CN116554290B - 一种脂肪酸转运蛋白及其编码基因AtFAX3基因与应用 - Google Patents
一种脂肪酸转运蛋白及其编码基因AtFAX3基因与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116554290B CN116554290B CN202310413725.2A CN202310413725A CN116554290B CN 116554290 B CN116554290 B CN 116554290B CN 202310413725 A CN202310413725 A CN 202310413725A CN 116554290 B CN116554290 B CN 116554290B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- fatty acid
- atfax
- arabidopsis
- fax3
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 52
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 title claims abstract description 33
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 title claims abstract description 33
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 title claims abstract description 33
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 33
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 claims abstract description 30
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 23
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 15
- 101100226771 Arabidopsis thaliana FAX3 gene Proteins 0.000 abstract description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 12
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 abstract description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000004807 localization Effects 0.000 abstract description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 5
- 239000004519 grease Substances 0.000 abstract description 4
- 230000032895 transmembrane transport Effects 0.000 abstract description 4
- 102000040792 FAX family Human genes 0.000 abstract description 2
- 108091071522 FAX family Proteins 0.000 abstract description 2
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 abstract description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 abstract description 2
- 241000894007 species Species 0.000 abstract description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 15
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 15
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 14
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- ZNJFBWYDHIGLCU-HWKXXFMVSA-N jasmonic acid Chemical compound CC\C=C/C[C@@H]1[C@@H](CC(O)=O)CCC1=O ZNJFBWYDHIGLCU-HWKXXFMVSA-N 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 6
