ES2813551T3

ES2813551T3 - Nuevas isoformas de tripsina y su uso

Info

Publication number: ES2813551T3
Application number: ES16745663T
Authority: ES
Inventors: Agusta Gudmundsdottir; Asgeir Asgeirsson; Bjarki Stefansson
Original assignee: Enzymatica AB
Current assignee: Enzymatica AB
Priority date: 2015-07-24
Filing date: 2016-07-22
Publication date: 2021-03-24
Anticipated expiration: 2036-07-22
Also published as: CN113846079A; US11918674B2; EP3736331A1; DK181080B1; JP7116823B2; EP3325618A1; JP6869979B2; AU2016299760A1; JP2018520707A; RU2020142400A; PT3325618T; PL3325618T3; JP2021106603A; RU2739945C2; RS60711B1; DK201870049A1; DK202070808A1; HRP20201290T1; BR112018001404A2; US20200197288A1

Abstract

Una isoforma de tripsina ZT de bacalao aislada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevas isoformas de tripsina y su uso

Campo de la invención

La invención se refiere a las nuevas isoformas de tripsina ZT. En particular, la invención se refiere al uso de isoformas de tripsina ZT en dispositivos médicos, productos farmacéuticos y cosméticos.

Antecedentes de la invención

Las proteinasas son enzimas que se definen por su capacidad para escindir proteínas. Las proteinasas pueden escindir sustratos en diferentes restos amino dentro de una secuencia proteica, lo que demuestra una diferencia en la especificidad del sustrato. Las tripsinas son proteinasas y se especifican en parte por su preferencia en la escisión C-terminal en restos de arginina o lisina (Olsen, Ong et al., 2004, Mol Cell Proteomics 3: 608-614). El método de perfilado múltiple de sustratos revela sitios de escisión de proteinasas y revela la importancia fundamental de los restos que rodean su sitio de escisión para su especificidad (O'Donoghue, Eroy-Reveles et al., 2012, Nat Methods 9: 1095-1100).

Los documentos de Patente de Estados Unidos N.os 4.801.451 y 4.963.491 desvelan una mezcla de exo- y endopeptidasas aisladas de krill del Antártico (Euphasia superba) y el uso de esta mezcla como solución de limpieza. El documento de patente 4.801.451 desvela el uso de tales enzimas para eliminar materia extraña y tejido muerto de heridas. El documento WO 85/04809 desvela el uso de enzimas de krill como agente promotor de la digestión. El documento EP-A1-0170115 desvela el uso de enzimas de krill para disolver coágulos de sangre. Sin embargo, todas estas referencias desvelan materiales impuros o mal caracterizados. Una peptidasa purificada o mezcla de peptidasas purificadas es deseable para proporcionar un producto farmacéuticamente útil.

El documento WO 96/24371 desvela el uso de una enzima proteolítica multifuncional obtenida a partir de krill y una familia de enzimas proteolíticas obtenidas a partir de crustáceos y peces que tienen similitud estructural con la enzima multifuncional obtenida a partir de krill del Antártico. El documento también se refiere a métodos para purificar la enzima multifuncional y a usos farmacéuticos, cosméticos y de otro tipo de la enzima multifuncional. En ese documento se define que la similitud estructural con la enzima multifuncional obtenida a partir de krill del Antártico tiene una homología de al menos un 70 % con la hidrolasa multifuncional obtenida a partir de krill.

El documento WO 2000078332 desvela el uso de tripsinas y quimotripsinas obtenidas a partir de bacalao en composiciones farmacéuticas o medicamentos para aplicación local y tópica para tratar enfermedades y trastornos internos y el uso cosmético de tales enzimas. Se encontró que el uso tópico para el tratamiento de trastornos internos locales, sin que la enzima tuviera que penetrar a través de heridas abiertas o tejido mucoso, era eficaz. Las serina proteinasas desveladas en el documento WO 2000078332 son proteinasas que tienen una homología de secuencia de aminoácidos de al menos un 90 % con tripsina I, tripsina II, tripsina III, tripsina IV obtenidas a partir de bacalao del Atlántico y proteinasas que son quimotripsina que tienen una homología de secuencia de aminoácidos de al menos un 90 % con cualquiera de quimotripsina A y quimotripsina B aisladas de bacalao del Atlántico.

Un ADN complementario (ADNc) que codifica la tripsina Y se aisló de una biblioteca de ADNc de bacalao del Atlántico (Spilliaert y Gudmundsdottir, 1999, Mar Biotechnol (NY) 1: 598-607). La tripsina Y de bacalao tiene una identidad de aproximadamente un 45 % con las dos tripsinas, I y X, de bacalao del Atlántico (documento WO 2000078332). Con anterioridad, la tripsina Y nativa y las formas recombinantes de tripsina Y se han descrito brevemente (Palsdottir y Gudmundsdottir, 2007, Protein Expr Purif 51: 243-252, Palsdottir y Gudmundsdottir, 2008, Food Chemistry 111: 408-414).

Sumario de la invención

La presente invención proporciona nuevas isoformas de tripsina, denominadas isoformas de tripsina ZT. Tales isoformas se pueden obtener a partir de pescado, tal como bacalao del Atlántico, o se pueden obtener en forma recombinante usando sistemas de expresión de proteínas. La presente invención además proporciona composiciones que comprenden al menos una isoforma de tripsina Zt de bacalao aislada de acuerdo con la invención, junto con excipientes y vehículos adecuados.

Los inventores han identificado características inesperadas, beneficiosas y únicas de las nuevas isoformas de tripsina ZT con respecto a las tripsinas conocidas previamente. Estas características proporcionan una ventaja con el uso de isoformas de tripsina ZT para diversas aplicaciones en dispositivos médicos, productos farmacéuticos y cosméticos. La presente invención proporciona dichas isoformas de tripsina ZT per se y su uso para tratar o prevenir enfermedades causadas por organismos patógenos. Esto es particularmente relevante para uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad del tracto respiratorio superior causada por microorganismos patógenos. Para ese fin, las isoformas de tripsina ZT se pueden usar, por ejemplo, en dispositivos médicos o como principio o principios activos en un producto farmacéutico. Además, la presente invención proporciona dichas isoformas de tripsina ZT para uso para el tratamiento de infecciones por heridas y heridas de quemaduras, para uso para eliminar la piel muerta o descamada de piel de otro modo sana por ejemplo, en un dispositivo médico, como un producto farmacéutico o como un cosmético. La presente invención además proporciona métodos para preparar las isoformas de tripsina ZT de bacalao de la presente invención.

• Basándose en el perfilado múltiple de sustratos, las isoformas de tripsina ZT prefieren la escisión en restos de Arg en comparación con la tripsina I. La tripsina I prefiere la escisión en restos de Lys en comparación con las isoformas de tripsina ZT.

• El perfilado múltiple de sustratos muestra que diferentes restos de aminoácido en el sustrato que rodea el sitio de escisión tienen un gran efecto en la escisión (aproximadamente cuatro restos de aminoácido en el lado N terminal y aproximadamente cuatro restos de aminoácido en el lado C terminal). Las isoformas de tripsina ZT prefieren ciertos restos de aminoácido que rodean el sitio de escisión con respecto a la tripsina I.

• Las secuencias de aminoácidos ricas en arginina y lisina se encuentran con frecuencia en secuencias virales, bacterianas y parasitarias que están asociadas con la infección.

• Los valores numéricos basados en la relación (datos del perfilado múltiple de sustratos) de puntuaciones (puntuación Z) estándar muestran que las isoformas de tripsina ZT son mucho más adecuadas para escindir péptidos que contienen varios restos de aminoácidos básicos consecutivos (Arg y Lys) en comparación con la tripsina I. Basándose en los datos, las isoformas de tripsina ZT pueden actuar como agentes antimicrobianos frente a virus y bacterias y se pueden escindir en restos de aminoácidos básicos agrupados tales como lisina y arginina.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona nuevas isoformas de tripsina, denominadas isoformas de tripsina ZT. Tales isoformas se pueden obtener a partir de pescado, tal como el bacalao del Atlántico, o se pueden obtener en forma recombinante usando sistemas de expresión de proteínas. La presente invención se refiere al uso de tales isoformas de tripsina ZT para el tratamiento y la prevención de enfermedades y en el campo cosmético. En particular, la invención se refiere a las nuevas isoformas de tripsina ZT de bacalao del Atlántico, útiles como productos farmacéuticos, en dispositivos médicos, y en cosméticos.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 muestra el aislamiento de isoformas de tripsina ZT con cromatografía de intercambio aniónico. El cromatograma de una separación en MonoQ de isoformas de tripsina de bacalao purificadas con benzamidina muestra la absorbancia a 280 nm con respecto al volumen de elución. Las isoformas de tripsina de bacalao se cargaron en una columna MonoQ y las proteínas eluyeron con un gradiente salino (línea discontinua). La flecha muestra el pico que contiene las isoformas de tripsina ZT. La columna se equilibró con un tampón (Tris 20 mM, CaCI²10 mM, pH 8,0), y las enzimas eluyeron con un gradiente lineal de NaCI 0-150 mM en 40 volúmenes de columna, NaCI 150-620 mM lineal en 6 volúmenes de columna, NaCI 620-850 mM en 10 volúmenes de columna a un caudal de 1 ml/min.

