CN115838815A - 用于检测鰤鱼诺卡氏菌的rpa组合物、荧光rpa试剂盒及检测方法 - Google Patents
用于检测鰤鱼诺卡氏菌的rpa组合物、荧光rpa试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115838815A CN115838815A CN202211428124.0A CN202211428124A CN115838815A CN 115838815 A CN115838815 A CN 115838815A CN 202211428124 A CN202211428124 A CN 202211428124A CN 115838815 A CN115838815 A CN 115838815A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rpa
- nocardia seriolae
- fluorescent
- detecting
- amplification
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241001503642 Nocardia seriolae Species 0.000 title claims abstract description 67
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 23
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 50
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 36
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 36
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 claims abstract description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 30
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 27
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 25
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 25
- 230000003578 releasing effect Effects 0.000 claims description 18
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 17
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 9
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 6
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 claims description 6
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 claims description 6
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 claims description 5
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 claims description 5
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 101710116602 DNA-Binding protein G5P Proteins 0.000 claims description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 101710162453 Replication factor A Proteins 0.000 claims description 4
- 101710176758 Replication protein A 70 kDa DNA-binding subunit Proteins 0.000 claims description 4
- 101710176276 SSB protein Proteins 0.000 claims description 4
- 101710126859 Single-stranded DNA-binding protein Proteins 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 3
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 25
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 15
- 241001125889 Micropterus salmoides Species 0.000 description 13
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 10
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 8
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 7
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 6