- 102000000476 Fatty Acid Transport Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010055870 Fatty Acid Transport Proteins Proteins 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- 101100226768 Arabidopsis thaliana FAX1 gene Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000219000 Populus Species 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- ZNJFBWYDHIGLCU-UHFFFAOYSA-N jasmonic acid Natural products CCC=CCC1C(CC(O)=O)CCC1=O ZNJFBWYDHIGLCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N tristearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100226772 Arabidopsis thaliana FAX4 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 2
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 2
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMTMAFAPLCGXGK-JMTMCXQRSA-N (15Z)-12-oxophyto-10,15-dienoic acid Chemical compound CC\C=C/C[C@H]1[C@@H](CCCCCCCC(O)=O)C=CC1=O PMTMAFAPLCGXGK-JMTMCXQRSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 101100226770 Arabidopsis thaliana FAX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100153168 Arabidopsis thaliana TIC21 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000013912 Ceratonia siliqua Nutrition 0.000 description 1
- 240000008886 Ceratonia siliqua Species 0.000 description 1
- 241000195585 Chlamydomonas Species 0.000 description 1
- 241000195597 Chlamydomonas reinhardtii Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100273813 Homo sapiens CDKN1A gene Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- PMTMAFAPLCGXGK-UHFFFAOYSA-N OPDA Natural products CCC=CCC1C(CCCCCCCC(O)=O)C=CC1=O PMTMAFAPLCGXGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108700038981 SUMO-1 Proteins 0.000 description 1
- 101100083337 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) pic1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102100026940 Small ubiquitin-related modifier 1 Human genes 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000583907 Taraka Species 0.000 description 1
- ABUBSBSOTTXVPV-UHFFFAOYSA-H [U+6].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O Chemical compound [U+6].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O ABUBSBSOTTXVPV-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H bis[[2-(5-hydroxy-4,7-dioxo-1,3,2$l^{2}-dioxaplumbepan-5-yl)acetyl]oxy]lead Chemical compound [Pb+2].[Pb+2].[Pb+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003763 carbonization Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229910052762 osmium Inorganic materials 0.000 description 1
- SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N osmium atom Chemical compound [Os] SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000008654 plant damage Effects 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000008117 seed development Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Botany (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了一种脂肪酸转运蛋白及其编码基因AtFAX3基因与应用。本发明首次对拟南芥(Arabidopsis thaliana)中对FAX3的定位及功能进行探究。利用生物信息学分析，比对不同物种中FAX家族成员的蛋白序列，推测FAX3的作用机制。然后开展相关实验，证明了AtFAX3参与叶绿体内脂肪酸跨膜转运过程，并且主要在角果皮中起作用，从而影响拟南芥种子中的油脂合成。本发明为提高种子含油量以及品质提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明属于分子育种技术领域，涉及一种脂肪酸转运蛋白及其编码基因AtFAX3基因与应用。
背景技术
由于关于质体中的脂肪酸向外运输的膜转运蛋白报道很少，因此脂肪酸运出质体的机制一直存在很大的争议。李楠楠等首次在拟南芥中对AtFAX1进行了研究，研究人员分离出FAX1，并对其功能进行验证。他们发现这种叶绿体质膜定位的转运体对于生物量产生、雄性育性以及脂肪酸衍生化合物(如脂类、蜡或花粉粒的细胞壁物质)的合成至关重要(LiNannan,et al."FAX1,a novel membrane protein mediating plastid fatty acidexport.."Plant biology 13.2(2015):doi:10.1371/journal.pbio.1002053.)。此外，还有研究发现在衣藻和甘蓝型油菜中，FAX1也在质体转运脂肪酸的过程中起作用([1]LiNannan,et al."Characterization of Fatty Acid Exporters involved in fatty acidtransport for oil accumulation in the green alga Chlamydomonas reinhardtii.."Biotechnology for biofuels
12.1(2019):doi:10.1186/s13068-018-1332-4.[2]Xiao Zhongchun,et al."TheBrassica napus fatty acid exporter FAX1-1 contributes to biological yield,seed oil content,and oil quality.."Biotechnology for biofuels 14.1(2021):doi:10.1186/S13068-021-02035-4.)。
李楠楠团队的另外一项研究中，进一步证明了质体包膜定位蛋白FAX2和FAX4作为种子胚胎质体中进行三酰基甘油(TAG)生物合成的FA输出体，主要作用在拟南芥种子灌浆过程中FA从质体运输到ER中进行TAG的生物合成(Li Nannan,et al."Two Plastid FattyAcid Exporters Contribute to Seed Oil Accumulation in Arabidopsis.."Plantphysiology 182.4(2020):doi:10.1104/pp.19.01344.)。
近期研究表发现，OPDA1在杨树的损伤胁迫调控中发挥重要作用，并且OPDA1过表达植株的茉莉酸含量以及与茉莉酸合成相关基因的表达量升高。此外，OPDA1还定位于杨树叶片叶绿体内层。AtFAX3作为调控OPDA1输出的候选基因之一，猜测其也可能在提高植株损伤胁迫中起作用(Zhao Xin,et al."OPDAT1,a plastid envelope protein involved in12-oxo-phytodienoic acid export for jasmonic acid biosynthesis in Populus.."Tree physiology 41.9(2021):doi:10.1093/TREEPHYS/TPAB037.)。
目前的研究发现，FAX/Tmemb_14家族成员作为膜内转运蛋白在质体脂肪酸输出中起到转运作用。FAX蛋白在拟南芥中有7个同源物，被命名为FAX1-7。AtFAX1-4被预测定位在质体膜中，并被预测参与植物中的脂质转运。其中FAX3与FAX4的DNA序列相似，进化树也显示二者亲缘关系较近。然而目前对于FAX3的研究还非常少，因此，申请人拟验证FAX3是否具有转运脂肪酸的功能以及在膜脂合成方面起作用，并且进一步探究FAX3调控种子中油脂的积累的机制。为培育出油脂产量更高，品质更好的油料作物提供新思路。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种脂肪酸转运蛋白及其编码基因AtFAX3基因与应用，该基因定位于质体包膜，可以参与脂肪酸的跨膜转运，是首次确定FAX3主要作用于角果皮，影响角果皮质体中脂肪酸的转运，进而探究其在膜脂合成、种子发育所需碳源供应方面的作用机制。最终确认FAX3在种子油脂合成积累的调控作用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种脂肪酸转运蛋白，包括a)或b)的蛋白质：
a)由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加与植物脂肪酸转运能力相关的蛋白质。
