CN106929460A - 大黄鱼白细胞介素17c2基因大肠杆菌表达产物及其制备方法与应用 - Google Patents

大黄鱼白细胞介素17c2基因大肠杆菌表达产物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

大黄鱼白细胞介素17C2基因大肠杆菌表达产物及其制备方法与应用，涉及白细胞介素17。大肠杆菌BL21/pET‑32a‑LCIL‑17C2已于2016年12月26日保藏。大黄鱼白细胞介素17C2基因大肠杆菌表达产物为分子量约34kDa的大黄鱼IL‑17C2重组蛋白。应用：1)可诱导大黄鱼外周血白细胞表达趋化因子、促炎因子及抗菌肽hepcidin等基因；2)参与调节对大黄鱼外周血白细胞的趋化作用，表明大黄鱼IL‑17C2重组蛋白具有明显的促进炎症反应及增强宿主抗细菌防御的功能；3)在制备水产免疫增强剂中应用。

Description

大黄鱼白细胞介素17C2基因大肠杆菌表达产物及其制备方法 与应用
技术领域
本发明涉及白细胞介素17，尤其是涉及大黄鱼白细胞介素17C2基因大肠杆菌表达产物及其制备方法与应用。
背景技术
白细胞介素17(Interleukin-17，IL-17)属于一类新的细胞因子家族，能够诱导促炎因子(如IL-6、G-CSF、TNF-α)、趋化因子(如CXCL1、CXCL2、CCL20等)，以及炎症效应因子(急性期蛋白、补体)等多种基因表达，在抗胞外细菌感染，炎症反应及自身免疫性疾病的发生和发展中发挥关键作用。IL-17对炎症反应过程中白细胞迁移也具有重要的协调作用(Iwakura,Y.,Ishigame,H.,Saijo,S.,Nakae,S.,2011,Functional Specialization ofInterleukin-17Family Members[J].Immunity 34,149-162)。IL-17家族现已发现6个成员，包括IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F，各个成员之间的序列相似性并不高，但是具有类似的蛋白结构，都含有四个保守的半胱氨酸残基以维系其三维构型(Gu,C.,Wu,L.,Li,X.,2013.IL-17family:cytokines,receptors and signaling[J].Cytokine64,477-485)。作为IL-17家族的一员，IL-17C主要参与宿主的黏膜免疫，可以诱导上皮细胞炎症反应，刺激促炎细胞因子，趋化因子及抗菌肽的表达(Song,X.,Zhu,S.,Shi,P.,Liu,Y.,Shi,Y.,Levin,S.D.,Qian,Y.,2011.IL-17RE is the functional receptor for IL-17C and mediates mucosal immunity to infection with intestinal pathogens[J].Nat.Immunol.12,1151-1158)。此外，IL-17C可诱导TNF-α和IL-1β在单核细胞系THP-1中表达，并促进诱导嗜中性粒细胞迁移(Iwakura,Y.,Ishigame,H.,Saijo,S.,Nakae,S.,2011,Functional Specialization of Interleukin-17Family Members[J].Immunity 34,149-162)。与哺乳动物不同，鱼类具有2个IL-17C的同源基因：IL-17C1和IL-17C2，二者序列相似性较高。鱼类IL-17C主要表达在黏膜相关组织中，在LPS诱导或细菌感染后表达量显著升高，表明IL-17C参与鱼类的抗细菌免疫反应(Kono,T.,Korenaga,H.,Sakai,M.,2011.Genomics of fish IL-17ligand and receptors:a review[J].Fish ShellfishImmunol.31,635-643.)。目前，在鱼类中还未展开对IL-17C功能的相关研究。
发明内容
本发明的目的之一在于提供大肠杆菌BL21/pET-32a-LCIL-17C2(Escherichiacoli BL21/pET-32a-LCIL-17C2)。
本发明的目的之二在于提供一种大黄鱼白细胞介素17C2基因大肠杆菌表达产物及其制备方法。
本发明的目的之三在于提供大黄鱼IL-17C2重组蛋白的应用。
所述大肠杆菌BL21/pET-32a-LCIL-17C2(Escherichia coli BL21/pET-32a-LCIL-17C2)已于2016年12月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016782，中国典型培养物保藏中心的地址为中国，武汉，武汉大学。
