PL191113B1 - Sposób integrowania interesującego DNA z genomem komórki roślinnej, sposób wytwarzania płodnej transgenicznej rośliny z genomem mającym wintegrowany DNA, zastosowanie genu kodującego białka wirulencji Agrobacterium w niebiologicznych sposobach transformacji komórek roślinnych, transgeniczna komórka roślinna, roślina regenerowana z komórki roślinnej oraz potomstwo roślin otrzymanych ze zregenerowanej komórki roślinnej - Google Patents

Abstract

1. Sposób integrowania interesujacego DNA z genomem komórki roslinnej, znamienny tym, ze do komórki roslinnej dostarcza sie nastepujace skladniki: a) interesujacy DNA otoczony przez sekwencje graniczne T-DNA Agrobacterium oraz b) co najmniej jedna chimerowa czasteczke DNA lub RNA zdolna do ekspresji w wymienionej komórce roslinnej jednego lub wiecej bialek promujacych integracje DNA otoczonego przez se- kwencje graniczne T-DNA, przy czym jedno lub wiecej bialek jest kodowane przez region wirulencji VirD2, VirD1 lub VirE2 na plazmidzie Ti lub Ri Agrobacterium, ze skladniki wprowadza sie do ko- mórki roslinnej sposobami niebiologicznymi. PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób integrowania interesującego DNA z genomem komórki roślinnej, sposób wytwarzania płodnej transgenicznej rośliny z genomem mającym wintegrowany DNA, zastosowanie genu kodującego białka wirulencji Agrobacterium w niebiologicznych sposobach transformacji komórek roślinnych, transgeniczna komórka roślinna, roślina regenerowana z komórki roślinnej oraz potomstwo roślin otrzymanych ze zregenerowanej komórki roślinnej.

Sposoby wprowadzania egzogennych cząsteczek DNA do komórek roślinnych, celem wytwarzania roślin transgenicznych są znane. Są to sposoby biologiczne, wykorzystujące modyfikowane systemy biologiczne, takie jak system przenoszenia T-DNA do komórek roślin, w których pośredniczy Agrobacterium oraz sposoby niebiologiczne, fizyczne, takie jak elektroporacja, mikroinjekcje, pobieranie DNA lub fuzje komórek, wspomagane przez fosforan wapnia lub glikol polietylenowy (PEG) i bombardowanie komórek mikropociskami („Plant Genetic Transformation and Gene Expression, A Laboratory Manual, rozdz. 2i3, red. Draper, J. i wsp., wyd. Blackwell Scientific Publications (1988); a także Potrykus i wsp., „Direct Gene Transfer: State of the Art and Future Potential. Plant. Mol. Biol. Rep. 3; 117-128 (1985)).

Znane sposoby pozwalają na względnie stabilną transformację szerokiego zakresu gatunków roślin egzogennym DNA. W szczególności sposoby fizyczne pozwoliły na przezwyciężenie ograniczeń, co do możliwości stosowania gospodarza, nakładane przez systemy biologiczne. Jednak również znane metody fizyczne obarczone są wadami, przede wszystkim wynikającymi z faktu, że mechanizmy i reakcje zachodzące w komórkach nie są do końca poznane. Integracja dostarczanego DNA do genomu rośliny, zależna od tych mechanizmów, nie jest w pełni kontrolowana i uporządkowana, nie jest więc w pełni przewidywalna. Zdarza się, że egzogenny DNA jest integrowany jako wielokrotne kopie losowych fragmentów, na ogół w pojedynczym miejscu genomu rośliny.

Poprawienie przewidywalności zajścia stabilnej, genetycznej transformacji komórki roślinnej, wynikającej z fizycznego wprowadzania egzogennego DNA, znacznie zwiększyłoby przydatność i ogólną wydajność tego procesu. Próbowano stosować kombinację technik i systemów biologicznych, polegających na stosowaniu białek, które promują transformację i/lub integrację z wprowadzaniem DNA technikami niebiologicznymi. Aby uzyskać pożądany efekt uważano jednak, że jest konieczne łączenie samych białek z egzogennymi cząsteczkami DNA przed dostarczeniem do docelowej transformowanej komórki, imitując w ten sposób tak bardzo jak to jest możliwe system biologiczny, z którego pochodzą te białka (WO 95/05471 i WO 95/34647).

Pośród badań dotyczących stosowania białek, które promują transformację i/lub integrację DNA w komórkach roślinnych przeprowadzone zostały badania nad rolą jaką białko VirE2 odgrywa w pobieraniu łańcucha cząsteczki jądrowego T-DNA podczas infekcji Agrobacterium. Wyniki tych badań, przeprowadzanych z protoplastami tytoniu, są znane z publikacji Citovsky i współ., SCIENCE, 1992.

Badania obejmują dwa doświadczenia transformacyjne. Pierwsze znich (str. 1803), dotyczy transformacji protoplastów tytoniu, przy czym sposób transformacji nie jest szczegółowo opisany. Stwierdza się, że „sekwencja kodująca dla locus virE2 została przyłączona do końca 3' genu b-glukoronidazy (GUS), a otrzymany konstrukt został wprowadzony do protoplastów tytoniu.

Drugie doświadczenie (str. 1804), dotyczy sposobu transformacji komórki roślinnej i wytwarzania transgenicznych roślin tytoniu. W tym sposobie, sekwencję kodującą VirE2 wprowadza się do pMON 316, a następnie rekombinowany pMON 316 przenosi się do szczepu A208 Agrobacterium, mającego nieuzbrojony plazmid pTiT37-SE. Zarówno sekwencja kodująca VirE2 jak i sekwencja kodująca fosfotransferazę II neomycyny zostają przeniesione do genomu rośliny, a zatem można wnioskować, że sekwencje te znajdują się pomiędzy sekwencjami granicznymi T-DNA. Rekombinację za pomocą pMON 316 można więc uważać za odpowiadającą wprowadzeniu do komórki roślinnej jednego konstruktu DNA obejmującego sekwencję kodującą VirE2 oraz sekwencję kodującą fosfotransferazę II neomycyny, który to konstrukt znajduje się pomiędzy sekwencjami granicznymi T-DNA.

Białka wytwarzane poza komórką eukariotyczną nie muszą więc być produkowane i łączone z egzogennym DNA poza tą komórką tak jak to naturalnie czynią, aby sprzyjać stabilnej integracyjnej transformacji. Dostarczenie do komórki eukariotycznej mogącego ulec translacji RNA lub chimerowego genu kodującego takie białko może równie skutecznie promować stabilną, integracyjną transformację wspólnie dostarczanego egzogennego DNA.

Zgodnie z wynalazkiem sposób integrowania interesującego DNA z genomem komórki roślinnej, charakteryzuje się tym, że do komórki roślinnej wprowadza się: a) interesujący DNA otoczony

PL 191 113 B1 przez sekwencje graniczne T-DNA Agrobacterium oraz b), co najmniej jedną chimerową cząsteczkę DNA lub RNA, zdolną do ekspresji w wymienionej komórce roślinnej jednego lub więcej białek promujących integrację DNA, otoczonego przez sekwencje graniczne T-DNA, przy czym jedno lub więcej białek jest kodowane przez region wirulencji VirD2, VirD1 lub VirE2 na plazmidzie Ti lub Ri Agrobacterium, a obydwa składniki wprowadza się do komórki roślinnej sposobami niebiologicznymi.

Korzystnie składniki a)ib) wprowadza się do komórki roślinnej równocześnie i korzystnie stosuje się sposoby niebiologiczne wybrane z grupy obejmującej elektroporację, mikroinjekcję, indukowane pobieranie i bombardowanie mikropociskami.

W sposobie integrowania interesującego DNA, według wynalazku, korzystnie stosuje się chimerową cząsteczkę DNA lub RNA, która koduje VirD1, albo VirD2, albo kombinację VirD1 i VirD2, albo kombinację VirD1, VirD2 i VirE2. Korzystnie też chimerowa cząsteczka DNA lub RNA albo interesujący DNA, otoczony przez sekwencje graniczne T-DNA Agrobacterium jest częścią wirusowego wektora roślinnego, ale równie korzystnie zarówno chimerowa cząsteczka DNA lub RNA i interesujący DNA, otoczony przez sekwencje graniczne T-DNA Agrobacterium są częścią wirusowego wektora roślinnego.

Preferowany jest sposób integrowania, w którym stosuje się komórkę roślinną pochodzącą z rośliny dwuliściennej, a zwłaszcza z rośliny dwuliściennej, wybranej z grupy złożonej z tytoniu, bawełny, rzepaku i soi, albo sposób, w którym stosuje się komórkę roślinną pochodzącą z rośliny jednoliściennej, a zwłaszcza z rośliny jednoliściennej wybranej z grupy złożonej z kukurydzy, pszenicy i ryżu.

Korzystne jest takie przeprowadzanie sposobu integrowania według wynalazku, w którym stosuje się interesujący DNA, zawierający gen chimerowy, zwłaszcza taki, który jest zdolny do ekspresji białka w komórce roślinnej. Korzystne jest także stosowanie interesującego DNA, otoczonego przez sekwencje graniczne T-DNA Agrobacterium oraz chimerowej cząsteczki DNA, które są składnikami jednej cząsteczki DNA.

Zgodnie z wynalazkiem sposób wytwarzania płodnej transgenicznej rośliny z genomem mającym wintegrowany DNA, otoczony przez sekwencje graniczne T-DNA Agrobacterium, obejmujący transformację a następnie regenerację komórek roślinnych do płodnej rośliny transgenicznej, charakteryzuje się tym, że do genomu komórki roślinnej wprowadza się: a) interesujący DNA otoczony przez sekwencje graniczne T-DNA Agrobacterium oraz b), co najmniej jedną chimerową cząsteczkę DNA lub RNA, zdolną do ekspresji w wymienionej komórce roślinnej jednego lub więcej białek promujących integrację DNA otoczonego przez sekwencje graniczne T-DNA, przy czym jedno lub więcej białek jest kodowane przez region wirulencji VirD2, VirD1 lub VirE2 na plazmidzie Ti lub Ri Agrobacterium, a obydwa komponenty wprowadza się do komórki roślinnej sposobami niebiologicznymi.

Korzystnie jako płodną roślinę transgeniczną według wynalazku wytwarza się roślinę wybraną z grupy złożonej z tytoniu, bawełny, rzepaku, soi, kukurydzy, pszenicy i ryżu.

Zastosowanie genu kodującego białka wirulencji Agrobacterium w niebiologicznych sposobach transformacji komórek roślinnych, zgodnie z wynalazkiem, charakteryzuje się tym, że gen ten steruje integracją interesującego DNA, otoczonego przez graniczne sekwencje T-DNA Agrobacterium, zgenomem komórki roślinnej, przy czym korzystnie wymieniony gen jest genem chimerowym kodującym białka VirD2, VirD1, lub VirE2.

Zgodnie z wynalazkiem wytwarza się transgeniczną komórkę roślinną przez wprowadzenie do jej genomu: a) interesującego DNA, otoczonego przez sekwencje graniczne T-DNA Agrobacterium oraz b), co najmniej jednej chimerowej cząsteczki DNA lub RNA, zdolnej do ekspresji w wymienionej komórce roślinnej jednego lub więcej białek promujących integrację DNA otoczonego przez sekwencje graniczne T-DNA, przy czym jedno lub więcej białek jest kodowane przez region wirulencji VirD2, VirD1 lub VirE2 na plazmidzie Ti lub Ri Agrobacterium, a obydwa komponenty wprowadza się do komórki roślinnej sposobami niebiologicznymi. Z tak otrzymanej transgenicznej komórki roślinnej, regeneruje się, zgodnie z wynalazkiem, roślinę transgeniczną, która jest płodna i stabilnie wyraża pożądany transgen oraz przekazuje go potomstwu. Stabilna ekspresja transgenu jest dziedziczona jako cecha Mendlowska przez potomstwo rośliny transgenicznej.

Zgodnie z wynalazkiem potomstwo uzyskanych roślin transgenicznych zawiera interesujący DNA, otoczony przez sekwencje graniczne T-DNA Agrobacterium.

Interesujący egzogenny fragment DNA, ulegający integracji może być dowolnym fragmentem DNA, który chce się wintegrować w nienaruszonej formie do genomu komórki eukariotycznej, np. takim jak chimeryczny gen, wyrażający w komórce roślinnej lub w powstałej roślinie lub hodowli komórkowej konkretny biologicznie czynny RNA (np. antysensowny RNA lub rybozym) lub interesujące białka.

PL 191 113 B1

Białko zdolne do promocji integracji rzeczonego egzogennego DNA jest w szczególności białkiem kodowanym przez region wirulencji plazmidów Agrobacterium Ti iRi, które są stosowane do sterowania integracją interesującego DNA otoczonego przez graniczne sekwencje T-DNA w genomie komórki eukariotycznej.

Sposób integracji według wynalazku stanowi ulepszoną metodę stabilnej transformacji komórek roślinnych egzogennym DNA, który łączy dodatnie cechy przenoszenia DNA, w którym pośredniczą plazmidy T Agrobacterium z niebiologicznymi metodami wprowadzania DNA. Ten ulepszony sposób obejmuje dostarczenie komórce roślinnej egzogennego fragmentu DNA, który chce się wintegrować do genomu komórki roślinnej, otoczonego przez graniczne sekwencje T-DNA, wraz z co najmniej jednym chimerycznym genem lub RNA zdolnym do ekspresji w komórce roślinnej białka pochodzącego z Agrobacterium, które promuje integrację egzogennego DNA. Białko pochodzące od Agrobacterium, które jest wytwarzane w komórce roślinnej w szczególności odpowiada VirD1, VirD2 lub VirE2. Korzystnie stosuje się kombinacje VirD2 z VirD1 albo z VirE2 lub inne kombinacje tych białek. Najbardziej korzystne jest stosowanie samego VirD2, kombinacji VirD1 i VirD2 lub kombinacji VirD1, VirD2 i VirE2. Wyrażanie białek pochodzących od Agrobacterium w komórce roślinnej powoduje integrację egzogennego DNA jako nienaruszonych fragmentów z przewidywalnymi końcami.

Egzogenny fragment DNA i białka pochodzące od Agrobacterium są obecne w komórce roślinnej po podaniu egzogennego DNA i zanim ulegnie integracji egzogenny DNA. Można to uzyskać przez równoczesne podanie obydwu komponentów. Alternatywnie komórka roślinna mająca ulec transformacji może pochodzić z rośliny lub hodowli roślinnej, która była uprzednio stabilnie transformowana genem (genami) chimerycznymi zdolnymi do ekspresji białek pochodzących z Agrobacterium.

Stosowane definicje:

Integracja - jest to proces, za pomocą którego egzogenna cząsteczka DNA wprowadzona do komórki eukariotycznej jest stabilnie wbudowywana do genomowego DNA komórki eukariotycznej.

Bombardowanie mikropociskami. To określenie odnosi się do ogólnie znanej metody wprowadzania kwasów nukleinowych, wtym DNA i RNA do żywej komórki przez powleczenie mikropocisku kwasami nukleinowymi i wystrzelenie tak pokrytego mikropocisku do żywej komórki (przykładowo: opis patentowy US 5 036 006, przykłady 1-4; WO 91/02071 - dotyczy zastosowania bombardowania mikropociskami do transformacji roślin i ich komórek; opis patentowy US 5 302 23; Koziel i wsp., Biotechnology 11:194-200 (1993) - dotyczy transformacji wsobnych linii Elite kukurydzy przez bombardowanie cząsteczkami; Vasil i wsp., Biotechnology 11: 1553-1558 (1993); Weeks i wsp., Plant Physiol. 102: 1077-1084 (1993); Tanaka, T. i wsp., „Successful expression in pollen of various plant species of in vitro synthesized mRNA introduced by particle bombardment, Plant. Mol. Biol. 28:337-341(1995); Vasil i wsp., Biotechnology 10:667-674 (1992); R. i wsp.; Walker, L. i wsp., „GUS Messenger RNA Delivery and Expression in Plant Cells via Particle Bombardment, In Vitro Cell Dev. Biol. 26: 70A-#218(1990); Lida, A. i wsp., Appl. Microbiol. Biotechnol. 33: 560-563 (1990); Gordon-Kamm i wsp., Plant Cell 2: 603-618 (1990); Fromm i wsp., Biotechnology 8: 833-839 (1990); Morikawa, H. i wsp., Appl. Microbiol. Biotechnol. 31: 320-322 (1989)).

„Wstrzykiwanie za pomocą strumienia aerozolowego” - dotyczy fizycznego sposobu dostarczania kwasów nukleinowych do żywej komórki w postaci strumienia aeorozolu (opis patentowy US 5 240 842).

„Elektroporacja” - sposób dostarczania cząsteczek biologicznych, w szczególności kwasów nukleinowych takich jak DNA i RNA, do żywych komórek przez poddanie komórek impulsowi elektrycznemu lub wyładowaniu w obecności cząsteczek biologicznych (opis US 5 231 019; „Plant Genetic Transformation and Gene Expression, A Laboratory Manual”, red. Draper, J. i wsp., wyd. Blackwell Scientific Publications (1988), rozdział 3.3; Saul, M.W. i wsp., „Direct DNA Transfer to Protoplasts With and Without Electroporation”, Plant Molecular Biology Manual A1: 1-16 (1988); J. i wsp.; Okada K., iwsp. „Introduction of Functional RNA into Plant Protoplasts by Electroporation”, Plant Cell Physiol. 27(4):619-626 (1986); Shilito, R.D. i wsp. „High Efficiency Direct Gene Transfer to Plants”, Biotechnology 3: 1099-1103 (1985); EP 292 435 (dla Ciba-Geigy), EP 393 225 (dla Ciba-Geigy).

„Mikroinjekcja” - mechaniczne wstrzykiwanie biologicznej substancji, w szczególności DNA lub RNA, bezpośrednio do żywej komórki („Plant Genetic Transformation and Gene Expression, A Laboratory Manual, supra, rozdział 3.4; Graessman, M.iwsp. „Microinjection of Tissue Culture Cells”, Methods in Enzymology 101: 482-492 (1983)).

„Indukowane pobieranie” - metody, które indukują pobieranie substancji biologicznych, w szczególności kwasów nukleinowych przez żywe komórki (opis patentowy US 5 036 006). W szczególności pobieranie, w którym pośredniczy glikol polietylenowy (PEG) („Plant Genetic Transformation

PL 191 113 B1 and Gene Expression, A Laboratory Manual”, red. J. Draper i wsp., wyd. Blackwell Scientific Publications, 1988, rozdział 3.2; Saul, M.W.i wsp. „Direct DNA Transfer to Protopasts With and Without Electroporation, supra; Negrutiu i wsp., „Plant Mol. Biol., 8:363-373 (1987)) oraz działanie szokiem termicznym (opis patentowy US 5 231 019).

„VirD” - geny lub białka pochodzące z operonu wirulencji (Vir) D plazmidów Ti lub Ri, które dostarczają funkcji wymaganych dla przenoszenia T-DNA (Zambryski P.C., „Chronicles from the Agrobacteriumplant cell DNA transfer story Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43: 465-490 (1992)). Poszczególne geny i odpowiadające im białka z tego regionu są określane za pomocą liczb w zależności od tego gdzie występują w operonie VirD. Na przykład pierwszy gen w operonie wirulencji D określany jest jako „VirD1”, drugi jako „VirD2” itd.

DNA regionu wirulencji normalnie nie jest przenoszony do komórki roślinnej ani integrowany do genomu rośliny podczas przenoszenia T-DNA, w którym pośredniczy Agrobacterium. Zamiast tego produkty genu vir działają naturalnie w trans, aby mobilizować element T-DNA z plazmidu Ti lub Ri do genomu rośliny. Region T i region vir mogą być na różnych plazmidach bez utraty funkcji (De Framond, A.J. i wsp., Bio/Technology 1: 262-269 (1983); Hoekema i wsp., Nature 303: 179-180 (1983); Bevan, M. Nucleic Acids Res. 12: 8711-8721 (1984)).

Dwa polipeptydy kodowane przez 5' połowę locus VirD odgrywają kluczową rolę w inicjacji obróbki DNA do przenoszenia T-DNA z Agrobacterium do komórek roślinnych: VirD1 i VirD2. Białka VirD1 i VirD2 są odpowiednio kodowane przez pierwszy gen i drugi gen operonu VirD (Stachel

S.E. & Nester E.W. „The genetic and transcriptional organization of the vir region of the A6 Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens. EMBO J. 5:1445-1454 (1986)). Badania genetyczne wykazały, że w wytwarzaniu nici T pośredniczą produkty operonu VirD (Yanofsky i wsp., Cell 47: 471-477 (1986); Stachel i wsp., EMBO J. 6:857-863 (1987)). W szczególności wykazano, że pierwszy i drugi gen operonu VirD kodują polipeptydy wymagane do cięcia granic T-DNA (De Vos & Zambryski, Mol. Plant Microbe Inter. 2: 43-52 (1989); Filchkin & Gelvin, Mol. Microbiol 8:915-926 (1993); Jayaswal i wsp., J. Bacteriol. 169,:5035-5045 (1987); Porter i wsp., Nucleic Acids Res. 15:7503-7515 (1987); Stachel i wsp., J. 6:857-863 (1987)). Aktywność powoduje wytwarzanie nacięć w jednej nici („nicks) w granicznych sekwencjach T-DNA (Stachel S.E. i wsp., „Generation of single-stranded T-DNA molecules during the initial stage of T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to plant cells Nature (London) 322: 706-712 (198). Yanofsky i wsp., Cell 47: 471-477 (1986), Wang i wsp., Science 235: 587-591 (1987); Albright i wsp., J. Bacteriol. 169: 1046-1055 (1987)). VirD1/VirD2 przecinają sekwencje graniczne T-DNA między trzecią i czwartą zasadą. Kiedy powstają te nacięte sekwencje, obserwuje się produkcję kopii wolnego liniowego ssDNA dolnej nici T-DNA (nić T) (Stachel i wsp., Nature (London) 332 706-712 (1986); Stachel i wsp., EMBO J. : 857-863 (1987)) VirD2 zostaje kowalencyjnie połączone do końca 5' T-DNA (przegląd - Zupan J.R. & Zambryski P. „Transfer of DNA from Agrobacterium to the plant cell. Plant Physiol. 107: 1041-1047 (1995)).

Badania mutanta virD2, który utracił 50% C-końcowej części VirD2 pokazały, że do nacinania granicznych obszarów T-DNA potrzebne jest tylko N-końcowe 50% VirD2. Jednak ten mutant nie jest zdolny do wywoływania guzów w zakażonych roślinach. Tak więc C-koniec wydaje się odgrywać rolę w przenoszeniu T-DNA w komórkach roślinnych (przegląd w Zambryski P.C. „Chronicles from the Agrobacterium-plant DNA transfer story Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43: 465-480 (1992)). Domena ta zawiera dwuczęściowy sygnał lokalizacji jądrowej (NLS) (Howard i wsp., Cell 68: 109-118 (1992)). Biologiczna właściwość sekwencji NLS została potwierdzona przez obserwację, że rakotwórczość Agrobacterium ulega poważnemu zmniejszeniu, gdy usunie się 2 zasadowe struktury dwuczęściowego NLS z VirD2 (Shurvinton, Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 89, 11837-11841 (1992)).

Sam VirD2 in vitro przeprowadza specyficzną w stosunku do miejsca reakcję cięcia-łączenia wskazując, że białko to niesie aktywność katalityczną wymaganą do cięcia DNA (Pansegrau i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11538-11542 (1993)). Doniesiono, że VirD1 i VirD2 pTiC58 razem in vitro wystarczają do katalizowania specyficznego cięcia granicznych obszarów T-DNA (Scheiffle i wsp., J. Biol. Chemistry 270: 1269-1276 (1995)) (ale p. Jasper i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 694698(1994)).

Aktywność topoizomerazy typu l została opisana dla wyciągów zawierających VirD1 (Ghi & Das, Proc. Natl. Acad. Sci.86: 319-3113 (1989). Aktywność tą przypisano VirD1 i proponowano, że jest ona wymagana do relaksowania DNA, aby przygotować je do cięcia przez VirD2. Jednak bardziej oczyszczone białko VirD1 nie wykazywało aktywności topoizomerazy (Scheifflei wsp., J. Biol. Chemistry 270: 1269-1276 (1995)).

PL 191 113 B1

Analiza sekwencji VirD2 wykazała, że N-koniec jest konserwowany w85% wśród szczepów Agrobacterium niosących plazmidy typu oktopina, nopalina lub rhizogenes (Hirayama i wsp., Mol. Gen. Genet. 213:229-237 (1988); Wang i wsp., J. Bacteriol. 172:4432-4440 (1990); Yanofsky i wsp., Cell 47:471-477 (1986)). C-koniec konserwowany jest tylko w25%, ale najwyższe podobieństwo stwierdza się w ostatnich 30 aminokwasach z sygnałami NLS (przegląd - Zambryski, 1992).

„VirE2” są to geny lub odpowiednie białka pochodzące z operonu wirulencji (Vir) E plazmidu Ti iRi, które dostarczają funkcji wymaganych do przenoszenia T-DNA. Określenie jest stosowane do białka wiążącego jednoniciowy DNA (ssDNA), które zostało zidentyfikowane jako produkt genu VirE2 z operonu VirE (Gielt, C. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 9006-9010 (1987); Citovsky i wsp., Science 240: 501-504 (1988). Uważa się, że VirE2 powleka T-DNA na całej jego długości. Interakcja tego białka z jednoniciowym DNA nie jest specyficzna. Białko nopalinowe VirE2 (Hirooka i wsp., J. Bacteriol. 169: 1529-1536 (1987)) i białko oktopinowe VirE2 (Winans i wsp., Nucleic Acids Res. 15: 825-837 (1987)) zawierają sygnały lokalizacji jądrowej. Uważa się, że białko VirE2 jest istotną częścią kompleksu T i mogłoby pomagać w transporcie jądrowym (przegląd p. Zupan & Zambryski, Plant Physiol., 107:1041-1047 (1995)). Rośliny transgeniczne wyrażające gen virE2 są zdolne do komplementacji mutantów VirE Agrobacterium dostarczając dowodu, że białko virE2 odgrywa ważną rolę w komórce roślinnej (przegląd p. Zupan & Zambryski, Plant Physiol. 107:1041-1047 (1995)).

„VirC” określa locus VirC w plazmidach Ti iRi, który koduje dwa polipeptydy, VirC1 i VirC2 (Yanofsky M.F. & Nester E.W. „Molecular characterization of a host-range determining locus from Agrobacterium tumefaciens, J. Bacteriol,. 168:237-243 (1986)). Pokazano, że locus ten wzmaga nacinanie sekwencji granicznych T-DNA u Agrobacterium (Toro N. i wsp. „Role of the overdrive sequence in T-DNA border nicking in Agrobacterium, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85(22): 85588562(1988)). Wykazano także, że VirC1 wzmaga produkcję nici T w heterologicznym systemie E. coli, gdzie produkty genów VirD1 i VirD2 są ograniczające (De Vos G. & Zambryski P. „Expression of Agrobacterium nopaline specific VirD1, VirD2 and VirC1 and their requirement for T-strand produc-tion in E. coli Molec. Plant. Microbe Inter 2: 42-52(1989)). Choć wykazano za pomocą chromatografii powinowactwa DNA, że VirC1 reaguje z sekwencjami oktopiny typu „overdrive dokładna rola VirC1 nie jest znana. Może łączyć się z VirD1 i VirD2 lub z powtórzeniem w obszarze granicznym i/lub sekwencją „overdrive, aby wspomagać nacinanie i produkcję nici T (Toro N.iwsp. „The Agrobacterium tumefaciens virC1 gene product binds to overdrive, a T-DNA transfer enhancer J. Bacteriol. 171: 68456849 (1989)). „Graniczny T-DNA dotyczy ok. 25 pz. niedoskonałego bezpośredniego powtórzenia sekwencji DNA, które ze względu na swoją obecność na obu końcach fragmentu DNA powodują rozpoznanie tego fragmentu jako T-DNA i działanie na niego białek Agrobacterium. Granice T-DNA występujące na dowolnym końcu T-DNA są określane według zwyczaju jako „lewy i „prawy.

Sekwencja najwyższej zgodności dla prawego obszaru granicznego to

5'-GNNTGNCAGGATATATNNNNNNGTNAN-3' (SEKW. NR ID 1), a sekwencja najwyższej zgodności lewego obszaru granicznego to

5'-GGTGGCAGGATATATNNNNNNTGTAAA-3' (SEKW. NR ID 2) (Jouanin i wsp., Plant Mol. Biol. 12:75-85 (1989)). Dowolny DNA między tymi sekwencjami granicznymi jest przenoszony z Agrobacterium do komórki roślinnej (przegląd Zambryski P.C. „Chronicles from the Agrobacterium-plant cell DNA transfer story, Ann. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol. 43:465-490(1992)).

Badania nad zawartością T-DNA różnych transformowanych linii roślin wykazały, że integracja T-DNA do genomu roślin często zachodzi w (dla prawego obszaru granicznego) lub blisko (dla lewego obszaru granicznego) tych powtórzeń granicznych (Slightom i wsp., EMBO J. 4: 3069-3077 (1985); Gheysen i wsp., Genes & Dev. 5:287-297 (1991); Mayerhofer i wsp., EMBO J. 10: 697-704 (1991); Ohta i wsp., Plant J., 7: 157-164 (1995); Koncz i wsp., Proc. Natl. Acd. Sci. 86: 8467-8471 (1989)).

Mimo podobieństw strukturalnych między lewym i prawym obszarem granicznym badania funkcji obszarów granicznych wykazały, że są one inaczej wykorzystywane. Delecja lub inwersja prawej sekwencji granicznej powoduje nieomal całkowitą utratę przenoszenia T-DNA podczas, gdy usunięcie lewego powtórzenia granicznego prawie nie ma żadnego efektu (Shaw C.H. i wsp. „The right hand copy of the nopaline Ti plasmid 25 pz repeat is required for tumor formation Nucleic Acids Res. 12: 6031-6041 (1984); Jen G.C. & Chilton M.-D. „The right border region of pTiT37 T-DNA is intrinsically more active than the left border in promoting T-DNA transformation Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)

PL 191 113 B1

83: 3895-3899 (1986)). Analiza genetyczna pokazuje, że przenoszenie T-DNA jest polarne, a polarność jest określana przez orientację powtórzeń granicznych (Wang i wsp., Cell 38: 455-462 (1984); Peralta i Ream, Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 5112-5116 (1985)). Jest to prawdopodobnie spowodowane przez fakt, że nić T jest wytwarzana w kierunku od prawej do lewej (Albright i wsp., „Processing of the T-DNA of Agrobacterium tumefaciens generates border nicks and linear, single stranded T-DNA J. Bacteriol. 16, 1046-1055(1987)).

Otoczenie granicznych sekwencji T-DNA bardzo wpływa na ich aktywność. Sekwencje otaczające prawy obszar graniczny wzmagają, a sekwencje otaczające lewy obszar graniczny atenuują polarne przenoszenie DNA (Wang K i wsp. „Sequence context of the T-DNA border repeat element determines its relative activity during T-DNA transfer to plant cells Mol. Gen. Genet. 210; 338-346 (1987)). Cis-aktywna sekwencja 24 pz. zwana „overdrive jest obecna obok prawej granicy plazmidu oktopinowego (Peralta i wsp. EMBO J. 5: 1137-1142(1986); Shurviton & Ream., J. Bacteriol. 173: 5558-5563 (1991). Overdrive stymuluje transfer DNA nawet, gdy jest położony parę tysięcy par zasad od obszaru granicznego (Van Haaren M.J.J. i wsp., „Overdrive is a T-region transfer enhancer which stimulates T-strand production in A. tumefaciens, Nucleic Acids Res. 15: 8993-8997 (1987)). Jednak nie może samo w sobie powodować przenoszenia T-DNA (Peralta, E.G. i wsp., „overdrive, a T-DNA transmission enhancer on the „Agrobacterium tumefaciens tumour-inducing plasmid EMBO J. 5: 1137-1142 (1986); Van Haaren M.J.J. i wsp. „Functional analysis of the Agrobacterium tumefaciens octopine Ti-plasmid left and right T-region border fragment. Plant Mol. Biol. 8:95-104 (1987). Sekwencja overdrive została pierwotnie zlokalizowana w regionie na prawo od obszaru prawego powtórzenia granicznego oktopinowego TL-DNA plazmidu Ti. Podobne sekwencje są obecne w pobliżu prawego granicznego obszaru regionu pTi TR i obszarów agropinowych pRi TLiTR (Slightom i wsp. „Nucleotide sequence analysis of TL-DNA Agrobacterium rhizogenes type plasmid. Identification of open reading frames. J. Biol. Chem. 261: 108-121 (1986); Jounin i wsp. „Analysis of TR-DNA/plant junction in the genome of a Convolvulus arvensis clone transformed with Agrobacterium rhizogenes strain A4, Plant Mol. Biol. 12: 75-85 (1989)). Porównanie sekwencji w pobliżu prawego obszaru granicznego wykazało region 8 pz. zasad zwany sekwencją rdzenia (5'-TGTTTGTT-3'), występujący w różnej odległości na prawo od każdego prawego powtórzenia. Prawy obszar graniczny typu mannopiny w pRi8196 T-DNA nie zawiera żadnej sekwencji spokrewnionej z sekwencją overdrive, ale zawiera inną sekwencję 8 pz. (5'-ATTAGTTC-3') powtórzoną 6 razy (Hansen G. i wsp. „Agrobacterium rhizogenes pRi8196 T-DNA. Mapping and DNA sequence of functions involved in mannopine synthesis and hairy root differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 7763-7767 (1991). Sekwencja ta jest funkcjonalnie ekwiwalentna overdrive (Hansen G. i wsp. „A T-DNA transfer enhancer sequence in the vicinity of the right border of Agrobacterium rhizogenes Ri8196. Plant Mol. Biol. 20:113-122(1992)). Nie ma żadnej sekwencji bardzo przypominającej overdrive w pobliżu granic nopalinowego T-DNA (Wang K. i wsp., Sequence context of the T-DNA border repeat element determines its relative activity during T-DNA transfer to plant cells. Mol. Gen. Genet. 210:338-346(1987), ale to nie wyklucza, że jakaś inna sekwencja w tym obszarze odgrywa analogiczną rolę.

Prawa sekwencja graniczna 25 pz. stosowana w przykładach pochodzi z pTiAchS (Van Haaren, M.J.J., Plant Mol. Biol. 13:523-531 (1989)). Lewa sekwencja graniczna obecna na plazmidzie pNeoRBIuc pochodzi z pTiT37 (Bevan, Nucleic Acids Res. 12:8711-8721(1984)).

Choć wykazano, że sekwencje w pobliżu prawego obszaru granicznego mogą poprawiać przenoszenie DNA do komórki roślinnej, w doświadczeniach opisanych w przykładach wybrano minimalną długość prawej sekwencji granicznej, aby zminimalizować możliwe zniszczenie ekspresji genu lucyferazy. Jednak można stosować długie prawe sekwencje graniczne, które zawierają sekwencje podobne do enhancerów takie jak overdrive.

