CN103992997A - 一种利用壳聚糖∕黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的方法及应用 - Google Patents
一种利用壳聚糖∕黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种利用壳聚糖/黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的方法及应用，通过使用壳聚糖和黄原胶作为包埋壁材，将双歧杆菌冻干菌粉接种于MRS肉汤中，在37℃培养条件下MRS活化三次，将所得菌泥制成菌悬液后与黄原胶溶液混合加入除氧剂，混匀后得到双歧杆菌菌胶液，将双歧杆菌菌胶液加入壳聚糖溶液中搅拌，获得微胶囊，待微胶囊完全交联后，过滤后洗涤，得到微胶囊的活菌数为3.0～4.1×109CFU/g双歧杆菌微胶囊。壳聚糖和黄原胶都是天然的生物大分子，生物相容性好，无毒副作用。将制备出的双歧杆菌微胶囊加入自制酸奶中，贮存4周后，其活菌数仍大于106CFU/g，饮用后可有效的发挥其益生作用。
Description
技术领域
本发明属于益生菌制品制备技术领域，具体涉及一种利用壳聚糖/黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的方法及应用。
背景技术
双歧杆菌(Bifidobacteria)是由法国Tisser博士从母乳喂养婴儿的粪便中分离出的一种厌氧菌。经研究发现，双歧杆菌是人体肠道中的一种重要的益生菌，其在肠道中定殖的数量往往与人的健康状况存在着关系。双歧杆菌作为一种典型的益生菌，可通过改善肠道微生物菌群的平衡而发挥保健功能，例如具有双向调理胃肠的功能，抗癌作用，免疫调节功能等。但其对氧极为敏感，对低pH值的抵抗力差，活性保持较为困难。
微胶囊技术具有防止外界环境因素破坏芯材、有效地控制芯材的释放、掩盖芯材的异味、改变芯材的物理和化学性质，使其便于贮藏和运输等作用。利用微胶囊及技术对益生菌进行包埋，可对益生菌起到一定的保护作用，可有效的降低环境对菌体的破坏作用。
目前，利用微胶囊包埋技术保护双歧杆菌的报道很多，大多数都是利用海藻酸盐作为包埋壁材使用。在嗜酸乳杆菌包埋过程中，也有其他材料被作为壁材使用。例如，CN10275589A中公开的双歧杆菌包埋方法中提到，先利用果胶对菌体进行单层包埋，再利用海藻酸钠进行双层包埋；CN103355656A中也公开一种双歧杆菌微胶囊，该微胶囊用海藻酸盐、甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯共聚物组成壁材，或是壳聚糖、海藻酸盐、甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯共聚物组成壁材，来对双歧杆菌进行包埋；CN102210659A中提到的双歧杆菌微胶囊，是以海藻酸钠和菌体混合后进行乳化，再与氯化钙进行固化；CN102302160A中公开了一种婴儿双歧杆菌微胶囊的制备方法，此微胶囊是以食用明胶–树胶作为壁材，转股酰胺酶作为交联剂最终制得微胶囊；文献“肠溶性双歧杆菌微胶囊的初步研究”中公开的双歧杆菌微胶囊是以肠溶性丙烯酸树脂作为包埋材料。