La FIG. 2 muestra SDS-PAGE de isoformas de tripsina ZT de bacalao. Análisis SDS-PAGE del pico de cromatografía de intercambio aniónico de tripsina ZT marcada de la Figura 1. La tripsina 1, la tripsina 5 y la tripsina 7 son isoformas aisladas de tripsina X de bacalao. La tripsina X de bacalao está muy relacionada con la tripsina I de bacalao, se diferencian en aproximadamente ocho restos de aminoácido. Las proteínas se resolvieron mediante SDS-PAGE y el gel se tiñó con plata. Las barras y números en la parte izquierda muestran la migración y el peso molecular en kDa de proteínas estándar (Dalton Mark Vll-L) separadas en el gel.

La FIG. 3 muestra el análisis de transferencia de Western de la tripsina X de bacalao (tripsina 1, tripsina 5 y tripsina 7) e isoformas de tripsina ZT. La tripsina X de bacalao y las isoformas de tripsina ZT se sometieron a SDS-PAGE. Después de la transferencia, se hizo una inmunotransferencia de las muestras con tripsina l/X (panel superior) y anticuerpos que reaccionan con la isoforma de tripsina ZT (panel inferior). Esto muestra que las isoformas de tripsina ZT se separaron de la tripsina l/X usando intercambio aniónico. Como se puede observar en la FIG. 3, el anticuerpo policlonal que reacciona frente a las isoformas de tripsina ZT no presenta reacción cruzada con la tripsina l/X y el anticuerpo peptídico generado contra la tripsina l/X no presenta reacción cruzada con las isoformas de tripsina ZT.

La FIG. 4 muestra un diagrama de Venn que ilustra escisiones compartidas y únicas generadas por la tripsina ZT y la tripsina I en tres momentos diferentes en un análisis del perfilado múltiple de sustratos. Número de sitios de escisión compartidos (color negro) y únicos con la tripsina ZT (color blanco en la parte izquierda) y con la tripsina I (color blanco en la parte derecha) después de incubación durante 5 min. (A), 15 min. (B) y 60 min (C). La figura muestra que, en todos los momentos, hay sitios de escisión compartidos y sitios de escisión únicos para la tripsina ZT y la tripsina I en los 124 péptidos definidos (cada uno conteniendo 14 restos de aminoácido) dentro de la biblioteca. Los datos demuestran que la especificidad hacia el substrato de la tripsina ZT es diferente al de la tripsina I.

La FIG. 5 muestra la actividad antiviral de la tripsina ZT contra enterovirus (virus Coxsackie B2). El eje Y muestra el porcentaje de pocillos infectados en comparación con el control y el eje X muestra el tratamiento con el control (barra en la parte izquierda) y el tratamiento con las isoformas de tripsina ZT (barra en la parte derecha).

Los inventores han identificado nuevas isoformas de tripsina denominadas isoformas de tripsina ZT. La tripsina ZT incluye al menos una de las siguientes isoformas: isoforma de tripsina ZT-1 de bacalao del Atlántico, isoforma de tripsina ZT-2 de bacalao del Atlántico, isoforma de tripsina ZT-3 de bacalao del Atlántico e isoforma de tripsina ZT-4 de bacalao del Atlántico. Las cuatro isoformas de tripsina ZT de bacalao del Atlántico tienen una masa molecular similar de aproximadamente 25 kDa. Las isoformas de tripsina ZT de bacalao del Atlántico de la presente invención se representan mediante las siguientes secuencias de aminoácidos:

SEQ ID NO: 1

IX1GGX2X3CEPX4SRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQW VLSVAHCW YNPYYM QVMLGEHDL

RVFEGTEQLVKTNTIFW HEX5YDYQTLDYDM M M IKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGM LC

SVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEX6VX7CX8AX9YPGMISPRMX10CX11GX12MDGG

RDX^CNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGXuGCAX^PNXiePGVYVKVYEXiyLSWIQTTLDANP en la que

X^Ise selecciona entre I y V;

X²se selecciona entre Q y H;

X³se selecciona entre D y E;

X⁴se selecciona entre R y N;

X⁵es L;

X6 se selecciona entre T y P;

X⁷se selecciona entre D y A;

X8 se selecciona entre E y Q;

X⁹se selecciona entre A y S;

X¹⁰se selecciona entre V y M;

X^{I I}se selecciona entre A y V;

X¹²se selecciona entre Y y F;

X¹³se selecciona entre A y V;

X¹⁴se selecciona entre Q y R;

X¹⁵se selecciona entre L y E;

X¹⁶se selecciona entre Y y S; y

X¹⁷se selecciona entre Y y F.

SEQ ID NO: 2 Isoforma de tripsina ZT-1 de bacalao del Atlántico

IVGGHECEPNSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRV

FEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSV

SGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPRMMCVGFMDGGRDVCNG

DS GSPLVCEGVLTGLVSW GRGC AEPNSPGVYVKVYEFLSWIQTTLDANP

SEQ ID NO: 3 Isoforma de tripsina ZT-2 de bacalao del Atlántico

IVGGHECEPNSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRV

FEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSV

SGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPRMVCAGYMDGGRDACNGD

S GSPLVCEGVLTGLVSW GQGC ALPNYPGVYVKVYEYLSWIQTTLDANP

SEQ ID NO: 4 Isoforma de tripsina ZT-3 de bacalao del Atlántico

IIGGQDCEPRSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVF

EGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVS

GWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPRMMCVGFMDGGRDVCNGD

S GSPLVCEGVLTGLVSW GRGCAEPNSPGVYV KVYE FLSWIQTTLDAN P

SEQ ID NO: 5 Isoforma de tripsina ZT-4 de bacalao del Atlántico

IIGGQDCEPRSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQVWLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVF

EGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVS

GWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPRMVCAGYMDGGRDACNGDS

GSPLVCEGVLTGLVSW GQ GC ALPNYPGVYVKVYEYLSWIQTTLDANP

Las isoformas de tripsina ZT de la presente intervención tienen menos de un 50 % de identidad de aminoácido con las tripsinas desveladas en el documento WO 2000078332 y menos de un 45 % de homología con las quimotripsinas desveladas en el documento WO 2000078332.

Las isoformas de tripsina ZT mencionadas anteriormente representan las variantes activas de estas tripsinas, es decir, variantes que se han activado cuando el extremo N terminal de las tripsinas se ha eliminado por escisión. Estas tripsinas son proteínas expresadas en el ciego pilórico (tejido pancreático en pescado) con un número de aminoácidos en el extremo N terminal que es importante para la secreción fuera de las células y para mantener la enzima inactiva. En el presente documento las isoformas de tripsina ZT de longitud completa también se desvelan como

SEQ ID NO: 19 Isoforma de tripsina ZT-1 de bacalao del Atlántico sin escindir

MIGLALLMLLGAAAAAVPRDVGKIVGGHECEPNSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSV

AHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEV

TQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEPVACQASYPGM

ISPRM M CVGFM DGGRDVCNGDSGSPLVCEGVLTGLVSW GRGCAEPNSPGVYVKVYEFLS

Wl QTTLDAN P

SEQ ID NO: 20 Isoforma de tripsina ZT-2 de bacalao del Atlántico sin escindir

MIGLALLMLLGAAAAAVPRDVGKIVGGHECEPNSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSV

AHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEV

TQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVETVDCEAAYPGMI

SPRM VCAGYM DGGRDACNGDSGSPLVCEGVLTGLVSW GQGCALPNYPGVYVKVYEYLS

WIQTTLDANP

SEQ ID NO: 21 Isoforma de tripsina ZT-3 de bacalao del Atlántico sin escindir

MIGLALLMLLGAAAAVPREDGRIIGGQDCEPRSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVA

HCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVT

QSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEPVACQASYPGMI

SPRM M CVGFM DGGRDVCNGDSGSPLVCEGVLTGLVSW GRGCAEPNSPGVYVKVYEFLS

WIQTTLDANP

SEQ ID NO: 22 Isoforma de tripsina ZT-4 de bacalao del Atlántico sin escindir

MIGLALLMLLGAAAAVPREDGRIIGGQDCEPRSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVA

HCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVT

QSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVETVDCEAAYPGMI

SPRM VCAGYM DGGRDACNGDSGSPLVCEGVLTGLVSW GQGCALPNYPGVYVKVYEYLS

WIQTTLDANP

El perfilado múltiple de sustratos se usa para analizar la especificidad de enzimas (proteinasas) hacia el sustrato (O'Donoghue, Eroy-Reveles et al., 2012, Nat Methods 9: 1095-1100). Las proteinasas pueden escindir los sustratos en diferentes restos amino dentro de una secuencia peptídica, lo que demuestra una diferencia en la especificidad del sustrato. Las tripsinas se especifican por su preferencia hacia la escisión C-terminal en restos de arginina o lisina. De forma inesperada, el perfilado múltiple de sustratos en las isoformas de tripsina ZT reveló que los aminoácidos que rodean a la arginina o a la lisina en un sustrato tienen un efecto diferente en su escisión en comparación con la tripsina I. En resumen, se incubaron isoformas de tripsina ZT o de tripsina I (5, 15 y 60 min) con una biblioteca peptídica (124 péptidos definidos, secuencias de 14 meros, total de 1612 enlaces peptídicos) con una amplia diversidad fisicoquímica (O'Donoghue, Eroy-Reveles et al., 2012, Nat Methods 9: 1095-1100). Después de la incubación, los sitios de escisión se identificaron mediante análisis de espectrometría de masas. Los resultados se presentan en los siguientes ejemplos y muestran que existen numerosos sitios de escisión únicos para la tripsina ZT en comparación con la tripsina I. Además, los sitios de escisión que mostraban una escisión preferente se identificaron mediante isoformas de tripsina ZT en comparación con la tripsina I. Además, las nuevas isoformas de tripsina ZT tienen una especificidad hacia el sustrato diferente en comparación con una tripsina I, que se desvela en el documento WO 2000078332. Estos hallazgos fueron inesperados. Basándose en los resultados del análisis del perfilado múltiple de sustratos, se generó una tabla que contenía valores numéricos basados en la relación de puntuaciones estándar (puntuación Z) en las posiciones P4-P4' en el sustrato donde la especificidad de la tripsina ZT hacia el sustrato se comparó con la de la tripsina I. Los valores positivos (puntuación Z) reflejan una preferencia por el resto de aminoácido en una determinada posición P a favor de las isoformas de tripsina ZT en comparación con la tripsina I.