Chimeryczne geny zdolne do wytwarzania w komórce eukariotycznej białka, które promuje integrację wstawek DNA mogą być skonstruowane przy zastosowaniu standardowych technik inżynierii genetycznej, tak jak pokazują przykłady. Taki chimeryczny gen będzie się składał z sekwencji DNA kodującej białko, połączonej w sposób funkcjonalny z odpowiednimi sygnałami regulacyjnymi (np. promotor, sekwencja liderowa, terminator transkrypcji, miejsce poliadenylacji), które sterują ekspresją funkcjonalnie połączonej sekwencji kodującej w komórce eukariotycznej. Sekwencje kodujące i sygnały regulatorowe są znane i dokładnie opisane w literaturze. Aby polepszyć ekspresję białka promującego integrację można stosować syntetyczną wersję sekwencji kodującej, zoptymalizowaną dla ekspresji w docelowej komórce eukariotycznej.

PL 191 113 B1 mRNA zdolny do wytwarzania białka, które promuje integrację w komórce eukariotycznej może być przygotowany z zastosowaniem standardowych układów do wytwarzania zdolnych do ulegania translacji transkryptów poliA-mRNA kodujących pożądane białko, tak jak jest to pokazane w przykładach.

Egzogenny DNA i chimeryczny gen (geny) lub RNA kodujący (kodujące) białko (białka), które promują stabilną integrację egzogennego DNA mogą być dostarczone do komórki roślinnej na szereg różnych sposobów stosując standardowe, znane techniki. Konkretny sposób, wjaki składniki te są dostarczane do komórki nie jest istotny, oile białko (białka), które promuje stabilną integrację egzogennego DNA jest wytwarzane w tej samej komórce, co egzogenny fragment DNA podczas właściwego jak opisano poniżej) okresu czasu.

Nie jest konieczne by białka umożliwiające efekt promowania stabilnej integracji fragmentu egzogennego DNA w nienaruszonej formie były wytwarzane w komórce roślinnej zanim egzogenny fragment DNA jest wprowadzony do tej komórki, ani po integracji egzogennego fragmentu DNA w komórce. Jest natomiast konieczne, aby białka te były wytwarzane w komórce roślinnej wdostatecznej ilości, podczas okresu przejściowego, po dostarczeniu egzogennego fragmentu DNA do komórki i zanim egzogenny DNA zostanie zintegrowany. Może być zastosowany każdy sposób, którym wprowadza się chimeryczny gen lub mogący ulec translacji RNA do komórki eukariotycznej tak, aby w tym określonym zakresie czasu było wytwarzane kodowane białko.

Jak ilustrują przykłady wykonania, uzyskanie dostatecznej ilości białek, w odpowiednim okresie czasu jest możliwe przez wprowadzenie chimerycznego genu lub zdolnego do translacji RNA kodującego białko do komórki eukariotycznej wraz z egzogennym fragmentem DNA (tzn. przez równoczesne dostarczenie składników). To podejście jest preferowane, ponieważ obejmuje pojedyncze dostarczenie cząsteczek kwasów nukleinowych (DNA lub DNA i RNA) do komórki eukariotycznej, która ma ulec transformacji, a ponadto białko promujące integrację uzyskuje się tylko we właściwym czasie, zamiast wytwarzania stałego, które mogłoby niekorzystnie wpływać na normalny wzrost i rozwój komórki. W konsekwecji uzyskuje się wynik, który jest podobny do uzyskiwanego przy transformacji T-DNA, w której pośredniczy Agrobacterium tumefaciens.

Białko pochodzące od Agrobacterium, które może być wytwarzane w komórce roślinnej, obejmuje białka pochodzące z obszaru wirulencji plazmidu Ti lub Ri Agrobacterium. Korzystnie, wytwarzane białko (białka) są białkiem VirD2 lub kombinacją VirD2 zalbo VirD1, VirE2 lub zarówno VirD1 i VirD2. Ekspresja białek (białka) pochodzących od Agrobacterium w komórce roślinnej powoduje integrację egzogennego DNA jako nienaruszonego fragmentu przypominającego T-DNA Agrobacterium wintegrowanego do jego genomu.

Chimeryczne geny zdolne do wytwarzania w komórce roślinnej białka pochodzącego od Agrobacterium mogą być skonstruowane stosując standardowe techniki inżynierii genetycznej tak jak pokazują to przykłady. Taki chimeryczny gen będzie składał się z sekwencji DNA kodującej białko pochodzącej od Agrobacterium funkcjonalnie związanej z odpowiednimi sekwencjami regulatorowymi (np. promotor, lider, terminator transkrypcji, miejsce poliadenylacji), które sterują ekspresją funkcjonalnie połączonych sekwencji kodujących w komórce roślinnej. Takie sekwencje kodujące i sygnały regulatorowe są łatwo dostępne w dziedzinie. Sekwencje kodujące VirD1 i VirD2 stosowane w przykładach podane są w GenBank z numerem dostępu M14762.

RNA zdolny do wytwarzania w komórce roślinnej białka pochodzącego z Agrobacterium może być przygotowany, (co ilustrują przykłady) standardowymi metodami przygotowywania transkryptów poliA mRNA.

Egzogenny fragment DNA mający ulec integracji może być dowolnym fragmentem DNA, które osoba biegła w dziedzinie chce wintegrować w formie nienaruszonej do genomu rośliny tak, aby w komórce roślinnej, roślinie lub w hodowli komórek roślinnych, wyrażał konkretny biologicznie czynny RNA (np. antysensowny RNA lub rybozym) lub interesujące białko. Jedynym ograniczeniem jest, żeby fragment był otoczony przez jeden lub więcej granicznych T-DNA tak, aby mógł być rozpoznany przez białka VirD1 i VirD2, które będą na niego oddziaływać. Przyłączenie takich obszarów granicznych T-DNA do egzogennego fragmentu DNA jest opisane w przykładzie 1.

Każdy eukariont, który jest podatny na podanie kwasów nukleinowych za pomocą jednego lub więcej różnych mechanizmów dostępnych w dziedzinie, awięc grzyby, drożdże, komórki zwierzęce, a w szczególności komórki roślinne, może być użyty jako cel do transformacji. Dla drożdży przeniesienie T-DNA już pokazano, p. Piers i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. 93:1613-1618 (1996). Dla komórek zwierzęcych wykazano lokalizację jądrową VirD2 i VirE2 (po modyfikacji ich sygnałów lokalizacji)

PL 191 113 B1

p. Guralnick i wsp. Plant Cell 8:363-373 (1996). Sposoby dostarczania kwasów nukleinowych do różnych komórek zwierzęcych są dobrze znane w dziedzinie („Current Protocols in Molecular Biology t. 1-3, red. Ausubel, F.M. i wsp., wyd. John Wlley & Sons, Inc. (1995), zwłaszcza Rozdział 9, „Introduction of DNA into Mammalian Celles.).

Opisany proces transformacji daje w efekcie całkowity zestaw lub kolekcję stransformowanych komórek na ogół identyfikowanych przez ekspresję genu markerowego. Regeneracja komórek do roślin następnie dostarcza całkowity zestaw lub kolekcję stransformowanych roślin. Całkowity zestaw zarówno stransformowanych komórek roślinnych jak i zregenerowanych stransformowanych roślin może być scharakteryzowany za pomocą zdarzeń integracyjnych. W opisanym sposobie transformacji ponad 5% poszczególnych komórek lub roślin zawiera interesujący DNA połączony do genomowego DNA przez prawe graniczne sekwencje T-DNA Agrobacterium tak, jakby były wtransformowywane z zastosowaniem agroinfekcji. Korzystnie procent ten wynosi ponad 10%, przy czym na ogół obserwuje się od 5-70%, a bardziej korzystnie od 10-50%. Zestaw stransformowanych komórek lub roślin jest przeważnie oparty na 10 lub więcej niezależnych zdarzeń transformacyjnych.

Potencjalne docelowe rośliny obejmują zarówno rośliny jedno- jak i dwuliścienne, wtym nie tylko szczególnie ważne dla rolnictwa: kukurydzę i zboża, takie jak: pszenica, owies, żyto, sorgum, ryż, jęczmień, proso, darń i trawy paszowe oraz zboża tym podobne, ale także bawełnę, trzcinę cukrową, burak cukrowy, rzepak oleisty, banan, topolę, orzechy włoskie, tytoń i soję.

Każdy typ lub źródło roślin, które mogą posłużyć jako cel do transformacji przez jeden lub więcj z szeregu biologicznych i niebiologicznych metod dostarczania kwasów nukleinowych dostępnych w dziedzinie może też służyć jako cel do transformacji w sposobie według wynalazku. Mogą to, więc być: niedojrzałe i dojrzałe zarodki, pyłek, protoplasty, komórki z hodowli zawiesiny, komórki kalusa, liścienie lub inne części nasion i siewek, i liście lub części liści.

Stransformowane rośliny uzyskane sposobem według wynalazku będą zawierały wintegrowany nienaruszony egzogenny interesujący DNA. Ten wintegrowany interesujący DNA może zawierać częściowe sekwencje graniczne T-DNA zatrzymywane na wintegrowanym DNA po insercji T-DNA. Stransformowane rośliny mogą być stosowane do otrzymania transgenicznych roślinnych hodowli tkankowych według standardowych procedur dobrze znanych w dziedzinie.

Właściwości genetyczne nadane wytwarzanym roślinom transgenicznym i pochodzących od nich nasion są przekazywane za pomocą rozmnażania płciowego lub wzrostu wegetatywnego i mogą więc być utrzymane i namnażane wśród roślin potomnych. Ogólnie rzecz biorąc utrzymanie i namnażanie wykorzystuje znane metody rolnicze opracowane dla specyficznych celów takie jak uprawa, siew, lub zbieranie. Specjalistyczne procesy takie jak hydroponika lub technologie szklarniowe mogą być także wykorzystane. Jako, że rosnące zbiory są wrażliwe na atak i zniszczenia powodowane przez owady lub zakażenia, a także na współzawodnictwo przez chwasty, podejmuje się odpowiednie kroki, aby kontrolować chwasty, choroby roślinne, owady, nicienie i inne niekorzystne warunki by poprawić plony. Obejmuje to środki mechaniczne takie jak uprawa ziemi lub usuwanie chwastów i zakażonych roślin oraz stosowanie agrochemikaliów takich jak herbicydy, fungicydy, gametocydy, nematocydy, regulatory wzrostu, środki sprzyjające dojrzewaniu i insektycydy.

Zastosowanie korzystnych właściowości genetycznych transgenicznych roślin i nasion może być także dokonane w hodowli roślin, której celem jest opracowanie roślin z ulepszonymi właściwościami takimi jak tolerancja szkodników, herbicydów czy stresu, polepszona wartość odżywcza, zwiększone plony, lub polepszona struktura powodująca mniejsze straty przy wylęganiu lub rozpadaniu. Różne etapy hodowli są określone przez dobrze zdefiniowane ludzkie interwencje takie jak wybór linii do krzyżowania, sterowanie zapylaniem linii rodzicielskich, lub wybór odpowiednich roślin potomnych. W zależności od pożądanych właściwości stosuje się różne, znane techniki, które obejmują: hybrydyzację, chów wsobny, krzyżówki wsteczne, krzyżówki między wieloma liniami, mieszanie odmian, hybrydyzację międzygatunkową, techniki aneuploidów itp. Techniki hybrydyzacji obejmują sterylizację roślin, prowadzoną za pomocą metod mechanicznych, chemicznych lub biochemicznych i prowadzącą do wytwarzania męsko lub żeńsko sterylnych roślin. Krzyżowe zapylenie męskosterylnej rośliny pyłkiem innej linii zapewnia, że genom męskosterylnej, ale żeńsko płodnej rośliny uzyska równomiernie właściwości obu linii rodzicielskich. Tak, więc transgeniczne nasiona i rośliny mogą być stosowane do wyhodowania polepszonych linii roślin, które na przykład zwiększają efektywność konwencjonalnych metod takich jak działanie herbicydów lub pestycydów lub pozwalają na nie stosowanie rzeczonych metod ze względu na swe zmodyfikowane właściwości genetyczne. Możliwe jest też uzyskanie nowych roślin hodowlanych z poprawioną tolerancją na stres, które ze względu na swoje

PL 191 113 B1 zoptymalizowane „wyposażenie” genetyczne dadzą zbierane produkty lepszej jakości niż produkty, które nie są zdolne do tolerowania porównywalnych niekorzystnych warunków rozwojowych.

W produkcji nasion jakość kiełkowania i jednorodność nasion są istotnymi cechami produktu podczas, gdy jakość kiełkowania i jednorodność nasion zbieranych i sprzedawanych przez rolnika nie jest istotna. Jako, że trudne jest utrzymywanie jednej rośliny uprawnej wolnej od innych nasion i innych roślin, aby kontrolować choroby przenoszone przez nasiona, i, aby produkować nasiona z dobrą jakością kiełkowania opracowane zostały przez producentów nasion dość rozbudowane praktyki produkcji nasion. Tak więc jest częstą praktyką, że rolnik kupuje atestowane nasiona spełniające specyficzne standardy jakości zamiast stosować nasiona zebrane z własnych plonów. Materiał do rozmnażania do stosowania jako nasiona jest na ogół traktowany ochronną substancją zawierającą herbicydy, insektycydy, fungicydy, środki bakteriobójcze, nematocydy, środki mięczakobójcze i ich mieszaniny. Często stosowane ochronne związki do powlekania obejmują takie związki jak kaptan, karboksyn, tiram (TMTD), methalaksyl (APron) i pirimifos-metyl (Actellic). Jeśli jest to pożądane związki te mogą występować z dodatkowymi nośnikami, związkami powierzchniowo czynnymi lub adiuwantami ułatwiającymi nakładanie zwyczajowo stosowanymi w dziedzinie przygotowywania takich kompozycji, aby zapewnić ochronę przeciw szkodom powodowanym przez bakterie, grzyby lub zwierzęta. Ochronne powleczenia mogą być nakładane przez impregnację materiału do rozsiewu środkami płynnymi lub przez powlekanie łącznie proszkami lub płynami. Możliwe jest też nanoszenie odpowiednich środków na pączki lub owoce.

Ilości składników dostarczanych do komórki mogą zmieniać się w zależności od sposobu i postaci, w której dany składnik jest dostarczany. Jeśli jest to pożądane, specjalista może rutynowo zmieniać ilość każdego dostarczanego składnika wcelu ustalenia optymalnego poziomu każdego przy zastosowaniu danego systemu dostarczania. W przykładzie 1 opisany jest korzystny, konkretny przypadek, który może stanowić punkt wyjścia dla dalszej optymalizacji.

Dostarczanie składników do komórki roślinnej może być prowadzone przez stosowanie różnorodnych technik, dostępnych w dziedzinie do dostarczania kwasów nukleinowych do roślin. Mogą to być mechanizmy biologiczne, takie jak transformacja T-DNA, w której pośredniczy Agrobacterium (p. np. WO 95/35388 pt. „Plant Genetic Transformation Methods and Transgenic Plants) i niebiologiczne, takie jak bombardowanie mikropociskami, elektroporacja, mikroinjekcje, indukowane pobieranie, i wstrzykiwanie za pomocą strumienia aerozolu. Preferowane jest równoczesne dostarczanie wszystkich składników, tzn. egzogennego DNA i chimerycznych genów lub RNA kodujących białka, które promują integrację egzogennego DNAdo komórki roślinnej.

Oczekuje się, że mRNA kodujący białko promujące integrację DNA wytworzy to białko w komórce roślinnej, zanim sam zostanie zdegradowany. Oczekuje się też, że białko wytwarzane z tego mRNA pozostanie w komórce roślinnej zanim i ono także zostanie zdegradowane w wyniku normalnych procesów komórkowych. Tak więc, białka mogą być dostarczane do komórki roślinnej tylko na pewien okres czasu. Takie okresowe dostarczanie białka jest szczególnie korzystne w sytuacjach, kiedy ciągła obecność takich białek mogłaby mieć niepożądane efekty. Ten sam efekt można uzyskać przez wprowadzenie chimerycznego genu kodującego białko promujące integrację w postaci, która nie może łatwo wintegrować się do genomu komórki roślinnej.

W przypadkach, kiedy białka promujące integrację są dostarczane do komórki przez gen chimeryczny, odpowiednie geny chimeryczne są korzystnie dodawane łącznie z egzogennym fragmentem DNA jako odrębne cząsteczki DNA, choć mogą też być połączone i dodawane jako jedna cząsteczka DNA. Dostarczanie jako odrębne cząsteczki DNA pozwala na zmianę i optymalizację stosunku chimerycznego genu do egzogennego fragmentu DNA. Jest też prawdopodobnie bardziej wygodne przygotowanie obu konstruktów jako odrębnych cząsteczek.

Można oczekiwać, że stabilna inkorporacja takich chimerycznych genów do genomu poprzez losową integrację będzie zachodzić z mierzalną częstością względem ukierunkowanej integracji egzogennego DNA otoczonego przez sekwencje graniczne T-DNA. Aby ułatwić oddzielenie takich losowych przypadków integracji od ukierunkowanej integracji egzogennego DNA chimeryczne geny kodujące białka promujące integrację mogą korzystnie być dostarczone jako pojedyncza cząsteczka DNA, oddzielnie od egzogennego DNA. Stosując to podejście, kopie genów chimerycznych będą prawdopodobnie wintegrowane winny locus od ukierunkowanej integracji egzogennego DNA otoczonego przez sekwencje graniczne T-DNA. W efekcie łatwo można uzyskać rozdział ukierunkowanych przypadków integracji dotyczących egzogennego DNA od losowo wintegrowanych genów VirD1 i VirD2 przez wyhodowanie roślin pochodzących od stransformowanych komórek roślinnych.

PL 191 113 B1

Jako nośnik do dostarczenia chimerycznego genu DNA albo RNA kodującego białko promujące integrację do komórki roślinnej może być stosowany wirusowy wektor roślinny. Wektory takie mogą być spreparowane z replikonów wirusów roślinnych, takich jak replikony geminiwirusów (Ugaki M., Nucleic Acids Research 19: 371-377(1994)) i wektorów z wirusów RNA (Sablowski, R.W., Proc. Natl. Acad. Sci. 92:6901-6907 (1995)) do inkorporacji i ekspresji pożądanego DNA lub RNA w komórce roślinnej. Ponieważ wektory te typowo replikują w docelowej komórce roślinnej, uzyskana jest amplifikacja chimerycznego genu lub RNA wprowadzonego do takich wektorów i wzrost ilości produkowanego przez nie białka. Także nie oczekuje się, by wektory wirusowe tego typu integrowały do genomu komórki, ponieważ replikony wirusowe, z których pochodzą, normalnie tego nie robią. Tak więc taki sposób ma zaletę przejściowego wytwarzania dużych ilości białek promujących integrację zarazem obniżając niebezpieczeństwo integracji chimerycznych genów produkujących takie białka. Może także być korzystne zastosowanie takich wektorów do uprzedniej infekcji ogólnoustrojowej komórek roślinnych mających ulec transformacji, co pozwala na dostarczenie egzogennego DNA, które chce się wintegrować w większych ilościach przez uniknięcie konieczności jednoczesnego dostarczania DNA lub RNA kodującego białko lub białka promujące integrację.

Wirusowy wektor roślinny może być użyty jako środek do dostarczenia egzogennego fragmentu DNA mającego ulec integracji w komórce roślinnej. Ponieważ wektory te ulegają replikacji w docelowej komórce roślinnej, ich zastosowanie w ten sposób amplifikuje ilość egzogennych matryc fragmentów DNA dostępnych dla integracji.

Do dostarczenia zarówno egzogennego fragmentu DNA mającego ulec integracji i chimerycznego genu kodującego białko promujące integrację do komórki roślinnej może być użyty ten sam wektor wirusowy albo mogą być użyte dwa oddzielne wektory wirusowe.

Transformacja, w której pośredniczy Agrobacterium w dostarczaniu wektora(ów) wirusowego do komórki roślinnej określana jest jako „agroinfekcja (p. Grimsley i wsp., Nature 325:177-179 (1987)).

Jako alternatywa dla wspólnego dostarczania chimerycznych genów kodujących białka, promujące integrację z egzogennym DNA, egzogenny DNA może być dostarczony do transgenicznej komórki roślinnej już zawierającej te geny stabilnie wintegrowane do jej genomu. Transgeniczne rośliny lub hodowle tkankowe transgenicznych komórek roślinnych generowanych przez transformację, stosując standardowe techniki z cząsteczkami DNA obejmującymi geny chimeryczne kodujące białka promujące integrację, mogą być stosowane jako źródło takich transgenicznych komórek roślinnych. Stosując to podejście sterowane przypadki integracji obejmujące egzogenny DNA mogą być oddzielone od stabilnie wintegrowanych genów chimerycznych przez krzyżowanie roślin pochodzących ze stransformowanych komórek roślinnych (p. np. Peerbolte, R. i wsp. „Transformation of plant protoplasts with DNA: cotransformation of non-selected calf thymus carrier DNA and meiotic segregation of transforming DNA sequences, Plant Mol. Biol. 5(4):235-246 (1985).

Chociaż wynalazek jest opisany jako transformacja pojedynczej komórki, metody dostarczania składników (z wyjątkiem mikroinjekcji) są typowymi metodami stosowanymi także do populacji komórek w formie hodowli tkankowej, kalusa lub tkanki wyciętej z całej rośliny. W efekcie stosowane są różnorodne techniki dostarczania, identyfikacji i/lub selekcji stabilnie transformowanych komórek roślinnych z mieszanej populacji stransformowanych i niestransformowanych komórek roślinnych (np. Dekeyser, R. i wsp. „Evaluation of selectable markers for rice transformation, Plant Physiol. 90(1):217-223 (1989)). Odnośnie składnika egzogennego DNA stosowane są niebiologiczne metody dostarczania jako dające dwa typy przypadków integracji: (1) prosta insercja nienaruszonego egzogennego fragmentu DNA otoczonego przez sekwencje graniczne T-DNA, ukierunkowana przez obecność białka (białek) promującego takie wypadki integracyjne i (2) losowa integracja różnych części i permutacji egzogennego DNA charakterystyczna dla stosowanej niebiologicznej metody wprowadzania. Te dwa typy integracji mogą być łatwo rozróżnione przez zastosowanie standardowych analitycznych narzędzi molekularnych do genomowego DNA transformowanej rośliny takich jak hybrydyzacja typu Southerna trawionego restryktazami genomowego DNA stosując egzogenny fragment DNA lub jego podfragmenty jako sondę, techniki oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy (PGR) zaplanowane do detekcji obecności egzogennego fragmentu DNA w nienaruszonej formie. Dla komórek roślinnych, które zawierają oba typy integracji, takie integracje mogą być rozdzielone w pochodzących z komórek transgenicznych roślinach przez klasyczne krzyżowanie. Stosując te narzędzia, transgeniczne komórki roślinne lub rośliny mające prostą insercję nienaruszonego egzogennego fragmentu

PL 191 113 B1

DNA otoczonego przez graniczne sekwencje T-DNA mogą być zidentyfikowane i wykorzystane do wygenerowania transgenicznych kodowli komórek roślinnych i/lub transgenicznych roślin i ich potomstwa.

Dla realizacji wynalazku możliwe jest stosowanie dodatkowych układów, w których występują białka promujące integrację i sekwencje rozpoznawane analogiczne do białek Vir i sekwencji granicznych T-DNA tak modyfikowane, że polepszają częstość zachodzenia prostych zjawisk integracji w eukariotycznej komórce mającej ulec transformacji. Na przykład nagromadzone dane sugerują, że istnieje bliski stosunek między przenoszeniem T-DNA z Agrobacterium do roślin i koniugacją bakteryjną, w której pośredniczy plazmid. Znaleziono pokrewieństwa sekwencji pomiędzy (i) obszarem nacięcia sekwencji granicznych Tiori transferu incP; (ii) skupienia genów operonu virD i operonu relaksazy (Tral/TraJ). Tral i VirD2 jak i ich cele - obszar nacięcia oriT RP4 i obszary powtórzone granicznych sekwencji T, odpowiednio, mają znaczące podobieństwo (p. WO 88/03564 pt. „Plant Transformation). In vitro, Tral i VirD2 są każdy z nich wystarczające by dać nacięcia w jednoniciowych oligonu-kleotydach niosących ich odpowiednie miejsca nacinania (p. Pansegrau i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90:11538-11542 (1993)). W obecności nadmiaru produktów cięcia, zarówno Tral i VirD2 mogą także katalizować przeciwną reakcję, łącząc dwa kawałki jednoniciowego DNA. VirD2 może także katalizować przecięcie oriT. Znaleziono także funkcjonalne podobieństwa między białkami Rep geminiwirusów lub białek związanych z replikacją bakteriofagów i plazmidów według modelu toczącego się koła i, z drugiej strony, białkami biorącymi udział w koniugacyjnym przeniesieniu DNA u bakterii lub w przeniesieniu i integracji T-DNA z Agrobacterium do genomu roślinnego (Heyraud-Nitschke F. i wsp. Nuci. Acids Res. 910-916 (1995)).

Opis rysunków

Figura 1(A-B): Pokazane są struktury plazmidów użytych w doświadczeniach opisanych w przykładzie 1. Składniki tych plazmidów są opisane w części Materiały i Metody Przykładu 1. RB odpowiada 25-pz prawej sekwencji granicznej. Miejsca restrykcyjne są pokazane w następujący sposób: E=EcoRI; P=Pstl.

Figura 2: Pokazana jest schematycznie budowa plazmidu pNeoRLuc. LB -lewa sekwencja graniczna, RB - prawa sekwencja graniczna. W ramkach nad wykresem pokazane są sondy stosowane do analizy typu Southerna transformantów. Miejsca restrykcyjne są pokazane w następujący sposób: E=EcoRI; P=Pstl; X=Xbal, H=Hindlll. „NOS” oznacza promotor syntazy nopaliny. „NPTII” oznacza otwartą ramkę odczytu fosfotransferazy II neomycyny. „NOST” oznacza terminator syntazy nopaliny. „CaMV 35S” oznacza promotor 35S z wirusa mozaiki kalafiora (CaMV). „LUC” oznacza otwartą ramką odczytu dla lucyferazy. „35 T oznacza terminator transkryptu CaMV 35S.

Figura 3: Analiza sekwencji docelowych miejsc roślinnego DNA po transformacji pNeoRBLuc, p35SD1 i p35SD2. Liczby dotyczą numerów określających klony. Prawa sekwencja graniczna niesiona przez pNeoRBLuc zapisana jest małymi literami (ścieżka Rb.styk). Docelowe sekwencje roślinne fragmentów 1, 2a, 3i5, odpowiednio, wykazują 100% homologii z PSII tytoniu (X62426; nt908), 100% z NtplI10 tytoniu (X70088; nt 573), 100% z karboksylazą rybulozo 1,5 bisfosforanu tytoniu (X02353; nt 2174) i 80% homologii z białkiem wiążącym chlorofil petunii (M21317;nt1013).

Figura 4 (A-F). Mapy plazmidów użytych w przykładach 3i4. Skróty stosowane są tak jak opisano w części „Materiały i Metody Przykładu 3.

Figura 5 (A-B). Schemat plazmidów pwAdhD1, pwAdhD2, pwBarRBLuc, i pBARRBLuc stosowanych w przykładzie 5.

Figura 6. Schemat plazmidu pCIB1711 (p. przykład 1).

Figura 7. Schemat plazmidu pCIB1711deltaB (p. przykład 7).

Figura 8. Schemat plazmidu pCIB1711deltaB -H,N (p. przykład 7).

Figura 9. Schemat plazmidu pCIB1711-H,N-B (p. przykład 7).

Figura 10. Schemat plazmidu pCIB1711-H,N (p. przykład 7).

Figura 11. Schemat plazmidu pBS-NC (p. przykład 7).

Figura 12. Schemat plazmidu pBS-NC-RB (p. przykład 7).

Figura 13. Schemat plazmidu UbiPATdl (p. przykład 7).

Figura 14. Schemat plazmidu LB.UbiPATdl (p. przykład 7).

Figura 15. Schemat plazmidu pAVM1 (p. przykład 7).

Figura 16. Schemat plazmidu p35SD2 (p. przykład 8).

Figura 17(A-B). Schemat preparatyki fragmentów A-C z fragmentu EcoRI p35SD2 zawierającego otwartą ramkę odczytu virD2 (p. przykład 8).

PL 191 113 B1

Figura 18. Schemat plazmidu pTC182 (p. przykład 8).

Figura 19. Schemat plazmidu pTC182-A (p. przykład 8).

Figura 20. Schemat plazmidu pTC182-B (p. przykład 8).

Figura 21. Schemat plazmidu pUC21 (p. przykład 8).

Figura 22. Schemat plazmidu pC-21-X (p. przykład 8).

Figura 23. Schemat plazmidu pUC21-C (p. przykład 8).

Figura 24. Schemat plazmidu pUC21-virD2 (p. przykład 8).

Figura 25. Schemat plazmidu T7poliA (p. przykład 8).

Figura 26. Schemat plazmidu T7virD2poliA (p. przykład 8).

PRZYKŁADY

Standardowe techniki rekombinacji DNAi molekularne techniki klonowania tu stosowane są dobrze znane w dziedzinie i są opisane wJ. Sambrook, E.F. Fritsch i T. Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) i T. Silhavy, M.L. Berman, i L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984).

P r z y k ł a d 1. „Agrolistyczna” transformacja komórek roślinnych: Integracja nici T generowanych w roślinach po biolistycznym dostarczeniu genów VirD1 i VirD2 i podlegającego selekcji genu markerowego otoczonego przez T-DNA.

A. Streszczenie

Geny wirulencji VirD1 i VirD2 są wymagane do wycinania nici T z plazmidu Ti w Agrobacterium tumefaciens przed dostarczeniem do roślin gospodarzy, gdy T-DNA wbudowuje się do jądrowego DNA roślin. Zastosowaliśmy biolistyczne dostarczanie plazmidowego DNA do sprawdzenia wiązania i/lub specyficznego w stosunku do miejsca nacinania granicznej sekwencji T-DNA przez VirD1 i VirD2 in planta. Złote mikropociski powleczono mieszaniną 3 plazmidów, zawierających odpowiednio regiony kodujące VirD1 i VirD2 pod kontrolą promotora CaMV35S i genu testowego zawierającego prawą sekwencję graniczną wstawioną między promotorem CaMV35S i regionem kodującym lucyferazy. Badaliśmy przejściową ekspresję lucyferazy, aby sprawdzić integralność i dostępność dla transkrypcji testowanego genu. Zarówno w komórkach tytoniu i kukurydzy przejściowa ekspresja genu lucyferazy była silnie hamowana przez wspólne dostarczenie plazmidów VirD1 i VirD2. Inhibicja była większa, gdy zwiększono stosunek plazmidów VirD do plazmidu z testowanym genem. Znaczące hamowanie zachodziło tylko z jedną orientacją sekwencji granicznej tzn. tą orientacją, która by doprowadziła do nacinania przez VirD2 nici DNA, która stanowi matrycę dla lucyferazowego mRNA. Efekt samego VirD1 lub samego VirD2 był słabszy. Biolistyczne dostarczenie wektora do transformacji z selekcjonowalnym markerem i testowym genem lucyferazy oraz mieszanina plazmidów VirD dała umiarkowaną częstość „agrolistycznych” wstawek, których prawe złącza z DNA roślinnym zawierały dokładnie sekwencję, której oczekiwano dla zjawisk insercji T-DNA. Znaleźliśmy zdarzenia zarówno bioloistyczne jaki agrolistyczne w pewnych liniach transformantów.

B. Wstęp

Dostarczanie genów przez bombardowanie cząsteczkami stało się szeroko przyjętą techniką z szerokimi zastosowaniami do transformacji u roślin (przegląd - Ahl Goy i Duesing, 1995). Na przykład opracowano za pomocą tej metody kukurydzę oporną na omacnicę prosowiankę (Koziel i wsp., 1993). W czasie opracowywania produktu konieczne jest ustalenie struktury i liczby kopii transgenów jaki ich stabilność. Najbardziej pożądany produkt byłby taki, który posiada pojedynczą prostą wstawką bez dodatkowego plazmidowego wektorowego DNA. Jednak w transformacji za pomocą bombardowania mikropociskami jest tendencja do integrowania wielokrotnych kopii wprowadzanego genu wraz z wektorem plazmidowym (Klein i wsp., 1988; Klein i wsp., 1989; Gordon-Kamm W.J. i wsp., 1990; Vasil i wsp., 1992; Wan, Y. i Lemaux P, 1994). Procedura ta wydaje się sprzyjać konkatemeryzacji plazmidów, albo przed albo w czasie integracji. Wielokrotne kopie wintegrowane w czasie transformacji biolistycznej są na ogół sprzężone genetycznie i nie mogą być następnie rozdzielone w czasie krzyżowania.

Wielokrotne kopie transgenów mogą doprowadzić do niestabilności ich ekspresji za pomocą kilku mechanizmów (przegląd w Matzke M. i Matzke A., 1995), wielokrotne kopie transgenów mogą oddziaływać inaktywując się nawzajem i spokrewnione geny gospodarza za pomocą epigenetycznych mechanizmów określanych jako „kosupresja” lub „wyciszanie genów”. Dodatkowo rekombinacja homologiczna może powodować genetyczną niestabilność wielokrotnych kopii. Z tych powodów redukcja

PL 191 113 B1 liczby kopii wstawionych transgenów powinna okazać się korzystna dla utrzymania nienaruszonej struktury wprowadzonych genów.

Wzór integracji obcych genów wprowadzonych poprzez transformację, w której pośredniczy Agrobacterium jest na ogół uderzająco odmienny od wynikającego z bombardowania cząsteczkami komórek roślin (przegląd- Chilton, 1993). Liczba kopii nienaruszonych i zrearanżowanych transgenów wynikających z biolistycznego wprowadzania przekracza, często znacznie, liczbę kopii transgenów wprowadzanych do roślin przez układ Agrobacterium. Agrobacterium wykształcił mechanizm, w którym transferowane geny są zlokalizowane na plazmidach zwanych plazmidami indukującymi guz (Ti) albo plazmidami indukującymi korzenie (Ri) (przegląd - Kado, 1993). Specyficzny odcinek zwany T-DNA (transferowany DNA) plamizdowego DNA Ti lub Ri, który jest oflankowany na plazmidzie Ti/Ri przez 25-pz bezpośrednie powtórzone sekwencje graniczne wądruje z bakterii do jądra komórkowego i ulega integracji do chromosomalnego DNA rośliny. Złożony mechanizm przenoszenia DNA jest zakodowany w serii genów wirulencji (vir) (przegląd - Zambryski, 1992). Aktywacja genów vir powoduje powstanie naciąć specyficznych w stosunku do miejsca w powtórzeniach granicznych T-DNA i powoduje powstanie liniowej jednoniciowej cząsteczki DNA (nić T) odpowiadającej dolnej nici T-DNA. Nadacie wymaga dwóch polipeptydów kodowanych przez operon VirD: VirD1 i VirD2 (Stachel i Nester, 1986; Stachel i wsp., 1987; Herrera-Estrella i wsp., 1988; DeVos i Zambryski, 1989; Durrenberger i wsp., 1989; Howard i wsp., 1989; Koukolikova-Nicola i wsp., 1993). VirD1 wykazuje aktywność relaksującą DNA (Ghai i Das, 1990; Filichkin i Gelvin, 1993) podczas, gdy VirD2 ma aktywność endonukleazy, która przecina dolną nić sekwencji granicznej (Stachel i wsp., 1986; Yanofsky i wsp., 1986; Wachel i wsp., 1987; Albright i wsp., 1987). Doświadczenia in vitro także wykazały, że oczyszczony VirD2 specyficznie nacina jednoniciowy DNA (Pansegrau i wsp., 1993; Jasper i wsp., 1994). Ani superzwinięty ani zrelaksowany dwuniciowy DNA nie działa jako substrat do cięcia przez sam VirD2 in vitro (Jasper i wsp., 1994).