所述大黄鱼白细胞介素17C2基因大肠杆菌表达产物，为分子量约34kDa的大黄鱼IL-17C2重组蛋白。
所述大黄鱼白细胞介素17C2基因大肠杆菌表达产物的制备方法包括以下步骤：
1)克隆大黄鱼IL-17C2基因全长cDNA序列，再采用PCR技术扩增出编码第25～171位氨基酸的大黄鱼IL-17C2成熟肽基因片段；
2)将步骤1)得到的大黄鱼IL-17C2成熟肽基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET-32a，得到含大黄鱼IL-17C2成熟肽基因片段的重组表达载体pET-32a-LCIL-17C2；
3)将重组表达载体pET-32a-LCIL-17C2转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株，经氨苄青霉素筛选及测序鉴定后，获得含有大黄鱼IL-17C2成熟肽基因片段的大肠杆菌BL21/pET-32a-LCIL-17C2工程菌；同时，表达载体pET-32a转化大肠杆菌BL21菌株，获得的大肠杆菌BL21/pET-32a作为对照菌株；
4)大肠杆菌BL21/pET-32a-LCIL-17C2工程菌在LB培养基中经0.1mM IPTG诱导、37℃振荡培养4h，将培养物离心收集菌体，Buffer A重悬后，超声破碎，分别收集菌体裂解液上清和菌体裂解液沉淀，经聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE分析证明大黄鱼IL-17C2重组蛋白以包涵体形式表达；
在步骤4)中，所述LB培养基的配方为：10g/L蛋白胨、5g/L酵母抽提物、10g/L氯化钠；所述Buffer A的组成可为20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.5％Triton X-100和30mM咪唑，pH 7.9。
5)利用镍离子鳌合亲和层析介质(Ni-NTA)纯化该重组蛋白：离心收集大肠杆菌BL21/pET-32a-LCIL-17C2工程菌培养物中菌体，用包涵体洗涤液重悬菌体，第1次超声破碎，离心收集沉淀，再用包涵体裂解液重悬沉淀，第2次超声破碎，离心收集上清后上柱，4℃结合2h，用杂蛋白洗涤液洗柱，再用6M尿素洗柱，最后用变性蛋白洗脱液洗脱，获得大黄鱼IL-17C2重组蛋白，纯化后的大黄鱼IL-17C2重组蛋白分别经缓冲液1、缓冲液2和缓冲液3进行3步透析，即得到有活性的大黄鱼IL-17C2重组蛋白；所述缓冲液1的配方为：3M尿素、20mMTris-HCl、150mM NaCl、0.25M咪唑、0.1mM氧化型谷胱甘肽、0.5mM还原型谷胱甘肽、5％甘油和0.005％Tween 20；所述缓冲液2的配方为：1M尿素、20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.125M咪唑、0.1mM氧化型谷胱甘肽、0.5mM还原型谷胱甘肽、5％甘油和0.005％Tween 20；所述缓冲液3的配方为：20mM Tris-HCl、150mM NaCl和5％甘油。
在步骤5)中，所述包涵体洗涤液的配方可为：2M尿素、20mM Tris-HCl、150mMNaCl、1mM EDTA和0.5％Triton X-100，pH 7.9；所述第1次超声破碎的时间可为10min；所述包涵体裂解液的配方可为：8M尿素、20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.1％β‐巯基乙醇、0.2％Triton X-100和30mM咪唑，pH 7.9；第2次超声破碎的时间可为5min；所述杂蛋白洗涤液的配方可为：6M尿素、20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.1％β‐巯基乙醇和30mM咪唑，pH 6.0；所述变性蛋白洗脱液的配方可为：6M尿素、20mM Tris-HCl、150mM NaCl和0.5M咪唑，pH 4.5。
所述大黄鱼IL-17C2重组蛋白的应用之一在于其可诱导大黄鱼外周血白细胞表达趋化因子(CXCL8、CXCL12、CXCL13)、促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IFNg)及抗菌肽hepcidin等基因。
所述大黄鱼IL-17C2重组蛋白的应用之二在于其参与调节对大黄鱼外周血白细胞的趋化作用，表明大黄鱼IL-17C2重组蛋白具有明显的促进炎症反应及增强宿主抗细菌防御的功能，显示出其在水产免疫增强剂研发中的良好应用前景。
附图说明
