DNA包被的微粒轰击玉米悬液细胞。作为对照组，还单独用pwiBarRBLuc和pBarRBLuc质料进行轰击。通过在含Basta的培养基上培养来选择稳定的转化体。轰击后3-4周每个滤膜上平均出现了8-10个Basta抗性克隆，但对每个平板上的一小组克隆作进一步分析。当p35AdhE2质粒DNA与其他侵入性基因共传送时，每个滤膜回收到稍高数目的愈伤组织(12-15个)。可根据经分析表明不表达荧光素酶的Basta抗性愈伤组织的总数对Basta愈伤组织的总数的比例来粗略估计农杆菌轰击事件的频率。按照这个标准，当pBarRBLuc与pwi35SAdhD1和pwi35SAdhD2质粒DNA共运送时，农杆菌轰击事件的发生率约为20％。当所用的靶质粒是pwiBarRBLuc时，这一发生率提高到大约40％。当pwi35SAdhE2也与上述质粒共运送时，这一发生率增加到约50％。
Southern分析
就分子水平来说，代表农杆菌轰击事件的插入片段应与Bar探针杂交，而不与luc探针杂交。此外，在农杆菌轰击事件中，被导入的DNA和植物DNA间接头的序列准确地相应于T链的右边缘末端。在同一植物中可发生两种类型的事件，但这样的克隆一般被记为基于荧光素酶活性存在的生物轰击事件。以Southern杂交法研究生物轰击和假定的农杆菌轰击事件，以检测每种类型插入的发生频率。
对用下列质粒DNA轰击后得到的Basta抗性愈伤组织细胞系进行Southern印迹杂交：(i)pwiBarRBLuc DNA；(ii)pwiBarRBLuc、pwiD1和pwiD2 DNA，(iii)pwiBarRBLuc、pwiD1、pwiD2和pwiE2DNA，(iv)pBarRBLuc DNA和(v)pBarRBLuc、pwiD1、pwiD2 DNA。
如在表9中总结的，印迹分析揭示出三组转基因愈伤组织细胞系：(i)其中一些愈伤细胞系与bar和neo探针杂交的愈伤组织细胞系；(ii)其中某些插入片段只与bar探针杂交，而某些插入片段则与两种探针杂交的愈伤组织细胞系；(iii)具有只与bar探针杂交的插入片段的愈伤组织细胞系。第一组愈伤组织可能不包含农杆菌轰击事件。第二组愈伤组织可能包含两种类型的事件；农杆菌轰击事件和生物轰击事件。第三组愈伤组织只表现有假定的农杆菌轰击事件。例如，在pwiBarRBLuc、pwiD1和pwiD2转化实验分析的10个转基因玉米中，有3个包含生物轰击事件，6个含有假定的农杆菌轰击事件，1个兼有两者。分立细胞系的杂交模式独特地显示，愈伤组织细胞系具有独立的转化过程。
对假定的农杆菌轰击事件的分子分析
经检测被整合DNA和植物DNA之间的接头序列，证实假定的农杆菌轰击事件的性质。核苷酸序列分析表明，其中每个片段都含有右边缘/植物DNA接头。如预期的生物轰击事件那样，被插入片段的右终点完全相同于T-DNA之右边缘序列的切割位点。
表8：玉米细胞中VirD1和VirD2的活性
 质粒                                           均值    ±SD
pwi35SRBLuc                                     15.0    ±1.2
pwi35SRBLuc+pwi35SAdhD1(1∶1)                   8.1     ±1.1
pwi35SRBLuc+pwi35SAdhD2(1∶1)                   0.7     ±0.3
p3wi35SRBLuc+pwi35SAdhD1+pwi35SAdhD2(1∶1∶1)   0.2     ±0.1
p35SRBLuc                                       17.6    ±1.2
p35SRBLuc+pwi35SAdhD1+pwi35SAdhD2(1∶1∶1)      0.8     ±0.1
p35SRBLuc+p35SAdhD1+p35SAdhD2(1∶1∶1)          1.0     ±0.2
无DNA                                           0.2
借助生物轰击装置将DNA运送到玉米细胞中。括号内数字代表质粒的比例。保温24小时后，制备组织匀浆并测定酶活性。作为DNA转移效率的对照，各次轰击中均包括表达β-葡糖醛酸酶(GUS)的质粒(pGUS)，并以荧光素酶对GUS活性的比例来表示报导基因的活性。分析独立的轰击并以三次重复的平均值加或减标准差的形式给出有关数据。
表9：对用靶质粒和/或Vir基因轰击BMS细胞后回收的Bastar抗性愈伤组织的分析质粒                      愈伤组织    荧光素        Southern    事件类型
                                  酶活性pwiBarRBLuc(0.2μg)        16         15Luc(+)        5        5B
                                  1Luc(-)pwiBarRBLuc+pwiD1+pwiD2    19         10Luc(-)        10       3B，6A，1A+B(0.4μg+0.4μg+0.4μg)                9Luc(+)         9        8B，1B+ApwiBarRBLuc+pwiD1+pwiD2    11         8Luc(-)         4        1B，2A，1B+A(0.4μg+0.8μg+0.8μg)                3Luc(+)         1        1BpwiBarRBLuc+pwiD1+pwiD2+   21         10Luc(-)        4        1B，2ApwiE2                                 11Luc(+)        5        5B(0.4μg+0.4μg+0.4μg+0.4μg)pBarRBLuc(0.4μg)          10         9 Luc(+)        2        2BpBarRBLuc+pwiD1+pwiD2      38         7 Luc(-)        4        4B(0.4μg+0.4μg+0.4μg)                31 Luc(+)       5        4B，1B+A
括号内数字表示用于转化实验的DNA的浓度。
B＝生物轰击事件；A＝农杆菌轰击事件；Southern＝用Southern
杂交法分析的愈伤组织的数目；愈伤组织＝分析荧光素酶活性
的愈伤组织的数目。
实施例6：玉米和烟草细胞中VirD1和VirD2在单一启动子下
         的表达
为了实现细菌基因在植物细胞中的表达，细菌基因的个别编码区必须融合到分立的植物启动子上，因为真核启动子不允许在植物细胞中转录。虽然使每个基因融合到一个分立的启动子上是可以作得到的，但目前还存在几个困难：例如，如将同一启动子用于不同的基因则可出现基因沉默。本实施例中已证明的一个战略是将两基因串联连接到一个植物启动子上。该多基因信息包括均属于农杆菌之VirD操纵子的VirD1和VirD2两个编码序列。
由VirD操纵子的5′半侧编码的两个多肽在启动DNA加工，以从农杆菌向植物细胞转移T-DNA中起着关键性作用。VirD2是链特异性内切核酸酶，其在VirD1的帮助下于第三和第四个碱基之间切割T-DNA边缘序列。VirD2保持共价连接到T-DNA的5′末端，并据信引导T-DNA进入植物细胞，并参予使T-DNA的5′端连接到植物基因组中。已表明当钩连到植物启动子上时，这两个蛋白质是有功能的。
在本实施例中，工程化构建由单个植物启动子驱动的VirD1和VirD2基因组成的表达单位，已证明其在植物内是能功能性表达的。作为转录融合体或翻译融合体连接个别基因，并显示在后一种情况下可在植物细胞中保留它们的酶促活性。
材料的方法
D1-D2或D2-D1融合体的构建
构建两种类型的融合体：
1)转录融合体：
使用在VirD1和VirD2编码区之间存在有小间隙(33nt)的VirD1和VirD2编码区的序列。将p35SD1的1.1Kb Not1-Pst1片段和p35D2的1.5Kb Pst1-Xba1片段克隆到pSK+的Not1-Spe1位点中，以得到p35StpD1D2。
2)翻译融合体：
也通过一个中间序列使侵性基因VirD1和VirD相融合，以充许两蛋白质自由运动，并使之对翻译后切割敏感。对于p35SD1D2来说，VirD1编码区是在融合体的5′端，而p35SD2D1则在启动子之后直接含有VirD2区。所有修饰都得到DNA测序的证实。
p35SD1D2的构建：为了产生编码VirD1和VirD2的VirD1-VirD2融合体，去除VirD1的终止密码子和VirD2的起始密码子。为此将一个退火的DNA寡核苷酸对克隆到pUC21的EcoR1-HindIII中，在p35SD1的0.48Kb EcoR1-BanI片段上和p35SD2的0.25Kb Pvu1-Hind III片段上侧连上BanI粘端和pvuI粘端。退火的核苷酸对由下列寡核苷酸组成：5′-GTGCCTTGCCTTCTACTCCCCCAACTCCCTCTCCTAGCACGCCTCCGACACCTAGCCCCG
AT-3′(SEQ ID NO：15)和5′-CGGGGCTAGGTGTCGGAGGCGTGCTAGGAGAGGGAGTTGGGGGAGTAGAAGGCAAG-3′
(SEQ ID NO：16).