Las isoformas de tripsina ZT tienen propiedades antimicrobianas específicas. Basándose en los valores generados y presentados en los ejemplos, se puede observar que las isoformas de tripsina ZT son mucho más adecuadas para la escisión de péptidos que contienen varios restos consecutivos con carga positiva (arginina o lisina) en comparación con la tripsina I. Esos tipos de secuencias (secuencia de aminoácidos rica en lisina y arginina) se encuentran con frecuencia en proteínas virales (Suzuki, Orba et al., 2010, PLoS Pathog 6: e1000801, Jiang, Cun et al., 2012, J Virol 86: 7256-7267, Gallaher y Garry, 2015, Viruses 7: 285-305).

Las viroporinas son un grupo de proteínas que interactúan con las membranas plasmáticas modificando la permeabilidad y pueden favorecer la liberación de partículas virales. Los restos de lisina y/o arginina agrupados son importantes para la actividad de las viroporinas. Basándose en el análisis del perfilado múltiple de sustratos, las isoformas de tripsina ZT pueden actuar como agentes antivirales contra virus de ARN ya que pueden escindir estos restos de aminoácidos básicos agrupados. Se ha descrito que las viroporinas están presentes en una serie de familias de virus, incluyendo Flaviviridae, Picornaviridae, Retroviridae, Coronaviridae, Reoviridae y Paramyxoviridae (Royle, Dobson et al., 2015, Viruses 7: 5375-5387). Los estudios han demostrado que los restos básicos, lisina o arginina, en las viroporinas son un requisito fundamental para su función. La mayoría de las viroporinas se han identificado en virus de ARN. Los virus que contienen viroporinas ricas en lisina y arginina que podrían ser una diana para las isoformas de tripsina ZT incluyen el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), rotavirus, Ébola, virus Reston (RESTV), virus Lloviu (LLOV), virus de Sudán (SUDV), Bundibugyo (BDBV), virus del bosque de Tai (TAFV) (Suzuki, Orba et al., 2010, PLoS Pathog 6: e1000801, Gallaher y Garry, 2015, Viruses 7: 285-305).

Las viroporinas se encuentran en una amplia diversidad de virus de ADN y ARN tales como el virus 1 del Paramecium bursaria chlorella, virus 40 de simio (SV40), polioma humano ^jC (JCV), coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) (Kang, Moroni et al., 2004, Proc Natl Acad Sci U S A 101: 5318-5324, Liao, Tarn et al., 2006, Adv Exp Med Biol 581: 199-202, Daniels, Sadowicz et al., 2007, PLoS Pathog 3: e98).

Recientemente se han identificado proteínas virales altamente básicas, denominadas agnoproteínas, a partir de virus de ADN como los de las familias Polyomaviridae y Papillomaviridae (Royle, Dobson et al., 2015, Viruses 7: 5375 5387). Estas proteínas muestran una serie de características de la viroporina. En agnoproteínas se han identificado secuencias conservadas que contienen varios restos de aminoácidos básicos agrupados (Royle, Dobson et al., 2015, Viruses 7: 5375-5387). Basándose en el análisis del perfilado múltiple de sustratos, las isoformas de tripsina ZT pueden actuar como agentes antivirales contra virus de ADN, ya que pueden escindir estos restos de aminoácidos básicos agrupados (Royle, Dobson et al., 2015, Viruses 7: 5375-5387).

Muchos virus y bacterias han desarrollado mecanismos para aumentar la entrada celular usando péptidos o proteínas que penetran en la célula (Milletti, 2012, Drug Discov Today 17: 850-860). Los virus incluyen pestivirus de la familia Flaviviridae, virus del herpes (VHS-1), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1, hepatitis B y virus sincitial respiratorio humano (VSR) (Elliott y O'Hare, 1997, Cell 88: 223-233, Oess y Hildt, 2000, Gene Ther 7: 750 758, Langedijk, 2002, J Biol Chem 277: 5308-5314, Langedijk, Olijhoek et al., 2005, International Congress Series 1277: 95-107, Lu, Tager et al., 2006, Anal Biochem 353: 7-14, Godet, Guergnon et al., 2010, PLoS One 5: e13760). Además, estos tipos de proteínas se han encontrado en bacterias tales como Mycobacterium tuberculosis (Lu, Tager et al., 2006, Anal Biochem 353: 7-14). Los péptidos que penetran en la célula (CPP) tienen en común que son ricos en restos de aminoácidos básicos especialmente argininas (Milletti, 2012, Drug Discov Today 17: 850-860). Las porinas son proteínas de la membrana externa que desempeñan un papel fundamental en la patogenicidad bacteriana y para protección y, por esa razón, son dianas útiles para agentes terapéuticos (Galdiero, Falanga et al., 2012, Curr Protein Pept Sci 13: 843-854). Estas proteínas a menudo contienen restos consecutivos del aminoácido arginina. Basándose en el análisis del perfilado múltiple de sustratos, las isoformas de tripsina ZT pueden actuar como agentes antimicrobianos contra virus y bacterias ya que pueden escindir restos de aminoácidos básicos agrupados.

Los parásitos dependen de determinantes de virulencia tales como proteínas que contienen dominios ricos en arginina, por ejemplo, Toxoplasma gondii (Fentress, Steinfeldt et al., 2012, Cell Microbiol 14: 1921-1933). El análisis del perfilado múltiple de sustratos mostró que las isoformas de tripsina ZT podrían ser beneficiosas frente a parásitos al actuar frente a proteínas de ese tipo.

La herramienta básica de búsqueda de alineamientos locales (BLAST) se usó para buscar algunas de las secuencias de aminoácidos únicas y preferentes escindidas por isoformas de tripsina ZT. Los resultados de la búsqueda demostraron que estos tipos de secuencias se encuentran en muchos patógenos, incluyendo virus (por ejemplo, de las familias de virus Paramyxoviridae y Coronaviridae), bacterias (por ejemplo, el género Haemophilus) y parásitos (por ejemplo, el género Plasmodium). La familia Paramyxoviridae incluye virus tales como el virus sincitial respiratorio (RSV) y el virus de la parainfluenza humana y virus que producen paperas y sarampión. La familia Coronaviridae incluye virus que producen el síndrome respiratorio agudo severo (SARS). El género de bacterias Haemophilus incluye Haemophilus parainfluenzae que está asociado con endocarditis, meningitis, y bacteriemia. El género Plasmodium incluye Plasmodium falciparum que produce malaria.

Mediante la expresión "dispositivo médico" se hace referencia, pero no se limita a, cualquier instrumento, aparato, electrodoméstico, software, material u otro artículo con la finalidad de diagnóstico, prevención, monitorización, tratamiento o alivio de enfermedades, tal como diagnóstico, monitorización, tratamiento, alivio o compensación; para una lesión o discapacidad, tal como investigación, reemplazo o modificación de la anatomía o de un proceso fisiológico; control de la concepción; incluyendo los dispositivos que no consiguen su principal acción prevista en o sobre el cuerpo humano por medios farmacológicos, inmunológicos o metabólicos - pero que pueden ser asistidos en su función por dichos medios.

La presente invención se refiere a las nuevas isoformas de tripsina ZT. La invención describe propiedades de escisión de proteínas sin predecir y únicas de las isoformas de tripsina ZT que las hacen valiosas en aplicaciones médicas. En particular, la invención se refiere a las nuevas isoformas de tripsina ZT de bacalao del Atlántico, útiles como productos farmacéuticos, en dispositivos médicos, y cosméticos.

En un aspecto de la invención, se proporciona una isoforma de tripsina ZT de bacalao aislada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.

En una realización de este aspecto se proporciona una isoforma de tripsina ZT de bacalao aislada, seleccionada entre tripsina ZT-1, que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2; tripsina ZT-2 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 3; tripsina ZT-3 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 4; y tripsina ZT-4, que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 5.

En un aspecto de la invención, se proporciona una composición que comprende al menos una isoforma de tripsina ZT de bacalao de acuerdo con la invención, junto con excipientes y vehículos adecuados. Dicha isoforma de tripsina ZT de bacalao se puede seleccionar entre tripsina ZT-1 de bacalao, que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2; tripsina ZT-2 de bacalao que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 3; tripsina ZT-3 de bacalao que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 4; y tripsina ZT-4 de bacalao que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 5.

Normalmente, dicha composición comprende dichas isoformas de tripsina ZT de bacalao presentes en mezcla con otras tripsinas de bacalao. Preferentemente, dichas isoformas de tripsina ZT de bacalao comprenden al menos un 5 % (p/p) del contenido total de tripsinas de bacalao en dicha composición, tal como al menos un 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o un 50 % o más (p/p) del contenido total de tripsinas de bacalao en dicha composición.

Normalmente dicha composición se administra por vía tópica, en forma de una loción, un hidrogel, una pulverización bucal o una pulverización nasal. Dicha composición puede comprender además un alcohol polivalente, tal como glicerol.

En una realización de este aspecto, se proporciona dicha composición para uso en terapia.