VirD2 przyłącza sią kowalencyjnie do 5' końca naciętego DNA (Ward i Barnes, 1988; Young i Nester, 1988; Howard i wsp., 1989) poprzez resztę tyrozyny 29 (Durrenberger i wsp., 1989; Vogel iDas, 1992; Pansegrau i wsp., 1993). Drugie nacięcie w lewej sekwencji granicznej doprowadza do uwolnienia nici T. Nić T jest dodatkowo pokryta na całej swojej długości przez białko wiążące pojedynczą nić VirE2. VirD2 i VirE2 zawierają sygnały lokalizacji jądrowej (NLS) - uważa się, że to one naprowadzają nić T do jądra komórkowego komórki roślinnej (Herrera-Estrella, 1990; Howard i wsp., 1992; Shurvinton i wsp. 1992; Tinland i wsp. 1992; Rossi i wsp. 1993). NLS VirD2 i VirE2 są rozpoznawane u tytoniu i kukurydzy (Citovsky i wsp., 1994) ale ich skuteczność zależy od stadium rozwoju tkanki. Ostatnie dane popierają pogląd, że VirD2 może brać udział w ligacji 5' końca nici T do DNA rośliny (Tinland i wsp., 1995).

W obecnych badaniach opracowaliśmy nowy sposób transformacji roślin, który łączy pewne korzyści systemu Agrobacterium z udowodnioną wysoką skutecznością sposobu biolistycznego i innych dostarczania DNA do szerokiego zakresu roślin hodowlanych. Jest zaplanowany, aby wintegrować interesujący gen bez sekwencji wektorowych tak jak we wstawkach T-DNA i, aby kontrolować liczbą kopii. Nasze podejście to zastosowanie kaset ekspresyjnych roślin dla genów VirD1 i VirD2 dostarczanych wspólnie z transformującym plazmidem zawierającym sekwencje graniczne T flankujące marker mogący podlegać selekcji. Stwierdziliśmy, że przejściowo eksprymowane produkty genów VirD1 i VirD2 mogą w istocie ciąć graniczne sekwencje T-DNA in planta i produkować zdarzenia typu insercja T-DNA (zdarzenia „agrolistyczne”) po podaniu biolistycznym.

C. Materiały i metody

1. Plazmidy

Struktury wszystkich stosowanych wstawek plazmidów są przedstawione na fig. 1.

pCIB1711 jest pochodną pUN zawierającą gen lucyferazy świetlika pod kontrolą promotora wirusa mozaiki kalafiora 35S (CaMV35S).

Konstrukcja pCIB1711 pCIB1711 zawiera gen lucyferazy połączony z sygnałami ekspresji 35S. Wyjściowy wektor pCIB710 (Rothstein i wzp. 1987) był modyfikowany przed wstawieniem genu lucyferazy przez usunięcie unikalnych miejsc restrykcyjnych Pstl i Narl. Miejsce Pstl umieszczone przed promotorem CaMV usunięto przez przecięcie w przylegających miejscach restrykcyjnych Sali i Sphl i ligację syntetycznego linkera [5'-TCGACATG-3'], aby odtworzyć miejsce SalI i usunąć miejsca Sphl i Pstl. Miejsce Narl umieszczone 3' od sekwencji poliadenylacji CaMV zostało usunięte przez cięcie Narl i Ndel wycinając fragment 52pz, a następnie przeprowadzono trawienie Klenowem i ligację tępych końców. Plazmidy

PL 191 113 B1 pJD204 (Ow i wsp., Science 234: 856-859 (1986)) i pDO04 (De Wet i wsp., Mol. Cell. Biol. 7(2): 725-737 (1987)) otrzymano odpowiednio od Dr. Donalda Helinskiego i Dr. Steve'a Howella. Fragment 1826 pz Hindlll-BamHI z pJD204 zawierający gen lucyferazy, 22 pz 5' UTL lucyferazy i około 130 pz 3' końca poddano ligacji z syntetycznym linkerem z oligonukleotydów

5'-GATCCCTGCAGA-3' (SEKW. NR ID 3) i 5'-AGCTTCTGCAGG-3' (SEKW. NR ID 4) w miejsce BamHI pCIB710 tak by była umieszczona między promotorem 35S i sygnałami poliadenylacji.

Wstawienie genu lucyferazy do zmodyfikowanego wektora pCIB710 dało pCIB1701. pCIB1711 skonstruowano przez strawienie pCIB1701 Pstl i Narl i ligację powstałego plazmidu z linkerem R5B1 zawierającym lider i 5' koniec genu.

Linker R5B1 składa się z fragmentu z następujących komplementarnych oligomerów:

5'-ATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCT

ATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGATCCCTGCAGGACACGCTGAAATCACCAG

TCTCTCTCTACAAATCTATCTCTCTCTATG-3' (SEKW. ID NR: 5) oraz

5'-GATCCATAGAGAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACTGGTGATTTCAGCGTGTCCTGCAGG

GATCCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCGAAGGATAGTG

GGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGAT-3' (SEKW. ID NR: 6).

Dla wprowadzenia granic T-DNA połączono dwa syntetyczne oligonukleotydy odpowiadające prawej sekwencji granicznej LBA5269 (Van Haaren i wsp., 1989), aby uzyskać dupleks:

5'-ATCCGCAGGATATATACCGTTGTAATTCTGCA-3' (SEKW. NR ID 7).

Ten dupleks oflankowany miejscami BamHI-Pstl wstawiono w odpowiednie miejsca pCIB1711 pomiędzy promotorem i sekwencją kodującą lucyferazy dając pRB(+)Luc. W pRB(-)Luc prawa sekwencja graniczna została wprowadzona w odwrotnej orientacji w stosunku do promotora. pNeoRBLuc został zaprojektowany do stabilnej transformacji komórek tytoniu w zawiesinie i zawiera lewą sekwencją graniczną, gen fosfotransferazy neomycyny (npA1) igen lucyferazy z prawą graniczną sekwencją wstawioną pomiędzy promotorem i regionem kodującym lucyferazy z pRB(+)Luc (fig. 2). Gen nptll sterowany przez promotor nos (syntazy nopaliny) wycięto z plazmidu pBin19 jako fragment 2.2 kb Sacll-Hindlll (Bevan, 1984). Lewą sekwencję graniczną wycięto z pBin19 jako fragment BglllEcoRI. Oba te fragmenty wstawiono do miejsc Xbal-Hindlll pRB(+)Luc. pNeoLuc jest ekwiwalentem pNeoRBIuc bez prawej sekwencji granicznej wstawionej pomiędzy promotorem CaMVS35 i regionem kodującym lucyferazy.

Geny VirD1 i VirD2 z pTiA6 subklonowano w wektorze ekspresyjnym pMF6 (Callis i wsp., 1987) składającym się z promotora CaMV35S (0,5 kb), pierwszego intronu Adh1 (0,5 kb), i regionu poliadenylacji syntazy nopaliny nos (0,25 kb) (fig. 1). Fragment 0,6 kb EcoRI-Pstl z pAD1187 (Ghai i Das, 1989) odpowiadający sekwencji kodującej VirD1 został sklonowany w pMF6 dając p35SAdhD1. Sekwencja kodująca VirD2 została wycięta jako fragment 1,8 kb EcoRI z pAD1190 (Ghai i Das, 1989) i sklonowana w pMF6. Uzyskane plazmidy, p35SAdhD2 i p35SAdhD2(rev) zawierały region kodujący VirD2 albo w orientacji sensownej albo w antysensownej. Sekwencja intronu Adh1 została wydeletowana z p35SAdhD1, p35SAdhD2 i p35SAdhD2(rev), aby stworzyć odpowiednio p35SD1, p35SD2 i p35SD2(rev) do eksperymentów planowanych dla tkanek tytoniu.

pGUS jest pochodną pUC zawierającą sekwencję kodującą b-glukuronidazy (GUS) pod kontrolą promotora CaMV35S i intron genu katalazy rycyny (Ohta i wsp., 1990).

2. Materiał roślinny

Komórki kukurydzy w zawiesinie: Hodowle zawiesinowe kukurydzy (Zea mays L.) inicjowano z zamrożonych kalusów embriogenicznych typu II wybranych z niedojrzałych embrionów linii Elite spokrewnionej z B73. Około 1 g zamrożonego kalusa (DiMaio i Shilito, 1992) dodano do 50 ml płynnego podłoża N6 (Chu i wsp., 1975) uzupełnionego 30 g/l sacharozy i2 mg/l kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego (2,4-D) (2N63S). Hodowle inkubowano w25°C w ciemności w wytrząsarce

PL 191 113 B1 orbitalnej przy 150 obr/min. Subkultury przeprowadzano co 7 dni przez przeniesienie 1 ml objętości upakowanych komórek do 50 ml świeżej pożywki 2N63S.

Zawiesiny komórek kukurydzy stosowane do doświadczeń z bombardowaniem pobierano z 3-dniowych szybko rosnących hodowli. Przed bombardowaniem około 0,5 ml objętości upakowanych komórek przesączano w próżni na filtry 7 cm (Whatman Nr 4). Filtry następnie przenoszono na N6 pożywkę zestaloną za pomocą gelrite zawierającą 120 g/l sacharozy. Po wysianiu komórki trzymano 4 godziny w25°C przed bombardowaniem. Po bombardowaniu płytki inkubowano w25°C przez 24 godz.

Komórki tytoniu w zawiesinie: Linia komórkowa Nicotiana tabacum NT-1 (An, 1985) była hodowana w pożywce wg Murashige i Skoog (Murashige i Skoog) uzupełnionej 2 mg/l 2,4-D i sacharozą (30 g/l) (MS3S). Komórki brano do subkultur raz na tydzień przez dodanie 5 ml inokulum do 100 ml świeżej pożywki w butelkach 500 ml. Butelki inkubowano w27°C w wytrząsarce rotacyjnej przy 125 obr/min. Próbki 0,5 ml z 4-dniowych hodowli rozprowadzano na sterylnych filtrach (Whatman Nr 4), które następnie prznoszono do pożywki MS uzupełnionej 12% sacharozą i trzymano wtemperaturze pokojowej przez 4 godziny przed bombardowaniem.

3. Bombardowanie komórek roślinnych

Tkanki bombardowano złotymi mikropociskami, na które współstrącano mieszaninę plazmidów. Jako wewnętrzną kontrolę dla wszystkich doświadczeń z kukurydzą i tytoniem stosowano plazmid pGUS. Do doświadczeń z kotransformacją cząsteczki złota niosły albo równe masy wszystkich DNA plazmidowych (0,5 mg każdego plazmidowego DNA na docelową płytkę) albo molowe stosunki 2:1 plazmidów niosących geny VirD1 i VirD2 do plazmidu substratowego. Dla eksperymentów ze stabilną transformacją mieszaniny kotransformacyjne zawierały stosunek molowy 5:1 plazmidów niosących geny VirD1 i VirD2 do plazmidu selekcyjnego npAI. Każda próbka plazmidowej mieszaniny bombardowana na płytkę składała się z0,1 mg markera selekcyjnego i 0,5 mg każdego zDNA plazmidów p35SD1 i p35SD2. Odpowiednie ilości każdego DNA mieszano w całkowitej objętości 10 ml i strącano 50 ml 2,5 M CaCI2 i20 ml 0,1 M spermidyny (wolna zasada), aby spowodować strącanie na 50 ml 1,0 mm złotych mikronośników (60 mg/ml). Bombardowania mikropociskami przeprowadzono za pomocą urządzenia biolistycznego PDS-1000 (DuPont) stosując przeponę bezpieczeństwa 1500 psi z próbką położoną 8 cm poniżej ekranu hamującego.

4. Stabilna transformacja komórek tytoniu w zawiesinie godziny po bombardowaniu komórki przenoszono na płytki MS3S z 300 mg/ml kanamycyny. Niezależne mikrokalusy, które pojawiały się około 3 tygodnie po bombardowaniu przenoszono na świeże szalki uzupełnione 300 mg/ml kanamycyny. Po dwóch subkulturach na tej samej pożywce, rozpoczynano kultury zawiesinowe przez inokulację około 100 mg komórek tytoniu w 25 ml pożywki płynnej uzupełnionej 300 mg/ml kanamycyny.

5. Oznaczenia przejściowej ekspresji

Lucyferazę oznaczano w ekstraktach zgodnie z zaleceniami dostawcy (Luciferase assay system, Promega). Aktywność b-glukuronidazy oznaczano przez pomiar chemiluminescencji z zestawem GUS-Light (Tropix). Aktywności lucyferazy i b-glukuronidazy są wyrażane jako jednostki światła wykrywane przez Luminometer Analytical Luminescence Model 2001 zintegrowane przez 10 sekund w 25°C.

6. Izolacja DNA i hybrydyzacja typu Southerna

Hodowle komórek zbierano poprzez filtrowanie 10 dni po inokulacji i zamrażano w ciekłym azocie. DNA izolowano jak opisano (Hall i wsp., 1991).

Około 5 mg genomowego DNA stosowano do trawienia EcoRI. Po rozdziale na 0,7% żelu agarozowym DNA przenoszono na błonę Gene-screen Plus i przeprowadzano hybrydyzację w warunkach opisanych przez producenta (NEN Research Products, DuPont). Sondy DNA znakowano za pomocą [a-³²P]dCTP stosując zestaw do „oligo-labeling firmy Pharmacia. Sonda neo odpowiada 2 kb fragmentowi Pstl genu npAI (fig. 2). Sonda luc odpowiada 0,7 kb fragmentowi Xbal-EcoRI genu lucyferazy (fig. 2). W celu usunięcia sond membrany poddawano traktowaniu roztworem 0,1% SDS w 100°C przez 5 minut.

7. Klonowanie styków T-DNA/DNA roślinny

DNA (30 mg) z transgenicznych kalusów tytoniu trawiono EcoRI i poddawano preparatywnej elektroforezie na 1% żelu agarozowym (Sea-Plaque, FMC). Plasterki agarozy odpowiadające wielkości fragmentów, które miały być klonowane, wycinano z żelu i DNA ekstrahowano za pomocą QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Fragmenty następnie klonowano w defosforylowanym miejscu EcoRI

PL 191 113 B1 pUC19. Mieszaniny ligacyjne użyto do transformacji komórek E. coli HB101 za pomocą elektroporacji. Kolonie zawierające plazmid z odpowiednią wstawką identyfikowano przez hybrydyzację kolonijną stosując fragment 0,5 kpz promotora CaMV35S jako sondę. Sekwencję styku plazmidu donorowego z DNA roślinnym analizowano stosując primer 5'-CCACTATCCTTCGCAAGACC-3' (SEKW. NR ID 8) zlokalizowany w promotorze CaMV35S w odległości 106 pz od prawej sekwencji granicznej.

D. WYNIKI

1. Schemat doświadczenia

Aby zbadać czy produkty genów VirD1 i VirD2 mogą nacinać graniczną sekwencję T-DNA, gdy ulegają ekspresji w komórkach roślinnych skonstruowaliśmy testowy plazmid pRB(+)Luc, niosący substratową sekwencję graniczną T-DNA między promotorem i obszarem kodującym genu lucyferazy. Wstawienie prawej sekwencji granicznej między promotorem CaMV35S i regionem kodującym lucyferazy nie interferuje z ekspresją genu lucyferazy w tkankach roślinnych (dane nie przedstawione). Sekwencja graniczna była umieszczona wtaki sposób, że specyficzne w stosunku do sekwencji nacięcia wprowadzone przez produkty genów VirD1 i VirD2 by doprowadziły do nacięcia DNA, który jest matrycą dla mRNA lucyferazy, co powinno doprowadzić do obniżenia produkcji transkryptu i enzymu lucyferazy. Po wspólnym bombardowanie komórek roślinnych pRB(+)Luc i plazmidami niosącymi geny virD, nacinanie sekwencji granicznej powinno być mierzalne ilościowo przez oznaczenie aktywności lucyferazy. Jednak każde obniżenie aktywności lucyferazy można by także tłumaczyć przez wiązanie produktów genów VirD1 i VirD2 do sekwencji granicznej zlokalizowanej między promotorem i sekwencją kodującą, które mogłoby hamować transkrypcję genu lucyferazy. pRB(-) Luc, plazmid, który zawiera sekwencję graniczną w odwrotnej orientacji wstosunku do promotora został więc zbadany by odróżnić te dwie możliwości. Jeśli obniżenie aktywności lucyferazy jest efektem wiązania produktu (produktów) genów VirD do sekwencji granicznej, obniżenie to powinno także powstać przy sekwencji granicznej w odwrotnej orientacji.

Ponieważ białka VirD1 i VirD2 muszą być produkowane przejściowo w bombardowanych komórkach roślinnych zanim natną sekwencję graniczną, takie nacinanie prawdopodobnie zachodzi po rozpoczęciu transkrypcji genu lucyferazy. Tak więc oznaczenia aktywności lucyferazy najprawdopodobniej zaniżą aktywność VirD1 i VirD2 w komórkach roślinnych.

Aby wyrazić geny VirD1 i VirD2 w komórkach roślinnych ich odpowiednie otwarte ramki odczytu (ORF) umieszczono pod komtrolą promotora CaMV35S. ORF VirD2 wprowadzono także w orientacji antysensownej w stosunku do promotora jako kontrolę. Jako że stwierdzono, że obecność intronu 1 dehydrogenazy alkoholowej 1 kukurydzy zwiększa ekspresję genów u kukurydzy (Callis i wsp., 1987) skonstruowaliśmy także p35SAdh1 i p35SAdh2 (odpowiednio zawierające intron wstawiony między promotorem i obszarem kodującym ORFów VirD1 i VirD2) do stosowania w doświadczeniach z ekspresją przejściową u kukurydzy. Plazmid wyrażający gen b-glukuronidazy (GUS), pGUS, został wprowadzony w każdym bombardowaniu jako wewnętrzny standard, aby kontrolować wydajność przenoszenia DNA. We wszystkich przypadkach aktywność reportera jest wyrażona jako stosunek aktywności lucyferazy do GUS, aby wnieść poprawkę na zmienność wprowadzania DNA.

2. Oznaczenia przejściowej ekspresji, aby sprawdzić nacinanie granicznej sekwencji przez produkty genów VirD1 i VirD2 in planta.

Komórki kukurydzy i tytoniu najpierw poddano przejściowej transformacji naszym testowym plazmidem podawanym wspólnie z genami VirD1 i VirD2 oddzielnie, aby sprawdzić indywidualnie ich zdolność do wpływania na transkrypcję przez sekwencję graniczną T-DNA. Po wspólnym dostarczeniu albo DNA p35SD1 albo DNA p35SAdhD1 z DNA pRB(+)Luc, zaobserwowano 80% kontrolnego poziomu lucyferazy do GUS w tkankach tytoniu i kukurydzy (tabela 1 i tabela 2, p. niżej). Wspólne dostarczenie DNA p35SD2 (tytoń) albo DNA p35SAdhD2 (kukurydza) z DNA pRB(+)Luc dało 50%i 80% kontrolnych poziomów aktywności lucyferaza do GUS (tabela 1i tabela 2, p. niżej).

Tab e la 1

Aktywność VirD1 i VirD2 w komórkach w zawiesinie tytoniu

Plazmidy + pGUS	Średnia	± odch. standar.	% kontroli
1	2	3	4
pRB(+)LUC	1,36	± 0,06	-
pRB(+)LUC + p35SD1	0,98	± 0,03	72

PL 191 113 B1

c.d. tabeli 1

1	2	3	4
pRB(+)LUC + p35SD2	0,69	± 0,07	50
pRB(+)LUC + p35SD1 + p35SD2 (1:1:1)	0,27	± 0,05	20
pRB(+)LUC + p35SD1 + p35SD2 (1:2:2)	0,14	± 0,05	10
pRB(+)LUC + p35SD1+p35SD2(rev) (1:1:1)	1,08	± 0,13	80
pRB(+)LUC + p35SD1 + p35SD2(rev) (1:2:2)	1,13	± 0,08	83
pRB(-)LUC	1,40	± 0,14	-
pRB(-)LUC + p35SD1	1,33	± 0,13	95
pRB(-)LUC + p35SD2	1,19	± 0,12	85
pRB(-)LUC + p35SD1 + p35SD2	1,56	± 0,38	112

Tabela 1. Aktywność VirD1 i VirD2 w komórkach tytoniu. Konstrukty plazmidowe opisane w fig. 1 wprowadzano do komórek tytoniu za pomocą urządzenia biolistycznego. Liczby w nawiasach oznaczają stosunki molowe plazmidów. Po inkubacji przez 24 godziny tkanki homogenizowano i oznaczano aktywności enzymów. Aktywności są wyrażane jako stosunek lucyferazy (Luc) do b-glukuronidazy (Glu). Analizowano niezależne bombardowania i dane przedstawiono jako średnie wartości z sześciu oznaczeń plus minus odchylenie standardowe (SD). % wartości kontrolnych określa się ze stosunku molowego lucyferazy do b-glukuronidazy do aktywności obserwowanych z plazmidem kontrolnym.

Tab e la 2

Aktywność genów VirD1 i VirD2 w komórkach w zawiesinie kukurydzy

Plazmidy + pGUS	Średnia	± odch. standar.	% kontroli
pRB(+)LUC	1,260	± 0,27	-
pRB(+)LUC + p35SAdhD1	1,320	± 0,28	105,0
pRB(+)LUC + p35SAdhD2	1,020	± 0,15	81,0
pRB(+)LUC + p35SAdhD1+p35SAdhD2 (1:1:1)	0,110	± 0,03	8,7
pRB(+)LUC + p35SAdhD1+p35SAdhD2 (1:2:2)	0,006	± 0,007	0,5
pRB(+)LUC + p35SAdhD1+p35SAdhD2(rev) (1:1:1)	0,990	± 0,20	78,6
pRB(+)LUC + p35SAdhD1+p35SAdhD2(rev) (1:2:2)	0,960	± 0,26	76,0

Tabela 2. Aktywność VirD1 i VirD2 w komórkach kukurydzy. Aktywności są wyrażone tak jak opisano w stopce do tabeli 1.

Dwa geny vir razem wydają się mieć efekt synergistyczny. Wspólne dostarczenie za pomocą urządzenia biolistycznego równych ilości DNA pRB(+)Luc z obydwoma plazmidami niosącymi geny VirD1 i VirD2 (stosunek 1:1:1) obniżyło aktywność lucyferazy do około 20% poziomu kontroli u tytoniu (tabela 1)i 10% w komórkach kukurydzy (tabela 2). W wyższych stosunkach plazmidów VirD1i VirD2 do plazmidu badanego (2:2:1) aktywność lucyferazy została obniżona jeszcze bardziej do około 10% w komórkach tytoniu (tabela 1) i 1% wkomórkach kukurydzy (tabela 2). Analogiczne eksperymenty z zastosowaniem plazmidu kontrolnego p35SD2(rev) (tytoń) i p35SAdhD2(rev) (kukurydza) z sekwencją

PL 191 113 B1 kodującą VirD2 w orientacji antysensownej dały podobne wyniki jak uzyskano dla samego VirD1 (tabela 1 i tabela 2), zgodnie z oczekiwaniem. Wykazuje to, że nasz wewnętrzny standard gen GUS jest skuteczną kontrolą dla efektów zmiany stężeń całkowitego dostarczanego DNA.

Odwrócenie orientacji granicy T-DNA w testowym plazmidzie eliminowało lub bardzo obniżało jakiekolwiek efekty genów VirD1 i/lub VirD2 na ekspresję przejściową genu lucyferazy. Gdy pRB(-) Luc bombardowano do komórek tytoniu wspólnie zDNA plazmidowym p35SD1 i p35SD2 nie stwierdzono znaczącego obniżenia aktywności lucyferazy. Wspólne dostarczanie pRB(-)Luc wykonane z p35SD1 i p35SD2 oddzielnie także nie dało znaczącego obniżenia aktywności lucyferazy (tabela 1). Te obserwacje silnie sugerują, że obniżenie aktywności lucyferazy widziane z plazmidem testowym pRB(+)luc plus geny VirD1 i VirD2 jest wynikiem specyficznego, co do nici nacięcia na prawej sekwencji granicznej przez produkty genów vir podobnie jak się obserwuje u Agrobacter (przegląd - Zambryski, 1992).

3. Analiza stabilnych transformantów

Następnie przeprowadzono stabilną transformacją komórek w zawiesinie tytoniu, aby ocenić efekt aktywności produktów genów VirD1 i VirD2 na wzór integracji DNA po wspólnym dostarczaniu tych genów z ich substratowym DNA za pomocą urządzenia biolistycznego. Do tych eksperymentów użyto pNeoRBLuc, który zawiera lewą sekwencję graniczną T-DNA, npAI jako marker selektywny igen 35SRB(+)Luc z prawą sekwencją graniczną T-DNA wstawioną pomiędzy promotorem i regionem kodującym lucyferazy. W wynikach i dyskusji poniżej określamy jako „zdarzenia agrolistyczne” takie insercje DNA do genomu tytoniu, które powstają po działaniu VirD1 i VirD2 na sekwencje graniczne, powodując powstanie nici T-DNA. W odróżnieniu określamy jako „zdarzenia biblistyczne” te insercje DNA, które są wynikiem procesu normalnie zachodzącego po wprowadzaniu genów do komórek roślinnych za pomocą urządzenia biolistycznego. Wstępnym kryterium do rozróżnienia zdarzeń biolistycznych i przypuszczalnych zdarzeń agrolistycznych jest aktywność lucyferazy w transformowanym klonie wynikająca z wykluczenia kodującego obszaru lucyferazy przez wycinanie T-DNA z pNeoRBLuc. Na poziomie molekularnym transgeny wynikające ze zdarzenia agrolistycznego powinny hybrydyzować z sondą neo, anie z sondą luc. Dodatkowo, w zdarzeniu agrolistycznym sekwencja styku pomiędzy wprowadzonym DNA aDNA roślinnym powinna odpowiadać dokładnie prawej granicy nici T. Oba typy zdarzeń mogą zachodzić w tej samej komórce roślinnej, ale takie klony byłyby klasyfikowane na podstawie badań genetycznych jako wyniki zdarzeń biolistycznych w oparciu o obecność aktywności lucyferazy. Za pomocą hybrydyzacji typu Southerna badano zdarzenia biolistyczne i przypuszczalne agrolistyczne, aby ustalić częstość każdego typu insercji.

Komórki zawiesiny tytoniu bombardowano mikropociskami powleczonymi DNA plazmidu pNeoRBLuc wraz zDNA p35SD1 i p35SD1 w stosunku 1:5:5. Jako kontrolę stosowano bombardowanie samym plazmidem pNeoRBLuc oraz pozbawionym sekwencji granicznej plazmidem kontrolnym pNeoLuc wspólnie z p35SD1 i p35SD1. Stabilne transformanty selekcjonowano przez wzrost na pożywce z kanamycyną. Uzyskiwano średnio 40 klony oporne na kanamycynę na każdym bombardowanym filtrze, ale z każdej płytki analizowano dalej tylko jeden lub dwa kalusy. Podobne ilości kalusów opornych na kanamycynę uzyskano po bombardowaniu samym kontrolnym plazmidem pNeoRBIuc albo DNA pNeoLuc plus DNA p35SD1 i p35SD1.

Można było z grubsza oszacować częstość zdarzeń agrolistycznych przez stosunek całkowitej ilości analizowanych kalusów opornych na kanamycynę, które nie wyrażają lucyferazy w stosunku do wszystkich opornych na kanamycynę. Według tego kryterium, częstość zdarzeń agrolistycznych wynosiła około 10%; z32 analizowanych linii kalusów w3 nie była obecna aktywność lucyferazy. Jak argumentowano powyżej, ta liczba prawdopodobnie zaniża ilość zdarzeń agrolistycznych ponieważ wtej samej komórce mogą zachodzić zdarzenia agrolistyczne i biolistyczne.

4. Analiza typu Southerna kontrolnych zdarzeń „biolistycznych

Przeprowadzono hybrydyzację typu Southerna na DNA z kontrolnych linii kalusów opornych na kanamycynę uzyskanych po bombardowaniu (i) samym pNeoRBLuc i (ii) plazmidem pNeoLuc wspólnie z DNA p35SD1 i p35SD1. Genomowy DNA strawiono EcoRI, co daje fragment 3,9 kb z plazmidu pNeoRBLuc, który jest homologiczny do obu sond neo i luc (fig. 2). Gdy strawiony genomowy DNA hybrydyzowano z sondą neo, wszystkie ścieżki wykazały hybrydyzujący prążek o przewidywanej wielkości (3,9 kb) i z ilością nienaruszonych kopii fragmentów opartej na porównaniu natężenia hybrydyzacji ze ścieżkami z kontrolnymi ilościami DNA, które wahały się od 1 do więcej niż 10 na jądro. Analiza typu Southerna stransformowanych linii z bombardowania wspólnie DNA p35SD1 i p35SD1 wspólnie z pozbawionym sekwencji granicznych plazmidem pNeoLuc

PL 191 113 B1 stosowanych jako sondy wykazała obecność zarówno nienaruszonego jak i zrearanżowanego genu npAI w tych komórkach. Takie rearanżacje są często obserwowane u transformantów uzyskiwanych za pomocą urządzenia biolistycznego.

5. Analiza typu Southerna przypuszczalnych zdarzeń „agrolistycznych

Przeprowadzono hybrydyzację typu Southerna na DNA z 16 linii kalusów opornych na kanamycynę uzyskanych po łącznym bombardowaniu pNeoRBLuc stosując DNA plazmidów p35SD1 i p35SD1 jako sondy do hybrydyzacji. Do analizy typu Southerna wybrano losowo 13 linii kalusa pośród 32, które dały wynik dodatni w badaniu na obecność lucyferazy, wrazz trzema klonami, u których nie stwierdzono ekspresji lucyferazy. DNA z kalusów lucyferazo-dodatnich zawierało prążek o oczekiwanej wielkości (3,9 kb) hybrydyzujący z sondą neo. Ilość kopii nienaruszonych genów w oparciu o porównanie z kontrolnymi ścieżkami wahała się od 1 do 10 na jądro. Liczba kopii była znacznie niższa w kalusach transformowanych DNA pNeoLuc i DNA p35S1 i p35S2.

Zaobserwowaliśmy prążek o wielkości 3,4 kb wDNA ze wszystkich transgenicznych kalusów bombardowanych DNA p35SD1 i p35SD1 wspólnie z pNeoRBLuc. W tych liniach fragment tej wielkości hybrydyzował z sondą VirD2. Fragment stosowany jako sonda neo zawierał kawałek sekwencji terminatorowej, która także była obecna w konstruktach p35SD1 i p35SD2, i choć stanowi zaledwie 1,2% znakowanej sondy może być wiele kopii insercji genu VirD2, co mogłoby dawać sygnał o obserwowanej wielkości.

Gdy sondy hybrydyzowano z sondą luc możliwe było rozróżnienie 3 grup transgenicznych linii kalusa (i) linie kalusa z insercjami hybrydyzującymi do sondy neo i do sondy luc, (ii) linie kalusa, w których niektóre insercje hybrydyzowały tylko do sondy neo, a niektóre do sondy neo i do sondy luc; (iii) linie kalusa z insercjami hybrydyzującymi tylko do sondy neo. Pierwsza grupa kalusów prawdopodobnie nie zawierała zdarzeń agrolistycznych. Druga grupa kalusów prawdopodobnie zawierała dwa rodzaje zdarzeń: agrolistyczne ujawniane przez obecność fragmentów 4,8 kb, 4,6 kb i 5 kb hybrydyzujących do sondy neo i biolistyczne ujawniane przez obecność fragmentu 3,9 kb hybrydyzującego do sondy luc. Trzecia grupa kalusów wykazywała tylko przypuszczalne zdarzenia agrolistyczne w oparciu o ich zdolność do hybrydyzacji tylko z sondą neo. Trzy linie kalusów należały do tej grupy: jeden zawierał hybrydyzujący prążek 3,2 kb, drugi dwa hybrydyzujące prążki 3,8 kb i 5 kb, i trzeci zawierał jeden prążek 5,5 kb. Te trzy wzory hybrydyzacji były unikalne, ewidentnie reprezentując zdarzenia transformacji pojedynczych komórek.

Wśród 16 linii transgenicznych tytoniu przeanalizowanych za pomocą hybrydyzacji typu Southerna 10 wykazało zdarzenia biolistyczne, 3 przypuszczalne agrolistyczne, a 3 wykazywały oba.

6. Analiza molekularna przypuszczalnych zdarzeń agrolistycznych

Charakter przypuszczalnych zdarzeń agrolistycznych ostatecznie sprawdzono przez określenie sekwencji styku między wintergrowanym DNA i DNA roślinnym w liniach kalusa wykazujących wzory hybrydyzacji zgodne z takimi przypuszczalnymi zdarzeniami. Fragmenty DNA z tych linii obejmujące te styki sklonowano i zsekwencjonowano na zewnątrz od wnętrza granic T-DNA (p. metody). Sekwencje nukleotydów wykazały, że każdy z tych fragmentów zawierał sekwencją wskazującą na styk prawa granica/roślinny DNA. Prawy koniec T-DNA był identyczny jak miejsce nacinania na prawej granicznej sekwencji T-DNA.

Sekwencja nukleotydów roślinnych w czterech z pięciu sekwencji idealnie odpowiadała sekwencjom styków u tytoniu, które uprzednio opisali inni w formie cDNA. Interesujące jest, że we wszystkich czterech przypadkach prawy styk DNA jest wstawiony z promotorem CaMV35S zorientowanym w kierunku antysensownym w stosunku do genów roślinnych w obszarach bogatych w AT blisko miejsca poliadenylacji wnie ulegających translacji 5' obszarach genu. Nie stwierdzono dodatkowych nukleotydów ani powtórzonych sekwencji na prawych miejscach styku. Nie jest możliwe wywnioskowanie czy zaszły delecje miejsc docelowych, ponieważ nie ustalono lewej granicy insercji.

Jako kontrolę sklonowano także fragmenty DNA obejmujące prawą sekwencję graniczną i przyległe obszary z obu stron z linii kalusa wykazujących wzory hybrydyzacji zgodne z fragmentami DNA ze zdarzeń biolistycznych. Sekwencja nukleotydowa tych przypadków nie wykazywała żadnego styku prawa sekwencja graniczna-DNA roślinny, ale raczej pełnej długości prawą sekwencję graniczną i za nią oczekiwaną sekwencję lucyferazy.

