CN104434817A - 一种利拉鲁肽的注射用缓释微球制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利拉鲁肽的注射用缓释微球制剂，由利拉鲁肽、聚乙丙交酯和聚乙烯醇组成，其中利拉鲁肽、聚乙丙交酯和聚乙烯醇的重量比为1:15:30。其制备方法采用复乳法制备，离心得缓释微球后冻干既得。本发明的制剂稳定性良好，载药量大，包封率高，加速试验条件不发生降解、聚集，且体内安全性良好。

Description

一种利拉鲁肽的注射用缓释微球制剂

技术领域

本发明涉及一种药物制剂，尤其涉及一种多肽类药物利拉鲁肽的注射用缓释微球制剂。

背景技术

利拉鲁肽，英文通用名为liraglutide，是一种人工合成的人胰高血糖素样肽-1类似物，由31个氨基酸残基构成，其氨基酸序列为：H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-y-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。

目前市场上可以获得的利拉鲁肽制剂为注射剂，给药途径为皮下注射。由于多肽药物进入体内易被降解，血浆半衰期较短，因此需要每日给药三次，由此导致患者顺应性较低，容易忘记给药，不利于患者自行给药。

多肽药物的缓释制剂通常采用化学修饰方法或采用缓释制剂技术。其中对多肽药物进行PEG修饰或融合蛋白修饰对延长多肽药物的体内半衰期较为有效，但所制备的缓释制剂价格昂贵，导致患者经济负担过重。

缓释制剂技术在多肽药物中的应用目前仅有及少数案例获得成功。其中一种人胰高血糖素样肽-1类似物艾塞那肽(Exenatide)的缓释制剂(商品名BYDUREON)已在国外被批准上市。其缓释制剂采用聚乙丙交酯和蔗糖作为辅料，具有显著的缓释效果，能够有效降低用药频率。但近年研究证实，BYDUREON与艾塞那肽的普通注射剂相比能够显著增加甲状腺C细胞癌的风险，因此存在显著的不良作用。该药目前已被美国食品药品管理局在说明书中标识黑框警告。

关于利拉鲁肽的缓释制剂目前尚无该类产品上市。国内公开的专利文献CN102429876A(公开日2012年5月2日)公开了一种利拉鲁肽的缓释微球制剂，由利拉鲁肽和生物可降解材料组成，其中生物可降解材料选自聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物，乙交酯-丙交酯共聚物，聚乙醇酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸-聚己内酯共聚物或PLCG-聚己内酯，或其中任意两种或两种以上的混合物。该缓释微球制剂的体外累计释放实验显示其缓释可达28-30天。但该文献说明书附图部分给出的体内药效学实验结果显示，该缓释微球给药后第1、7、14、28天采血样测定血糖浓度，结果采样日均表现出显著的血糖峰谷现象，说明其体内药物释放存在不稳定的突释现象，从而导致了血糖忽高忽低的问题，以上问题在体外累计释放实验中未能被发现，且上述制剂的体内安全性尚未得到证实。对于缓释效果达到28-30天的缓 释制剂而言，随有利于降低给药频率，但由于载药量过大，一旦出现药物突释即会导致血糖的急剧降低诱发低血糖昏迷等问题，因此，目前治疗糖尿病的多肽药物的缓释剂型或者经化学修饰的缓释多肽，通常设计为每日或每周给药一次，每月给药一次的降血糖药物，相对于其突释风险而言，其缓释效果的收益已不再重要，因此此类缓释制剂尚见被批准上市。

本发明人对利拉鲁肽的缓释微球制剂进行了研究，发现使用现有技术中的方法和常规方法制备的利拉鲁肽缓释制剂存在不稳定，突释、包封率和载药量不理想等诸多缺点，而目前药物缓释微球制剂的研究中，虽然根据药物的理化性质解决微球的载药量和包封率等技术问题已有一定的经验可供遵循，但对提高微球的稳定性以及有效避免药物突释问题，尚缺乏可供普遍遵循的经验和技术教导。尤其是对于人胰高血糖素样肽-1类似物多肽乙交酯-丙交酯共聚物缓释微球制剂引发的甲状腺C细胞癌风险，尚未见降低其发病率的有效手段。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的在于提供一种利拉鲁肽的缓释制剂，具体的说是一种利拉鲁肽的注射用缓释微球制剂。

本发明的另一方面还提供了一种利拉鲁肽注射用缓释微球制剂的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种利拉鲁肽的注射用缓释微球制剂，其配方中包括利拉鲁肽、聚乙丙交酯和聚乙烯醇，其中，利拉鲁肽、聚乙丙交酯和聚乙烯醇的重量比为1:15:30。