En una realización de este aspecto, se proporciona dicha composición para uso para tratar o prevenir una enfermedad causada por un organismo patógeno seleccionado entre el grupo que consiste en un virus, una bacteria, un hongo, un parásito y un protozoo.

En una realización de este aspecto, se proporciona dicha composición para uso para tratar o prevenir una enfermedad del tracto respiratorio superior causada por organismos patógenos tales como virus, bacterias y hongos. En una realización de este aspecto, se proporciona dicha composición para uso para tratar o prevenir el dolor, inflamación aguda, inflamación crónica, artritis, articulaciones inflamadas, bursitis, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis séptica, fibromialgia, lupus eritematoso sistémico, flebitis, tendinitis, erupción cutánea, psoriasis, acné, eccema, eccema facial seborreico, eccema de las manos, cara o cuello, infecciones del prepucio, pie de atleta, infecciones por fístulas, úlceras tópicas infectadas, infecciones del ombligo en recién nacidos, arrugas, cicatrices, queloides, forúnculos, verrugas y picazón alérgica, hemorroides, una infección fúngica y un trastorno inmunológico que incluye una enfermedad autoinmune.

En una realización de este aspecto, se proporciona dicha composición para uso para el tratamiento de infecciones por heridas y heridas de quemaduras.

En una realización de este aspecto, se proporciona dicha composición para uso para eliminar la piel muerta o descamada de piel de otro modo sana.

En una realización de este aspecto, se proporciona dicha composición para uso cosmético. Dicha composición puede comprender además un compuesto cosméticamente activo adicional.

En un aspecto de la invención, se proporciona un método para tratar enfermedades, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de acuerdo con la presente invención, a un paciente que lo necesita.

En una realización de este aspecto, dicha enfermedad está causada por un organismo patógeno seleccionado entre el grupo que consiste en un virus, una bacteria, un hongo, un parásito y un protozoo

En una realización de este aspecto, dicha enfermedad es una enfermedad del tracto respiratorio superior causada por organismos patógenos tales como virus y bacterias.

En una realización de este aspecto, dicha enfermedad se selecciona entre dolor, inflamación aguda, inflamación crónica, artritis, articulaciones inflamadas, bursitis, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis séptica, fibromialgia, lupus eritematoso sistémico, flebitis, tendinitis, erupción cutánea, psoriasis, acné, eccema, eccema facial seborreico, eccema de las manos, cara o cuello, infecciones del prepucio, pie de atleta, infecciones por fístulas, úlceras tópicas infectadas, infecciones del ombligo en recién nacidos, arrugas, cicatrices, queloides, forúnculos, verrugas y picazón alérgica, hemorroides, una infección fúngica y un trastorno inmunológico que incluye una enfermedad autoinmune.

En una realización de este aspecto, dicha enfermedad consiste en infecciones por heridas o heridas de quemaduras. En un aspecto de la invención, se proporciona una isoforma de tripsina ZT de bacalao aislada, seleccionada entre tripsina ZT-1 de longitud completa, que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 19; tripsina ZT-2 de longitud completa que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 20; tripsina ZT-3 de longitud completa que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 21; y tripsina ZT-4 de longitud completa, que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 22.

En un aspecto de la invención, se proporciona un método para preparar isoformas de tripsina ZT de bacalao que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una cualquiera de la SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 5, que comprende

(i) extraer tripsina ZT de vísceras de bacalao,

(ii) aplicar el extracto al menos a una o más etapas de cromatografía, incluyendo una etapa de cromatografía de afinidad usando un ligando de afinidad de p-aminobenzamidina, y

(iii) desorber y eluir las isoformas de tripsina ZT de bacalao unidas al ligando de afinidad de p-aminobenzamidina. En una realización de este aspecto, dicho método además comprende al menos una etapa de uso de una resina de intercambio aniónico después de dicha etapa (ii) de cromatografía de afinidad.

En una realización de este aspecto, dichas isoformas de tripsina ZT de bacalao se seleccionan entre tripsina ZT-1, que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2; tripsina ZT-2 que comprende Una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 3; tripsina ZT-3 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 4; y tripsina ZT-4 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 5, o una mezcla de las mismas.

Las vísceras de bacalao normalmente se usan para purificar y aislar las isoformas de tripsina ZT. Los inventores han identificado nuevos métodos que se describen a continuación, útiles para una producción de isoformas de tripsina ZT a escala comercial. La extracción se lleva a cabo un pH de 6-8 a una temperatura inferior a 10 °C. Las vísceras de bacalao se mezclan con agua en una relación (p/p) de 1:6 a 1:20. El extracto se separa de los restos de vísceras y se aclara mediante sedimentación y filtración. Esto va seguido de microfiltración y ultrafiltración dando como resultado una solución que contiene las isoformas de tripsina ZT que se usa para separación mediante cromatografía que puede incluir varias etapas.

Una cromatografía de afinidad, preferentemente mediante cromatografía de afinidad de amino benzamidina, se lleva a cabo para purificar las isoformas de tripsina ZT. A continuación las isoformas de tripsina ZT se pueden purificar adicionalmente mediante cromatografía de intercambio aniónico.

Un método de aplicación de las isoformas de tripsina ZT o mezclas de tripsinas de bacalao purificadas que contienen isoformas de tripsina ZT, se realiza en una preparación de hidrogel o loción y agua que contiene de un 0 a un 90 % (vol/vol) de un alcohol polivalente (poliol) tal como glicerol. Una concentración adecuada de las isoformas de tripsina ZT constituye una relación de concentración de proteína de al menos 1 a 100 con respecto a otras formas de tripsina, preferentemente un 5 %, o superior (p/p) del contenido total de tripsinas de bacalao. La actividad de la tripsinas de 0,1 a 10.000 unidades enzimáticas de actividad para CBZ-Gly-Pro-Arg-pNA (carbobenzoxi Gly-Pro-Argpara nitroanilida) por 100 mililitros de la preparación final de hidrogel/loción.

Se desvelan, pero no forman parte de la invención, (a) métodos relacionados con ciertas condiciones que usan cantidades eficaces de las isoformas de tripsina ZT purificadas descritas anteriormente, (b) composiciones o sustancias para su uso para métodos de ese tipo, (c) composiciones farmacéuticas o para dispositivo médico que contienen cantidades eficaces de isoformas de tripsina ZT para su uso para métodos de ese tipo, y (d) usos de la enzima o composición enzimática para la fabricación de un medicamento (farmacéuticos y dispositivos médicos) para su uso para métodos de este tipo.

Los métodos que se desvelan, pero que no forman parte de la invención, son, entre otros, para:

tratar o prevenir enfermedades patogénicas causadas por virus, bacterias y hongos que, por ejemplo, se producen en el tracto respiratorio superior, tracto respiratorio inferior y en los pulmones;

tratar o prevenir profilácticamente afecciones dermatológicas tales como, por ejemplo, acné, erupción cutánea, psoriasis o eccema, incluyendo eccema facial seborreico o eccema de las manos, cara, cuero cabelludo o cuello, hemorroides y similares, donde preferentemente la cantidad de isoformas de tripsina ZT y otras tripsinas administradas es una cantidad eficaz para tratar o prevenir una afección dermatológica;

tratar enfermedades pulmonares donde las isoformas de tripsina ZT, con o sin otras tripsinas se usan, por ejemplo, en un inhalador de dosis medida presurizada de alta eficacia en una dosis eficaz para el tratamiento; tratar o prevenir de forma profiláctica la infección por heridas y desbridamiento de heridas (mediante la aplicación, a la herida, de una cantidad eficaz de isoformas de tripsina ZT, con o sin otras tripsinas, para prevenir la infección microbiana o favorecer la cicatrización de heridas mediante la administración de una cantidad de isoformas de tripsina ZT eficaz para inhibir microbios con o sin otras tripsinas, cuando se trata, el tejido necrótico de la herida se puede liberar sustancialmente;

tratar quemaduras, donde preferentemente la cantidad de isoformas de tripsina ZT, con o sin otras tripsinas, se administra en una cantidad suficiente para favorecer la cicatrización;

tratar quemaduras solares, donde preferentemente la cantidad de ¡soformas de tripsina, con o sin otras tripsinas, se administra en una cantidad suficiente para favorecer la cicatrización;

tratar quemaduras por radiación, donde preferentemente la cantidad de isoformas de tripsina ZT, con o sin otras tripsinas, se administra en una cantidad suficiente para favorecer la cicatrización;

eliminar la piel muerta o descamada de piel de otro modo sana para mejorar el aspecto de la piel, donde preferentemente la cantidad de isoformas de tripsina ZT, con o sin otras tripsinas, se administra en una cantidad eficaz para eliminar la piel muerta;

tratar talones agrietados, donde preferentemente la cantidad de isoformas de tripsina ZT, con o sin otras tripsinas, se administra en una cantidad suficiente para un tratamiento eficaz;

para el tratamiento de la piel irritada, tal como en forma de parches secos, picor, enrojecimiento y manchas, donde preferentemente la cantidad de isoformas de tripsina ZT, con o sin otras tripsinas, se administra en una cantidad suficiente para un tratamiento eficaz;

tratar o prevenir de forma profiláctica la fibrosis quística, cáncer, por ejemplo, mediante la administración de una cantidad eficaz de isoformas de tripsina ZT para el tratamiento de un tumor o una cantidad para prevenir o inhibir una metástasis tumoral, aterosclerosis, asma, choque séptico, síndrome de choque tóxico, adherencias tisulares tales como la vaina del tendón, adherencias postquirúrgicas abdominales o articulares, lesión por reperfusión, malaria, trastorno inmunológico tal como una enfermedad autoinmune, apoptosis, colitis y enteritis, tal como enfermedad de Crohn, donde preferentemente la cantidad administrada de isoformas de tripsina ZT y peptidasas relacionadas son eficaces;

