CN103005168A - 一种微生物溶菌酶微胶囊及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物制剂和水产养殖领域，公开了一种溶菌酶微胶囊，通过以下方法制备：（1）将海藻酸钠与溶菌酶的混合溶液滴加到含有壳聚糖和氯化钙的醋酸溶液中，并搅拌；（2）滴加完毕后固化0.5～4小时，取固体洗涤，得到溶菌酶/海藻酸钠/壳聚糖凝珠；（3）溶菌酶/海藻酸钠/壳聚糖凝珠预冷冻后进行冷冻干燥。这种微胶囊用于制备鱼饲料，在经过饲料加工过程的高温挤压后，依然较高地保留微生物溶菌酶的活性；在常温保存的过程中，微生物溶菌酶的稳定性可保持半年以上；饲喂养殖中，能经受水产动物胃中强酸和消化环境，在肠道中释放并发挥有效的促生长保健效果。

Description

一种微生物溶菌酶微胶囊及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物制剂和水产养殖领域，具体为一种微生物溶菌酶微胶囊及制备方法和应用。

背景技术

现今，水产类食品遭受药物污染与危及人类健康的现象越来越严重，许多国家已明令禁止或限制抗生素等在饲料中的应用，因此，寻找天然安全的抗生素替代物是各国水产养殖业迫切需要解决的问题。

微生物溶菌酶是由微生物分泌产生的一种能溶解细菌细胞壁的酶，因其比卵清溶菌酶具有更高的生产率和更广泛的抑菌谱，近年来其在食品、医学、酶工程和饲料工业上倍受关注，因而将其作为水产养殖中抗生素替代物的思路是极具意义的，然而因其蛋白质结构易受胃肠道环境的降解而在口服制剂的运用中依然受到限制。

微胶囊技术是采用半透囊膜将物质包裹在囊内形成微胶囊，对芯材物质起保护及选择性释放的作用。其壁材有很多，海藻酸钠是从褐藻中提取的聚阴离子天然杂多糖，其溶液可与多价阳离子(如Ca²⁺)交联形成“蛋格”结构而瞬时凝胶化，此反应条件温和，成膜能力强且可降解性较好，因而海藻酸钠常被用作包埋药物、蛋白质或细胞的壁材。然而单独的海藻酸钠壁材结构稀疏，因此加入辅助壁材可增加包埋物稳定性，提高药物生物利用率，并且改变药物释放速率。壳聚糖是甲壳素经脱乙酰基后的产物，能溶于酸性溶液形成阳离子基团，易与带负电荷的海藻酸钠发生静电络合，使壁材膜更为致密坚固。此两者均资源丰富，价廉易得，相容性好，可生物降解，并均有报道具有免疫促进作用而适宜用于饲料添加剂。

截止目前，尚未有利用海藻酸钠/壳聚糖为壁材法制备微生物溶菌酶微胶囊的报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种溶菌酶微胶囊。

本发明还提供了上述溶菌酶微胶囊的制备方法和应用。

本发明的溶菌酶微胶囊制备方法包括如下步骤：

（1）将海藻酸钠与溶菌酶的混合溶液滴加到含有壳聚糖和氯化钙的醋酸溶液中，并搅拌；滴加搅拌时间为10～90分钟，优选为20～50分钟；

优选的，所述海藻酸钠与溶菌酶的混合溶液中，海藻酸钠含量为0.01～0.03g/mL，溶菌酶的活性为5000～10000U/mL；

所述含有壳聚糖和氯化钙的醋酸溶液中，壳聚糖含量为0.001～0.006g/mL，氯化钙含量为0.01～0.04g/mL，醋酸的含量为1～5ml/L；所述壳聚糖的脱乙酰度为75%～95%；所述的海藻酸钠与壳聚糖的用量比为1：1～1：10；

（2）滴加完毕后固化0.5～4小时，取固体洗涤，得到溶菌酶/海藻酸钠/壳聚糖凝珠；优选的，固化时间为50～70分钟；

（3）溶菌酶/海藻酸钠/壳聚糖凝珠预冷冻后进行冷冻干燥；

所述预冷冻温度为-15～-25℃，预冻时间为6～24h；冷冻干燥的温度为-20～-28℃，压力为50～100Pa，时间为18～36h。

通过上述方法所制备的溶菌酶微胶囊，以海藻酸钠/壳聚糖为壁材，其中溶菌酶含量为20000～30000U/g。

上述溶菌酶微胶囊可用于制备鱼饲料，尤其是制备异育银鲫的饲料，用于异育银鲫的养殖。在异育银鲫的饲料中，以溶菌酶计，溶菌酶的含量为50000～250000U/kg。

微生物溶菌酶在经过饲料加工中的高温挤压和长期保存过程，以及喂食后被鱼体肠道消化环境的降解破坏而使得酶活损失率大，而达不到促进免疫、防病治病效果，本发明解决了上述技术问题。

本发明通过制备一种以海藻酸钠/壳聚糖为复合壁材的微生物溶菌酶微胶囊，添加于异育银鲫饲料，其优势在于：经过饲料加工过程的高温挤压后，依然较高地保留微生物溶菌酶的活性；在常温保存的过程中，微生物溶菌酶的稳定性可保持半年以上；饲喂养殖中，能经受水产动物胃中强酸和消化环境，在肠道中释放并发挥有效的促生长保健效果，长期服用可以代替或部分代替抗生素对一些致病菌引起的疾病进行防治，解决抗生素使用带来的抗药性和药物残留问题，也有望运用于食品防腐添加剂、医疗等领域。

具体实施方式

下面以具体例子对本发明进行说明。

实施例1

取100ml 40g/L的海藻酸钠溶液与100ml 2mg/mL溶菌酶溶液（溶菌酶的活性为5000U/mg）混合均匀，将上述混合溶液通过蠕动泵滴入到200ml含20g/L氯化钙和50g/L壳聚糖(脱乙酰度为90％）及5mL/L醋酸的水溶液中，并以180rpm的速度搅拌，蠕动泵滴加速度为100滴/min（约4～6mL/min）。

约40分钟后滴加完毕，停止搅拌，固化1小时后，取固体用蒸馏水洗涤两次，用纱布沥干。

-20℃下预冷冻12小时，-25℃、80pa下冷冻干燥24小时。2％氯化钙与0.5％壳聚糖(脱乙酰度为90％）的0.5％（v/v)醋酸水溶液中并不断进行搅拌，10^6U/4

所得到的溶菌酶微胶囊以海藻酸钠/壳聚糖为壁材，其中溶菌酶含量为23000～27000U/g。在常温保存的过程中，微胶囊中溶菌酶的稳定性可保持半年以上。

实施例2

将上述制得的溶菌酶微胶囊进行异育银鲫养殖试验：

1材料与方法

1.1试验用鱼与饲料制备

试验于2011年7月-9月在上海海洋大学特种水产养殖场进行。选用当年异育银鲫，放于试验池中用基础饲料养殖40d，使其适应试验条件，并消除试验鱼因营养和环境造成的差异。试验分为11个组每组4个重复，每个重复30尾（初重28.11±2.14g）。根据异育银鲫的营养需求制定饲料配方，制作基础饲料。在基础饲料中分别添加溶菌酶制品和其包被品，其中溶菌酶制品即酶活为5000U/mg的微生物溶菌酶晶体粉末；包被品是将微生物溶菌酶微胶囊用高速粉碎机粉碎成40目的粉末（溶菌酶含量为25000U/g）。溶菌酶组设置5个梯度：10mg/kg，20mg/kg，30mg/kg，40mg/kg和50mg/kg（酶制剂1-5）；溶菌酶包被品组根据与溶菌酶组初始酶活相等的原则，将添加量分别设置为：2g/kg，4g/kg，6g/kg，8g/kg和10g/kg（包被组1-5）。以包被品10g/kg组为对比，不足部分用纤维素补充。饲料原料与溶菌酶或者溶菌酶微胶囊逐级混合后制成直径0.5cm颗粒，常温密闭保存。

1.2饲养管理

饲养水源为经过120目筛绢过滤后的天然河水，室外养殖（温度21-34℃），每组网箱2m*0.75m*1.0m，间断性充气，使溶解氧控制在6-12mg/L，氨氮<0.5mg/L。每周换水1/2左右。

试验过程中每天按照鱼体总重的3％左右投喂，参照前一天的摄食情况，酌情增加或减少投饵量。每天投喂三次（7:00，11:00，17:00），每次分2轮投喂，每次投喂时间控制在30分钟左右。投喂完1小时检查摄食情况，以无残饵为宜。

1.3实验仪器与药品

1.3.1主要仪器

冰箱(-20℃)；冷冻干燥机；双螺杆制粒机；固体样品粉碎机；电热恒温鼓风干燥箱；高速台式离心机；电子天平；热恒温水浴锅；生化培养箱；高压灭菌锅；722分光光度计；移液器；玻璃匀浆管。

1.3.2药品

溶菌酶试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、淀粉酶试剂盒、蛋白酶试剂盒购于南京建成生物过程研究所。

1.4测定指标

1.4.1生产性能：养殖试验结束后，每个重复组采样10尾分别称重测量体长，并称取每个重复组总重。计算饵料系数、相对增重率。

增重率(％)=(末体重-初始体重)／初始体重×100

饲料系数(FCR)=投喂饲料总重/(终末总重-初始总重)

1.4.2内源酶指标：养殖试验结束，采取试验鱼的肠道和肝胰脏测定其淀粉酶和蛋白酶的活力，采全血制备血清后测定其溶菌酶、SOD，采集脾脏测定其溶菌酶和SOD活力。

1.4.3攻毒试验：养殖试验结束后，每组选取体质健壮，规格均匀的试验鱼进行嗜水气单胞菌的抗感染试验。每组选取32尾，其中30尾随机分成3组，每组10尾。试验鱼个体间体重无显著差异。嗜水气单胞菌取自上海海洋大学水生动物病原库，接种于营养琼脂平板培养48h后，用生理盐水冲洗稀释至10⁹cfu/mL备用。每尾注射0.5mL菌液，采用腹腔注射。另选取剩下2尾，注射0.5mL生理盐水，作为空白对照。试验鱼在80×50×45cm的周转箱内暂养48h后，开始试验，试验期间水温18-23℃，观察120h内各组死亡情况(120h后试验鱼的死亡趋于稳定)并记录。试验期间全部投喂基础组饲料。

1.5数据处理

用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，影响显著者采用Duncan’s法进行多重比较比较。试验结果以平均数±标准差表示。

2结果

2.1溶菌酶对异育银鲫生长性能的影响

表1显示，包被品组相对增长率除1组和4组相对基础组有显著提高，其他组无显著差异；溶菌酶组相对增重率5组与基础组有显著的降低而溶菌酶1组相对增重率相对基础组有显著提高，其他组和基础组无显著差异。包被品组饵料系数1、2组和3组相对基础组有显著降低，5组相对基础组有显著的升高；溶菌酶组除5组相对基础组有显著的提高，其他组相对基础组无显著差异。在相同的酶活条件下，溶菌酶包被品对异育银鲫的生长性能的影响对比相同酶活溶菌酶组有明显的优势，在一定剂量范围内可有效降低饵料系数。

表1溶菌酶及其包被品对异育银鲫生长性能的影响

注：同行数据后含有相同字母表示差异不显著（P＞0.05），字母不同表示差异显著（P＜0.05），下同。

2.2嗜水气单胞菌攻毒感染试验

由表2显示，相对基础组，溶菌酶2组、4组、5组的攻毒死亡率均有显著降低；包被品组除1组其他组相对基础组死亡率显著降低。包被品组死亡率相对基础组均有显著的降低。在相同的酶活条件下，包被组试验鱼的死亡率普遍低于溶菌酶组，其中差异最显著的为1组和3组，即说明溶菌酶经包被后，更有利于促进异育银鲫对嗜水气单胞菌的抗感染能力。

表2溶菌酶及其包被品对异育银鲫攻毒死亡率的影响

2.3溶菌酶及其包被品对异育银鲫内源酶的影响

由表3可知，溶菌酶对异育银鲫血清溶菌酶的影响不显著，而包被品4、5组的血清溶菌酶相对基础组有显著提高。脾脏溶菌酶的趋势和对血清溶菌酶的趋势基本一致，包被品5组相对基础组有显著提高。血清SOD除溶菌酶4组与基础组无显著差异，其他的试验组均比基础组有显著提高；而脾脏SOD与基础组均无显著性差异。

Claims (10)

1.一种制备溶菌酶微胶囊的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将海藻酸钠与溶菌酶的混合溶液滴加到含有壳聚糖和氯化钙的醋酸溶液中，并搅拌；

（2）滴加完毕后固化0.5～4小时，取固体洗涤，得到溶菌酶/海藻酸钠/壳聚糖凝珠；

（3）溶菌酶/海藻酸钠/壳聚糖凝珠预冷冻后进行冷冻干燥。

2.权利要求1所述制备溶菌酶微胶囊的方法，其特征在于，步骤（1）中所述海藻酸钠与溶菌酶的混合溶液中，海藻酸钠含量为0.01～0.03g/mL，溶菌酶的活性为5000～10000U/mL。

3.权利要求1所述制备溶菌酶微胶囊的方法，其特征在于，步骤（1）中所述含有壳聚糖和氯化钙的醋酸溶液中，壳聚糖含量为0.001～0.006g/mL，氯化钙含量为0.01～0.04g/mL，醋酸的含量为1～5ml/L；所述壳聚糖的脱乙酰度为75%～95%；所述的海藻酸钠与壳聚糖的用量比为1：1～1：10。

4.权利要求1所述制备溶菌酶微胶囊的方法，其特征在于，步骤（1）中的滴加搅拌时间为10～90分钟。

5.权利要求1所述制备溶菌酶微胶囊的方法，其特征在于，步骤（2）所述的固化时间为50～70分钟。

6.权利要求1所述制备溶菌酶微胶囊的方法，其特征在于，步骤（3）所述预冷冻温度为-15～-25℃，预冻时间为6～24h；冷冻干燥的温度为-20～-28℃，压力为50～100Pa，时间为18～36h。

7.一种溶菌酶微胶囊，其特征在于，通过权利要求1～任一项所述的方法制备，以海藻酸钠/壳聚糖为壁材，其中溶菌酶含量为20000～30000U/g。

8.权利要求7所述溶菌酶微胶囊在制备鱼饲料方面的应用。

9.权利要求7所述溶菌酶微胶囊在制备异育银鲫的饲料方面的应用。

10.权利要求7所述溶菌酶微胶囊在制备异育银鲫饲料方面的应用，其特征在于，所述异育银鲫的饲料中，以溶菌酶计，溶菌酶的含量为50000～250000U/kg。