JP2012179012A - 酵母変異株及びこれを用いたタンパク質の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】宿主酵母に対して目的タンパク質をコードする外来遺伝子を発現可能に導入し、且つ、オートファゴソームの形成に必須な因子又は液胞内においてオートファジックボディの崩壊に関与する因子をコードし、オードファジーに関連する遺伝子の機能を低減させる、タンパク質の製造方法。
【選択図】図3
Description
(1)目的タンパク質をコードする外来遺伝子を発現可能に導入し、且つ、オードファジーに関連する遺伝子の機能を低減させた酵母変異株。
(2)機能を低減させる遺伝子は、オートファゴソームの形成に必須な因子又は液胞内
においてオートファジックボディの崩壊に関与する因子をコードする遺伝子であることを特徴とする(1)記載の酵母変異株。
(3)上記オートファゴソームの形成に必須な因子をコードする遺伝子は、以下(a)〜(c)のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする(2)記載の酵母変異株。
(a)Atg1キナーゼ複合体を構成するタンパク質
(b)Atg8又はAtg12が関与するユビキチン様結合反応系を構成するタンパク質
(c)PtdIns 3-キナーゼ複合体を構成するタンパク質
(4)上記オートファゴソームの形成に必須な因子をコードする遺伝子は、Atg1遺伝子、Atg13遺伝子、Atg8遺伝子及びAtg4遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子であることを
特徴とする(2)記載の酵母変異株。
(5)上記液胞内においてオートファジックボディの崩壊に関与する因子はAtg15遺伝
子であることを特徴とする(2)記載の酵母変異株。
(6)Saccharomyces属酵母であることを特徴とする(1)記載の酵母変異株。
(7)上記(1)乃至(6)いずれか一記載の酵母変異株を培養する工程と、目的タンパク質を回収する工程とを含むタンパク質の製造方法。
(8)上記酵母変異株の培養上清から上記目的タンパク質を回収することを特徴とする(7)記載のタンパク質の製造方法。
当該遺伝子のアクセッション番号である。当該アクセッション番号によりUniprotKBデー
タベースから各ATG遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列情報を取得でき
る。表1に示すアクセッション番号のうち、ATG25遺伝子のQ6JUT9はPichia angusta由来
の遺伝子に関するアクセッション番号であり、ATG28遺伝子のQ5IF00及びATG30遺伝子のC4R5T1はPichia pastoris由来の遺伝子に関するアクセッション番号である。これら以外の
アクセッション番号は全てSaccharomyces cerevisiae由来の遺伝子に関するアクセッション番号である。
ゼ複合体が関与し、ユビキチン様タンパク質であるAtg8及びAtg12のユビキチン様結合反
応系が関与する。したがって、オートファゴソームの形成に必須な因子とは、(a)Atg1タンパク質キナーゼ複合体を構成するタンパク質、(b)Atg8又はAtg12が関与するユビキチン様結合反応系に関与するタンパク質、及び(c)PtdIns 3-キナーゼ複合体を構成するタンパク質を挙げることができる。
ク質である。Atg8又はAtg12が関与するユビキチン様結合反応系に関与するタンパク質は
、Atg3タンパク質、Atg4タンパク質、Atg5タンパク質、Atg7タンパク質、Atg8タンパク質、Atg10タンパク質、Atg12タンパク質及びAtg16タンパク質である。PtdIns 3-キナーゼ複合体を構成するタンパク質は、図2に示すように、Atg6タンパク質及びAtg14タンパク質
である。
するATG22遺伝子を挙げることができる。
伝子からなる群から選ばれる少なくとも1以上の遺伝子の機能を低減させることが好ましい。
の塩基配列及び当該ATG13遺伝子によりコードされるATG13タンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号5及び6に示す。Saccharomyces cerevisiaeにおけるATG15遺伝子のコー
ディング領域の塩基配列及び当該ATG15遺伝子によりコードされるATG15タンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号7及び8に示す。
特に限定されないが、例えば、対象となる遺伝子の発現制御領域を改変する手法や、対象となる遺伝子の全部又は一部を欠失させる手法を適用する。遺伝子の翻訳量を低下させるには、特に限定されないが、例えば、いわゆるRNA干渉やアンチセンスRNAを利用する方法を挙げることができる。換言すれば、所定の遺伝子の発現量を低下させるには、当該遺伝子を破壊する手法として公知の如何なる手法を適用しても良い。
酵母は、上述した酵母の野生株でも良いが、各種の変異が導入された変異株でも良い。例えば、遺伝子組換えや変異導入により外来遺伝子の発現量が向上するといった特徴を有する酵素変異株を宿主として使用することができる。この場合、更に上述したオートファジー関連遺伝子の機能を低減させることで、タンパク質の生産性がより向上することが期待できる。
ウェアを利用して、表1に示したアクセッション番号で特定される遺伝子の相同遺伝子を特定することができる。上述した酵母のゲノム配列情報が未知である場合には、一例として、cDNAライブラリー等を作製し、表1に示したアクセッション番号で特定される遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブを用いて相同遺伝子をcDNAライブラリーから特定することができる。
来遺伝子に含まれる。
ッカーゼ遺伝子、リグニンオキシダーゼ遺伝子、リグニンペルオキシダーゼ遺伝子、リパーゼ遺伝子、マンガンペルオキシダーゼ遺伝子、1,2-α-マンノシダーゼ遺伝子、ヌクレ
アーゼ遺伝子、ペクチンリアーゼ遺伝子、ペクチンメチルエステラーゼ遺伝子、酸性ホスファターゼ遺伝子、ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、キシラナーゼ遺伝子、β-キシロシ
ダーゼ遺伝子等を挙げることができる。特に、生産対象のタンパク質としては、リゾチーム、キモシン、レクチン、インターロイキン、ラクトフェリン、味覚修飾タンパク質であるミラクリン、抗Fas抗体などの抗体医薬、ダニアレルゲン、花粉アレルゲン、木質バイオマス分解のためのセルロース分解酵素、サイトカイン等が高等生物由来の遺伝子によりコードされるタンパク質として例示できる。
浸透圧応答7遺伝子(HOR7)のプロモーターなどが利用可能である。なかでもピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子(PDC1)のプロモーターが下流の目的遺伝子を高発現させる能力が高いために好ましい。
Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限
定されない。
クリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で解析することにより測定できる。細胞培養中に生産された目的タンパク質は培地の中に分泌され、そして、例えば細胞培地から不要な成分を取り除くことにより、精製、又は、単離される。目的タンパク質の精製には、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカ上またはDEAEなどの陽イオン交換樹脂によるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、 SDS-PAGE、硫酸アンモニュ
ウム沈殿法、ゲルろ過等の手法を単独で又は組み合わせて使用できる。
本実施例では、Saccharomyces cerevisiaeにおけるatg遺伝子を破壊した変異株を作製
し、外来遺伝子として導入したOgataea neopini ATCC28781株由来のβ-グルコシダーゼ遺伝子の発現量の変化を測定した。具体的に、変異株としては、Atg1遺伝子破壊株、Atg4遺伝子破壊株、Atg13遺伝子破壊株及びAtg15遺伝子破壊株を作製した。
テグレートすることで作製した。なお、Atg1遺伝子、Atg4遺伝子、Atg13遺伝子及びAtg15遺伝子のそれぞれについて、Atg1遺伝子破壊断片(配列番号9)、Atg4遺伝子破壊断片(配列番号10)、Atg13遺伝子破壊断片(配列番号11)及びAtg15遺伝子破壊断片(配列番号12)を化学合成により作製した。
ダーゼ遺伝子を導入したYP-ONBGL1株を使用した。なお、Ogataea neopini ATCC28781株由来のβ-グルコシダーゼ遺伝子は、以下のように特定した。
した。このDNA配列を取得し、ゲノム上の前後DNA配列を付加した配列を作成し、遺伝子解析ソフトGenetyx version8を用いてORF検索を行った。その結果、Ogataea neopini ATCC28781株由来の新規なβ-グルコシダーゼ遺伝子(以下、ONBGL1遺伝子)の塩基配列情報を