图1为大黄鱼IL-17C2成熟肽基因片段PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳分析。在图1中，M泳道为DL1000DNA marker；1泳道为大黄鱼IL-17C2成熟肽基因片段的PCR扩增产物。
图2为纯化的大黄鱼IL-17C2重组蛋白的SDS-PAGE分析。在图2中，M泳道为蛋白质分子量标准；1泳道是纯化的Trx重组蛋白；2泳道是纯化的大黄鱼IL-17C2重组蛋白。箭头所指的是大黄鱼IL-17C2重组蛋白。
图3为大黄鱼IL-17C2重组蛋白对大黄鱼外周血白细胞中下游基因表达的调节作用。在图3中，A为趋化因子CXCL8，B为趋化因子CXCL12，C为趋化因子CXCL13；D为促炎因子TNF-α，E为促炎因子IL-1β，F为促炎因子IL-6；G为抗菌肽Hepcidin；H为促炎因子IFNg。
图4为大黄鱼IL-17C2重组蛋白参与促进对大黄鱼外周血白细胞的趋化作用。在图4中，标记a表示Trx重组蛋白处理的大黄鱼外周血白细胞培养基；b表示1L-17C2重组蛋白处理的大黄鱼外周血白细胞培养基；c表示Trx重组蛋白，d表示1L-17C2重组蛋白。取50ng/mL的大黄鱼IL-17C2重组蛋白处理大黄鱼外周血白细胞，再收集处理后的大黄鱼外周血白细胞培养基上清分析对大黄鱼外周血白细胞的趋化活性。对照蛋白是50ng/mL的Trx重组蛋白，用于检验大黄鱼IL-17C2重组蛋白对大黄鱼外周血白细胞趋化活性的特异性。*P<0.05，**P<0.01。
具体实施方式
一、大黄鱼IL-17C2基因cDNA的获得
通过对大黄鱼脾脏转录组文库分析，发现了部分大黄鱼IL-17C2cDNA序列，经过5’-RACE和3’-RACE PCR,获得了大黄鱼IL-17C2的全长cDNA，该序列全长897个核苷酸，编码一个由172个氨基酸组成的蛋白质。
所述大黄鱼IL-17C2基因cDNA及其推断的氨基酸序列如下：
其中，下划线部分为预测的大黄鱼IL-17C2信号肽；阴影部分表示IL-17保守结构域；方框标示保守的半胱氨酸残基；星号表示终止密码子。
二、含大黄鱼IL-17C2成熟肽基因的大肠杆菌BL21/pET-32a-LCIL-17C2工程菌的构建
1.含大黄鱼IL-17C2成熟肽基因的重组表达载体pET-32a-LCIL-17C2的构建
(1)大黄鱼IL-17C2成熟肽基因片段的PCR扩增：合成带有限制性核酸内切酶EcoRI位点的正向引物IL-17C2-F：CCGGAATTCTCATCTTGCTCAG和带有Xho I位点的反向引物IL-17C2-R：CCGCTCGAGCTTGGATGATATT；使用TAKARA公司的HS DNA Polymerase按照说明书进行PCR扩增，PCR体系为：
双蒸水补至50μL。
PCR程序如下：
PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件：电压120V，时间15min。使用凝胶成像仪观察，可见一条大小为450个核苷酸的条带(图1)，与预期相符，然后用Omega公司胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。
(2)酶切反应：回收的PCR扩增产物和大肠杆菌原核表达载体pET-32a分别进行限制性核酸内切酶EcoR I和Xho I双酶切，酶切反应体系：
10×酶切缓冲液 2μL
EcoR I 1μL
Xho I 1μL
载体1μg/PCR产物(400ng)
双蒸水补至20μL。
酶切条件：37℃反应3h。酶切产物使用Omega公司胶回收试剂盒进行回收。
(3)连接反应：使用TAKARA公司T4DNA连接酶连接双酶切后的PCR扩增产物和pET-32a载体，连接体系如下：
双蒸水补至10μL。
反应条件：16℃反应4h。
(4)连接产物转化Novogen公司大肠杆菌E.coli TOP10感受态细胞，经菌落PCR筛选阳性克隆，扩大培养后，使用Omega公司质粒小量提取试剂盒提取质粒，并测序验证，从而获得了含大黄鱼IL-17C2成熟肽基因片段的重组表达载体pET-32a-LCIL-17C2。
2.大肠杆菌BL21/pET-32a-LCIL-17C2工程菌的构建
将含有大黄鱼IL-17C2成熟肽基因片段的重组表达载体pET-32a-LCIL-17C2转化大肠杆菌BL21感受态细胞，将转化后的菌液涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃静置培养16h，长出单菌落，得到含有大黄鱼IL-17C2成熟肽基因的大肠杆菌BL21/pET-32a-LCIL-17C2工程菌。
培养基配方：
LB液体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母抽提物和10g/L氯化钠；