tratar o prevenir de forma profiláctica una infección microbiana, por ejemplo, una infección vírica tal como un rinovirus (RV), virus sincitial respiratorio (VSR), gripe, infección por virus del herpes (por ejemplo, VHS-1 , VHS-2, infección por herpes zóster o herpes genital), infección por VIH, hepatitis, coronavirus, citomegalovirus o virus del papiloma; una infección que causa una enfermedad gastrointestinal tal como ulcera o diarrea; una infección fúngica tal como una infección fúngica sistémica, cutánea, oral, vaginal o esofágica, incluyendo, por ejemplo, infección por levadura, incluyendo una infección fúngica de las uñas e infecciones por Candida; infecciones microbianas del ojo, tratadas preferentemente con administraciones oculares; infecciones bacterianas que incluyen la infección por Helicobacter pylori, Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus resistente a Meticilina (MRSA), Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenza, Streptococcus mitis, Streptococcus spp., Klebsiella spp., Pseudomonas spp., Neisseria gonorrheae, Haemophilus spp., Chlamydia spp., syphilis e infecciones por E. coli e infecciones bacterianas que causan chancroide; infecciones microbianas oportunistas en pacientes inmunocomprometidos donde preferentemente la cantidad administrada de las tripsinas de bacalao es una cantidad eficaz para tratar o prevenir la infección microbiana o tiene una actividad inhibitoria contra la adhesión célula-célula o célula-virus;

tratar o prevenir de forma profiláctica una indicación seleccionada entre el grupo que consiste en dolor, inflamación, inflamación aguda o crónica, artritis, articulaciones inflamadas, bursitis, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis séptica, fibromialgia, lupus sistémico eritematoso y flebitis donde preferentemente la cantidad es una cantidad eficaz para el tratamiento o la prevención;

eliminar la placa dental, donde preferentemente la cantidad de isoformas de tripsina ZT, con o sin otras tripsinas, se administra en una cantidad eficaz para eliminar la placa dental; y someter a lisis coágulos sanguíneos, donde preferentemente la cantidad de isoformas de tripsina ZT es una cantidad eficaz para la lisis del coágulo.

El método comprende la administración de una composición que comprende la isoformas de tripsina ZT como se ha descrito anteriormente.

La invención proporciona composiciones tópicas cosméticas y médicas que comprenden las isoformas de tripsina ZT que se han descrito anteriormente; y composiciones de gel, crema o supositorio.

También se desvela, pero que no forma parte de la invención, un método para inhibir o prevenir de forma profiláctica la transmisión de un microbio patógeno mediante la administración de isoformas de tripsina ZT con o sin otras tripsinas. Preferentemente, la tripsina ZT con o sin otras tripsinas se aplica a la parte del cuerpo que comprende la vía de entrada de transmisión primaria para el microbio en cuestión. En una realización, una pulverización, pomada o lavado se aplica a un orificio del cuerpo involucrado en la actividad sexual, por ejemplo, para prevenir la transmisión del VIH o la hepatitis. En otra divulgación, las isoformas de tripsina ZT o peptidasas relacionadas se aplican a las vías respiratorias superiores, por ejemplo, mediante un aerosol, para inhibir o prevenir la transmisión de un virus del resfriado común, tal como un rinovirus o un coronavirus.

El método desvelado, pero que no forma parte de la invención, de tratamiento, por vía extracorpórea, de un tejido, fluido corporal o composición de células para eliminar componentes de adhesión celular reduce el rechazo inmunológico de tejido, fluido corporal o composición de células que se trasplanta de un individuo a otro. En otro aspecto, los tratamientos de ese tipo eliminan o inactivan los componentes de adhesión celular que se encuentran en el tejido tratado, fluido corporal o composición de células implicadas en una infección microbiana.

En el tratamiento o en la prevención del choque séptico o síndrome de choque tóxico por vía profiláctica, mediante la administración de isoformas de tripsina ZT o peptidasas relacionadas, que se desvelan pero no forman parte de la invención, las vías de administración apropiadas incluyen la administración sistémica. Para las infecciones vaginales asociadas con el choque, como método de administración se pueden usar lavados vaginales, cremas, geles o supositorios. En el tratamiento o en la prevención de dolor, inflamación, inflamación aguda o crónica, artritis, articulaciones inflamadas, bursitis, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis séptica, fibromialgia, lupus eritematoso sistémico, flebitis mediante la administración de isoformas de tripsina ZT o peptidasas relacionadas, las vías de administración apropiadas podrían incluir, pero sin limitarse a, cremas, geles o supositorios, en particular, pero sin limitarse a, hidrogeles que contienen glicerol u otros polioles.

En el tratamiento o prevención que se desvelan pero que no forman parte de la invención, de erupciones cutáneas, psoriasis, acne, eccema, incluyendo eccema facial seborreico o eccema de las manos, cara, cuero cabelludo o cuello, infecciones del prepucio, pie de atleta, infecciones por fístulas, úlceras tópicas infectadas, infecciones del ombligo en recién nacidos, arrugas, cicatrices y queloides, forúnculos, verrugas y picazón alérgica, hemorroides y similares, heridas, infecciones por heridas, heridas de quemaduras, eliminación de la piel muerta o descamada de piel de otro modo sana para mejorar el aspecto de la piel, una infección fúngica tal como infección fúngica sistémica, cutánea, oral, vaginal o esofágica, incluyendo, por ejemplo, infección por levadura, incluyendo una infección fúngica de las uñas e infecciones por Candida y trastornos inmunitarios que incluyen enfermedades autoinmunes mediante la administración de isoformas de tripsina ZT, con o sin otras tripsinas, por vía profiláctica, las vías de administración apropiadas podrían incluir cremas, geles o supositorios, en particular, pero sin limitarse a, hidrogeles que contienen glicerol u otros polioles.

Los objetivos anteriores se consiguen mediante el uso de una composición que contiene una cantidad eficaz de isoformas de tripsina ZT con o sin otras tripsinas que es capaz de aliviar el dolor, inflamación, artritis, hinchazón, edema, psoriasis, eccema, dermatitis, erupción y/u otros síntomas de las enfermedades mencionadas en la parte introductoria. Las isoformas de tripsina ZT se pueden obtener con un alto rendimiento y de una manera relativamente sencilla a partir de vísceras de bacalao. Se ha descubierto que las isoformas de tripsina ZT se pueden purificar a escala comercial de una manera relativamente sencilla con rendimientos razonables. Las isoformas de tripsina ZT sin o junto con otras serina proteasas del Atlántico se pueden usar para los fines de la invención.

Las isoformas de tripsina ZT que se presentan en la presente divulgación se pueden desorber de la matriz de afinidad aplicando condiciones que desestabilizarán la interacción entre la enzima y el ligando de afinidad. Tales condiciones incluyen alto contenido de sal seguido de pH bajo, preferentemente en un 30 % o más de glicerol. Se deja que el eluyente de la columna fluya en un tampón neutralizante para estabilizar la tripsina de bacalao después de la etapa de elución ácida. A continuación las isoformas de tripsina ZT se pueden purificar adicionalmente usando intercambio aniónico y pueden eluir con una concentración de sal creciente. Mediante estos métodos se pueden aislar isoformas de tripsina ZT con una pureza superior a aproximadamente un 90 %. La fracción de tripsina de bacalao obtenida de ese modo contiene 2-3 isoformas principales tal como se pone de manifiesto mediante electroforesis en SDS, que produce dos bandas y análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF. La masa molecular de las isoformas de tripsina ZT es de aproximadamente 25 kDa, mientras que el punto isoeléctrico calculado es 4,35 - 4,49 dependiendo de la isoforma.

Las isoformas de tripsina ZT con o sin otras tripsinas en formulaciones específicas se pueden usar como producto farmacéutico, en dispositivos médicos (tal como formulaciones químicas) o en cosméticos, dependiendo del uso pretendido. Las isoformas de tripsina ZT (con o sin otras tripsinas) de la invención se pueden administrar, en el método desvelado pero que no forma parte de la invención, por vía tópica, oral, rectal, vaginal, por instilación (por ejemplo, en el tracto urinario o en fístulas), por la día pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un aerosol (por ejemplo, mediante el uso de un inhalador de dosis medida presurizado (pMDI)), mediante la aplicación de gotas en el ojo, o por vía sistémica, tal como por vía parenteral, incluyendo, por ejemplo, por vía intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intraarterial o por vía intravenosa. Las isoformas de tripsina ZT se administran en solución o se combinan con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable de acuerdo con la práctica farmacéutica estándar. Para el modo de administración oral, las isoformas de tripsina ZT se usan en forma de comprimidos, cápsulas, pastillas para chupar, chicles, trociscos, polvos, jarabes, elixires, soluciones y suspensiones acuosas y similares. Para la administración parenteral, normalmente se preparan soluciones estériles de isoformas de tripsina ZT y los valores de pH de las soluciones se ajustan y se tamponan de forma adecuada. Para uso intravenoso, la concentración total de solutos se debería controlar para hacer que la preparación sea isotónica. Para la administración ocular, se pueden administrar pomadas o líquidos que se administran mediante goteo mediante sistemas de administración ocular conocidos en la técnica, tales como aplicadores o goteros. Para la administración pulmonar, se seleccionarán diluyentes y/o vehículos que sean apropiados para permitir la formación de un aerosol. Para administraciones tópicas, las isoformas de tripsina ZT se administran normalmente en un hidrogel, que contiene de un 0 a un 85 % de glicerol, tal como de aproximadamente un 20 % a un 30 % de glicerol y posiblemente hasta un 85 % de glicerol.

Para tratamientos tópicos, una dosis adecuada de las isoformas de tripsina ZT con o sin otras tripsinas por aplicación varía de aproximadamente 0,01 pg/cm2 a aproximadamente 1 mg/cm2, preferentemente de aproximadamente 0,1 pg/cm2 a aproximadamente 0,01 mg/cm2 (usando, por ejemplo, aproximadamente 0,01 mg/ml de gel enzimático). Para tratamientos sistemáticos, las dosificaciones se seleccionarán generalmente para mantener un nivel sérico de las isoformas de tripsina ZT con o sin otras tripsinas entre aproximadamente 0,1 mg/100 ml y aproximadamente 100 mg/100 ml, preferentemente entre aproximadamente 0,5 mg/100 ml y aproximadamente 2,0 mg/100 ml. En una medida alternativa de las cantidades de administración sistemática preferentes, se usarán preferentemente de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, más preferentemente de aproximadamente 1 mg/kg. Para tratamientos vaginales y del tracto urinario, las soluciones de instilación/lavado adecuadas de las isoformas de tripsina ZT tendrán generalmente concentraciones de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, preferentemente de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 3 mg/ml. Para todos los tratamientos, la composición enzimática se aplicará generalmente de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 veces al día, preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 veces al día. Estos valores, por supuesto, variarán con una serie de factores que incluyen el tipo y la gravedad de la enfermedad, y la edad, el peso y el estado médico del paciente, como reconocerán los expertos en las técnicas médicas. Se cree que se pueden usar dosis sustancialmente más altas sin efectos adversos sustanciales.

Para la cicatrización de heridas, las isoformas de tripsina ZT con o sin otras tripsinas se aplican preferentemente con más frecuencia que simplemente en el momento en que se cura la herida por primera vez. Preferentemente, las isoformas de tripsina ZT se aplican al menos aproximadamente cada vez que se cambia el apósito para heridas. Las isoformas de tripsina ZT también se pueden aplicar al menos aproximadamente cada dos días, más preferentemente, todos los días o pocas veces al día. Para situaciones dermatológicas tales como eccema, psoriasis y similares, un hidrogel de isoforma de tripsina ZT (con o sin otras tripsinas) se aplica preferentemente todos los días, más preferentemente dos veces al día. Para inflamación crónica o aguda, artritis, articulaciones, bursitis, osteoartritis, y similares, las isoformas de tripsina ZT se aplican preferentemente todos los días, más preferentemente dos veces al día.

En la técnica se conocen numerosos métodos para determinar el porcentaje de homología de proteínas. El porcentaje de identidad se calculó usando ClustalW2 (versión Clustal2.1) cuando se llevan a cabo comparaciones de secuencias (sitio web de EMBL-EBI http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ fecha 4 de mayo de 2015).

La invención se describirá ahora mediante una serie de ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1

Preparación de una mezcla de proteasas de bacalao

Aproximadamente 100 kg de vísceras de bacalao del Atlántico congeladas se descongelaron y se añadieron a un volumen de cuatro veces de agua potable fría en un tanque de extracción y el pH se ajustó a aproximadamente pH 6 con solución de hidróxido sódico. La mezcla se agitó durante aproximadamente 10 horas entre 0 y 5 °C. Después de un breve periodo de sedimentación del producto crudo (aproximadamente 30 minutos), el extracto acuoso se eliminó de las vísceras insolubles restantes con una bomba y se recogió en un tanque de sedimentación. Se permitió que el extracto acuoso reposara en el tanque de sedimentación enfriado para que sedimentara de aproximadamente 40 a 80 horas. El sobrenadante se decantó desde el tanque de sobrenadante a un tanque de retención usando una bomba. El sobrenadante se concentró de 10 a 20 veces mediante ultrafiltración y se sometió a diafiltración hasta un nivel aceptable de fuerza iónica con una conductividad inferior a aproximadamente 2,5 mS/cm. Se obtuvieron aproximadamente 10-15 litros de concentrado proteico ultrafiltrado y diafiltrado.

EJEMPLO 2

Purificación de las isoformas de tripsina ZT de bacalao a partir de extracto concentrado de vísceras de bacalao

Aproximadamente 12 litros de concentrado ultrafiltrado y diafiltrado como se obtuvo en el Ejemplo 1 se aplicaron a una serie continua conectada de columnas de cromatografía empaquetadas de aproximadamente 1 litro, la primera conteniendo una resina de intercambio catiónico de flujo rápido de carboximetilo (CM) (GE healthcare) y la segunda conteniendo un ligando de afinidad de p-aminobenzamidina acoplada a una resina de Sepharose (GE healthcare). Las columnas de CM y p-aminobenzamidina se equilibraron previamente con aproximadamente 10 volúmenes de columna de tampón Tris 25 mM a pH 7,8, que contenía cloruro cálcico 2,5 mM (tampón A). El concentrado se bombeó sobre las columnas de CM y p-aminobenzamidina a un caudal de aproximadamente 100 ml por minuto. Cuando la aplicación de la solución concentrada en las columnas se completó, el material residual se eliminó del sistema de columna continua mediante lavado con aproximadamente 8 litros de tampón A. Una vez completado este lavado, la columna de afinidad de p-aminobenzamidina se desconectó de la columna de CM y se lavó con aproximadamente 5 volúmenes de columna de una solución con alto contenido de sal de tampón Tris 25 mM a pH 7,5 que contenía NaCl 0,5 M y cloruro cálcico 2,5 mM. A continuación, las tripsinas de bacalao se desorbieron del ligando de afinidad y se eluyeron de la columna con una solución ácida de ácido acético 25 mM a pH 3,2 que contenía cloruro cálcico 10 mM y glicerol al 30 %.

La preparación que contenía la isoforma de tripsina ZT de bacalao purificada era homogénea mediante electroforesis SDS PAGE. La preparación purificada se esterilizó con filtro a través de un filtro de 0,22 micrómetros y se almacenó congelada a aproximadamente -20 °C. La preparación que contenía isoforma de tripsina ZT de bacalao se esterilizó con filtro a través de un filtro de 0,22 micrómetros y se almacenó congelada a aproximadamente -20 °C. La preparación que contenía isoforma de tripsina ZT de bacalao se aplicó a una columna de cromatografía de intercambio aniónico (MonoQ) y las proteínas eluyeron con un gradiente salino (FIG. 1). La columna se equilibro con un tampón (Tris 20 mM, CaCI²10 mM, pH 8,0), y las enzimas se eluyeron con un gradiente lineal de NaCI 0-150 mM en 40 volúmenes de columna, NaCI 150-620 mM lineal en 6 volúmenes de columna, NaCI 620-850 mM en 10 volúmenes de columna a un caudal de 1 ml/min. Las proteínas en el pico de tripsina ZT marcada de la FIG. 1 se sometieron a análisis SDS-PAGE (FIG. 2). La banda de proteína en el gel del pico de la tripsina ZT se sacó del gel y se analizó usando espectrometría de masas de desorción/ionización por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS). El análisis de espectrometría de masas (MS) reveló la identidad para la tripsina ZT-1, tripsina ZT-2, tripsina ZT-3 y tripsina ZT-4 (Tabla 1 y Tabla 2). Los anticuerpos contra la tripsina I y la tripsina X se prepararon en conejos frente a un péptido ((NH²-) CVLSGWVRDTMA (-C^oO^h)) (SEQ ID NO: 23) que corresponde a los restos 228-239 en el extremo C terminal de la tripsina I de bacalao y la tripsina X de bacalao. Los anticuerpos se purificaron por afinidad a partir de suero de conejo usando el péptido acoplado a un soporte de perla de gel. Los anticuerpos policlonales contra isoformas de tripsina ZT se prepararon en fluido ascítico de ratón como se describe en Overkamp et al. (Overkamp, Mohammed-Ali et al., 1988, J Immunoassay 9: 51-68). Una forma purificada de la tripsina ZT-4 recombinante se inyectó por vía intraperitoneal (i.p.) en ratones Balb/C2. Los ratones se sacrificaron el día 34 y el fluido ascítico se recogió. Los respectivos anticuerpos se usaron en análisis de transferencia de Western. El análisis de transferencia de Western se llevó a cabo en las proteínas en el pico de tripsina ZT marcada de la FIG. 1 (FIG. 3). El anticuerpo de la isoforma de tripsina ZT reaccionó contra las proteínas del pico de tripsina ZT marcada mientras que un anticuerpo contra la tripsina I y la tripsina X no lo hizo (FIG. 3).

La Tabla 1 muestra masas peptídicas obtenidas a partir del análisis de MS en la banda de proteína del gel de SDS-PAGE en la Figura 2 (muestra no guanidilada), véase la columna 1 Mr (esp.). Mr se refiere a la masa molecular relativa en Da. Las columnas 2, 3 y 4 muestran los valores calculados (para masas que coinciden con masas en la columna 1) a partir de una digestión con tripsina in silico de las secuencias de aminoácidos de la tripsina ZT-1, tripsina ZT-2, tripsina ZT-3 y tripsina ZT-4. La columna 5 muestra la secuencia del péptido que dio el valor de masa de la digestión in silico. La columna 6 muestra modificaciones de los diferentes péptidos basándose en la digestión in silico.

Tabla 1

Mr

(esp.)

