CN105330746A - 一种聚乙二醇修饰的人干扰素与人抗菌肽融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种聚乙二醇修饰的人干扰素IFN-α2a与人抗菌肽LL-37融合蛋白。所获得的IFN-α2a与LL-37融合蛋白同时具有IFN-α2a的抗病毒活性和LL-37的抗菌活性，同时其大鼠体内半衰期由单用IFN-α2a的9.3小时延长到78小时以上。

Description

一种聚乙二醇修饰的人干扰素与人抗菌肽融合蛋白

技术领域

本发明属于生物工程技术领域

背景技术

Cathelicidin家族是一类在哺乳动物、禽类、鱼类及爬行动物体内表达的保守的抗菌肽。LL-37是人体唯一合成的Cathelicidin家族抗菌肽，主要由免疫细胞和上皮细胞表达合成。LL-37的序列为LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES，因前两个均为LL(亮氨酸)且序列长度为37而得名。LL-37通过结构中形成的正6个正电荷的双亲超螺旋与细菌细胞膜磷脂的亲水部结合，然后其疏水部翻转插入磷脂双分子层，从而引起细胞膜的破坏。LL-37对革兰氏阳性和阴性菌均有效果，其抗菌谱广，受到研究与应用领域的广泛重视。

干扰素是由免疫细胞产生的一类糖蛋白，具有抗肿瘤、抗病毒和调节免疫的作用，在临床上获得广泛应用。干扰素在临床上使用存在的主要问题是由于其分子量小，容易被血清中的蛋白酶降解和被肾小球过滤掉。克服干扰素使用过程中缺陷的有效手段，一是通过融合表达，增加分子量；二是通过表面修饰，防止蛋白酶的降解。

发明内容

1PEG表观质量检测

PEG5000、PEG10000、PEG20000用硼酸-硼砂缓冲液(pH9.0)溶解成终浓度10mg/mL。进行SDS-PAGE分析，采用而磺染色，用凝胶成像系统拍照。

2PEG分子量对修饰产物的影响

配制蛋白浓度0.6mg/mL3份，按蛋白∶PEG(摩尔比)＝1∶10分别加入mPEG5000-SS、PEG10000-SS和PEG20000-SS，反应条件为4℃、6h，取样进行SDS-PAGE分析。

3融合蛋白浓度对产物修饰率的影响

按浓度梯度0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL，蛋白∶mPEG-SS(摩尔比)＝1∶10修饰反应液，反应条件为4℃、6h，取样分析融合蛋白修饰率。

4蛋白与mPEG-SS摩尔比对产物修饰率的影响

在上述确定的最佳蛋白浓度下，分别取蛋白∶mPEG-SS(摩尔比)＝1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25制备修饰反应液，反应条件为4℃、6h，取样分析融合蛋白修饰率。

5反应时间对产物修饰率的影响

在前述确定的蛋白浓度、蛋白PEG摩尔比、温度条件下，制备7份反应液，分别反应2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h，取样分析融合蛋白修饰率。

6反应温度对产物修饰率的影响

在前述确定的蛋白浓度与蛋白PEG摩尔比的条件下，制备4份修饰反应液，分别在4℃、10℃、20℃、30℃条件下反应6h，取样分析融合蛋白修饰率。

7pH对融合蛋白修饰率的影响

在前述确定的最优条件下，制备10份反应液，分别调节pH为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，取样分析融合蛋白修饰率。

8聚乙二醇修饰的人干扰素与人抗菌肽融合蛋白

8.1相对分子质量与修饰率的测定

通过凝胶电泳成像系统获得凝胶图谱，用系统软件进行扫描分析。根据蛋白Marker估计PEG及其修饰产物的相对分子质量，并按下式计算蛋白修饰率：

8.2修饰产物的体外活性检测

修饰产物的干扰素活性按《中国药典》三部(2010版)附录中干扰素将从测定方法检测其体外活性，并对照原料蛋白活性，计算活性保留率。

修饰产物的抗菌活性用大肠杆菌ATCC25922作为检测菌种，用双层琼脂糖打孔法测定。底层培养基上打直径3mm的圆孔，每孔加10μL发酵液，37℃孵化3h后，在底层上覆盖一层营养琼脂，37℃继续培养20h，测量无菌生长的透明圈直径。并对照原料蛋白活性，计算活性保留率。

8.3修饰产物半衰期的测定

从皮下给SD大鼠单剂量注射人IFN-α2a或经PEG修饰的人IFN-α2a与人LL-37融合蛋白，注射剂量分别为2.5μg/kg和5μg/kg。选取不同的时间点抽取SD大鼠的血液样品，肝素抗凝，离心后用人IFNαELISA试剂盒测定血浆中融合蛋白的量。