除以上提到的包埋材料之外，还可以利用壳聚糖与黄原胶的聚电解质络合作用形成的共混凝胶做为壁材进行双歧杆菌的包埋，制备出的益生菌微胶囊可加入至含果粒的液态酸奶中，得到新型液态食品。壳聚糖和和黄原胶都是天然的生物大分子，生物相容性好，无毒副作用。壳聚糖溶于酸性水溶液中带正电荷，可与带负电荷的阴离子多糖黄原胶通过聚电解质络合作用形成共凝胶，从而作为包埋壁材使用。这种材料的使用可以避免海藻酸盐材料在使用过程中凝胶不稳定的缺陷。目前还没有利用壳聚糖和黄原胶作为壁材对双歧杆菌进行包埋的发明专利，为此，提供一种利用壳聚糖/黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的方法及应用是很有必要的。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的缺点，提供一种利用壳聚糖/黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的方法及应用，能够避免壁材在使用过程不稳定的影响，提高菌体的包埋产率以及包埋活菌数。
为实现上述目的，一种利用壳聚糖∕黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的方法，包括以下步骤：
1)将双歧杆菌冻干菌粉接种于MRS肉汤中，在37℃培养条件下MRS活化三次，前两次以3％～5％的接种量转接，并在37℃的条件下培养22～24h，第三次按照2％～3％的接种量转接，并在37℃的条件下培养18h，后进行离心处理并收集菌体，弃去上清液得菌泥，将菌泥与浓度为0.85～0.9％的无菌生理盐水混合配制成1.2～1.3×109CFU/mL的菌悬液备用；
2)取浓度为0.5～1.1％的黄原胶溶液，灭菌和离心除气处理后备用；
3)取浓度为0.4～1.3％壳聚糖溶液，调节pH至5～5.9备用；
4)取除氧剂溶液，除氧剂溶液中的除氧剂为异抗坏血酸钠或半胱氨酸盐酸盐，过滤除菌后备用；
5)将步骤1)制备的菌悬液和步骤2)制备的黄原胶溶液按照1:(3～10)的质量比例混合得到菌胶液，后加入步骤4)制备的除氧剂，除氧剂的添加量按照菌胶液总量的0.03～0.07％加入，混匀后得到双歧杆菌菌胶液，将双歧杆菌菌胶液加入磁力搅拌器上的步骤3)制备的壳聚糖溶液中，菌胶液与壳聚糖比例为1:(3～6)，加入后搅拌，获得微胶囊；
6)待微胶囊完全交联后，过滤后洗涤，得到微胶囊的活菌数为3.0～4.1×109CFU/g双歧杆菌微胶囊。
所述的步骤1)中离心时的转速为7000～10000r/min，离心时间为10～15min。
所述的步骤2)中灭菌处理的温度为：80～110℃，时间为10～15min；离心除气处理的转速为：5000～7000r/min，时间为10～15min。
所述的步骤3)中，调节pH值时使用的试剂为浓度为1N的NaOH溶液。
所述的步骤5)中，将将双歧杆菌菌胶液加入磁力搅拌器上的壳聚糖溶液中的方式为：使用针头规格为0.45～0.7mm的无菌注射器将双歧杆菌菌胶液以一滴一滴地方式挤压入磁力搅拌器上的壳聚糖溶液中；且搅拌时间为30～60min。
所述的步骤6)中，过滤时使用160～200目的纱布过滤；洗涤时使用生理盐水洗涤若干次。
一种利用壳聚糖∕黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的应用，在酸奶中，以0.5％～1％(w/w)的加入量将制备的双歧杆菌微胶囊加入，获得含益生菌微胶囊的液态酸奶。
本发明具有以下的有益效果：本发明使用壳聚糖和黄原胶作为包埋壁材，由于壳聚糖和和黄原胶都是天然的生物大分子，生物相容性好，无毒副作用。且壳聚糖溶于酸性水溶液中带正电荷，可与带负电荷的阴离子多糖黄原胶通过聚电解质络合作用形成共凝胶，从而作为包埋壁材使用。另外，将制备出的双歧杆菌微胶囊加入自制酸奶中，在4℃的条件下贮存，并以含107～108CFU/mL的游离双歧杆菌的酸奶作为对照。存贮4周后，发现加有微胶囊的酸奶中活菌数虽有不同程度的下降，但其活菌数仍大于106CFU/g，饮用后可有效的发挥其益生作用，且酸奶的酸度和pH变化不大，从而对酸奶的品质不会造成影响。未包埋的双歧杆菌活菌数剧烈下降，其活菌数小于105CFU/mL，未达到益生菌食品要求达到的活菌数标准，且酸奶的酸度和pH变化较大。所以，利用壳聚糖/黄原胶制备的双歧杆菌微胶囊可增强菌体的抗酸性，发挥其有益人体健康的作用。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作详细说明。