然后将包括VirD1编码区、接头和VirD2编码区之5′端的该构建体的EcoRI-PstI片段插入到p35SD2的EcoRI-PstI位点中，得到p35SD1D2。
p35SD2D1的构建：同样，质粒pD2D1含有在pD2D1的5′端上含有VirD2编码区，其在框内通过同样的中间序列连接到VirD1编码区上。首先从重叠寡核苷酸重新构建VirD1的N末端编码序列，以在5′端提供EcoR1位点，并删去VirD1的第一个密码子(5′-AATTCTCAAAACACACCAGAGTCACGTCGAGTGAGACT-GCCATCAACCAGCAT-3′；SEQ ID NO：17)。将这些退火的寡核苷酸克隆到pBluescript KS+(Stratagene，lnc)中，以产生pKS5′D1。然后将p35SD2中的1.3Kb Sac II-BfaI片段和Sac II-EcoR1切割的pKS5′D1质粒DNA与一接头连接，所说的接头在5′端包含Bfal位点的改变，从而使之缺少VirD2的天然终止密码子。
(5′-TATCCTTCTACTCCCCCAACTCCCTCTCCTAGCACGCCTCCGACAC-CTAGC-3′(SEQ ID NO：18) 和   5′-AATTGGCTAGGTGTCGGAGGCGTGCTAGGAGAG-GGAGTTGGGGGAGTAGAAGGA-3′(SEQ ID NO：19))，然后将包括VirD2编码区、接头和VirD1编码区之5′端的EcoRI-ClaI片段克隆到p35SD1的EcoR1-Cla1位点中，得到p35SD2D1。
试验质粒的构建：
pwBarBLuc、pRBLuc的构建如实施例5中所述。
植物材料：
如上面实施例中所述制备以生物轰击装置进行轰击的玉米(B73衍生株)和烟草(NT-1)悬液细胞。
轰击植物细胞：
用已沉积了质粒混合物的金微粒轰击组织。为进行共转化实验，金颗粒携带有0.5μg或1μg试验质粒，以及总共2μg(烟草细胞)或4μg(玉米细胞)辅助质粒。混合适当量的pUV18质粒DNA以使混合物中保有等质量的质粒DNA(见表10和表11)。用2.5MCaCl2和0.1M亚精胺游离碱将DNA沉淀到50μl 0.3μm金微载体上(60mg/ml)。使用在制动屏架下方8cm处理有样品的1550psi破裂盘，以PDS-1000 He生物轰击装置(DuPont)进行微粒轰击。
瞬时表达试验：
按照供应商(Luciferase assay system，Promega)推荐的方法检测组织提取物中的荧光素酶。于25℃用Analytical Luminescence 2001型发光计(积分10秒钟)检测光单位并以其表示荧光素酶活性。为了计算比活性，使用Bio-Rad蛋白检测盒检测蛋白质浓度。
结果和讨论：
融合设计策略：
VirD1和VirD2基因是从根癌农杆菌的章鱼氨酸pTiA6质粒衍生的。p35StpD1D2携带的转录融合体含有VirD1和VirD2的编码区，连同存在于VirD操纵子中的天然中间序列。
p35SD1D2和p35SD2D1携带的翻译融合体含有通过中间序列融合的VirD1和VirD2编码区，所说的中间序列充许两蛋白质自由运动并且对翻译后切割敏感。
多基因在植物内的功能性表达
为了检测转录和翻译融合体的功能性表达，用生物轰击装置将p35StpD1D2、p35SD1D2和p35SD2D1与试验质粒共运送到植物细胞内。试验质粒含有插入启动子和荧光素酶编码区之间的右边缘序列，以这样一种方式使链特异性切割发生在该序列之内，从而导致荧光素酶表达的降低。在玉米细胞检测两种类型的试验质粒：pUC衍生质粒(pRBLuc)和小麦矮化双粒病毒组衍生的质粒(pwBar-RBLuc)。
为了试验VirD1和VirD2基因通过T-DNA边缘序列影响转录的能力，首先用共运送的试验质粒与分别由不同的启动子驱动的VirD1和VirD2基因瞬时转化玉米和烟草细胞。将p35SD1 DNA和p35SD2 DNA与pRBLuc或pwBarRBLuc DNA共运送后，观察到烟草和玉米组织中荧光素酶活性分别为对照组水平的0.3％和1％(表10，11和12)。
转录融合体的两种Vir基因在一起似乎稍有活性。用生物轰击装置共运送等量的pRBLuc和p35StpD1D2 DNA(1∶1比例)，在烟草中使荧光素酶活性约降低到对照组的57％(表12)，玉米细胞中降低到60-80％(表10和11)。p35StpD1D2质粒与试验质粒的比例较高(2∶1)时，荧光素酶活性没有明显的进一步降低。
使用携带翻译融合体的p35SD1D2质粒进行的类似实验显示，烟草细胞(表12)和玉米细胞(表10和11)中荧光素酶活性分别降低到对照组的约12％和22-47％。当p35SD1D2质粒和试验质粒的比例较高(2∶1)时，所有情况下荧光素酶活性都进一步降低到大约2-5％。
倒转翻译融合体p35SD2D1中侵入性基因的天然定向，产生与使用p35SD1D2相似的结果(表10、11和12)。
这些观察强有力地表明，翻译融合体在植物内是有功能的。
表10：用pUC衍生载体作为试验质粒时，转录和翻译融合体在
玉米细胞中的活性
运送到玉米细胞中的质粒            荧光素酶活性      ％对照
pRBLuc+pUC18                      12333±543        100
(1μg+4μg)
pRBLuc+p35SD1+p35SD2              182±43           1.5
(1μg+2μg+2μg)
pRBLuc+p35SD1D2+pUC18             5744±290         47
(1μg+2μg+2μg)
pRBLuc+p35SD1D2                   300±12           2.4
(1μg+4μg)
pRBLuc+p35SD2D1+pUC18             5920±813         48
(1μg+2μg+2μg)
pRBLuc+p35SD2D1                  329±59          2.6
(1μg+4μg)
pRBLuc+p35StpD1D2+pUC18          7312±1091       60
(1μg+2μg+2μg)
pRBLuc+p35StpD1D2                6436±615        52
(1μg+4μg)
表10：用生物轰击装置将DNA运送到玉米细胞中。括号内的数字表示质粒的比例。保温24小时后，制备组织匀浆并检测荧光素酶活性，该活性以光单位/μg蛋白质表示。分析独立的轰击结果，并以3次重复的平均值加或减标准差来给出所得数据
表11：用双粒病毒组衍生载体作为试验质粒时，转录和翻译融合体在玉米细胞中的活性
运送到玉米细胞中的质粒          荧光素酶活性      ％对照
pwBarRBLuc+pUC18                531±38           100
(1μg+4μg)
pwBarRBLuc+p35SD1+p35SD2        5±3              1
(1μg+2μg+2μg)
pwBarRBLuc+p35SD1D2+pUC18       115±23           22
(1μg+2μg+2μg)
pwBarRBLuc+p35SD1D2             32±4             6
(1μg+4μg)
pwBarRBLuc+p35SD2D1+pUC18       60±10            11
(1μg+2μg+2μg)
pwBarRBLuc+p35SD2D1             19±3             3.6
(1μg+4μg)
pwBarRBLuc+p35StpD1D2+pUC18     431±115          81
(1μg+2μg+2μg)
pwBarRBLuc+p35StpD1D2           380±53           72
(1μg+4μg)
脚注内容同表10。
表12：转录和翻译融合体在烟草细胞中的活性
运送到玉米细胞中的质粒           荧光素酶活性      ％对照
pRBLuc+pUC18                     21611±760        100
(0.5μg+2μg)
pRBLuc+p35SD1+p35SD2             60±1             0.3
(0.5μg+1μg+1μg)
pRBLuc+p35SD1D2+pUC18            2494±44          12
(0.5μg+1μg+1μg)
pRBLuc+p35SD1D2                  1179±183         5.4
(0.5μg+2μg)
pRBLuc+p35SD2D1+pUC18            1603±422         7.4
(0.5μg+1μg+1μg)
pRBLuc+p35SD2D1                  1071±113         5
(0.5μg+2μg)
pRBLuc+p35StpD1D2+pUC18          12240±1417       57
(0.5μg+1μg+1μg)
pRBLuc+p35StpD1D2                11627±2491       54
(0.5μg+2μg)
脚注内容同表10。
实施例7：VirE2在转化效率中的作用
在玉米细胞中试验“修复”载体增加农杆菌轰击发生频率的能力。所使用的这一载体含有位于T-DNA结构内，右边缘序列左侧的聚腺苷酸化信号。
在实验的第二部分，VirE2与VirD1和VirD2基因共运送。已显示该蛋白质是有效地转移T-DNA所需要的，但不影响T-DNA产生(Stachel等，1986)。VirE2在体外协同和非特异地结合到单链DNA上。VirE2可参予保护T链。VirE2蛋白质是诱导侵入性基因后在根癌农杆菌中产生的最丰富蛋白质(Stachel等，1986)。因为VirE2具有核定位信号，并且是在植物内被识别的(例如参见Zupan和Zambryski，1995)，所以期望在植物内引入该基因时获得较高的转化率。
材料和方法：
在右边缘处含有聚腺苷酸化信号的载体pAVM1的构建(见图6-15)
A.pC1B1711-HN的构建
用BamHI消化pC1B1711并重新连接成1711δB，其中EcoR1位点(现为独有的)被切断并经插入一个同时产生的HindIII和NotI位点而被破坏。经序列分析，我们鉴定出一个其中这些位点的朝向(在Sac1位点后)是KpnI然后是HindIII的克隆。为了恢复原质粒中丢失的部分，我们首先插入以正确方向携带Luc编码区的大的BamHI片段，形成1711-HN-B；然后我们用原pC1B1711的相应部分取代其Xba1插入片段，重新导入丢失的前导序列。
B.在EcoRI和Luc编码区末端的BamH1位点之间导入合成的寡核苷酸边缘序列，我们将Not1/Cla1片段亚克隆到pBluescript中，以在插入片段中提供单一的EcoR1和BamHI位点。插入边缘寡核苷酸后形成pBS-NC-RB，我们将其经修饰的Not1/Cla1插入片段送回pC1B1711-HN骨架上，形成pC1B1711-HN-RB。
C.将左边缘T-DNA插入pUbiPATδ1中
为了除掉pUC1AC的内含子中的不需要的EcoR1位点，我们用Cla1消化该质粒(生长于dam-菌株SCS110中)，去掉两个包括EcoR1位点的小片段。然后引入一个用来去掉Cla1位点并造成Sph1位点的寡核苷酸，形成质粒pUbiPATδ1。我们将pTiT37(在从一个末端计起的68碱基对位置上携带有T-DNA左边缘的胭脂氨酸型Ti质粒，Yadav，N. S.，Vanderleyden，J.，Bennet，D. Barnes，W. M.，和Chilton，M. -D.，1982)的EcoRI片段29克隆到嵌合PAT基因之末端上的新的单一EcoR1位点中。短的同向重复序列侧接胭脂氨酸Ti质粒上的T-DNA(美国国家科学院院报79，6322-6326)，形成LB-UbiPATδ1。
D.pAVM1的组装
切掉pC1B1711-HN-RB的HindIII插入片段，并连接到LB-UbiPATδ1的HindIII位点中。经基因作图，我们鉴定了一个左和右边缘侧接PAT基因，并且有转移所需正确方向的构建体。所得到的质粒具有Luc基因启动子和处在T-DNA之外的编码区，但其终止子正好在右边缘之内。
玉米悬液细胞：
使玉米(Zea Mays cv. Black Mexican Sweet(BMS))的悬液培养物维持于加有30g/L蔗糖和2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的N6培养基(2N63S)中(Chu等，1975)。从迅速生长3天的培养物中取出用于轰击实验的玉米细胞悬液。轰击前，在7cm滤纸(Whatman，N°4)上真空过滤约0.5ml堆积体积的细胞。轰击前将铺敷的细胞在含有120g/L蔗糖的植物琼脂固化的2N6培养基上25℃放置4小时。为了稳定地转化，轰击后24小时将滤纸转到2N63S固化培养基上。然后以8天间隔期相继将滤膜转移到有渐增浓度的Bastar的新鲜培养基上，直到培养物中的大部分细胞停止生长为止。这种情况一般是在含有8-10mg/L Basta的平板上选择4-6周后出现。然后将滤纸上发育的独立的愈伤组织转到加有Bas-ta(10mg/L)的植物琼脂固化的培养基上。在同样培养基上两次亚培养后，将大约100mg玉米细胞接种到25ml添加有Basta(10mg/L)的液体培养基中以制备用于分离DNA的悬液培养物。
轰击植物细胞：
用其上面沉积有质粒混合物的金微粒轰击组织。共转化混合物含有比例为1∶1.3的携带侵入性基因的质粒和bar选择质粒。轰击每个靶平板的每一等份质粒混合物均由0.6μg选择标志和各0.8μgp35SAdhD1及p35SAdhD2和/或p35SAdhE2质粒DNA组成。以总容积10μl昆合适当量的各种DNA，并用50μl 2.5M CaCl2和20μl0.1M亚精胺游离碱使之沉淀于50μl 0.3μm金微载体(60mg/L)上。使用制动屏架下方8cm处置有样品的1100psi破碎盘，用pDS-1000He生物轰击装置(DuPont)进行微粒轰击。
DNA提取和Southern印迹杂交
接种后10天过滤收获细胞培养物并将其置于液氮中冷冻保存。按已述方法(Hall等，1991)提取DNA。
用EcoR1消化大约10μg基因组DNA。在0.7％琼脂糖凝胶上分离后，将DNA转移至Amersham Hybond+膜上并按照制造商(Amersham)所述的条件进行杂交。使用Pharmacia的oligo标记试剂盒，用[a-32P]dCTP标记DNA探针。PAT探针相应于pat基因的0.7Kb PstI片段。luc探针相应于荧光素酶基因的0.7Kb XbaI-EcoRI片段。为了除去探针，于100℃下将膜用0.1％SDS的溶液冲洗5分钟。
结果
分析稳定的转化体
对玉米悬液细胞进行稳定地转化，以估计在用生物轰击装置随侵入性基因共运送pAVM1载体后该载体对转化效率的影响。前种载体具有处于右边缘内的35S启动子，其方向可以很容易地为表达其中插入了T链的反义基因提供一种手段。在这一新型的载体中，35S启动子被右边缘内的35S终止子取代，其取向应是使其插入在3′末端，从而得以“修复”靶基因。
为进行本实验而使用了pAVM1，该载体含有右T-DNA边缘、作为可选择标志的PAT、35S终止子、右T-DNA边缘，和处于T-DNA样结构以外的荧光素酶基因。我们称为“农杆菌轰击事件”的是那些DNA插入玉米基因组中发生在Vir基因产物作用于边缘序列，产生T链之后。相反，我们称为“生物轰击事件”的则是那些代表了借助生物轰击装置将基因运送到植物细胞中后出现的正常事件的DNA插入。区分生物轰击事件和假想的农杆菌轰击过程的最初标准是被转化的克隆中没有荧光素酶活性，这是由于从pAVM1中切掉T-DNA进而排除Luc编码区引起的。
用pAVM1质粒DNA连同p35SAdhD1、p35SAdhD2和/或p35SAdhE2DNA包被的微粒轰击玉米悬液细胞。作为对照，还单独用pAVM1轰击。在含Basta培养基上选择稳定的转化体。单用pAVM1轰击后每个滤膜约可回收到5-8个愈伤组织。用pAVM1、p35SAdhD1、p35SAdhD2和p35SAdhE2 DNA轰击玉米细胞后4-5周每个滤膜平均可回收10个Basta抗性克隆。每个平板只对某些克隆作进一步分析。用pAVM1、p35SAdhD1和p35SAdhD2 DNA轰击的滤膜上出现大约2-3个愈伤组织。这种差异可能是起因于VirE2基因的存在，该基因编码参予保护T链的单链DNA结合蛋白。已显示该蛋白质是有效地转移T-DNA所必需的，而T-DNA生成则不需要其参予(Stachel等，1986)。
可以用经分析表明有表达荧光素酶的Basta抗性愈伤组织的总数对总Basta抗性愈伤组织数的比例来估计农杆菌轰击事件的发生频率。按照这一标准，当pAVM1与p35SAdhD1和p35SAdhD2DNA共运送时，农杆菌轰击事件的发生频率约为25％。当pwiE2也与上述质粒共运送时这一频率稍有增加，达到约50％。
Southern分析
在分子水平上，代表农杆菌轰击事件的转基因应与Bar探针杂交，而不与luc探针杂交。两种事件可发生在同一植物细胞中，但基于荧光素酶活性的存在，这样的克隆一般应记为生物轰击事件。用Southern杂交法研究生物轰击和假想的农杆菌轰击事件，以估测每种类型插入的发生频率。用(i)pAVM1 DNA和(ii)pAVM1，p35SAdhD1、p35SAdhD2和p35SAdhE2 DNA轰击后得到Basta抗性愈伤组织，并对其DNA进行Southern印迹杂交。结果总结于下列表13中。
表13：对用pAVM1加或不加Vir基因轰击玉米细胞后回收的
Basta抗性愈伤组织的分析
质粒             愈伤组织   荧光素酶活性   Southern    事件类型
pAVM1                14       14Luc(+)       3            3B
pAVM1+D1+D2          10       2Luc(-)      未分析
                              8Luc(+) pAVM1+D1+D2+E2            44        14Luc(-)       7        4A，1A+B，2B
                                 30Luc(+)       3        3B
结论：
a)用pAVM1轰击时农杆菌轰击事件对生物轰击事件的比例约为35％，并且是在常见的20-40％这一百分比范围内。
b)VirE2的存在可改善转化效率。
因为VirE2具有核定位信号并且是在植物内被识别的(如参见Zupan和Zambryski，植物生理学107：1041-1047(1995))，所以当将该基因导入植物中时获得了预期的较高转化率。表达VirE2基因的转基因植物能够弥补农杆菌的VirE突变，从而为VirE2蛋白质在植物细胞中起重要作用提供了证据。
实施例8：VirD1和VirD2 mRNA轰击玉米细胞
本实施例描述向植物细胞运送作为mRNA的VirD1和VirD2基因，及它们作用于T-DNA边缘序列的活性。
材料和方法：
玉米细胞：
从选自B73相关优良品系之未成熟胚的冷冻保存的胚发生II型愈伤细胞开始制备玉米(Zea mays L.)的悬液培养物，并使之生长于添加有30g/L蔗糖和2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的N6液体培养基(2N63S)(Clu等，1975)中。在暗处25℃下，于150rpm轨道振荡器上保温培养物。每7天从悬液培养物中取1ml堆积细胞移入50ml新鲜2N63S液体培养基中进行亚培养。取3天龄迅速生长的培养物，作为用于轰击实验的玉米悬液。轰击前，在7cm滤纸(Whatman，N°4)上真空过滤约0.5ml堆积细胞。
烟草细胞：
将Nicotiana tabacum细胞系NT-1培养在添加有2mg/L 2，4-D和蔗糖(30g/L)的Murachige和Skoog培养基中。向加在50ml培养瓶中的100ml新鲜培养基内加入5ml接种物，将细胞每周亚培养1次。在125rpm的旋转振荡器上，于27℃下保温培养瓶。亚培养后4天取0.5ml等份的细胞散布于无菌滤纸(Whatman，N4)上。然后将滤膜移到MS培养基上。
质粒构建：
含有T7启动子和polyA尾的载体的构建：
将含有下限制性位点(SphI-EcoRI-NheI-ClaI-Bgl II-Asp718-Hind III-XhoI-Hind* III，最后的HindIII作为杀伤位点)的多接头插入到pT7RecA50的SphI-Hind III位点中。然后将指定的Asp718-A(50)-Dra1-Hind III寡聚体插入到相应位点中，得到pT7-A50。该寡聚体的互补链具有下示结构：
                      (SEQ ID NO：20)5′-    CGAATTCGCTAGCATCGATAGATCTGGTACCAAAGCTTCTCGAGT    -3′
    |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||3′-GTACGCTTAAGCGATCGTAGCTATCTAGACCATGGTTTCGAAGAGCTCATCGA-5′
                      (SEQ ID NO：21)
pT7D1A50的构建
将D1编码区的EcoR1-Bgl II片段预先克隆到pSG5(来自p35SAdh1D1的EcoR1-BamHI片段)的EcoR1-BamH1中。
pT7D2polyA的构建：(参见图16-26)
A.分离修剪的片段
用EcoRI从p35SD2上切下VirD2编码区，以制备性凝胶电泳法分离并从琼脂糖中提取DNA。内部位点使得有必要在亚片段上对VirD2的5′和3′末端进行修剪。用PvuI修整从5′末端分离的HindIII/EcoRI片段，以产生片段A。用HaeIII修整从3′末端分离的BamH1/EcoRI片段以产生片段C。经Hind III/BamHI消化得到中央片段B。
B.片段A和B的克隆
用HindIII和SphI消化载体pTC182，并将片段A加上SphI末端的衔接头寡核苷酸(其恢复起始密码子)连接到适当的位置，以形成pTC182-A。用HindIII和BamHI消化该质粒，并将片段B连接到A的3′端。切下结合的片段AB并在用BamHI/Sph1消化所得质粒pTC182-A-B后进行凝胶纯化。
C.在修饰的pUC21载体中克隆片段AB和C
去掉BamHI和XbaI之间pUC21多接头的部分并用寡核苷酸对取代之，以恢复大多数位点，包括我们的构建中所需要的Bg1 II位点。用BamHI和EcoRV消化所得到的质粒pUC21-X，并将片段C连接到该载体中以形成pUC21-C。然后用BamHI和Sph1消化该产物并连接如上分离的片段AB，以构建VirD2。用Sph1和Bg1 II消化所得到的质粒pUC21-VirD2后，我们用凝胶纯化了含有修剪的VirD2 ORF的片段ABC。
D.将VirD2克隆到T7转录载体中
用SphI和Bg1 II消化上述转录载体T7polyA，并将片段ABC(＝VirD2)连接到T7启动子下游和42A残基区段之上游的位置。
mRNA合成：
用XhoI(其在poly(A)段的紧下游切割)将T7D1A50和T7D2A50质粒切成线性。用苯酚/氯仿提取并用乙醇沉淀线性化DNA。使用含有[m7G(5′)ppp(5′)]和T7Cap-Scribe药盒(Boehringer)中的T7聚合酶体外转录线性化DNA。以琼脂糖凝胶电泳法测定mRNA的完整性和浓度。
生物轰击工具的消毒：
将60mg金颗粒(0.3μm-Heraeus)放在100％乙醇和0.1％DE-PC中消毒。将颗粒用无核酸酶的水淋洗3次，然后重悬于1ml无核酸酶的50％甘油溶液中。50μl等分的制备好的颗粒用于6次发射。将微载体浸没在100％乙醇和0.1％DEPC中，然后用100％乙醇洗3次并风干。高压消毒制动屏。
核酸沉淀：
依次加入0.5μl Tris缓冲液(1M)、50μl CaCl2和2.5μl 0.1M亚精胺，以使DNA(1μg)和mRNA(约8μg∶4μg D1、4μgD2或8μg非特异性mRNA)沉淀在50μl金颗粒悬液(60mg/ml；0.3μm)上。所有试剂都加完之后，连续旋转3分钟，之后经简单离心(1分钟)沉降出颗粒。去掉上清并用冷的100％乙醇将颗粒洗一次，然后重悬于60μl100％乙醇中。旋转该混合物，抽取10μl等份加到微载体盘上并在层流罩中风干。
向植物细胞微粒运送
使用在离发射组件5.5cm处置有样品的1550psi破碎盘，以颗粒加速器(PDS-He1000；DuPont)将微粒运送到植物细胞。100μm目不锈钢屏放在制动板和组织正中间。轰击靶平板2次。
荧光素酶检测：
使用Promega的荧光素酶检测系统，按供应商推荐的方法检测组织提取物中的荧光素酶和Gus。于25℃下用Analytical Lumines-cence 2001型发光计测光单位(10秒钟)，并以其表示荧光素酶和β-葡糖醛酸酶活性。
结果：
轰击后24小时进行荧光素酶检测试验。D1和D2的mRNA与p35SRBLuc(其含有插入在35S启动子和荧光素酶编码序列之间的右边缘序列)共轰击。在对照实验中，将p35SRBluc与非特异性mRNA一起轰击，或者D1和D2mRNA与不含任何边缘序列的pLUC DNA共运送。结果显示于下列表14中。
表14：向玉米细胞中共传递D1和D2 mRNA与靶质粒
靶质粒±mRNA                            均值     ±SD     ％对照
pRB(+)Luc                               3.2      ±0.3    100％
pRB(+)Luc+D1mRNA                        2.7      ±0.2    84％
pRB(+)Luc+D2mRNA                        1.4      ±0.2    44％
pRB(+)Luc+D1mRNA+D2mRNA(1∶1∶1)        0.6      ±0.2    18％
pRB(+)Luc+D1mRNA+D2mRNA(1∶2∶2)        0.4      ±0.1    12％
pRB(+)Luc+p35SAdhD1+p35SAdhD2(1∶1∶1)  0.1      ±0.1    3％
pLuc                                    3.6      ±0.2    100％
pLuc+D1mRNA+D2mRNA(1∶1∶1)             3.7      ±0.3    102％
保温24小时后，制备组织习浆并检测酶活性。各次轰击中均包括表达β-葡糖醛酸酶(GUS)的质粒pGUS作为DNA转移效率的对照，并以荧光素酶对GUS活性的比例表示报导分子的活性。分析各独立的轰击，结果以3次重复的平均值加或减标准差表示。根据荧光素酶对β-葡糖醛酸酶活性(用对照质粒观察到的那些活性)的比例确定％对照值。
结论：
与pRB(+)Luc DNA一起共运送D1 mRNA和D2 mRNA后，观察到荧光素酶活性降低10倍。作为mRNA向植物细胞运送的两种Vir基因似乎具有协同作用。这些观察结果强有力地表明，荧光素酶活性的降低似乎是Vir基因产物在右边缘序列上进行链特异性切割的结果。
mRNA运送的优点在于其效应必然是瞬时的。没有辅助质粒的外来DNA。
实施例9：原生质体中的“农杆菌轰击”
转化技术是遗传操作和改善作物品种的重要工具(Raskin，1996)。多种转化系统可将外来遗传材料直接转移到能够产生能育植物的细胞内。这些系统包括借助电穿孔或直接DNA摄入将DNA运送到原生质体中、微注射到细胞内，以及用DNA包被的微粒轰击进行基因转移(参见Morrish和Fromm，1992)。在已有的运送系统中，有一个整合外来基因的多个拷贝的倾向。因此需要有一种方法，能够形成一种在没有载体序列的情况整合外来基因的简单模式。
本文描述的称为“农杆菌轰击”的转化方法有可能产生以简单模式插入外来基因并且不包括载体序列的转基因材料。该方法是使用适于侵入性基因的植物表达盒，所说的基因在形成和保护与含有侧接可选择标志之T-DNA边缘序列共运送的T-DNA(VirD1、VirD2和VirE2)中起着关键性作用。在前面的实施例中，已证明在借助生物轰击装置将所有这些元件运送到植物细胞中时，该技术是可行的。
本实施例中，我们利用直接向原生质体运送DNA的方法运送所有这些元件。我们已发现，以这种方式运送的VirD1和VirD2基因产物确实可产生T-DNA型插入事件，并且VirE2基因产物的卷入可增加转化的频率。
材料和方法
质料
pClB1711是pUC衍生物，其含有由花柳菜花叶病毒35S(CaMV35S)启动子驱动的荧光虫荧光素基因，并已在实施例3中作了描述。为了导入T-DNA边缘，将相应于LBA5269(Van Haaren等，1989)之右边缘序列的两个合成的寡核苷酸退火，得到双链体：5′-ATCCGGCAGGATATATACCGTTGTAATTCTGCA-3′(SEQID NO：22)。将此侧接BamHI-Pst1位点的双链体在启动子和荧光素酶编码序列之间插入pC1B1711的相应位点中，得到pRBLuc(参见图2)。pNeoRBLuc含有左边缘序列、新霉素磷酸转移酶基因(npt II)和荧光素酶基因，后者带有插入到启动子与来自pRB(+)Luc的荧光素酶编码区之间的右边缘序列。作为2.2Kb SacII-HindIII)片段从质粒pBin19上切下由nos(胭脂氨酸合酶)启动子驱动的nptII基因。将这些片段一起插入pRB(+)Luc的Xba1-HindIII位点中。pNeoLuc是没有插入在CaMV35S启动子和荧光素酶编码区之间的右边缘序列的pNeoRBLuc的等同物。
将来自pTiA6的VirD1和VirD2基因亚克隆到表达载体pMF6(Callis等，1987)中，该载体由CaMV35S启动子(0.5Kb)、Adh1第一内含子(0.5Kb)和胭脂氨酸合酶(nos)聚腺苷酸化区(0.25Kb)组成(图1)。将相当于VirD1编码序列的来自pAD1187的EcoR1-Pst1片段克隆到pMF6中，得到p35SAdhD1。从pAD1190(Ghai &Das，1989)中切掉作为1.8Kb EcoR1片段的VirD2编码序列并克隆到pMF6中，得到p35SAdhD2。
从含有农杆菌Ti质粒pTiA6(登记号X04784)(Winans等，1987)之3Kb XhoI片段的pw108中克隆VirE2编码区。首先将pw108的687 bp SacI-Sma1片段克隆到pKS(-)的相应位点中，得到pKS3′E2。将pw108中的924bp HaeIII-SacI与pKS3′E2中的SacI-PstI片段和侧接EcoRI粘端及平端的退火的DNA寡核苷酸对(5′-AATTCATGGATCTTTCTGGCAATGAGAAATCCAGG-3′；SEQ ID NO：23)结合，并克隆到pBluescript KS-(Stratagene，Inc)的EcoR1-Pst1位点中，得到pKSE2。然后将复盖整个VirE2编码区的Xho1-Pst1片段亚克隆到pMF6的Xho1-Pst1中，得到p35SAdhE2。
植物材料
玉米悬液细胞：
将玉米(Zea Mays cv Black Mexican Sweet(BMS))的悬液培养物保持在添加有30g/L蔗糖和2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的N6培养基(2N63S)(Chu等，1975)中。用于实验的玉米细胞悬液取自3天龄迅速生长的培养物。
按照“黑墨西哥甜玉米的组织培养应用，生物研究用的玉米”，W. F. Sheridan编著，Charlottesville，Va.植物分子生物学会(1982)p.385-388中所述的方法，从玉米近交系BMS(Black mex-ican sweet)的细胞悬液培养物中分离原生质体。转化后2天在培养基中加入巴龙霉素(200mg/L)。将转化后约4周显现的独立的小愈伤组织转移到加有200μg/ml巴龙霉素的新鲜平板上。在同样培养基上进行两次亚培养后，将大约100mg玉米细胞接种到25ml加有200μg/ml巴龙霉素的液体培养基中以制备悬液培养物。用如表15中所述的不同浓度的pNeoRBLuc DNA加或不加p35SAdhD1、p35SAdhD2和/或p35SAdhE2转化原生质体。
DNA提取和Southern印迹杂交
接种后10天过滤收获细胞培养物并冷冻在液氮中。按已述方法(Mall等，1991)分离DNA。
用EcoR1消化约10μg基因组DNA。在0.7％琼脂糖上分离后，将DNA转移到Mybond+膜上并按照制造商(Amersham)所述的条件进行杂交。使用Pharmacia的寡标记试剂盒，用[α-32P]dCTP标记DNA探针。neo探针相应于npt11基因的0.3KB PstI-SphI片段。luc探针相应于荧光毒酶基因的0.7Kb XbaI-EcoRI片段。为了去掉探针，于100℃下将膜用0.5％SDS溶液浸洗5分钟。
结果：
实验设计
设计载体以便可借助遗传学试验筛选VirD1和VirD2介导的插入事件。载体pNeoRBluc含有来自Ti质粒的天然左边缘、nos-NPT11-nos(带有胭脂氨酸合酶启动子和终止子序列的嵌合新霉素磷酸转移酶II基因)、35S启动子、合成的右边缘序列和荧光素酶编码区。通过通常机制转化的巴龙霉素抗性玉米愈伤组织一定总是含有荧光素酶基因并表达荧光素酶。相反，没有表达任何荧光素酶的克隆才是VirD1和VirD2介导的切除和T链整合的候选产物。为了在植物细胞中表达VirD1、VirD2和VirE2，它们各自的开放读框(ORF)都应处在CaMV35S启动子的控制之下。
分析稳定的转化体
用不同比例的pNeoRBluc质粒DNA与p35SAdhD1和p35SAdhD2和/或p35SAdhE2 DNA转化原生质体。作为对照，还单独运送pNeoRBLuc质粒。根据在含巴龙霉素培养基上的生长情况选择稳定的转化体。当pNeoRBLuc与VirD1和VirD2基因共运送时，每个板上平均出现120个巴龙霉素抗性克隆，但只对其中30个愈伤组织作进一步分析。当向侵入性基因的混合物中加入VirE2时，巴龙霉素抗性愈伤组织的数目可达到250个。
分析每组实验中的30个巴龙霉素抗性克隆，发现大约10-40％不表达荧光素酶，提示VirD1-VirD2介导的整合发生频率约为10-40％。这可能对“农杆菌轰击”事件的发生频率估计不足，因为在90％的荧光素酶阳性组中包括含两种插入片段的克隆。从加或不加VirE2基因的实验中回收的不表达荧光素酶的愈伤组织频率没有明显差异。
对转化体克隆的Southern印迹分析：
对用下列质粒轰击后得到的对照巴龙霉素抗性愈伤组织系的DNA进行Southern印迹杂交分析：(i)单独pNeoRBLuc；(ii)pNeoR-BLuc质粒与p35SAdhD1和p35SAdhD2 DNA共转化；(iii)pNeoR-BLuc质粒与p35SAdhD1、p35SAdhD2和p35SAdhE2DNA共转化。
用EcoRI消化基因组DNA，结果由pNeoRBLuc质粒产生一个与neo和luc探针同源的3.9Kb片段。EcoRI片段具有一个在pNe-oRBLuc的T-DNA结构部分内的位点，且另一个在荧光素酶编码区中。
从单用pNeoRBLuc转化原生质体回收的对照转化体呈现出预期的3.9Kb EcoR1片段，该片段与luc和neo两探针杂交。第一个片段的拷贝数大于5，而可见有重排的和/或分离的DNA的多个拷贝。
表15中给出对共运送pNeoRBLuc与p35SAdhD1、p35SAdhD2和/或p35SAdhE2质粒DNA后得到的巴龙霉素抗性愈伤组织系的DNA所作Southern印迹分析结果。为进行Southern印迹分析，选择经试验显示荧光素酶活性为阴性的愈伤组织系。例如，对实验#8中回收的8个转基因玉米系进行Southern杂交分析，4个表现有生物轰击事件，4个表现有假想的农杆菌轰击事件。正如根据与包括在同一杂交滤膜中的拷贝数标准品所作比较判定的，估计每个转化体基因组的NPTII基因拷贝数一般为1或2个。包含与neo探针和luc探针杂交的基因组DNA的愈伤组织系比单用pNeoLuc DNA转化后回收的愈伤组织系呈现出较少的拷贝。
表15：转化实验
                               愈伤
实验#      靶质粒±vir基因          Luc(-)/30  Southern  事件类型
                               组织
#1         pNeoRBLuc           3
           (5μg)
#2         pNeoRBLuc           20
           (10μg)
#3         pNeoRBLuc           85             4[luc+]     4B
           (20μg)
#4         pNeoRBLuc+p35AdhD1  101  5Luc(-)   2           1NT，1B
           +p35AdhD2
           (5μg+20μg+20μg)
#5         pNeoRBLuc+p35AdhD1+ 123  5Luc(-)               1B+A，
           p35AdhD2                                       3B，1NT
           (10μg+20μg+20μg)
#6     pNeoRBLuc+p35AdhD1+    147     6Luc(-)      6       1A，2B，
       p35AdhD2                                            3NT
       (20μg+20μg+20μg)
#7     pNeoRBLuc+p35AdhD1+219         9Luc(-)      5       2A，1B
       p35AdhD2+p35AdhE2                                   1NT
       (5μg+20μg+20μg+20
       μg)
#8     pNeoRBLuc+p35AdhD1+    245     14Luc(-)     9       4A，4B，
       p35AdhD2+p35AdhE2                                   1NT
       (10μg+20μg+20μg+
        20μg)
#9     pNeoRBLuc+p35AdhD1+   268      7Luc(-)      1       1A
       p35AdhD2+p35AdhE2
       (10μg+20μg+20μg+
        20μg)
表中给出了转化后4周记录的个体愈伤组织的数目。
结论：
这些结果清楚地表明，本技术可简化运送到原生质体的外来基因整合的模式。VirD1-VirD2介导的整合发生频率约为20-30％。此外，加入VirE2可改善转化效率。本技术将有助于回收被转化的植物，目的基因整合的模式简单且没有多余DNA。
实施例10：经直接轰击未成熟合子胚来转化CG00526基因型玉
米并使用膦丝菌素作为选择剂分离被转化的愈伤组织
制备使用生物轰击装置轰击的DNA
可按照Koziel等人(生物技术11：194-200，1993，其中相关部分列为本文参考文献)所述的方法转化玉米的未成熟胚或I型愈伤组织。
基本上按照已公开的方法，于微米大小金颗粒(一般1.0mm或0.3mm直径)存在下经化学沉淀制备用于微粒轰击的DNA。除了金颗粒外，也可使用其他微米大小的致密颗粒，如钨或铂颗粒。在一改进的方法中，首先将颗粒本身悬浮在水中并进行超声处理以制备之。然后离心沉淀超声处理的颗粒并重新悬浮于50％甘油的含水溶液中。然后将按这种方法制备的颗粒以50μl容积平均分配到每管约含有约3mg金颗粒的各试管中。根据待用质粒数、其大小，及所需的DNA终浓度，以不同的量向每个试管中加入DNA。
然后，依次向各管内加入约50μl 2.5M CaCl2和约20μl 0.1M亚精胺，同时涡旋约3分钟。然后轻轻离心DNA/金复合物。去除上清。用250μl无水乙醇将颗粒洗一次，再次离心沉淀，并重新悬浮于约75μl新鲜无水乙醇中。以这种方法制备的每管DNA/金复合物可使用PDS-1000/He装置“发射”6次。于无振动环境中将10μl充分悬浮的DNA/金复合物吸移到各个微载体片上。
在PDS-1000/He装置中，因打破在不同程度压力下应用的塑料园盘而释放出一股氦。例如，可以获得在每平方英吋氦200、450、650、900、1000、1350、1550、1800、2000和2200磅的猝发压力下破坏的单个盘或组合盘。这股气体推动微载体片后者由不锈钢屏制动。屏可以是有不同筛目的，例如10×10、16×16、24×24等。其他设定是微载体飞行距离、缺口距离和颗粒飞行距离。制造商提供的使用说明书中详细描述了这些设定。一般使用的缺口距离约为5.5mm，微载体飞行距离约为10mm，颗粒飞行距离约为6-9cm。此外，可将—屏或隔板插在制动屏和靶板之间的颗粒飞行距离之内。这样的屏可干扰从膨胀气体发出的冲击波，从而减小对靶的损害。在一个实例中，使用有大约100μm开口的不锈钢屏。也可使用有其他开口大小和材料组分的屏。
可以按不同图形将未成熟胚或I型胚发生愈伤组织安排在靶板上。通过一系列实验，建立了适于不成熟胚的最佳排布图形。在一种最佳图形中，将未成熟胚按直径约2cm的环形排列。将未成熟胚放在环的外周。每个靶板上放大约25个未成熟胚。此外，靶板可与微载体发射组件有一定的角度。这样可保证使未成熟胚的向基部被散出颗粒最大程度地饱和。未成熟胚的向基部分是产生胚发生反应的部分。
在轰击I型胚发生愈伤组织的一个实例中，将愈伤组织放在营养培养基上约1cm直径环的外周上。轰击装置的机械设定可放在与上面列举的轰击未成熟胚的设定相似或相同的位置上。
应指出的是，靶图形和发射枪设定是相互关联的。换句话说，在微粒轰击装置上使用其他机械设定可产生受体组织在靶板上的其他最佳排布。机械设定和靶图形的其他组合包括在本发明范围内。
转化
自花授粉后约14获得未成熟胚。以每靶板25个未成熟胚，在含有能够诱导和支持胚发生愈伤组织生成之培养基的不同靶板间分配未成熟合子胚。用使用PDS1000/He装置(BioRad)，用质粒p35SAdhD1、p35SAdhD2和T-DNA靶质粒(pbarRBLuc或pAVM1)的混合物轰击未成熟合子胚。也可包括用作VirE2基因的可表达DNA。基本上按照如上描述的已公开方法使质粒沉淀在0.3或1μm金颗粒上。使用1100-1300磅的猝发压力，每个靶板用质粒和金颗粒制剂射击两次。
因为质粒pbarRBluc含有编码抗膦丝菌素(Phosphinothricin)抗性的嵌合基因，所以可用该物质体外选择被转化的细胞。轰击后1天以3mg/L应用这种选择剂，并总共维持8-12周。于1mg/L膦丝菌素存在下繁殖如此得到的胚发生愈伤组织。
按照美国专利申请07/759,243(申请日1991年9月13日，其相关部分列为本文参考文献)中所述，用氯酚红(CR)试验检查所有愈伤组织的抗PPT抗性。该试验是利用pH敏感指示剂染料显示那些于PPT存在下生长的细胞。生长的细胞引起培养基中的pH改变，并使指示剂氯酚红从红变黄。该试验中很容易鉴定出表达抗PPT抗性基因的植物。用PCR法检验CR试验阳性的植物，以分析bar基因的存在。
检验含有可选择标志基因的植物中荧光素酶的表达情况。没有荧光素酶活性即指示愈伤组织可能是农杆菌轰击的。农杆菌轰击事件是其中DNA以与T-DNA插入相类似的方式整合到玉米DNA中，而没有农杆菌的介导。用Southern印迹法分折荧光素酶基因表达呈阴性的植物。经Southern印迹分析观察到的带形表明这些转化体的性质是农杆菌轰击的。
实施例11：经直接轰击未成熟合子胚转化A188基因型玉米并使用膦丝菌素作为选择剂分离被转化的植物
使188基因型玉米的复穗状花序自花授粉并于大约12-14天后得到未成熟合子胚。将未成熟合子胚铺敷在2JMS+5Dc加Ag-NO3培养基上。16-20小时后，将未成熟合子胚转移到含有12％蔗糖的同一培养基上。3-5小时后，借用PDS1000/He装置用质粒p35SAdhD1、p35SAdhD2和T-DNA靶质粒(pbarRBluc或pAVM1)的混合物轰击未成熟合子胚。轰击材料中还可包括VirE2基因的可表达DNA。基本上按照如上文描述的BioRad已公开的方法使质粒沉淀在0.3或1μm金颗粒上。使用1100-1300磅的氦猝发压力传送颗粒。每个靶板用质粒和金颗粒制剂击射两次。保温过夜后，将未成熟胚转移到新鲜的含有2％蔗糖和5-10mg/L膦丝菌素的培养基上，并大约每两周在同样培养基上亚培养一次。于1mg/L膦丝菌素存在下再生如此得到的胚发生愈伤组织。
用氯酚红(CR)试验法检验所有再生植物的抗PPT的抗性。对PPT有抗性的叶片改变培养基中的pH并使指示剂从红变黄。该试验中很容易鉴定出表达抗PPT抗性基因的植物。用PCT法分析CR试验呈阳性的植物中bar基因的存在。
检测含有可选择标志基因的植物中荧光素酶基因的表达情况。没有荧光素酶活性即指示愈伤组织可能是农杆菌轰击的。农杆菌轰击过程是其中DNA以与T-DNA插入相类似的方式整合到玉米DNA中，而没有农杆菌的介导。用Southern印迹法分析荧光素酶基因表达呈阴性的植物。Southern印迹上的带形表明这些转化体的性质是农杆菌轰击的。
实施例12：经轰击由未成熟合子胚衍生的I型愈伤组织以转化CG00526基因型玉米并使用膦丝菌素作为选择剂来分离被转化的愈伤组织
使用标准培养技术从未成熟合子胚得到I型愈伤组织。为了进行基因运送，经用解剖刀片切割而制备约300mg I型愈伤组织，用含有18％蔗糖的标准培养基淋洗3次并直接放在也含18％蔗糖的半固体培养基上。大约4小时后，使用BioRad的PDS-1000/He生物轰击装置轰击组织。使用BioRad推荐的标准方法将质粒沉淀到0.3或1μm金颗粒上。基因运送后大约16-20小时，将愈伤组织转移到含有2％蔗糖和10mg/L膦丝菌素(作为Basta)的标准培养基上。在选择培养基上亚培养8周，然后将存活并生长的愈伤组织移至标准再生培养基上以生产植物。
用氯酚红(CR)试验法检验所有再生的植物对PPT的抗性。该试验利用pH敏感性指示剂染料显示那些可在PPT存在时生长的细胞。生长的细胞使培养基的pH发生改变并使指示剂从红色变成黄色。用该试验很容易鉴定出表达抗PPT抗性的植物。用PCR法分析CR试验呈阳性的植物中有无bar基因。
检测含可选择性标志基因的植物中荧光素酶的表达。没有荧光素酶活性即指示愈伤组织可能是农杆菌轰击的。农杆菌轰击事件是其中DNA以与T-DNA插入相类似的方式整合到玉米DNA中，而没有农杆菌的介导。以Southern印迹法分析荧光素酶基因表达阴性的植物。Southern印迹上的带形表明这些转化体的性质是农杆菌轰击的。
实施例13：经轰击从未成熟合子胚衍生的易碎悬液培养细胞来转化衍生于B73的玉米基因型的愈伤组织，并使用膦丝菌素作为选择剂分离被转化的愈伤组织
按美国专利No.5,350,689(其列为本文参考文献)所述方法，平板接种衍生于B73的基因型未成熟胚，得到易碎愈伤细胞。在N6培养基中每周亚培养悬液培养物。通过710μm不锈钢滤网过滤，收获亚培养后3-5天的细胞，然后将其分布于Durapore(见CGC1280/81)膜的表面上。每个47mm直径膜的表面上分布约0.4g细胞。将膜放在含12％蔗糖的N6培养基上，3-5小时后借助PDS1000/He装置用携带vir基因的质粒(35SAdhD1，p35SAdhD2)和T-DNA靶质粒(pbarRBlue或pAVM1)的混合物轰击。向细胞运送等量(1∶1∶1)的VirD1、VirD2和35S-bar靶T-DNA(两次冲击总共各1.3μg)，或过量Vir基因(2次冲击2∶2∶1μg)。这些实验中也可包括VirE2基因的可表达DNA。
基本上按照如前所述的BioRad的公开方法将质粒沉淀到0.3或1μm金颗粒上。和用1100-1300磅的氦猝发压力传送颗粒。每个靶板接受两次冲击。过夜保温后，将带有愈伤组织的膜移到含有2％蔗糖和膦丝菌素(3mg/L)的新鲜维持液中。3周后将每个滤膜上的细胞分散于3块含10mg/L Basta 2N6培养基的平板表面上。4周后，将生长的集落移到含3mg/L Basta的新鲜2N6中，一周后用氯酚红(CR)试验法检验如此得到的愈伤组织是否有抗PPT抗性。该试验利用pH敏感性指示剂染料显示于PPT存在下生长的细胞。生长的细胞使培养基的pH发生改变，并使指示剂由红色变成黄色。该试验很容易鉴定出表达抗PPT抗性的愈伤组织。使培养基变成黄色或桔黄色的阳性叶片表明至少对PPT有一定的抗性，然后将它们放在含5mg/L Basta的2N6培养基上。
用PCR法分析CR试验阳性的愈伤组织是否有bar或PAT基因。
表16：鉴定玉米愈伤组织的被转化的细胞系
处理           黄色       桔黄色
对照(1)        0           1
对照(2)        0           0
2∶2∶1        0           1*
1∶1∶1(1)  21          2§
1∶1∶1(2)     4           0
表中(1)和(2)是进行两次重复处理
    *该集落是荧光素酶阳性的
    §其中之一是推测的农杆菌轰击事件
检测含可选择性标志基因的愈伤组织中荧光素酶的表达。没有荧光素酶活性即指示愈伤组织可能是农杆菌轰击的。农杆菌轰击事件是其中DNA以与T-DNA插入相类似的方式整合到玉米DNA中，而没有农杆菌的介导。以Southern印迹法分析荧光素酶基因表达阴性的愈伤组织。Southern印迹(图)上的带形表明这些转化体的性质是农杆菌轰击的。
表17：分析用适于将T-DNA运送到玉米细胞的构建体轰击玉
米细胞后回收的玉米愈伤组织细胞系荧光素酶检测       分析的数目    农杆菌轰击  生物轰击      农杆菌/
               (Southern)     (假定的)                  生物轰击luc+         12     6                         6luc-         11     9             4           3             2未分析的    5
该表显示，本实验中分析的23个细胞系中，11个没有荧光素酶活性，并且用Southern印迹法分析的9个细胞系中，4个只含有T-DNA样插入片段，2个含有T-DNA样插入片段和使用非生物(本例中为生物轰击)方法运送DNA后发现的典型插入片段。
实施例14：经轰击由未成熟合子胚衍生的1型愈伤组织来转化CG00526基因型玉米的愈伤组织，并使用膦丝菌素作为选择剂以分离被转化的愈伤组织
按照Koziel等人(生物技术11：194-200，1993)所述的方法平板接种基因型CG00526的未成熟胚，得到愈伤组织。
每周将培养物亚培养于维持液(2DG4+0.5mg/L 2，4-D)上，亚培养后2-3天取出细胞块并在含12％蔗糖的2DG4培养基上放3-5小时。每个板上以8-10mm直径的环形排列16片靶愈伤组织。使用携带Vir基因(35SAdhD1，35SAdhD2)的质粒和T-DNA靶质粒(pbarRBluc或pAVM1)，借助PDS1000/He装置轰击愈伤组织。将等量(1∶1∶1)的VirD1、VirD2和35S-bar靶T-DNA(2次冲击，总共各1.3μg)或过量的Vir基因(2∶2∶1μg作两次冲击)运送到细胞内。也可包括VirE2基因的可表达DNA。
基本上按照如上所述的BioRad公开的方法将质粒沉淀到0.3或1μm金颗粒上。使用650磅的氦猝发压力传送颗粒。每个靶板接受2次冲击。保温过夜后将愈伤组织转移到含有2％蔗糖的新鲜维持液中。再过2周后将希望要的愈伤组织(显示有典型的I型形态)移到含有120mg/L Basta(PPT)的维持液中亚培养。4周后，将生长的愈伤组织移到含30mg/L Bastar的新鲜维持液中。
经过共8周选择性亚培养愈伤组织后，将存活并生长的愈伤组织转移到标准再生培养基上以产生植物。用氯酚红(CR)检验法检验再生的植物是否有抗PPT抗性。该试验利用pH敏感性指示剂染料显示于PPT存在下生长的细胞。生长的细胞改变培养基的pH并使指示剂由红色变成黄色。该试验很容易鉴定出表达抗PPT抗性的愈伤组织。用PCR法分析CR试验呈阳性的植物细胞中是否存在bar基因。
检测含可选择性标志基因的植物中荧光素酶的表达。没有荧光素酶活性即指示愈伤组织可能是农杆菌轰击的。农杆菌轰击事件是其中DNA以与T-DNA插入相类似的方式整合到玉米DNA中，而没有农杆菌的介导。以Southern印迹法分析荧光素酶基因表达阴性的植物。Southern印迹上的带形表明这些转化体的性质是农杆菌轰击的。
实施例15：用Vir基因和T-DNA靶序列转化玉米原生质体
美国专利No.5,350,689中描述了从玉米的悬液培养物制备原生质体及用DNA进行转化的方法。
例如用于转化原生质体的DNA可由质粒p35SAdhD1、p35SAdhD2和T-DNA靶质粒(pbarRBluc或pAVM1)的混合物组成。也可包括VirE2基因的可表达DNA(见实施例7)。从原生质体回收愈伤组织，并按已述方法，使用膦丝菌素作为选择剂再生植物。一般在用DNA处理后10天开始施用3-5mg/L PPT，以选择被转化的原生质体衍生的细胞。
用氯酚红(CR)试验法检验所有再生的植物对PPT的抗性。该试验利用pH敏感性指示剂染料显示那些可在PPT存在时生长的细胞。生长的细胞使培养基的pH发生改变并使指示剂从红色变成黄色。用该试验很容易鉴定出表达抗PPT抗性的植物。用PCR法分析CR试验呈阳性的植物中有无bar基因。
检测含可选择性标志基因的植物中荧光素酶的表达。没有荧光素酶活性即指示愈伤组织可能是农杆菌轰击的。农杆菌轰击事件是其中DNA以与T-DNA插入相类似的方式整合到玉米DNA中，而没有农杆菌的介导。以Southern印迹法分析荧光素酶基因表达阴性的植物。Southern印迹上的带形表明转化体具有一个T-DNA样插入片段。可以进行边缘序列的克隆和测序，以进一步证实插入片段的性质。
虽然上文已描述了本发明的有限数目的实施例，但本领域技术人员会很容易理解到，在没有从实质上背离本发明的新技术和优点的前提下可对这些实例作许多改动。因此，所有这类改动都应包括在本发明的范围之内。
实施例中所列参考文献的目录Ahl Goy，P. & Duesing J.H.(1995)生物技术13，454-458。Albert，H.，Dale，E.C.，Lee，E. & Ow，D.W.(1995)植物杂志7，649-659。Albright，L.M.，Yanosky，M.F.Leroux，B.，Ma D.，& Nester，E. W.(1987)细菌学杂志169，1046-1055。An，G.(1985)植物生理学79，568-570。Bevan，M.(1984)核酸研究12，8711-8721。Callis，J.，Fromm，M.E.，Walbot，V.(1987)Genes & Dev. 1，1183-1200。Chilton M-D.(1993)美国国家科学院院报90，3119-3120。Chu，C.C.，Wang，C.C. Sun，C.S. Hsu，C.，Yin，K.G.，Chu，C.Y.& Bi，F.Y.(1975)Sci. Sin. 18，659-668。Chyi，Y.S.，Jorgensen，R.A.，Golstein，D.，Tanksley，S.D. &Loaiza-Figueroa，F.(1986)分子普通遗传学(Mol. Gen. Genet.)204，64-69。Citovsky V.，Warnick，D. & Zambryski，P.(1994)美国国家科学院院报91，3210-3214.deWet，J.R，Wood，K.V.，DeLuca，M.，Helsinki，D.R.和Subra-mani，S.(1987)，”萤火虫荧光素酶基因的结构和在哺乳动物细胞中的表达”，分子细胞生物学7：725-737。DiMaio，J.J. & Shillito，R.D.(1992)组织培养方法杂志(J. TissueCult. Methods)12，163-169。Dowson Day，M.J.，Ashurst，J.L.，Mathias，S.F.，Watts，J.W.，Wilson T.M.A.，& Dixon，R.A.(1993)植物分子生物学23，97-109。Durrenberger，F.，Crameri，A.，Hohn，B.，& Koukolikova-Nico-la，Z.(1989)美国国家科学院院报86，9154-9158。Filichkin，S.A. & Gelvin，S.B.(1993)分子微生物学(Mol.Micro-biol.)8，915-926。Fukushige，S. & Sauer，B.(1992)美国国家科学院院报89，7905-7909。Gallie，D.R.，Lucas，W.J. & Walbot，V.(1989)植物细胞1，301-311。Gallie，D.R.(1991)Genes & Dev. 5，2108-2116。Gallie，D.R.(1993)，植物细胞报道(Plant Cell reports)13，119-122。Ghai，J. & Das A.(1989)美国国家科学院院报8，：3109-3113。Gheysen，G.，Villaroel，R. & Van Montagu，M.(1991)Genes &Dev. 5：，287-297。Gordon-Kamm，W. J.，Spencer，T. M.，Mangano，M. L.，Adams，T.R.，Daines，R.J.，Start，W.G.，O’Brien，J.V. Cham-bers，S.A.，Adams，R.A.，Willets，N.G.，Rice，T.B.，Mackey，C.J.，Krueger，R.W.，Kausch，A.P. & Lemaux，P.G.(1990)植物细胞(Plant Cell)2，603-618.Hall，G.，Allen，G.C.，Loer，D.S.，Thompson，W.F. & Spiker，S.(1991)美国国家科学院院报88，9320-9324。Herman，L.，Jacobs，A.，Van Montagu，M.，& Depicker，A.(1990)分子普通遗传学224，248-256。Herrera-Estrella，A.，Chen，Z.，Van Montagu，M.，& Wang，K.，(1988)EMBO J.7，4055-4062。Herrera-Estrella，A.，van Montagu，M. & Wang，K.(1990)美国国家科学院院报87，9534-9537。Higgs，D.C. & Colbert，J.T.(1993)植物细胞报道12，445-452。Howard，E.A.，Winsor，B.，De Vos，G.，& Zambryski，P.(1989)美国国家科学院院报86，4017-4021。Howard，E.A.，Zupan，J.R.，Citovsky，V. & Zambryski，P.(1992)细胞68，109-118。Jasper，F.，Koncz，C.，Schell，J. & Steinbiss，H.-H.(1994)美国国家科学院院报91，694-698。Kado，C.I.(1993)细菌接合(Bacterial conjugation)，Clewell，D.B.编(Plenum，New York)，pp.243-254。Kertbundit，S.，De Greve，H.，Deboeck，F.，Van Montagu，M. &Hernalsteens，J. -P.(1991)美国国家科学院院报88，5212-5216。Klein，T. M.，Harper，E. C.，Svab，Z.，Sanford，J. C.，Fromm，M.E. & Maliga，P.(1988)美国国家科学院院报85，8502-8505。Klein，T.M.，Kornstein，L.，Sanford，J.C.， & Fromm，M.E.(1989)植物生理学，91，440-444。Koncz，C.，Martini，N.，Mayerhofer，R.，Koncz-Kalman，Zs.，Krber，H.，Redei，G.P. & Schell，J.(1989)美国国家科学院院报86，8467-8471。Koukolikova-Nicola，Z.，Raineri，D.，Stephens，K.，Ramos，C.，Tinland，B.，Nester，E.，& Hohn，B.(1993)细菌学杂志175，723-731。Koziel，M.G.，Beland，G.L.，Bowman，C.，Carozzi，N.B.，Cren-shaw，R.，Crossland，L.，Dawson，J.，Desai，N.，Hill，M.，Kad-well，S.，Launis，K.，Lewis，K.，Maddox，D.，McPherson，K.，Meghji，M.R.，Merlin，E.，Rhodes，R.，Warren，G.W.，Wright，M. & Evola，S.V.(1993)生物技术11，194-200。Lakso，M. Sauer，B.，Mosinger，B.，Lee，E.J.，Manning，R.W.，Yu，S.H.，Mulder，K.L. & Westphal，H.(1992)美国国家科学院院报89：6232-6236。Matsuzaki，H.，Araki，H. & Oshima，Y.(1988)分子细胞生物学8，955-962。Matsuzaki，H.，Nakajima，R.，Nishiyama，J.，Araki，H. & Oshi-ma，Y.(1990)细菌学杂志172，610-618。Matzke，M.A. & Matzke，A.J.M.(1995)植物生理学107，679-685。Mayerhofer，R.，Koncz-Kalman，Z.，Nawrath，C.，Bakkeren，G.，Crameri，A.，Angelis，K.，Redei，G.P.，Schell，J.，Hohn.B. & Koncz，C.(1991)EMBO J.10，697-704。Morrish F.M.和Fromm M.E.1992生物技术中的现行观点(Cur-rent Opinion in Biotechnology)3：141-146。Murashige，T. & Skoog，F.(1962)植物生理15，473-497.Odell，J. T. & Russell S.H.(1994)《植物中的同源重组和基因沉默》Paszkowski，J.编(Kluwer Academic Publishers)pp.219-270。O’Gorman，S.，Fox，D.T. & Wahl，G.M.(1991)科学251，1351-1355。Ohba，T.，Yoshioka，Y.，Machida，C. & Machida，Y.(1995)植物杂志J.7，157-164.Ohta，S.，Mita，S.，Hattori，T. & Nakamura，K.(1990)植物细胞生理学(Plant Cell Physiol.)31，805-813.Onouchi，H.，Yokoi，K.，Machida，C.，Matsuzaki，H.，Oshima，Y.，Matsuoka，K.，Nakamura，K. & Machida，Y.(1991)核酸研究19，6373-6378。Onouchi，H.，Nishihama，R.，Kudo，M.，Machida，Y. & Machi-da，C.(1995)分子普通遗传学247，653-660。Ow，D.W.，Wood，K.V.，DeLuca，M.，deWet，J.R.，Helinski，D.R. & Howell，S.H.(1986)科学234，856-859。Pansegrau，W.，Schoumacher，F.，Hohn，B. & Lanka，E.(1993)美国国家科学院院报90，11538-11542。Raskin，I.1996美国国家科学院院报933164-3166。Rothstein，S. J.，Lahners，K. N.，Lotstein，R. J.，Carozzi，N.B.，Jayne，S. M. & Rice，D. A.(1987)基因53，153-161。Rosenberg，A.H.，Lade，B.N.，Chui，D-S.，Lin，S-W.，Dun，J.J.，Studier，F.W.(1987)基因，125-135.Rossi，L.，Hohn，B. & Tinland，B.(1993)分子普通遗传学239，345-353。Russell，S.H.，Hoopes，J.L.& Odell，J.T.(1992)分子普通遗传学234，49-59。Saunders，K.，Lucy，A.，和Stanley，J.(1991)核酸研究19，2325-2330。Shurvinton，C.E.，Hodges，L. & Ream，W.(1992)美国国家科学院院报89，11837-11841。Stachel，S.E.，Timmermann，B. & Zambryski，P.(1986)自然(伦敦)322，706-712。Stachel et al.，美国国家科学院院报83：379-383(1986)。Stachel，S.，Timmerman，B.，& Zambryski，P.(1987)EMBO J.6，857-663。Stenger，D.C.Revington，G.N.，Stevenson，M.C.，和Bisaro，D，M.(1991)美国国家科学院院报88，8029-8033。Thompson，C.J. Movva，N.R.Tizard，R.，Crameri，R.，Davies，J.E. Lauweereys，M.和Botterman，J.(1987)EMBO J. 6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                        序列表(1)一般信息：
(i)申请人：
     (A)名称：CIBA-GEIGY AG
     (B)街道：Klybeckstr.141
     (C)城市：Basel
     (E)国家：瑞士
     (F)邮编(ZIP)：4002
     (G)电话：+41 61 69 11 11
     (H)传真：+41 61 696 79 76
     (I)电报：962 991
(ii)发明名称：输送给真核细胞的外源DNA的改良整合方法
(iii)序列数：23
(iv)计算机可读形式：
     (A)媒体类型：软盘
     (B)计算机：IBM PC兼容
     (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
     (D)软件：PatentIn Release #1.0，版本#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征：
     (A)长度：27碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：双链
     (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：GNNTGNCAGG ATATATNNNN NNGTNAN   27(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征：
(A)长度：27碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：GGTGGCAGGA TATATNNNN NTGTAAA   27(2)SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征：
(A)长度：12碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：GATCCCTGCA GA            12(2)SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征：
(A)长度：12碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：AGCTTCTGCA GG           12(2)SEQ ID NO：5的信息：(i)序列特征：
(A)长度：150碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：ATCTCCACTG ACGTAAGGGA TGACGCACAA TCCCACTATC CTTCGCAAGA CCCTTCCTCT     60ATATAAGGAA GTTCATTTCA TTTGGAGAGG GATCCCTGCA GGACACGCTG AAATCACCAG    120TCTCTCTCTA CAAATCTATC TCTCTCTATG                                     150(2)SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特征：
(A)长度：154碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：GATCCATAGA GAGAGATAGA TTTGTAGAGA GAGACTGGTG ATTTCAGCGT GTCCTGCAGG     60GATCCCTTCC CAAATGAAAT GAACTTCCTT ATATAGAGGA AGGGTCTTGC GAAGGATAGT    120GGGATTGTGC GTCATCCCTT ACGTCAGTGG AGAT                                154(2)SEQ ID NO：7的信息：(i)序列特征：
(A)长度：33碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：ATCCGGCAGG ATATATACCG TTGTAATTCT GCA    33(2)SEQ ID NO：8的信息：(i)序列特征：
(A)长度：20碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：CCACTATCCT TCGCAAGACC    20(2)SEQ ID NO：9的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：TCGAGTTGCA TGCAG                                   15(2)SEQ ID NO：10的信息：(i)序列特征：
(A)长度：17碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：GATCGCAGCA TGCCTAG                                 17(2)SEQ ID NO：11的信息：(i)序列特征：
(A)长度：45碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：GATCAAGCTT TTGATGAAAG AATCGTTAT TCTTTCATCA AGATC                     45(2)SEQ ID NO：12的信息：(i)序列特征：
(A)长度：46碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：AGCTACTGCA GTTGATGAAA GAATACGTTA TTCTTTCATC AACTAG                  46(2)SEQ ID NO：13的信息：(i)序列特征：
(A)长度：45碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：GATCAAGCTT TTGATGAAAG AATACGTTAT TCTTTCATCA AGATC                      45(2)SEQ ID NO：14的信息：(i)序列特征：
(A)长度：35碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：AATTCATGGA TCTTTCTGGC AATGAGAAAT CCAGG                                35(2)SEQ ID NO：15的信息：(i)序列特征：
(A)长度：62碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：GTGCCTTGCC TTCTCTCCC CCAACTCCCT CTCCTAGCAC GCCTCCGACA CCTAGCCCCG    60AT                                                                  62(2)SEQ ID NO：16的信息：(i)序列特征：
(A)长度：56碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：CGGGGCTAGG TGTCGGAGGC GTGCTAGGAG AGGGAGTTGG GGGAGTAGAA GGCAAG     56(2)SEQ ID NO：17的信息：(i)序列特征：
(A)长度：53碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：AATTCTCAAA ACACACCAGA GTCACGTCGA GTGAGACTGC CATCAACCAG CAT        53(2)SEQ ID NO：18的信息：(i)序列特征：
(A)长度：51碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：TATCCTTCTA CTCCCCCAAC TCCCTCTCCT AGCACGCCTC CGACACCTAG C               51(2)SEQ ID NO：19的信息：(i)序列特征：
(A)长度：54碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：AATTGGCTAG GTGTTCGGAGG CGTGCTAGGA GAGGGAGTTG GGGGAGTAGA AGGA            54(2)SEQ ID NO：20的信息：(i)序列特征：
(A)长度：45碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：CGAATTCGCT AGCATCGATA GATCTGTAC CAAAGCTTCT CGAGT                        45(2)SEQ ID NO：21的信息：(i)序列特征：
(A)长度：53碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：AGCTACTCGA GAAGCTTTGG TACCAGATCT ATCGATGCTA GCGAATTCGC ATG             53(2)SEQ ID NO：22的信息：(i)序列特征：
(A)长度：33碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：ATCCGGAGG ATATATACCG TTGTAATTCT GCA                                    33(2)SEQ ID NO：23的信息：(i)序列特征：
(A)长度：35碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iii)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：AATTCATGGA TCTTTCTGGC AATGAGAAAT CCAGG                                35

Claims (27)

1.将目的DNA整合到真核细胞基因组中的方法，该方法包括用：
a)由邻接有T-DNA边缘序列的目的DNA组成的DNA片段；和
b)至少一个能够在所说的真核细胞中表达一种或多种促进邻接有T-DNA边缘序列的DNA整合之蛋白质的嵌合DNA或RNA分子转化所说的细胞。
2.权利要求1的方法，其中步骤a)和b)是同时进行的。
3.权利要求1的方法，其中所说的真核细胞是植物细胞。
4.权利要求1的方法，其中所说嵌合DNA或RNA分子构成编码一种或多种蛋白质的嵌合核酸分子，其中所说蛋白质是由农杆菌Ti或Ri质粒的侵入性区域编码的。
5.权利要求4的方法，其中所说的嵌合DNA或RNA分子编码VirD2、VirD1、VirC1、VirC2或VirE2。
6.权利要求5的方法，其中所说的嵌合DNA或RNA分子编码单一VirD2、或VirD1和VirD2的组合、或VirD1、VirD2和VirE2的组合。
7.权利要求5的方法，其中所说的嵌合DNA或RNA分子编码VirD2。
8.权利要求3的方法，其中邻接有T-DNA边缘序列的目的DNA是植物病毒载体的一部分。
9.权利要求3的方法，其中所说的DNA基因是植物病毒载体的一部分。
10.权利要求3的方法，其中邻接有T-DNA边缘序列的目的DNA和所说的DNA基因是植物病毒载体的一部分。
11.权利要求3的方法，其中所说的植物细胞是双子叶植物的细胞。
12.权利要求11的方法，其中所说的双子叶植物选自烟草、棉花、油籽油菜和大豆。
13.权利要求3的方法，其中所说的植物细胞是单子叶植物的细胞。
14.权利要求13的方法，其中所说的单子叶植物选自玉米、小麦和稻。
15.权利要求1的方法，其中所说的目的DNA包括嵌合基因。
16.权利要求15的方法，其中所说的嵌合基因能够在所说的真核细胞中表达蛋白质。
17.权利要求1的方法，其中所说的邻接有T-DNA边缘序列的目的DNA和所说的DNA基因是单一DNA分子的成分。
18.生产能育的转基因植物的方法，其中所说的植物具有整合到基因组中的邻接T-DNA边缘序列的DNA，该方法包括
a)根据权利要求3的方法将所说的DNA转化到植物细胞的基因组中；并且
b)将被转化的细胞再生成能育的转基因植物。
19.权利要求18的方法，其中所说的能育的转基因植物选自烟草、棉花、油籽油菜、大豆、玉米、小麦和稻。
20.编码农杆菌侵入性蛋白质的基因在指导邻接有T-DNA边缘序列的目的DNA整合到真核细胞基因组中的转化方法中的应用。
21.根据权利要求20的应用，其中所说的基因是编码VirD2、VirD1、VirC1、VirC2或VirE2的嵌合基因。
22.在物理转化实验中得到的整组转基因植物细胞或植物，其中5％或更多所说的植物细胞或植物包含通过农杆菌右边缘T-DNA序列连接到基因组DNA上的目的DNA。
23.根据权利要求22的一组植物细胞或植物，其通过微粒轰击法获得。
24.根据权利要求22的一组植物细胞或植物，其中10％至70％的所说的植物细胞或植物包含通过农杆菌右边缘T-DNA序列连接到植物基因组DNA上的目的DNA。
25.根据权利要求22的一组植物细胞或植物，其由20个或更多个独立的转化事件得到。
26.根据权利要求24的一组植物细胞或植物，其由10个或更多个独立的转化事件得到。
27.根据权利要求22的植物细胞或植物的子代。
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