附图说明

图1PEG₅₀₀₀、PEG₁₀₀₀₀与PEG₂₀₀₀₀的SDS-PAGE图谱

图2PEG分子量对LL-37与IFN-α2a融合蛋白修饰的影响

注：图中Marker为蛋白质分子量标准(低)；0为未修饰的融合蛋白；1为PEG₅₀₀₀修饰的融合蛋白；2为PEG₁₀₀₀₀修饰的融合蛋白；3为PEG₂₀₀₀₀修饰的融合蛋白。

图3融合蛋白浓度对产物修饰率的影响

图4蛋白与PEG摩尔比对融合蛋白修饰率的影响

图5反应时间对融合蛋白修饰率的影响

图6反应温度对融合蛋白修饰率的影响

图7pH对融合蛋白修饰率的影响

具体实施方式

下面结合附图和实施例子对本发明作进一步说明，但本发明并不限于此。

1PEG的表观分子量

三种分子量的PEG的SDS-PAGE结果见图1。

与蛋白Marker相比，PEG₅₀₀₀的分子量约为14000，PEG₁₀₀₀₀的分子量约为29000，PEG₂₀₀₀₀的分量约为40000，这与其实际的分子量均偏大。PEG₅₀₀₀与PEG₁₀₀₀₀约偏大3倍，PEG₂₀₀₀₀约偏大2倍。偏大的原因与SDS-PAGE测量分子大小是依据链长度为标准有关。在相同链长条件下，组成链长单元的平均氨基酸分子量要比乙二醇大，故在以蛋白为标准对照的体系中，PEG的表观分子量就显得偏大。

2PEG分子量对修饰产物的影响

PEG分子量对LL-37与IFN-α2a融合蛋白修饰的影响见图2。

从图中可以看出，对比未修饰的融合蛋白条带，三种分子量PEG修饰的融合蛋白均未完全修饰，其中PEG₅₀₀₀修饰后残留的未修饰所占比重最小，约为12％。在PEG₅₀₀₀所修饰的条带中，依次出现了三条带，对应分子量分别为约39000、53000和67000，这与PEG₅₀₀₀单分子修饰、双分子修饰和三分子修饰融合蛋白的分子量相当(PEG表观分子量+融合蛋白分子量)，表明在修饰过程中，PEG对融合蛋白的修饰位点可以有三个，并可同时实现修饰。PEG₁₀₀₀₀的修饰产物中，只出现了单点修饰和二点修饰，未见有明显的三点修饰条带。PEG₂₀₀₀₀的修饰产物中，只出现了一个条带，可能只有明显的单点修饰发生。出现这种情况可能的原因是分子量越大，相对移动速度就越低，因此产生修饰所需的碰撞概率就降低，从而导致PEG分子量越大，修饰越困难。如果PEG的分子量过小，有可能会导致修饰后对蛋白的保护作用也相应减弱，因此，综合考虑选择PEG₅₀₀₀作为后续实验的分子量。

3重融合蛋白浓度对产物修饰率的影响

融合蛋白浓度对产物修饰率的影响结果见图3。

从图中可以看出，融合蛋白浓度在0.4mg/mL～0.7mg/mL时，修饰率较高，其中在0.6mg/mL时修饰率最高，达到84％。按一级化学反应理论，反应物的浓度越高，反应速度越快，因此随蛋白浓度的升高，修饰反应速度应该越来越快，但修饰率却并未一直随蛋白浓度升高而增加，反而在高浓度时出现下降的，这可能是因为蛋白浓度升高后，在PEG浓度不变的情况下，PEG受限所引起。综合各方面情况，选择0.6mg/mL为最佳蛋白浓度。

4蛋白与PEG摩尔比对融合蛋白修饰率的影响

蛋白与PEG摩尔比对融合蛋白修饰率的影响结果见图4。

从图中可以看出，蛋白与PEG₅₀₀₀的摩尔比为1∶10时，融合蛋白的修饰率达到最大值。低于1∶10修饰率下降，可能是PEG摩尔浓度低，反应速率下降的原因。摩尔比超过1∶10后，反应速率越下降，可能是由PEG自身浓度升高后，体系粘度也升高，导致PEG扩散速率下降所致。综合以上实验结果，应选择蛋白与PEG₅₀₀₀的摩尔比为1∶10为最佳反应条件。

5反应时间对融合蛋白修饰率的影响

反应时间对融合蛋白修饰率的影响见图5。

从图5中可以看出，PEG对融合蛋白的修饰反应速度在2小时以内较快，修饰率直线上升，至2小时时，修饰率已经达到75％以上。2小时之后，反应速率逐渐下降，至第4小时后，反应速率趋于零，表现为修饰率自2小时后上升速度逐渐降低，至4小时后，累积修饰率达到85％以上后，基本不在上升，维持平衡。从尽可能提高修饰速率的角度考虑，选择4小时为最佳修饰反应时间。

6反应温度对融合蛋白修饰率的影响

反应温度对融合蛋白修饰率的影响见图6。

从图中可以看出，温度对提高融合蛋白修饰率未有明显的影响。根据化学反应的一级方程理论，随温度升高分子扩散加快，反应速率相应上升，但在本实验中，并未表现出对修饰速率的影响。因此融合蛋白修饰的速度可能受温度的影响，在反应时间4h以上，温度并不会对修饰率产生明显影响。温度对修饰速率影响的具体情况需要进一步研究。从更好保持蛋白的稳定性角度考虑，选择4℃为融合蛋白修饰反应的温度。

7pH对融合蛋白修饰率的影响

pH对融合蛋白修饰率的影响见图7。

从图7中可以看出，随pH的升高，修饰率逐渐升高。PEG与蛋白的修饰反应主要是PEG的羟基与蛋白氨基酸残基的氨基或羧基发生缩合反应。碱性环境对羟基的缩合反应有利，酸性环境却有利于酯键的水解。因此，在碱性环境下，PEG对融合蛋白的修饰能力将会加强。从实验结果看，在pH9左右时，反应速率达到最高值，因此pH9为PEG₅₀₀₀对LL-37与IFN-α2a融合蛋白修饰的最佳pH条件。

8修饰产物的体外活性检测

经检测，LL-37与IFN-α2a融合蛋白中原始干扰素的活性为7.86×10⁶IU/mg。经上述探索的最佳工艺修饰后，LL-37与IFN-α2a融合蛋白的活性为4.58×10⁶IU/mg，干扰素活性保持率为58.3％。另外，LL-37与IFN-α2a融合蛋白原始的抗菌活性为1.32cm/mg，修饰后为1.28cm/mg，抗菌活性保持率为97.0％，表明PEG对LL-37与IFN-α2a融合蛋白的修饰对其中LL-37部分没有明显的影响。

9修饰产物的半衰期

为了比较和测定PEG修饰的人IFN-α2a和人LL-37融合蛋白的代谢，采用了SD大鼠皮下注射给药，不同时间点采取血液样品并特异性检测人源IFN-α2a。SD大鼠皮下注射PEG修饰的人IFN-α2a和人LL-37融合蛋白5μg/kg，对照组皮下注射IFN-α2a2.5μg/kg。注射后采集外周血，用ELISA检测血液中的IFN-α2a蛋白浓度。结果显示，IFN-α2a标准蛋白注射的大鼠在4.8h后血药浓度达到峰值12.3ng/mL，9.3h下降为6.15ng/mL，17小时后恢复至底线。而PEG修饰的人IFN-α2a和人LL-37融合蛋白的吸收较为缓慢，在注射后16.7h达到血药峰值18.3ng/mL，至78h达到半衰期，血液中可检测到存留时间直到140h以上。

Claims (7)

1.一种聚乙二醇修饰的人干扰素与人抗菌肽融合蛋白。

2.权利要求1的人干扰为人IFN-α2a。

3.权利要求1的人抗菌肽为人LL-37。

4.权利要求1的人干扰素与人抗菌肽融合蛋白，是由人IFN-α2a与人LL-37之间由接头GlyGlyGlyGlySer连接而成。

5.权利要求1的聚乙二醇修饰的人干扰素与人抗菌肽融合蛋白，系由人IFN-α2a与人LL-37融合蛋白，在PEG分子量为5000、融合蛋白浓度为0.6mg/mL、蛋白与PEG₅₀₀₀的摩尔浓度比为1∶10、反应温度为4℃、反应时间为4h、pH为9.0等条件下修饰而成。

6.权利要求1的聚乙二醇修饰的人干扰素与人抗菌肽融合蛋白同时具有人IFN-α2a的抗病毒活性与人LL-37的抗细菌活性。

7.权利要求1的聚乙二醇修饰的人干扰素与人抗菌肽融合蛋白在动物体内的半衰期相对于单体的IFN-α2a由9.3h延长了到78h以上。