E. Wniosek

Białka wirulencji VirD1 i VirD2 kodowane na plazmidzie T są wymagane do wytwarzania nici T u Agrobacterium. Przedstawiamy tu dowody na tworzenie T-DNA in planta i integracji w komórkach roślinnych po wprowadzeniu za pomocą urządzenia biolistycznego dwóch genów wirulencji VirD1

PL 191 113 B1 i VirD2 pod kontrolą promotora CaMV35S wraz z plazmidem niosącym sekwencje graniczne. Około 10% stransformowanych kalusów tytoniu wykazywało insercje agrolistyczne, tzn. DNA wintegrowany wyłącznie po działaniu produktów genów VirD1 i VirD2. Podobna część stransformowanych kalusów zawierała zarówno przypadki agrolistyczne jak i biolistyczne. Styki transgen: DNA roślinny w zdarzeniach agrolistycznych wykazywały specyficzne, co do sekwencji nacięcia w prawej sekwencji granicznej zgodnie ze skompilowanymi danymi wykazującymi, że prawa graniczna sekwencja DNA kończy się zaraz po pierwszych 3 nukleotydach powtórzenia 25 pz. (Gheysen i wsp., 1991; Mayerhofer i wsp., 1991; Ohba, 1995). Precyzja zdarzeń integracyjnych była interpretowana jako bezpośredni udział VirD2 w procesie rekombinacji w komórce roślinnej (Tinland i wsp. 1995).

Miejsca integracji zdarzeń agrolistycznych są tu identyfikowane w regionach transkrybowanych, popierając dane, że T-DNA jest preferencyjnie integrowany w potencjalnie transkrybowane loci genomowe (Koncz i wsp., 1989; Herman i wsp., 1990; Kertbundit i wsp., 1991) z insercjami T-DNA losowo rozmieszczonymi w chromosomach roślin (Chyi i wsp., 1986; Wallroth i wsp., 1986). Choć integracja T-DNA nie jest na ogół korelowana z dużymi rearanżacjami w DNA roślinnym, delecje, inwersje i duplikacje docelowych sekwencji DNA roślinnego mogą zachodzić podczas transformacji T-DNA. Dla zdarzeń agrolistycznych tu badanych nie zaobserwowano znacznych rearanżacji w docelowych miejscach u roślin.

Konsystentny wzór integracji agrolistycznych w pobliżu miejsca poliadenylacji znanych genów tytoniu indukowalnych przez światło i/lub fotosyntetycznych z promotorem CaMV35S na prawej granicy skierowanym w orientacji antysensownej do ramki odczytu jest intrygujący. Wtej orientacji, insercja struktury T-DNA może generować antysensowny transkrypt, który mógłby inaktywować ekspresję odpowiadającego genu tytoniu. Takie geny fotosyntetyczne nie są jednak wymagane przez te nie fotosyntetyzujące hodowane komórki NT1.

W oparciu o przejściowe systemy ekspresji, w których nacięcie na prawej sekwencji granicznej wydawało się zachodzić z wysoką częstością, wygląda na to, że wysoki procent cząsteczek substratu było ciętych. Jest dziwne, że ta proporcja nie jest utrzymana przy stabilnej transformacji. Może to być tłumaczone przez reakcje ligacji na prawej sekwencji granicznej po cięciu przez VirD2, ponieważ oznaczenia in vitro pokazały, że VirD2 katalizuje specyficzną w stosunku do miejsca reakcję cięciałączenia z jednoniciowymi oligonukleotydami zawierającymi sekwencje graniczne T-DNA (Pansegrau i wsp., 1993). Innym wyjaśnieniem może być brak wiążącego pojedyncze nici VirE2 potrzebnego do wydajnej transformacji, w której pośredniczy Agrobacterium. Choć można założyć, że w komórkach roślinnych jest ekwiwalent dla niespecyficznego białka wiążącego pojedynczą nić VirE2, które mogłoby wiązać się i chronić nić T, dodatek genu virE2 wraz z VirD1 i VirD2 mogłoby polepszyć wydajność odzyskiwania zdarzeń agrolistycznych. Zauważamy także wadę, że towarzyszące geny VirD1 i VirD2 wspólnie dostarczone z plazmidem transformującym zapewne są biolistycznie integrowane do tych samych stransformowanych linii z wysoką częstością: kotransformacja jest bardzo skuteczna z urządzeniem biolistycznym. Te niechciane geny reprezentują inny typ egzogennego DNA. Jednak zakładamy, ze względu na ich unikalny mechanizm insercji, że nie są one sprzężone z insertem agrolistycznym i mogą być eliminowane przy dalszym krzyżowaniu rośliny transgenicznej. To założenie nie może być testowane na tych komórkach NT1, które nie ulegają regeneracji.

System transformacji agrolistycznej ma kilka konkretnych zalet: (i) Powinien być możliwy do natychmiastowego zastosowania do każdej tkanki roślinnej podatnej na sposoby transformacji biolistycznej. (ii) Wstawiony DNA nie zawiera dodatkowych sekwencji wektora, (iii) Wstawianych jest mniej kopii interesującego genu niż w przypadku genu dostarczanego bez VirD1 i VirD2. To powinno zminimalizować regiony homologii, które mogą sprzyjać niestabilności.

Podejście agrolistyczne w ten sposób łączy najlepsze cechy dostarczania biolistycznego z elegancją i precyzją mechanizmów insercji T-DNA za pomocą Agrobacterium, aby dostarczyć nową, szeroko stosowalną technologię do produkcji transgenicznych roślin użytkowych o wartości rolnicznej.

P rzy k ład 2. Konstrukcja Roślinnych Kaset Ekspresyjnych

Sekencje genów przeznaczone do eksprymowania w roślinach transgenicznych lub komórkach roślinnych są najpierw łączone w ekspresyjnych kasetach za odpowiednim promotorem i przed odpowiednim terminatorem transkrypcji, aby stworzyć gen chimeryczny. Te kasety ekspresyjne mogą być potem łatwo przeniesione do roślinnych wektorów do transformacji opisanych powyżej w przykładzie 3.

Selekcja promotora

Selekcja promotora stosowanego w kasetach lub genach chimerycznych określi przestrzenny i czasowy wzór ekspresji transgenu w roślinie transgenicznej. Wybrane promotory będą eksprymować

PL 191 113 B1 transgeny w specyficznych typach komórek (takich jak komórki naskórka liści, komórki mezofilu, komórki rdzenia korzenia) lub we specyficznych tkankach lub narządach (korzenie, liście lub kwiaty, na przykład) ta selekcja będzie odbiciem pożądanej lokalizacji ekspresji transgenu. Odmiennie wybrany promotor może sterować ekspresją genu pod kontrolą promotora indukowanego przez światło lub innego promotora regulowanego w czasie. Dalszą alternatywą jest chemiczna regulacja wybranego promotora. To by dało możliwość indukcji ekspresji transgenu tylko wtedy, gdy to jest pożądane i powodowane przez podanie induktora chemicznego.

Terminatory transkrypcji

Dostępne są różne terminatory transkrypcji możliwe do stosowania jako kasety ekspresyjne. Są one odpowiedzialne za terminację transkrypcji za transgenem i za jego prawidłową poliadenylację. Odpowiednie terminatory transkrypcji to te, o których wiadomo, że działają w roślinach i obejmują terminator CaMV 35S, terminator tml, terminator syntazy nopaliny, terminator pbcS E9 grochu. Mogą one być stosowane zarówno u jednoliściennych jakiu dwuliściennych.

Sekwencje wzmagające lub regulujące ekspresję

Stwierdzono, że liczne sekwencje wzmagają ekspresję genów z wewnątrz jednostki transkrypcyjnej i sekwencje te mogą być użyte wraz z genami tego wynalazku w celu zwiększenia ich ekspresji w roślinach transgenicznych.

Wykazano, że różne introny zwiększają ekspresję, szczególnie w komórkach jednoliściennych. Na przykład stwierdzono, że introny genu Adh1 kukurydzy znacząco wzmagają ekspresję dzikiego genu pod jego odpowiednim promotorem po wprowadzeniu do komórek kukurydzy. Stwierdzono, że intron 1 jest szczególnie skuteczny i wzmaga ekspresję w konstruktach z fuzją z genem acetylotransferazy chloramfenikolu (Callis i wsp., Genes Develop. 1: 1183-1200 (1987). W tym samym układzie eksperymentalnym intron z genu bronze 1 kukurydzy miał podobny efekt we wzmaganiu ekspresji (Callis et al., supra). Sekwencje intronów standardowo inkorporowano do wektorów transformujących roślin na ogół wewnątrz nie ulegającego translacji lidera.

Wiadomo, że pewna ilość nie ulegających translacji liderów pochodzących z wirusów także wzmaga ekspresję. Szczególnie wykazano, że sekwencje liderowe z wirusa mozaiki tytoniu (TMV, sekwencja „omega), wirusa plamistej chlorozy kukurydzy (MCMV), wirusa mozaiki lucerny (AIMV) są skuteczne we wzmaganiu ekspresji (np. Gallie i wsp., Nucl. Acids Res. 15:8693-8711(1987), Skuzeski i wsp., Plant Molec. Biol. 15:65-79(1990)).

P r zy k ł ad 3: Metoda „Uderzyć i uciec” do przeprowadzania rekombinacji specyficznej w stosunku do miejsca w biolistycznie wprowadzanym DNA: łączne podawanie mRNA rekombinazy

A. Streszczenie

Opisujemy sposób łącznego podawania DNA i mRNA do komórek roślinnych stosując urządzenie biolistyczne. Za pomocą elektroforezy na żelu wykazaliśmy stabilność i odzyskanie DNA i mRNA strąconych na mikropociskach w różnych warunkach. Dla dostarczania aktywnego mRNA, skuteczne było strącanie samym CaCI2 albo CaCI2 plus spermidyna plus bufor Tris, podczas, gdy niezbuforowana spermidyna fragmentowała RNA.

Stosując wydajne metody strącania i dostarczanie biolistyczne do komórek kukurydzy i tytoniu, wykazaliśmy ekspresją zsyntetyzowanych in vitro poliadenylowanych mRNA mających czapeczkę kodujących lucyferazę świetlika. Badana kinetyczne wykazały, że ekspresja mRNA lucyferazy osiągała maksimum wcześniej niż w przypadku przejściowej ekspresji równocześnie podawanego DNA 35S/lucyferaza.

Aby wykazać aktywność biolistycznie podanego mRNA kodującego R, specyficzną w stosunku do miejsca rekombinazę Zygosaccharomyces rouxii, wspólnie podaliśmy komórkom kukurydzy plazmid substratowy zawierający odwrócony promotor 35S oflankowany przez odwrócone kopie RS, 32 pz miejsce docelowe rekombinazy poprzedzające lider 35S, gen lucyferazy i region terminatorowy 35S. Podczas, gdy sam plazmid substratowy nie dawał znaczącej ekspresji lucyferazy, gdy był podany łącznie z R mRNA jego promotor był obracany przez rekombinazę i zachodziła produkcja enzymu lucyferazy.

Potencjalne zastosowanie systemów rekombinazy specyficznej w stosunku do miejsca, aby kontrolować insercję i ekspresję transgenu są omówione, wraz z zaletami wprowadzania aktywności rekombinazy w sposób przejściowy jako mRNA.

B. Wstęp

Gdy bombardowanie cząsteczkami jest stosowane do dostarczania genów do komórek roślinnych DNA transgenu wbudowuje się losowo do genomu, na ogół w pojedynczym miejscu zawierającym

PL 191 113 B1 wielokrotne kopie (Klein i wsp., 1988, Klein i wsp., 1989, Gordon-Kamm, W.J. i wsp., 1990; Vasil i wsp., 1992; Wan Y. i Lemaux P, 1994). Ułożenie, pozycja insercji i często wysoka liczba kopii transgenów może doprowadzić do niestabilnej ekspresji za pomocą kilku mechanizmów: na przykład, wielokrotne kopie transgenów oddziałują inaktywując się nawzajem poprzez antysensy lub metylację lub inne mechanizmy „wyciszania”, które nie są dobrze zrozumiane (przegląd w Matzke M i Matzke A, 1995). Ponieważ wiele kopii transgenów jest połączonych w pojedynczym miejscu integracji, nie jest możliwe obniżenie liczby kopii poprzez segregację w kolejnych pokoleniach roślin. Zarówno do badań podstawowych ekspresji transgenów jak i dla handlowej produkcji transgenicznych roślin do zastosowań rolnych, polepszenie ułożenia i ekspresji wprowadzanych genów jest zagadnieniem o wysokim priorytecie. Układy rekombinacji specyficzne w stosunku do miejsca mogą być użytecznym sposobem upraszczania wzoru insercji transgenów, a nawet kierowania ich do ustalonych uprzednio miejsc w genomie roślinnym (Albert i wsp. 1995).

Wykazano, że kilka rekombinaz specyficznych w stosunku do miejsca jest aktywnych w komórkach roślinnych (przegląd -p. Odell & Russell, 1994): układ Cre/Lox bakteriofaga P1, system rekombinacji FLP/FRI z plazmidu 2m Saccharomyces cerevisiae, i system R/RS z plazmidu pSR1 Zygosaccharomyces rouxii (Matsuzaki i wsp., 1988). Systemy te są potencjalnie użyteczne ze względu na swoją prostotę; aby były w pełni czynne wymagają tylko jednego białka rekombinazy (Cre, FLP, R) i odpowiedniego celu, krótkiej określonej sekwencji rekombinacyjnej (odpowiednio lox, FLP, RS). Dalej, ich częstość rekombinacji jest uderzająco wysoka. Rekombinaza może pośredniczyć w trzech typach rearanżacji DNA poprzez swoje reakcje rekombinacji, w zależności od lokalizacji i orientacji miejsc rozpoznawania. Jeśli fragment DNA jest ograniczony przez dwa miejsca rozpoznawane, które są odwrócone w stosunku do siebie zachodzi odwrócenie wprowadzanego DNA. Jeśli dwa miejsca restrykcyjne są w tej samej orientacji, zachodzi wycięcie i cyrkularyzacja znajdującego się między nimi DNA. Jeśli miejsca rozpoznawane są na odrębnych cząsteczkach DNA zachodzi wymiana genetyczna i jeśli jedna z nich jest liniowa, ta cząsteczka ulega liniowej integracji do drugiej.

Specyficzna w stosunku do miejsca aktywność rekombinazy może być wykorzystana dla uproszczenia i naprowadzania transgenów wprowadzanych do roślin. Jeśłi ta aktywność jednak pozostaje może destablizować strukturę rekombinanta. Jest więc pożądane by wyrażać aktywność rekombinazy tylko przejściowo. Uzyskano to w niedawnych pracach, które wykazały celową integrację transgenu zawierającego sekwencję lox do miejsca lox w roślinie transgenicznej wyrażającej Cre (Albert i wsp., 1995). Ponieważ miejsce lox leżało pomiędzy promotorem i obszarem kodującym genu cre, rekombinacja specyficzna w stosunku do miejsca inaktywowała ekspresją Cre, stabilizując produkt. Wszystkie badane zdarzenia integracji zachodziły w pojedynczej kopii w oparciu o analizę techniką Southerna. W niniejszych badaniach przystosowaliśmy system specyficznej w stosunku do miejsca rekombinazy R/RS do stosowania z podawaniem biolistycznym. Wykazano, że system R/RS działa wydajnie w tytoniu:, gdy wtransformowano gen R przejściowo do protoplastów produkt jego genu włączał kryptyczny gen glukuronidazy (GUS) przez specyficzną w stosunku do miejsca inwersję lub wycięcie DNA (Onouchi i wsp., 1992). Wykazujemy tu, że rekombinaza R dostarczana za pomocą biolistyki do komórek kukurydzy i tytoniu działa podobnie, choć z niską wydajnością (wydajność można zwiększyć przez optymalizację parametrów), aby włączyć kryptyczny gen lucyferazy przez obrócenie jego promotora. Co więcej, zastosowanie mRNA raczej niż DNA do produkcji rekombinazy zapewnia, że jest ona produkowana szybko po wprowadzeniu substratu DNA do komórki. Docelowe miejsce RS zawiera 31 pz palindromową sekwencję nukleotydów złożoną z pary odwróconych powtórzeń oddzielonych asymetrycznym rdzeniem 3 pz (Matsuzaki i wsp., 1988). Dla produkcji roślin transgenicznych jest pożądane stosowanie mRNA rekombinazy raczej niż DNA, aby uniknąć integracji genu R do genomu roślinnego i wten sposób zapewnić tylko przejściową ekspresję rekombinazy podczas wczesnych stadiów transformacji. Poniżej opisujemy sposób dla wspólnego wprowadzania mRNA kodującego rekombinazę R wraz z docelowym konstruktem z kryptyczną lucyferazą zawierającym docelowy, RS,co daje w efekcie przejściową aktywność rekombinazy, która aktywuje ekspresję lucyferazy.

C. Materiały i metody

1. Materiał roślinny

Komórki kukurydzy

Hodowle zawiesinowe kukurydzy (Zea mays L.) inicjowano z zamrożonych kalusów embriogenicznych typu II wybranych z niedojrzałych embrionów linii Elite spokrewnionej z B73. Komórki zamrożone (DiMaio i Shilito, 1992) szybko rozmrażano i około 1 g dodano do 50 ml płynnego podłoża N6 (Chu i wsp., 1975) uzupełnionego 30 g/l sacharozy i 2 mg/l kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego (2,4-D)

PL 191 113 B1 (2N63S). Hodowle inkubowano w 25°C w ciemności w wytrząsarce orbitalnej przy 150 obr/min. Podkultury zakładano co 7 dni przez przeniesienie 2 ml objętości upakowanych komórek do 50 ml świeżej pożywki 2N63S.

Próbki zawierające około 200 mg komórek rozmieszczano równomiernie na sterylnych filtrach durapore i umieszczono na pożywce 2N6 uzupełnionej 12% sacharozą jako osmoticum. Po wysianiu komórki trzymano 4 godziny w temperaturze pokojowej przed bombardowaniem ido 24 godz. po bombardowaniu.

Komórki tytoniu

Linia komórkowa Nicotiana tabacum NT-1 (An, 1985) była hodowana w pożywce wg Murashige i Skoog (Murashige i Skoog) uzupełnionej 2 mg/l 2,4-D i sacharozą (30 g/l). Komórki brano do subkultur raz na tydzień przez dodanie 5 ml inokulum do 100 ml świeżej pożywki w butelkach 500 ml. Butelki inkubowano w 27°C w wytrząsarce rotacyjnej przy 125 obr/min. Próbki 0,5 ml z hodowli 4 dni po subkulturze rozprowadzano na sterylnych filtrach (Whatman Nr 4), które następnie przenoszono do pożywki MS uzupełnionej 12% sacharozą i trzymano w temperaturze pokojowej przez 4 godziny przed bombardowaniem i do 24 godzin po bombardowaniu.

2. Plazmidy

Matryca T7LUCA50 (fig. 4A) do transkrypcji in vitro mRNA lucyferazy świetlika była skonstruowana przez najpierw połączenie luc z promotorem T7, następnie wstawienie fragmentu T7/luc do pochodnej pUC18 ze wstawką poliA. Aby podłączyć promotor T7 do obszaru kodującego luc, promotor T7 wycięto zpET3 (Rosenberg i wsp., 1987) jako fragment Bglll i sklonowano w miejsce BamHI pUC19, aby dać pAT 26. Sekwencja od +9 do +26 została zastąpiona przez miejsce BamHI za pomocą delecji uzyskanej za pomocą PCR, aby uzyskać pAT27. Fragment lider35S-lucyferaza wycięty z pCIB1711 (fig. 4C, p. niżej) jako fragment BamHI/Asp 718 został wprowadzony do pAT27 dając T7Luc. Wstawka T7/luc ztego plazmidu została przeniesiona do pUC18A50X jako fragment Xbal/Asp718. pUC18A50X jest pochodną pUC18 zawierającą parę oligonukleotydów z 50 resztami A otoczonymi przez „overhang” Asp718(5') i Hindlll(3'), których miejsce EcoRI zostało przekształcone na miejsce Xbal za pomocą syntetycznego oligonukleotydu.

pT7RecA50 (fig. 4B) jest pochodną pUC18A50X zawierającą promotor T7, lider 35S i region kodujący rekombinazę w dodatku do swego obszaru kodującego poliA. Fragment lider 35S/rekombinaza zpRec (p. niżej) został wycięty jako fragment BamHI/Asp7,18 i zligowany z pAT27, aby wytworzyuć pT7Rec. Fragment Xbal/Kpnl zT7 Rec został następnie wprowadzony do pUC18A50X, aby wytworzyć pT7RecA50.

pCIB1711 (fig. 4C) jest pochodną pCIB710 (Rothstein i wsp., 1987) w którym wprowadzono region kodujący lucyferazy z pJD204 (de Wet i wsp., 1987) jako fragment Hindlll-BamHI do miejsca BamHI na wektorze z adapterem oligonukleotydowym BamHI/Pstl/Hindlll na końcu 5', aby stworzyć pCIB1701. Promotor/lider 35S powstałego plazmidu był dopasowany by umieścić miejsce BamHI dokładnie przy starcie transkrypcji przez zastąpienie jego fragmentu EcoRV-BamHI fragmentem pDO435 (Ow i wsp., 1986), aby dać pCIB1700. Hybrydowy lider 35S (50 pz)/lider lucyferazy (22 pz) z pCIB1700 usunięto w miejscu Pstl przez Narl w genie luc i zastąpiono syntetycznym oligonukleotydem odpowiadającym 58 pz lidera 35S i początkowi ORF luc (p. Carozzi i wsp., w przygotowaniu, aby uzyskać szczegóły tej konstrukcji).

pRec (fig. 4D) jest pochodną pCIB1711, która zachowuje promotor 35S, sekwencje lidera i terminatora ima region kodujący lucyferazy zastąpiony przez region kodujący rekombinazy z pGAHR (Onouchi i wsp., 1991) sklonowano jako fragment BamHI/Bglll w odpowiadające miejsca pSP72 (Promega), a DNA pomiędzy miejscami wektora Xhol i wstawki Pvull zostało zastąpione oligonukleotydem:

5'-TCGAGTTGCATGCAG-3' (SEKW. NR ID 9); tak, że kodon start rekombinazy (podkreślony) został zamieniony w miejsce Sphl. Wektor pCIB1711 podobnie modyfikowano, aby umieścić miejsce Sphl na końcu lidera 35S w następujący sposób: Fragment Pstl/EcoRI zawierający promotor/lider 35S subklonowano do wektora pSGpoly11 by jego miejsce BamHI stało się unikalne. Po strawieniu BamHI/Xbal, wprowadzono linker zawierający miejsce Sphl: 5-GATCGCAGATGC(CTAG)-3' (SEKW. NR ID 10; część w nawiasach pokazuje sekwencję na nici komplementarnej oligonukleotydu). Powstający zmodyfikowany fragment Pstl/EcoRI przywrócono do szkieletu p1711 przez ligację 3-składnikową. Gen rekombinazy następnie wprowadzano na miejsce genu lucwdwóch kolejnych ligacjach ze względu na wewnętrzne miejsce Sphl.

p2RSLuc (fig. 4E) jest pochodną pCIB1711, wktórej miejsce 31 pz RS zostało wprowadzone pomiędzy promotorem 35S iliderem 35S genu lucyferazy. Fragment promotora między miejscami

PL 191 113 B1

Hindlll i Pstl najpierw subklonowano do pSGpoly7, aby dać pSG35, a w unikalne miejsce BamHI wprowadzono parę oligonukleotydów odpowiadającą następującej sekwencji z miejscem RS (wytłuszczone) i miejscem Hindlll (podkreślone)

5'-GATCAAGCTTTTGATGAAAGAATACGTTATTCTTTCATCAA(GATC)-3' (SEKW. IDNR: 11)

Klon, którego wstawiony oligonukleotyd określono przez sekwencjonowanie zgodnie z kierunkiem wskazówek zegara jak pokazano powyżej został wybrany, a jego zawierający RS subfragment został przywrócony do szkieletu pCIB1711 za pomocą ligacji 3-składnikowej, aby dać p1RSLuc.

p2RSLuc (fig. 4F) jest pochodną pCIB1711, w której wprowadzono zobu stron promotora 35S syntetyczne miejsca RS w odwrotnej orientacji, w której cały promotor 35S jest odwrócony w stosunku do genu luc. Opisany powyżej subklon promotora 35S pSG35S strawiono Hindlll/Xbal i para oligonukleotydów odpowiadająca następującej sekwencji zRS (wytłuszczone) i miejscem Pst (podkreślone) została wprowadzona:

5'-AGCTACTGCAGTTGATGAAAGAATACGTTATTCTTTCATCAA (CTAG)-3' (SEKW. ID NR: 12)

Powstały klon strawiono BamHI i wprowadzono drugą kopię RS przez wligowanie pary oligonukleotydów opisanej w poprzednim akapicie. Wybrano klon, w którym orientacja drugiego miejsca RS była odwrotna w stosunku do pierwszego (tzn.

5'-GATCAAGCTTTTGATGAAAG-AATACGTTATTCTTTCATCAA(GATC)-3' (SEKW. ID NR: 13 była w orientacji przeciwnej do kierunku wskazówek zegara) Orientacja palindromowej sekwencji RS jest zdefiniowana przez podkreślony centralny trójnukleotyd CGT (lub ACG na drugiej nici). Z powstałego klonu promotora 2RS wycięto fragment Hindlll/Pstl i odtworzono szkielet pCIB1711 za pomocą ligacji 2-składnikowej, odwracając orientację fragmentu 35S, aby stworzyć p2RSLuc.

3. Synteza mRNA

Plazmidy T7lucA50 i T7RecA50 (fig. 4A i 4B) linearyzowano Hindlll, który tnie zaraz za odcinkiem poli(A). Zlinearyzowany DNA ekstrahowano za pomocą fenolu/chloroformu,anastępnie strącano etanolem. Transkrypcja in vitrolinearyzowanego DNA była przeprowadzona z zastosowaniem polimerazy T7 z zestawu T7 Cap-Scribe zawierającego [m⁷G(5')ppp(5')] (Boehringer). W niektórych doświadczeniach produkt transkrypcji natychmiast traktowano DNAzą wolną od RNAzy (0,03 u/ml Worthington Biochemical) w obecności RNAsin (1 U/ml, Promega) przez 5 min, 37°, a następnie ekstrahowano fenolem/chloroformem i strącano etanolem. Integralność i stężenie mRNA określano za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym.

4. Sterylizacja materiałów biolistycznych

Cząsteczki złota (1,0 mm, Biorad, 0,3 mm. Heraeus) sterylizowano przez umieszczenie 60 mg cząsteczek w 100% etanolui 0,1% DEPC. Cząsteczki płukano3 razy wodą wolną od

RNAzy a następnie zawieszano w1 ml wody wolnej od RNAzy lub 1 ml 50% roztworu glicerolu wolnego od RNAzy. Próbki około 50 ml przygotowanych cząsteczek używano dla sześciu strzałów. Mikronośniki przykrywano 100% etanolem i 0,1% DEPC, następnie płukano 3 razy w100% etanolu i suszono na powietrzu. Ekrany hamujące autoklawowano.

5. Strącanie kwasów nukleinowych

DNA strącano na 50 ml zawiesiny cząsteczek złota (60 mg/ml) według instrukcji Bio-Rad. mRNA strącano na 50 ml zawiesiny cząsteczek złota wróżnych warunkach wskazanych wtekście. Wszystkie odczynniki do strącania były wolne od RNAzy i były dodawane do zawiesiny cząsteczek złota podczas ciągłego worteksowania w4°C. Po dodaniu wszystkich odczynników, kontynuowano worteksowanie przez 3 minuty, po czym cząsteczki osadzano przez krótkie mikrowirowanie (1 min). Usuwano nadsącz i cząsteczki płukano raz zimnym 100% etanolem i zawieszano w60 ml 100% etanolu. Mieszaniną worteksowano, i pipetowano próbki 10 ml na dysk makronośnika i pozwalano im wyschnąć pod wyciągiem laminarnym.

6. Dostarczanie mikropocisków komórkom roślinnym

Mikropociski dostarczano do komórek roślinnych przez akcelerator cząsteczek (PDS-100/He) stosując przeponę bezpieczeństwa 1100-1500 psi z próbką umieszczoną 5,5 cm od wyrzutni. Ekran o sicie 100 mm umieszczano w połowie drogi między płytą hamującą i tkanką. Docelowe płytki bombardowano 1 raz (komórki tytoniu) lub 2 razy (komórki kukurydzy).

PL 191 113 B1

7. Oznaczenia lucyferazy

Lucyferazę oznaczano w ekstraktach tkanek za pomocą systemu do oznaczania lucyferazy Promega według zaleceń producenta. Aktywność lucyferazy jest wyrażana jako jednostki światła wykrywane za pomocą Luminometru model 2001 Analytical lumienscence zintegrowane na 10 s w 25°C. Dla wyliczenia aktywności specyficznej mierzono stężenie białek stosując zestaw do oznaczeń firmy Bio-Rad.

D. Wyniki

1. Strącanie nienaruszonego mRNA na cząsteczkach złota

Aby zoptymalizować dostarczanie mRNA i jego następną ekpresję, przebadano kilka metod strącania mRNA na cząsteczki złota i analizowano stan i odzyskiwanie mRNA w osadzie i supernatancie za pomocą elektroforezy na żelach agarozowych. Frakcje określano jako „supernatant” (pipetowany bezpośrednio ze wstępnej reakcji strącania), „złoto” (cząsteczki złota zawieszane w wodzie po strącaniu mRNA) i „eluat wodny” (supernatant po odwirowaniu cząsteczek złota powleczonych mRNA). Eluat wodny badano by określić jak łatwo strącany mRNA mógłby się rozpuszczać po dostarczeniu do komórki roślinnej.

Po zastosowaniu metody strącania DuPont z 1,0 M CaCI2 i 16 mM spermidyną, mRNA był poważnie zdegradowany (dane nie przedstawione). Spermidyna w formie wolnej zasady prawdopodobnie powoduje hydrolizę alkaliczną RNA. Dlatego też zbadano strącanie mRNA na cząsteczki złota przez różne stężenia CaCI2 (1,0 M, 0,3M i 0,07M) bez spermidyny. 1,0 M CaCI2 dał najlepsze wyniki, a inkubacja przez noc z RNA w 1,0 M CaCI2 w -20°C okazała się poprawiać skuteczność w 90-100%, mRNA rozpuszczał się z cząsteczek w wodnym eluacie łatwiej po płukaniu etanolem dwukrotnie niż po jednym razie, prawdopodobnie ze względu na usunięcie CaCI2.

2. Przejściowa ekspresja lucyferazy po podaniu biolistycznym

Aby ocenić czy mRNA strącany na cząsteczki złota w ten sposób przeżywa proces podania biolistycznego i może działać przejściowo w komórkach roślinnych, podano komórkom mRNA lucyferazy zsyntetyzowany in vitro. Sekwencję liderową CaMV35S i poliA z 50 resztami adenylanowymi inkorporowano do konstruktu T7LucA50, aby spróbować wzmocnić ekspresję lucyferazy w komórkach roślinnych. mRNA lucyferazy z czapeczką strącano na cząsteczkach złota za pomocą 1,0 M CaCI2 i inkubowano przez noc w -20°C i cząsteczkami bombardowano zawiesinowe komórki kukurydzy i tytoniu. Oznaczenia lucyferazy przeprowadzano 2, 6 i 24 godziny po podaniu. Wyniki pokazano w tabeli 3 poniżej. Po 2 godzinach wykryto znaczącą aktywność lucyferazy. Aktywność wzrosła po 6 godzinach, ale spadła po 24 godz. Przeciwnie, ekspresja przejściowa plazmidu DNA zawierającego gen 35S-lucyferaza (pCIB1711) strąconego na cząsteczki złota według protokołu BioRad była najwyższa po 24 godzinach.

Tab e la 3

Wykazanie aktywności lucyferazy w komórkach tytoniu i kukurydzy po bombardowaniu lucyferazowym mRNA. Przedstawiono wyniki oznaczenia aktywności lucyferazy (jednostki światła/mg białka) w 2 g, 6 gi24 g po bombardowaniu

			Tytoń	Kukurydza
	Opis	czas
RNA lucyferazy	RNA	2 g	980	2100
		6 g	5300	2400
		24 g	700	400
DNA pCIB1711 DNA	DNA lucyferazy	2 g	78500	1000
		6 g	198000	6900
		24 g	1034600	14800
DNA T7-LucA50 DNA	sama matryca	6 g	30	300
Bez RNA-DNA		24 g	0	100

PL 191 113 B1

3. Wykazanie, że układ R/RS rekombinaza działa w kukurydzy: odwrócony promotor jest obracany by włączyć przejściową ekspresję lucyferazy

Aby zbadać, czy układ rekombinazy R/RS specyficznej, co do miejsca zZ. rouxii działa w kukurydzy tak jak doniesiono, że działa w tytoniu (Onouchi i wsp., 1991), zastosowano podwójne oznaczenie przejściowe, w którym przejściowo wyrażana w komórkach kukurydzy R-rekombinaza jest wymagana by obrócić promotor, aby włączyć przejściową ekspresję równocześnie dostarczonego kryptycznego genu lucyferazy. Jako pozytywną kontrolę, testowano podwójne oznaczenie przejściowe w komórkach tytoniu. Za pomocą bombardowania mikropociskami plazmid pRec (fig. 4D) zawierający gen 35S-rekombinaza dostarczano do komórek kukurydzy równocześnie z kryptycznym plazmidem lucyferazy, p2RLuc (fig. 4F). Obrócenie promotora p2RS pozostawia kopię RS (31 pz) między promotorem a genem luc, a efekt tego na ekspresję nie był znany. Dlatego także skonstruowaliśmy pozytywny plazmid kontrolny p1RSLuc (fig. 4E), aby symulować oczekiwany produkt p2RS Luc odwrócony przez rekombinazę. P1RSLuc zawiera promotor CaMV35S we właściwej orientacji, ale oddzielony przez pojedyncze miejsce RS od lidera i sekwencji kodującej lucyferazę. Stwierdzono, że p1RSLuc wyrażany jest na poziomie podobnym do pCIB1711 zarówno w tytoniu jak kukurydzy (dane nie pokazane); wten sposób „odcisk stopy” RS w genie ma tylko nieznaczny efekt na ekspresję luc.

Mieszanina plazmidów p2RSLuc ipRec jak isam kontrolny plazmid 2RSLuc, p1RSLuc i p1RSLuc plus pRec strącano na cząsteczki złota według protokołu BioRad i bombardowano nimi komórki tytoniu i kukurydzy (tabela 4). Podczas, gdy rekombinaza R włączała gen luc w tytoniu z przynajmniej 4% wydajnością po 24 godz (26.000 w stosunku do 597.000 jednostek światła/mg białka) proces wydawał się znacznie mniej skuteczny u kukurydzy z wydajnością zaledwie 0,27% (53 wstosunku do 20000 jednostek światła/mg białka). Ta bardzo niska aktywność wykrywana w kukurydzy okazała się być znacząca i powtarzalna. Cecha ograniczająca aktywność rekombinazy w kukurydzy mogła być jądrowa (wolna transkrypcja, fałszywe miejsca splicingu, nie wychodzenie mRNA z jądra) albo cytoplazmatyczna (stawanie rybosomów, stosowanie rzadkich kodonów, niestabilność mRNA itp.). Jeśli problem by był jądrowy, spodziewaliśmy się, że można by było go obejść za pomocą biolistycznego dostarczania mRNA rekombinazy, które powinno wprowadzać transkrypt bezpośrednio do cytoplazmy.

Tab e la 4

Aktywność rekombinazy w komórkach tytoniu i kukurydzy po bombardowaniu.