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 241000607528 Aeromonas hydrophila Species 0.000 description 3
- 241000607574 Aeromonas veronii Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000604777 Flavobacterium columnare Species 0.000 description 3
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 3
- 241001600434 Plectroglyphidodon lacrymatus Species 0.000 description 3
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 3
- 241000607522 Aeromonas sobria Species 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 2
- 241000269795 Lateolabrax japonicus Species 0.000 description 2
- 241001655308 Nocardiaceae Species 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 2
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 241000607534 Aeromonas Species 0.000 description 1
- 241001597062 Channa argus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241001596950 Larimichthys crocea Species 0.000 description 1
- 241000276701 Oreochromis mossambicus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000719209 Trachinotus ovatus Species 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物、荧光RPA试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。该用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物，包括上游引物、下游引物和探针。此外，本发明提出一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的荧光RPA试剂盒，包括上述RPA组合物。本发明还提出一种鰤鱼诺卡氏菌的检测方法，包括以下步骤：S1、提取待测样品DNA；S2、以步骤S1所提取的DNA为扩增模板，采用上述RPA组合物避光进行RPA扩增反应，并在扩增反应期间收集多次荧光信号，采集荧光数据，如果获得扩增曲线，则判定为阳性，反之，无扩增曲线则判定为阴性。该RPA组合物能快速、简便、特异的检测鰤鱼诺卡氏菌。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物、荧光RPA试剂盒及检测方法。
背景技术
鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)，属于诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、诺卡氏菌属(Nocardia)，是鱼类诺卡氏菌病的主要致病菌。鰤鱼诺卡氏菌可感染包括淡水养殖鱼种和海水养殖鱼种在内的40余种鱼类，如大口黑鲈(Micropterus salmoides)、罗非鱼(Oreochromis niloticus)、乌鳢(Channa argus)、卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)和大黄鱼(Larimichthys crocea)等。鱼体感染鰤鱼诺卡氏菌后的发病症状主要为肝脏、脾脏和肾脏组织形成大量白色结节。鰤鱼诺卡氏菌自然感染发病率可达到30％-60％，患病鱼死亡率高，对水产养殖业造成了较大的经济损失。
由于鰤鱼诺卡氏菌感染早期为隐性感染，通常在中晚期才发现明显症状，所以需要对鰤鱼诺卡氏菌进行早期检测。此外，鰤鱼诺卡氏菌生长缓慢，因此从患病鱼体分离出鰤鱼诺卡氏菌的分离率较低，通过传统的细菌分离和生化鉴定准确率差。分子检测方法具有灵敏度高、时间短、操作简单等优点。目前已有报道基于分子技术检测鰤鱼诺卡氏菌的方法，如聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR反应和环介导等温扩增技术。然而，PCR和实时荧光定量PCR反应操作过程复杂、耗时且依赖于昂贵的设备(如PCR仪等)，不适合现场快速检测；环介导等温扩增技术需要在60-65℃完成，需要水浴锅或恒温箱，且在此温度下反应容易因气溶胶污染产生假阳性，因此也不适宜鰤鱼诺卡氏菌的渔场检测。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一种等温DNA扩增技术，与其他DNA扩增方法相比具有多项优势，特别是其可在非实验室环境下应用。重组酶聚合酶反应特异性强，可在25-45℃的恒温条件下反应15-30min即可实现特定核酸序列的扩增。该技术对硬件设备的要求很低，且反应时间短，无需对样品进行复杂处理，具有灵活性好和实用性强等优点，特别适用于渔场的病原检测，如何实现鰤鱼诺卡氏菌的RPA检测是现有技术的难题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术不足，提供一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物、荧光RPA试剂盒及检测方法，解决现有技术中如何实现鰤鱼诺卡氏菌的RPA检测的技术问题。
为达到上述技术目的，本发明的技术方案提供一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物，包括上游引物、下游引物和探针；
所述上游引物和所述下游引物的寡核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；
所述上游引物：
5’GTAGTCCGGCGGACGCTCATGGGTGGAACACTGAC 3’；
所述下游引物：
5’-CAAAGATGCTCGCGTCCACTGTGCAGTTCTC-3’；
所述探针的寡核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，且探针序列中具有荧光基团FAM和猝灭基团BHQ1，两个基团之间由四氢呋喃隔开，3’端由C3 Spacer修饰；
所述探针：
5’-CACTGACAACCTTCATCGCACTCGATCGGTAC(FAM-dT)C(THF)G(BHQ1-dT)GACCGGTCGCGGTGGA(C3 Spacer)-3’。
进一步地，本发明提出一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的荧光RPA试剂盒，所述荧光RPA试剂盒包括上述RPA组合物。
进一步地，所述荧光RPA试剂盒还包括阳性对照。
进一步地，所述阳性对照为鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA。
进一步地，所述荧光RPA试剂盒还包括核酸释放剂、结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、反应体系缓冲液和醋酸镁。
进一步地，所述核酸释放剂的使用方法包括：取组织，加入水后充分研磨得到组织均浆液，取组织匀浆液到EP管中，加入核酸释放剂，混匀后静置得到产物，最后取所述产物进行实时荧光RPA检测。
此外，本发明还提出一种鰤鱼诺卡氏菌的检测方法，包括以下步骤：
S1、提取待测样品DNA；
S2、以步骤S1所提取的DNA为扩增模板，采用上述RPA组合物避光进行RPA扩增反应，并在扩增反应期间收集多次荧光信号，采集荧光数据，如果获得扩增曲线，则判定为阳性，反之，无扩增曲线则判定为阴性。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明提出的用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物能够实现鰤诺卡氏菌的实时荧光RPA检测，能快速、简便、特异的检测鰤鱼诺卡氏菌。
附图说明
图1为引物和探针筛选的结果。1：F1/R1/probe；2：F1/R2/probe；3：F1/R3/probe；4：F2/R1/probe；5：F2/R2/probe；6：F2/R3/probe；7：阳性对照；8：F3/R1/probe；9：F3/R2/probe；10：F3/R3/probe；11：阳性对照；
图2为利用鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA检测实时荧光RPA灵敏度的结果。(A)PCR对不同浓度的鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA的扩增结果，M：DL2000，1-9的DNA浓度分别为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl和1fg/μl，10：阴性对照；(B)实时荧光RPA对不同浓度的鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA的扩增结果，1-9的DNA浓度分别为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl和1fg/μl，10：阴性对照。
图3为利用pMD18-ITS质粒检测实时荧光RPA灵敏度的结果。(A)PCR对不同拷贝数的pMD18-ITS质粒的扩增结果，M：DL2000，1-8的质粒拷贝数分别为107copies/μl、106copies/μl、105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、10copies/μl和1copy/μl，9：阴性对照；(B)实时荧光RPA对不同拷贝数的pMD18-ITS质粒的扩增结果，1-8的质粒拷贝数分别为107copies/μl、106copies/μl、105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、10copies/μl和1copy/μl，9：阴性对照。
图4为实时荧光RPA特异性检测的结果。1：鰤鱼诺卡氏菌；2：嗜水气单胞菌；3：柱状黄杆菌；4：温和气单胞菌；5：荧光假单胞菌；6：维氏气单胞菌；7：阴性对照；8：阳性对照。
图5为使用组织DNA提取试剂盒提取临床样品组织DNA后进行PCR和实时荧光RPA检测的结果。(A)PCR的临床样品检测结果，M：DL2000，1-3分别为1号健康加州鲈的肝脏、脾脏和肠道；4-6分别为2号健康加州鲈的肝脏、脾脏和肠道，7-9分别为1号感染加州鲈的肝脏、脾脏和肠道；10-12分别为2号感染加州鲈的肝脏、脾脏和肠道；(B)实时荧光RPA的临床样品检测结果，1-3分别为1号健康加州鲈的肝脏、脾脏和肠道；4-6分别为1号感染加州鲈的肝脏、脾脏和肠道。
图6为使用核酸释放剂释放临床样品组织中的核酸后进行PCR和实时荧光RPA检测的结果。(A)PCR的临床样品检测结果，M：DL2000，1：健康加州鲈的脾脏，2-4分别为3条感染加州鲈的脾脏；(B)实时荧光RPA的临床样品检测结果，1：健康加州鲈的脾脏，2-4分别为3条感染加州鲈的脾脏。