2、编码前述脂肪酸转运蛋白的基因，即AtFAX3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3、含有前述基因的表达盒。
4、含有前述基因或表达盒的重组载体。
5、含有前述基因或表达盒的重组质粒。
6、含有前述基因、表达盒或重组载体的重组菌。
7、含有前述基因、表达盒或重组载体的转基因植物细胞系。
8、前述脂肪酸转运蛋白、基因、表达盒、重组载体、重组质粒、重组菌或转基因植物细胞系在调控植物种子油脂合成中的应用。
作为优选的技术方案之一，所述植物为拟南芥。
作为进一步优选的技术方案之一，所述脂肪酸转运蛋白参与拟南芥质体脂肪酸跨膜转运过程、影响角果皮和种子连接处细胞的发育、种子形态以及调控油脂合成。
作为优选的技术方案之一，所述脂肪酸转运蛋白定位于质膜，主要作用于角果皮，从而转运脂肪酸。
9、一种构建转基因植物的方法，使前述脂肪酸转运蛋白在拟南芥中过表达或敲除，进而影响拟南芥质体中的脂肪酸转运，改变(提高/降低)种子中油脂合成量。
作为优选的技术方案之一，过表达或敲除的方法为：向拟南芥中导入35s驱动的前述脂肪酸转运蛋白的编码基因，或者敲除所述编码基因。定位于质膜，过表达会提高种子含油量，而敲除会使油脂含量显著下调。
本发明的有益效果在于：
本发明首次对拟南芥(Arabidopsis thaliana)中对FAX3的定位及功能进行探究。利用生物信息学分析，比对不同物种中FAX家族成员的蛋白序列，推测FAX3的作用机制。然后开展相关实验，证明了AtFAX3参与叶绿体内脂肪酸跨膜转运过程，并且主要在角果皮中起作用，从而影响拟南芥种子中的油脂合成。本发明为提高种子含油量以及品质提供了新的思路。
具体优势如下：
1)本发明成功克隆了拟南芥AtFAX3基因，并将其转运蛋白应用到提高油脂含量研究中去。通过进行功能验证相关实验，证明了AtFAX3可以参与脂肪酸的跨膜转运，并影响种子中的能量分配。
2)首先在拟南芥中敲除FAX3，发现拟南芥表现出种子油脂含量显著降低，角果皮细胞叶绿体内脂滴增多。为探究种子油脂合成和提高产油量提供新思路。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明。
图1是本发明拟南芥RNA的提取(A)及AtFAX3的扩增(B)，M为Marker，1，2，3，4为四个重复的扩增结果；
图2是本发明野生型拟南芥(WT)和转基因拟南芥过表达株系#1,#2,#8,#10,#12。M为Marker；H为DNA-free water；WT为野生型；1,2,3,4,5一次对应过表达株系
#1,#2,#8,#10,#12。
图3是本发明AtFAX3在拟南芥各组织中的表达水平检测；
图4是本发明野生型拟南芥(WT)和转基因拟南芥过表达(AtFAX3-WT)株系#1、
#2、#8、#10、#12基因表达水平验证；
图5是本发明atfax3突变株系3、12序列分析(A)和FAX3半定量电泳图(B)，ACTIN作为内参基因，WT、atfax3#3和atfax3#12各两个技术重复；
图6是FAX3过表达和突变体干种子形态观察与分类，根据干种子大小，将种子分为Large、Normal、Small和Shrunken四种类型；
图7是对不同发育时期各品系角果中的种子形态观察(A)和统计(B)，DAF：开花后天数。
图8是拟南芥角果皮模式图(A)和atfax3突变体角果皮切片的透射电镜观察(B)。模式图中方框内为具体的切片位置。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtFAX3基因的克隆方法
通过生工EZ-10DNAaway RNA提取试剂盒从拟南芥的嫩叶中提取RNA，电泳检测RNA质量(如图1中A)。利用Takara公司的反转录试剂盒将其mRNA反转录成cDNA；以该cDNA作为PCR模板，扩增得到AtFAX3-CDS片段，引物组合：
AtFAX3-OE-F：5'-ATGAGGTCTCGCACCATGGCGGATTTGAT TTTGAGTTC-3'，如SEQ IDNO.3所示；
AtFAX3-OE-R：3'-ATGAGGTCTCTCGCCGTGGAGGCTGCGCATGATACCGT-5'，如SEQ IDNO.4所示；
为AtFAX3基因过表达克隆。
为了获得fax3突变体株系，设计双靶点
T1：5'-CCACTGCTTCACCGATCCGA-3'；
T2：5'-CTCGGTGCAGTAGTTCCCTC-3'，以AtU6-29载体质粒(购自武汉艾迪晶生物有限公司)作为启动子驱动靶基因表达。以AtFAX3基因过表达克隆为例，PCR(聚合酶链式反应)方法与程序见表1。
表1PCR方法与程序
具体PCR反应程序如下：94℃预变性2min→(98℃10s→55℃30s→68℃1min30s)该过程进行32个扩增循环→68℃继续延伸5min→4℃保存。PCR产物以用质量浓度1％琼脂糖凝胶进行电泳检测质量。质量浓度1％琼脂糖凝胶电泳检测可见约723bp大小的条带，与目的条带大小吻合(图1中B)。回收目的片段连接载体，转化大肠杆菌，并进行菌液检测，挑选菌液检测正确的几个菌液送样进行测序，所得序列与参考序列一致。
T载体连接具体见表2。
表2.T载体连接
酶切-连接反应参数见表3。
表3.酶切-连接反应参数
实施例2转基因拟南芥阳性植株的获得
以野生型拟南芥为实验材料，采用根癌农杆菌转化法对其进行浸花处理(Duy D,Wanner G,Meda AR,von Wiren N,Soll J,et al.(2007)PIC1,an ancient permease inArabidopsis chloroplasts,mediates iron transport.Plant Cell 19:986–1006.PMID:17337631)。
