CN116103416A - 用于检测鰤鱼诺卡氏菌的rpa组合物、试剂盒及鰤鱼诺卡氏菌的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物、试剂盒及鰤鱼诺卡氏菌的检测方法，属于生物技术领域。该用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物，包括RPA引物和探针。本发明还提出一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的试剂盒，所述RPA‑LFD试剂盒包括上述RPA组合物。本发明还提出一种鰤鱼诺卡氏菌的检测方法，包括以下步骤：S1、提取待测样品DNA；S2、以步骤S1所提取的DNA为扩增模板，采用上述RPA组合物进行RPA扩增反应得到产物；S3、分析步骤S2得到的产物。本发明提出的检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物能够实现鰤鱼诺卡氏菌的RPA检测，能快速、简便、特异的检测鰤鱼诺卡氏菌。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物、试剂盒及鰤鱼诺卡氏菌的检测方法。
背景技术
鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)，属于诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、诺卡氏菌属(Nocardia)，是鱼类诺卡氏菌病的主要致病菌。鰤鱼诺卡氏菌可感染包括淡水养殖鱼种和海水养殖鱼种在内的40余种鱼类，如大口黑鲈(Micropterus salmoides)、罗非鱼(Oreochromis niloticus)、乌鳢(Channa argus)、卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)和大黄鱼(Larimichthys crocea)等。鱼体感染鰤鱼诺卡氏菌后的发病症状主要为肝脏、脾脏和肾脏组织形成大量白色结节。鰤鱼诺卡氏菌自然感染发病率可达到30％-60％，患病鱼死亡率高，对水产养殖业造成了较大的经济损失。
由于鰤鱼诺卡氏菌感染早期为隐性感染，通常在中晚期才发现明显症状，所以需要对鰤鱼诺卡氏菌进行早期检测。此外，鰤鱼诺卡氏菌生长缓慢，因此从患病鱼体分离出鰤鱼诺卡氏菌的分离率较低，通过传统的细菌分离和生化鉴定准确率差。分子检测方法具有灵敏度高、时间短、操作简单等优点。目前已有报道基于分子技术检测鰤鱼诺卡氏菌的方法，如聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR反应和环介导等温扩增技术。然而，PCR和实时荧光定量PCR反应操作过程复杂、耗时且依赖于昂贵的设备(如PCR仪等)，不适合现场快速检测；环介导等温扩增技术需要在60-65℃完成，需要水浴锅或恒温箱，且在此温度下反应容易因气溶胶污染产生假阳性，因此也不适宜鰤鱼诺卡氏菌的渔场检测。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一种等温DNA扩增技术，与其他DNA扩增方法相比具有多项优势，特别是其可在非实验室环境下应用。重组酶聚合酶反应特异性强，可在25-45℃的恒温条件下反应15-30min即可实现特定寡核苷酸序列的扩增，且扩增产物可通过侧向层析试纸条实现可视化判别。该技术对硬件设备的要求极低，通过优化后，可以完全不需要大型或昂贵的硬件设备，且反应时间短，无需对样品进行复杂处理，具有灵活性好和实用性强等优点，特别适用于渔场的病原检测，如何实现鰤鱼诺卡氏菌的RPA检测是现有技术的难题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术不足，提供一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物、试剂盒及鰤鱼诺卡氏菌的检测方法，解决现有技术中如何实现鰤鱼诺卡氏菌的RPA检测。
为达到上述技术目的，本发明的技术方案提供一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物，包括RPA引物和探针；
所述RPA引物上游引物和下游引物的寡核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，且下游引物5’端标记生物素；
所述上游引物的序列为：
5’-GTAGTCCGGCGGACGCTCATGGGTGGAACACTGAC-3’；
所述下游引物的序列为：
5’-CGCTCTTACAAACTTACTAACAAAGATGCTCGC-3’；
所述探针的序列如SEQ ID NO.3所示；且5’端标记羧基荧光素FAM，3’端添加延伸阻断基团C3 Spacer，在第34-35位碱基之间增加一个四氢呋喃，所述探针的序列为：
5’-CTCATGGGTGGAACACTGACAACCTTCATCGCACTCGATCGGTACTCAGTG-3’。
此外，本发明还提出一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的试剂盒，所述RPA-LFD试剂盒包括上述RPA组合物。
进一步地，所述RPA-LFD试剂盒还包括阳性对照。
进一步地，所述阳性对照为鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA。
进一步地，所述RPA-LFD试剂盒还包括核酸释放剂、结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、反应体系缓冲液和醋酸镁。
进一步地，所述核酸释放剂的使用方法包括：取组织，加入水后充分研磨得到组织均浆液，取组织匀浆液到EP管中，加入核酸释放剂，混匀后静置得到产物，最后取所述产物进行RPA-LFD检测。
此外，本发明还提出一种鰤鱼诺卡氏菌的检测方法，包括以下步骤：
S1、提取待测样品DNA；
S2、以步骤S1所提取的DNA为扩增模板，采用上述RPA组合物进行RPA扩增反应得到产物；
S3、分析步骤S2得到的产物。
进一步地，在步骤S3中，将所述产物通过琼脂糖凝胶电泳检测进行分析。
进一步地，在步骤S2中，所述扩增反应的温度为25-45℃，时间为10min以上。
进一步地，在步骤S3中，使用侧向层析试纸条对产物进行分析：试纸条质控线和检测线同时出现条带为阳性；试纸条质控线出现条带，但检测线没有条带为阴性。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明提出的用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物能够实现鰤鱼诺卡氏菌的RPA检测，能快速、简便、特异的检测鰤鱼诺卡氏菌。
附图说明
图1为引物和探针筛选的结果，每组引物组合均设置了阴性对照。(A)分别使用9组引物组合对鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA进行基础RPA扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，M：DL2000，1和2：F1/R1；3和4：F1/R2；5和6：F1/R3；7和8：F2/R1；9和10：F2/R2；11和12：F2/R3；13和14：F3/R1；15和16：F3/R2；17和18：F3/R3；19：阳性对照；(B)将2条探针分别与F2、R2组合，对鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA进行RPA-LFD扩增，试纸条的检测线和质控线的显色情况，1和2：F2/R2/probe1；3和4：F2/R2/probe2。
图2为不同反应条件对RPA-LFD扩增效果的影响。(A)不同反应温度对RPA-LFD扩增效果的影响，图中1-8号试纸条的反应温度分别为20℃，25℃，30℃，35℃，38℃，40℃，45℃和50℃；(B)不同反应时间对RPA-LFD扩增效果的影响，图中1-8号试纸条的反应时间分别为1min，5min，10min，15min，20min，25min，30min，35min。
图3为利用鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA检测RPA-LFD灵敏度的结果。(A)PCR对不同浓度的鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA的扩增结果，M：DL2000，1-9的DNA浓度分别为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl和1fg/μl，10：阴性对照；(B)RPA-LFD对不同浓度的鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA的扩增结果，1-9的DNA浓度分别为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl和1fg/μl，10：阴性对照。
图4为利用pMD18-ITS质粒检测RPA-LFD灵敏度的结果。(A)PCR对不同拷贝数的pMD18-ITS质粒的扩增结果，M：DL2000，1-8的质粒拷贝数分别为107copies/μl、106copies/μl、105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、10copies/μl和1copy/μl，9：阴性对照；(B)RPA-LFD对不同拷贝数的pMD18-ITS质粒的扩增结果，1-8的质粒拷贝数分别为107copies/μl、106copies/μl、105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、10copies/μl和1copy/μl，9：阴性对照。
图5为RPA-LFD特异性检测的结果。1：鰤鱼诺卡氏菌；2：嗜水气单胞菌；3：柱状黄杆菌；4：温和气单胞菌；5：荧光假单胞菌；6：维氏气单胞菌；7：阴性对照。
图6为使用组织DNA提取试剂盒提取临床样品组织DNA后进行PCR和RPA-LFD检测的结果。(A)PCR的临床样品检测结果，M：DL2000，1-3分别为1号健康加州鲈的肝脏、脾脏和肠道；4-6分别为2号健康加州鲈的肝脏、脾脏和肠道；7-9分别为1号感染加州鲈的肝脏、脾脏和肠道；10-12分别为2号感染加州鲈的肝脏、脾脏和肠道；(B)RPA-LFD的临床样品检测结果，1-3分别为1号健康加州鲈的肝脏、脾脏和肠道；4-6分别为1号感染加州鲈的肝脏、脾脏和肠道。
图7为使用核酸释放剂释放临床样品组织中的核酸后进行PCR和RPA-LFD检测的结果。(A)PCR的临床样品检测结果，M：DL2000，1：健康加州鲈的脾脏，2-4分别为3条感染加州鲈的脾脏；(B)RPA-LFD的临床样品检测结果，1：健康加州鲈的脾脏，2-4分别为3条感染加州鲈的脾脏。
具体实施方式
本具体实施方式提供一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物，包括RPA引物和探针；
所述RPA引物上游引物和下游引物的寡核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，且下游引物5’端标记生物素；
所述上游引物的序列为：
5’-GTAGTCCGGCGGACGCTCATGGGTGGAACACTGAC-3’；
所述下游引物的序列为：
5’-CGCTCTTACAAACTTACTAACAAAGATGCTCGC-3’；
所述探针的序列如SEQ ID NO.3所示；且5’端标记羧基荧光素FAM，3’端添加延伸阻断基团C3 Spacer，在第34-35位碱基之间增加一个四氢呋喃，所述探针的序列为：
5’-CTCATGGGTGGAACACTGACAACCTTCATCGCACTCGATCGGTACTCAGTG-3’。
本具体实施方式还提出一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的试剂盒，所述RPA-LFD试剂盒包括上述RPA组合物；进一步地，所述RPA-LFD试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA。
进一步地，所述RPA-LFD试剂盒还包括核酸释放剂、结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、反应体系缓冲液和醋酸镁；所述核酸释放剂的使用方法包括：取组织，加入水后充分研磨得到组织均浆液，取组织匀浆液到EP管中，加入核酸释放剂，混匀后常温静置5min得到产物，最后取所述产物进行RPA-LFD检测。
此外，本具体实施方式还提出一种鰤鱼诺卡氏菌的检测方法，包括以下步骤：
S1、提取待测样品DNA；
S2、以步骤S1所提取的DNA为扩增模板，采用上述RPA组合物进行RPA扩增反应得到产物；
S3、分析步骤S2得到的产物。
在某些实施例中，将所述产物通过琼脂糖凝胶电泳检测进行分析。
在某些实施例中，使用侧向层析试纸条对产物进行分析：试纸条质控线和检测线同时出现条带为阳性；试纸条质控线出现条带，但检测线没有条带为阴性。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。需要说明的是，下述实施例中的核酸释放剂采购自安普未来生物科技有限公司。
实施例1鰤鱼诺卡氏菌RPA-LFD引物和探针的设计及筛选
(1)细菌基因组DNA的提取
本发明中所使用的鰤鱼诺卡氏菌菌株(NSFS001)、嗜水气单胞菌菌株(XS91-4-1)、柱状黄杆菌菌株(G4)、温和气单胞菌菌株(CR79-1-1)、荧光假单胞菌菌株(W81-11)和维氏气单胞菌菌株(HS2205-01)均由本实验室保存。使用细菌基因组DNA提取试剂盒(购自美基生物科技有限公司)，按照说明书来提取细菌基因组DNA，并最终用50μl的无DNase和RNase水洗脱，提取的DNA存放到-20℃备用。
(2)引物和探针的设计
本发明根据鰤鱼诺卡氏菌的转录间隔区核酸序列设计引物和探针；同时通过对来自GenBank中的AB060282.1、AP017900.1、CP017839.1、CP073655.1、CP063662.1、CP059737.1、AB060281.1、JF810852.1、JF810855.1和AF536475.1的转录间隔区核酸序列进行比对分析，进一步明确鰤鱼诺卡氏菌转录间隔区的保守区域，针对该区域设计引物和探针，以期能够检测到尽可能多的鰤鱼诺卡氏菌。所有的引物和探针都由擎科生物科技有限公司(武汉)合成。结合RPA-LFD的检测特点，本发明分别设计合成了3条上游引物、3条下游引物和2条探针，如下表1所示。
表1.鰤鱼诺卡氏菌转录间隔区的候选RPA引物和探针
本实施例中的所述鰤鱼诺卡氏菌转录间隔区的特异性保守序列如SEQ ID NO.9所述，序列如下：
CTCATACGTAGTCCGGCGGACGCTCATGGGTGGAACACTGACAACCTTCATCGCACTCGATCGGTACTCAGTGACCGGTCGCGGTGGATATACCGACACACTATTGGGTCCTGAAAGAACAGACGACAGTCTTTCTTTCCAGGCAAAAAACGATCTGCTCGGATCTTCTGAGAAACTGCTGGCTGTGCCGGTAAGTCCTGATATCCCATCCGAGTGGGTGTGTTGTTTGAGAACTGCACAGTGGACGCGAGCATCTTTGTTAGTAAGTTTGTAAGAGCGTAC
(3)引物和探针的筛选
以提取的鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA作为模板进行扩增试验。将3条上游引物和3条下游引物，两两组合成9组引物，分别在37℃条件下进行基础RPA扩增。筛选用的50μl的基础RPA反应体系如下：将10μmol/L正向引物2μl、10μmol/L反向引物2μl、2μl DNA模板、12.1μl无DNase和RNase水以及29.4μl缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2ml的TwistAmpbasic反应管中。然后将2.5μl的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上，考虑到RPA反应灵敏度较高，易出现假阳性的情况，发明者为每组引物组合均设置了阴性对照，阴性对照不加模板，模板体积用水补足。扩增：将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃扩增30min。结果判断：取5μl的RPA扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果如图1(A)所示，引物组合F2/R2的条带单一且明亮，引物二聚体较少，因此选择F2/R2为最佳引物组合。需要说明的是，冻干酶粉包括结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶。
在F2/R2引物中间设计两条探针，然后在37℃条件下进行RPA-LFD检测。筛选用的50μl的RPA-LFD反应体系如下：将10μmol/L正向引物2μl、10μmol/L反向引物2μl、10μmol/L探针0.6μl、2μl DNA模板、12.2μl无DNase和RNase水以及29.4μl缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2ml的TwistAmp nfo反应管中。然后将2.5μl的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上，考虑到RPA反应灵敏度较高，易出现假阳性的情况，发明者为每一组引物探针组合均设置了一组阴性对照，阴性对照不加模板，模板体积用水补足。扩增：将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃扩增20min。结果判断：取10μl的RPA扩增产物用无DNase和RNase水稀释至200μl，再吸取80μl滴加到试纸条上显色，显色时间控制在3-5min。检测结果如图1(B)所示，probe1组的检测线更深，因此选择probe1为最佳探针，最终确定F2/R2/probe1为37℃条件下扩增效率最高的引物与探针组合。
实施例2鰤鱼诺卡氏菌RPA-LFD反应条件的优化
按照实施例1中RPA-LFD的检测方法，利用筛选后的引物和探针组合对实施例1中提取的鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA进行扩增试验。
(1)反应温度
在确定RPA-LFD方法的最佳反应温度时，我们分别试验了8个不同的反应温度，分别为20℃、25℃、30℃、35℃、38℃、40℃、45℃、50℃，并将孵育时间设定为30min。检测结果如图2(A)所示，在20℃时试纸条检测线上出现较弱的条带，在25-35℃之间试纸条检测线上有比较清晰的条带，在38-45℃之间试纸条检测线上有明显清晰的条带且无差异，当温度为50℃时，试纸条检测线上没有出现条带，结果表明该试验的反应温度可以为25-45℃，最佳反应温度为38-45℃，我们选择38℃作为后续实验的反应温度。
(2)反应时间
在确定RPA-LFD方法的最佳反应时间时，我们在38℃下设定了8个不同的时间，分别为1min、5min、10min、15min、20min、25min、30min，35min，检测结果如图2(B)所示，在反应1min的时候在试纸条检测线上没有条带，反应5min时试纸条检测线上有比较清晰的条带，当反应时间在10-35min时，试纸条检测线上有明显清晰的条带且无差异，我们选择20min作为后续实验的反应时间。
实施例3鰤鱼诺卡氏菌RPA-LFD灵敏度检测
(1)利用基因组DNA进行灵敏度检测
用Nanodrop-2000分光光度计测量提取的鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA的浓度，并将其稀释为100ng/μl；对浓度为100ng/μl的鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA进行十倍倍比稀释，选取浓度为100ng/μl-l fg/μl的9个浓度的基因组DNA作为模板，选用F2/R2/probe1在38℃下进行RPA-LFD扩增，扩增时间为20min，阴性对照不加模板，模板体积用水补足，确定RPA-LFD的最低检出浓度，进行灵敏性分析，结果与PCR进行比较。
所用PCR方法的引物对的核苷酸序列如下所示。
上游引物：5’CACTGACAACCTTCATCGCAC3’，
下游引物：5’AACTTACTAACAAAGATGCTCGC3’
扩增条件为94℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃再延伸10min，16℃5min。
检测结果如图3所示，RPA-LFD和PCR方法对鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA的最低检出浓度一样，都为100pg/μl。
(2)利用质粒进行灵敏度检测
设计扩增鰤鱼诺卡氏菌转录间隔区的PCR引物，所述的引物对的核苷酸序列如下所示。
上游引物：5’-TCTAAGGGGCACTTCTACGCA-3’，
下游引物：5’-GTACGCTCTTACAAACTTACTAA-3’
以提取的鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA为模板，扩增条件为94℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃再延伸10min，16℃5min。PCR产物于20g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，以确定扩增得到大小为349bp的目的片段。用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自美基生物科技有限公司)回收PCR产物，与pMD18-T克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养12h。筛选出阳性单菌落到含有氨苄青霉素的液体培养基中，37℃培养，取菌液15ml，使用无内毒素质粒小提中量试剂盒(购自天根生化科技有限公司)提取质粒，测定序列为阳性的pMD18ITS，并用Nanodrop-2000分光光度计测量提取的pMD18ITS质粒的浓度。
根据拷贝数计算公式：拷贝数(copies)/μl＝6.02×1023×质粒浓度(ng/μl)×10-9/(质粒碱基数×660)，计算提取的重组质粒pMD18-ITS的拷贝数，并将其稀释为107copies/μl。对浓度为107copies/ul的质粒进行十倍倍比稀释，选取拷贝数为107-100copies/μl的质粒，选用F2/R2/probe1，在38℃下进行RPA-LFD扩增，扩增时间为20min，阴性对照不加模板，模板体积用水补足，确定RPA-LFD的最低检出浓度，进行灵敏性分析，结果与PCR进行比较。
检测结果如图4所示，RPA-LFD和PCR方法对pMD18-ITS质粒的最低检出浓度一样，都为103copies/μl。
综上所述，我们建立的鰤鱼诺卡氏菌RPA-LFD检测方法的最低检测限和PCR一样，具有较高的灵敏性。
实施例4鰤鱼诺卡氏菌RPA-LFD特异性检测
分别以鰤鱼诺卡氏菌、嗜水气单胞菌、柱状黄杆菌、温和气单胞菌、荧光假单胞菌和维氏气单胞菌的基因组DNA为模板进行RPA-LFD扩增，阴性对照不加模板，模板体积用水补足。结果如图5所示，只有鰤鱼诺卡氏菌能够进行很好的扩增，检测线出现条带，其他均未在检测线出现条带，说明该方法对检测鰤鱼诺卡氏菌具有较强的特异性。
实施例5鰤鱼诺卡氏菌RPA-LFD对临床样品的检测
利用组织DNA提取试剂盒(购自Omega生物科技有限公司)对健康和鰤鱼诺卡氏菌感染的加州鲈内脏组织(肝脏、脾脏和肠道)提取组织DNA后，作为模板进行RPA-LFD检测，同时按照实施例3的方法进行PCR平行试验。对样品的检测结果如图6所示，含有鰤鱼诺卡氏菌的加州鲈内脏组织检出结果为阳性，健康加州鲈内脏组织检出结果为阴性，与PCR检测结果一致，说明本研究建立的RPA-LFD检测方法可有效检测出发病加州鲈体内的鰤鱼诺卡氏菌。
实施例6核酸释放剂的效果评价
实施例5中使用组织DNA提取试剂盒提取组织DNA，步骤繁琐，耗时较长，为了将RPA-LFD应用于现场检测，发明者尝试并比较了多种核酸释放剂，挑选其中效果最好的核酸释放剂进行组织中核酸的释放，从而取代组织DNA提取试剂盒。
分别取健康和鰤鱼诺卡氏菌感染的加州鲈脾脏组织30mg，加入200μl水后充分研磨，取25μl组织匀浆液到新的1.5ml EP管中，加入5μl核酸释放剂，混匀后常温静置5min，最后取2μl作为模板进行RPA-LFD检测，同时按照实施例3的方法进行PCR平行试验。结果如图7所示，对于健康加州鲈脾脏组织，PCR和RPA-LFD均没有条带，对于鰤鱼诺卡氏菌感染的加州鲈脾脏组织，PCR和RPA-LFD检测均有条带，并且PCR和RPA-LFD的条带亮度一致，这说明该核酸释放剂释放出的核酸可以用来进行PCR和RPA-LFD，其核酸释放效果较好。
相较于现有技术，本发明的方法还具有如下优势：
1)节约时间：核酸释放剂释放核酸只需要5min，该时间远远低于组织DNA提取试剂盒的4-6h，并且RPA整个实验过程只需要20min，该时间远远低于PCR的1.5h。
2)降低反应温度：RPA在25-45℃恒温条件下即可完成实验，该温度远远低于PCR的6095℃。
3)方法简单便于携带：扩增所需要的酶和其他一些必要的东西已经冻干保存，能常温放置，扩增时只需要加入水解缓冲液、引物、探针和模板，并加入镁离子起始反应即可，而RPA-LFD只需要常温即可完成实验，对操作人员专业要求低，适用于渔场现场诊断，也能够用于鰤鱼诺卡氏菌的科学研究。
4)特异性强：本发明试剂盒中添加了探针，增加了检测的特异性，与现有的PCR方法的符合度为100％。
5)检测结果简单可靠：直接肉眼观察试纸条显色情况，检测线和质控线均显色就可定性判断为鰤鱼诺卡氏菌阳性。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物，其特征在于，包括RPA引物和探针；
所述RPA引物上游引物和下游引物的寡核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示，且下游引物5’端标记生物素；
所述上游引物的序列为：
5’-GTAGTCCGGCGGACGCTCATGGGTGGAACACTGAC-3’；
所述下游引物的序列为：
5’-CGCTCTTACAAACTTACTAACAAAGATGCTCGC-3’；
所述探针的序列如SEQ ID NO.3所示；且5’端标记羧基荧光素FAM，3’端添加延伸阻断基团C3 Spacer，在第34-35位碱基之间增加一个四氢呋喃，所述探针的序列为：
5’-CTCATGGGTGGAACACTGACAACCTTCATCGCACTCGAT CGGTACTCAGTG-3’。
2.一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的试剂盒，其特征在于，所述RPA-LFD试剂盒包括如权利要求1所述的RPA组合物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA-LFD试剂盒还包括阳性对照。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA-LFD试剂盒还包括核酸释放剂、结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、反应体系缓冲液和醋酸镁。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸释放剂的使用方法包括：取组织，加入水后充分研磨得到组织均浆液，取组织匀浆液到EP管中，加入核酸释放剂，混匀后静置得到产物，最后取所述产物进行RPA-LFD检测。
7.一种鰤鱼诺卡氏菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取待测样品DNA；
S2、以步骤S1所提取的DNA为扩增模板，采用如权利要求1所述的RPA组合物进行RPA扩增反应得到产物；
S3、分析步骤S2得到的产物。
8.根据权利要求7所述的鰤鱼诺卡氏菌的检测方法，其特征在于，在步骤S3中，将所述产物通过琼脂糖凝胶电泳检测进行分析。
9.根据权利要求7所述的检测鰤鱼诺卡氏菌的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述扩增反应的温度为25-45℃，时间为10min以上。
10.根据权利要求7所述的鰤鱼诺卡氏菌的检测方法，其特征在于，在步骤S3中，使用侧向层析试纸条对产物进行分析：试纸条质控线和检测线同时出现条带为阳性；试纸条质控线出现条带，但检测线没有条带为阴性。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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