CN114634990A

CN114634990A - 一种用于检测鰤诺卡氏菌的rpa引物、探针以及检测方法

Info

Publication number: CN114634990A
Application number: CN202210535699.6A
Authority: CN
Inventors: 谭爱萍; 涂传明; 邓玉婷; 赵飞; 黄志斌
Original assignee: Guangzhou Yixin Biotechnology Co ltd; Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Guangzhou Yixin Biotechnology Co ltd; Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2022-05-18
Filing date: 2022-05-18
Publication date: 2022-06-17
Anticipated expiration: 2042-05-18
Also published as: CN114634990B

Abstract

本发明属于生物检测的技术领域，具体涉及一种用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物、探针以及检测方法。所述RPA引物中引物F和R的核酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探针的核酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。本发明的用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物和探针，从临床判断为感染或疑似感染鰤诺卡氏菌组织中快速准确地检测岀鰤诺卡氏菌，该方法体现出较强的特异性，以及其检测灵敏度均较常规PCR更高，检测限度达到60 pg/μL，还可以对不同来源的鰤诺卡氏菌进行检测，这对鰤诺卡氏菌病的早期诊断、早期治疗等方面具有重要意义，同时还可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使用。

Description

一种用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物、探针以及检测方法

技术领域

本发明属于生物检测的技术领域，具体涉及一种用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物、探针以及检测方法。

背景技术

鰤诺卡氏菌（Nocardia seriolae）是革兰氏阳性丝状杆菌，属于放线菌目（Actinomycetales）、诺卡氏菌科（Nocardiaceae）、诺卡氏菌属（Nocardia），1967年在日本五条鰤（Seriola quinqueradiata）中首次分离发现，随后陆续在北美、欧洲、大洋洲的多种海水和淡水鱼类中被报道。该菌宿主范围广，已在多种鱼类如大黄鱼（Larimichthys crocea）、乌鳢（Channa argus）、大口黑鲈（Micropterus salmoniodes）暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）、罗非鱼(Tilapia mossambica)、招财鱼(Osphronemus goramy)等发现。鰤诺卡氏菌感染在环境温度为25~28℃时发病最严重，气温下降后发病情况有所缓解，该病菌感染持续时间长，病鱼前期无明显症状，中期开始表现出少食、反应迟缓等症状，后期出现体表溃烂出血、肛门红肿、腹部肿大，病鱼肝、脾、肾、肌肉等出现大量肉眼可见的白色结节等临床表现，从发病到死亡需要2周左右，自然发病率为35~60%，如能早期诊断、早期治疗常可控制或痊愈，否则会很难治疗甚至出现大量死亡，是目前影响加州鲈和乌鳢养殖产业健康持续发展的主要病害，每年因该病带来的经济损失也非常大。因此，开发鰤诺卡氏菌的早期快速检测技术，对鰤诺卡氏菌病早期诊断、早期治疗具有重要的意义。

现有的鰤诺卡氏菌病检测方法主要有传统生理生化鉴定方法和分子生物学方法，其中传统生理生化鉴定方法包括采用生化管鉴定或采用微生物鉴定系统；分子生物学方法包括普通PCR和荧光定量PCR方法，上述方法有的耗时长，有的需要昂贵的设备，有的检测灵敏度不够高或者容易出现假阳性现象，因此研发灵敏、快速的检测方法是本领域不断探索的课题。

鰤诺卡氏菌是一种生长缓慢的革兰氏阳性菌，生长周期为3~7天，因此传统生理生化鉴定方法不适合进行诺卡氏菌的快速检测。例如，普通PCR操作繁琐、交叉污染的风险较高，检测时间也较长，一般需要1~1.5 h，不适合鰤诺卡氏菌的快速检测；荧光定量PCR方法的绝对定量依赖于Ct值和标准曲线，对于低拷贝的靶基因或模板差异倍速不大的情况下，该技术的检测敏感性和精确度会受限制；LAMP方法需要使用的引物多达4~6条，对扩增的目的基因片段的特异性要求非常高，增加了污染风险，容易出现假阳性的情况；以及RAA方法，扩增后需要通过凝胶电泳观察结果，均不利于现场的快速检测。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物、探针以及检测方法。

本发明的技术内容如下：

本发明提供了一种用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物，所述RPA引物为基于陈国权等（“鱼类鰤鱼诺卡氏菌特异性PCR检测方法的建立”2020）报道的鰤诺卡氏菌特异性序列设计得到，所述引物F和R的核酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

SEQ ID NO.1（引物F）：5’-CGCGGATGTGGGCCACAACGTCGAACGCCT-3’；

SEQ ID NO.2（引物R）：5’-GGAACCCGTG AAAATGCGAG TGATCAGTGG-3’。

本发明还提供了一种用于检测鰤诺卡氏菌的探针，所述探针根据上述RPA引物设计得到，所述探针的基因大小为30~45bp，其5’端用FAM标记，3’端进行C3 Spacer（C3间臂）修饰，且在探针中间距离5’端30bp处进行THF修饰；

所述探针的核酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；

SEQ ID NO.3（探针P）：5’-FAM-AGATTGCGAATCGCCAAGTGCTCGTCCGCA[FAM-dT][THF][BHQ-dT]CGAACGGGGTCGTAG(C3 Spacer)-3’。

本发明还提供了一种用于检测鰤诺卡氏菌的RPA检测组合，所述检测组合包括上述用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物和探针；

所述RPA引物的核酸序列为：

SEQ ID NO.1（引物F）：5’-CGCGGATGTGGGCCACAACGTCGAACGCCT-3’；

SEQ ID NO.2（引物R）：5’-GGAACCCGTG AAAATGCGAG TGATCAGTGG-3’。

所述探针的核酸序列为：

本发明还提供了一种基于RPA法检测鰤诺卡氏菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述检测鰤诺卡氏菌的RPA检测组合。

本发明还提供了一种基于RPA法检测鰤诺卡氏菌的方法，包括如下步骤：

1）提取待测样品中的DNA；

2）以步骤1）所提取的DNA为扩增模板，将所述引物F和R、探针P在RPA反应管中进行RPA扩增反应；

3）分析RPA扩增反应得到的产物；

步骤2）所述RPA扩增反应的体系组分以总体积为50 μL计，包括：溶解剂20 μL、10μmol/L引物R 2.1 μL、10 μmol/L引物F 2.1 μL、10 μmol/L引物P 0.6 μL、模板DNA 2 μL、ddH₂O 21.2 μL、激活剂 2 μL；

所述RPA扩增反应的条件为：95℃，30秒，40℃，30秒，40个循环，95℃，1分钟终止反应；

步骤3）所述分析RPA扩增反应得到的产物，通过分析其曲线图，若待测样品出现S曲线，而且质控曲线正常，则表明该样品中含有鰤诺卡氏菌，如果仅是质控样品出现S曲线，则表明该样品中不含鰤诺卡氏菌。

本发明的有益效果如下：

本发明的用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物和探针，首次将RPA技术应鰤诺卡氏菌的检测，能够实现从临床判断为感染或疑似感染鰤诺卡氏菌组织中快速准确地检测岀鰤诺卡氏菌，该方法体现出较强的特异性，以及其检测灵敏度均较常规PCR更高，检测限度达到60pg/μL，还可以对不同来源的鰤诺卡氏菌进行检测，这对鰤诺卡氏菌病的早期诊断、早期治疗等方面具有重要意义，同时还可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使用；相比现有技术所采用的RAA或PCR技术，它们需要等待电泳的结果，以及没有涉及探针；

本发明的用于检测鰤诺卡氏菌所设计的探针能够通过荧光识别，在体外进行核酸扩增不需要加热，在恒温条件下即可完成对双链DNA的解链处理，并进行循环扩增，在等温条件下即可高效、快速、高特异、高灵敏地进行靶基因的扩增；也不需要进行凝胶电泳来观察结果，减少开盖污染环境的风险；10分钟内就能完成阳性样品的扩增，扩增结果可通过普通荧光检测仪进行判读或与免疫层析检测试纸联合应用目测判读，对于鰤诺卡氏菌的检测具有重要意义，其用于动物疾病诊断、病原检测和鉴定、食品安全检测、生物安全检测、转基因农作物以及环境监测等方面发挥着重要的作用。

附图说明

图1为实施例中利用RPA引物恒温扩增鰤诺卡氏菌的曲线图；

图2为试验例1中利用RPA引物检测鰤诺卡氏菌的特异性曲线图；

图3为试验例2中利用RPA引物检测鰤诺卡氏菌的灵敏度曲线图；

图4为试验例3中利用RPA引物进一步检测鰤诺卡氏菌的特异性曲线图。

具体实施方式

以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。

若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。

实施例

一种用于检测鰤诺卡氏菌的RPA检测组合：

1）模板DNA的制备：

参照广州奕昕生物科技有限公司的磁珠法细菌DNA提取试剂盒使用说明书对DNA进行提取：离心收集菌体，加入255 µL Buffer STE混合剂进行裂解；加入220 µL BufferDL和10 µL Proteinase K消化菌体；取适量上清液至新的离心管中，加入450 µL BufferBD和20 µL MagPure Particle进行抽提；加入600 µL Buffer AW1收集菌体DNA；加入600 µL 80%乙醇洗涤2次；晾干后加入60~100 µL Elution Buffer溶解回收菌体DNA，-20℃或4℃保存备用。

2）引物及探针的设计：

将鰤诺卡氏菌菌株NK16020（为本领域技术人员可通过常规方法从患病乌鳢组织分离纯化得到，NK16020为自行编号）用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物和探针的筛选和设计，所述RPA引物为基于陈国权等（“鱼类鰤鱼诺卡氏菌特异性PCR检测方法的建立”2020））报道的鰤诺卡氏菌特异性序列（726bp的基因组片段ORF3659，genbank序列号NZ_JNCT01000001.1，Sc-affold277:54:779）利用Primer 5设计得到，所述探针为根据RPA引物序列设计一条大小为30-45bp，探针的5’端用FAM标记，3’端进行C3 Spacer（C3间臂）修饰，且在探针中间距离5’端30bp处进行THF修饰，即得到用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物和探针；

所述RPA引物对的核酸序列为：

SEQ ID NO.1（引物F）：5’-CGCGGATGTGGGCCACAACGTCGAACGCCT-3’；

SEQ ID NO.2（引物R）：5’-GGAACCCGTG AAAATGCGAGTGATCAGTGG-3’。

所述探针的核酸序列为：

所有引物及探针由湖州河马生物科技有限公司合成。

将所述引物对和探针用于鰤诺卡氏菌的检测，如图1所示（注：其中，阳性对照，NK；空白对照，ddH₂O），为利用RPA引物恒温扩增鰤诺卡氏菌的曲线图，10分钟即可完成阳性样品的扩增，其中，阳性对照为鰤诺卡氏菌DNA（4个平行样），空白对照为ddH₂O（4个平行样），结果显示，阳性对照有S曲线，阴性对照没有S曲线，该结果表明本发明引物和探针可用于鰤诺卡氏菌的检测，即表明所设计的用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物和探针的合成有效。

试验例1

用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物和探针的特异性检测

1）提取菌株的DNA：采用如表1所示的菌株进行特异性检测，所有菌株DNA采用广州奕昕生物科技有限公司的磁珠法细菌DNA提取试剂盒进行提取获得，操作同实施例1；

表1 用于RPA检测的菌株

所采用的鰤诺卡氏菌NK16020、维氏气单胞菌JY、无乳链球菌QDB为本实验自患病鱼体分离保存，为本领域技术人员通过常用提取技术可得到；

2）以步骤1）所提取的DNA为扩增模板，将所述引物F和R、探针P在RPA反应管中进行RPA扩增反应，反应体系见表2；

RPA反应条件为:95℃，30秒，40℃，30秒，40个循环，95℃，1分钟终止反应；

3）分析RPA扩增反应得到的产物，通过分析其曲线图，结果如图2（注：其中，阳性对照，NK；阴性对照，JY和QDB），其中，鰤诺卡氏菌（NK16020）DNA为阳性对照，嗜水气单胞菌（JY）和无乳链球菌（QBD）DNA为检测样品，结果显示，阳性对照有S曲线，阴性样品没有S曲线，该结果表明本发明的用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物和探针具有较好的特异性。

试验例2

用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物和探针的灵敏度检测

以鰤诺卡氏菌NK16020为模板，利用实施例的RPA引物对R、F和检测探针进行RPA扩增，其中，NK16020基因组DNA用ddH₂O梯度稀释为600 ng/μL、60 ng/μL、6 ng/μL、600 pg/μL、60 pg/μL、6 pg/μL、600 fg/μL，在RPA反应管中进行RPA反应，RPA反应体系和反应条件同试验例1，分析其扩增反应的产物曲线图，如图3所示（注：其中，NKE0，600 ng/μL；NKE-1，60ng/μL；NKE-2，6 ng/μL；NKE-3，600 pg/μL；NKE-4，60 pg/μL；NKE-5，6 pg/μL；NKE-6，600fg/μL），结果显示，600 ng/μL、60 ng/μL、6 ng/μL、600 pg/μL和60 pg/μL均有S曲线，其他组别样品没有S曲线，表明本发明的用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物和探针的检测下限可达到60 pg/μL，灵敏度较高。

试验例3

进一步测试用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物和探针的特异性

以NK16020为阳性对照，ddH₂O为空白对照，利用RPA引物和探针进一步检测鰤诺卡氏菌的特异性，所采用的菌株如表3所示，所有菌株DNA采用广州奕昕生物科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取得到；

表3中的菌株：迟缓爱德华氏菌06052、铜绿假单胞菌14038、鰤诺卡氏菌17012、香港海鸥菌17015、霍乱弧菌17048、类志贺邻单胞菌17107、嗜水气单胞菌18033、海分枝杆菌18035、蜡样芽孢杆菌18041、鰤诺卡氏菌18052、海豚链球菌21010为本实验自患病鱼体分离保存，枯草芽孢杆菌99210为本实验自池塘水环境分离保存，均为本领域技术人员通过常用提取技术即可得到，编号为自行编号；金黄色葡萄球菌ATCC 7-1受赠自深圳大学医学院；ATCC 25922和ATCC 43700菌株购于ATCC菌株保藏库。

将所提取的菌株DNA为扩增模板，将所述引物F和R、探针P在RPA反应管中进行RPA扩增反应，RPA反应体系和反应条件同试验例1，分析其扩增反应的产物曲线图，如图4所示（注：其中，阳性对照，NK；阳性样品，17012和18052；空白对照，ddH₂O；其他待测样品，14株阴性菌），鰤诺卡氏菌（NK16020）DNA为阳性对照，ddH₂O为空白对照，其它菌株的为检测样品，除阳性对照、17012和18052检测样品有S曲线外，其他检测样品和空白对照均没有曲线，进一步表明本发明用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物和探针具有优异的特异性，能够检测出不同来源的鰤诺卡氏菌。

由上可见，本发明所设计的RPA引物和探针检测鰤诺卡氏菌具有快速、精准的特点，以及具有特异性，相比现有技术具有更优异的灵敏度。

序列表

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所广州奕昕生物科技有限公司

<120> 一种用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物、探针以及检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

cgcggatgtg ggccacaacg tcgaacgcct 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ggaacccgtg aaaatgcgag tgatcagtgg 30

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

agattgcgaa tcgccaagtg ctcgtccgca cgaacggggt cgtag 45

Claims

1.一种用于检测鰤诺卡氏菌的RPA引物，其特征在于，所述RPA引物F和R的核酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

引物F：5’-CGCGGATGTGGGCCACAACGTCGAACGCCT-3’；

引物R：5’-GGAACCCGTGAAAATGCGAGTGATCAGTGG-3’。

2.一种用于检测鰤诺卡氏菌的探针，其特征在于，所述探针根据权利要求1所述的RPA引物设计得到，所述探针的基因大小为30~45bp，其5’端用FAM标记，3’端进行C3 Spacer修饰，且在探针中间距离5’端30bp处进行THF修饰；

所述探针的核酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；

探针P：5’-FAM-AGATTGCGAATCGCCAAGTGCTCGTCCGCA[FAM-dT][THF][BHQ-dT]CGAACGGGGTCGTAG（C3 Spacer）-3’。

3.一种用于检测鰤诺卡氏菌的RPA检测组合，其特征在于，所述检测组合包括如权利要求1所述的RPA引物和如权利要求2所述的探针；

所述RPA引物的核酸序列为：

引物F：5’-CGCGGATGTGGGCCACAACGTCGAACGCCT-3’；

引物R：5’-GGAACCCGTGAAAATGCGAGTGATCAGTGG-3’；

所述探针的核酸序列为：

探针P：5’-FAM-AGATTGCGAATCGCCAAGTGCTCGTCCGCA[FAM-dT][THF][BHQ-dT]CGAACGGGGTCGTAG(C3 Spacer)-3’。

4.一种基于RPA法检测鰤诺卡氏菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求3所述的用于检测鰤诺卡氏菌的RPA检测组合。

5.一种基于RPA法检测鰤诺卡氏菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）提取待测样品中的DNA；

2）以步骤1）所提取的DNA为扩增模板，采用如权利要求3所述的引物F和R、探针P在RPA反应管中进行RPA扩增反应；

3）分析RPA扩增反应得到的产物。

6.根据权利要求5所述的基于RPA法检测鰤诺卡氏菌的方法，其特征在于，步骤2）所述RPA扩增反应的体系组分以总体积为50 μL计，包括：溶解剂20 μL、10 μmol/L引物R 2.1 μL、10 μmol/L引物F 2.1 μL、10 μmol/L引物P 0.6 μL、模板DNA 2 μL、ddH₂O 21.2 μL、激活剂 2 μL。

7.根据权利要求5所述的基于RPA法检测鰤诺卡氏菌的方法，其特征在于，步骤2）所述RPA扩增反应的条件为：95℃，30秒，40℃，30秒，40个循环，95℃，1分钟终止反应。