Secuencia Modificaciones

842,4077

1045,4976

1082,5603

1144,4826 1144,5415 1144,5415 (R)IIGGQDCEPR(S) Carbamidometilo (C) 1149,5283 1149,6150 1149,6150 1149,6150 1149,6150 (R)VFEGTEQLVK(T)

1212,4511

1216,4408 1216,4908 1216,4908 (R)MVCAGYMDGGR(D) Carbamidometilo (C) 1260,4492 1260,4992 1260,4992 (R)MMCVGFMDGGR(D) Carbamidometilo (C) 1262,4221 1262,4962 1262,4962 (R)MVCAGYMDGGR(D) 2 Oxidación (M)

Propionamida (C) 1276,4272 1276,4941 1276,4941 (R)MMCVGFMDGGR(D) Carbamidometilo (C) Oxidación (M) 1320,5165 1320,6253 1320,6253 (R)GCAEPNSPGVYVK(V)

1354,5907

1377,5624 1377,6467 1377,6467 (R)GCAEPNSPGVYVK(V) Carbamidometilo (C) 1493,5870

1638,7873

1707,6807

1839,8099

1994,9057

^{2800,2263 2800,3831}2800,3831 (R)LQCLDVPIVEPVAC 2 Carbamidometilo QASYPGMISPR(M) (C)

2814,2398 2814,3987 2814,3987 (R)LQCLDVPIVEPVAC Carbamidometilo (C)

QASYPGMISPR(M) Propionamida (C) ^{2830,2763 2830,3936 2830,3936}(R)LQCLDVPIVEPVAC Carboximetil (C)

QASYPGMISPR(M) Oxidación (M)

Propionamida (C)

^{2847,3361 2847,3725 2847,3725}(R)LQCLDVPIVETVDC Carbamidometilo (C)

EAAYPGMISPR(M) Propionamida (C)

Las secuencias en la Tabla 1 son las que siguen a continuación:

La Tabla 2 muestra masas peptídicas obtenidas a partir del análisis de MS en la banda de proteína del gel de SDS-PAGE en la Figura 2 (muestra guanidilada), véase la columna 1 Mr (esp.). Mr se refiere a la masa molecular relativa en Da. Las columnas 2, 3 y 4 muestran los valores calculados (para masas que coinciden con masas en la columna 1) a partir de una digestión con tripsina in silico de las secuencias de aminoácidos de la tripsina ZT-1, tripsina ZT-2, tripsina ZT-3 y tripsina ZT-4. La columna 5 muestra la secuencia del péptido que dio el valor de masa de la digestión in silico. La columna 6 muestra modificaciones de los diferentes péptidos basándose en la digestión in silico.

Tabla 2

cü cü Cü Cü

(esp.) Secuencia Modificaciones (Q/>. (_Q/>_.(Q/>. (Q/>.

781,5661

842,4931

^{1144,5651 1144,5415 1144,5415}(R)IIGGQDCEPR(S) ^{Carbamidometilo (C)}1173,6305

1191,6567 1191,6368 1191,6368 1191,6368 1191,6368 (R)VFEGTEQLVK(T) Guanidinilo (K) 1210,5861

1212,5237

1216,5105 1216,4908 1216,4908 (R)MVCAGYMDGGR(D) Carbamidometilo (C) 1222,6291

_{1260,5201 1260,4992 1260,4992}(R)MMCVGFMDGGR(D) _{Carbamidometilo (C)}1270,6331

1276,5112 1276,4941 1276,4941 (R)MMCVGFMDGGR(D) Carbamidometilo (C)

Oxidación (M)

1638,8623

1993,9786

^{2635,2760 2635,2127 2635,2127}(R)DVCNGDSGSPLVC Carbamidometilo (C)

EGVLTGLVSWGR(G) Carboximetilo (C) ^{2649,2755 2649,2283 2649,2283}(R)DVCNGDSGSPLVC Carboximetilo (C) EGVLTGLVSWGR(G) Propionamida (C) 2752,4779

2762,6478

2766,5037

^{2776,6052 2776,3354 2776,3354}(R)LQCLDVPIVETVD

CEAAYPGMISPR(M)

^{2800,4952 2800,3831 2800,3831}(R)LQCLDVPIVEPVA 2 Carbamidometilo CQASYPGMISPR(M) (C) ^{2814,5098 2814,3987 2814,3987}(R)LQCLDVPIVEPVA Carbamidometilo (C)

CQASYPGMISPR(M) Propionamida (C) ^{2830,5112 2830,3936 2830,3936}(R)LQCLDVPIVEPV Carboximetilo ACQASYPGMISPR(M) Oxidación Propionamida

^{2833,4913 2833,3569 2833,3569}(R)LQCLDVPIVETV 2 Carbamidometilo DCEAAYPGMISPR(M)

^{2847,5160 2847,3725 2847,3725}(R)LQCLDVPIVETV Carbamidometilo (C)

DCEAAYPGMISPR(M) Propionamida

Las secuencias en la Tabla 2 son las que siguen a continuación:

EJEMPLO 3

Perfilado de múltiple sustratos en isoformas de tripsina ZT

El perfilado múltiple de sustratos se usó para analizar la especificidad del sustrato de enzimas (proteinasas) (O'Donoghue, Eroy-Reveles et al., 2012, Nat Methods 9: 1095-1100). Las proteinasas pueden escindir sustratos en diferentes restos amino dentro de una secuencia peptídica, lo que demuestra una diferencia en la especificidad del sustrato. Las tripsinas se especifican por su preferencia al escindir el C-terminal en restos de arginina o lisina.

Isoformas enzimáticas

Las isoenzimas de tripsina de bacalao se separaron aplicando tripsina de bacalao purificada con benzamidina a una columna de intercambio iónico MonoQ HR 5/5. Para el aislamiento de la tripsina I, la columna se equilibró con Tris 20 mM, etanolamina 5 mM, CaCh 10 mM, pH 9,1, y las enzimas se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl 0 200 mM en 80 volúmenes de columna, gradiente lineal de NaCI 200-1000 mM en 10 volúmenes de columna a un caudal de 1 ml/min. El pH de la muestra se ajustó a pH 9,1 con NaOH 1 M antes de la aplicación.

Para el aislamiento de las isoformas de tripsina ZT, la columna se equilibró con Tris 25 mM, CaCl²25 mM, glicerol al 15 % (vol/vol), pH 7,5, y las enzimas se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl 0-150 mM en 5 volúmenes de columna, gradiente lineal de NaCl 150-550 mM en 20 volúmenes de columna, gradiente lineal de NaCl 500-1000 mM en 1 volumen de columna a un caudal de 1 ml/min.

La composición de ambas muestras enzimáticas (tripsina ZT y tripsina I) se ajustó de forma que la concentración final de Tris fuera 60 mM, CaCl²30 mM y glicerol al 15 % (vol/vol) con un pH de 8,5.

Análisis del perfilado múltiple de sustratos

Las isoformas de tripsina ZT o de tripsina I purificadas se incubaron (5, 15 y 60 min.), con una biblioteca de péptidos (124 péptidos definidos, secuencias de 14-meros, total de 1612 enlaces peptídicos) con una amplia diversidad fisicoquímica como se describe en O'Donoghue, Eroy-Reveles et al. (O'Donoghue, Eroy-Reveles et al., 2012, Nat Methods 9: 1095-1100). Después de la incubación, los sitios de escisión se identificaron mediante análisis de espectrometría de masas (O'Donoghue, Eroy-Reveles et al., 2012, Nat Methods 9: 1095-1100).

Resultados

El análisis del perfilado múltiple de sustratos mostró inesperadamente que existen numerosos sitios de escisión únicos para las isoformas de tripsina ZT en comparación con la tripsina I, desvelados en el documento WO 2000078332 (FIG. 4 y Tabla 4). Además, se identificaron los sitios de escisión que mostraban una escisión preferente por las isoformas de tripsina ZT en comparación con la tripsina I (Tabla 4). Basándose en los resultados del análisis del perfilado múltiple de sustratos, se generó una tabla que contiene valores numéricos basados en la relación de puntuaciones estándar (puntuación Z) en las posiciones P4-P4' en el sustrato donde se comparó la especificidad del sustrato de la tripsina ZT con la tripsina. I (Tabla 3). Los valores positivos (puntuación Z) reflejan una preferencia por el residuo de aminoácido en una determinada posición P a favor de las isoformas de tripsina ZT en comparación con la tripsina I. De forma inesperada, el perfilado múltiple de sustratos en isoformas de tripsina ZT reveló que los aminoácidos que rodean a la arginina o la lisina en un sustrato tiene un efecto diferente sobre su escisión en comparación con la tripsina I.

