SU1722502A1 - Препарат биоспорин дл профилактики и лечени желудочно-кишечных заболеваний человека - Google Patents

Abstract

Использование: медицина, дисбактери- озы, профилактика и лечение желудочно-кишечных заболеваний, вызванных патогенными и условно-патогенными микроорганизмами . Сущность изобретени : живые штаммы Bacillus Subtiiis ВКПМ № В- 2335 и Bacillus llchenlformis ВКПМ №В-233б с типичными свойствами смешивают в количестве соответственно 4-109-16-109 и 2-108-3 «109 кл/мл по 47 об.% каждого, довод т наполнителем до 100%. Препарат провер ют на безвредность и антагонистическую активность , определ ют фагоцитарную активность лейкоцитов и индукцию интерферона, Препарат испытан на люд х, 7 табл.

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии , а именно к препаратам дл  профилактики и лечени  дисбактериозов и других желудочно-кишечных заболеваний человека , вызванных патогенными и условно патогенными микроорганизмами.

Целью изобретени   вл етс  повышение эффективности профилактики и лечени  дисбактериозов и других желудочно-кишечных заболеваний человека.

Препарат биоспорин содержит в качестве живых микробных культур Bacillus subtllls 3 (ВКПМ № В-2335) и Bacillus- llchenlformls 31 (ВКПМ № В-2336) и наполнитель .

В качестве наполнител  препарат содержит предпочтительно сахарозу - желатиновую смесь.

Вход щие в состав препарата живые микробные культуры характеризуютс  следующими свойствами.

B.subtilis 3 (ВКПМ Ns В-2335) - грампо- ложительные аэробные спорообразующие палочки, продуцирующие каталазу. На сусло-агаре , среде Громыко, стрептомицетном агаре растут обильно, образу  матовые складчатые колонии телесного цвета с изрезанными кра ми, легко снимаютс  петлей.

В мазках из колоний, выросших на МЛА, через 18 ч обнаруживаютс  пр мые палочковидные клетки размером 2,7x0,8 мкм, расположенные одиночно или в виде цепочек. Клетки подвижны, образуют аэробно споры овальной формы, которые располагаютс  в клетке центрально. При спорообразовании клетки не раздуваютс . После роста на глю- козном агаре з протоплазме не обнаруживаютс  включени  поли-/3-оксимасл ной кис/юты. На МП Б культура образует пленку. Не растет в анаэробных услови х, не гидро- лизует мочзвину, не образует газ из нитратов в анаэробных услови х, не продуцирует

аргининдигидролазу. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, растет в присутствии 7% NaCI. Гидролизует крахмал и казеин, разжижает желатину, Ферментирует глюкозу, арабинозу, ксилозу, маннит с образованием кислоты без газа. Редуцирует нитраты, обеспечивает метиленовую синь. Не обладает коагулазной и лецитиназной активностью.

B.lfchenlformis 31 (ВКПМ № 8-2336) - грамположительные клетки, палочковидные , размером 2,5x0,6 мкм. Клетки подвижны , перитрихи, располагаютс , в основном, в виде цепочек. Споры овальной формы, располагаютс  в клетке центрально. Клетки при спорообразовании не раздуваютс . После роста на глюкозном агаре в протоплазме не обнаруживаютс  включени  поли- /3-оксимасл ной кислоты.

На МПА колонии с тусклой грубой по- . верхностыо, непрозрачные, плотно прикреплены к агару; нередко на поверхности обнаруживаетс  слизь. На МПБ образуетс  морщиниста  пленка, иногда с кремовым оттенком.

Культура образует каталазу, характеризуетс  способностью расти на агаре в анаэробных услови х. Даёт положительную реакцию Фогес-Проскаузра, растет при 7% NaCI. Гидролизует крахмал, казеин, не гид- ролизует мочевину. Желатин разжижает медленно. Ферментирует глюкозу, арабинозу , ксилозу, маннит с образованием кислоты без газа. Редуцирует нитраты, в анаэробных услови х из нитратов образует газ. Продуцирует аргининдигидролазу, Me обладает коагулазной и лецитиназной активностью .

Пример 1. Из штаммов В. subtilis 3 и B.llcheniformis 31 с типичными морфологи- ческими, культуральными, биохимическими свойствами приготовлены три варианта препарата биоспорин с различным содержанием микробных клеток в составе препарата .

Вариант,

Препарат, содержащий

следующие компоненты , об.%:

Биомасса В.subtilis

ВКПМ №В-2335 4 млрд.

живых микробных клеток

в 1 мл физиологического

раствора47

Биомасса B.llcheniformis

ВКПМ №В-2336 200 млн.

