CN103509838B - 仔猪大肠杆菌k88、k99、987p纤毛抗原的高表达生产工艺及其提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效表达仔猪大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原的生产工艺及其提取方法。其特征在于，在一定温度、搅拌速度、通气量、pH值条件下，培养过程中进行葡萄糖和蛋白胨补料，可获得高效表达纤毛抗原的大肠杆菌，蛋白胨优选为胰蛋白胨。本发明是在一定温度、搅拌速度、通气量、pH值条件下，通过葡萄糖和蛋白胨动态补料，可获得高效表达K88、K99、987P纤毛抗原的大肠杆菌，且培养基成本低廉，发酵工艺简单易行，为工业化生产仔猪黄痢疫苗奠定了坚实的基础。

Description

仔猪大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原的高表达生产工艺及其提取方法

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及大肠杆菌纤毛抗原的生产工艺及其提取方法。

背景技术

产肠毒素大肠杆菌（EnterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC）是引起幼龄家畜腹泻的主要病因之一（VuKhacH,HolodaE,PilipcinecE,eta1.Serotypes,virulencegenes,andPFGEprofilesofEscherichiacoliisolatedfrompigswithpostweaningdiarrhoeainSlovakia[J].BMCVetRes.2006,2:10），而其致病作用与黏附性纤毛和肠毒素密切相关。ETEC菌株是通过细菌的纤毛与宿主小肠上皮细胞表面的相应受体结合，从而在该局部组织黏附、定居、繁殖和产生毒素，导致腹泻（JeyasinghamMD,ButtyP,KingTP,eta1.EscherichiacoliK88receptorexpressioninintestineofdisease-susceptibleweanedpigs[J].VeterinaryMicmbiology.1999,68(3-4):219-234）。引起仔猪腹泻的纤毛抗原主要是K88、K99、987P和F41（FairbrotherJM,汪铭书.从腹泻病新生仔猪分离的非传统血清型Ecoli的纤毛抗原和肠毒素检测[J].国外兽医学—畜禽传染病,1989,9(3):26-28）。

纤毛抗原具有良好的免疫原性，免疫机体后能产生相应的纤毛抗体，对产肠毒素大肠杆菌具有免疫作用。由于幼畜起病早、发病快，利用纤毛抗原免疫怀孕母猪，产生特异性纤毛抗体，仔猪可通过被动免疫途径获得保护。

研制有效的纤毛抗原疫苗最重要的是获得大量表达纤毛抗原的产肠毒素大肠杆菌，并将纤毛抗原从菌体上提取出来。巫月生等（巫月生，齐冬梅，张毓金等，猪K88、K99、987P、F41埃希氏大肠杆菌高密度发酵培养技术的初步探讨，《中国兽医杂志》，2011年，45（5）:8-10）采用高密度发酵培养，用反向间接血凝试验测定纤毛抗原的效价，可达到2¹¹-2¹³。常采用的大肠杆菌菌毛提取的方法有4℃万能混合器混合法，60-65℃水浴振荡法，4℃组织捣碎法，冰浴匀浆法，4℃高速搅拌法。

纤毛抗原的表达除与菌株、培养基组成等有关外，培养方法亦至关重要。因此，研究高效表达纤毛抗原的产肠毒素大肠杆菌的生产工艺具有十分重要的现实意义。

发明内容

大肠杆菌在发酵过程中，碳源和氮源是决定发酵效果的关键因素，大肠杆菌对碳源和氮源的需求是变化的而不是一成不变的，在发酵过程的菌体生长阶段，随着菌体浓度的增长，菌体所需的碳氮比呈现越来越高的趋势。因此，在基础培养基的基础上，根据发酵不同时期，通过补料实时调控碳源、氮源平衡，进行大肠杆菌高密度发酵培养，同时获得高表达量的纤毛抗原，是研究的核心内容。

本发明的目的之一，筛选合适的氮源用于补料，获得高表达纤毛抗原的大肠杆菌培养物。

为了实现上述目的，通过不同的氮源（胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨）进行筛选，最后确定优选为胰蛋白胨。

本发明的另一目的是，对碳源（葡萄糖）和氮源之间的添加量的最佳实施方案进行了摸索。

培养过程中，以初始培养基体积计，大肠杆菌C83549、C83644、C83710补充葡萄糖8-30g/L，优选为12-25g/L，补充胰蛋白胨8-20g/L，优选为10-16g/L。

本发明的另一目的在于提供一种高效表达仔猪大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原的生产工艺，包括下述步骤：按照发酵罐体积70%加入改良Minca汤培养基，以培养基体积计，加入0.1%（v/v）的消泡剂，高压灭菌后，待培养基温度降至35-37℃，再按1%-5%（v/v）的接种量加入产纤毛抗原的大肠杆菌种子培养物，培养温度37℃，搅拌速度300-450r/min，通气量为6-9L/min，培养过程中自动补加氨水，使菌液pH值维持7.2左右，控制溶氧20%以上，以初始培养基体积计，补充葡萄糖和胰蛋白胨分别为8-30g/L、8-20g/L，培养6-9h制备大肠杆菌菌液。

本发明的优选技术方案中，在所述的仔猪大肠杆菌K88纤毛抗原的生产工艺中，以初始培养基体积计，补充葡萄糖8-30g/L，优选为12-25g/L，补充胰蛋白胨8-20g/L，优选为10-16g/L，培养时间为6-9h，优选为8-9h。

本发明的优选技术方案中，在所述的仔猪大肠杆菌K99纤毛抗原的生产工艺中，以初始培养基体积计，补充葡萄糖8-30g/L，优选为12-25g/L，补充胰蛋白胨8-20g/L，优选为10-16g/L，培养时间为6-9h，优选为8-9h。

本发明的优选技术方案中，在所述的仔猪大肠杆菌987P纤毛抗原的生产工艺中，以初始培养基体积计，补充葡萄糖8-30g/L，优选为12-25g/L，补充胰蛋白胨8-20g/L，优选为10-16g/L，培养时间为6-9h，优选为6-7h。

为了清楚地表述本发明的保护范围，本发明对相关术语进行如下进一步说明：本发明所述的大肠杆菌纤毛又称菌毛、柔毛、黏附素、黏附性纤毛、定居因子等。

本发明实施例所用改良Minca汤（干粉）购自北京中海生物科技有限公司，货号为CM04003；改良Minca汤培养基配方为（g/L）：蛋白胨5g；酵母浸粉1g；磷酸二氢钾1.5g；磷酸氢二钠10g；硫酸镁0.01g；氯化锰0.001g；氯化亚铁0.000135g；氯化钙0.0004g，甘油5ml，pH7.1-7.5；改良Minca固体培养基是在改良Minca汤培养基基础上另加1.5%琼脂粉。

本发明实施例所使用的纤毛因子血清购自中国兽医药品监察所。

本发明实施例所使用的消泡剂（甘油聚醚）购自大连广汇科技有限公司。

除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。

与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：

1、在本发明工艺条件下培养，可获得高效表达K88、K99、987P纤毛抗原的大肠杆菌，纤毛抗原表达量均可达到6400RIHA单位/ml菌液以上，且培养基成本低廉，发酵工艺简单易行。

2、本发明获得的纤毛抗原可用于预防由大肠杆菌引起的仔猪黄痢，有效抗原含量高，具有极好的产业应用价值。

附图说明

图1发酵培养获得的大肠杆菌纤毛抗原的SDS-PAGE蛋白电泳分析结果。

具体实施方式

以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。

实施例1氮源种类的优化

1）生产用菌种：按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》（2000年版）出版发布的《仔猪大肠埃希氏菌三价灭活疫苗制造及检验规程》要求，表达K88纤毛抗原的大肠杆菌为C83549，表达K99纤毛抗原的大肠杆菌为C83644，表达987P纤毛抗原的大肠杆菌为C83710。

2）一级种子的培养：将大肠杆菌C83549冻干菌种划线接种改良Minca琼脂平板，36-37℃培养20小时，选取光滑圆整单个菌落若干个，分别用相应的纤毛因子血清逐个进行平板凝集反应。每个菌株选取8-10个凝集反应达“++++”的菌落，接种改良Minca汤培养基，37℃振荡培养16小时，平板凝集反应达“++++”，纯检合格，按10%（v/v）加入甘油混匀、分装，作为一级种子。用同样方法制备大肠杆菌C83644、C83710一级种子。在-20℃以下保存，应不超过6个月。

3）二级种子的培养：取大肠杆菌一级种子直接接种改良Minca琼脂平板，36-37℃培养20小时，选取光滑圆整菌落，用相应的纤毛因子血清逐个进行平板凝集反应，选取“++++”的菌落若干个接种改良Minca汤培养基，37℃振荡培养16h，取样用相应纤毛因子血清进行平板凝集反应，应达到“++++”，纯检合格，即可作为二级种子，用于制苗菌液的培养。于2-8℃保存，应不超过7日。

4）菌液培养：按照发酵罐（上海高机微生物发酵罐，型号BIOF-6000B（10L））体积70%加入改良Minca汤培养基，以培养基体积计，加入0.1%（v/v）的消泡剂，高压灭菌，待培养基温度降至35℃-37℃，按2%（v/v）接种二级种子，培养温度37℃，搅拌速度300-450r/min，通气量为6-9L/min，培养过程中自动补加氨水，使菌液pH值维持7.2左右，控制溶氧20%以上。通过液体形式补料，整个发酵过程，以初始培养基体积7L计算，葡萄糖补料100g，进行不补氮源及补充不同氮源，氮源选择胰蛋白胨、大豆蛋白胨和牛肉蛋白胨，均为80g。大肠杆菌C83549、C83644、C83710均采用上述培养方式。当pH值开始回升时收获菌体。从OD值、活菌数、菌液纤毛表达量等方面进行了试验效果的比较。