La Tabla 3 muestra valores numéricos basados en la relación de puntuaciones estándar (puntuación Z) en las posiciones P4-P4' en el sustrato que comparan la especificidad del sustrato de la tripsina ZT y la tripsina I después de la incubación durante 5, 15 y 60 min. Los restos de aminoácido en un sustrato sometido a escisión se denominaron P1, P2, P3, P4 en la dirección N-terminal del enlace escindido (Schechter y Berger, 1967, Biochem Biophys Res Commun 27: 157-162, Schechter y Berger, 1968, Biochem Biophys Res Commun 32: 898-902). Los restos en la dirección C-terminal se denominan P1', P2', P3', P4'. Las posiciones P se proporcionan en las columnas y las filas muestran aminoácidos en las diferentes posiciones P. Los valores positivos (puntuación Z) en la tabla reflejan una preferencia por el resto de aminoácido en una posición P determinada a favor de las isoformas de tripsina ZT en comparación con la tripsina I. Los valores negativos (puntuación Z) reflejan una preferencia a favor de la tripsina I en comparación con la tripsina ZT. Por ejemplo, basándose en los valores de la Tabla 3, se puede observar que la tripsina ZT es mucho más adecuada para escindir péptidos que contienen varios restos consecutivos con carga positiva (arginina o lisina) en comparación con la tripsina I. De nuevo, esos tipos de secuencias, que son las secuencias de aminoácidos ricas en lisina y arginina, se encuentran con frecuencia en toxinas proteicas, proteínas y péptidos involucrados en la patogénesis (Suzuki, Orba et al., 2010, PLoS Pathog 6: e1000801, Fentress, Steinfeldt et al., 2012, Cell Microbiol 14: 1921-1933, Jiang, Cun et al., 2012, J Virol 86: 7256-7267, Milletti, 2012, Drug Discov Today 17:850-860, Gallaher y Garry, 2015, Viruses 7: 285-305). Como se mencionó anteriormente, las isoformas de tripsina ZT tienen por lo tanto propiedades beneficiosas contra las proteínas responsables de la patogenicidad de muchos microorganismos.

T l

La Tabla 4 muestra las intensidades de iones precursores de péptidos seleccionados a partir del perfilado múltiple después de la incubación con tripsina ZT o con tripsina I. Las intensidades de iones precursores son intensidades de picos peptídicos en la MS antes de la fragmentación que representan una medida de la abundancia relativa para una especie dada. X, en la secuencia peptídica, indica un marcador de posición para la ausencia de un aminoácido en una secuencia peptídica. Los datos muestran que las isoformas de tripsina Z^tpueden escindir de forma exclusiva tres secuencias peptídicas (QGKKAPXX, WGⁿR^sPLE y QAVRPNGM) en comparación con la tripsina I. Además, los datos muestran que las isoformas de tripsina ZT escinden preferentemente dos péptidos en comparación con la tripsina I. Las isoformas de tripsina ZT pudieron escindir XIARQPWN en 5 minutos y FDNRVGKW en 15 minutos, mientras que la escisión dentro de estos dos péptidos solo se detectó con la tripsina I después de 60 minutos de incubación.

T l 4

EJEMPLO 4

Purificación de las isoformas de tripsina ZT de bacalao a partir de extracto concentrado de visceras de bacalao

Aproximadamente 12 litros de concentrado ultrafiltrado y diafiltrado como se obtuvo en el Ejemplo 1 se aplicaron a una serie continua conectada de columnas de cromatografía empaquetadas de aproximadamente 1 litro, la primera conteniendo una resina de intercambio catiónico de flujo rápido de CM (GE healthcare), la segunda conteniendo un ligando de afinidad de p-aminobenzamidina acoplada a una resina de Sepharose (GE healthcare) y la tercera una resina de intercambio aniónico de flujo rápido de DEAE (GE healthcare). Las columnas de CM y paminobenzamidina se equilibraron previamente con aproximadamente 10 volúmenes de columna de tampón Tris 25 mM a pH 7,8, que contenía cloruro cálcico 2,5 mM. El concentrado se bombeó sobre las columnas de CM y paminobenzamidina a un caudal de aproximadamente 100 ml por minuto. Cuando la aplicación de la solución concentrada en las columnas se completó, el material residual se eliminó del sistema de columna continua mediante lavado con aproximadamente 8 litros de tampón A. Una vez completado este lavado, la columna de afinidad de paminobenzamidina se desconectó de la columna de CM y se lavó con aproximadamente 5 volúmenes de columna de una solución con alto contenido de sal de tampón Tris 25 mM a pH 7,5 que contenía NaCl 0,5 M y cloruro cálcico 2,5 mM. A continuación, las tripsinas de bacalao se desorbieron del ligando de afinidad y se eluyeron de la columna con una solución ácida de ácido acético 25 mM a pH 3,2 que contenía cloruro cálcico 10 mM y glicerol al 30 %. La fracción de tripsina de bacalao se recogió en un tampón de neutralización de Tris 200 mM a pH 8,5 que contenía glicerol al 30 %. La columna de intercambio aniónico de DEAE se equilibró previamente con aproximadamente 10 volúmenes de columna de tampón Tris 25 mM a pH 7,8, que contenía cloruro cálcico 2,5 mM. La fracción de tripsina de bacalao se aplicó a la resina de intercambio aniónico de DEAE y se lavó con aproximadamente 5 volúmenes de columna del tampón de equilibrado. Las isoformas de tripsina ZT a continuación se desorbieron de la columna usando una solución de oscuras salino de NaCI hasta 0,9 M. La preparación de isoforma de tripsina ZT de bacalao purificada era homogénea mediante electroforesis SDS PAGE y cromatografía FPLC Mono Q. la preparación purificada se esterilizó con filtro a través de un filtro de 0,22 micrómetros y se almacenó congelada a aproximadamente -20 °C.

EJEMPLO 5

Preparación de una preparación de hidrogel de tripsinas de bacalao, que incluye isoformas de tripsina ZT de bacalao

La preparación que contenía isoforma de tripsina ZT de bacalao purificada del Ejemplo 2 se mezcló con gel hidrocoloide que comprendía un gel acuoso que contenía un 0,8 % en p/v de Carbómero 940 y un 40 % de glicerol. La preparación de tripsina de bacalao se mezcló en una proporción de 1:1 con el hidrogel para dar una concentración final de 4 unidades enzimáticas por mg (U/mg) de la mezcla final de gel-enzima (la pomada de hidrogel enzimático), siendo la unidad de enzima determinada usando Cbz-GPR-pNA como sustrato como se describió anteriormente. Por lo tanto, la pomada de hidrogel enzimático resultante contenía aproximadamente 0,01 mg/ml, o 1 U/ml de las enzimas tripsina de bacalao, Carbómero 940 al 0,4 %, glicerol al 20 % y paraoxibenzoato al 0,04 %.

EJEMPLO 6

Actividad antiviral de las isoformas de tripsina ZT contra enterovirus como modelo para rinovirus

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una isoforma de tripsina ZT de bacalao aislada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.

2. La isoforma de tripsina ZT de bacalao aislada de acuerdo con la reivindicación 1, seleccionada entre tripsina ZT-1 de bacalao, que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2; tripsina ZT-2 de bacalao que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 3; tripsina ZT-3 de bacalao que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 4; y tripsina ZT-4 de bacalao que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 5.

3. Una composición que comprende al menos una isoforma de tripsina ZT de bacalao de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, junto con excipientes y vehículos adecuados.

4. La composición de acuerdo con la reivindicación 3, en la que dicha(s) isoforma(s) de tripsina ZT de bacalao están presentes en mezcla con otras tripsinas de bacalao.

5. La composición de acuerdo con la reivindicación 4, en la que dicha(s) isoforma(s) de tripsina ZT de bacalao comprenden al menos un 5 % (p/p) del contenido total de tripsinas de bacalao en dicha composición.

6. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, que se puede administrar por vía tópica, como una loción, un hidrogel, una pulverización bucal o una pulverización nasal.

7. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, que además comprende un alcohol polivalente, tal como glicerol.

8. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, para uso en terapia.

9. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, para uso para (a) tratar o prevenir una enfermedad causada por un organismo patógeno seleccionado entre el grupo que consiste en un virus, una bacteria, un hongo, un parásito y un protozoo;

(b) tratar o prevenir una enfermedad del tracto respiratorio superior causada por organismos patógenos tales como virus, bacterias y hongos;

(c) tratar o prevenir dolor, inflamación aguda, inflamación crónica, artritis, articulaciones inflamadas, bursitis, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis séptica, fibromialgia, lupus eritematoso sistémico, flebitis, tendinitis, erupción cutánea, psoriasis, acné, eccema, eccema facial seborreico, eccema de las manos, cara o cuello, infecciones del prepucio, pie de atleta, infecciones por fístulas, úlceras tópicas infectadas, infecciones del ombligo en recién nacidos, arrugas, cicatrices, queloides, forúnculos, verrugas y picazón alérgica, hemorroides, una infección fúngica y un trastorno inmunológico incluyendo una enfermedad autoinmune;

(d) el tratamiento de infecciones por heridas y heridas de quemaduras; y/o

(e) eliminar la piel muerta o descamada de piel de otro modo sana.

10. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, para uso cosmético.

11. La composición para uso cosmético, de acuerdo con la reivindicación 10, comprendiendo además dicha composición un compuesto cosméticamente activo adicional.

12. Un método para preparar isoformas de tripsina ZT de bacalao que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una cualquiera de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 5, que comprende

(i) preparar un extracto acuoso de vísceras de bacalao,

(ii) someter el extracto acuoso al menos a una etapa de cromatografía, incluyendo una etapa de cromatografía de afinidad usando un ligando de afinidad de p-aminobenzamidina, y

(iii) desorber y eluir las isoformas de tripsina ZT de bacalao unidas al ligando de afinidad de paminobenzamidina.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, que además comprende al menos una etapa que usa una resina de intercambio aniónico después de dicha etapa (ii) de cromatografía de afinidad y/o

que además comprende al menos una etapa que usa una resina de intercambio catiónico antes de la etapa (ii) de cromatografía de afinidad.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, en el que dichas isoformas de tripsina ZT de bacalao desorbidas y eluidas se filtran para esterilización usando un filtro con un tamaño de poro de 0,45 pm o menor.

15. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que dichas isoformas de tripsina ZT de bacalao se seleccionan entre tripsina ZT-1, que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2; tripsina ZT-2 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 3; tripsina ZT-3 que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 4; y tripsina ZT-4, que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 5, o una mezcla de las mismas.