一种利用壳聚糖/黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的方法，包括以下步骤：
1)将双歧杆菌冻干菌粉接种于MRS肉汤中，在37℃培养条件下采用此MRS液体培养基活化三次，前两次以3％～5％的接种量转接，并在37℃的条件下培养22～24h，第三次按照2％～3％的接种量转接，并在37℃的条件下培养18h，后离心处理，离心时的转速为7000～10000r/min，离心时间10～15min，后收集菌体获得菌泥，将菌泥与0.85～0.9％的无菌生理盐水混合配制成1.2～1.3×109CFU/mL的菌悬液以备使用；
2)配制浓度为0.5～1.1％的黄原胶溶液，在80～110℃下灭菌10～15mim，将灭菌后的黄原胶溶液进行离心除气，离心转速为5000～7000r/min，离心时间为10～15min后备用；
3)配制浓度为0.4～1.3％壳聚糖溶液，用浓度为1N的NaOH溶液将壳聚糖溶液pH调节至5～5.9，以备使用；
4)配制除氧剂溶液，除氧剂为异抗坏血酸钠、半胱氨酸盐酸盐，过滤除菌以备使用；
5)将步骤1)制备的菌悬液和步骤2)制备的黄原胶溶液按照1:(3～10)的质量比例混合，并加入除氧剂，除氧剂的添加量按照菌胶液总量的0.03～0.07％加入，充分混匀后得到双歧杆菌菌胶液，并用针头规格为0.45～0.7mm的无菌注射器将双歧杆菌菌胶液以一滴一滴地方式挤压入磁力搅拌器上的壳聚糖溶液中，后搅拌30～60min，菌胶液与壳聚糖比例为1:(3～6)；
6)待微胶囊完全交联后，用160～200目的纱布将其过滤，过滤得到的湿胶囊用生理盐水充分洗涤，得到微胶囊的活菌数为3.0～4.1×109CFU/g的双歧杆菌微胶囊。
一种利用壳聚糖和黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的应用：在酸奶中，以0.5％～1％(w/w)的加入量将制备的双歧杆菌微胶囊加入，获得含益生菌微胶囊的液态酸奶。
步骤1)中的MRS肉汤来自青岛高科技园海博生物技术有限公司。
具体实施例：
实施例1：
(1)将双歧杆菌冻干菌粉接种于MRS肉汤中，在37℃培养条件下采用此MRS液体培养基活化三次，其中前两次以3％的接种量转接，并在37℃的条件下培养22h，第三次按照2％的接种量转接，并在37℃的条件下培养18h，然后离心处理，离心转速：7000r/min，离心时间：15min，弃去上清液得菌泥，将菌泥与0.85～0.9％的无菌生理盐水混合配制成1.2×109CFU/mL的菌悬液以备使用；
(2)配制浓度为0.5％的黄原胶溶液，80℃，灭菌15mim，将灭菌后的黄原胶溶液进行离心除气，离心时转速为5000r/min，离心时间：15min，离心后备用；
(3)配制浓度为0.4％壳聚糖溶液，用1N NaOH溶液将壳聚糖溶液pH调节至5，以备使用；
(4)制备为异抗坏血酸钠溶液的除氧剂，过滤除菌；
(5)将菌悬液与黄原胶溶液按照1:3的比例混合，除氧剂以菌胶液总量的0.03％的添加量加入，之后摇匀；