LB平板：10g/L蛋白胨、5g/L酵母抽提物、10g/L氯化钠和15g/L琼脂粉。
三、大黄鱼IL-17C2基因在大肠杆菌中表达及其表达产物纯化
1.大黄鱼IL-17C2重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE分析
将上述构建的大肠杆菌BL21/pET-32a-LCIL-17C2工程菌，挑取单菌落接种至5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，180r/min过夜振荡培养。第二天按1︰100比例接种于100mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基的中，37℃，180r/min振荡培养。待培养物OD600至0.4～0.5时，加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导蛋白表达，37℃继续振荡培养4h，将培养物离心，收集菌体。
用10mL Buffer A重悬收集的菌体，超声破碎10min，再将裂解液在4℃，12000r/min，离心20min，收集裂解液上清，并用10mL Buffer A重悬裂解液沉淀。菌体裂解液、菌体裂解液上清，菌体裂解液沉淀各取50μL，并加入等体积蛋白电泳上样缓冲液，沸水煮10min，然后进行浓度为15％的SDS-PAGE电泳。结果显示，对照菌株BL21/pET-32a的菌体裂解液中出现了一条约20kDa左右的蛋白条带，为空载体pET-32a所表达的重组蛋白Trx。而在大肠杆菌BL21/pET-32a-LCIL-17C2工程菌的菌体裂解液中则出现了一条约34kDa左右的蛋白条带，说明了大黄鱼IL-17C2重组蛋白在大肠杆菌中得到了表达，同时发现IL-17C2重组蛋白含量在菌体裂解液沉淀中显著多于菌体裂解液上清中，说明大黄鱼IL-17C2重组蛋白在大肠杆菌BL21/pET-32a-LCIL-17C2工程菌中主要以包涵体的形式表达。基于此，后续采用包涵体蛋白纯化方法对大黄鱼IL-17C2重组蛋白进行纯化。
Buffer A：20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.5％Triton X-100和30mM咪唑，pH 7.9。
2.亲和层析法纯化大黄鱼IL-17C2重组蛋白
参照Invitrogen公司镍离子鳌合亲和层析介质(Ni-NTA)推荐的方法进行重组蛋白的纯化：首先4℃，5000r/min离心10min收集100mL IPTG诱导后的大肠杆菌BL21/pET-32a-LCIL-17C2工程菌菌体，用10mL包涵体洗涤液重悬菌体，超声破碎10min，然后4℃，12000r/min，离心10min收集菌体裂解液沉淀，再用10mL包涵体裂解液重悬沉淀，超声破碎5min，18000r/min，4℃，离心20min离心收集包涵体上清备用。
先用1mL镍离子鳌合亲和层析介质装柱，用5倍柱体积双蒸水洗柱，再加入5倍柱体积包涵体裂解液平衡层析柱，液体流净后，步骤1)中收集的包涵体上清上柱，4℃孵育2h，然后用10mL杂蛋白洗涤液洗柱，重复洗10次，洗去未结合的蛋白，再用10mL 6M尿素洗柱，重复5次，最后用1mL变性蛋白洗脱液洗脱目的蛋白，重复收集5次。
包涵体洗涤液：2M尿素、20mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mM EDTA和0.5％Triton X-100，pH 7.9；
包涵体裂解液：8M尿素、20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.1％β‐巯基乙醇、0.2％Triton X-100和30mM咪唑，pH 7.9；
杂蛋白洗涤液：6M尿素、20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.1％β‐巯基乙醇和30mM咪唑，pH 6.0；
变性蛋白洗脱液：6M尿素、20mM Tris-HCl、150mM NaCl和0.5M咪唑，pH 4.5。
同时，通过相同的方法纯化Trx重组蛋白。
3.大黄鱼IL-17C2重组蛋白透析
纯化后大黄鱼IL-17C2重组蛋白用依次用缓冲液1、缓冲液2和缓冲液3透析，每步不低于4h。透析后，4℃，12000r/min离心30min去除沉淀，同时通过相同的方法透析Trx重组蛋白。取少量进行SDS-PAGE电泳分析，结果显示得到了纯度较高的大黄鱼IL-17C2重组蛋白(参见图2)，剩余的保存于-70℃备用。
透析缓冲液配方：