具体实施方式
本具体实施方式提供一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物，包括上游引物、下游引物和探针；
所述上游引物和所述下游引物的寡核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；
所述上游引物：
5’GTAGTCCGGCGGACGCTCATGGGTGGAACACTGAC 3’；
所述下游引物：
5’-CAAAGATGCTCGCGTCCACTGTGCAGTTCTC-3’；
所述探针的寡核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，且探针序列中具有荧光基团FAM和猝灭基团BHQ1，两个基团之间由四氢呋喃隔开，3’端由C3 Spacer修饰；
所述探针：
5’-CACTGACAACCTTCATCGCACTCGATCGGTAC(FAM-dT)C(THF)G(BHQ1-dT)GACCGGTCGCGGTGGA(C3 Spacer)-3’。
此外，本具体实施方式还提出一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的荧光RPA试剂盒，所述荧光RPA试剂盒包括上述RPA组合物。
进一步地，所述荧光RPA试剂盒还包括阳性对照；所述阳性对照为鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA。
此外，所述荧光RPA试剂盒还包括核酸释放剂、结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、反应体系缓冲液和醋酸镁。
进一步地，所述核酸释放剂的使用方法包括：取组织，加入水后充分研磨得到组织均浆液，取组织匀浆液到EP管中，加入核酸释放剂，混匀后常温静置5min得到产物，最后取所述产物进行实时荧光RPA检测。
一种鰤鱼诺卡氏菌的检测方法，包括以下步骤：
S1、提取待测样品DNA；
S2、以步骤S1所提取的DNA为扩增模板，采用上述RPA组合物进行RPA扩增反应，39℃避光反应30min，并收集多次荧光信号，采集荧光数据，如果获得扩增曲线，则判定为阳性，反之，无扩增曲线则判定为阴性。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
需要说明的是，下述实施例中的核酸释放剂采购自安普未来生物科技有限公司。
实施例1鰤鱼诺卡氏菌荧光RPA引物和探针的设计及筛选
(1)细菌基因组DNA的提取
本实施例中所使用的鰤鱼诺卡氏菌菌株(NSFS001)、嗜水气单胞菌菌株(XS91-4-1)、柱状黄杆菌菌株(G4)、温和气单胞菌菌株(CR79-1-1)、荧光假单胞菌菌株(W81-11)和维氏气单胞菌菌株(HS2205-01)均由本实验室保存。使用细菌基因组DNA提取试剂盒(购自美基生物科技有限公司)，按照说明书来提取细菌基因组DNA，并最终用50μl的无DNase和RNase水洗脱，提取的DNA存放到20℃备用。
(2)引物和探针的设计
本实施例根据鰤鱼诺卡氏菌的转录间隔区核酸序列设计引物和探针；同时通过对来自GenBank中的AB060282.1、AP017900.1、CP017839.1、CP073655.1、CP063662.1、CP059737.1、AB060281.1，JF810852.1、JF810855.1和AF536475.1的转录间隔区核酸序列进行比对分析，进一步明确鰤鱼诺卡氏菌转录间隔区的保守区域，针对该区域设计引物和探针，以期能够检测到尽可能多的鰤鱼诺卡氏菌。所有的引物和探针都由擎科生物科技有限公司(武汉)合成。结合实时荧光RPA的检测特点，本实施例分别设计并合成了3条上游引物、3条下游引物和1条探针，如下表1所示。
表1.鰤鱼诺卡氏菌转录间隔区的候选RPA引物和探针
所述鰤鱼诺卡氏菌转录间隔区的特异性保守序列如SEQ ID NO.8所示：
SEQ ID NO.8：
CTCATACGTAGTCCGGCGGACGCTCATGGGTGGAACACTGACAACCTTCATCGCACTCGATCGGTACTCAGTGACCGGTCGCGGTGGATATACCGACACACTATTGGGTCCTGAAAGAACAGACGACAGTCTTTCTTTCCAGGCAAAAAACGATCTGCTCGGATCTTCTGAGAAACTGCTGGCTGTGCCGGTAAGTCCTGATATCCCATCCGAGTGGGTGTGTTGTTTGAGAACTGCACAGTGGACGCGAGCATCTTTGTTAGTAAGTTTGTAAGAGCGTAC
(3)引物和探针的筛选
以提取的鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA作为模板进行扩增试验。将3条上游引物和3条下游引物，两两组合成9组引物，分别和探针组合，然后在39℃条件下进行实时荧光RPA扩增。筛选用的50μl的基础RPA反应体系如下：将10μmol/L正向引物2μl、10μmol/L反向引物2μl、10μmol/L探针0.6μl、2μl DNA模板、12.2μl无DNase和RNase水以及29.4μl缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2ml的TwistAmp exo反应管中。然后将2.5μl的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上，考虑到RPA反应灵敏度较高，易出现假阳性的情况，发明者为每一组引物探针组合均设置了一组阴性对照，阴性对照不加模板，模板体积用水补足。扩增：将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后放入荧光检测仪中39℃避光反应30min，每30s收集一次荧光信号，采集荧光数据。需要说明的是，冻干酶粉包括结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶。