所述聚乙丙交酯中乙交酯、丙交酯的摩尔比例为30:70。

本发明还提供本发明利拉鲁肽的注射用缓释微球制剂的制备方法，包括以下步骤：

1)将利拉鲁肽溶于灭菌注射用水，调整溶液浓度为6mg/ml，用pH调节剂调节pH为8.0～8.3；

2)将聚乙丙交酯溶于二氯甲烷，调整溶液浓度为90mg/ml，用pH调节剂调节pH为8.0～8.3；

3)将内水相与油相混合，冰浴条件下15000转/分钟搅拌30分钟,4℃下静置24小时得初乳；

4)将聚乙烯醇溶于灭菌注射用水，用pH调节剂调节pH为8.0～8.3；

5)将步骤4)所得溶液加入步骤3)所得初乳，30000转/分钟搅拌30分钟得复乳；

6)将步骤5)所得复乳6000转/分钟离心30分钟，收集微球，用灭菌注射用水冲洗，冻干得利拉鲁肽注射用缓释微球。

所述步骤1)中调节pH值采用的调节剂为碳酸氢钠溶液；

所述步骤2)中调节pH值采用的调节剂为氢氧化钠溶液；

所述步骤4)中调节pH值采用的调节剂为磷酸二氢钠缓冲溶液。

本发明人对利拉鲁肽的缓释制剂进行了大量研究。在研究过程中，本发明人惊奇的发现，采用利用缓释微球技术结合特殊材料的使用可获得利拉鲁肽的稳定性良好、载药量大、包封率高的缓释微球制剂，且采用本发明组方和制备工艺，能够有效提高利拉鲁肽缓释微球的稳定性，避免药物体内突释，且体外致突变实验表明本发明的缓释微球制剂无诱癌风险。本发明所采用的制备方法简单，工艺条件易控制，适于大规模工业化生产，并易于得到质量稳定的产品，批间差异小，便于质量控制。

附图说明：

附图1：本发明实施例1制备的利拉鲁肽缓释微球制剂的药时曲线，横坐标给药后时间-小时，纵坐标血药浓度-ng/ml，采血时间点为给药后第0、12、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240h；

附图2：本发明实施例2制备的利拉鲁肽缓释微球制剂的药时曲线，横坐标给药后时间-小时，纵坐标血药浓度-ng/ml，采血时间点为给药后第0、12、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240h；

附图3本发明实施例3制备的三种利拉鲁肽缓释微球制剂对比制剂的药时曲线，横坐标给药后时间-小时，纵坐标血药浓度-ng/ml，采血时间点为给药后第0、12、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240h。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的解释。应当理解的是，以下实施例仅用于解释本发明，而不是限制本发明的保护范围。