大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原的提取方法，包括下述步骤：将实施例1获得的大肠杆菌发酵培养物取样，离心，收获菌体，用PBS（0.01mol/L，pH值7.2）悬浮菌体至原始体积，加热至55-62℃，以100-300r/min搅拌20-30min进行热脱处理，离心收获上清液，即为纤毛抗原。

采用反向间接血凝试验（RIHA）测定K88、K99、987P纤毛抗原的含量。具体测定方法为：将K88、K99、987P纤毛抗原样品均用稀释液（含0.1%BSA的PBS（0.01mol/L，pH值7.2））作100倍稀释，混匀后备用。取一洁净96孔V型血凝板，第1-12孔各加入稀释液30μl，第1孔加入经稀释的待检纤毛样品30μl，2倍倍比稀释至第11孔，最后1孔（第11孔）吸弃30μl，第12孔为致敏血球对照。加样完毕，每孔加入相应纤毛抗体致敏血球（致敏血球为武汉中博生物股份有限公司制备）30μl。振荡混匀，室温静置90-120分钟后判定。以使50%致敏血球被凝集的样品稀释倍数，为待测样品的RIHA单位/ml菌液。

结果显示，培养过程中采用不同氮源的补料，对大肠杆菌的菌体浓度及纤毛抗原表达情况均有着很大的影响。与不补充氮源相比，补充不同的氮源均能一定程度上提高大肠杆菌的菌体浓度及纤毛表达量，其中，胰蛋白胨的效果最佳，其次是牛肉蛋白胨，结果见表1。

表1不同氮源对大肠杆菌生长情况的影响

实施例2碳源、氮源添加量的优化

一级种子、二级种子的培养同实施例1。

菌液培养：按照发酵罐（上海高机微生物发酵罐，型号BIOF-6000B（10L））体积70%加入改良Minca汤培养基，以培养基体积计，加入0.1%（v/v）的消泡剂，高压灭菌，待培养基温度降至35℃-37℃，按2%（v/v）接种二级种子，培养温度37℃，搅拌速度300-450r/min，通气量为6-9L/min，培养过程中自动补加氨水，使菌液pH值维持7.2左右，控制溶氧20%以上。当pH值开始回升时收获菌体。采用葡萄糖和胰蛋白胨补料，从OD值、活菌数、菌液纤毛表达量等方面进行了试验效果的比较。补料方式为通过液体形式补料，整个发酵过程，以初始培养基体积计算补料的葡萄糖和胰蛋白胨的用量和浓度，例如，初始培养基体积为7L，添加葡萄糖8g/L，则补充葡萄糖量为56g。

结果显示，大肠杆菌C83549发酵培养后，其K88纤毛抗原含量在6400-25600RIHA单位/ml菌液，C83644和C83710分别获得的K99、987P纤毛抗原含量均可达到6400-12800RIHA单位/ml菌液。

表2葡萄糖、胰蛋白胨添加量对大肠杆菌C83549生长情况的影响

表3葡萄糖、胰蛋白胨添加量对大肠杆菌C83644生长情况的影响

表4葡萄糖、胰蛋白胨添加量对大肠杆菌C83710生长情况的影响

2）SDS-PAGE蛋白电泳

将实施例2制得的大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原进行SDS-PAGE蛋白电泳，结果见图1，3种纤毛抗原的蛋白分子量约为26KD、18KD、20KD。电泳结果表明，经发酵培养的大肠杆菌，K88、K99、987P纤毛抗原浓度高，热脱后的杂蛋白较少。

Claims (4)

1.一种发酵罐培养大肠杆菌提高纤毛抗原表达的方法，其特征在于，在培养温度37℃，搅拌速度300-450r/min，通气量为6-9L/min条件下，培养过程中进行葡萄糖和胰蛋白胨补料，以初始改良Minca汤培养基体积计，补充葡萄糖8-30g/L，胰蛋白胨8-20g/L，用氨水调节pH值7.2，培养6-9h，分别制备大肠杆菌C83549、C83644、C83710菌液，获得高效表达纤毛抗原的大肠杆菌。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：按照发酵罐体积70％加入改良Minca汤培养基，以培养基体积计，加入消泡剂，高压灭菌后，待培养基降至35-37℃，按1％-5％(v/v)的接种量加入产纤毛抗原的大肠杆菌种子培养物，培养温度37℃，搅拌速度300-450r/min，通气量为6-9L/min，培养过程中，补充葡萄糖和胰蛋白胨，用氨水调节pH值7.2，控制溶氧高于20％，培养6-9h分别制备大肠杆菌C83549、C83644、C83710菌液。

3.如权利要求2所述的方法，大肠杆菌C83549培养时间为8-9h，C83644培养时间为8-9h，C83710培养时间为6-7h。

4.如权利要求3所述的方法，所述的葡萄糖为12-25g/L，胰蛋白胨为10-16g/L。