检测结果如图1(B)所示，F2/R1/probe组产生的荧光信号最强，因此选择F2/R1/probe为最佳引物探针组合，最终确定F2/R1/probe为39℃条件下扩增效率最高的引物与探针组合。
实施例2鰤鱼诺卡氏菌实时荧光RPA灵敏度检测
(1)利用基因组DNA进行灵敏度检测
用Nanodrop-2000分光光度计测量提取的鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA的浓度，并将其稀释为100ng/μl；对浓度为100ng/μl的鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA进行十倍倍比稀释，选取浓度为100ng/μl-lfg/μl的9个浓度的基因组DNA作为模板，选用F2/R1/probe在39℃下进行实时荧光RPA扩增，阴性对照不加模板，模板体积用水补足，确定实时荧光RPA的最低检出浓度，进行灵敏性分析，结果与PCR进行比较。
所用PCR方法的引物对的核苷酸序列如下所示。
上游引物：CACTGACAACCTTCATCGCAC
下游引物：AACTTACTAACAAAGATGCTCGC
扩增条件为94℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃再延伸10min，16℃5min。
检测结果如图2所示，实时荧光RPA和PCR方法对鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA的最低检出浓度一样，都为100pg/μl。
(2)利用质粒进行灵敏度检测
设计扩增鰤鱼诺卡氏菌转录间隔区的PCR引物，所述的引物对的核苷酸序列如下所示。
上游引物：5’-TCTAAGGGGCACTTCTACGCA-3’，
下游引物：5’-GTACGCTCTTACAAACTTACTAA-3’
以提取的鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA为模板，扩增条件为94℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃再延伸10min，16℃5min。PCR产物于20g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，以确定扩增得到大小为349bp的目的基因片段。用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自美基生物科技有限公司)回收PCR产物，与pMD18-T克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养12h。筛选出阳性单菌落到含有氨苄青霉素的液体培养基中，37℃培养，取菌液15ml，使用无内毒素质粒小提中量试剂盒(购自天根生化科技有限公司)提取质粒，测定序列为阳性的pMD18 ITS，并用Nanodrop-2000分光光度计测量提取的pMD18 ITS质粒的浓度。
根据拷贝数计算公式：拷贝数(copies)/μl＝6.02×1023×质粒浓度(ng/μl)×10-9/(质粒碱基数×660)，计算提取的重组质粒pMD18-ITS的拷贝数，并将其稀释为107copies/μl。对浓度为107copies/ul的质粒进行十倍倍比稀释，选取浓度为107-100copies/μl的8个浓度的质粒，利用筛选后的引物探针组合进行实时荧光RPA扩增，阴性对照不加模板，模板体积用水补足，确定实时荧光RPA的最低检出浓度，进行灵敏性分析，结果与PCR进行比较。
检测结果如图3所示，实时荧光RPA和PCR方法对pMD18-ITS质粒的最低检出浓度一样，都为103copies/μl。
综上所述，我们建立的鰤鱼诺卡氏菌实时荧光RPA检测方法的最低检测限和PCR一样，具有较高的灵敏性。
实施例3鰤鱼诺卡氏菌实时荧光RPA特异性检测
分别以鰤鱼诺卡氏菌、嗜水气单胞菌、柱状黄杆菌、温和气单胞菌、荧光假单胞菌和维氏气单胞菌的基因组DNA为模板进行实时荧光RPA扩增，阴性对照不加模板，模板体积用水补足。检测结果如图4所示，只有鰤鱼诺卡氏菌能够进行很好的扩增，产生扩增曲线，其他均未产生扩增曲线，说明该方法对检测鰤鱼诺卡氏菌具有较强的特异性。
实施例4鰤鱼诺卡氏菌实时荧光RPA对临床样品的检测
利用组织DNA提取试剂盒(购自Omega生物科技有限公司)对健康和鰤鱼诺卡氏菌感染的加州鲈内脏组织(肝脏、脾脏、肠道)提取组织DNA后，作为模板进行实时荧光RPA检测，同时按照实施例2的方法进行PCR平行试验。对样品的检测结果如图5所示，含有鰤鱼诺卡氏菌的加州鲈内脏组织检出结果为阳性，健康加州鲈内脏组织检出结果为阴性，与PCR检测结果一致，说明本研究建立的实时荧光RPA检测方法可有效检测出发病加州鲈体内的鰤鱼诺卡氏菌。
实施例5核酸释放剂的效果评价
实施例4中使用组织DNA提取试剂盒提取组织DNA，步骤繁琐，耗时较长，因此，发明者尝试并比较了多种核酸释放剂，挑选其中效果最好的核酸释放剂进行组织中核酸的释放，从而取代组织DNA提取试剂盒。
分别取健康和鰤鱼诺卡氏菌感染的加州鲈脾脏组织30mg，加入200μl水后充分研磨，取25μl组织匀浆液到新的1.5ml EP管中，加入5μl核酸释放剂，混匀后常温静置5min，最后取2μl作为模板进行实时荧光RPA检测，同时按照实施例2的方法进行PCR平行试验。结果如图6所示，对于健康加州鲈脾脏组织，PCR和荧光RPA检测结果都为阴性，对于鰤鱼诺卡氏菌感染的加州鲈脾脏组织，PCR和荧光RPA检测结果都为阳性，并且PCR的条带亮度和荧光RPA的荧光强度一致，这说明该核酸释放剂释放出的核酸可以用来进行PCR和荧光RPA，其核酸释放效果较好。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (7)
1.一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物，其特征在于，包括上游引物、下游引物和探针；