缓冲液1：3M尿素、20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.25M咪唑、0.1mM氧化型谷胱甘肽、0.5mM还原型谷胱甘肽、5％甘油和0.005％Tween 20；
缓冲液2：1M尿素、20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.125M咪唑、0.1mM氧化型谷胱甘肽、0.5mM还原型谷胱甘肽、5％甘油和0.005％Tween 20；
缓冲液3：20mM Tris-HCl、150mM NaCl和5％甘油。
四、大黄鱼IL-17C2重组蛋白对大黄鱼外周血白细胞中免疫基因的调节作用分析
(1)将大黄鱼外周血白细胞以1×106个/mL的细胞密度接种于6孔细胞培养板，每孔2mL Leibovitz's L15培养基(Gibico公司)，于25℃生化培养箱中过夜培养；
(2)细胞培养基中加入大黄鱼IL-17C2重组蛋白至终浓度为50ng/mL，分别于处理后6、12、24和48h收集细胞培养物，使用微量RNA提取试剂盒(SV total RNA IsolationSystem，Promega公司)提取细胞总RNA，并按照逆转录酶M-MLV(RNaseH-，Takara公司)说明书进行反转录PCR。同时，设置Trx重组蛋白处理的细胞为阴性对照组。
(3)通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测趋化因子(CXCL8、CXCL12、CXCL13)、促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IFNg)及抗菌肽hepcidin在大黄鱼外周血白细胞中的表达水平。Real-time PCR于Mastercycler ep gradient realplex4荧光定量PCR仪(Eppendorf公司)进行反应，条件如下：95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火15s，72℃延伸15s并获取荧光，40个循环。以β-actin作为内参基因。各基因引物如表1所示。实验结果采用2-ΔΔCT法进行分析。结果显示大黄鱼IL-17C2重组蛋白可显著上调大黄鱼外周血白细胞中趋化因子(CXCL8、CXCL12、CXCL13)、促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IFNg)及抗菌肽hepcidin等基因的表达，上述基因的表达量约上升了10～30倍。
大黄鱼IL-17C2重组蛋白对大黄鱼外周血白细胞中下游基因表达的调节作用参见图3，50ng/mL的大黄鱼IL-17C2重组蛋白处理大黄鱼外周血白细胞6、12、24和48h后，收集处理细胞并利用Real-time PCR检测其中趋化因子(CXCL8、CXCL12、CXCL13)、促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IFNg)及抗菌肽hepcidin的基因变化水平。对照蛋白为50ng/mL的Trx重组蛋白。以大黄鱼β-actin基因为内参，标准化上述基因的相对表达量。上述基因的倍数变化为大黄鱼IL-17C2重组蛋白处理外周血白细胞中标准化的基因相对表达量除以Trx重组蛋白处理细胞中标准化的基因相对表达量。
五、大黄鱼IL-17C2重组蛋白参与调节大黄鱼外周血白细胞的趋化作用
参照Transwell法(Harun N.O.,Zou J.,Zhang Y.A.,Nie P.,Secombes C.J.,2008.The biological effects of rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)recombinantIL-8[J].Dev.Comp.Immunol.32,673-681)对大黄鱼IL-17C2重组蛋白体外趋化活性进行分析：
表1 Real-time PCR实验所需引物序列
(1)将大黄鱼外周血白细胞以1×106个/mL的细胞密度接种于6孔细胞培养板，每孔2mL L15培养基，于25℃生化培养箱过夜培养；
(2)将所获得的大黄鱼IL-17C2重组蛋白经过0.22μm滤膜过滤除菌后，加入细胞培养基中至终浓度为50ng/mL，于处理后24h收集细胞培养基，并以600g离心力于4℃离心10min，取上清；