живых микробных клеток

в 1 мл физиологического

раствора47

НаполнительОстальное

до 100

Вариант II,

Препарат, содержащий

следующие компоненты, об.%:

Биомасса B.subtllls ВКПМ

№В-2335 10 млрд. живых

микробных клеток в 1 мл

физиологического раствора 47

Биомасса B.llcheniformis

ВКПМ №В-2336 1,6 млрд.

живых микробных клеток в

1 мл физиологического

раствора47

НаполнительОстальное

. до 100

Вариант 111.

Препарат, содержащий

следующие компоненты, об.%:

Биомасса B.slbtltls ВКПМ

NsB-2335 16 млрд. живых

микробных клеток в 1 мл

физиологического

раствора47

Биомасса B.llcheniformis

ВКПМ МгВ-2336 3 Млрд.

живых микробных клеток

в 1 мл физиологического

раствора47

НаполнительОстальное

до 100

Результаты испытани  вариантов препарата биоспорин НИ на безвредность и антагонистическую активность представлены в табл.1.

Как видно из представленных в табл. 1 данных, оптимальные количества живых микробных клеток в 1 мл составл ют дл  В.subtilis ВКПМ №В-2335 4-10 млрд и дл  B.llchenlformis ВКПМ NbB-2336200млн-1,6 млрд при их объемном соотношении 47% : 47%. Дальнейшее .увеличение количества микробных клеток не измен ет существенным образом специфическую активность препарата в отношении тест-культур микроорганизмов .

Пример 2. Эффективность препарата биоспорин, содержащее различные соотношени  культур В.subtilis 3 и B.Hchenlformls 31 оценена путем воздействи  их на Staph. aureus.

Результаты опытов представлены в табл.2.

Результаты табл. 2 также подтверждают , что наиболее оптимальным сочетанием культур В.subtilis ВКПМ NsB-2335 и B.llchenlformis ВКПМ №В-2336  вл етс  соотношение между ними соответственно 47% и 47%. При таком соотношении культур регистрируетс  наиболее быстрое и наиболее полное подавление стафилококка. Сходныв данные получены и при изучении воздействи  различных вариантов препарата биоспорин на патогенные дл  человека эше- рихии, сальмонеллы, шигеллы и другие болезнетворные микроорганизмы.

Пример 3. Культуры, нход щие в состав препарата биослорин, безвредны дл  лабораторных животных. Введение даже значительных доз препарата .не вызывает , гибели и патологических изменений у животных. Против.опоказаний к применению препарата нет.

Результаты исследовани  безвредности штаммов B.subtllis 3 и B.llchenlformls 31, вход щих в состав препарата биоспорин , представлены в табл . 3 и 4.

П р и м е р. 4. Антагонистическую активность биоспорина определ ют методом отсроченного антагонизма, Дл  этого содержимое ампулы раствор ют в 1 мл физиологического раствора, Полученную взвесь высевают штрихом по диаметру чашки Петри с агазированиой средой Гаузе №2 (или в центре чашки) петлей диаметром 3,5 мм. Посевы инкубируют в термостате при 37°С в течение 72 ч. Затем к выросшей ассоциации культур подсевают штрихом посевной материал тест-микроорганизмов (500-миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе). Учет результатов провод т через 18 ч инкубировани  при 37°С по величине зон отсутстви  роста тест-культур. Контролем роста тест-культур служит их параллельный посев на чашки с агаризованной средой Га- узе № 2 без исследуемой ассоциации культур .

Данные об антагонистической активности препарата биоспорин представлены в табл. А.

Пример 5. Определение фагоцитарной активности лейкоцитов животных провод т по Лабинской (1968).

Опыты провод т на кроликах массой 2,5-2,8 кг, которым ввод т перорально препарат на прот жении 10 дней. Пробы крови исследуют по фагоцитарной активности в различные сроки после пероральиого введени  препарата (до опыта, через 5 дней, 10 дней и 15 дней и через один мес ц).

Контрольным животным ввод т перо-, рально физиологический раствор или  ичный белок (200 мг).

Определение фагоцитарной активности лейкоцитов провод т в отношении различных текст-культур возбудителей желудочно- кишечных заболеваний человека.

Клинические наблюдени  за экспериментальными животными, проведенные и процессе пероральиого введени  препарата , а также на прот жении двух мес цев после окончани  введени  показывают: все животные остаютс  активными, полностью поедают пищевой рацион, физиологические 5 отправлени  у них не нарушаютс , поведение обычное, изменений со стороны шерстного покрова не отмечаетс .

При исследовании показателе фагоцитоза (по отношению к энтеропатогенным

0 штаммам E.coll и сальмонеллам) отмечаетс  существенное повышение афгоцитарной активности лейкоцитов кроликов, которым ввод т препарат перорально (табл.5).

Число фагоцитируемых клеток E.coli

5 увеличиваетс  почти вдвое, а число фагоцитируемых сальмонелл - в полтора раза. Фагоцитарна  активность лейкоцитов крови кроликов, получавших перорально препарат биоспорин, по отношению к разным бак0 тери м представлены в табл. 6.

Таким образом полученные данные свидетельствуют о том, что пероральное введение препарата вызывает существенное повышение фагоцитарной активности лей5 коцитов животных.

Пример 6, С целью проверки .индукции интерферона биоспорин ввод т через рот подопытным мышам весом 18-20 г. В контроле две группы по 30 животных. Одной

0 группе ввод т физиологический раствор, другой - вирус болезни Ньюкасла (2-10 БОЕ/мл). Через различные промежутки времени мышей декапитируют и собирают пул сывороток от 5-6 животных одной группы.

5 Сыворотки центрифугируют в течение 1 мин при 3000 об/мин, затем обрабатывают 0,1N HCI (довод  рН их до 2,2) и выдерживают 3 сут при температуре 4°С. Затем рН сывороток довод т с помощью 0,1N NaOH до нейт0 рального значени ..Эту операцию провод т с целью инактивации, индукторов интерферона , которые могут быть в сыворотке крови .

Дл  определени  интерферонной ак5 тивности.полученных сывороток их титруют на культуре мышиных клеток линии «против вируса индуктора -вируса везикул рного стоматита (штамм Индиана). С этой целью пробы раститрованных сывороток нанос т

0 на монослой клеток линиисг, выдерживают 18-20 ч при 37°С, затем отмывают их раствором Хенкса и ввод т 100 ТЦДбО вируса индикатора . Учет провод т через 24 ч. За титр интерферона принимают наибольшее раз5 ведение сыворотки, которое угнетает репродукцию вируса в культуре клеток.

Дл  подтверждени  интерферонной активности полученных сывороток их выдерживают на монослое клеток ав

присутствии антибиотика актиномицина Д, который используют в концентрации 5 мкг/мл в качестве ингибитора транскрипции . Затем в реакционную систему внос т вирус индикатора (100 ТЦДбо). Отсутствие антивирусного действи  сывороток свидетельствует об их интерферонной активности .

Результаты опыта представлены в табл.7.

Данные, представленные в табл. 7, свидетельствуют о том, что пероральное введение препарата биоспорин существенно индуцирует продукцию эндогенного интерферона .

Пример 7. Препарат биоспорин применен на люд х, показана его абсолютна  безвредность, хороша  переносимость и высока  эффективность.

Пациент В-в, 57 лет. Жалобы на частый .стул с примесью слизи, боли в животе. При обследовании отмечаетс  болезненность по ходу толстого кишечника. Диагноз - обострение хронического колита, дисбактериоз кишечника. Принимает биоспорин по 2 дозы 4 раза в день. Уже через несколько часов после применени  препарата отмечаетс  исчезновение тошноты, болей в животе. После 3 дней приема препарата состо ние хорошее , стул нормализовалс , живот м гкий, безболезненный. Таким образом препарат биоспорин оказывает выраженное лечебное действие, причем действие его наступает быстрее и значительно эффективнее, чем действие употребл емых пациентом ранее в подобных случа х препаратов (бисептола, фуразолидона и др.).

Claims (1)

1. Таким образом препарат биоспорин может быть использован дл  профилактики и лечени  дисбактериозов и других желудочно-кишечных заболеваний человека, вызванныхпатогеннымии 0 условно-патогенными микроорганизмами. Формула изобретени  Препарат биоспорин дл  профилактики и лечени  желудочно-кишечных заболеваний человека, содержащий живую культуру 5 штамма Bacillus Subtllls и наполнитель, о т- л и ч а ю щи и с   тем, что, с целью повышени  эффективности препарата за счет усилени  фагоцитарной активности крови и индукции интерферона, дополнительно со- 0 держит штамм Bacillus Ilchenlformls ВКПМ №В-2336 в количестве 2-10в-3-109 кл/мл. а в качестве культуры Bacillus Subtllls штамм Bacillus Subtllls ВКПМ NsB-2335 о количестве 4-109-16109 кл/мл при следующем соот- 5 ношении компонентов, об.%: Штамм Bacillus Subtills ВКПМ №8-2335 в количестве 4-103-16 109 кл/мл Штамм Bacillus llchenl- 0 form Is ВКПМ NsB-2336 в количестве 2«108-3-109 кл/мл Наполнитель

   47

   47 До

   100

   Таблица 1

   taблицa2

   и

   12

   1722502

   Таблица.

   Определение токсичности фильтратов и центрифугатов культур, выращенных на среде Гаузе W 2 при 37°С в течение

   8 сут

   12

   Примечание. Интервалы значений составл ли рт + 0,01 ,21.

   Таблицаб

   Таблица 7