Wyniki średniej i odchylenia standardowego aktywności lucyferazy (jednostek światła/mg białka) z 6 powtórzeń komórek tytoniu i 3 powtórzeń komórek kukurydzy

	Tytoń	Kukurydza
bez DNA	16	< 1
p2RSIuc	1 300 ± 2300	4 ± 1
p2RS+pRec	26100±2600	53 ± 4
pIRSIuc	852 000 ± 91 000	15 700 ± 4100
pIRSIuc + pRec	597 000 ± 122 000	20 700 ± 2600

Docelowe miejsce dla rekombinazy Z. rouxii poprzednio zaważono do obszaru 58 pz (Matsuzaki i wsp., Molecular and Cellular Biology 8, 955-962 (1988)) obejmującego palindromową sekwencję 31 pz tu stosowaną. Nasze wyniki pokazują, że palindrom 31 pz. wystarcza, by pozwolić na obracanie promotora naszego kryptycznego konstruktu lucyferazy, w którym pośredniczy gen R. Tak więc ta skrócona sekwencja RS jest wystarczająca dla rekombinacji specyficznej w stosunku do miejsca zarówno u tytoniu jak i kukurydzy.

4. Przejściowa ekspresja DNA lucyferazy poprzez aktywność mRNA rekombinazy mRNA rekombinazy strącano z p2RSLuc DNA na cząsteczki złota w warunkach sprzyjających odzyskaniu RNA: 1,0 M CaCI2 i inkubacja przez noc w -20°C. Cząsteczkami bombardowano komórki

PL 191 113 B1 kukurydzy i mierzono aktywności lucyferazy po 2i 24 godzinach. Wyniki pokazano w tabeli 5 poniżej. Ekspresja lucyferazy była pomijalna w 2 godziny po bombardowaniu. Po 24 godzinach ekspresja lucyferazy była widoczna zarówno przy działaniu rekombinazy jak i 35S-DNA rekombinazy działającej na kryptyczny plazmid lucyferazy 2RS. Reakcja inwersji, gdy zbliża się do równowagi, osiąga stan stały z50% „włączonych” i50% „wyłączonych” orientacji promotora. Maksymalny oczekiwany poziom ekspresji lucyferazy wynosi wiać 50% aktywności p1RSLuc. Odwracanie sterowane przez mRNA osiągnęło zadziwiającą wydajność 67% maksimum teoretycznego. Wydajność inwersji sterowanej przez DNA była też znacząco poprawiona, jednak niesłychanie niski poziom ekspresji p1RSLuc wskazywał, że metoda strącania opracowana dla RNA była bardzo niewydajna dla DNA. Tak więc badano dalsze warunki strącania by znaleźć optymalny kompromis skuteczny dla zarówno DNA jaki RNA.

Tab e la 5

Wykazanie aktywności rekombinazy RNA w komórkach kukurydzy. Aktywność lucyferazy jest wyrażona jako jednostki światła na mg białka i była mierzona 2i24 godziny po bombardowaniu

	Opis	2 g	24 g
p2RSluc	sam cel	5,3	6,4
p2RSIuc + T7-RecA50	cel + sama matryca	4,5	7,8
p2RSIuc + Rec RNA	cel + rec RNA	6,7	34,8
p2RSIuc + Rec DNA	cel + rec DNA	5,0	15,6
pIRSIuc	kontrola dodatnia	37,4	89,6

5. Wydajne współstrącanie mRNA i DNA na cząsteczki złota.

Aby poprawić wydajność łącznego dostarczania DNA zmRNA ponownie zbadaliśmy to zagadnienie stosując spermidynę w mieszaninie do strącania, ale włączyliśmy bufor Tris, aby obniżyć pH i ewentualnie zapobiec degradacji RNA. W obecności 50 mM buforu Tris wpH 7,5 DNA koprecypitowano na cząsteczki stosując 1,0 M CaCI2 i2, 4, 10 lub 16 mM spermidynę. Wydajność strącania kwasów nukleinowych badano za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym jak opisano powyżej. Nienaruszony DNA i mRNA strącano skutecznie we wszystkich stężeniach spermidyny (dane nie przedstawione). Najniższe stężenie pozwalało na rozpuszczanie więcej DNA i mRNA z cząsteczek do wody, co może być korzystne przy ekspresji przejściowej iprzy stabilnej transformacji.

W ostatecznym dopracowaniu zmienialiśmy stężenie buforu Tris i badaliśmy skuteczność stosując kryterium aktywności biologicznej: Luc mRNA strącano stosując 2 mM spermidynę z 5 mM (procedura A) lub 50 mM (procedura B) buforem Tris pH 7,5 i bombardowano do komórek kukurydzy. W 5 godzin po bombardowaniu, poziomy przejściowej ekspresji wynosiły 1091 i 8000 jednostek światła/mg białka odpowiednio dla procedur AiB. Wyższa aktywność mRNA uzyskana stosując 50 mM Tris stanowi 3-4 krotną poprawę w stosunku do uprzednich warunków strącania z0,1 M CaCI2 i inkubacją przez noc w -20°C (tabela 1).

Procedury AiB stosowano, aby strącić mRNA rekombinazy z p2RSLuc DNA, które bombardowano do komórek kukurydzy i tytoniu. Aktywność lucyferazy mierzono po 24 godzinach, wyniki przedstawiono w tabeli 6 poniżej. Ekspresja DNA była poprawiona przy stosowaniu zarówno 5 mM jaki50 mM Tris, ale poziomy nie były zbliżone do uzyskiwanych ze stosowaniem procedury strącania BioRad (tabela 4). Warunki, które sprzyjają ekspresji mRNA, 50mM Tris dały najwyższe wydajności aktywności rekombinazy przy 18,9% i 9,4% odpowiednio dla kukurydzy i tytoniu. Choć wydajność rekombinazy jest niższa niż widziana w tabeli 5, wyższy poziom ekspresji DNA jest ważny dla uzyskania stabilnej transformacji. Wnioskujemy, że niskie stężenie spermidyny, buforowane Tris, mogłoby być stosowane z mRNA i polepszać ekspresję DNA.

PL 191 113 B1

Tab e l a 6

Ekspresja mRNA rekombinazy w komórkach tytoniu i kukurydzy mRNA (4 mg/6 strzałów), pRS Luc DNA (2 mg/6 strzałów) i p1RSLucDNA (2 mg/6 strzałów) bombardowano do komórek tytoniu i kukurydzy. mRNA syntetyzowany z genu b-glukuronidazy stosowano jako kontrolą. Aktywność lucyferazy wyrażona jako jednostki światła/mg białka była mierzona 24 godziny po bombardowaniu.

	Tytoń	Kukurydza
5 mM	50 mM	5 mM	50 mM
p2RSLuc+	139 ± 2,8	311 ±18	19 ± 1,7	20 ± 0,07
mRNA Rec
p2RSLuc+	57 ± 10	34 ± 2	3,5 ± 0,2	3,8 ± 0,9
mRNA
p1RSLuc+	16683±1460	6644±1565	426 ± 5	211 ± 40
mRNA

E. Dyskusja

Podajemy tu sposób wspólnego dostarczania mRNA iDNA poprzez bombardowanie cząsteczkami, który umożliwia przejściową ekspresję białka kodowanego przez mRNA na cząsteczce DNA. Wspólne podawanie mRNA iDNA pozwala na dostarczanie czynników trans-działających do komórki bez możliwości permanentnej ekspresji wynikającej ze stabilnej transformacji. Rekombinaza kodowana przez mRNA jest tylko aktywna przejściowo w czasie krótkiego okresu w czasie podania. Podejście to może być użyte do wprowadzania DNA donorowego w sposób specyficzny w stosunku do miejsca RS w genomie rośliny bez komplikacji ekspresji rekombinazy w powstałej roślinie.

Zarówno badania na żelu agarozowym jak i nad lucyferazą wskazują, że warunki które sprzyjają dostarczaniu DNA nie są optymalne dla mRNA ivice versa. Przez wybór różnych warunków strącania można sprzyjać jednemu z nich, aby uzyskać optymalne poziomy zrearanżowanego DNA w docelowej komórce roślinnej. Analiza elektroforetyczna kwasów nukleinowych na cząsteczkach złota po strącaniu okazała się być elegackim sposobem jakościowej i ilościowej oceny wydajności poszczególnych procedur strącania. Podejście to może być dalej wykorzystane do oceny kolejnych ulepszeń dostarczania kwasów nukleinowych poprzez bombardowanie cząsteczkami. Ostateczną diagnozą musi jednak być aktywność biologiczna, ponieważ elektroforeza na żelu może tylko wykryć znaczne uszkodzenia.

Cząsteczki mRNA wprowadzane egzogennie wtych badaniach były opracowane z trzema cechami, o których wiadomo, że odgrywają rolę w wydajnej ekspresji transkryptów. Dodawano czapeczkę na 5' końcu, aby działała jako miejsce rozpoznawania dla wiązania eukariotycznego czynnika inicjacyjnego, ważnego i niezbędnego kroku w translacji. Ogon poli(A) z50 reszt adenylanowych został zsyntetyzowany na 3' końcu podczas transkrypcji in vitro, ponieważ translacja niepoliadenylowanych mRNA jest około 100 do 200 razy niższa niż ich adenylowanych odpowiedników w elektroporowanych protoplastach tytoniu, marchwi, kukurydzy, i ryżu (Gallie i wsp., 1989 Plant Cell). Wykazano, że wydajność poliadenylowanego mRNA może być zwiększona orząd wielkości w obecności 5' czapeczki (Gallie, 1991). Nie ulegająca translacji sekwencja liderowa CaMV35S została włączona i wykazano, że wzmaga translację zarówno u tytoniu jak i kukurydzy (Gallie i wsp., 1989 Plant cell, Dowson Dayi wsp., 1993).

Bezpośrednie dostarczanie mRNA do komórek roślinnych ma zalety przy badaniu funkcji komórek. Stabilność i wydajność translacyjną mRNA można badać in vivo niezależnie od czynników transkrypcyjnych, obróbki i transportu do cytoplazmy. Elektroporacja (Higgs & Colbert, 1993) i glikol polietylenowy (Gallie, 1993 Plant cell reports) okazały się być użytecznymi i wydajnymi metodami wprowadzania mRNA do protoplastów roślinnych. Jednak te metody dostarczania są ograniczone do protoplastów, podczas, gdy podawanie biolistyczne może być szeroko stosowane do wielu rodzajów komórek i narządów roślinnych. Białka, które mogłyby być niekorzystne lub zbyt szkodliwe przy stabilnej ekspresji w komórce transgenicznej mogą być przejściowo eksprymowane z mRNA dostarczanego za pomocą biolistyki. Ekspresja rekombinazy w roślinie R/RS, na przykład, mogłaby doprowadzić do mozaikowych wzorów ekspresji, tak jak krzyżówki genetyczne wykonywane między roślinami zwierającymi gen rekombinazy i roślinami zawierającymi miejsce docelowe często doprowadzały do chimerycznej aktywności rekombinacyjnej i mozaikowej ekspresji u roślin F1 (Russell i wsp., 1992; Onouchi i wsp., 1995).

PL 191 113 B1

Dla produkcji kolejno ulepszanych transgenicznych konstruktów rośliny użytkowej, można stosować sytem R/RS do podstawienia nowego genu (genów) w pozycji starego. Tak więc pierwsza transgeniczna kaseta ijej selekcjonowalny marker (flankowane przez miejsca RS) mogą być zastąpione przez drugi, z innym markerem selekcjonowalnym. Z kolei drugi może ewentualnie być zastąpiony przez trzeci stosując znowu pierwszy selekcjonowalny marker. To podejście obniżyłoby liczbę potrzebnych selekcjonowalnych markerów i by uniknęło efektu zmiany pozycji kasety transgenicznej.

Zastosowanie systemu rekombinacji specyficznego w stosunku do miejsca u roślin stwarza możliwość większej kontroli insercji i ekspresji transgenu. Systemy rekombinaz umożliwiły insercje w uprzednio ustalone miejsce w genomie imogą obchodzić tak zwane „efekty pozycji (Fukushige & Sauer, 1992; Lakso i wsp., 1992; O'Gorman i wsp., 1991). Delecje i inwersje trangenów, w których pośredniczy rekombinaza pozwoliły na kontrolą ekspresji genów i usuwanie selekcjonowanych genów markerowych (przegląd Odeli & Russell, 1994). Wprowadzenie aktywności rekombinazy w postaci mRNA może rozszerzyć to stosowanie przez wymuszenie zajścia zdarzeń rekombinacyjnych wcześnie w procesie transformacji obniżając niebezpieczeństwo mozaicyzmu. W dodatku dostarczanie mRNA powinno dać większy stopień elastyczności w planowaniu schematów integracji specyficznej w stosunku do miejsca, które unikają wprowadzania informacji genetycznej rekombinazy do genomu.

P r zy k ł ad 4. Wspólne bombardowanie mRNA kodującego białka promujące integrację VirD1 i VirD2 do komórek tytoniu i kukurydzy.

Jak wskazano w szczegółowym opisie wynalazku, oczekuje się, że białka promujące integrację dostarczane do komórki eukariotycznej przeznaczonej do transformacji przez mogący ulec translacji mRNA będą produkowane przez skończony okres czasu aż mogący ulec translacji mRNA zostanie zdegradowany.

Oczekuje się, że białko wytworzone na tym mRNA pozostanie w komórce roślinnej przez skończony okres czasu zanim ono także ulegnie degradacji przez normalne procesy komórkowe. Tak więc dostarczanie promujących integrację białek w postaci mogącego ulec translacji mRNA jest sposobem dostarczania takich białek w sposób przejściowy. Przejściowe dostarczanie tych białek może być preferowane wtych sytuacjach, gdzie utrzymana obecność tych białek może mieć niepożądane efekty. Następujący przykład opisuje takie podejście do dostarczania białek VirD1 i VirD2 do komórek roślinnych wraz z fragmentem DNA otoczonym przez granice T-DNA. Podane tu wyniki wykazują, że te białka Vir były produkowane i przekazywały swoją aktywność promującą integrację na fragment DNA.

Stosowane materiały roślinne

Komórki kukurydzy

Hodowano zawiesinowe kultury kukurydzy (Zea mays L) inicjowane z zamrożonego embriogennego kalusa z niedojrzałych zarodków wybranych linii komórkowej elite (2717) spokrewnionej z B73 w płynnej pożywce N6 (Chu i wsp., 1975) uzupełnionej 30 g/l sacharozy i 2 mg/l kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego (2,4-D) (2N63S). Kultury inkubowano w25°C w ciemności w wytrząsarce orbitalnej przy 150 obr/min. Podkultury kultur zawiesinowych zakładano co 7 dni przez przeniesienie 1 ml upakowanej objętości komórek do 50 ml świeżej pożywki 2N63S. Zawiesina komórek kukurydzy stosowana do doświadczeń z bombardowaniem była pobierana z 3-dniowych szybko rosnących kultur. Przed bombardowaniem, około 0,5 ml upakowanej objętości komórek sączono pod próżnią na 7 cm filtry (Whatman Nr 4).

Komórki tytoniu:

Linię Nicotiana tabacum NT-1 hodowano w pożywce wg Murashige i Skoog uzupełnionej 2 mg/ml 2,4-D i sacharozą (30 g/l). Subkultury zakładano raz na tydzień przez dodanie 5 ml inoculum do 100 ml świeżej pożywki w butelkach 500 ml. Butelki inkubowano w 27°C na wytrząsarce rotacyjnej przy 125 obr/min. Próbki 0,5 ml komórek 4 dni po założeniu subkultury rozprowadzano po sterylnym sączku (Whatman No. 4). Filtry następnie przenoszono na pożywkę MS.

Konstrukcja plazmidów:

1. Konstrukcja wektora zawierającego promojor T7 i ogon poliA

Polilinker (SphI-EcoRI-NheI-ClaI-BgIll-Asp718-Hindlll-XhoI-Hind*lll, inaktywujące miejsce HindIII) wstawiano do miejsca SpHI-HindIII pT7RecA50 (p. przykład 3). Oligonukleotyd Asp718-A(50)-Dral-HindIII wstawiano następnie w odpowiadające miejsca, co dało pT7A50.

2. Konstrukcja pT7D1A50:

Fragment EcoRI-Bglll zawierający obszar kodujący virD1 uprzednio wklonowany w EcoRI-BamHI pSG5 (z fragmentu EcoRI-BamHI p35SAdh1D1) wstawiano w pT7-A50 strawionym EcoRI i Bglll.

PL 191 113 B1

3. Konstrukcja pT7D2A50

Dwa fragmenty, EcoRI-:BamHI (5'-koniec) i BamHI-ClaI (3' koniec) kodującego obszaru virD2 sklonowano w miejsce EcoRI-ClaI pT7-A50. Koniec 3' najpierw sklonowano jako fragment BamHI-Haelll w BamHI-EcoRV plazmidu Bluescript pSK, aby przekształcić go we fragment BamHI-CIaI.

Synteza mRNA:

Plazmidy T7D1A50 i T7D2A50 linearyzowano XhoI, który tnie zaraz za obszarem poli(A). Linearyzowany DNA poddawano ekstrakcji fenol/chloroform i strącano etanolem. Przeprowadzono transkrypcją in vitro linearyzowanego DNA stosując polimeraze T7 z zestawu T7 Cap-Scribe zawierającego [m⁷G(5')ppp(5')] (Boehringer). Integralność i stężenie mRNA kodującego VirD1 i VirD2 badano za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym.

Sterylizacja materiałów biolistycznych

Cząsteczki złota (0,3 mm - Heraeus) sterylizowano przez umieszczenie 60 mg cząsteczek w100% etanolu i 0,1% DEPC. Cząsteczki płukano 3 razy wodą wolną od RNAzy, a następnie zawieszano w 1 ml wody wolnej od RNAzy lub 1 ml 50% roztworu glicerolu wolnego od RNAzy. Próbki około 50 ml przygotowanych cząsteczek używano dla sześciu strzałów. Makronośniki zanurzano w100% etanolu i0,1% DEPC, następnie płukano 3 razy w100% etanolu i suszono na powietrzu. Ekrany hamujące autoklawowano.

Strącanie kwasów nukleinowych

DNA (1 mg) i mRNA (około 8 mg: 4 mg virD1 i 4 mg virD2 lub 8 mg niespecyficznego mRNA dla kontroli) strącano na 50 ml zawiesiny cząsteczek złota (60 mg/ml; 0,3 mm) przez dodawanie kolejno 0,5 ml buforu Tris (1M), 50 ml CaCI2 (2,5 M) i2,5 ml 0,1 M spermidyny. Po dodaniu wszystkich odczynników, kontynuowano worteksowanie przez 3 minuty, po czym cząsteczki osadzano przez krótkie mikrowirowanie (1 min). Usuwano nadsącz i cząsteczki płukano raz zimnym 100% etanolem i zawieszano w 60 ml 100% etanolu. Mieszaniną worteksowano i pipetowano próbki 10 ml na dysk makronośnika i pozwalano im wyschnąć pod wyciągiem laminarnym.

Dostarczanie mikropocisków komórkom roślinnym

Mikropociski dostarczano komórkom roślinnym przez akcelerator cząsteczek (PDS-100/He) stosując przeponą bezpieczeństwa 1100-1500 psi z próbką umieszczoną 5,5 cm od wyrzutni. Ekran o sicie 100 mm umieszczano w połowie drogi miądzy płytą hamującą i tkanką. Docelowe płytki bombardowano 2 razy.

Oznaczenia lucyferazy

Lucyferazę oznaczano w ekstraktach tkanek za pomocą systemu do oznaczania lucyferazy Promega według zaleceń producenta. Aktywność lucyferazy jest wyrażana jako jednostki światła wykrywane za pomocą Luminometru model 2001 Analytical Luminescence przez 10 s w 25°C. Dla wyliczenia aktywności specyficznej mierzono stążenie białek stosując zestaw do oznaczeń firmy Bio-Rad.

Wyniki

Oznaczenia lucyferazy przeprowadzano 24 godz. po bombardowaniu. mRNA virD1 i virD2 wspólnie bombardowano z p35SRBLuc, który zawiera prawą sekwencję graniczną wstawioną miądzy promotorem 35S i sekwencją kodującą lucyferazy. W kontrolnym doświadczeniu, p35SRBLuc bombardowano niespecyficznym mRNA. Wyniki wstępnych doświadczeń przedstawiono w tabeli 7 poniżej. Wyniki następnego doświadczenia są opisane w przykładzie 8 i przedstawione w tabeli 14.

Tab e la 7

Bombardowanie komórek roślinnych mRNA virD1 i virD2. Liczby w nawiasach wskazują na molowy stosunek plazmidów do mRNA. W każdym eksperymencie także bombardowano pGUS. Po inkubacji przez 24 godz. tkanki homogenizowanoiokreślano aktywności enzymów. Aktywności są wyrażane jako stosunek lucyferazy (Luc) do b-glukuronidazy (Glu). Analizowano niezależne bombardowaniaidane są przedstawione jako średnie wartości z3 powtórzeń plus minus odchylenie standardowe

	Tytoń	Kukurydza
średnia	± odch. standard	średnia	± odch. standard.
1	2	3	4	5
pRB(+)Luc	9,3	± 0,4	8,6	± 1,0
pRB(+)Luc + D1 mRNA	7,6	± 0,5	8,6	± 0,2

PL 191 113 B1

c.d. tabeli 7

1	2	3	4	5
pRB(+)Luc + D2 mRNA	8,4	± 0,1	8,3	± 0,1
pRB(+)Luc+ D1 mRNA+ D2 mRNA (1:1:1)	5,6	± 0,1	6,5	± 0,9
pRB(+)Luc+D1 mRNA+D2mRNA(1:2:2)	4,3	± 0,2	4,7	± 0,4
pCIB1711	8,8	± 0,8	0,5	± 1,4
pCIB1711+D1 mRNA+D2mRNA(1:1:1)	9,2	± 0,5	8,9	± 0,3
pCIB1711+D1 mRNA+D2mRNA(1:2:2)	8,6	± 0,4	11,8	± 1,9

Wniosek:

Po wspólnym dostarczeniu virD1 mRNAivirD2 mRNAzpRB(+)Luc DNA,wtym eksperymencie zaobserwowano 50% obniżenie aktywności lucyferazy (tabela 7). Dwa geny vir dostarczane do komórek roślinnych jako mRNA wydawały się mieć efekt synergistyczny. Te obserwacje silnie sugerują, że obniżenie aktywności lucyferazy było wynikiem nacięcia specyficznego w stosunku donici na prawej sekwencji granicznej przez białka virD1 ivirD2.

P rzy k ład 5. Integracja nici Twgenomie kukurydzy generowana in planta

Streszczenie

Została opracowana nowa technika transformacji roślin określana tu jako „agrolistyczna”, która pozwala na integrację wyłącznie interesującego genu, bez sekwencji wektora, jakwinsertach T-DNA i pozwala na kontrolę liczby kopii. Podejście polega na stosowaniu roślinnych kaset ekspresyjnych dla genów wirulencji wspólnie dostarczanych przez urządzenie biolistyczne zwektorem zawierającym sekwencje graniczne T-DNA otaczające selekcjonowalny marker. W niniejszych badaniach, wybrano wirus karłowatości pszenicy (WDV) jako wektor replikujący do wprowadzania eksprymowalnych wroślinach genów wirulencji (virD1, virD2 ivirE2) iselekcjonowanego markera flankowanego przez lewą iprawą sekwencje graniczną do komórek kukurydzy. Stwierdzono, że produkty genów virD1 i virD2 mogąwistocie przecinać graniczne sekwencje T-DNA in plantaigenerować zdarzenia insercyjne typu T (zdarzenia „agrolistyczne) po podaniu biolistycznym.

Wstęp

Agrobacterium stosuje się szeroko jako narzędzie do genetycznej manipulacji czy inżynierii komórek roślinnych za pomocą transformacji. Szczególny region jego patogennego plazmidu, T-DNA, jest przenoszony istabilnie integrowany do genomu rośliny. T-DNA jest ograniczany przez bezpośrednie powtórzone sekwencje 25 pz zwane sekwencjami granicznymi (przegląd p. Zupan i Zambryski, 1995). Każda sekwencja DNA położona pomiędzy granicami T może być wydajnie przenoszona z Agrobacterium do komórek roślinnych. Jednak przenoszenie i integracja T-DNA jest ograniczona przez zakres gospodarza bakterii, pozwalając na wydajną transformację tylko kilku roślin jednoliściennych (przegląd Chilton, 1994).

Aby wypełnić lukę wynikającązograniczonego zakresu gospodarza Agrobacterium jest pożądane znalezienie skutecznych metod genetycznej transformacji roślin jenoliściennych. Jedna możliwa metoda polega na generowaniu kompleksu T in planta przez dostarczenie komórkom roślinnym wszystkich narzędzi potrzebnych do rekonstrukcji kompleksu. Narzędzia te to: 1) interesujący gen oflankowany sekwencją granicznąi2) geny wirulencji pod kontrolą roślinnej kasety ekspresyjnej. Produkty genów virD1ivirD2 są niezbędne dla kluczowego etapu obróbki T-DNA (przegląd Zupan & Zambryski, 1995). VirD2 jest endonukleazą specyficznąwstosunku do nici, która, gdy jest wspomagana przez VirD1 specyficznie rozpoznaje sekwencje graniczne. Po cięciu VirD2 pozostaje kowalencyjnie przyłączony do 5' końca jednoniciowego DNA czyli nici T. Nić T jest chroniona przez białko wiążące jedną nić, virE2. Powstający kompleks nukleoproteinowy jest eksportowany do komórki roślinnej. VirD2 zawiera sekwencje lokalizacji jądrowej, która pilotuje nić T do genomu komórki roślinnej. VirD2 może brać udziałwligacji 5' końca nici T do genomu roślinnego (Tinlandiwsp. 1995).

W niniejszych badaniach, wybrano wirus karłowatości pszenicy jako wektor replikujący w roślinach, aby badać wytwarzanie nici T in plantaijej integrację do genomu rośliny. Cel stosowania takiego wektora jest, że geminiwirusy namnażają sięwjądrze komórkowym roślinwwysokiej liczbie kopii i pozwalają na wysokie poziomy ekspresji.

PL 191 113 B1

Materiałi metody

Plazmidy (p. fig. 5 gdzie przedstawiony jest schemat) pCIB1711 jest pochodną pUC zawierającą lucyferazę świetlika pod kontrolą promotora wirusa mozaiki kalafiora 35S (CaMV35S). Jest opisany w przykładzie 3.

pwiBarRBLuc został opracowany dla stabilnej transformacji komórek zawiesiny kukurydzy i zawiera lewą sekwencję graniczną, gen Bar (Thompson i wsp., 1987) pod kontrolą promotora CaMV35S i gen lucyferazy z prawą sekwencją graniczną wstawioną pomiędzy promotorem i sekwencją kodującą lucyferazy. Gen bar wycięto z pCIB3064 (Koziel i wsp., 1993) jako fragment Hindlll-EcoRI. Lewa granica została wycięta z pBin19 jako fragment Bglll-EcoRI (Bevan, 1984).

Geny virD1 i virD2 z pTiAG najpierw subklonowano do wektorów ekspresyjnych pMF6 (Callis i wsp., 1987) złożonych z promotora CaMV35S (0,5 kpz), pierwszego intronu Adh1 (0,5 kpz) i regionu poliadenylacji syntazy nopaliny (nos) (0,25 kpz). Fragment 0,6 kpz EcoRI-Pstl z pAD1187 (Vogel i Das, 1992) i 1,8 kpz fragment z pAD1190 sklonowano w pMF6 dając odpowiednio p35SAdh1 i p35SAdh2. Fragment Xbal-Notl z p35SAdh1 zawierający gen virD1 pod kontrolą promotora 35S subklonowano w miejsca Nhel-Notl zmodyfikowanego pwi-11. Polilinker (Nhel-Notl-Spel-Kpnl-Bglll) wprowadzano w unikalne miejsca BamHI-Sall pwi-11 (Ugaki i wsp., 1987). Fragment Notl z p35SAdhD2 obejmujący sekwencję kodującą virD2 pod kontrolą promotora 35S subklonowano w unikalne miejsce Notl pwi-11. Region kodujący virE2 wycięto z pw108, który zawiera 3 kpz fragment Xhol z plazmidu Agrobacterium Ti pTiA6 (numer dostępu X04784)(Winans i wsp., 1987). Fragment Sacl-Smal pw108 najpierw wklonowano w odpowiednie miejsca pBluescript KS-(Stratagene, Inc), aby uzyskać pKS3'E2. Fragment 924 pz Haelll-Sacl z pw108 skombinowano z fragmentem SacI-Pstl z pKS3'E2 i zhybrydyzowaną parą oligonukleotydów flankowanych lepkim końcem EcoRI i tępym końcem (5'-AATTCATGGATCTTTCTGGCAATGAGAAATCCAGG-3'; SEKW. NR ID 14) i sklonowano wmiejscach EcoRI-PstI pBluescript KS - aby dać pKSE2. Fragment Xhol-PstI, który pokrywa cały obszar kodujący virE2 został następnie subklonowany w XhoI-PstI pMF6, aby dać p35SAdhE2. Obszar Notl-XbaI zawierający promotor 35S, intron AdhI i obszar kodujący virE2 i terminator Nos sklonowano w miejsca Notl-NheI pwi-11. pGUS jest pochodną pUC zawierający sekwencję kodującą b-glukuronidazy (GUS) pod kontrolą promotora CaMV35Si intron genu katalazy rycyny (Ohta i wsp., 1990).

Komórki kukurydzyw zawiesinie

Zawiesinową kulturę kukurydzy Zea mays cv Black Mexican Sweet hodowano w pożywce N6 (Chu i wsp., 1975) uzupełnionej 30 g/l sacharozy i 2 mg/l kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego (2,4-D) (2N63S). Zawiesina komórek kukurydzy stosowana do doświadczeń z bombardowaniem była pobierana z 3-dniowych szybko rosnących kultur. Przed bombardowaniem, około 0,5 ml ubitej objętości komórek sączono pod próżnią na 7 cm filtry (Whatman Nr 4). Wysiane komórki trzymano 4 godz. w 25°C przed bombardowaniem na pożywce 2N6 zestalonej fitoagarem zawierającej 120 g/l sacharozy. Aby uzyskać stabilne trans-formanty filtry przenoszono na pożywkę stałą 2N63S 24 godziny po bombardowaniu. Następnie przenoszenie filtrów na świeżą pożywkę ze wzrastającymi stężeniami Basta robiono, co 8 dni aż większość komórek w hodowli przestawała rosnąć. To na ogól zachodziło po 4 do 6 tygodniach selekcji na płytkach zawierających 8 do 10 mg/l Basta. Niezależne kalusy rozwinięte na tym filtrze następnie przenoszono na pożywkę zestaloną fitoagarem i uzupełnioną Basta (10 mg/l). Po dwóch podkulturach na tej samej pożywce, inicjowano kultury zawiesinowe przez inokulacją około 100 mg komórek kukurydzy w 25 ml pożywki płynnej uzupełnionej Basta (10 mg/l) do izolacji DNA.

Bombardowanie komórek roślinnych

Tkanki bombardowano złotymi mikropociskami, na które strącono mieszaniną plazmidów. DNA plazmidu pGUS stosowano jako wewnętrzną kontrolę w eksperymentach z ekspresją przejściową. Do eksperymentów z kotransformacją, cząsteczki złota albo niosły równe masy plazmidów (0,5 mg każdego plazmidu na płytce docelowej). Do doświadczeń nad stabilną transformacją mieszaniany kotransformacyjne zawierały stosunek molowy 1:1 albo 2:1 plazmidów niosących geny wirulencji do plazmidu selekcyjnego bar. Każda próbka mieszaniny plazmidów bombardowanych na docelową szalkę składała się z 0,4 mg markera selekcyjnego i 0,4 mg albo 0,8 mg każdego plazmidowych DNA pwi35SAdh1 i pwiAdh35SD2 i/lub pwiAdh35SE2. Odpowiednie ilości każdego DNA mieszano w całkowitej objętości 10 ml i strącano za pomocą 50 ml 2,5 M CaCI2 i 20 ml 0,1 M spermidyny-wolna zasada, aby uzyskać strącenie na 50 ml 0,3 mm złotych mikronośników (60 mg/ml). Bombardowanie mikropociskami przeprowadzono za pomocą urządzenia biolistycznego PDS-1000 He(DuPont) stosując przeponę bezpieczeństwa 1100 psi z próbką umieszczona 8 cm pod półką ekranu hamującego.

PL 191 113 B1

Oznaczenia aktywności przejściowej

Lucyferazę oznaczano w ekstraktach tkanek za pomocą systemu do oznaczania lucyferazy Promega według zaleceń producenta. Aktywność b-glukuronidazy oznaczano za pomocą oznaczenia chemilumine-scencyjnego z zestawem GUS-Light (Tropie). Aktywność lucyferazy i b-glukuronidazy są wyrażane jako jednostki światła wykrywane za pomocą Luminometru model 2001 Analytical Luminescence zintegrowane przez 10 sw 25°C.

Ekstrakcja DNAi hybrydyzacja typu Southerna

Hodowle komórek zbierano za pomocą sączenia 10 dni po inokulacji i zamrażano w ciekłym azocie. DNA izolowano jak opisano uprzednio (Hall i wsp., 1991).

Około 10 mg genomowego DNA stosowano do trawienia EcoRI. Po rozdziale na 0,7% żelu agarozowym DNA przenoszono na membranę Amersham Hybond Plus i hybrydyzacja przeprowadzano zgodnie z warunkami opisanymi przez producenta (Amersham). Sondy DNA znakowano [a-³²P]dCTP stosując zestaw do znakowania oligo Pharmacia. Sonda Bar odpowiadała 0,5 kpz fragmentowi BglII genu Bar. Sonda luc odpowiadała 0,7 kpz fragmentowi XbaI-EcoRI genu lucyferazy. Aby usunąć sondy membrany inkubowano w 0,1% SDS w 100°C przez 5 minut.

Klonowanie styków T-DNA/DNA roślinny

DNA (30 mg) z transgenicznych kalusów kukurydzy trawiono EcoRI i poddawano elektroforezie preparatywnej na żelu agarozowym 0,8%. Plasterki agarozy odpowiadające wielkości fragmentów, które miały być sklonowane wycinano z żelu i DNA eluowano z agarozy za pomocą zestawu Gene Clean. Fragmenty następnie klonowano w defosforylowanym miejscu EcoRI pUC18. Mieszaniny ligacyjne zostały użyte do transformacji komórek E. coli HB101 za pomocą elektroporacji. Kolonie zawierające plamzid z właściwą wstawką identyfikowano za pomocą hybrydyzacji kolonijnej, stosując fragment 0,5 kpz Bar jako sondę. DNA z pozytywnych klonów następnie trawiono BamHI-EcoRI BamHI ma miejsce położone w odległości 3 pz od prawej sekwencji granicznej. Fragment ten reklonowano w odpowiednie miejsca pUC18. Analizowano sekwencją styku donorowego plazmidowego DNA z DNA roślinnym, stosując uniwersalny primer.