实施例1利拉鲁肽注射用缓释微球的制备

配方

利拉鲁肽        10mg

聚乙丙交酯      150mg

聚乙烯醇        300mg

制备方法

1)将利拉鲁肽溶于灭菌注射用水，调整溶液浓度为6mg/ml，用碳酸氢钠溶液调节pH为8.0～8.3；

2)将聚乙丙交酯溶于二氯甲烷，调整溶液浓度为90mg/ml，用氢氧化钠溶液调节p为8.0～ 8.3；

3)将内水相与油相混合，冰浴条件下15000转/分钟搅拌30分钟,4℃下静置24小时得初乳；

4)将聚乙烯醇溶于灭菌注射用水，用磷酸二氢钠缓冲溶液调节pH为8.0～8.3；

5)将步骤4)所得溶液加入步骤3)所得初乳，30000转/分钟搅拌30分钟得复乳；

6)将步骤5)所得复乳6000转/分钟离心30分钟，收集微球，用灭菌注射用水冲洗，

冻干得利拉鲁肽注射用缓释微球。

实施例2利拉鲁肽注射用缓释微球的制备

配方

利拉鲁肽        10mg

聚乙丙交酯      150mg

聚乙烯醇        300mg

制备方法

1)将利拉鲁肽溶于灭菌注射用水，调整溶液浓度为6mg/ml，用磷酸二氢钠缓冲溶液调节pH为8.0～8.3；

2)将聚乙丙交酯溶于二氯甲烷，调整溶液浓度为90mg/ml，用碳酸氢钠溶液溶液调节pH为8.0～8.3；

3)将内水相与油相混合，冰浴条件下15000转/分钟搅拌30分钟,4℃下静置24小时得初乳；

4)将聚乙烯醇溶于灭菌注射用水，用磷酸二氢钠缓冲溶液调节pH为8.0～8.3；

5)将步骤4)所得溶液加入步骤3)所得初乳，30000转/分钟搅拌30分钟得复乳；

6)将步骤5)所得复乳6000转/分钟离心30分钟，收集微球，用灭菌注射用水冲洗，冻干得利拉鲁肽注射用缓释微球。

实施例3利拉鲁肽注射用缓释微球的处方对比

以利拉鲁肽组方，制备成不同的缓释制剂，测定包封率和载药量等技术指标，为对比效果，设对比制剂三种，分别如下：

A：利拉鲁肽，乙交酯、丙交酯摩尔比为50:50的聚乙丙交酯，聚乙烯醇三者重量比为1:0.5:20，采用实施例1的制备方法制备。

B：利拉鲁肽，乙交酯、丙交酯摩尔比为10:90的聚乙丙交酯，聚乙烯醇三者重量比为 1:10:70，采用实施例2的制备方法制备。

C:利拉鲁肽，乙交酯、丙交酯摩尔比为40:60的聚乙丙交酯，聚乙烯醇三者重量比为1:30:10，采用实施例1的制备方法制备。

实施例1和实施例2的制剂分别用D、E代表。包埋率(％)按照如下公式计算包埋率(％)＝(微球载药量/头要比)×100％，其中投药比(％)＝[处方中药物量/(处方中药物量+处方中辅料量)]×100％。载药量(％)按照如下公式计算：载药量(％)＝(微球中药物含量/微球重量)×100％。

	A	B	C	D	E
						包封率	41.8％	57.0％	32.8％	98.3％	99.1％
载药量	1.3％	0.5％	2.9％	9.06％	7.92％

由上表可见，本发明的组方可出乎意料的提高主药的载药量和包封率。

实施例4利拉鲁肽注射用缓释微球的稳定性考察

取实施例1和实施例2制备的利拉鲁肽注射用缓释微球各4份，1份为对照品测定主药含量后室温下留存，另外3份为实验品，分别置光照(4500±500)lx、高温(50±2)℃及高湿(70±5)％条件下放置60天，分别于第10天、30天及60天时取样，观察其外观，测定主药含量。各制剂外观无显著改变，主药含量等无显著差异，制剂中骨钙素未出现降解、聚集等现象。第60天时取样得到的各制剂主药含量数据见表1，其中主药含量以实验品实测主药含量与对照品实测主药含量的百分比表示。

	实施例1样品	实施例2样品
			主药含量	97.1～109.6％	98.6～99.3％

由上表可见，实施例1和实施例2制备的利拉鲁肽注射用缓释微球制剂稳定性较强，高温、高湿、光照条件下放置60天，主药含量无显著减少。

实施例5利拉鲁肽注射用缓释微球的体外释药试验

精密称取实施例1和实施例2制备的利拉鲁肽注射用缓释微球于不同的离心管中，加入pH8.0～8.3的磷酸盐缓冲液，室温下以100转/分钟水浴搅拌，分别于第24、96、192小时从溶液中吸取1ml测定利拉鲁肽含量，计算利拉鲁肽的累积释放量。结果见下表，表中释放量以累计释放的利拉鲁肽占样品制剂中利拉鲁肽含量的百分比表示。

	24h	96h	192h
				实施例1样品释放量	11％	26％	82％
实施例2样品释放量	16％	32％	89％

由上表可见，实施例1和实施例2制备的利拉鲁肽注射用缓释微球制剂有显著的体外缓释作用，且体外无突释现象。

实施例6利拉鲁肽注射用缓释微球的体内药代实验

比格犬，体重7～9kg，5只，雄性，分别于左后肢大腿内侧一次性皮下注射实施例3制备的A～E五种缓释微球制剂，给药剂量以利拉鲁肽计为1mg/kg，给药后分别于第0、12、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240h采血，离心制备血浆，测定血浆中利拉鲁肽药物含量(ng/ml)。结果见说明书附图。

由说明书附图可见，本发明的实施例1和2所制备的利拉鲁肽缓释微球制剂体内有显著的缓释作用，且无突释现象。

实施例7利拉鲁肽注射用缓释微球的致癌实验

菌株：

鼠伤寒沙门氏菌突变株(his-)TA97、TA98、TA100、TA102，由山东省疾病控制中心毒理所提供，本单位液氮冻存保种。经基因型鉴定(组氨酸需求实验，结晶紫抑菌实验，抗氨苄青霉素实验，抗四环素实验，紫外线敏感实验)，自发回变数实验及对阳性致突变物反应实验，各菌株均合格。培养基底层为最低营养V-13培养基，上层为组氨酸生物素软琼脂培养基。