(6)用针头规格为0.45mm的无菌注射器，将上述混合液一滴一滴以挤压方式加入至磁力搅拌器上的壳聚糖溶液中，并持续搅拌30min，菌胶液与壳聚糖比例为1:3，之后用160目的纱布进行过滤得湿胶囊，用生理盐水洗涤3次，得到的双歧杆菌微胶囊的活菌数为3.0×109CFU/g；
(7)在自制的酸奶中，以0.5％(w/w)的加入量将制备的双歧杆菌微胶囊加入，获得含益生菌微胶囊的液态酸奶。
实施例2：
(1)将双歧杆菌冻干菌粉接种于MRS肉汤中，在37℃培养条件下采用此MRS液体培养基活化三次，其中前两次以4％的接种量转接，并在37℃的条件下培养23h，第三次按照2.5％的接种量转接，并在37℃的条件下培养18h，然后离心处理，离心转速：8000r/min，离心时间：13min，弃去上清液得菌泥，将菌泥与0.85～0.9％的无菌生理盐水混合配制成1.25×109CFU/mL的菌悬液以备使用；
(2)配制浓度为0.6％的黄原胶溶液，100℃，灭菌13mim，将灭菌后的黄原胶溶液进行离心除气，离心时转速为6000r/min，离心时间：13min，离心后备用；
(3)配制浓度为0.7％壳聚糖溶液，用1N NaOH溶液将壳聚糖溶液pH调节至5.3，以备使用；
(4)制备为异抗坏血酸钠溶液的除氧剂，过滤除菌；
(5)将菌悬液与黄原胶溶液按照1:5的比例混合，除氧剂以菌胶液总量的0.05％的添加量加入，之后摇匀；
(6)用针头规格为0.6mm的无菌注射器，将上述混合液一滴一滴以挤压方式加入至磁力搅拌器上的壳聚糖溶液中，并持续搅拌40min，菌胶液与壳聚糖比例为1:5，之后用180目的纱布进行过滤得湿胶囊，用生理盐水洗涤3次，得到的双歧杆菌微胶囊的活菌数为3.5×109CFU/g；
(7)在自制的酸奶中，以0.7％(w/w)的加入量将制备的双歧杆菌微胶囊加入，获得含益生菌微胶囊的液态酸奶。
实施例3：
(1)将双歧杆菌冻干菌粉接种于MRS肉汤中，在37℃培养条件下采用此MRS液体培养基活化三次，其中前两次以5％的接种量转接，并在37℃的条件下培养24h，第三次按照3％的接种量转接，并在37℃的条件下培养18h，然后离心处理，离心转速10000r/min，离心时间10min，离心后弃去上清液得菌泥，将菌泥与0.85～0.9％的无菌生理盐水混合配制成1.3×109CFU/mL的菌悬液以备使用；
(2)配制浓度为0.9％的黄原胶溶液，110℃，灭菌10mim，后将灭菌后的黄原胶溶液进行离心除气，离心转速为7000r/min，离心时间10min后备用；
(3)配制浓度为1.3％壳聚糖溶液，用浓度为1N的NaOH溶液将壳聚糖溶液pH调节至5.9，以备使用；
(4)制备为半胱氨酸盐酸盐溶液的除氧剂，过滤除菌；
(5)将菌悬液与黄原胶溶液按照1:10的比例混合，除氧剂以菌胶液总量的0.07％的添加量加入，之后摇匀；
(6)用针头规格为0.7mm的无菌注射器，将上述混合液一滴一滴地挤压方式加入至磁力搅拌器上的壳聚糖溶液中，并持续搅拌60min，菌胶液与壳聚糖比例为1:6，之后用200目的纱布进行过滤得湿胶囊，用生理盐水洗涤3次，得到的双歧杆菌微胶囊的活菌数为4.1×109CFU/g；
(7)在自制的酸奶中，以1％(w/w)的加入量将制备的双歧杆菌微胶囊加入，获得含益生菌微胶囊的液态酸奶。
大多数的微胶囊包埋壁材是使用海藻酸盐，而海藻酸盐在有磷酸、乳酸等离子存在的环境中，凝胶中的钙离子被取代下来，会导致了凝胶的不稳定，这就限制其在发酵食品中的应用。另外，海藻酸盐等食用胶材料，长期服用会对人体产生一定的副作用。本发明使用的是壳聚糖和黄原胶作为包埋壁材，壳聚糖和和黄原胶都是天然的生物大分子，生物相容性好，无毒副作用。壳聚糖溶于酸性水溶液中带正电荷，可与带负电荷的阴离子多糖黄原胶通过聚电解质络合作用形成共凝胶，从而作为包埋壁材使用。另外，将制备出的双歧杆菌微胶囊加入自制酸奶中，贮存4周后，其活菌数仍大于106CFU/g，饮用后可有效的发挥其益生作用。