Wyniki

Oznaczanie ekspresji przejściowej do badania nacinania sekwencji granicznej przez produkty genów virD1i virD2 in planta

Aby zbadać czy produkty genów virD1 i virD2 mogą nacinać sekwencją graniczną T-DNA, gdy są wyrażane w roślinach oznaczono plazmidy testowe pwiRBLuc i pRBLuc. pRBLuc jest pochodną pUC podczas, gdy pwi jest wektorem opartym na wirusie karłowatości pszenicy (WDV), który replikuje się w komórkach kukurydzy i składa się z dwóch sensownych otwartych ramek odczytu C1 i C2 wymaganych do replikacji wirusa i ori replikacji p15A z E. coli. Wektor nie zawiera ORFV1 i ORFV2 związanymi z rozprzestrzenianiem sią wirusa i rozwojem objawów (Ugaki i wsp., 1991). Nacięcie specyficzne w stosunku do miejsca wprowadzane przez produkty genów virD1 i virD2, by powodowało pęknięciew nici DNA, która jest matrycą dla mRNA lucyferazy, i wten sposób powinno obniżać produkcję transkryptu i enzymu lucyferazy. Po wspólnym bombardowaniu komórek pRBLuc lub pwiRBLuc i plazmidami niosącymi geny virD pod kontrolą promotora CaMV35S dowolne nacinanie na granicy sekwencji granicznej powinno być mierzalne ilościowo przez oznaczenie aktywności lucyferazy.

Wysoki poziom ekspresji genu lucyferazy uzyskano w komórkach kukurydzy bombardowanych pRBLuc DNA lub pwiRBLuc DNA. Łączne podanie do komórek kukurydzy pwiD1 DNA i pwiD2 DNA z pRBLuc DNA lub z pwiRBLuc DNA powodowało 10-krotny spadek stosunku aktywności lucyferazy do GUS (tabela 8). Łączne podanie pwiD2 DNA z pwiRBLuc DNA także powodowało 10-krotne obniżenie stosunku aktywności lucyferazy do GUS. Ten wynik można wyjaśnić przez fakt, że WDV ma genom złożony z jednego DNA jednoniociowego. Namnaża się on w jądrze zakażonych komórek poprzez dwuniciowy intermediat, który jest następnie stosowany jako matryca do replikacji według modelu toczącego się koła DNA nici wirusowej (Saunders i wsp., 1991; Stenger i wsp., 1991). Wykazano, że VirD2 powoduje przecięcie in vitro jednoniciowych oligonukleotydów (Pansegrau i wsp, 1993; Jasper i wsp., 1994). Tak więc VirD1 nie jest wymagany do cięcia jednoniciowego DNA z geminiwirusa.

Analiza stabilnych transformantów

Przeprowadzono stabilną transformację komórek kukurydzy, aby ocenić efekty produktów genów virD1 i virD2 na wzór integracji DNA po łącznym dostarczeniu tych genów wraz z ich DNA substratowym przez urządzenie biolistyczne. Do tych doświadczeń stosowaliśmy pwiBarLuc i pBArRBLuc, które zawierają lewą granicę T-DNA, Bar jako selekcjonowalny marker, i gen 35SRBLuc z prawą granicą T-DNA wstawioną między promotorem i obszarem kodującym lucyferazę. Sposobem badania

PL 191 113 B1 integracji, w której pośredniczy virD był brak lucyferazy w stransformowanym klonie wynikający zwykluczenia regionu kodującego Luc przez wycinanie T-DNA z pBarRBLuc lub pwiBarLuc. Takie zdarzenia, które by wynikały z aktywności produktów genów vir na sekwencje graniczne, generując nić T były określone jako „zdarzenia agrolistyczne. Wręcz przeciwnie, „zdarzenia biolistyczne były wstawkami z genomu kukurydzy reprezentującymi proces normalnie zachodzący po dostarczaniu genów do komórek roślinnych przez urządzenie biolistyczne.

Komórki zawiesiny kukurydzy bombardowano mikropociskami powleczonymi DNA plazmidowym pBarRBLuc lub pwiBarRBLuc wraz zDNA pwiD1 i pwiD2 w stosunku 1:1:1 lub 1:2:2. Jako kontrole stosowano bombardowanie samym plazmidem pwiBarRBLuc i samym pBarRBLuc. W 3-4 tygodnie po bombardowaniu, na filtrze pojawiało się średnio od 8 do 10 klonów, ale tylko pewną ich część dalej analizowano. Gdy razem dostarczano DNA plazmidu p35AdhE2 z innymi genami wirulencji odzyskiwano nieznacznie większą ilość kalusów na filtr (12015). Zgrubny szacunek częstości zdarzeń agrolistycznych można było wykonać przez stosunek całkowitej ilości analizowanych kalusów opornych na Basta, które nie eksprymują lucyferazy do wszystkich kalusów Basta. Według tego kryterium, częstość zdarzeń agrolistycznych wynosiła około 20%, gdy pBarLuc dostarczano łącznie zDNA plazmidów pwi35SAdhD1 i pwi35SAdh2. Częstość wzrastała do około 40%, gdy docelowym plazmidem stosowanym był pwiBarRBLuc. Częstość ta wzrastała do około 50%, gdy wraz z opisanymi powyżej plazmidami dostarczano także pwi35SAdhE2.

Analiza Southerna

Na poziomie molekularnym wstawki reprezentujące zdarzenie agrolistyczne powinny hybrydyzować z sondą Baraniezsondą Luc. Co więcej, w zdarzeniu agrolistycznym sekwencja styku między wprowadzonym DNA aDNA Roślinnym powinna dokładnie odpowiadać prawej granicy końca nici T. Oba typy zdarzeń mogą zachodzić w tej samej komórce roślinnej ale takie klony byłyby określane na podstawie testów genetycznych jako biolistyczne w oparciu o aktywność lucyferazy. Zarówno biolistyczne jak i domniemane agrolistyczne zdarzenia badano techniką Southerna, aby zmierzyć częstość każdego typu insercji.

Przeprowadzono hybrydyzację typu Southerna na DNA z opornych na basta linii kalusa otrzymanych po bombardowaniu DNA: (i) pwiBarRBLuc, (ii)pwiBarRBLuc, pwiD1 i pwiD2, (iii)pwiBarRBLuc, pwiD2 i pwiE2, (iV) pBarRBLuc i (v)pBarRBLuc, pwiD1, pwiD2.

Analiza blotów wykazała 3 grupy linii transgenicznych kalusów jak podsumowano w tabeli 9: (i) linie kalusa hybrydyzujące zarówno z sondą bar ineo; (ii) linie kalusa, w których niektóre inserty hybrydyzowały tylko z sondą bar, a niektóre z obydwiema sondami; (iii) linie kalusa hybrydyzujące tylko z sondą bar. Pierwsza grupa kalusów prawdopodobnie nie zawiera zdarzeń agrolistycznych. Druga grupa kalusów prawdopodobnie zawiera dwa rodzaje zdarzeń: agrolistyczne i biolistyczne. Trzecia grupa kalusów wykazywała tylko przypuszczalne zdarzenia agrolistyczne. Na przykład wśród 10 linii transgenicznych kukurydzy analizowanych z doświadczenia z transformacją pwiBarRBLuc, pwiD1 i pwiD2, 3 zawierało zdarzenia biolistyczne, 6 zawierało przypuszczalne zdarzenia agrolistyczne i 1 miał obydwa. Wzory hybrydyzacji oddzielnych linii były unikalne wykazując, że linie kalusa były niezależnymi zdarzeniami transformacyjnymi.

Molekularna analiza przypuszczalnych zdarzeń agrolistycznych

Natura przypuszczalnych zdarzeń agrolistycznych była sprawdzana przez określenie sekwencji styku między wintegrowanym DNA iDNA Roślinnym. Sekwencja nukleotydów wykazała, że każdy ztych fragmentów zawierał styk prawa sekwencja graniczna/DNA Roślinny. Prawy koniec wstawionego fragmentu był identyczny z miejscem nacięcia prawej sekwencji granicznej w T-DNA, jak oczekuje się w przypadku zdarzenia agrolistycznego.

Tab e la 8

Aktywność virD1 i virD2 wkomórkach kukurydzy

Plazmidy	Średnia	± odch. standar.
1	2	3
pwi35SRBLuc	15,0	± 1,2
pwi35SRBLuc + pwi35SAdhD1 (1:1)	8,1	± 1,1

PL 191 113 B1

c.d. tabeli 8

1	2	3
pwi35SRBLuc + pwi35SAdhD2 (1:1)	0,7	± 0,3
pwi35SRBLuc + pwi35SAdhD1 + pwi35SAdhD2 (1:1:1)	0,2	± 0,1
p35SRBLuc	17,6	± 1,2
p35SRBLuc + pwi35SAdhD1 + pwi35SAdhD2 (1:1:1)	0,8	± 0,1
135SRBLuc + p35SAdhD1 + p35SAdhD2 (1:1:1)	1,0	± 0,2
bez DNA	0,2

DNA dostarczano do komórek za pomocą urządzenia biolistycznego. Liczby wnawiasach pokazują stosunek plazmidów. Po inkubacji przez 24 godz. tkanki homogenizowano i określano aktywności enzymów. W każdym bombardowaniu włączano plazmid eksprymujący b-glukuronidazę (GUS) pGUS jako kontrolę wydajności transferu DNA i aktywność genu reporterowego jest wyrażona jako stosunek aktywności lucyferazy do GUS. Analizowano niezależne bombardowania i dane są przedstawione jako średnie wartości z 3 powtórzeń plus minus odchylenie standardowe.

Tab e la 9

Analiza kalusów opornych na basta odzyskanych po bombardowaniu komórek BMS samym docelowym plazmidem i/lub z genami vir

Plazmidy	Kalus	Aktywność lucyferazy	Southern	Rodzaj zdarzenia
pwiBarRBLuc (0,2 mg)	16	15 Luc(+) 1 Luc (-)	5	5 B
pwiBarRBLuc + pwiD1 + pwiD2	19	10 Luc (-)	10	3 B, 6 A, 1 A+B
(0,4 mg +0,4 mg + 0,4 mg)		9 Luc (+)	9	8 B, 1 B+A
pwiBarRBLuc + pwiD1+pwiD2	11	8 Luc (-)	4	1 B, 2 A, 1 B+A
(0,4 mg + 0,8 mg + 0,8 mg)		3 Luc (+)	1	1 B
pwiBarRBLuc + pwiD1 + pwiD2 +	21	10 Luc(-)	4	1B, 2 A
pwiE2		11 Luc(+)	5	5B
(0,4 mg + 0,4 mg + 0,4 mg + 0,4 mg)
pBarRBLuc (0,4 mg)	10	9 Luc (+)	2	2 B
pBarRBLuc + pwiD1 + pwiD2	38	7 Luc(-)	4	4 B
(0,4 mg + 0,4 mg + 0,4 mg)		31 Luc(+)	5	4 B, 1 B+A

Liczby w nawiasach pokazują stężenie DNA stosowanew doświadczeniach z transformacją. B = zdarzenie biolistyczne;

A = domniemane zdarzenie agrolistyczne;

Southern = liczba kalusów analizowanych techniką Southerna; kalus = liczba kalusów badanych pod kątem aktywności lucyferazy

PL 191 113 B1

P r z y k ł a d 6. Ekspresja VirD1 i VirD2 z pojedynczego promotora wkomórkach kukurydzy i tytoniu

Aby uzyskać ekspresję genów bakteryjnych w komórkach roślinnych indywidualne regiony kodujące genów bakteryjnych muszą być w formie fuzji z odrębnymi promotorami roślin, ponieważ promotory prokariotyczne nie pozwalają na transkrypcję w roślinach. Choć jest możliwe podłączenie każdego genu do odrębnego promotora, mogłoby to stwarzać parę problemów, np. wyciszanie, jeśli ten sam promotor jest używany przez różne geny. Strategia wykazana w tym przykładzie jest to połączenie tandemowe dwóch genów do tylko jednego promotora roślinnego. Ten poligeniczny mRNA zawiera dwie sekwencje kodujące virD1i virD2, które należą do operonu virD Agrobacterium.

Te dwa polipeptydy kodowane przez 5' połowę operonu virD odgrywają kluczową rolę w inicjacji obróbki DNA do transferu z Agrobacterium do komórek roślinnych. VirD2 jest endonukleazą specyficzną w stosunku do nici, która z pomocą VirD1 nacina prawą granicę sekwencji T-DNA między trzecią i czwartą zasadą. VirD2 pozostaje kowalencyjnie przyłączone do 5' końca T-DNA i uważa się, że naprowadza T-DNA do komórek roślinnych i bierze udział w ligacji 5' końca T-DNA do genomu roślinnego.Wykazano, że te dwa białka są funkcjonalne w komórkach roślinnych po podłączeniu do promotora roślinnego.

W tym przykładzie została przygotowana jednostka ekspresyjna złożona z genów virD1 i virD2 sterowanych przez pojedynczy promotor roślinny, która wykazała funkcjonalną ekspresję in planta. Indywidualne geny łączono albo jako fuzję transkrypcyjną albo jako fuzję translacyjną i pokazano, że w tym drugim przypadku zachowują aktywności enzymatyczne w komórkach roślinnych.

Materiałi metody

Konstrukcja fuzji D1-D2 lub D2-D1

Skonstruowano dwa rodzaje fuzji:

1) Fuzje transkrypcyjne

Użyto sekwencji kodującej virD1 i irD2 zmałym interfragmentem (33 pz) obecnym między regionami kodującymi virD1 i virD2. Fragment 1,1 kpz Notl-Pstl p35SD1 i fragment 1,5 kpz Pstl-Xbal p35D2 klonowano w miejsca Notl-Spel pSK+, aby powstał p35StpD1D2.

2) Fuzje translacyjne

Zrobiono fuzję genów wirulencji virD1 i virD2 poprzez sekwencję interweniującą zaplanowaną, aby pozwolić na swobodny ruch obu białek i która jest podatna na post-translacyjne cięcie. Dla p35SD1D2 region kodujący virD1 jest na 5' końcu fuzji podczas, gdy p35SD2D1 zawiera region virD2 zaraz za promotorem. Wszystkie modyfikacje potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA.

Konstrukcja p35SD1D2. Aby stworzyć fuzję virD1-virD2, która koduje virD1 i virD2 usunięto kodon stop virD1 i kodon inicjacyjny virD2. Zrobiono to przez wklonowanie w miejsce EcoRI-Hindlll pUC32 zhybrydyzowanej pary oligonukleotydów DNA, oflankowanych przez lepkie końce BanI i lepkie końce PvuI do 0,48 kpz EcoRI-BanI p35SD1 i fragment 0,25 kpz PvuI-HindIII p35SD2. Połączona para była złożona z następujących oligonukleotydów:

5'-GTGCCTTGCCTTCTACTCCCCCAACTCCCTCTCCTAGCACGCCTCCGACACCTAGCCCCGAT-3' (SEKW. NR ID 15) oraz

5'-CGGGGCTAGGTGTCGGAGGCGTGCTAGGAGAGGGAGTTGGGGGAGTAGAAGGCAAG-3' (SEKW. ID NR: 16).

Fragment EcoRI-PstI tego konstruktu obejmujący region kodujący virD1, linker i 5' koniec regionu kodującego virD2 następnie wstawiano w miejsca EcoRI-Pstl p35SD2 dając p35SD1D2.

Konstrukcja p35SD2D1. Podobnie plazmid pD2D1 zawiera sekwencję kodującą virD2 na 5' końcu pD2D1 połączony w zgodnej ramce odczytu z regionem kodującym virD1 poprzez tę samą sekwencję wtrąconą. N-terminalną kodującą sekwencję virD1 najpierw zrekonstruowano przez zchodzące na siebie oligonukleotydy, aby dostarczyć miejsce EcoRI na 5' końcu i wydeletować pierwszy kodon virD1 (5'-AATTCTCAAAACACACCAGAGTCACGTCGAGTGAGACTGCCATCAACCAGCAT-3';

SEKW. ID NR: 17).

PL 191 113 B1

Te zhybrydyzowane oligonukleotydy wklonowano do pBluescript KS+ (Stratagene, Inc), aby uzyskać pKS5'D1. Fragment 1,3 kpz SacII-BfaI z p35SD2 i plazmid pKS5D1 cięty Sacl i EcoRI łączono następnie z linkerem zawierającym na 5' końcu zmianę miejsca Bfal tak, że nie posiada naturalnego kodonu stop virD2 (5'-TATCCTTCTACTCCCCCAACTCCCTCTCCTAGCACGCCTCCGACACCTAGC-3' (SEKW. ID NR: 18) oraz

5'-AATTGGCTAGGTGTCGGAGGCGTGCTAGGAGAGGGAGTTGGGGGAGTAGAAGGA-3' (SEKW. ID NR: 19)).

Fragment EcoRI-Clal obejmujący obszar kodujący virD2, linker i 5' koniec obszaru kodującego virD1 następnie wklonowano w miesjca EcoRI-Clal p35SD1, aby uzyskać p35SD2D1.

Konstrukcja plazmidów testowych

Konstrukcję plazmidów pwBarRBLuc, pRBLuc opisano w przykładzie 5.

Bombardowanie komórek roślinnych

Tkanki bombardowano złotymi mikropociskami, na które strącono mieszaninę plazmidów. Do eksperymentów z kontransformacją, cząsteczki złota niosły 0,5 mg lub 1 mg testowego plazmidu z łącznie 2 mg lub 4 mg plazmidów pomocniczych odpowiednio dla komórek tytoniu i kukurydzy. Dodawano odpowiednią ilość DNA plazmidu pUC18, aby zachować równą masę plazmidowych DNA w mieszaninie (p. tabela 9 i10). DNA strącano za pomocą 2,5 M CaCI2 i0,1 M spermidyny - wolna zasada na 50 ml 0,3 mm złotych mikronośników (60 mg/ml). Bombardowanie mikropociskami przeprowadzono za pomocą urządzenia biolistycznego PDS-1000 He (DuPont) stosując przeponę bezpieczeństwa 1100 psi z próbką umieszczoną 8 cm pod półką ekranu hamującego.

Oznaczenia aktywności przejściowej

Lucyferazę oznaczano w ekstraktach tkanek według zaleceń producenta (Luciferase assay system, Promega). Aktywność lucyferazy jest wyrażana jako jednostki światła wykrywane za pomocą Luminometru model 2001 Analytical Luminescence zintegrowane przez 10 s w 25°C. Do oznaczenia aktywności specyficznej oznaczano stężenie białka z zastosowaniem zestawu do oznaczania białek Bio-Rad.

Wyniki i dyskusja

Strategia projektów fuzji

Geny virD1 i virD2 pochodziły z plazmidu oktopinowego pTiA6 Agrobacterium tumefaciens. Fuzja transkrypcyjna niesiona przez p35StpD1D2 zawiera region kodujący virD1 i virD2 z naturalną sekwencją interweniującą obecną w operonie virD.

Fuzje translacyjne niesione przez p35SD1D2 i p35SD2D1 zawierają regiony kodujące virD1 i virD2 połączone poprzez sekwencję interweniującą zaplanowaną, aby pozwolić na swobodny ruch obu białek i która jest podatna na cięcie post-translacyjne.

Funkcjonalna ekspresja poligenu in planta

Aby badać funkcjonalną ekspresję fuzji transkrypcyjnych i translacyjnych, p35StpD1D2, p35SD1D2 i p35SD2D1 dostarczano wspólnie do komórek roślinnych z plazmidem testowym za pomocą urządzenia biolistycznego. Plazmid testowy zawiera prawą sekwencję graniczną wstawioną pomiędzy promotorem i regionem kodującym genu lucyferazy w taki sposób, że nacięcie specyficzne, co do nici w obrębie tej sekwencji doprowadzi do obniżenia ekspresji lucyferazy. Badano dwa typy plazmidów testowych w komórkach kukurydzy: plazmid pochodzący od pUC (pRBLuc) i plazmid pochodzący od geminiwirusa karłowatości pszenicy (pwBarRBLuc).

Komórki kukurydzy i tytoniu najpierw przejściowo transformowano plazmidem testowym dostarczanym wspólnie z genami virD1 i virD2, każdy znich był sterowany przez oddzielny promotor, aby sprawdzić ich zdolność do wpływania na transkrypcję poprzez graniczną sekwencją T-DNA. Po wspólnym dostarczeniu DNA p35SD1 i p35SD2 z pRBLuc lub pwBarRBLuc, obserwowano 0,3% i 1% kontrolnego poziomu lucyferazy w komórkach tytoniu i kukurydzy (tabela 10, tabela 11 i tabela 12).

Oba geny vir razem w formie fuzji transkrypcyjnej wydawały się być trochę aktywne. Wspólne dostarczenie za pomocą podania biolistycznego równych ilości DNA pRBLuc i DNA p35StpD1D2 (stosunek 1:1) obniżył aktywność lucyferazy do około 57% kontroli w tytoniu (tabela 12) i 60-80% w komórkach kukurydzy (tabela 10 i tabela 11). Przy wyższym stosunku plazmidu p35StpD1D2 do plazmidu testowego (2:1) aktywność lucyferazy została obniżona dalej do około 2-5% we wszystkich

PL 191 113 B1 przypadkach. Odwrócenie naturalnej orientacji genów wirulencji w fuzji translacyjnej p35SD2D1 dało podobne wyniki do uzyskanych z p35SD1D2 (tabele 10, 11 i 12).

Obserwacje te silnie sugerują, że fuzje translacyjne były czynne in planta.

Tab e la 10

Aktywność fuzji transkrypcyjnychitranslacyjnychwkomórkach kukurydzy z wektorem-pochodną pUC jako plazmidem testowym

Plazmidy wprowadzone do komórek kukurydzy	Aktywność lucyferazy	% kontroli
PRBLuc+ pUC18 (1 mg + 4 mg)	12333 ± 543	100,0
pRBLuc+ p35SD1 + p35SD2 (11 mg + 2 mg + 2 mg)	1 82 ± 43	1,5
pRBLuc + p35SD1D2 + pUC18 (1 mg + 2 mg + 2 mg)	5744 ± 290	47,0
pR6Luc + p35SD1D2 (1 mg + 4 mg)	300 ± 12	2,4
pRBLuc + p35SD2D1 + pUC18 (1 mg + 2 mg + 2 mg)	5920 ± 813	48,9
pRBLuc + p35SD2D1 (1 mg + 4 mg)	329 ± 59	2,6
pRBLuc + p35StpD1D2+ pUC18 (1 mg + 2 mg + 2 mg)	7312 ± 1091	60,0
pRBLuc + p35StpD1D2 (11 mg + 4 mg)	6436 ±615	52,0

Tabela 10: DNA dostarczano do komórek za pomocą urządzenia biolistycznego. Liczby w nawiasach wskazują stosunki plazmidów. Po inkubacji przez 24 godz., tkanki homogenizowano i oznaczano aktywność lucyferazy wyrażaną jako jednostki światła/mg białka. Analizowano niezależne bombardowania i dane są przedstawiane jako średnia z wartości z3 doświadczeń plus minus odchylenie standardowe.

Tab e la 11

Aktywność fuzji transkrypcyjnych i translacyjnych w komórkach kukurydzy z wektorem-pochodną geminiwirusa jako plazmidem testowym

Plazmidy wprowadzone do komórek kukurydzy	Aktywność lucyferazy	% kontroli
1	2	3
pwBarRBLuc + pUC18 (1 mg + 4 mg)	531 ± 38	100,0
pwBarRBLuc + p35SD1 + p35SD2 (1 mg + 2 mg + 2 mg)	5 ± 3	1,0
pwBarRBLuc + p35SD1D2 + pUC18 (1 mg + 2 mg + 2 mg)	115 ± 23	22,0

PL 191 113 B1

c.d. tabeli 11

1	2	3
pwBarRBLuc + p35SD1D2 (1 mg+ 4 mg)	32 ± 4	6,0
pwBarRBLuc + p35SD2D1 + pUC18 (1 mg +2 mg + 2 mg)	60 ± 10	11,0
pwBarRBLuc + p35SD2D1 (1 mg + 4 mg)	19 ±3	3,6
pwBarRBLuc + p35StpD1D2 + pUC18 (1 mg + 2 mg + 2 mg)	431 ± 115	81,0
pwBarRBLuc + p35StpD1D2 (1 mg + 4 mg)	380 ± 53	72,0

Tabela 11: p. stopka w tabeli 10.

Tab e la 12

Aktywność fuzji transkrypcyjnych i translacyjnych w komórkach tytoniu

Plazmidy wprowadzone do komórki tytoniu	Aktywność lucyferazy	% kontroli
pRBLuc+ pUC18 (0,5 mg + 2 mg)	21611± 760	100,0
pRBLuc + p35SD1 + p35SD2 (0,5 mg +1 mg +1 mg)	60 ± 1	0,3
pRBLuc + p35SD1D2 + pUC18 (0,5 mg +1 mg +1 mg)	2494 ± 44	12,0
pR8Luc + p35SD1D2 (0,5 mg + 2 mg)	1179±183	5,4
pRBLuc + p35SD2D1 + pUC18 (0,5 mg +1 mg +1 mg)	1603±422	7,4
pRBLuc + p35SD2D1 (0,5 mg + 2 mg)	1071 ±113	5,0
pRBLuc + p35StpD1D2 + pUC18 (0,5 mg +1 mg +1 mg)	12240±1417	57,0
pRBLuc + p35StpD1 D2 (0,5 mg + 2 mg)	11627±2491	54,0

Tabela 12: Patrz stopka do tabeli 10.

P rzy k ł a d 7. Rola VirE2 w wydajności transformacji

Testowano wektor „uzdrawiający” w komórkach kukurydzy pod kątem zwiększania częstości zdarzeń agrolistycznych. Stosowany wektor zawierał miejsce poliadenylacji wewnątrz struktury DNA z lewej strony prawej granicy.

W drugiej części doświadczenia, virE2 dostarczano wspólnie z genami virD1 i virD2. Wykazano, że to białko jest wymagane do skutecznego transferu T-DNA, ale nie do produkcji T-DNA (Stachel i wsp., 1986). VirE2 wiąże się in vitro kooperatywnie i niespecyficznie do jednoniciowego DNA. VirE2 może brać udział w ochronie nici T. Białko virE2 jest najbardziej licznym białkiem produkowanym przez Agrobacterium tumefaciens po indukcji genów wirulencji (Stachel i wsp., 1986). Ponieważ virE2 ma sygnały lokalizacji jądrowej i są one rozpoznawane u roślin (przegląd - Zupan i Zambryski, 1995), oczekuje się wyższej transformacji, gdy ten gen jest wprowadzany in planta.

PL 191 113 B1

Materiały i metody:

Konstrukcja pAVMI: Wektor zawierający sygnał poliadenylacji na prawej granicy (p. fig. 6-15).

Część A. Konstrukcja pCIB1711-HN pCIB1711 strawiono BamlII izreligowano, aby wytworzyć 1711deltaB, wktórym miejsce EcoRl (obecnie unikalne) zostało przecięte i zniszczone przez wstawienie oligonukleotydu, który równocześnie stworzył miejsca Hindlll iNotI. Za pomocą analizy sekwencji zidentyfikowaliśmy klon,wktórym te miejsca byływorientacji (po miejscu SacI) Kpnl, a potem HindlII. Aby przywrócić brakujące części oryginalnego plazmidu najpierw wstawiliśmy duży fragment BamIII niosący region kodujący Luc we właściwej orientacji, tworząc 1711-HN-B; potem zastąpiliśmy jego wstawkę XbaI przez odpowiednią część oryginalnego pCIB1711, ponownie wprowadzając brakującą sekwencję liderową.

Część B. Wstawienie syntetycznej oligonukleotydowej sekwencji granicznej między miejscami EcoRI iBamHl na końcu obszaru kodującego Luc, subklonowaliśmy fragment Notl/Cla do pBluescript, powodując, że miejsca EcoRIiBamHI we wstawce stały się unikalne. Po wstawieniu granicznego oligonukleotydu, aby wytworzyć pBS-NC-RB ponownie wstawiliśmy jego zmodyfikowany fragment Notl/Clal do szkieletu pCIB1711-HN dając pCIB1711-HN-RB.

Część C. Wstawienie lewej granicy T-DNA do pUbiPATdeltal

Aby wyeliminować niepożądane miejsce EcoRIwintronie pUCIAC strawiliśmy plazmid (wyhodowany wszczepie dam minus SCS110) Clal usuwając dwa małe fragmenty wtym miejscu EcoRI. Następnie wprowadziliśmy oligonukleotyd, który usunął miejsce ClaI istworzył miejsce Sphl, dając plazmid pUbiPATdelta. W obecnie unikalnym miejscu EcoRI na końcu chimerycznego genu PAT sklonowaliśmy fragment 29 EcoRI z pTiT37, plamizdu Ti typu nopalinowego, który niesie lewą granicę T-DNAwpozycji 68 pz. od jednego końca (Yadav, N.S., Vanderleyden, J., Bennet, D., Barnes, W.M., iChilton, M.-D. 1982). Krótkie bezpośrednie powtórzenia DNA flankują T-DNA na nopalinowym plazmidzie Ti. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6322-6326) tworząc LB-UbiPATdeltal.

Część D. Montaż pAVM1

Wycięto wstawkę HindIII pCIB1711-HN-RB i wligowano do miejsca Hindlll LB-UbiPATdeltal. Za pomocą mapowania zidentyfikowaliśmy konstrukt, wktórym lewe iprawe granice flankują gen PAT isą we właściwej orientacji do transferu. Powstały plazmid ma promotor Luciregion kodujący poza T-DNA, ale jego terminator jest akurat wewnątrz prawej granicy.

Komórki kukurydzy w zawiesinie

Zawiesinową kulturą kukurydzy Zea mays cv Black Mexican Sweet hodowano na pożywce N6 (Chuiwsp., 1975) uzupełnionej 30 g/l sacharozyi2 mg/l kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego (2,4-D) (2N63S). Zawiesina komórek kukurydzy stosowana do doświadczeń zbombardowaniem była pobieranaz3-dniowych szybko rosnących kultur. Przed bombardowaniem, około 0,5 ml objętości upakowanych komórek sączono pod próżnią na 7 cm filtry (Whatman Nr 4). Wysiane komórki trzymano 4 godz. w25°C przed bombardowaniem na pożywce 2N6 zestalonej fitoagarem zawierającej 120 g/l sacharozy. Aby uzyskać stabilne transformanty filtry przenoszono na pożywkę stałą 2N63S 24 godziny po bombardowaniu. Następnie przenoszono filtry na świeżą pożywkę ze wzrastającymi stężeniami Basta, co 8 dni aż większość komórek whodowli przestawała rosnąć. To na ogół zachodziło po 4 do 6 tygodniach selekcjina płytkach zawierających 8 do 10 mg/l Basta. Niezależne kalusy rozwinięte na tym filtrze następnie przenoszono na pożywkę zestaloną fitoagaremiuzupełnioną Basta (10 mg/l). Po dwóch podkulturach na tej samej pożywce, inicjowano kultury zawiesinowe przezinokulację około 100 mg komórek kukurydzy w 25 ml pożywki płynnej uzupełnionej Basta (10 mg/l) do izolacji DNA.

Bombardowanie komórek roślinnych

Tkanki bombardowano złotymi mikropociskami, na które strącono mieszaninę plazmidów. Mieszaniny do kontransformacji zawierały stosunek 1:1,3 plazmidów niosących geny wirulencji do plazmidu selekcyjnego bar. Każda próbka mieszaniny plazmidów bombardowanych na docelową szalkę składała sięz0,6 mg markera selekcyjnegoipo 0,8 mg każdego plazmidowego DNA p35SAdhD1 ip35SAdhD2 i/lub p35SAdhE2. Odpowiednie ilości każdego DNA mieszano wcałkowitej objętości 10 mlistrącano za pomocą 50 ml 2,5 M CaCI2i20 ml 0,1 M spermidyny-wolna zasada, aby uzyskać strącenie na 50 ml 0,3 mm złotych mikronośników (60 mg/ml). Bombardowanie mikropociskami przeprowadzono za pomocą urządzenia biolistycznego PDS-1000 He

PL 191 113 B1 (DuPont) stosując przeponę bezpieczeństwa 1100 psi z próbką umieszczoną 8 cm pod półką ekranu hamującego.

Ekstrakcja DNAi hybrydyzacja typu Southerna

Hodowle komórek zbierano za pomocą sączenia 10 dni po inokulacji i zamrażano w ciekłym azocie. DNA izolowano jak opisano uprzednio (Hall i wsp., 1991).

Około 10 mg genomowego DNA stosowano do trawienia EcoRI Po rozdziale na 0,7% żelu agarozowym DNA przenoszono na membranę Amersham Hybond Plus i hybrydyzację przeprowadzono zgodnie z warunkami opisanymi przez producenta (Amersham). Sondy DNA znakowano [a-³²P]dCTP stosując zestaw do znakowania oligo Pharmacia. Sonda PAT odpowiadała 0,7 kpz fragmentowi XbaI-PstI genu lucyferazy. Aby usunąć sondy membrany inkubowano w 0,1% SDS w 100°C przez 5 minut.

Wyniki

Analiza stabilnych transformantów

Przeprowadzono stabilną transformację komórek zawiesiny kukurydzy, aby ocenić efekt wektora pAVM1 na wydajność transformacji po wspólnym dostarczeniu takiego wektora z genami wirulencji za pomocą urządzenia biolistycznego. Pierwszy wektor ma promotor 35S wewnątrz prawej granicy w takiej orientacji, że może łatwo dostarczyć sposobu do ekspresji genu antysensownego do genu, w którym była wstawiona nić T. W tym nowym typie wektora, promotor 35S jest zastąpiony przez terminator 35S wewnątrz prawej granicy zorientowany tak by „naprawić” gen docelowy o ile wbuduje się po stronie 3'.

Do tego doświadczenia stosowano pAVM1, który zawiera lewą granicą T-DNA, PAT jako marker selekcyjny, i gen lucyferazy poza strukturą podobną do T-DNA. Określamy jako „zdarzenia agrolistyczne” takie insercje DNA do genomu kukurydzy, które by były wynikiem aktywności produktów genów vir na sekwencje graniczne generując nić T. Przeciwnie, określamy jako „zdarzenia biolistyczne” te wstawki DNA reprezentujące proces normalnie zachodzący po dostarczeniu genu do komórek roślinnych za pomocą urządzenia biolistycznego. Wstępnym kryterium do rozróżnienia zdarzeń biolistycznych i przypuszczalnych agrolistycznych jest brak aktywności lucyferazy w stransformowanych klonach, wynikający z wykluczenia regionu kodującego Luc przez wycięcie T-DNA z pAVM1.

Komórki zawiesinowe kukurydzy bombardowano mikropociskami pokrytymi plazmidem pAVM1 wraz z DNA p35SAdhD1, p35SAdhD2 i/lub p35SAdhE2. Jako kontrolę stosowano bombardowanie samym pAVM1. Stabilne transformanty selekcjonowano przez wzrost na pożywce zawierającej Basta. Średnio odzyskiwano 10 klonów opornych na Basta z filtra 4-5 tygodni po bombardowaniu komórek kukurydzy DNA pAVM1, p35SAdhD1, p35SAdhD2 i p35SAdhE2. Z każdej szalki tylko niektóre badano dalej. Około 2-3 kalusy pojawiały się na filtrach bombardowanych DNA pAVM1, p35SAdhD1 i p35SAdhD2. Tę różnicę można przypisać obecności genu virE2, który koduje białko wiążące jednoniciowy DNA związany z ochroną nici T. Wykazano, że to białko jest wymagane do wydajnego transferu T-DNA, ale nie do produkcji T-DNA (Stachel i wsp., 1986).

Częstość zdarzeń agrolistycznych można było ocenić na podstawie stosunku całkowitej ilości kalusów opornych na Basta, które nie wyrażały lucyferazy do wszystkich kalusów opornych na Basta. Według tego kryterium, częstość wydarzeń agrolistycznych wynosiła około 25%, gdy pAVM1 dostarczano wspólnie z DNA p35SAdhD1 i p35AdhD2. Ta częstość nieznacznie zwiększała się do około 50%, gdy dostarczano pwiE2 wraz z plazmidami opisanymi powyżej.

Analiza typu Southerna

Na poziomie molekularnym transgeny reprezentujące zdarzenie agrolistyczne powinny hybrydyzować z sondą Bar a nie z sondą luc. Oba typy zdarzeń mogą zachodzić w tej samej komórce roślinnej, ale takie klony będą uważane w teście genetycznym za zdarzenie biolistyczne w oparciu o obecność aktywności lucyferazy. Zarówno biolistyczne jak i przypuszczalne agrolistyczne zdarzenia badano hybrydyzacją typu Southerna, aby zmierzyć częstość każdego typu insercji.

Hybrydyzację typu Southerna przeprowadzono na DNA z komórek kalusa opornych na basta uzyskanych po bombardowaniu (i) DNA pAVM1, (iiZ) DNA pAVM1, p35SAdhD1, p35SAdhD2 i p35SAdhE2. Wyniki są podsumowane w tabeli 13 poniżej.

PL 191 113 B1

Tab e l a 13

Analiza kalusów opornych na Basta po bombardowaniu komórek kukurydzy z pAMV1 z lub bez genów vir

Plazmidy	Kalus	Aktywność lucyferazy	Southern	Rodzaj zdarzenia
pAVM1	14	14 Luc(+)	3	3B
pAVM1 + D1 + D2	10	2 Luc (-) 8 Luc(+)	nie badano
pAVM1 + D1 + D2 + E2 44	14 Luc (-) 30 Luc (+)		7 3	4 A, 1 A+B, 2 B 3B

Wnioski

a) Stosunek zdarzeń agrolistycznych do biolistycznych jest około 35% z pAVM1 ijest w zakresie procent na ogół mieszczącym się między 20-40%.

b) Obecność VirE2 może poprawić wydajność transformacji

Ponieważ VirE2 zawiera sygnały lokalizacji jądrowej i są one rozpoznawane in planta (przegląd, p. Zupan i Zambryski, Plant Physiol. 107:1041-1047 (1995)) spodziewano się uzyskania wyższych wydajności transformacji po wprowadzeniu tego genu in planta. Rośliny transgeniczne wyrażające gen virE2 są zdolne komplementować mutanty virE Agrobacterium, dostarczając dowodu, że białko VirE2 pełni ważną rolę w komórkach roślinnych.

P rzy k ład 8: Bombardowanie VirD1 i VirD2 mRNA do komórek kukurydzy

Niniejszy przykład opisuje dostarczanie do komórek roślinnych genów virD1 i virD2 jako mRNA iich działanie na sekwencje graniczne T-DNA

Komórki kukurydzy

Hodowano zawiesinowe kultury kukurydzy (Zea mays L) inicjowane z zamrożonego embriogennego kalusa z niedojrzałych zarodków wybranych linii komórkowej elite (2717) spokrewnionej z B73 w płynnej pożywce N6 (Chu i wsp., 1975) uzupełnionej 30 g/l sacharozy i 2 mg/l kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego (2,4-D) (2N63S). Kultury inkubowano w25°C w ciemności w wytrząsarce orbitalnej przy 150 obr/min. Subkultury kultur zawiesinowych zakładano, co 7 dni przez przeniesienie ml objętości upakowanych komórek do 50 ml świeżej pożywki 2N63S. Zawiesina komórek kukurydzy stosowana do doświadczeń z bombardowaniem była pobierana z 3-dniowych szybko rosnących kultur. Przed bombardowaniem, około 0,5 ml objętości upakowanych komórek sączono pod próżnią na 7 cm filtry (Whatman Nr 4).

Komórki tytoniu:

Linię Nicotiana tabacum NT-1 hodowano w pożywce wg Murashige i Skoog uzupełnionej mg/ml 2,4-D i sacharozą (30 g/l). Subkultury zakładano raz na tydzień przez dodanie 5 ml inoculum do 100 ml świeżej pożywki w butelkach 500 ml. Butelki inkubowano w27°C na wytrząsarce rotacyjnej przy 125 obr/min. Próbki 0,5 ml komórek 4 dni po założeniu subkultury rozprowadzano po sterylnym sączku (Whatman No. 4). Filtry następnie przenoszono na pożywkę MS.

Konstrukcja plazmidów:

Konstrukcja wektora zawierającego promotor T7i ogon poliA

Polilinker zawierający następujące miejsca restrykcyjne (SphI-EcoRI-NheI-ClaI-BgIII-Asp718HindIII-XhoI-Hind*III, inaktywujące miejsce HindIII wstawiano do miejsca SpHI-HindIII pT7RecA50. Oligonukleotyd Asp718-A(50)-DraI-Hindlll wstawiano następnie w odpowiadające miejsca dając pT7A50. Komplementarne nici tego oligomeru mają następującą sekwencję:

(SEKW. ID NR: 20)

5'- CGAATTCGCTAGCATCGATAGATCTGGTACCAAAGCTTCTCGAGT -3'

' -GTACGCTTAAGCGATCGTAGCTATCTAGACCATGGTTTCGAAGAGCTCATCGA - 5 ' (SEKW. ID NR: 21)

Konstrukcja pT7D1A50:

PL 191 113 B1

Fragment EcoRI-BgIII zawierający obszar kodujący D1 uprzednio wklonowany w EcoRI-BamHI pSG5 (z fragmentu EcoRI-BamHI p35SAdh1D1).

Konstrukcja pT7D2poliA (p. fig. 16-26)

A. Izolacja odpowiednich fragmentów

Region kodujący virD2 wycinano z p35SD2 za pomocą EcoRI i izolowano za pomocą preparatywnej elektroforezy na żelu i ekstrakcji DNA z agarozy. Wewnętrzne miejsca czyniły koniecznym dopasowanie końców virD2 przeprowadzone na subfragmentach. Fragment HindIII-EcoRI izolowany z 5' końca przycięto Haelll, aby wyprodukować fragment C. Centralny fragment B uzyskano za pomocą trawienia HindIII-BamHI.

B. Klonowanie fragmentów AiB

Wektor pTC182 strawiono HindIII i SphI, a fragment A plus oligonukleotydy adaptorowe dla końca SPhI, (który przywracał kodon start) ligowano, dając pTC182-A. Plazmid ten trawiono HindIII i BamHI, i fragment B ligowano do 3' końca A. Kombinowany fragment AB wycinano i oczyszczano na żelu po trawieniu BamHI/SphI powstałego plazmidu, pTC182-AB.

C. Klonowanie fragmentów AB i C w modyfikowanym wektorze pUC21.

Część polilinkera pUC21 między miejscami BamHI iXbaI usuwano i zastępowano parą oligonukleotydów, która przywracała większość miejsc i dodawała miejsce BglII wymagane w naszym konstrukcje. Powstały plazmid pUC21-X strawiono BamHI i EcoRV i fragment C zligowano ztym wektorem by dać pUC21-C. Następnie produkt ten strawiono BamHI i SphI zligowano z wyizolowanym fragmentem AB opisanym powyżej, aby zrekonstruować virD2. Po trawieniu powstałego plazmidu pUC21virD2 SphI i BglII oczyściliśmy na żelu fragment ABC zawierający spreparowany ORF virD2.

D. Klonowanie virD2 do wektora transkrypcyjnego T7

T7poly A, wektor transkrypcyjny opisany powyżej, został strawiony Sphl i Bglll i fragment ABC (=virD2) wligowano w pozycje za promotorem T7 i przed blokiem 42 reszt A.

Synteza mRNA:

Plazmidy T7D1A50 i T7D2A50 linearyzowano XhoI, który tnie zaraz za obszarem poli(A). Linearyzowany DNA poddawano ekstrakcji fenol/chloroform i strącano etanolem. Przeprowadzono transkrypcję in vitro linearyzowanego DNA stosując polimerazą T7 z zestawu T7 CapScribe zawierającego [m⁷G(5')ppp(5')] (Boehringer). Integralność i stężenie mRNA kodującego VirD1 i VirD2 badano za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym.

Sterylizacja materiałów biolistycznych

Cząsteczki złota (0,3 mm - Heraeus) sterylizowano przez umieszczenie 60 mg cząsteczek w100% etanolu i 0,1% DEPC. Cząsteczki płukano 3 razy wodą wolną od RNAzy, a następnie zawieszano w 1 ml wody wolnej od RNAzy lub 1 ml 50% roztworu glicerolu wolnego od RNAzy. Próbki około 50 ml przygotowanych cząsteczek używano dla sześciu strzałów. Makronośniki przykrywano 100% etanolem i0,1% DEPC, następnie płukano 3 razy w100% etanolu i suszono na powietrzu. Ekrany hamujące autoklaowano.

Strącanie kwasów nukleinowych

DNA (1 mg) i mRNA (około 8 mg: 4 mg virD1 i 4 mg virD2 lub 8 mg niespecyficznego mRNA dla kontroli) strącano na 50 ml zawiesiny cząsteczek złota (60 mg/ml; 0,3 mm) przez dodawanie kolejno 0,5 ml buforu Tris (1 M), 50 ml CaCI2 (2,5 M) i 2,5 ml 0,1 M spermidyny. Po dodaniu wszystkich odczynników, kontynuowano worteksowanie przez 3 minuty, po czym cząsteczki osadzano przez krótkie mikrowirowanie (1 min). Usuwano nadsącz i cząsteczki płukano raz zimnym 100% etanolem i zawieszano w60 ml 100% etanolu. Mieszaninę worteksowano, i pipetowano próbki 10 ml na dysk makronośnika i pozwalano im wyschnąć pod wyciągiem laminarnym.

Dostarczanie mikropocisków komórkom roślinnym

Mikropociski dostarczano komórkom roślinnym przez akcelerator cząsteczek (PDS-100/He) stosując przeponą bezpieczeństwa 1550 psi z próbką umieszczoną 5,5 cm od wyrzutni. Ekran o sicie 100 mm umieszczano w połowie drogi między płytą hamującą i tkanką. Docelowe płytki bombardowano 2 razy.

Oznaczenia lucyferazy

Lucyferazę i GUS oznaczano w ekstraktach tkanek za pomocą systemu do oznaczania lucyferazy Promega zgodnie z zaleceniami producenta. Aktywności lucyferazy i b-glukuronidazy wyrażano jako jednostki światła wykrywane przez Luminometr model Analytical Luminescence 2001 przez 10 s w 25°C.

PL 191 113 B1

Wyniki

Oznaczenia lucyferazy przeprowadzono 24 g, po bombardowaniu. mRNA D1 i D2 bombardowano wspólnie z p35S RBLuc, który zawiera prawą sekwencję graniczną wstawioną pomiędzy promotor 35S i sekwencję kodującą lucyferazy. W doświadczeniach kontrolnych p35SRBLuc bombardowano z niespecyficznym mRNA lub mRNA D1 i D2 wraz z pLUC DNA, które nie zawiera żadnych sekwencji granicznych. Wyniki przedstawiono poniżej w tabeli 14.

Tab e la 14

Wspólne dostarczanie mRNA D1i D2 z docelowym plamidem do komórek kukurydzy

Docelowe plazmidy ± mRNA	Średnia	± odch. standard.	% kontroli
pRB(+)Luc	3,2	± 0,3	100%
pRB(+)Luc + D1 mRNA	2,7	± 0,2	84%
pRB(+)Luc + D2 mRNA	1,4	± 0,2	44%
pRB(+)Luc + D1 mRNA+ D2 mRNA (1:1:1)	0,6	± 0,2	18%
pRB(+)Luc + D1 mRNA + D2 mRNA (1:2:2)	0,4	± 0,1	12%
pRB(+)Luc + p35SAdhD1 + p35SAdhD2 (1:1:1)	0,1	± 0,1	3%
pLuc	3,6	± 0,2	100%
pLuc+ D1 mRNA + D2 mRNA (1:1:1)	3,7	± 0,3	102%

Po inkubacji przez 24 godz. tkanki homogenizowano i oznaczano aktywności enzymów. Plazmid eksprymujacy b-glukuronidazę, (GUS) pGUS włączano wkażdym bombardowaniu jako kontrolę wydajności przenoszenia DNA i aktywność reportera jest wyrażana jako stosunek aktywności lucyferazy do GUS. Analizowano niezależne bombardowania i dane są przedstawione jako średnia z 3 powtórzeń plus minus odchylenie standardowe. % wartości kontrolnych określa się ze stosunku lucyferazy do b-glukuronidazy do aktywności obserwowanych z plazmidem kontrolnym.

Wniosek

Po dostarczeniu D1 mRNA i D2mRNA z pRB(+)Luc DNA obserwowano 10-krotne obniżenie aktywności lucyferazy. Dwa geny vir dostarczone jako mRNA do komórki roślinnej wydają się mieć efekt synergistyczny. Te obserwacje silnie wskazują na to, że zaobserwowane obniżenie aktywności lucyferazy było wynikiem nacięcia specyficznego w stosunku do nici na prawej granicznej sekwencji przez produkty genów vir.

Zaletą dostarczania mRNA jest, że efekt jest z konieczności przejściowy. Nie ma dodatkowego DNA plazmidów pomocniczych.

P rzy k ła d 9. „Agrolistyka” w protoplastach

Technologie transformacji są ważnym narzędziem dla manipulacji genetycznej i poprawy gatunków roślin uprawnych (Raskin 1996). Różne systemy transformacji pozwalają na bezpośrednie przeniesienie obcego materiału genetycznego do komórek zdolnych do dania płodnych roślin. Systemy te obejmują dostarczanie DNA protoplastom za pomocą elektroporacji lub bezpośredniego pobierania DNA, mikroinjekcje do komórek i przekazywanie genów za pomocą bombardowania z mikropociskami powleczonymi DNA (przegląd p. Morrish i Fromm, 1992). W istniejących systemach podawania jest skłonność do integracji wielokrotnych kopii obcego genu. Istnieje potrzeba podejścia, które dawałoby prosty wzór integracji obcego genu bez sekwencji wektorowych.

Metoda transformacji tu opisana, określana jako „agrolistyczna” ma potencjał, aby dawać materiał transgeniczny z prostym wzorem insercji obcego genu i wyłączenia sekwencji wektora. Podejście obejmuje stosowanie kaset ekspresyjnych roślin dla genów wirulencji, które odgrywają kluczową rolę w wytwarzaniu i ochronie T-DNA (virD1, virD2, i virE2) podawanych wraz z plazmidem zawierającym graniczne sekwencje T otaczające selekcjonowalny marker. W poprzednich przykładach pokazano,

PL 191 113 B1 że ta technologia działa, kiedy te wszystkie elementy są dostarczane do komórki za pomocą urządzenia biolistycznego.

W niniejszym przykładzie stosujemy metody bezpośredniego wprowadzania DNA do protoplastów, aby dostarczyć wszystkie te elementy. Stwierdziliśmy, że produkty genów virD1ivirD2 dostarczonewten sposób mogą w istocie produkować zdarzenia insercyjne typu T-DNAiże włączenie produktu genu virE2 może zwiększać częstość transformacji.

Materiał i metody

Plazmidy pCIB1711 jest pochodną pUC zawierającą gen lucyferazy świetlika pod kontrolą promotora wirusa mozaiki kalafiora 35S (CaMV35S) ijest opisany wprzykładzie 3. Dla wprowadzenia granic T-DNA dwa syntetyczne oligonukleotydy odpowiadające prawej sekwencji granicznej LBA5269 (Van Haareniwsp., 1988) hybrydyzowano, aby uzyskać dupleks:

5'-ATCCGGCAGGATATATACCGTTGTAATTCTGCA-3' (SEKW. ID NR: 22).

Ten dupleks oflankowany przez miejsca BamHI-Pstl został wstawiony do odpowiednich miejsc wpCIB1711 między promotorem isekwencją kodującą lucyferazy dając pRBLuc (p. fig. 2). pNeoR -BLuc zawiera lewą sekwencję graniczną, gen fosfotransferazy neomycyny (npAI) igen lucyferazy zprawą granicą wstawioną pomiędzy promotorem i regionem kodującym lucyferazyzpRB(+)luc. Gen nptll pod kontrolą promotora nos (syntaza nopaliny) został wycięty z plazmidu pBin19 jako fragment 2,2 kpz SacII-HindIII.Lewą sekwencję graniczną wycięto z pBin19 jako fragment BgllI-EcoRI, Oba fragmenty wstawiono do miejsc XbaI-HindIII pRB)(+)luc. pNeoLuc jest ekwiwalentem pNeoRBLuc bez prawej sekwencji granicznej wstawionej między promotorem CaMV35S iregionem kodującym lucyferazy.

Geny virD1ivirD2zpTiA6 subklonowano do wektora ekspresyjnego pMF6 (Callisiwsp., 1987) złożonego z promotora CaMV35S (0,5 kpz), pierwszego intronu Adh1 (0,5 kpz),iregionu poliadenylacji syntazy nopaliny (0,25 kpz) (fig. 1). Fragment 0,6 kpz EcoRI-PstI z pAD1187 odpowiadający regionowi kodującymi virD1 został wklonowany do plazmidu pMF6 dając p35SAdh1. Region kodujący virD2 wycięto jako fragment 1,8 kpz EcoRI z pAD1190 (Ghai iDas, 1989) isklonowano w pMF6, aby dać plazmid p35SAdhD2.

Obszar kodujący virE2 sklonowano zpw108, który zawiera 3 kpz fragment Xhol z plazmidu Agrobacterium TiA6 (nr dostępu X04784) (Winansiwsp., 1987). Fragment 687pz Sacl-Smal pw108 najpierw sklonowanowodpowiednie miejsce pKS(-), aby dać pKS3'E2. Fragment 924 pz HaeIII-SacI zpw108 połączono zfragmentem Sacl-Pstl zpKS3'E2 izhybrydyzowaną parą oligonukleotydów oflankowanych lepkimi końcami EcoRIitępymi końcami (5' -AATTCATGGATCTTTCTGGCAATGAGAAATCCAGG-3';

SEKW. ID NR: 23) i sklonowanowmiejscu EcoRI pBluescript KS-(Stratagene Inc), aby uzyskać pKSE2. Fragment XhoI-PstI, który pokrywa cały region kodujący virE2 został następnie subklonowany do XhoI-PstI pMF6, aby dać p35SAdhE2.

Komórki kukurydzy w zawiesinie

Zawiesinową kulturę kukurydzy Zea mays cv Black Mexican Sweet hodowano wpożywce N6 (Chuiwsp., 1975) uzupełnionej 30 g/l sacharozy i 2 mg/l kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego (2,4-D) (2N63S). Zawiesina komórek kukurydzy stosowana do doświadczeń z bombardowaniem była pobieranaz3-dniowych szybko rosnących kultur.

Protoplasty izolowano z zawiesinowej kultury komórek linii wsobnej kukurydzy BMS (Black Mexican Sweetman Nr 4). jak opisano w: „Black Mexican sweet corn: its use for tissue cultures. Maize for biological research”, red. W.F. Sheridan, Charlottesville, Va, Plant Molecular Biology Association (1982) str. 385-388. Do pożywki dodano paromomycyne (200 mg/l)w2 dni po transformacji. Niezależne mikrokalusy, które pojawiały się około 4 dni po transformacji przenoszono na świeże płytki uzupełnione 200 mg/ml paromomycyny. Protoplasty transformowano różnymi stężeniami DNA pNeoRBLuczlub bez p35SAdhD1, p35SAdhD2 i/lub p35SAdhE2 jak opisano w tabeli 15.

PL 191 113 B1

Ekstrakcja DNA i hybrydyzacja typu Southerna

Hodowle komórek zbierano za pomocą sączenia 10 dni po inokulacji i zamrażano w ciekłym azocie. DNA izolowano jak opisano uprzednio (Hall i wsp., 1991).

Około 10 mg genomowego DNA stosowano do trawienia EcoRI. Po rozdziale na 0,7% żelu agarozowym DNA przenoszono na membranę Amersham Hybond Plus i hybrydyzację przeprowadzano zgodnie z warunkami opisanymi przez producenta (Amersham). Sondy DNA znakowano [a-³²P]dCTP stosując zestaw do znakowania oligo Pharmacia. Sonda neo odpowiadała 0,3 kpz fragmentowi XbaI-EcoRI genu lucyferazy. Aby usunąć sondy membrany inkubowano w0,1% SDS w 100°C przez 5 minut.

Wyniki

Plan doświadczenia

Zaplanowano wektor, aby testować przesiewowe na zdarzenia insercji, w których pośredniczą VirD1 i VirD2 przez test genetyczny. Wektor pNeoRBLuc zawiera naturalną lewą granicę z plazmidu Ti, non-NPTII-noc (chimeryczny gen fosfotransferazy II neomycyny z promotorem i terminatorową sekwencją genu syntazy nopaliny), promotor 35S, syntetyczną prawą sekwencję graniczną i region kodujący lucyferazy. Kalusy kukurydzy oporne na paromomycynę, które były transformowane za pomocą zwykłego mechanizmu nieomal nieodmiennie będą zawierać gen lucyferazy i wyrażać lucyferazę. Przeciwnie, klony w których nie ma ekspresji lucyferazy są kandydatami na produkty wycinania i integracji nici T, w której pośredniczą produkty genów VirD1 i VirD2. Aby wyrazić geny virD1, virD2 i virE2 w komórkach roślinnych ich odpowiednie otwarte ramki odczytu (ORF) umieszczano pod kontrolą promotora CaMV35S.

Analiza stabilnych transformantów

Protoplasty transformowano pNeoRBLuc DNA wraz z p35SAdhD1 i p35SAdhD2 i/lub p35SAdhE2 DNA w różnych proporcjach. Jako kontrole dostarczano sam plazmid pNeoRBLuc. Stabilne transformanty selekcjonowano przez wzrost na pożywce zawierającej paromomycynę. Średnio 120 opornych na paromomycynę klonów pojawiało się na płytce, gdy transformowano pNeoRBLuc wraz z genami virD1 i virD2, ale dalej analizowano tylko 30 kalusów. Liczba klonów opornych na paromycynę mogła osiągnąć 250, gdy dodawano virE2 do puli genów wirulencji.

Z każdego zestawu doświadczeń analizowano 30 klonów opornych na paromomycynę i u około 10-40% stwierdzono brak ekspresji lucyferazy, co sugeruje 10-40% częstość zjawisk integracji, w których pośredniczy virD1-virD2. To prawdopodobnie zaniża częstości zdarzeń „agrolistycznych” ponieważ klony zawierające obie wstawki byłyby włączone do 90% grupy lucyferazododatniej. Nie było znaczącej różnicy w częstości kalusów nie wyrażających lucyferazy odzyskanych w doświadczeniach z lub bez genu virE2.

Analiza typu Southerna klonów transformantów

Hybrydyzacja typu Southerna została przeprowadzona na DNA z kontrolnych linii kalusa opornych na paromomycynę otrzymanych po bombardowaniu: (i) samym pNeoRBLuc; (ii) plazmidem pNeoRBLuc kotransformowanym zDNA p35SAdh1D1 i p35SAdh1D2 i (iii) plazmidem pNeoRBLuc kotransformowany z DNA p35SAdh1D1, p35SAdh1D2 i p35SAdh1E2.

Genomowy DNA trawiono EcoRI, który daje fragment 3,9 kpz plazmidu pNeoRBLuc, który jest homologiczny zarówno do sond neo iluc. EcoRI ma jedno miejsce w obrąbie części T pNeoRBLuc i drugie w regionie kodującym lucyferazę.

Kontrolne transformanty odzyskane po transformacji protoplastów samym pNeoRBLuc wykazywały oczekiwany fragment 3,9 kpz EcoRI hybrydyzujacy zarówno do sondy luc jak i neo. Liczba kopii tego fragmentu jest większa od 5 i w dodatku stwierdzono wielokrotne kopie rearanżowanego i/lub fragmentowanego DNA.

Analiza typu Southerna DNA z linii kalusa opornych na paromomycynę uzyskanych po kotransformacji pNeoRBLuc zDNA plazmidów p35SAdh1D1, p35SAdh1D2 i/lub p35SAdh1E2 jest przedstawiona w tabeli 15. Do analizy typu Southerna wybrano linie kalusów, które były negatywne dla lucyferazy. Na przykład wśród 8 transgenicznych linii kukurydzy odzyskanych w doświadczeniu #8 i analizowanych za pomocą techniki Southerna, 4 wykazywały zdarzenia biolistyczne i4 przypuszczalne zdarzenia agrolistyczne. Oszacowana liczba kopii genu NPTII była na ogół 1 do 2 na genom transformanta, sądząc po porównaniu z liczbą kopii standardów obecnych na tym samym filtrze do hybrydyzacji. Linie kalusa, które zawierały genomowy DNA hybrydyzujacy z sondą neo i sondą luc miały mniej kopii niż linie kalusa odzyskane z transformacji samym pNeoLuc.

PL 191 113 B1

Tab e la 15

Doświadczenia ztransformacją

Eksp. nr	Docelowe plazmidy ± geny vir	Kalus	Luc(-)	Southern	Rodzaj zdarzenia
#1	pNeoRBLuc (5 mg)	3
#2	pNeoRBLuc (10 mg)	20
#3	pNeoRBLuc (20 mg)	85	4[luc+]		4 B
#4	pNeoRBLuc + p35AdhD1 + p35AdhD2 (5 mg +20 mg +20 mg)	101	5 Luc(-)	2	1 NT, 1B
#5	pNeoRBLuc+ p35AdhD1+ p35AdhD2 (10 mg+20 mg +20 mg)	123	5 Luc(-)		1 B+A, 3B, 1NT
#6	pNeoRBLuc + p35AdhD1 + p35AdhD2 3 NT (20 mg +20 mg +20 mg)	147	6 Luc(-)	6	1A, 2B
#7	pNeoRBLuc + p35AdhD1 + p35AdhD2 + p35AdhE2 1NT (5 mg +20 mg +20 mg + 20 mg)	219	9 Luc(-)	5	2A, 1B
#8	pNeoRBLuc + p35AdhD1 + p35AdhD1 + p35AdhE2 1NT (5 mg +20 mg +20 mg + 20 mg)	245	14 Luc(-)	9	4A, 4B
#9	pNeoRBLuc + p35AdhD1 + p35AdhD2 + p35AdhE2 (10 mg +20 mg +20 mg + 20 mg)	268	7 Luc(-)	1	1A

Tabela 15. Liczba indywidualnych kalusów analizowanych 4 tygodnie po transformacji.

WNIOSEK:

Wyniki te jasno pokazują, że ta technologia może uprościć wzór integracji obcego genu dostarczanego do protoplastów. Częstość integracji, w której pośredniczyły VirD1-VirD2 wynosiła około 20-30%. Co więcej, dodatek virE2 poprawiał wydajność transformacji. Ta technologia będzie pomocna w odzyskiwaniu transformowanych roślin z prostymi wzorami integracji interesującego genu i bez dodatkowego DNA.

P rzy k ł ad 10. Transformacja genotypu kukurydzy CG00526 przez bezpośrednie bombardowanie niedojrzałych zarodków zygotycznych z zastosowaniemn fosfinotricyny jako czynnika selekcjonującego.

Przygotowanie DNA do bombardowania z zastosowaniem urządzenia Biolistic®

Niedojrzałe zarodki, czyli kalus typu l kukurydzy może być transformowany jak opisano w Koziel i wsp., Biotechnology 11: 194-200, 1933. Odpowiednie części tu są włączone w formie odnośnika.

DNA jest przygotowany do bombardowania przez mikropociski przez chemiczne strącenie w obecności złota wielkości mikrometrów (typowa średnica 1,9mm lub 0,3 mm), zasadniczo zgodnie z opublikowanymi procedurami. Oprócz złota, inne gęste cząsteczki wielkości mikrometrów mogą być stosowane, takie jak wolfram i platyna. W jednej modyfikacji procedury, cząasteczki są same najpierw

PL 191 113 B1 przygotowywane przez zawieszanie ich wwodzie i sonifikację. Sonifikowane cząsteczki są następnie osadzane przez wirowanie i zawieszane w wodnym roztworze 50% glicerolu. Cząsteczki przygotowywane wten sposób są następnie rozporcjowywane do pojedynczych probówek zawierających około 3 mg cząsteczek złota na probówkę w objętości 50 ml. DNA jest dodawane do każdej probówki w zmiennych ilościach wzależności od ilości plazmidów, które mają być użyte, ich wielkości ikońcowego stężenia pożądanego DNA.

Następnie dodaje się około 50 ml 2,5 M CaCI2iokoło 20 ml 0,1 M spermidynywtej kolejności, do każdej probówki podczas worteksowania około 3 minuty. Następnie łagodnie odwirowuje się kompleks DNA/złoto. Usuwa się nadsącz. Cząsteczki są płukane jeden raz 250 ml absolutnego etanolu, jeszcze raz osadzane i zawieszane wokoło 75 ml świeżego absolutnego etanolu. Każda probówka przygotowywana w ten sposób to wystarczająca ilość kompleksu DNA/złoto, by wystarczyć na sześć „strzałów zPDS-1000/He. Dziesięć ml dobrze zawieszonego kompleksu DNA/złoto jest pipetowane na każdy dysk makronośnikawśrodowisku wolnym od wibracji.

W urządzeniu PDS-1000/He uwalniany jest wybuch helu przez rozerwanie plastykowego krążka, który jest dostępny wróżnych klasach ciśnienia. Na przykład można uzyskać pojedyncze krążki, które pękają przy 200, 450, 650, 900,1100,1350,1550,1800, 2000 i 2200 funtach na centymetr kwadratowy helu. Ten wybuch gazu nadaje napęd arkuszowi makronośnika, który jest hamowany przez ekran ze stali nierdzewnej. Ekran może mieć różne wielkości sieci, takie jak 10x10, 16x16, 24 x 24 itp. Inne ustawienia są to odległości lotu makronośnika, odległością szczeliny i odległość lotu cząsteczek. Te ustawienia są szczegółowo opisane winstrukcjach producenta dla użytkownika. Typowo stosuje się odległość szczeliny około 5,5 mm, odległość lotu makronośnika około 10 mm i odległość lotu cząsteczek od około 6 do 9 cm. Dodatkowo ekran albo przegroda mogą być wstawione w odległość lotu cząsteczek między ekranem hamującym ipłytką docelową. Taki ekran albo przegroda zaburza falę uderzeniowązekspandującego gazuwten sposób zmniejszając zniszczenie celu. W jednym przykładzie stosowany jest ekran ze stali nierdzewnej zotwarciem około 100 mm. Inne wielkości otworu iskłady materiałów mogą być też stosowane.

Niedojrzałe zarodki lub kalus embriogeniczny typu l może być ułożony na tarczy według innych wzorów. Wserii doświadczeń ustala się optymalne wzorydla niedojrzałych zarodków. Wjednym zoptymalizownym wzorze niedojrzałe zarodki umieszcza się wkółku ookoło 2 cm średnicy. Niedojrzałe zarodki umieszcza się na obrębie koła. Około 25 niedojrzałych zarodków umieszcza się na każdej docelowej tarczy. Co więcej, tarcza może być umieszczona ukośnie w stosunku do wyrzutni mikronośnika. To zapewnia maksymalne nasycenie bazypetalnej części niedojrzałego zarodka przez rozprzestrzenianie cząsteczek. To bazypetalna część niedojrzałego zarodka jest odpowiedzialna za odpowiedź embriogeniczną.

W jednym przykładzie bombardowania kalusa embriogenicznego typu l kalus jest umieszczany na obrębie kółkaośrednicy około 1 cm na pożywce odżywczej. Mechaniczne ustawienia urządzenia bombardującego mogą być wtedy umieszczone w pozycjach podobnych lub identycznych w stosunku do ustawień podanych powyżej dla bombardowania niedojrzałych zarodków.

Należy zauważyć, że wzór celuiustawienia armatki są wzajemnie powiązane. Inaczej mówiąc, stosowanie innych ustawień urządzenia bombardującego może dawać inne optymalne ułożenia dla tkanki odbierającej na tarczy, inne kombinacje mechanicznych ustawień i wzorów celów sąwzakresie niniejszego wynalazku.

Transformacja

Niedojrzałe zarodki uzyskuje się około 14 dni po samozapyleniu. Niedojrzałezygotyczne zarodki są podzielone pomiędzy różnymi płytkami docelowymi zawierającymi pożywką zdolną do indukowania i podtrzymywania wytwarzania kalusa embriogenicznego przy 25 niedojrzałych zarodkach na płytę. Niedojrzałe zygotyczne zarodki są bombardowane mieszaniną plazmidów p35SAdh1D1, p35SAdh1D2 i docelowym plazmidem T-DNA (pbarRBLuc albo pAVM1) stosując urządzenie PDS1000/He firmy BioRad. Wyrażalny DNA dla genu virE2 może także być włączony. Plazmidy są strącane na cząsteczki złota 0,3 lub 1 mm zasadniczo według opublikowanej procedury opisanej powyżej. Do każdej docelowej płytki strzela sią dwa razy preparatem złota i plazmidu stosując ciśnienie wybuchu 1100-1300 psi. Ponieważ plazmid pbarRBLuc zawiera chimeryczny gen kodujący oporność na fosfinotricynę, substancja ta jest stosowana do selekcjonowania komórek in vitro. Selekcja ta jest stosowana przy 3 mg/l jeden dzień po bombardowaniuiutrzymywana przez łącznie 8-12 tygodni. Tak otrzymany kalus embriogeniczny jest regenerowanywobecności 1 mg/l fosfinotrycyny.

PL 191 113 B1

Wszystkie kalusy są testowane za pomocą testu czerwieni chloro-fenolowej (CR) na oporność na PPT jak opisano w Zgłoszeniu Patentowym US 07/7759,243 złożonym 13 września, 1991, którego odpowiednie cząści są tu włączone poprzez odniesienie. To oznaczenie wykorzystuje barwnik wskaźnikowy wrażliwy na pH, aby wykazać, które komórki rosną wobecności PPT. Komórki, które rosną powodują zmianę pH pożywki i zmieniają wskaźnik czerwień chlorofenolową na kolor żółty (z czerwonego). Rośliny eksprymujace gen oporności na PPT są łatwo wykrywane wtym teście. Rośliny dodatnie w teście CR są testowane za pomocą PCR na obecność genu bar.

Rośliny, które zawierają marker selekcjonowalny są oznaczane pod kątem ekspresji genu lucyferazy. Brak aktywności lucyferazy jest wskaźnikiem, że kalus może być zdarzeniem agrolistycznym. Zdarzenie agrolistyczne to takie, wktórym DNA jest wintegrowany do DNA kukurydzy w sposób analogiczny do insercji T-DNA, ale bez pośrednictwa Agrobacterium. Rośliny, które są negatywne dla ekspresji lucyferazy są analizowane za pomocą techniki Southerna. Wzory prążków, które są obserwowane za pomocą analizy Southerna wskazały, które transformanty były w istocie agrolistyczne.