(3)将离心后的培养基上清液加入到Corning公司的Transwell下层小室中，每孔500μL。对照为500μL的Trx重组蛋白处理的大黄鱼外周血白细胞培养基，以及含50ng/mL的大黄鱼IL-17C2重组蛋白或Trx重组蛋白的L15培养基。每组设置3个平行样。然后向Transwell上层小室加入分离的大黄鱼外周血白细胞100μL(细胞数量约为105个)，将Transwell板置于25℃培养箱中培养4h，收集下层小室中的细胞，计数。结果显示大黄鱼IL-17C2重组蛋白处理的外周血白细胞培养基对大黄鱼白细胞具有明显的趋化活性，趋化的大黄鱼白细胞数约为2.5×104个。而大黄鱼IL-17C2重组蛋白对大黄鱼白细胞则无明显的趋化活性(图4)，表明大黄鱼IL-17C2参与增强对大黄鱼白细胞的趋化作用。
序列表
<110>国家海洋局第三海洋研究所
<120>大黄鱼白细胞介素17C2基因大肠杆菌表达产物及其制备方法与应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 897
<212> DNA
<213>大黄鱼< Larimichthys crocea>
<400> 1
taaaggaaat agatgaagcg ttttcattag ctccccctgc gtggtttcat atatgttctg 60
tatatatata tataaatcca atggagatgc tggtctcact tcaacgcgtc cggattcagg 120
atggcattgg tcagtctgca aacgatcttc ctcggatcga tgttgatctt caacgaccac 180
acttcatcat catcatcttg ctcagctgct gctgtcccat ccggttgcat gagcgaggat 240
gatctcagga ttcgtggtga aacgtttgag gcgaaataca aggacaggac acgtgacctc 300
ggacagaagg acacgaggga gacctgcgag caggcggcga agaacctgag cggagggatg 360
aacacgcgct cctcgtcccc gtggaggtac aggctaaacc gagaagacga caggttccct 420
cgtgacatct tcttcgccga gtgcgtttgc gacggctgca tcattgatgg tcacaaaatc 480
gacttgaact acaactctgt gcgtgtgaat gcttcactca tggtcctgag gaagatctct 540
tgtccaggtt accacgacaa atataaagta aggaaggaga ttatcagcgt ccccgtggcc 600
tgcacctgtg tcatgccgaa agtaatatca tccaagtaac tgtcgtaaac atgtgctgac 660
gtgtgattgg ggttgcattt atctatccag gtgatcagtt atgtgtttgt gcaatttgag 720
cagagatttt tctcttaatc actgatttta gaaatgttta ttttgtcagt ttcgctccac 780
agagagtcaa agtgaaacca gaacttttgg gttcagttcc aaaagtaagt tttatgtcag 840
tctgtcgacc aatttagtcc aataaactat tagatagatt gctgtgaaaa aaaaaaa 897

Claims (10)

1.大肠杆菌BL21/pET-32a-LCIL-17C2(Escherichia coli BL21/pET-32a-LCIL-17C2)，已于2016年12月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016782。
2.大黄鱼白细胞介素17C2基因大肠杆菌表达产物，其特征在于为分子量约34kDa的大黄鱼IL-17C2重组蛋白。
3.如权利要求2所述大黄鱼白细胞介素17C2基因大肠杆菌表达产物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)克隆大黄鱼IL-17C2基因全长cDNA序列，再采用PCR技术扩增出编码第25～171位氨基酸的大黄鱼IL-17C2成熟肽基因片段；
2)将步骤1)得到的大黄鱼IL-17C2成熟肽基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET-32a，得到含大黄鱼IL-17C2成熟肽基因片段的重组表达载体pET-32a-LCIL-17C2；
3)将重组表达载体pET-32a-LCIL-17C2转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株，经氨苄青霉素筛选及测序鉴定后，获得含有大黄鱼IL-17C2成熟肽基因片段的大肠杆菌BL21/pET-32a-LCIL-17C2工程菌；同时，表达载体pET-32a转化大肠杆菌BL21菌株，获得的大肠杆菌BL21/pET-32a作为对照菌株；