培养基的制备：

营养肉汤培养基：

加热溶解，调pH至7.4，分装后0.103MPa 20min灭菌，普通冰箱保存备用。

底层培养基所需试剂及配制：

磷酸盐贮备液：

加超纯水至100ml，0.103MPa 20min灭菌。

40％葡萄糖溶液 

葡萄糖            40.00g 

加超纯水至100ml，0.55MPa 20min灭菌。

1.5％琼脂培养基 

琼脂粉            6.00g 

加超纯水至        400ml

融化后0.103MPa 20min灭菌。

底层培养基 

趁热(80℃)，在灭菌琼脂培养基中(400ml)依次加入：

磷酸盐贮备液      8ml

40％葡萄糖溶液    20ml

充分混匀，待凉至80℃左右时倒平皿，每皿25ml，37℃培养过夜以除去水份及检查有无污染。

顶层培养基的成分及制备

顶层琼脂

琼脂粉            3.00g 

NaCl              2.50g 

加超纯水至500ml。

0.5mmol/L组氨酸-生物素溶液 

D-生物素          30.50mg 

L-组氨酸          19.50mg 

加超纯水至250ml。

顶层培养基制备

加热融化顶层琼脂，每100ml顶层琼脂中加10ml 0.5mmol/L组氨酸-生物素溶液。混匀，分装在100ml三角瓶中，0.103MPa 20min灭菌。用时融化分装小试管，每管2ml，在45℃中保温。

试验方法

用营养肉汤培养基扩增4株菌株，培养至生长对数期，用自制麦氏比浊管进行比较，调整浓度约为1～2×10⁹个/ml。准备底层培养基。融化顶层培养基分装于无菌小试管，每管1.8ml，45℃保温。在顶层培养基中依次加入新鲜增菌液0.1ml混匀，加受试物0.1ml，混匀迅速倾入底层培养基，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化，37℃倒置培养48h。

四种细菌平皿各分为四组，A组加入用无菌注射用水溶解的实施例1制备的利拉鲁肽注射用缓释微球制剂，以利拉鲁肽计剂量为100μg/ml；B组加入用无菌注射用水溶解的实施例1制备的利拉鲁肽注射用缓释微球制剂，以利拉鲁肽计剂量为100μg/ml；C组加入溶媒无菌注射用水；D组加入阳性对照药1,8-二羟基蒽醌，用二甲基亚砜溶解并稀释成500μg/ml，加入顶层培养基后终浓度为50μg/ml。

实验结果显示，实验菌株A97、TA98、TA100、TA102在利拉鲁肽100μg/ml剂量浓度下平均回变菌落数均是其相应菌株自发回变数的2倍以内，呈阴性结果。结果表明，利拉鲁肽注射用缓释微球制剂体外浓度为100μg/ml对鼠伤寒沙门氏菌无致突变作用。

Claims (4)

1.一种利拉鲁肽的注射用缓释微球制剂，其特征在于，由利拉鲁肽、聚乙丙交酯和聚乙烯醇组成，其中利拉鲁肽、聚乙丙交酯和聚乙烯醇的重量比为1:15:30。乙交酯丙交酯。

2.根据权利要求1所述的利拉鲁肽注射用缓释微球制剂，其特征在于，所述聚乙丙交酯中乙交酯、丙交酯的摩尔比例为30:70。

3.权利要求1或2所述的利拉鲁肽注射用缓释微球制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将利拉鲁肽溶于灭菌注射用水，调整溶液浓度为6mg/ml，用pH调节剂调节pH为8.0～8.3；

2)将聚乙丙交酯溶于二氯甲烷，调整溶液浓度为90mg/ml，用pH调节剂调节pH为8.0～8.3；

3)将内水相与油相混合，冰浴条件下15000转/分钟搅拌30分钟,4℃下静置24小时得初乳；

4)将聚乙烯醇溶于灭菌注射用水，用pH调节剂调节pH为8.0～8.3；

5)将步骤4)所得溶液加入步骤3)所得初乳，30000转/分钟搅拌30分钟得复乳；

6)将步骤5)所得复乳6000转/分钟离心30分钟，收集微球，用灭菌注射用水冲洗，冻干得利拉鲁肽注射用缓释微球。

4.根据权利要求3所述的利拉鲁肽注射用缓释微球制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中调节pH值采用的调节剂为碳酸氢钠溶液；所述步骤2)中调节pH值采用的调节剂为氢氧化钠溶液；所述步骤4)中调节pH值采用的调节剂为磷酸二氢钠缓冲溶液。