P r z y k ł a d 11. Transformacja genotypu kukurydzy A188 przez bezpośrednie bombardowanie niedojrzałych zarodków zygotycznych z zastosowaniem fosfinotricyny jako czynnika selekcjonującego.

Samozapładnia się kolbę genotypu A188 i po około 12-14 dniach uzyskuje się niedojrzałe zarodki zygotyczne. Niedojrzałe zarodki zygotyczne wysiewa się na pożywce 2JMS+5DC plus AgNO3. Po 16-20 godzinach niedojrzałe zarodki zygotyczne przenosi się do tej samej pożywki, ale zawierającej 12% sacharozę. Po 3-5 godzinach niedojrzałe zarodki zygotyczne są bombardowane mieszaniną plazmidów p35SAdh1D1, p35SAdh1D2, i docelowym plazmidem T-DNA (pbarRBLuc lub pAVM1) stosując urządzenie PDS1000/He. Plazmidy są strącane na cząsteczki złota 0,3 lub 1 mm zasadniczo według opublikowanej procedury BioRad jak opisano powyżej. Cząsteczki są dostarczane stosując ciśnienie wybuchu 1100-1300 psi. Do każdej płytki strzela się dwa razy preparatem cząsteczek i złota. Po inkubacji przez noc niedojrzałe zarodki są przenoszone do świeżej pożywki podtrzymującej zawierającej 2% sacharozę i fosfinotricynę 5-10 mg/l i subklonowane, co około dwa tygodnie na tę samą pożywkę. Tak otrzymany kalus embriogeniczny jest regenerowanywobecności 1 mg/l fosfinotricyny.

Wszystkie kalusy są testowane za pomocą testu czerwieni chlorofenolowej (CR) na oporność na PPT. To oznaczenie wykorzystuje barwnik wskaźnikowy wrażliwy na pH, aby wykazać, które komórki rosną w obecności PPT. Komórki, które rosną prowodują zmianę pH pożywki i zmieniają wskaźnik czerwień chlorofenolową na kolor żółty (z czerwonego). Rośliny eksprymujace gen oporności na PPT są łatwo wykrywane wtym teście. Rośliny dodatnie wteście CR są testowane za pomocą PCR na obecność genu bar.

Rośliny, które zawierają marker selekcjonowalny są oznaczane pod kątem ekspresji genu lucyferazy. Brak aktywności lucyferazy jest wskaźnikiem, że kalus może być zdarzeniem agrolistycznym. Zdarzenie agrolistyczne to takie, wktórym DNA jest wintegrowany do DNA kukurydzy w sposób analogiczny do insercji T-DNA, ale bez pośrednictwa Agrobacterium. Rośliny, które są negatywne dla ekspresji lucyferazy są analizowane za pomocą techniki Southerna. Wzory prążków, które są obserwowane za pomocą analizy Southerna wskazały, które transformanty były w istocie agrolistyczne.

P r zy k ł ad 12. Transformacja genotypu kukurydzy CG00526 przez bezpośrednie bombardowanie kalusa typu l pochodzącego z niedojrzałych zarodków zygotycznych z zastosowaniem fosfinotricyny jako czynnika selekcjonującego.

Kalus typu l uzyskuje sią z niedojrzałych zarodków zygotycznych stosując standardowe techniki. Dla dostarczania genów około 300 mg kalusa typu l jest przygotowywana przez posiekanie skalpelem, przepłukanie 3 razy standardowymi pożywkami do hodowli zawierającymi 18% sacharozę i natychmiast umieszczane na półstałej pożywce hodowlanej zawierającej 18% sacharozę. Po około 4 godzinach tkanka jest bombardowana za pomocą urządzenia biolistycznego PDS -1000/He z BioRad. Plazmidy są strącane na cząsteczki złota 0,3 lub 1 mm stosując standardową procedurę BioRad. Około 16-20 godzin po dostarczeniu genów kalus jest przenoszony do standardowej pożywki hodowlanej zawierającej 2% sacharozę i fosfinotricynę 10 mg/l jako Basta. Kalus jest subklonowany z selekcją przez 8 tygodni, po czym rosnące żywe kalusy są przenoszone na standardową pożywkę regeneracyjnąwcelu produkcji roślin.

Wszystkie rośliny, które regenerują są testowane za pomocą testu czerwieni chlorofenolowej (CR) na oporność na PPT. To oznaczenie wykorzystuje barwnik wskaźnikowy wrażliwy na pH, aby wykazać, które komórki rosną w obecności PPT. Komórki, które rosną prowodują zmianę pH pożywki i zmieniają wskaźnik czerwień chlorofenolową na kolor żółty (z czerwonego). Rośliny eksprymujace

PL 191 113 B1 gen oporności na PPT są łatwo wykrywane w tym teście. Rośliny dodatnie w teście CR są testowane za pomocą PCR na obecność genu bar.

Kalusy, które zawierają marker selekcjonowalny są oznaczane pod kątem ekspresji genu lucyferazy. Brak aktywności lucyferazy jest wskaźnikiem, że kalus może być zdarzeniem agrolistycznym. Zdarzenie agrolistyczne to takie, w którym DNA jest wintegrowany do DNA kukurydzy w sposób analogiczny do insercji T-DNA ale bez pośrednictwa Agrobacterium. Rośliny, które są negatywne dla ekspresji lucyferazy są analizowane za pomocą techniki Southerna. Wzory prążków, które są obserwowane za pomocą analizy Southerna wykazują, które transformanty byływ istocie agrolistyczne.

P rz y k ła d 13. Transformacja kalusa genotypu kukurydzy pochodzącego od B73 przez bombardowanie kruchych komórek z kultur zawiesinowych z zastosowaniem fosfinotricyny jako czynnika selekcjonującego

Kruche kalusy uzyskano przez wysianie niedojrzałych zarodków genotypu pochodzącego z B73 jak opisano w Patencie US Nr 5,350,689, który jest tu włączony poprzez odniesienie. Subkultury hodowli zawiesinowych zakładano, co tydzień w pożywce N6. Komórki zebrane 3-5 dni po subkulturze zbierano przez przesączenie ich przez filtr ze stali nierdzewnej 710 mm średnicy. Membrany umieszczano na pożywce N6 zawierającej 12% sacharozę na 3-5 dni przed bombardowaniem zarodków mieszaniną plazmidów zawierających geny vir (p35SAdh1D1, p35SAdh1D2) i docelowym plazmidem T-DNA (pbarRBLuc albo pAVM1) stosując urządzenie PDS1000/He. Stosowano albo równe ilości (1:1:1) VirD1, virD2 i 35S-bar docelowego DNA (każdy łącznie 1,3 mg jako 2 strzały) albo nadmiar genów vir (2:2:1 mg jako dwa strzały). Wyrażalny DNA dla genu virE2 może także być włączony.

Plazmidy są strącane na cząsteczki złota 0,3 lub 1 mm zasadniczo według opublikowanej procedury BioRad opisanej powyżej. Cząsteczki dostarcza się stosując ciśnienie wybuchu 1100-1300 psi helu. Do każdej docelowej płytki strzela się dwa razy. Po inkubacji przez noc błony z kalusem przenoszono do świeżej pożywki utrzymującej zawierającej 2% sacharozę i fosfinotricynę 3 mg/l. Po 3 tygodniach komórki z każej płytki rozprowadzano na powierzchni 3 płytek z pożywką 2N6 zawierającą 10 mg/l basta. Po 4 tygodniach kolonie przenoszono na świeżą pożywkę 2N6 z 3 mg/l Basta i po tygodniu tak otrzymane kalusy testowano za pomocą testu czerwieni chlorofenolowej (CR) na oporność na PPT. To oznaczenie wykorzystuje barwnik wskaźnikowy wrażliwy na pH, aby wykazać, które komórki rosną w obseności PPT. Komórki, które rosną prowodują zmianę pH pożywki i zmieniają wskaźnik czerwień chlorofenolową na kolor żółty (z czerwonego). Komórki eksprymujace gen oporności na PPT są łatwo wykrywane w tym teście. Dodatnie kawałki powodowały zmianę barwy pożywki na żółtą lub pomarańczową, wykazując przynajmniej pewną oporność na PPT i zostały umieszczone na pożywce 2N6 zawierającej 5 mg/l basta.

Kalusy dodatnie w teście CR są testowane za pomocą PCR na obecność genu bar.

Tab e la 16

Identyfikacja stransformowanych linii kalusa kukurydzy

Procedura	Żółte	Pomarańczowe
Kontrola(1)	0	1
Kontrola(2)	0	0
2:2:1	0	1*
1:1:1(1)*	21	2§
1:1:1(2)	4	0

Tabela 16 ^;(1) i (2) to dwa powtórzenia * Ta kolonia była dodatnia dla lucyferazy ^§jedno z nich było domniemanym zdarzeniem agrolistycznym

Rośliny, które zawierają marker selekcjonowalny są oznaczane pod kątem ekspresji genu lucyferazy. Brak aktywności lucyferazy jest wskaźnikiem, że kalus może być zdarzeniem agrolistycznym. Zdarzenie agrolistyczne to takie, w którym DNA jest wintegrowany do DNA kukurydzy w sposób analogiczny do insercji T-DNA ale bez pośrednictwa Agrobacterium. Rośliny, które są negatywne dla

PL 191 113 B1 ekspresji lucyferazy są analizowane za pomocą techniki Southerna. Wzory prążków, które są obserwowane za pomocą analizy Southerna (rysunek) wskazały, które transformanty były w istocie agrolistyczne.

Tabela 17

Analiza linii kalusa kukurydzy odzyskanych po bombardowaniu komórek kukurydzy konstruktami zdolnymi do dostarczania wstawek T-DNA do kukurydzy

Oznaczenie lucyferazy	Badano (Southern)	Agrolistyczne (przypuszczalne	Biolistyczny	Agro/Biolistyczny
Luc+ 12		6	6
luc- 11	9	4	3	2
nie badano: 5

Tabela pokazuje, żez23 linii, które analizowano w tym eksperymencie, u 11 nie było aktywności lucyferazy, a z tych 9, które analizowano techniką Southerna 4 zawierały tylko inserty typu T-DNA, a2 zawierały inserty typu T-DNA i typowe wstawki stwierdzone po zastosowaniu niebiologicznej (w tym przypadku biolistycznej metody dostarczania DNA).

P r zy k ł ad 14. Transformacja kalusa genotypu kukurydzy CG00526 przez bombardowanie kalusa typu l pochodzącego z niedojrzałych zarodków zygotycznych z zastosowaniem fosfinotricyny jako czynnika selekcjonującego.

Kalus uzyskuje się przez wysianie niedojrzałych zarodków zygotycznych jak opisali Koziel i wsp., Biotechnology 11: 194-200, 1993).

Subkultury zakłada się co tydzień na pożywce utrzymującej (2DG4 + 0,5 mg/l 2,4-D) i skupiska komórek są pobierane 2-3 dni po subkulturze i umieszczane w pożywce 2DG4 zawierającymi 12% sacharozę na 3-5 godzin. 16 kawałków docelowego kalusa jest umieszczanych na płytce w kółku o średnicy 8-10 mm. Kalus jest bombardowany mieszaniną plazmidów zawierających geny vir (p35SAdh1D1, p35SAdh1D2) i docelowym plazmidem T-DNA (pbarRBLuc albo pAVM1) stosując urządzenie PDS1000/He. Stosowano albo równe ilości (1:1:1) VirD1, virD2 i 35S-bar docelowego DNA (każdy łącznie 1,3 mg jako 2 strzały) albo nadmiar genów vir (2:2:1 mg jako dwa strzały). Wyrażalny DNA dla genu virE2 może także być włączony.

Plazmidy są strącane na cząsteczki złota 0,3 lub 1 mm stosując standardową procedurę BioRad jak opisano powyżej. Cząsteczki są dostarczane stosując ciśnienie wybuchu 650 psi helu. Każda płytka dostaje 2 strzały. Po inkubacji przez noc kalus jest przenoszony do świeżej pożywki utrzymującej zawierającej 2% sacharozę. Po dalszych 2 tygodniach kalusy pożądane (wykazujące typową morfologię typu l) są subkulturowane do pożywki utrzymującej zawierającej 120 mg/l Basta (PPT). Po czterech kolejnych tygodniach kalus jest przenoszony do świeżej pożywki utrzymującej z30 mg/l Basta.

Kalus jest subkulturowany w obecności selekcji przez 8 tygodni, po czym rosnące przeżywające kalusy są przenoszone do standardowej pożywki regenerującej do produkcji Roślin.

Wszystkie rośliny, które regenerują są testowane za pomocą testu czerwieni chlorofenolowej (CR) na oporność na PPT. To oznaczenie wykorzystuje barwnik wskaźnikowy wrażliwy na pH, aby wykazać, które komórki rosną w obecności PPT. Komórki, które rosną prowodują zmianę pH pożywki i zmieniają wskaźnik czerwień chlorofenolową na kolor żółty (z czerwonego). Rośliny eksprymujace gen oporności na PPT są łatwo wykrywane wtym teście. Rośliny dodatnie w teście CR są testowane za pomocą PCR na obecność genu bar.

Rośliny, które zawierają marker selekcjonowalny są oznaczane pod kątem ekspresji genu lucyferazy. Brak aktywności lucyferazy jest wskaźnikiem, że kalus może być zdarzeniem agrolistycznym. Zdarzenie agrolistyczne to takie, w którym DNA jest wintegrowany do DNA kukurydzy w sposób analogiczny do insercji T-DNA, ale bez pośrednictwa Agrobacterium. Rośliny, które są negatywne dla ekspresji lucyferazy są analizowane za pomocą techniki Southerna. Wzory prążków, które są obserwowane za pomocą analizy Southerna wykazują, które transformanty były w istocie agrolistyczne.

PL 191 113 B1

P r z y k ł a d 15. Transformacja protoplastów kukurydzy genami vir i docelową sekwencją T-DNA Metody przygotowywania protoplastów z kultur zawiesinowych Zea mays opisano w Patencie US Nr 5,350,689.

DNA stosowany do transformacji protoplastów składa się na przykład z mieszaniny plazmidów p35SAdh1D1, p35SAdh1D2 i docelowego plazmidu T-DNA (pbarRBLuc albo pAVM1). Wyrażalny DNA dla genu virE2 może także być włączony (p. przykład 7). Kalus jest odzyskiwany z protoplastów i rośliny są regenerowane jak opisano, stosując fosfinotricyną jako czynnik selekcjonujący. Komórki stransformowane pochodzące od protoplastów są typowo selekcjonowane przez podanie 3-5 mg/l PPT począwszy od 20 dni po podaniu DNA.

Wszystkie Rośliny, które regenerują są testowane za pomocą testu czerwieni chlorofenolowej (CR) na oporność na PPT. To oznaczenie wykorzystuje barwnik wskaźnikowy wrażliwy na pH, aby wykazać, które komórki rosną w obecności PPT. Komórki, które rosną prowodują zmianę pH pożywki i zmieniają wskaźnik czerwień chlorofenolową na kolor żółty (z czerwonego). Rośliny eksprymujace gen oporności na PPT są łatwo wykrywane wtym teście. Rośliny dodatnie w teście CR są testowane za pomocą PCR na obecność genu bar.

Rośliny, które zawierają marker selekcjonowalny są oznaczane pod kątem ekspresji genu lucyferazy. Brak aktywności lucyferazy jest wskaźnikiem, że kalus może być zdarzeniem agrolistycznym. Zdarzenie agrolistyczne to takie, w którym DNA jest wintegrowany do DNA kukurydzy w sposób analogiczny do insercji T-DNA ale bez pośrednictwa Agrobacterium. Rośliny, które są negatywne dla ekspresji lucyferazy są analizowane za pomocą techniki Southerna. Wzory prążków, które są obserwowane za pomocą analizy Southerna wykazują, które transformanty były w istocie agrolistyczne. Klonowanie i sekwencjonowanie sekwencji granicznych może być przeprowadzone, aby potwierdzić natura insercji.

Choć podano tylko ograniczona ilość przykładowych postaci tego wynalazku, osoby biegłe w dziedzinie łatwo docenią, że możliwe jest wiele modyfikacji przykładowych postaci bez odbiegania znacząco od nowych nauk i korzyści niniejszego wynalazku. Tak więc wszystkie takie modyfikacje powinny być włączone do zakresu niniejszego wynalazku.

LITERATURA CYTOWANA W PRZYKŁADACH

Ahl Goy, P. & Duesing J.H. (1995) Bio/Tachnology 13, 454-458.

Albert, H., Dale, E. C., Lee, E. & Ow, D.W. (1995) Plant J. 7,649-659.

Albright, L.M., Yanosky.M.F. Leroux,B., Ma D., Nester, E.W. (1987) J. Bacteriol. 169, 1046-1055. An, G. (1985) Plant Physiol. 79, 568-570.

Bevan, M. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 8711-8721.

Callis, J., Fromm, M.E., Walbot, V. (1987) Genes & Dev. 1, 1183-1200.

Chilton M-D. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90, 3119-3120.

Chu, C.C., Wang, C.C. Sun, C.S. Hsu, C., Yin, K.G., Chu, C.Y. & Bi, F.Y. (1975) Sci. Sin.

18,659-668.

Chyi, Y.S., Jorgensen, R.A., Golstein, D., Tanksley, S.D. & Loaiza-Figueroa, F. (1986) Mol. Gen. Genet. 204, 64-69.

Citovsky V., Warnick, D. & Zambryski, P. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 91, 3210-3214. deWet, J.R, Wood, K.V., DeLuca, M., Helsinki, D.R., and Subramani, S. (1987), Firefly luciferase gene: Structure and expression in mammalian cells Mol. Cell. Biol. 7: 725-737.

PL 191 113 B1

DiMaio, J.J. & Shillito, R.D. (1992) J.Tissue Cult. Methods 12,163-169.

Dowson Day, M.J., Ashurst, J.L., Mathias, S.F., Watts, J.W., Wilson T.M.A., & Dixon, R.A. (1993) Plant Mol.Biol.23, 97-109.

Durrenberger, F.,Crameri, A., Hohn, B.,& Koukolikova-Nicola, Z. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86, 9154-9158.

Filichkin, S.A. & Gelvin, S.B. (1993) Mol.Microbiol. 8, 915-926.

Fukushige, S. & Sauer, B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89, 7905-7909.

Gallie, D.R., Lucas, W.J. & Walbot, V. (1989) PlantCell 1, 301-311.

Gallie, D.R. (1991) Genes & Dev. 5, 2108-2116.

Gallie, D.R. (1993) PlantCell reports 13, 119-122.

Ghai, J. & Das A. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 8: 3109-3113.

Gheysen, G., Villaroel, R. & Van Montagu, M. (1991) Genes & Dev. 5:287-297.

Gordon-Kamm, W.J., Spencer, T.M., Mangano, M.L., Adams, T.R., Daines, R.J., Start, W.G., O'Brien, J.V. Chambers, S.A., Adams, R.A., Willets, N.G., Rice, T.B., Mackey, C.J., Krueger, R.W., Kausch, AP. & Lemaux, P.G. (1990) PlantCell 2, 603-618.

Hali, G., Allen, G.C., Loer, D.S., Thompson, W.F. & Spiker, S. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)88,9320-9324.

Herman, L., Jacobs, A., Van Montagu, M., & Depicker, A. (1990) Mol. Gen. Genet. 224 248-256.

Herrera-Estrella, A., Chen, Z., Van Montagu, M., & Wang, K., (1988) EMBO J. 7, 4055-4062.

Herrera-Estrella, A., van Montagu, M. & Wang, K. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87, 9534-9537.

Higgs, D.C. & Colbert, J.T. (1993) PlantCell reports 12, 445-452.

Howard, E.A., Winsor, B., De Vos, G., & Zambryski, P. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86, 4017-4021.

Howard E.A., Zupan J.R., Citovsky, V. & Zambryski, P. (1992)Cell 68,t 109-118.

Jasper, F., Kończ, C., Schell, J. & Steinbiss, H.-H. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 91, 694-698.

Kado, C.l. (1993) in Bacterial conjugation, ed. Clewell, D.B. (Plenum, New York), pp. 243-254.

Kertbundit, S., De Greve, H., Deboeck, F., Van Montagu, M. & Hemalsteens, J.-P. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88, 5212-5216.

Klein, T. M., Harper, E. C., Svab, Z., Sanford, J. C., Fromm, M.E. & Maliga, P. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85, 8502-8505.

Klein, T. M., Kornstein, L., Sanford, J.C., & Fromm, M.E. (1989) Plant Physiol. 91,440-444.

PL 191 113 B1

Koncz.C., Martini, N., Mayerhofer, R., Koncz-Kalman, Zs., Korber, H., Redei, G.P. & Schell,

J. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86 8467-8471.

Koukolikova-Nicola, Z., Raineri, D., Stephens, K., Ramos, C., Tinland, B., Nester, E., & Hohn, B.

(1993) J. Bacteriol.175, 723-731.

Koziel, M.G., Beland, G.L., Bowman, C., Carozzi, N.B., Crenshaw, R., Crossland, L., Dawson, J., Desai, N., Hill, M., Kadwell, S., Launis, K., Lewis, K., Maddox, D., McPherson, K, Meghji, M.R., Merlin, E., Rhodes, R., Warren, G.W., Wright, M. & Evola, S.V. (1993) Bio/Technology 11, 194-200.

Lakso, M. Sauer, B., Mosinger, B., Lee, E.J., Manning, R.W., Yu, S.H., Mulder, K.L. & Westphal, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 6232-6236.

Matsuzaki, H., Araki, H. & Oshima, Y. (1988) Mol.Cell. Biol. 8, 955-962.

Matsuzaki, H., Nakajima, R., Nishiyama, J., Araki, H. & Oshima, Y. (1990) J. Bacteriology 172, 610-618.

Matzke, MA & Matzke, A.J.M. (1995) Plant Physiol.107, 679-685.

Mayerhofer, R., Koncz-Kalman, Z., Nawrath, C., Bakkeren, G., Crameri, A., Angelis, K., Redei, G.P., Schell, J., Hohn. B. & Kończ, C. (1991) EMBO J.10, 697-704.

Morrish F.M. and Fromm M.E. 1992 Current Opinion in Biotechnology 3:141-146.

Murashige, T. & Skoog, F. (1962) Physiol. Plant 15, 473-497.

Odeli, J.T. & Russell S.H. (1994) in HomologousRecombination and gene Silencing in Plants, ed. Paszkowski, J. (Kluwer Academic Publishers)pp. 219-270.

O'Gorman, S., Fox, D.T. & Wahl, G.M. (1991) Science 251, 1351-1355.

Ohba.T., Yoshioka, y., Machida.C. & Machida.Y. (1995) PlantJ.7,157-164.

Ohta, S., Mita, S., Hattori, T.& Nakamura, K. (1990) PlantCell Physiol. 31,805-813.

Onouchi H., Yokoi, K., Machida, C., Matsuzaki H., Oshima, Y., Matsuoka, K., Nakamura, K. & Machida, Y. (1991) Nucleic Acids Res. 19, 6373-6378.

Onouchi, H., Nishihama, R., Kudo, M., Machida, Y. & Machida, C. (1995) Mol. Gen. Genet. 247, 653-660.

Ow, D.W., Wood, K.V., DeLuca, M., deWet, J.R., Helinski, D.R. & Howell, S.H. (1986) Science 234, 856-859.

Pansegrau, W., Schoumacher, F., Hohn, B. & Lanka, E. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90, 11538-11542.

Raskin, l. 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 3164-3166.

Rothstein, S.J., Lahners, K.N., Lotstein, R.J., Carozzi, N.B., Jayne, S.M. aRice, D.A. (1987) Gene 53, 153-161.

Rosenberg, A.H., Lade, B.N., Chui, D-S., Lin, S-W., Dun, J.J., Studier, F.W. (1987) Gene, 125-135.

Rossi, L., Hohn, B. &Tinland, B. (1993) Mol. Gen. Genet. 239, 345-353.

PL 191 113 B1

Russell, S.H., Hoopes, J.L. & Odeli, J.T. (1992) Mol. Gen. Genet. 234, 49-59.

Saunders, K., Lucy, A., and Stanley, J. (1991) Nucleic Acids Research 19, 2325-2330. Shurvinton, C.E., Hodges, L. & Ream, W. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89, 11837-11841. Stachel, S.E., Timmermann, B. & Zambryskl, P. (1986) Nature (London) 322, 706-712.

Stachel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 379-383 (1986).

Stachel, S., Timmerman, B., & Zambryski, P. (1987) EMBO J. 6, 857-663.

Stenger, D.C. Revington, G.N., Stevenson, M.C., and Bisaro, D,M. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci.

(USA) 88, 8029-8033.

Thompson, C.J. Movva, N.R. Tizard, R., Crameri, R., Davies, J.E. Lauweereys, M. and Botterman, J. (1987) EMBO J. 6:2519-2523.

Tinland, B., Koukolikova-Nicola, 2., Hall, M.N. & Hohn, B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89, 8000-8004.

Tinland, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8000-8004 (1994).

Tinland, B., Schoumacher, F., Gloeckler, V., Bravo Angel, A.M.B. & Hohn, B. (1995) EMBO

J. 14, 3585-3595.

Ugaki, M., Ueda, T., Timmermans, M.C.P., Vieira, J., Elliston, K.O. and Messing, J. (1991) Nucleic acids Research 19, 371-377.

Van Haaren, M.J.J., Sedee, N.JA, De Boer, HA, Schilperoort, RA & Hooykaas, P.J.J. (1989) Plant Mol. Biol. 13, 523-531.

Vasil, V., Castillo, A.M., Fromm, M.E. & Vasil, I.K. (1992) Bio/Technology 10, 667- 674.

Vogel, A.M. & Das, A. (1992) J. Bacteriol 174, 303-312. Wallroth, M., et al. Mol. Gen. Genet.

202: 6-15 (1986).

Wan.Y. & Lemaux, P.G. (1994) Plant Physiol. 104, 37-48.

Wang, K., Stachel, S.E., Timmerman, B., Van Montagu, M., & Zambryski, P. (1987) Science

235, 587-591.

Ward, E.R. & Barnes, W.M. (1988) Science 242, 927-930.

Winans et al, Nucl. Acids Res. (1987) 15: 825-837.

Yanofsky, M.F., Porter, S.G., Young, C., Albright, L.M., Gordon, M.P. & Nester, E.W. (1986) Cell 47, 471-477.

Young, C. & Nester, E.W. (1988) J. Bacteriol. 8, 3367-3374.

Yusibov, V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2994-2998 (1994). Zambryski, P. (1992) Annu.

Rev. Plant Physiol. 43, 465-490.

Zupan J.R. & Zambryski P. (1995) Plant Physiol. 107:1041-1047.

PL 191 113 B1

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: CIBA-GEIGY AG (B) ULICA: Klybeckstr. 141 (C) MIASTO: Bazyleja (E) PAŃSTWO: Szwajcaria (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 4002 (G) TELEFON: +41 61 69 11 11 (H) TELEFAKS: + 41 61 696 79 76 (I) TELEX: 962 991 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Ulepszona integracja egzogennego DNA wprowadzanego do komórek eukariotycznych (iii) LICZBA SEKWENCJI: 23 (iv) SPOSÓB ZAPISU KOMPUTEROWEGO:

(A) ŚRODOWISKO: Dyskietka (B) KOMPUTER: IBM PC kompatybilny (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Relase#1.0, Wersja #1,25 (EPO) (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKW. NR ID: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 1:

GNNTGNCAGG ATATATNNNN NNGINAN 21

PL 191 113 B1 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKW. NR ID: 2:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 2:

GGTGGCAGGA ΤΑΤΑΊΝΝΝΝΝ NTGTAAA 27 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKW. NR ID: 3:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 12 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 3:

GATCCCTGCA GA 12 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKW. NR ID: 4:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 150 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa

PL 191 113 B1 (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 4:

AGOTTCTGCA GG 12 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKW. NR ID: 5:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 154 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 5:

ATCTCCACTG A03TAAGGGA TGACGCACAA TCCCACTATC CTTCGCAAGA CCCTTCCTCT 60

ATATAAGGAA GTTCATTTCA TTTCGAGAGG GATCCCTGCA GGACACGCTG AAATCACCAG 120

TCTCTCTCTA CAAATCTATC TCTCTCTATC 150 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKW. NR ID: 6:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowa)

PL 191 113 B1 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 6:

GATCCATAGA GAGAGATAGA TTT3TAGAGA GAGACTGGTG ATTCAGCGT GTCCTGCAGG 60

GATCCCTCTC CAAATGAAAT GAACTTCCTT ATATAGAGGA AGGGTCTTGC GAAGGATAGT 120

GGGATTGTGC GTCATCCCIT ACGTCAGTGG AGAT 154 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKW. NR ID: 7:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 7:

ATCCGGCAGG ATATATACOG ΤΊΌΤΑΑΤΚΤ GCA 33 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKW. NR ID: 8:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie

PL 191 113 B1 (iii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 8:

CCACTATCCT TCGCAAGACC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKW. NR ID: 9:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (8) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 9:

TCGAGTTCCA TGCAG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKW. NR ID: 10:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 45 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 10:

GATCGCAGCA TGCCTAG

PL 191 113 B1 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKW. NR ID: 11:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 46 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 11:

GATCAAGCTT TTGATGAAAG AATA03ITAT TCTITCATCA AGATC 45 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKW. NR ID: 12:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 45 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 12:

AGCTACTGCA GTTGATGAAA GAATACGTTA TTCTTTCATC AACTAG 4S (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKW. NR ID: 13:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: podwójny

PL 191 113 B1 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 13:

GATCAAGCIT TTGATGAAAG AATACGTTAT TCTITCATCA AGATC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKW. NR ID: 14:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 62 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 14:

AATTCATGGA TCTTTCIGGC AATGAGAAAT CCAGG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKW. NR ID: 15:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 56 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie

PL 191 113 B1 (iii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 15:

GTCCCTTGCC TTCTACTCCC CCAACTCCCT CTCCTAGCAC GCCTCCEACA CCTAGCCCCE 60

AT 62 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKW. NR ID: 16:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 53 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 16:

CGGGGCTAGG TCTCGGAGGC GTCCTAGGAG AGGGACTTCG GGGAGTAGAA GGCAAG 56 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKW. NR ID: 17:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 51 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 17:

PL 191 113 B1

AATTCTCAAA ACACACCAGA GTCACGTCGA CT3AGACTGC CATCAACCAG CAT 53 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKW. NR ID: 18:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 54 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 18:

TATCCTTCTA CTCCCCCAAC TCCCTCTCCT AGCACGCCTC CGACACCTAG C 51 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKW. NR ID: 19:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 45 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 19:

AATTGGCTAG GTGTCGGAGG CGTGCTAGGA GAGGGAGTPG GGGGAGTAGA AGGA 54

PL 191 113 B1 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKW. NR ID: 20:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 53 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 20:

CGAATTCGCT AGCATCGATA GATCK5GTAC CAAAGCTTCT CGAGT 45 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKW. NR ID: 21:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 21:

AGCTACTCGA GAAGCITTGG TACCAGATCT ATCGATCCIA GCGAATTCGC ATG 53 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKW. NR ID: 22:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: podwójny

PL 191 113 B1 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 22:

ATCCGGCAGG ATATATACCG TTGTAATTCT GCA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKW. NR ID: 23:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 14 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SPLOT: podwójny (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowa) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 23:

AATTCATGGA TCTTTCTGGC AATGAGAAAT CCAGG

Claims (22)

1. I. Sposób integrowania interesującego DNA zgenomem komórki roślinnej, znamienny tym, że do komórki roślinnej dostarcza się następujące składniki:

   a) interesujący DNA otoczony przez sekwencje graniczne T-DNA Agrobacterium oraz

   b) co najmniej jedną chimerową cząsteczkę DNA lub RNA zdolną do ekspresji wwymienionej komórce roślinnej jednego lub więcej białek promujących integrację DNA otoczonego przez sekwencje graniczne T-DNA, przy czym jedno lub więcej białek jest kodowane przez region wirulencji VirD2, VirD1 lub VirE2 na plazmidzie Ti lub Ri Agrobacterium,żeskładniki wprowadza się do komórki roślinnej sposobami niebiologicznymi.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do komórki roślinnej wprowadza się równocześnie składniki a)ib).
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że składniki wprowadza siędo komórki roślinnej sposobami niebiologicznymi wybranymi zgrupy obejmującej elektroporację, mikroinjekcję, indukowane pobieranieibombardowanie mikropociskami.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dostarcza się chimerową cząsteczkę DNA albo RNA, która koduje białka VirD1.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dostarcza się chimerową cząsteczkę DNA lub RNA, która koduje samo białko VirD2, albo kombinację białek VirD1 iVirD2 albo kombinację białek

   VirD1, VirD2iVirE2.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się chimerową cząsteczkę DNA lub RNA, która koduje białko VirD2.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się interesujący DNA otoczony przez sekwencje graniczne T-DNA Agrobacterium, który jest częścią wirusowego wektora roślinnego.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dostarcza się chimerową cząsteczkę DNA, która jest częścią wirusowego wektora roślinnego.
9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się interesujący DNA, otoczony przez sekwencje graniczne T-DNA i chimerową cząsteczkę DNA, które są częścią wirusowego wektora roślinnego.
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się komórkę roślinną pochodzącą zrośliny dwuliściennej.

    II. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stosuje się komórkę roślinną pochodzącą zrośliny dwuliściennej, wybranej z grupy złożonejztytoniu, bawełny, rzepaku i soi.
11. 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się komórkę roślinną pochodzącą zrośliny jednoliściennej.
12. 13. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że stosuje się komórkę roślinną pochodzącą zrośliny jednoliściennej wybranej z grupy złożonej z kukurydzy, pszenicyiryżu.
13. 14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się interesujący DNA, który zawiera gen chimerowy.
14. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że stosuje się gen chimerowy DNA, który jest zdolny do ekspresji białka w komórce roślinnej.
15. 16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się interesujący DNA otoczony przez sekwencje graniczne T-DNA Agrobacterium oraz cząsteczkę chimerowego DNA, które są składnikami pojedynczej cząsteczki DNA.
16. 17. Sposób wytwarzania płodnej transgenicznej rośliny zgenomem mającym wintegrowany DNA, otoczony przez sekwencje graniczne T-DNA Agrobacterium, obejmujący transformację, anastępnie regenerację komórek roślinnych do płodnej rośliny transgenicznej, znamienny tym, że DNA transformuje się do genomu komórki roślinnej sposobem określonym w zastrz. 1.
17. 18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że wytwarza się płodną roślinę transgeniczną wybranązgrupy złożonejztytoniu, bawełny, rzepaku, soi, kukurydzy, pszenicyiryżu.
18. 19. Zastosowanie genu kodującego białka wirulencji Agrobacterium wniebiologicznych sposobach transformacji komórek roślinnych, znamienne tym, że gen ten steruje integracją interesującego DNA, otoczonego przez graniczne sekwencje T-DNA Agrobacterium, z ge n o m e m komórki roślinnej.
19. 20. Zastosowanie genu według zastrz. 19, znamienne tym, że wymieniony gen jest genem chimerowym kodującym białka VirD2, VirD1, lubVirE2.
20. 21. Transgeniczna komórka roślinna otrzymana sposobem określonym w zastrz. 1.
21. 22. Roślina regenerowanazkomórki roślinnej określonej w zastrz. 21.
22. 23. Potomstwo roślin określonychwzastrz. 22, które zawiera interesujący DNA określony w zastrz. 1.