4)大肠杆菌BL21/pET-32a-LCIL-17C2工程菌在LB培养基中经0.1mM IPTG诱导、37℃振荡培养4h，将培养物离心收集菌体，Buffer A重悬后，超声破碎，分别收集菌体裂解液上清和菌体裂解液沉淀，经聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE分析证明大黄鱼IL-17C2重组蛋白以包涵体形式表达；
5)利用镍离子鳌合亲和层析介质纯化该重组蛋白：离心收集大肠杆菌BL21/pET-32a-LCIL-17C2工程菌培养物中菌体，用包涵体洗涤液重悬菌体，第1次超声破碎，离心收集沉淀，再用包涵体裂解液重悬沉淀，第2次超声破碎，离心收集上清后上柱，4℃结合2h，用杂蛋白洗涤液洗柱，再用6M尿素洗柱，最后用变性蛋白洗脱液洗脱，获得大黄鱼IL-17C2重组蛋白，纯化后的大黄鱼IL-17C2重组蛋白分别经缓冲液1、缓冲液2和缓冲液3进行3步透析，即得到有活性的大黄鱼IL-17C2重组蛋白；所述缓冲液1的配方为：3M尿素、20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.25M咪唑、0.1mM氧化型谷胱甘肽、0.5mM还原型谷胱甘肽、5％甘油和0.005％Tween 20；所述缓冲液2的配方为：1M尿素、20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.125M咪唑、0.1mM氧化型谷胱甘肽、0.5mM还原型谷胱甘肽、5％甘油和0.005％Tween 20；所述缓冲液3的配方为：20mM Tris-HCl、150mM NaCl和5％甘油。
4.如权利要求3所述大黄鱼白细胞介素17C2基因大肠杆菌表达产物的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述LB培养基的配方为：10g/L蛋白胨、5g/L酵母抽提物、10g/L氯化钠。
5.如权利要求3所述大黄鱼白细胞介素17C2基因大肠杆菌表达产物的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述Buffer A的组成为20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.5％Triton X-100和30mM咪唑，pH 7.9。
6.如权利要求3所述大黄鱼白细胞介素17C2基因大肠杆菌表达产物的制备方法，其特征在于在步骤5)中，所述包涵体洗涤液的配方为：2M尿素、20mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mMEDTA和0.5％Triton X-100，pH 7.9；所述第1次超声破碎的时间可为10min。
7.如权利要求3所述大黄鱼白细胞介素17C2基因大肠杆菌表达产物的制备方法，其特征在于在步骤5)中，所述包涵体裂解液的配方为：8M尿素、20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.1％β‐巯基乙醇、0.2％Triton X-100和30mM咪唑，pH 7.9；第2次超声破碎的时间可为5min。
8.如权利要求3所述大黄鱼白细胞介素17C2基因大肠杆菌表达产物的制备方法，其特征在于在步骤5)中，所述杂蛋白洗涤液的配方为：6M尿素、20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.1％β‐巯基乙醇和30mM咪唑，pH 6.0。
9.如权利要求3所述大黄鱼白细胞介素17C2基因大肠杆菌表达产物的制备方法，其特征在于在步骤5)中，所述变性蛋白洗脱液的配方为：6M尿素、20mM Tris-HCl、150mM NaCl和0.5M咪唑，pH 4.5。
10.大黄鱼IL-17C2重组蛋白的应用，其特征在于所述大黄鱼IL-17C2重组蛋白诱导大黄鱼外周血白细胞表达趋化因子、促炎因子及抗菌肽hepcidin基因，所述趋化因子包括CXCL8、CXCL12、CXCL13；所述促炎因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IFNg；
所述大黄鱼IL-17C2重组蛋白参与调节对大黄鱼外周血白细胞的趋化作用，表明大黄鱼IL-17C2重组蛋白具有明显的促进炎症反应及增强宿主抗细菌防御的功能；
所述大黄鱼IL-17C2重组蛋白在制备水产免疫增强剂中应用。
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