取得することができた。
遺伝子を発現し、且つ、所定のオートファジー関連遺伝子の機能が低減したSaccharomyces cerevisiae変異株を作製した。すなわち、YP-ONBGL1株に上記Atg1遺伝子破壊断片、Atg4遺伝子破壊断片、Atg13遺伝子破壊断片又はAtg15遺伝子破壊断片を導入した5つの変異
株を作製し、それぞれΔATG1株、ΔATG4株、ΔATG13株及びΔATG15株と命名した。なおAtg遺伝子破壊断片が所望の位置にインテグレートされたか否かは、トリプトファン非含有
培地にて生育し、トリプトファン要求性が回復したことを指標として判断した。
子の発現量をタンパク質レベルで検証した。なお、前培養としては、YPD液体培養にて30
℃、120rpm及び24時間の培養条件とした。本培養としては、YPD-2%液体培養にて30℃、120rpm及び初発菌体量OD=1の培養条件とした。また、ONBGL1遺伝子の発現量は、β-グルコ
シダーゼにおけるPNPG活性を検討した。なおPNPG活性は、β-グルコシダーゼ活性の指標
である。すなわち、β-グルコシダーゼがPNPGを基質としてp-nitrophenolとD-glucoseを
生成するので、p-nitrophenol量を測定することでβ-グルコシダーゼ活性を検証することができる。具体的に、PNPG活性は以下の文献:S.Saitoh, T. Hasunuma, T. Tanaka, A. Kondo: Co-fermentation of cellobiose and xylose using beta-glucosidase displaying
diploid industrial yeast strain OC-2. Appl.Miclobiol. Biotechnol. (2010) 87:1975-1982記載の方法によった。結果を表2に示した。なお、表2に示した数値の単位は(U/DW-g)である。
オートファジー関連遺伝子の機能が低減した酵母変異株は、外来遺伝子の発現量が大幅に向上しているため、タンパク質の高収率な製造に有効であることが示された。
Claims (8)
- 目的タンパク質をコードする外来遺伝子を発現可能に導入し、且つ、オードファジーに関連する遺伝子の機能を低減させた酵母変異株。
- 機能を低減させる遺伝子は、オートファゴソームの形成に必須な因子又は液胞内においてオートファジックボディの崩壊に関与する因子をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項1記載の酵母変異株。
- 上記オートファゴソームの形成に必須な因子をコードする遺伝子は、以下(a)〜(c)のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項2記載の酵母変異株。
(a)Atg1キナーゼ複合体を構成するタンパク質
(b)Atg8又はAtg12が関与するユビキチン様結合反応系を構成するタンパク質
(c)PtdIns 3-キナーゼ複合体を構成するタンパク質 - 上記オートファゴソームの形成に必須な因子をコードする遺伝子は、Atg1遺伝子、Atg13遺伝子、Atg8遺伝子及びAtg4遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子であることを特徴と
する請求項2記載の酵母変異株。 - 上記液胞内においてオートファジックボディの崩壊に関与する因子はAtg15遺伝子であ
ることを特徴とする請求項2記載の酵母変異株。 - Saccharomyces属酵母であることを特徴とする請求項1記載の酵母変異株。
- 請求項1乃至6いずれか一項記載の酵母変異株を培養する工程と、目的タンパク質を回収する工程とを含むタンパク質の製造方法。
- 上記酵母変異株の培養上清から上記目的タンパク質を回収することを特徴とする請求項7記載のタンパク質の製造方法。
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JPN6014050065; EMBO J. vol.20, no.21, 2001, pp.5971-5981 * |
JPN6014050066; Yeast vol.21, no.12, 2004, pp.1057-1065 * |
JPN6014050069; Semin. Cell Dev. Biol. vol.21, no.7, 2010, pp.664-670 * |
Cited By (4)
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