所述上游引物和所述下游引物的寡核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
所述上游引物：
5’GTAGTCCGGCGGACGCTCATGGGTGGAACACTGAC 3’；
所述下游引物：
5’-CAAAGATGCTCGCGTCCACTGTGCAGTTCTC-3’；
所述探针的寡核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，且探针序列中具有荧光基团FAM和猝灭基团BHQ1，两个基团之间由四氢呋喃隔开，3’端由C3 Spacer修饰；
所述探针：
5’-CACTGACAACCTTCATCGCACTCGATCGGTAC(FAM-dT)C(THF)G(BHQ1-dT)GACCGGTCGCGGTGGA(C3 Spacer)-3’。
2.一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的荧光RPA试剂盒，其特征在于，所述荧光RPA试剂盒包括如权利要求1所述的RPA组合物。
3.根据权利要求2所述的荧光RPA试剂盒，其特征在于，所述荧光RPA试剂盒还包括阳性对照。
4.根据权利要求3所述的荧光RPA试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA。
5.根据权利要求2所述的荧光RPA试剂盒，其特征在于，所述荧光RPA试剂盒还包括核酸释放剂、结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、反应体系缓冲液和醋酸镁。
6.根据权利要求5所述的荧光RPA试剂盒，其特征在于，所述核酸释放剂的使用方法包括：取组织，加入水后充分研磨得到组织均浆液，取组织匀浆液到EP管中，加入核酸释放剂，混匀后静置得到产物，最后取所述产物进行实时荧光RPA检测。
7.一种鰤鱼诺卡氏菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取待测样品DNA；
S2、以步骤S1所提取的DNA为扩增模板，采用如权利要求1所述的RPA组合物避光进行RPA扩增反应，并在扩增反应期间收集多次荧光信号，采集荧光数据，如果获得扩增曲线，则判定为阳性，反之，无扩增曲线则判定为阴性。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211428124.0A CN115838815B (zh) | 2022-11-15 | 2022-11-15 | 用于检测鰤鱼诺卡氏菌的rpa组合物、荧光rpa试剂盒及检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211428124.0A CN115838815B (zh) | 2022-11-15 | 2022-11-15 | 用于检测鰤鱼诺卡氏菌的rpa组合物、荧光rpa试剂盒及检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115838815A true CN115838815A (zh) | 2023-03-24 |
| CN115838815B CN115838815B (zh) | 2024-06-14 |
Family
ID=85575633
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211428124.0A Active CN115838815B (zh) | 2022-11-15 | 2022-11-15 | 用于检测鰤鱼诺卡氏菌的rpa组合物、荧光rpa试剂盒及检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115838815B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101962678A (zh) * | 2010-09-26 | 2011-02-02 | 宁波大学 | 一种鰤鱼诺卡氏菌荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 |
| CN105176997A (zh) * | 2015-11-02 | 2015-12-23 | 深圳市富炜城投资有限公司 | 一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法 |
| CN113186319A (zh) * | 2021-06-22 | 2021-07-30 | 广东海洋大学 | 检测鰤鱼诺卡氏菌的引物、试剂盒及方法 |
| CN114634990A (zh) * | 2022-05-18 | 2022-06-17 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种用于检测鰤诺卡氏菌的rpa引物、探针以及检测方法 |
-
2022
- 2022-11-15 CN CN202211428124.0A patent/CN115838815B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101962678A (zh) * | 2010-09-26 | 2011-02-02 | 宁波大学 | 一种鰤鱼诺卡氏菌荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 |
| CN105176997A (zh) * | 2015-11-02 | 2015-12-23 | 深圳市富炜城投资有限公司 | 一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法 |
| CN113186319A (zh) * | 2021-06-22 | 2021-07-30 | 广东海洋大学 | 检测鰤鱼诺卡氏菌的引物、试剂盒及方法 |
| CN114634990A (zh) * | 2022-05-18 | 2022-06-17 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种用于检测鰤诺卡氏菌的rpa引物、探针以及检测方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| EMMANUEL EDWAR SIDDIG ET AL.,: "The developed molecular biological identification tools for mycetoma causative agents: An update", ACTA TROP., vol. 225, pages 1 - 3 * |
| ITANO T ET AL.: "Detection of fish nocardiosis by loop-mediated isothermal amplification", JOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGY, vol. 100, no. 6, 31 December 2006 (2006-12-31), pages 1381 - 1387 * |
| 王亚楠等: "重组酶聚合酶扩增技术研究进展", 解放军医学杂志, vol. 46, no. 5, pages 3 * |
| 陈国权等: "鰤鱼诺卡氏菌特异性PCR检测方法的建立", 基因组学与应用生物学, vol. 40, pages 2656 - 2665 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115838815B (zh) | 2024-06-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111118218B (zh) | 对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组、试剂盒及其检测方法 | |
| CN107058538B (zh) | 一种引物组合物及其组成的试剂盒和应用 | |
| Wang et al. | Rapid and sensitive recombinase polymerase amplification combined with lateral flow strips for detecting Candida albicans | |
| CN111926116A (zh) | 快速定量检测鸭腺病毒4型的引物和探针及其检测方法与应用 | |
| CN108611429B (zh) | 凡纳滨对虾抗病性相关est-ssr分子标记及其应用 | |
| US20110287965A1 (en) | Methods and compositions to detect clostridium difficile | |
| Gumaa et al. | Specific detection and differentiation between Brucella melitensis and Brucella abortus by a duplex recombinase polymerase amplification assay | |
| Niu et al. | Highly sensitive detection method for HV69-70del in SARS-CoV-2 alpha and omicron variants based on CRISPR/Cas13a | |
| CN107227377B (zh) | 检测创伤弧菌的rpa-iac引物及方法 | |
| JP2007274934A (ja) | プライマーセット及び食中毒細菌の検出方法 | |
| CN106755574B (zh) | 一种高灵敏度的OsHV‑1实时荧光定量PCR检测试剂盒及方法 | |
| CN115838815B (zh) | 用于检测鰤鱼诺卡氏菌的rpa组合物、荧光rpa试剂盒及检测方法 | |
| CN107385057B (zh) | 检测霍乱弧菌的rpa-iac引物及方法 | |
| CN116179763A (zh) | 一种基于era技术的基因ⅰ型和基因ⅱ型黄头病毒多重快速检测方法及检测用引物和探针 | |
| CN113355460B (zh) | 用于检测新型鹅呼肠孤病毒的引物、试剂盒及其检测方法与应用 | |
| CN116103416B (zh) | 用于检测鰤鱼诺卡氏菌的rpa组合物、试剂盒及鰤鱼诺卡氏菌的检测方法 | |
| CN105969907B (zh) | 一种检测st251型致病性嗜水气单胞菌的试剂盒及应用 | |
| CN109576394B (zh) | 一种检测Nebovirus的SYBR Green荧光定量RT-PCR引物及应用 | |
| CN114350759A (zh) | 基于CRISPR/Cas12a的对虾急性肝胰腺坏死病快速检测试剂盒及检测方法 | |
| CN107227378B (zh) | 检测拟态弧菌的rpa-iac引物及方法 | |
| CN110257560A (zh) | 一种用于蓝舌病病毒8型检测的试剂、检测方法及应用 | |
| JP2007020423A (ja) | 腸内細菌群検出用核酸断片 | |
| CN117210593B (zh) | 特异性检测多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的引物组以及检测方法 | |
| CN113621719B (zh) | 杀鱼爱德华氏菌的快速检测方法及应用 | |
| CN116515840B (zh) | 一种用于检测牛病毒性腹泻病毒3型的试剂盒与检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |