CN117398337B - 一种奥拉帕尼缓控释药物组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种奥拉帕尼缓控释药物组合物及其制备方法，属于医药技术领域。制备奥拉帕尼‑人参皂苷Rh2‑鞣花酸共晶后，表面沉积磁性四氧化三铁获得磁性微粒，包埋于叶酸改性脂质体中，加入水凝胶中，反复冻融，制得奥拉帕尼缓控释药物组合物。本发明制得的奥拉帕尼缓控释药物组合物具有生物相容性好、细胞毒性低，能够有效降低药物的突发释放，实现稳定的缓释，在较长时期内维持稳定有效的血浓度，提高其抗肿瘤效应，并减少毒副作用的发生，提高了患者的给药依从性，具有广阔的应用前景。

Description

一种奥拉帕尼缓控释药物组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种奥拉帕尼缓控释药物组合物及其制备方法。
背景技术
奥拉帕尼是聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶(PARP)抑制剂。主要阻滞DNA损伤修复，造成DNA损伤累积，最终杀死肿瘤细胞；除此之外，还能增加细胞对其他内外源DNA损伤因子的敏感性；抑制血管生成；增强正常细胞的免疫力，从而抵抗癌细胞的入侵。
奥拉帕尼对卵巢癌的治疗作用已获得高度认可。EMEA和FDA先后授予奥拉帕尼治疗卵巢癌的孤儿药认证。目前奥拉帕尼正在进行乳腺癌易感基因(BRCA)突变的卵巢癌、胃癌和非小细胞肺癌的临床研究。在对复发性卵巢癌II期维持研究中，携带BRCA突变的卵巢癌患者，从本品单药维持疗法中获得了最大的治疗益处。与安慰剂相比，本品显著延长了患者的无进展生存期(11.2个月vs4.3个月)。2013年美国临床肿瘤学会年会报道，本品的维持治疗使BRCAm患者有最大的临床获益。
中国发明专利CN102238945B中公开一种奥拉帕尼组合物。该组合物中以共聚维酮为基质，并且共聚维酮的用量为57.5％。共聚维酮是N-乙烯基吡咯烷酮(VP)乙酸乙烯酯(VA)的线性共聚物，目前广泛应用于药物制剂中，但是临床研究表明口服后会引起胃部不适。
奥拉帕尼速释制剂正在广泛的研发，但是在生产以及临床运用的过程中，仍显示出较多的局限性：
1)血药浓度峰谷波动严重，剂量限制性毒性明显。速释制剂虽可快速达PARP酶抑制所需的血药浓度水平，但体内消除较快，为长期维持在有效酶抑制所需的血药浓度水平，需较高的口服剂量，稳态血药浓度峰值高于PARP酶IC90值几倍甚至十几倍，产生的较多严重的毒副作用，常见毒副作用有恶心、疲劳、呕吐、腹泻、味觉障碍等，严重副作用包括骨髓增生异常综合征、急性骨髓性白血病及肺炎；
2)生物利用度低，需大剂量服药。市售胶囊生物利用度约10-20％，日剂量为800mg，片剂虽生物利用度有所提高，但日剂量仍为600mg。由于药物的疗效与酶抑制率的维持时间相关，为了维持PARP酶抑制所需的浓度游离血药浓度，需大剂量服药，药物利用率低；
3)临床用药不便，成本高。较大的药物口服剂量(400mg剂量，8颗0#胶囊，BID)，也导致药品的生产、包装、贮存和运输代价高，患者顺应性差。
发明内容
本发明的目的在于提出一种奥拉帕尼缓控释药物组合物及其制备方法，具有生物相容性好、细胞毒性低，能够有效降低药物的突发释放，实现稳定的缓释，在较长时期内维持稳定有效的血浓度，提高其抗肿瘤效应，并减少毒副作用的发生，提高了患者的给药依从性，具有广阔的应用前景。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种奥拉帕尼缓控释药物组合物的制备方法，制备奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶后，表面沉积磁性四氧化三铁获得磁性微粒，包埋于叶酸改性脂质体中，加入水凝胶中，反复冻融，制得奥拉帕尼缓控释药物组合物。
作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：
S1.共晶的制备：将奥拉帕尼溶于二氯甲烷中，将人参皂苷Rh2溶于乙醇中，将鞣花酸溶于二甲亚砜中，将三种溶液混合均匀，敞口至于室温下静置，过滤，球磨，获得奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶粉；
S2.磁性微粒的制备：将铁盐、醋酸铵、柠檬酸钠、步骤S1制得的奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶粉加入乙二醇中，混合均匀，抽真空，惰性气体保护下，加热至第一温度，反应第一时间段，然后升温至第二温度，反应第二时间段，冷却至室温，磁铁分离，洗涤，干燥，制得磁性微粒；
S3.叶酸改性脂质体的制备：将步骤S2制得的磁性微粒、三油酸甘油酯、胆固醇油酸酯、胆固醇、乙醇、丙酮混合均匀，加入磷脂聚乙二醇叶酸、大豆卵磷脂，搅拌混合均匀，制得油相；将脱氧胆酸钠溶于Tris-HCl溶液中，制得水相；将油相加入水相中，乳化，减压去除有机溶剂，制得叶酸改性脂质体；
S4.水凝胶的制备：将聚乙烯醇溶于水中，加入单宁酸和催化剂，室温搅拌反应，透析，透析液干燥，得到改性聚乙烯醇，将壳聚糖溶于酸液中，将改性聚乙烯醇溶于水中，将两者混合均匀，制得水凝胶体系；
S5.奥拉帕尼缓控释药物组合物的制备：将步骤S3制得的叶酸改性脂质体加入步骤S4中的水凝胶体系中，反复冻融，制得奥拉帕尼缓控释药物组合物。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述奥拉帕尼、人参皂苷Rh2和鞣花酸的质量比为10-15∶2-4∶1-3，所述静置的时间为3-5天，所述球磨的时间为1-2h。
作为本发明的进一步改进，步骤S2中所述铁盐、醋酸铵、柠檬酸钠、奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶粉、乙二醇的质量比为1-2∶3-5∶0.3-0.5∶7-10∶60-80，所述铁盐选自氯化铁、硫酸铁、硝酸铁中的至少一种，所述第一温度为160-180℃，所述第一时间段为0.5-1h，所述第二温度为190-210℃，所述第二时间段为7-10h。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述磁性微粒、三油酸甘油酯、胆固醇油酸酯、胆固醇、乙醇、丙酮、磷脂聚乙二醇叶酸、大豆卵磷脂的质量比为10-12∶3-5∶5-7∶2-4∶40-60∶15-20∶4-7∶1-2，所述脱氧胆酸钠、Tris-HCl溶液的质量比为3-5∶100，所述Tris-HCl溶液为pH＝8-9的Tris-HCl溶液，所述油相和水相的质量比为10-12∶17-20。
作为本发明的进一步改进，步骤S4中所述聚乙烯醇、单宁酸、催化剂的质量比为10-12∶4-7∶0.1-0.2，所述催化剂为pH＝8.5-9的Tris-HCl溶液，所述室温搅拌反应的时间为7-10h，所述透析的透析袋孔径为1-1.5kDa，所述酸液为1-2wt％的醋酸或盐酸溶液，所述改性聚乙烯醇、壳聚糖的质量比为12-15∶17-22。
作为本发明的进一步改进，步骤S5中所述叶酸改性脂质体、水凝胶体系的质量比为7-10∶30-50，所述反复冻融的方法为在-20至-25℃冷冻2-4h，室温融化，重复操作3-5次。
作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：
S1.共晶的制备：将10-15重量份奥拉帕尼溶于100重量份二氯甲烷中，将2-4重量份人参皂苷Rh2溶于30-40重量份乙醇中，将1-3重量份鞣花酸溶于10—15重量份二甲亚砜中，将三种溶液混合均匀，敞口至于室温下静置3-5天，过滤，球磨1-2h，获得奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶粉；
S2.磁性微粒的制备：将1-2重量份铁盐、3-5重量份醋酸铵、0.3-0.5重量份柠檬酸钠、7-10重量份步骤S1制得的奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶粉加入60-80重量份乙二醇中，混合均匀，抽真空，惰性气体保护下，加热至160-180℃，搅拌反应0.5-1h，然后升温至190-210℃，搅拌反应7-10h，冷却至室温，磁铁分离，洗涤，干燥，制得磁性微粒；
S3.叶酸改性脂质体的制备：将10-12重量份步骤S2制得的磁性微粒、3-5重量份三油酸甘油酯、5-7重量份胆固醇油酸酯、2-4重量份胆固醇、40-60重量份乙醇、15-20重量份丙酮混合均匀，加入4-7重量份磷脂聚乙二醇叶酸、1-2重量份大豆卵磷脂，搅拌混合均匀，制得油相；将3-5重量份脱氧胆酸钠溶于100重量份pH＝8-9的Tris-HCl溶液，制得水相；将100-120重量份油相加入170-200重量份水相中，乳化，减压去除有机溶剂，制得叶酸改性脂质体；
S4.水凝胶的制备：将10-12重量份聚乙烯醇溶于100重量份水中，加入4-7重量份单宁酸和0.1-0.2重量份催化剂，室温搅拌反应7-10h，用孔径为1-1.5kDa的透析袋透析3-5h，透析液干燥，得到改性聚乙烯醇；将17-22重量份壳聚糖溶于200重量份1-2wt％的醋酸或盐酸溶液中，将12-15重量份改性聚乙烯醇溶于200重量份水中，将两者混合均匀，制得水凝胶体系；
所述催化剂为pH＝8.5-9的Tris-HCl溶液；
S5.奥拉帕尼缓控释药物组合物的制备：将7-10重量份步骤S3制得的叶酸改性脂质体加入30-50重量份步骤S4中的水凝胶体系中，-20至-25℃冷冻2-4h，室温融化，重复操作3-5次，制得奥拉帕尼缓控释药物组合物。
本发明进一步保护一种上述的制备方法只得到的奥拉帕尼缓控释药物组合物。
本发明进一步保护一种上述奥拉帕尼缓控释药物组合物在制备治疗或辅助治疗卵巢癌的药物中的应用。
本发明具有如下有益效果：
奥拉帕尼因水溶性差、生物利用度较低、组织分布较少以及不能通过血脑屏障等问题，直接服用效果不佳，而普通的奥拉帕尼速释制剂会引起稳态血浆浓度波动大且半衰期短，导致严重的毒副作用。
在奥拉帕尼分子中含有-NH-，-CO-等活性官能团，可作为氢键的给体或受体形成氢键，同时，其含六元杂环的结构也可以形成π-π堆积作用。人参皂苷Rh2、鞣花酸分子中的-OH、羧基则可以与奥拉帕尼分子自组装形成超分子合成子，形成共晶，通过形成药物共晶控制奥拉帕尼原料药的溶解速率，从而降低其毒副作用，延长半衰期。同时，鞣花酸具有抗血管生成、抗增殖、诱导凋亡等多种生物活性效应，可通过不同途径抑制乳腺癌及其他类型肿瘤细胞的生长。人参皂苷Rh2能消除细胞的快速增长、启动细胞凋亡、促使化疗药抵抗的癌症患者的再应答。因此，由三者形成的奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸不仅能够控制奥拉帕尼的溶解速率，还可以协同作用，提高奥拉帕尼的抗肿瘤效果。
本发明在制得的奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸表面沉积一层磁性四氧化三铁制得磁性颗粒，该磁性颗粒可以在低频旋转磁场的作用下，不完全自转运动会产生一种物理性的机械力，破坏细胞膜结构、损伤溶酶体引起细胞凋亡，造成肿瘤细胞的破坏，发挥磁力效应和药物效应的双重作用，从而提高了抗肿瘤的效果。
本发明将制得的磁性颗粒通过脂质体包埋，磷脂、胆固醇、胆固醇酯以及甘油三酯，与人体内血浆中的脂蛋白脂质高密度脂蛋白构成相近，胆固醇酯、甘油三酯和游离胆固醇构成非极性的脂质核部分；大豆卵磷脂、游离胆固醇组成极性壳表面，从而使得制得的脂质体形成稳定的状态，同时，具有良好的水溶性，能有效保护包含在其内部的疏水性药物。通过叶酸的标记，使得制得的产物的受体过表达于90％以上的卵巢癌细胞表面，在大多数正常组织细胞表面低表达，具有生物识别作用，且亲和作用强，因此，具有靶向输送的效果。
本发明中水凝胶具有高度水合的三维聚合网络，水凝胶在结构和物理特性方面表现出与天然细胞外基质的高度相似，具有良好的生物相容性和低细胞毒性，有助于靶向缓控释释药的作用，本发明单宁酸修饰的聚乙烯醇与壳聚糖，可以通过氢键形成网络，以及聚乙烯醇和壳聚糖分子链在低温下冷冻和室温解冻的反复操作下，低温下受到限制开始结晶，形成的晶体构成水凝胶中的物理交联点，实现了无化学交联剂的物理交联，进一步降低了水凝胶的毒性，同时，物理交联的水凝胶也便于在后续的细胞反应过程中水化释放药物。
将叶酸改性脂质体加入水凝胶体系中，该水凝胶体系由于单宁酸修饰聚乙烯醇，具有较强的水化能力，成功排斥了外周血中表面呈负电性物质，叶酸的修饰减少背景的干扰又能高效特异性作用于靶细胞，同时，叶酸的靶向识别作用后，能够促进物理交联的水凝胶的降解，从而有助于药物的缓控释释放，脂质体和水凝胶作为药物释放的第1道屏障和第2道屏障，降低药物的突发释放，实现稳定的缓释，在较长时期内维持稳定有效的血浓度，提高其抗肿瘤效应，并减少毒副作用的发生。
本发明制得的奥拉帕尼缓控释药物组合物具有生物相容性好、细胞毒性低，能够有效降低药物的突发释放，实现稳定的缓释，在较长时期内维持稳定有效的血浓度，提高其抗肿瘤效应，并减少毒副作用的发生，提高了患者的给药依从性，缓控释制剂可以减少给药次数、控释制剂可以维持血药浓度等，减少不良反应可以提高患者对治疗的容忍性，控释制剂使血药浓度更稳定，具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1制得的叶酸改性脂质体的SEM图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
聚乙烯醇，医用级，购于天津希恩思奥普德科技有限公司；壳聚糖，脱乙酰度为90％，购于上海泰坦科技股份有限公司。
实施例1
本实施例提供一种奥拉帕尼缓控释药物组合物的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.共晶的制备：将10重量份奥拉帕尼溶于100重量份二氯甲烷中，将2重量份人参皂苷Rh2溶于30重量份乙醇中，将1重量份鞣花酸溶于10重量份二甲亚砜中，将三种溶液混合均匀，敞口至于室温下静置3天，过滤，乙醇洗涤，球磨1h，获得奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶粉；
S2.磁性微粒的制备：将1重量份氯化铁、3重量份醋酸铵、0.3重量份柠檬酸钠、7重量份步骤S1制得的奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶粉加入60重量份乙二醇中，混合均匀，抽真空，氮气保护下，加热至160℃，搅拌反应0.5h，然后升温至190℃，搅拌反应7h，冷却至室温，磁铁分离，乙醇洗涤，干燥，制得磁性微粒；
S3.叶酸改性脂质体的制备：将10重量份步骤S2制得的磁性微粒、3重量份三油酸甘油酯、5重量份胆固醇油酸酯、2重量份胆固醇、40重量份乙醇、15重量份丙酮，搅拌混合15min，加入4重量份磷脂聚乙二醇叶酸、1重量份大豆卵磷脂，搅拌混合10min，制得油相；将3重量份脱氧胆酸钠溶于100重量份pH＝8的Tris-HCl溶液，制得水相；将100重量份油相加入170重量份水相中，10000r/min乳化15min，减压去除有机溶剂，制得叶酸改性脂质体；图1为制得的叶酸改性脂质体的SEM图，由图可知，获得了粒径均匀的球体。
S4.水凝胶的制备：将10重量份聚乙烯醇溶于100重量份水中，加入4重量份单宁酸和0.1重量份催化剂，室温搅拌反应7h，用孔径为1kDa的透析袋透析3h，透析液干燥，得到改性聚乙烯醇；将17重量份壳聚糖溶于200重量份1wt％的盐酸溶液中，将12重量份改性聚乙烯醇溶于200重量份水中，将两者搅拌混合15min，制得水凝胶体系；
所述催化剂为pH＝8.5的Tris-HCl溶液；
S5.奥拉帕尼缓控释药物组合物的制备：将7重量份步骤S3制得的叶酸改性脂质体加入30重量份步骤S4中的水凝胶体系中，-20℃冷冻2h，室温融化4h，重复操作3次，制得奥拉帕尼缓控释药物组合物。
实施例2
本实施例提供一种奥拉帕尼缓控释药物组合物的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.共晶的制备：将15重量份奥拉帕尼溶于100重量份二氯甲烷中，将4重量份人参皂苷Rh2溶于40重量份乙醇中，将3重量份鞣花酸溶于15重量份二甲亚砜中，将三种溶液混合均匀，敞口至于室温下静置5天，过滤，乙醇洗涤，球磨2h，获得奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶粉；
S2.磁性微粒的制备：将2重量份硫酸铁、5重量份醋酸铵、0.5重量份柠檬酸钠、10重量份步骤S1制得的奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶粉加入80重量份乙二醇中，混合均匀，抽真空，氮气保护下，加热至180℃，搅拌反应1h，然后升温至210℃，搅拌反应10h，冷却至室温，磁铁分离，乙醇洗涤，干燥，制得磁性微粒；
S3.叶酸改性脂质体的制备：将12重量份步骤S2制得的磁性微粒、5重量份三油酸甘油酯、7重量份胆固醇油酸酯、4重量份胆固醇、60重量份乙醇、20重量份丙酮，搅拌混合15min，加入7重量份磷脂聚乙二醇叶酸、2重量份大豆卵磷脂，搅拌混合10min，制得油相；将5重量份脱氧胆酸钠溶于100重量份pH＝9的Tris-HCl溶液，制得水相；将120重量份油相加入200重量份水相中，10000r/min乳化15min，减压去除有机溶剂，制得叶酸改性脂质体；
S4.水凝胶的制备：将12重量份聚乙烯醇溶于100重量份水中，加入7重量份单宁酸和0.2重量份催化剂，室温搅拌反应10h，用孔径为1.5kDa的透析袋透析5h，透析液干燥，得到改性聚乙烯醇；将22重量份壳聚糖溶于200重量份2wt％的醋酸溶液中，将15重量份改性聚乙烯醇溶于200重量份水中，将两者搅拌混合15min，制得水凝胶体系；
所述催化剂为pH＝9的Tris-HCl溶液；
S5.奥拉帕尼缓控释药物组合物的制备：将10重量份步骤S3制得的叶酸改性脂质体加入50重量份步骤S4中的水凝胶体系中，-25℃冷冻4h，室温融化4h，重复操作5次，制得奥拉帕尼缓控释药物组合物。
实施例3
本实施例提供一种奥拉帕尼缓控释药物组合物的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.共晶的制备：将12重量份奥拉帕尼溶于100重量份二氯甲烷中，将3重量份人参皂苷Rh2溶于35重量份乙醇中，将2重量份鞣花酸溶于12重量份二甲亚砜中，将三种溶液混合均匀，敞口至于室温下静置4天，过滤，乙醇洗涤，球磨1.5h，获得奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶粉；
S2.磁性微粒的制备：将1.5重量份氯化铁、4重量份醋酸铵、0.4重量份柠檬酸钠、8.5重量份步骤S1制得的奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶粉加入70重量份乙二醇中，混合均匀，抽真空，氮气保护下，加热至170℃，搅拌反应1h，然后升温至200℃，搅拌反应8h，冷却至室温，磁铁分离，乙醇洗涤，干燥，制得磁性微粒；
S3.叶酸改性脂质体的制备：将11重量份步骤S2制得的磁性微粒、4重量份三油酸甘油酯、6重量份胆固醇油酸酯、3重量份胆固醇、50重量份乙醇、17重量份丙酮，搅拌混合15min，加入5重量份磷脂聚乙二醇叶酸、1.5重量份大豆卵磷脂，搅拌混合10min，制得油相；将4重量份脱氧胆酸钠溶于100重量份pH＝8.5的Tris-HCl溶液，制得水相；将110重量份油相加入185重量份水相中，10000r/min乳化15min，减压去除有机溶剂，制得叶酸改性脂质体；
S4.水凝胶的制备：将11重量份聚乙烯醇溶于100重量份水中，加入5.5重量份单宁酸和0.15重量份催化剂，室温搅拌反应8h，用孔径为1.5kDa的透析袋透析4h，透析液干燥，得到改性聚乙烯醇；将20重量份壳聚糖溶于200重量份1.5wt％的醋酸溶液中，将13.5重量份改性聚乙烯醇溶于200重量份水中，将两者搅拌混合15min，制得水凝胶体系；
所述催化剂为pH＝8.7的Tris-HCl溶液；
S5.奥拉帕尼缓控释药物组合物的制备：将8.5重量份步骤S3制得的叶酸改性脂质体加入40重量份步骤S4中的水凝胶体系中，-22℃冷冻3h，室温融化4h，重复操作4次，制得奥拉帕尼缓控释药物组合物。
对比例1
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S1中未添加人参皂苷Rh2。
具体如下：
S1.共晶的制备：将12重量份奥拉帕尼溶于100重量份二氯甲烷中，将2重量份鞣花酸溶于12重量份二甲亚砜中，将两种溶液混合均匀，敞口至于室温下静置4天，过滤，乙醇洗涤，球磨1.5h，获得奥拉帕尼-鞣花酸共晶粉。
对比例2
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S1中未添加鞣花酸。
具体如下：
S1.共晶的制备：将12重量份奥拉帕尼溶于100重量份二氯甲烷中，将3重量份人参皂苷Rh2溶于35重量份乙醇中，将两种溶液混合均匀，敞口至于室温下静置4天，过滤，乙醇洗涤，球磨1.5h，获得奥拉帕尼-人参皂苷Rh2共晶粉。
对比例3
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S1。
具体如下：
S1.磁性微粒的制备：将1.5重量份氯化铁、4重量份醋酸铵、0.4重量份柠檬酸钠、8.5重量份奥拉帕尼加入70重量份乙二醇中，混合均匀，抽真空，氮气保护下，加热至170℃，搅拌反应1h，然后升温至200℃，搅拌反应8h，冷却至室温，磁铁分离，乙醇洗涤，干燥，制得磁性微粒；
S2.叶酸改性脂质体的制备：将11重量份步骤S1制得的磁性微粒、4重量份三油酸甘油酯、6重量份胆固醇油酸酯、3重量份胆固醇、50重量份乙醇、17重量份丙酮，搅拌混合15min，加入5重量份磷脂聚乙二醇叶酸、1.5重量份大豆卵磷脂，搅拌混合10min，制得油相；将4重量份脱氧胆酸钠溶于100重量份pH＝8.5的Tris-HCl溶液，制得水相；将110重量份油相加入185重量份水相中，10000r/min乳化15min，减压去除有机溶剂，制得叶酸改性脂质体；
S3.水凝胶的制备：将11重量份聚乙烯醇溶于100重量份水中，加入5.5重量份单宁酸和0.15重量份催化剂，室温搅拌反应8h，用孔径为1.5kDa的透析袋透析4h，透析液干燥，得到改性聚乙烯醇；将20重量份壳聚糖溶于200重量份1.5wt％的醋酸溶液中，将13.5重量份改性聚乙烯醇溶于200重量份水中，将两者搅拌混合15min，制得水凝胶体系；
所述催化剂为pH＝8.7的Tris-HCl溶液；
S4.奥拉帕尼缓控释药物组合物的制备：将8.5重量份步骤S2制得的叶酸改性脂质体加入40重量份步骤S3中的水凝胶体系中，-22℃冷冻3h，室温融化4h，重复操作4次，制得奥拉帕尼缓控释药物组合物。
对比例4
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S2。
具体如下：
S1.共晶的制备：将12重量份奥拉帕尼溶于100重量份二氯甲烷中，将3重量份人参皂苷Rh2溶于35重量份乙醇中，将2重量份鞣花酸溶于12重量份二甲亚砜中，将三种溶液混合均匀，敞口至于室温下静置4天，过滤，乙醇洗涤，球磨1.5h，获得奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶粉；
S2.叶酸改性脂质体的制备：将11重量份步骤S1制得的奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶粉、4重量份三油酸甘油酯、6重量份胆固醇油酸酯、3重量份胆固醇、50重量份乙醇、17重量份丙酮，搅拌混合15min，加入5重量份磷脂聚乙二醇叶酸、1.5重量份大豆卵磷脂，搅拌混合10min，制得油相；将4重量份脱氧胆酸钠溶于100重量份pH＝8.5的Tris-HCl溶液，制得水相；将110重量份油相加入185重量份水相中，10000r/min乳化15min，减压去除有机溶剂，制得叶酸改性脂质体；
S3.水凝胶的制备：将11重量份聚乙烯醇溶于100重量份水中，加入5.5重量份单宁酸和0.15重量份催化剂，室温搅拌反应8h，用孔径为1.5kDa的透析袋透析4h，透析液干燥，得到改性聚乙烯醇；将20重量份壳聚糖溶于200重量份1.5wt％的醋酸溶液中，将13.5重量份改性聚乙烯醇溶于200重量份水中，将两者搅拌混合15min，制得水凝胶体系；
所述催化剂为pH＝8.7的Tris-HCl溶液；
S4.奥拉帕尼缓控释药物组合物的制备：将8.5重量份步骤S2制得的叶酸改性脂质体加入40重量份步骤S3中的水凝胶体系中，-22℃冷冻3h，室温融化4h，重复操作4次，制得奥拉帕尼缓控释药物组合物。
对比例5
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S3中未添加磷脂聚乙二醇叶酸。
具体如下：
S3.脂质体的制备：将11重量份步骤S2制得的磁性微粒、4重量份三油酸甘油酯、6重量份胆固醇油酸酯、3重量份胆固醇、50重量份乙醇、17重量份丙酮，搅拌混合15min，加入6.5重量份大豆卵磷脂，搅拌混合10min，制得油相；将4重量份脱氧胆酸钠溶于100重量份pH＝8.5的Tris-HCl溶液，制得水相；将110重量份油相加入185重量份水相中，10000r/min乳化15min，减压去除有机溶剂，制得脂质体。
对比例6
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S3。
具体如下：
S1.共晶的制备：将12重量份奥拉帕尼溶于100重量份二氯甲烷中，将3重量份人参皂苷Rh2溶于35重量份乙醇中，将2重量份鞣花酸溶于12重量份二甲亚砜中，将三种溶液混合均匀，敞口至于室温下静置4天，过滤，乙醇洗涤，球磨1.5h，获得奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶粉；
S2.磁性微粒的制备：将1.5重量份氯化铁、4重量份醋酸铵、0.4重量份柠檬酸钠、8.5重量份步骤S1制得的奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶粉加入70重量份乙二醇中，混合均匀，抽真空，氮气保护下，加热至170℃，搅拌反应1h，然后升温至200℃，搅拌反应8h，冷却至室温，磁铁分离，乙醇洗涤，干燥，制得磁性微粒；
S3.水凝胶的制备：将11重量份聚乙烯醇溶于100重量份水中，加入5.5重量份单宁酸和0.15重量份催化剂，室温搅拌反应8h，用孔径为1.5kDa的透析袋透析4h，透析液干燥，得到改性聚乙烯醇；将20重量份壳聚糖溶于200重量份1.5wt％的醋酸溶液中，将13.5重量份改性聚乙烯醇溶于200重量份水中，将两者搅拌混合15min，制得水凝胶体系；
所述催化剂为pH＝8.7的Tris-HCl溶液；
S4.奥拉帕尼缓控释药物组合物的制备：将8.5重量份步骤S2制得的磁性微粒加入40重量份步骤S3中的水凝胶体系中，-22℃冷冻3h，室温融化4h，重复操作4次，制得奥拉帕尼缓控释药物组合物。
对比例7
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S4中未添加单宁酸。
具体如下：
S4.水凝胶的制备：将20重量份壳聚糖溶于200重量份1.5wt％的醋酸溶液中，将13.5重量份聚乙烯醇溶于200重量份水中，将两者搅拌混合15min，制得水凝胶体系。
对比例8
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S4和步骤S5。
具体如下：
S1.共晶的制备：将12重量份奥拉帕尼溶于100重量份二氯甲烷中，将3重量份人参皂苷Rh2溶于35重量份乙醇中，将2重量份鞣花酸溶于12重量份二甲亚砜中，将三种溶液混合均匀，敞口至于室温下静置4天，过滤，乙醇洗涤，球磨1.5h，获得奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶粉；
S2.磁性微粒的制备：将1.5重量份氯化铁、4重量份醋酸铵、0.4重量份柠檬酸钠、8.5重量份步骤S1制得的奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶粉加入70重量份乙二醇中，混合均匀，抽真空，氮气保护下，加热至170℃，搅拌反应1h，然后升温至200℃，搅拌反应8h，冷却至室温，磁铁分离，乙醇洗涤，干燥，制得磁性微粒；
S3.叶酸改性脂质体的制备：将11重量份步骤S2制得的磁性微粒、4重量份三油酸甘油酯、6重量份胆固醇油酸酯、3重量份胆固醇、50重量份乙醇、17重量份丙酮，搅拌混合15min，加入5重量份磷脂聚乙二醇叶酸、1.5重量份大豆卵磷脂，搅拌混合10min，制得油相；将4重量份脱氧胆酸钠溶于100重量份pH＝8.5的Tris-HCl溶液，制得水相；将110重量份油相加入185重量份水相中，10000r/min乳化15min，减压去除有机溶剂，制得叶酸改性脂质体，即为奥拉帕尼缓控释药物组合物。
对比例9
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S3、步骤S4和步骤S5。
具体如下：
S1.共晶的制备：将12重量份奥拉帕尼溶于100重量份二氯甲烷中，将3重量份人参皂苷Rh2溶于35重量份乙醇中，将2重量份鞣花酸溶于12重量份二甲亚砜中，将三种溶液混合均匀，敞口至于室温下静置4天，过滤，乙醇洗涤，球磨1.5h，获得奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶粉；
S2.磁性微粒的制备：将1.5重量份氯化铁、4重量份醋酸铵、0.4重量份柠檬酸钠、8.5重量份步骤S1制得的奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶粉加入70重量份乙二醇中，混合均匀，抽真空，氮气保护下，加热至170℃，搅拌反应1h，然后升温至200℃，搅拌反应8h，冷却至室温，磁铁分离，乙醇洗涤，干燥，制得磁性微粒，即为奥拉帕尼缓控释药物组合物。
对比例10
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S2至S5。
具体如下：将12重量份奥拉帕尼溶于100重量份二氯甲烷中，将3重量份人参皂苷Rh2溶于35重量份乙醇中，将2重量份鞣花酸溶于12重量份二甲亚砜中，将三种溶液混合均匀，敞口至于室温下静置4天，过滤，乙醇洗涤，球磨1.5h，获得奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶粉，即为奥拉帕尼缓控释药物组合物。
测试例1细胞的增殖抑制效果
将生长状态良好的卵巢癌SKOV3细胞株经0.25wt％的胰酶消化后，用含胎牛血清的RPMI1640培养基进行重悬，分布接种细胞悬液100μL于细胞培养板中，在5.0v/v％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。待各组细胞恢复生长状态后用实施例1-3或对比例1-10制得的奥拉帕尼缓控释药物组合物(终浓度为10mg/L)，37℃孵育1h，对照组用等量的培养液替代药物，孵育结束后弃去培养液，加入200μL的MTT继续于适宜条件下培养2h。洗涤，加入DMSO，震荡处理30min。测试各个培养孔的吸光度，并计算细胞抑制率(％)。每组设置5个平行试验。
取另一组试验，在37℃孵育1h的同时，施加低频旋转磁场(50Hz)，然后计算细胞抑制率(％)。
细胞抑制率(％)＝(对照组0D值-试验组0D值)/对照组OD值×100％
结果见表1。
表1
由上表可知，本发明实施例1-3制得的奥拉帕尼缓控释药物组合物对卵巢癌细胞株SKOV3具有明显的抑制作用，在外加磁场的作用下，抑制效果更明显。
测试例2体外释放
精密称取奥拉帕尼缓控释药物组合物和奥拉帕尼缓释药(奥拉帕尼的含量相同)装入截留量为5×103的透析袋中，封口夹夹住透析袋两端。释放介质为PBS缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝7.4)中，介质体积200mL，水浴温度37℃，搅拌转速100r/min，分别在0.5、1、2、4、8、24、48和72h各取样2ml，并同时补加等量预热的介质，样品过0.22μm微孔滤膜，测试奥拉帕尼含量，计算药物释放率。
药物累积释放率＝释放药物总量/纳米粒所载药物总量×100％
结果见表2。
表2
由上表可知，本发明实施例1-3制得的奥拉帕尼缓控释药物组合物缓慢释药，72h释药率＜62％。
测试例3
选择8-10周龄雌性BALB/c裸鼠，体质量20±2g，将3×106个SKOV3细胞悬浮于0.2mL含胎牛血清的RPMI1640培养基中，注射到裸鼠腋下皮肤内建立裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型，接种2周后，待移植瘤直径长至约10mm。再将这些裸鼠随机分成14组，每组6只。对照组：灌胃予等量生理盐水0.2mL/只；实施例1-3组和对比例1-10组：灌胃给予相应制得的奥拉帕尼缓控释药物组合物5mg/kg；隔日给药1次，给药后1h施加低频旋转磁场(50Hz)30min，共1周；试验结束后处死裸鼠留取皮下移植瘤，计算抑瘤率(％)。
抑瘤率(％)＝(试验组瘤重-对照组瘤重)/对照组瘤重×100％
结果见表3。
表3
由上表可知，本发明实施例1-3制得的奥拉帕尼缓控释药物组合物能明显抑制卵巢癌小鼠肿瘤的生长。
对比例1、2与实施例3相比，步骤S1中未添加人参皂苷RH2或鞣花酸。对比例3与实施例3相比，未进行步骤S1。对卵巢癌细胞株SKOV3的抑制作用下降，缓控释释放效果下降，对裸鼠肿瘤的抑制率下降。在奥拉帕尼分子中含有-NH-，-CO-等活性官能团，可作为氢键的给体或受体形成氢键，同时，其含六元杂环的结构也可以形成π-π堆积作用。人参皂苷RH2、鞣花酸分子中的-OH、羧基则可以与奥拉帕尼分子自组装形成超分子合成子，形成共晶，通过形成药物共晶控制奥拉帕尼原料药的溶解速率，从而降低其毒副作用，延长半衰期。同时，鞣花酸具有抗血管生成、抗增殖、诱导凋亡等多种生物活性效应，可通过不同途径抑制乳腺癌及其他类型肿瘤细胞的生长。人参皂苷RH2能消除细胞的快速增长、启动细胞凋亡、促使化疗药抵抗的癌症患者的再应答。因此，由三者形成的奥拉帕尼-人参皂苷RH2-鞣花酸不仅能够控制奥拉帕尼的溶解速率，还可以协同作用，提高奥拉帕尼的抗肿瘤效果。
对比例4与实施例3相比，未进行步骤S2。外加磁场作用下的卵巢癌细胞株SKOV3的抑制作用下降，对裸鼠肿瘤的抑制率下降。本发明在制得的奥拉帕尼-人参皂苷RH2-鞣花酸表面沉积一层磁性四氧化三铁制得磁性颗粒，磁性颗粒可以在低频旋转磁场的作用下，不完全自转运动会产生一种物理性的机械力，破坏细胞膜结构、损伤溶酶体引起细胞凋亡，造成肿瘤细胞的破坏，发挥磁力效应和药物效应的双重作用，从而提高了抗肿瘤的效果。
对比例5与实施例3相比，步骤S3中未添加磷脂聚乙二醇叶酸。对比例6与实施例3相比，未进行步骤S3。对卵巢癌细胞株SKOV3的抑制作用下降，缓控释释放效果下降，对裸鼠肿瘤的抑制率下降。本发明将制得的磁性颗粒通过脂质体包埋，磷脂、胆固醇、胆固醇酯以及甘油三酯，与人体内血浆中的脂蛋白脂质高密度脂蛋白构成相近，胆固醇酯、甘油三酯和游离胆固醇构成非极性的脂质核部分；大豆卵磷脂、游离胆固醇组成极性壳表面，从而使得制得的脂质体形成稳定的状态，同时，具有良好的水溶性，能有效保护包含在其内部的疏水性药物。而叶酸的标记，其受体过表达于90％以上的卵巢癌细胞表面，在大多数正常组织细胞表面低表达，具有生物识别作用，且亲和作用强，因此，具有靶向输送的效果。将叶酸改性脂质体加入水凝胶体系中，该水凝胶体系由于单宁酸修饰聚乙烯醇，具有较强的水化能力，成功排斥了外周血中表面呈负电性物质，叶酸的修饰减少背景的干扰又能高效特异性作用于靶细胞，同时，叶酸的靶向识别作用后，能够促进物理交联的水凝胶的降解，从而有助于药物的缓控释释放，脂质体和水凝胶作为药物释放的第1道屏障和第2道屏障，降低药物的突发释放，实现稳定的缓释，在较长时期内维持稳定有效的血浓度，提高其抗肿瘤效应，并减少毒副作用的发生。
对比例7与实施例3相比，步骤S4中未添加单宁酸。对比例8与实施例3相比，未进行步骤S4和步骤S5。缓控释释放效果下降，对裸鼠肿瘤的抑制率下降。本发明中水凝胶具有高度水合的三维聚合网络，水凝胶在结构和物理特性方面表现出与天然细胞外基质的高度相似，具有生物相容性好，细胞毒性低，有助于靶向缓控释释药的作用，本发明经过单宁酸改性的聚乙烯醇与壳聚糖能够通过形成氢键，以及聚乙烯醇和壳聚糖分子链在低温下冷冻和室温解冻的反复操作下，低温下受到限制开始结晶，形成的晶体构成水凝胶中的物理交联点，实现了无化学交联剂的存在下的物理交联，进一步降低了水凝胶的毒性，同时，物理交联的水凝胶也便于在后续的细胞反应过程中水化释放药物。
对比例9与实施例3相比，未进行步骤S3、步骤S4和步骤S5。对比例10与实施例3相比，未进行步骤S2至S5。对卵巢癌细胞株SKOV3的抑制作用下降，缓控释释放效果下降，对裸鼠肿瘤的抑制率下降。本发明制得的奥拉帕尼缓控释药物组合物具有生物相容性好、细胞毒性低，能够有效降低药物的突发释放，实现稳定的缓释，在较长时期内维持稳定有效的血浓度，提高其抗肿瘤效应，并减少毒副作用的发生，提高了患者的给药依从性，具有广阔的应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种奥拉帕尼缓控释药物组合物的制备方法，其特征在于，制备奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶后，表面沉积磁性四氧化三铁获得磁性微粒，包埋于叶酸改性脂质体中，加入水凝胶中，反复冻融，制得奥拉帕尼缓控释药物组合物；
包括以下步骤：
S1.共晶的制备：将奥拉帕尼溶于二氯甲烷中，将人参皂苷Rh2溶于乙醇中，将鞣花酸溶于二甲亚砜中，将三种溶液混合均匀，敞口至于室温下静置，过滤，球磨，获得奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶粉；
S2.磁性微粒的制备：将铁盐、醋酸铵、柠檬酸钠、步骤S1制得的奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶粉加入乙二醇中，混合均匀，抽真空，惰性气体保护下，加热至第一温度，反应第一时间段，然后升温至第二温度，反应第二时间段，冷却至室温，磁铁分离，洗涤，干燥，制得磁性微粒；
S3.叶酸改性脂质体的制备：将步骤S2制得的磁性微粒、三油酸甘油酯、胆固醇油酸酯、胆固醇、乙醇、丙酮混合均匀，加入磷脂聚乙二醇叶酸、大豆卵磷脂，搅拌混合均匀，制得油相；将脱氧胆酸钠溶于Tris-HCl溶液中，制得水相；将油相加入水相中，乳化，减压去除有机溶剂，制得叶酸改性脂质体；
S4.水凝胶的制备：将聚乙烯醇溶于水中，加入单宁酸和催化剂，室温搅拌反应，透析，透析液干燥，得到改性聚乙烯醇，将壳聚糖溶于酸液中，将改性聚乙烯醇溶于水中，将两者混合均匀，制得水凝胶体系；
S5.奥拉帕尼缓控释药物组合物的制备：将步骤S3制得的叶酸改性脂质体加入步骤S4中的水凝胶体系中，反复冻融，制得奥拉帕尼缓控释药物组合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述奥拉帕尼、人参皂苷Rh2和鞣花酸的质量比为10-15:2-4:1-3，所述静置的时间为3-5天，所述球磨的时间为1-2h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述铁盐、醋酸铵、柠檬酸钠、奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶粉、乙二醇的质量比为1-2：3-5：0.3-0.5：7-10：60-80，所述铁盐选自氯化铁、硫酸铁、硝酸铁中的至少一种，所述第一温度为160-180℃，所述第一时间段为0.5-1h，所述第二温度为190-210℃，所述第二时间段为7-10h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述磁性微粒、三油酸甘油酯、胆固醇油酸酯、胆固醇、乙醇、丙酮、磷脂聚乙二醇叶酸、大豆卵磷脂的质量比为10-12:3-5:5-7:2-4:40-60:15-20:4-7:1-2，所述脱氧胆酸钠、Tris-HCl溶液的质量比为3-5:100，所述Tris-HCl溶液为pH=8-9的Tris-HCl溶液，所述油相和水相的质量比为10-12:17-20。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述聚乙烯醇、单宁酸、催化剂的质量比为10-12:4-7:0.1-0.2，所述催化剂为pH=8.5-9的Tris-HCl溶液，所述室温搅拌反应的时间为7-10h，所述透析的透析袋孔径为1-1.5kDa，所述酸液为1-2wt%的醋酸或盐酸溶液，所述改性聚乙烯醇、壳聚糖的质量比为12-15:17-22。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述叶酸改性脂质体、水凝胶体系的质量比为7-10:30-50，所述反复冻融的方法为在-20至-25℃冷冻2-4h，室温融化，重复操作3-5次。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1.共晶的制备：将10-15重量份奥拉帕尼溶于100重量份二氯甲烷中，将2-4重量份人参皂苷Rh2溶于30-40重量份乙醇中，将1-3重量份鞣花酸溶于10-15重量份二甲亚砜中，将三种溶液混合均匀，敞口至于室温下静置3-5天，过滤，球磨1-2h，获得奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶粉；
S2.磁性微粒的制备：将1-2重量份铁盐、3-5重量份醋酸铵、0.3-0.5重量份柠檬酸钠、7-10重量份步骤S1制得的奥拉帕尼-人参皂苷Rh2-鞣花酸共晶粉加入60-80重量份乙二醇中，混合均匀，抽真空，惰性气体保护下，加热至160-180℃，搅拌反应0.5-1h，然后升温至190-210℃，搅拌反应7-10h，冷却至室温，磁铁分离，洗涤，干燥，制得磁性微粒；
S3.叶酸改性脂质体的制备：将10-12重量份步骤S2制得的磁性微粒、3-5重量份三油酸甘油酯、5-7重量份胆固醇油酸酯、2-4重量份胆固醇、40-60重量份乙醇、15-20重量份丙酮混合均匀，加入4-7重量份磷脂聚乙二醇叶酸、1-2重量份大豆卵磷脂，搅拌混合均匀，制得油相；将3-5重量份脱氧胆酸钠溶于100重量份pH=8-9的Tris-HCl溶液，制得水相；将100-120重量份油相加入170-200重量份水相中，乳化，减压去除有机溶剂，制得叶酸改性脂质体；
S4.水凝胶的制备：将10-12重量份聚乙烯醇溶于100重量份水中，加入4-7重量份单宁酸和0.1-0.2重量份催化剂，室温搅拌反应7-10h，用孔径为1-1.5kDa的透析袋透析3-5h，透析液干燥，得到改性聚乙烯醇；将17-22重量份壳聚糖溶于200重量份1-2wt%的醋酸或盐酸溶液中，将12-15重量份改性聚乙烯醇溶于200重量份水中，将两者混合均匀，制得水凝胶体系；
所述催化剂为pH=8.5-9的Tris-HCl溶液；
S5.奥拉帕尼缓控释药物组合物的制备：将7-10重量份步骤S3制得的叶酸改性脂质体加入30-50重量份步骤S4中的水凝胶体系中，-20至-25℃冷冻2-4h，室温融化，重复操作3-5次，制得奥拉帕尼缓控释药物组合物。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的制备方法得到的奥拉帕尼缓控释药物组合物。
9.一种如权利要求8所述奥拉帕尼缓控释药物组合物在制备治疗或辅助治疗卵巢癌的药物中的应用。
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