Claims (7)
1.一种利用壳聚糖∕黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将双歧杆菌冻干菌粉接种于MRS肉汤中，在37℃培养条件下MRS活化三次，前两次以3～5％的接种量转接，并在37℃的条件下培养22～24h，第三次按照2～3％的接种量转接，并在37℃的条件下培养18h，后进行离心处理并收集菌体，弃去上清液得菌泥，将菌泥与浓度为0.85～0.9％的无菌生理盐水混合配制成1.2～1.3×109CFU/mL的菌悬液备用；
2)取浓度为0.5～1.1％的黄原胶溶液，灭菌和离心除气处理后备用；
3)取浓度为0.4～1.3％壳聚糖溶液，调节pH至5～5.9备用；
4)取除氧剂溶液，除氧剂溶液中的除氧剂为异抗坏血酸钠或半胱氨酸盐酸盐，过滤除菌后备用；
5)将步骤1)制备的菌悬液和步骤2)制备的黄原胶溶液按照1:(3～10)的质量比例混合得到菌胶液，后加入步骤4)制备的除氧剂，除氧剂的添加量按照菌胶液总量的0.03～0.07％加入，混匀后得到双歧杆菌菌胶液，将双歧杆菌菌胶液加入磁力搅拌器上的步骤3)制备的壳聚糖溶液中，菌胶液与壳聚糖比例为1:(3～6)，加入后搅拌，获得微胶囊；
6)待微胶囊完全交联后，过滤后洗涤，得到微胶囊的活菌数为3.0～4.1×109CFU/g双歧杆菌微胶囊。
2.根据权利要求1所述的一种利用壳聚糖∕黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的方法，其特征在于：所述的步骤1)中离心时的转速为7000～10000r/min，离心时间为10～15min。
3.根据权利要求1所述的一种利用壳聚糖∕黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的方法，其特征在于：所述的步骤2)中灭菌处理的温度为：80～110℃，时间为10～15min；离心除气处理的转速为：5000～7000r/min，时间为10～15min。
4.根据权利要求1所述的一种利用壳聚糖∕黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的方法，其特征在于：所述的步骤3)中，调节pH值时使用的试剂为浓度为1N的NaOH溶液。
5.根据权利要求1所述的一种利用壳聚糖∕黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的方法，其特征在于：所述的步骤5)中，将将双歧杆菌菌胶液加入磁力搅拌器上的壳聚糖溶液中的方式为：使用针头规格为0.45～0.7mm的无菌注射器将双歧杆菌菌胶液以一滴一滴地方式挤压入磁力搅拌器上的壳聚糖溶液中；且搅拌时间为30～60min。
6.根据权利要求1所述的一种利用壳聚糖∕黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的方法，其特征在于：所述的步骤6)中，过滤时使用160～200目的纱布过滤；洗涤时使用生理盐水洗涤若干次。
7.一种利用壳聚糖∕黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的应用，其特征在于：在酸奶中，以0.5％～1％(w/w)的加入量将制备的双歧杆菌微胶囊加入，获得含益生菌微胶囊的液态酸奶。
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