将10μl农杆菌加入10ml YEP(10mg Rif，10mg Kan)液体培养基中，28℃，220rpm于摇床振荡培养14-18h，直至对数生长OD600为0.6～0.8。将活化过夜的农杆菌按1：1000的比例(体积比)接种在相同的100ml YEP(100mg Rif，100mg Kan)液体培养基中，继续培养至OD600为0.2～0.4。无菌操作，将二活的农杆菌菌液倒入50ml离心管中4000rpm离心15min，去上清，加入100ml重悬液【0.22g MS(包含维生素的植物无菌培养基基盐)，5g蔗糖】，用移液枪吸打混匀，移入培养皿中，
在培养皿中加入30ul表面活性剂Silwet L-77，继续吹扫使三者融合。将开花后的拟南芥剪去已经授粉的花以及角果，其余盛开的花浸入培养皿中35s，然后暗培养2d(暗培养时需将拟南芥放倒)。暗培养结束后，在16h/8h昼夜循环(100μmol photons-m-2-s-1)，20℃～22℃条件下培养约两个月收种。
实施例3转基因拟南芥的验证
将用浸花法转化的拟南芥植株种子(T0)消毒后铺在含有25mg/L潮霉素的1/2MS培养基上进行筛选。培养7天后，将长出的拟南芥移入营养土中继续培养，2个月后收获种子(T1)。将T1代种子消毒后铺在含有25mg/L潮霉素的1/2MS培养基上生长7天，若发芽生根率为100％，则为阳性纯合。
用SDS方法提取抗性植株的全基因组DNA，以PCR的方法扩增标记基因片段，筛选出阳性植株。以该DNA作为PCR模板，使用Promega公司的2×Rapid Taq Master Mix聚合酶，以及DNA验证性引物
AtFAX3-OE-1-F：5'-GAGCACGCCTCTGTCTATG-3'，如SEQ ID NO.5所示；
AtFAX3-OE-1-R：3'-GCTCAGGTAGTGGTTGTCG-5'，如SEQ ID NO.6所示；
扩增得到相应的片段，PCR方法与程序PCR反应体系与基因扩增程序与基因扩增一致。
扩增片段的电泳显示，该基因片段大小约为1000bp左右，与预测的片段大小970bp一致(图2)。M为2000bp的DNA marker，WT为野生型拟南芥，1,2,3,4,5分别为转基因拟南芥株系p35s::FAX3-GFP#1,#2,#8,#10,#12。
实施例4拟南芥AtFAX3基因的组织表达量水平检测和定位
选取温室中生长状态良好的一个月的拟南芥植株材料(材料分为根、茎、新叶、老叶、花、开花后4天、10天、16天的角果)，通过EZ-10DNAaway RNA Mini-Preps提取试剂盒提取其RNA；然后利用Takara公司反转录试剂盒(RR047A)进行cDNA的反转录合成，以cDNA为模板釆用Promega公司的qPCR Master Mix A6002试剂对基因进行qPCR实验。参比基因引物：
qPCR-AtACTIN2-PF：5'-GTCGCCATCCAAGCTGTTC-3'，如SEQ ID NO.7所示；
qPCR-AtACTIN2-PR：3'-GGATGGCATGAGGAAGAGAG-5'，如SEQ ID NO.8所示；
目的基因引物：
qPCR-AtFAX3-PF：5'-GCTGTTCTGCTGTATGTC-3'，如SEQ ID NO.9所示；
qPCR-AtFAX3-PR：3'-GTATCGGGTTCCCATTACG-5'，如SEQ ID NO.10所示。
其他相关操作步骤见表4(实时荧光定量反应体系)。
表4.实时荧光定量反应体系
反应条件如下：95℃,10min；95℃,15s；60℃,1min；40个循环，65℃,5s。退火温度依引物不同而异，本研究中采用AtActin2(AT3G18780)作为内参基因。
每个样品设三个平行重复，以加入野生型拟南芥模板的反应体系为对照。配好的反应体系放入QuantStudioTM 1Real-Time(ABI公司)荧光定量PCR仪中进行PCR反应程序。程序结束后，利用溶解曲线Tm值判断产物单一性以及溶解温度。通过目的基因和参比基因比值的数值，得出相对于内参基因的目的基因的相对表达量，最后进行样品间相对表达量的比较。独立重复上述步骤两次，将所得数据用QuantStudioTM Design&Analysis Softwa软件进行分析作图。图3为AtFAX3在各组织中的表达水平检测，数据结果表明：AtFAX3在角果中表达量最高，特别是开花后14天的角果中表达量很高。
实施例5野生型拟南芥与转基因拟南芥AtFAX3基因的表达量水平检测
取温室中生长状态良好的同期野生型拟南芥及转基因拟南芥中叶，通过生工EZ-10DNAaway RNA提取试剂盒提取RNA，并将mRNA用Taraka公司的反转录试剂盒反转录成cDNA，利用cDNA做模板进行实时荧光定量PCR的检测实验(方法同上)。野生型和不同株系过表达拟南芥中AtFAX3基因中的表达水平结果见图4。转基因植株相比野生型AtFAX3基因的表达量水平依次高了约47，23，2.5，2.3，1.5倍。野生型和fax3突变株系#3，#12的mRNA反转录成cDNA用于碱基测序，所得结果见图5中A。再进行PCR扩增，并通过琼脂凝胶电泳仪测定PCR产物的数量(如图5中B)。
实施例6转基因拟南芥种子的形态分类
当详细检查种子的形态时，我们将fax3突变株系的种子分为4组：正常、大、小和萎缩(图6)。当我们用体视显微镜(SteREO Discovery V20,Zeiss)观察不同发育时期的fax3突变体、AtFAX3-OE和野生型在8、14和18DAF(DAF：开花后天数)的种子形态观察。将18DAF的单个角果中种子形态分成正常(Normal)和不正常两类。与野生型相比，fax3#3大约有12.1％的种子萎缩或变小，fax3#12大约有20.1％的种子萎缩或变小(图7)
实施例7野生型拟南芥与转基因拟南芥中进行拟南芥AtFAX3基因的脂肪酸转运的功能验证
由于AtFAX3主要表达在角果的皮中高表达，因此申请人进一步研究了fax3突变体和野生型在发育中的子房的细胞学差异(图8中A)。为了观察野生型和fax3突变体株系的角果皮细胞质体内的脂滴情况。将选定的WT和fax3突变体10DAF(DAF：开花后天数)果实的果皮用2.5％(v/v)戊二醛(pH7.4，0.1M PBS配置)在室温下固定2小时以上，然后再4℃。用0.1M PBS缓冲液清洗组织，用质量浓度1％锇酸(pH7.4，0.1M PBS配置)在4℃后固定2小时，用0.1M PBS在4℃清洗四次，每次15分钟。然后用体积浓度50％、70％、80％、90％、95％、100％的乙醇水溶液梯度脱色20分钟，然后用无水乙醇：无水丙酮(体积比1:1)脱色20分钟，然后用无水丙酮：环氧树脂Epon812(体积比2:1)在室温下进行3-4小时。100％丙酮：环氧树脂Epon812(1:2)室温下3-4小时，然后在室温下用纯包埋剂包埋2次，每次3-4小时。将样品放在PCR管中，用纯包埋剂包埋。将组织包埋在新鲜树脂中，并在60℃的烘箱中聚合48小时。在Leica Reichert Ultracut S切片机上切下约70纳米厚的超薄切片。收集到涂有碳化的铜格上，用醋酸铀染色。然后用柠檬酸铅将切片染色10分钟。使用Tecnai 12TEM 100kV(Phillips,Eindhoven,The Netherlands)检查记录切片，配备MegaView II CCD照相机和分析软件3.0版(Soft Imaging System GmbH,Germany)。fax3突变体叶绿体中的脂滴比野生型叶绿体中的大20倍，这也使突变体的叶绿体结构变得混乱(图8中B)。
以上结果说明，AtFAX3参与叶绿体内脂肪酸跨膜转运过程，并且主要在角果皮中起作用，当atfax3突变后，种子的形态也部分变小和皱缩，基于此，我们将进一步探索AtFAX3是否在拟南芥种子中的油脂合成中起作用。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (1)
1.敲除编码脂肪酸转运蛋白的基因在促使拟南芥种子变小和皱缩中的应用，其特征在于，所述的脂肪酸转运蛋白，由如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列组成；编码该脂肪酸转运蛋白的基因，即AtFAX3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310413725.2A CN116554290B (zh) | 2023-04-18 | 2023-04-18 | 一种脂肪酸转运蛋白及其编码基因AtFAX3基因与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310413725.2A CN116554290B (zh) | 2023-04-18 | 2023-04-18 | 一种脂肪酸转运蛋白及其编码基因AtFAX3基因与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116554290A CN116554290A (zh) | 2023-08-08 |
| CN116554290B true CN116554290B (zh) | 2024-05-28 |
Family
ID=87495599
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310413725.2A Active CN116554290B (zh) | 2023-04-18 | 2023-04-18 | 一种脂肪酸转运蛋白及其编码基因AtFAX3基因与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116554290B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1366050A (zh) * | 2001-10-31 | 2002-08-28 | 浙江大学 | 新的水稻胚乳表达序列标签及其构成的基因芯片 |
| CN112011553A (zh) * | 2020-08-27 | 2020-12-01 | 西南大学 | 一种脂质转运蛋白及其编码基因与应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060107345A1 (en) * | 2003-09-30 | 2006-05-18 | Nickolai Alexandrov | Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby |
-
2023
- 2023-04-18 CN CN202310413725.2A patent/CN116554290B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1366050A (zh) * | 2001-10-31 | 2002-08-28 | 浙江大学 | 新的水稻胚乳表达序列标签及其构成的基因芯片 |
| CN112011553A (zh) * | 2020-08-27 | 2020-12-01 | 西南大学 | 一种脂质转运蛋白及其编码基因与应用 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| "Characterization of Fatty Acid EXporters involved in fatty acid transport for oil accumulation in the green alga Chlamydomonas reinhardtii";Nannan Li 等;《Biotechnol Biofuels》;20190112;第12卷;doi: 10.1186/s13068-018-1332-4 * |
| "FAX1, a Novel Membrane Protein Mediating Plastid Fatty Acid Export";Nannan Li 等;《PLoS Biol》;20150203;第13卷(第2期);doi: 10.1371/journal.pbio.1002053 * |
| "OPDAT1, a plastid envelope protein involved in 12-oxo-phytodienoic acid export for jasmonic acid biosynthesis in Populus";Xin Zhao 等;《Tree Physiology》;20210409;第41卷(第9期);第1714–1728页 * |
| "甘蓝型油菜含油量相关候选基因筛选及BnaFAX1的功能研究";肖忠春;《中国博士学位论文全文数据库 (基础科学辑)》;20200515(第5期);D047-57 * |
| "莱茵衣藻中脂质代谢过程研究进展";张岩 等;《微生物学通报》;20190430;第46卷(第4期);第913-930页 * |
| Salanoubat,M.等."Arabidopsis thaliana Transmembrane proteins 14C (AT3G43520), mRNA".《genbank》.2022,ACCESSION NM_114220. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116554290A (zh) | 2023-08-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107312785B (zh) | OsKTN80b基因在降低水稻株高方面的应用 | |
| CN107435047B (zh) | 一种植物磷信号网络中耐低磷关键基因GmPHR25及其与应用 | |
| US20080092255A1 (en) | Methods of producing and using cold temperature tolerant plants, seeds, and crops | |
| CN111278849B (zh) | 用于改善植物的转化效率的方法和用于转化植物的方法 | |
| US11732270B2 (en) | Compositions and methods for manipulating the development of plants | |
| CN110592137B (zh) | 拟南芥at5g10290基因及其突变体在提高植物耐旱性的应用 | |
| BRPI0709801A2 (pt) | polinucleotÍdeo isolado, cassete de expressço, mÉtodo para modular o tamanho de àrgços sem plantas, mÉtodo de modular toda a planta ou o tamaho de àrgço em uma planta, produto | |
| CN113322261B (zh) | 大豆ABC转运蛋白基因GmALS3在耐低磷和抗铝毒胁迫植物育种中的应用 | |
| CN112048515B (zh) | 一种油菜S-腺苷-L-蛋氨酸依赖的甲基转移酶基因BnPMT6及其应用 | |
| CN107058317B (zh) | 一种花粉特异性启动子及其应用 | |
| CN115960189B (zh) | 一种文冠果蛋白及其编码基因在提高植物花瓣中花青素的含量中的应用 | |
| CN116554290B (zh) | 一种脂肪酸转运蛋白及其编码基因AtFAX3基因与应用 | |
| CN113337522B (zh) | 棉花GhNFYC4基因在促进植物开花中的应用 | |
| CN111041035B (zh) | 水稻转录因子OsNAC3在提高植物耐镉能力中的应用 | |
| CN114250233A (zh) | 拟南芥钙离子通道基因AtCNGC3在菌核病防控中的应用 | |
| CN114540529A (zh) | 一种半矮秆增产的玉米基因型、功能性分子标记InDel-K2及其应用 | |
| CN109971765B (zh) | 一种调控拟南芥脂肪酸和淀粉含量的玉米基因ZmNAC77及其应用 | |
| CN104805093A (zh) | 水稻基因OsLOL3在延缓植物叶片衰老和提高植物耐旱性中的应用 | |
| CN116143892B (zh) | OsGN11基因在改良水稻每穗粒数性状中的应用 | |
| CN114958866B (zh) | 调控大豆分枝数的基因及其用途 | |
| US10100321B2 (en) | Methods for increasing cotton fiber length | |
| CN117106817A (zh) | 草莓FvMAPK12基因及其编码蛋白和生物材料在调控果实产量和品质中的应用 | |
| JP3593565B2 (ja) | 植物の胚特異的遺伝子および該遺伝子のプロモータ、並びにそれらの利用 | |
| CN116854795A (zh) | 与甘薯块根生长、淀粉合成和抗病性相关蛋白IbPIF3及其编码基因与应用 | |
| CN117947080A (zh) | Nest1基因在调节水稻耐盐性中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |