CN108611429B - 凡纳滨对虾抗病性相关est-ssr分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种凡纳滨对虾抗病性相关EST‑SSR分子标记及其应用；本发明在凡纳滨对虾抗病相关基因LvIRF的5'UTR区域鉴定了一个SSR位点，根据该区域的序列特征设计特异性引物，通过PCR扩增及测序分型，建立了一套检测该位点多态性的分析方法。此外该位点中的核心重复序列（CT）的重复数量直接与对虾的抗病能力相关联，因此该位点可以作为一个快速、高效、便捷的分子标记，以应用于筛选与抗病相关的对虾。同时该分子标记也可以与其他分子标记联用，用来分析对虾种群遗传结构等。本发明提供的凡纳滨对虾抗病性相关功能基因EST‑SSR标记及其应用方法，可直接用于选择抗病的凡纳滨对虾个体，同时也可以用于种群遗传结构分析和分子标记辅助育种，尤其是在凡纳滨对虾抗病性优良品种选育中具有广阔的应用前景。

Description

凡纳滨对虾抗病性相关EST-SSR分子标记及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学标记技术领域，更具体地，涉及凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）抗病性相关的EST-SSR分子标记及其应用。
背景技术
凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）俗称南美白对虾、白虾，分类学上隶属于节肢动物门（Arthropoda）、甲壳纲（Crustacea）、十足目（Decapoda）、对虾科（Penaeidae）、对虾属（Penaeus），是原产于中南美洲的一种广温广盐性热带虾类。凡纳滨对虾的养殖区域包括全国沿海的海水养殖区和内陆的淡水养殖区，是我国产量最高的虾类品种。随着养殖规模的扩大，病害的爆发也越发的严重，其中白斑综合症病毒（white spot syndrome virus,WSSV），因其传播快、致死率高的特点，严重阻碍了对虾养殖业的发展。培育新型抗病性高的对虾品种是解决病害问题的一种重要手段。通过挖掘和筛选与抗病性相关的分子标记，利用分子标记辅助育种技术，可以提高选育的准确性，缩短育种周期。在常用的分子标记中，微卫星（microsatellite）又称简单重复序列（simple sequence repeats, SSR），具有多态性高、重复性好、遗传稳定和共显性等优点，是目前在动物种群遗传结构中应用较广泛的一类分子标记。
干扰素（Interferon，IFN）是一类糖蛋白，具有抗病毒、抑制细胞增殖及调节免疫的作用，在脊椎动物中，IFN的产生是细胞抗病毒免疫反应的标志。干扰素调节因子（Interferon regulatory factors, IRFs）是一类能激活IFN转录表达的转录因子。LvIRF（NCBI登录号KM277954）是凡纳滨对虾中发现的一个IRF家族同源基因。研究表明，LvIRF在对虾防御病毒感染中起重要作用，是一类重要的抗病毒信号通路蛋白，敲降LvIRF的表达严重影响了对虾的抗病毒能力，并且这也是首次证实在无脊椎动物中存在类似于脊椎动物干扰素介导的病毒防御机制（Li et al. Scientific Reports, 2015, 5:15078）。
公开号为CN107881246A的专利一种凡纳滨对虾EST-STR标记，所述EST-STR标记可用于凡纳滨对虾遗传关系分析及分子标记辅助育种；公开号为CN107287296A的专利公开了一种凡纳滨对虾功能基因EST-SSR标记及其特异性引物和检测方法，所述EST-SSR标记可用于凡纳滨对虾种质资源的遗传结构和遗传多样性分析、分子指纹图谱构建和分子标记辅助育种；公开号为CN105969873A的专利公开了一种凡纳滨对虾渗透压调节相关功能基因EST-SSR标记及其特异性引物和检测方法，所述可用于凡纳滨对虾种群遗传结构分析和分子标记辅助育种，特别是在凡纳滨对虾盐度抗逆优良品种的选育中具有重要的应用价值。
目前，还未见有凡纳滨对虾抗病性相关的EST-STR标记的研究或报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述上述现有技术的缺陷和不足，提供一种与凡纳滨对虾抗病性相关的EST-STR分子标记。本发明在LvIRF的5' UTR区域鉴定了一个SSR位点，发现其多态性能直接影响LvIRF的表达，并与对虾在感染WSSV后的死亡率相关。因此针对凡纳滨对虾LvIRF基因开发与抗病性相关的SSR分子标记，为凡纳滨对虾抗病优良品种的选育提供技术手段，可以加快抗病品种的培育工作。
本发明的第二目的是提供一种检测所述EST-STR分子标记的特异性引物。
本发明的第三个目的是提供一种检测所述EST-STR分子标记的方法。
本发明的第四个目的是提供所述EST-STR分子标记或检测所述分子标记的特异性引物的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
凡纳滨对虾抗病性相关的EST-SSR分子标记，SSR位点位于凡纳滨对虾抗病相关基因LvIRF 5' UTR区域，其核心重复序列为（CT）x，x=10～30。
具体地，当x = 19时，所述LvIRF-SSR的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明使用微卫星查找软件SSRHunter分析在LvIRF基因序列5' UTR区域鉴定了一个SSR位点，核心重复序列为（CT）x，x = 10～30；同时根据该区域的序列特征设计特异性引物，通过PCR扩增及测序分型，建立了一套检测该位点多态性的分析方法。此外，进一步研究发现，该位点中的核心重复序列（CT）的重复数量直接与对虾的抗病能力相关联，因此该位点可以作为一个快速、高效、便捷的分子标记，以应用于筛选与抗病相关的对虾。同时该分子标记也可以与其他分子标记联用，用来分析对虾种群遗传结构等。
一种检测上述EST-SSR分子标记的特异性引物，包括上游引物F和下游引物R，其核苷酸依次如SEQ ID NO：2～3或SEQIDNO：8～9所示；
一种检测凡纳滨对虾抗病性相关的EST-STR分子标记的方法，包括如下步骤：
S1.提取凡纳滨对虾基因组DNA；
S2.以S1的DNA为模板，采用SEQ ID NO：2～3或SEQIDNO：8～9所示引物进行PCR扩增反应，所述PCR扩增引物5'端连接有荧光标记FAM；
S3.对S2的PCR扩增产物进行测序分型。
优选地，PCR反应扩增程序为：94 ℃预变性5 min，30个循环：94 ℃变性30 s，56℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸5 min，16 ℃保存。
本发明还保护所述EST-SSR分子标记或检测所述分子标记的特异性引物在抗病基因LvIRF表达量检测中的应用。
优选地，所述应用包括如下步骤：
S1.提取凡纳滨对虾基因组DNA和mRNA；
S2.采用PCR引物扩增获得上述包含SSR位点的LvIRF基因5' UTR序列和LvIRF基因的CDS序列；
S3.将S2获得的两段序列片段连接至含双荧光素酶报告基因的质粒表达载体；
S4.使用双荧光素酶报告基因检测LvIRF基因在不同的核心重复序列数下的表达量变化。
优选地，S2所述扩增上述包含SSR位点的LvIRF基因5' UTR序列的引物序列如SEQID NO：4~5所示；所述扩增LvIRF基因的CDS序列的引物如SEQ ID NO：6~7所示。
LvIRF-5' UTR -KpnI-F：GGGGTACCATCGGGATCCACTCGCAGAT（SEQ ID NO：4）；
LvIRF-5' UTREcoRI-R：GGGAATTCGGCGACCTTAGACCGACGAG（SEQ ID NO：5）；
LvIRF-CDS-EcoRV-F：GGTATCCAATGCCGCCATCTTTCACCAATG（SEQ ID NO：6）；
LvIRF-CDS-Xba I-R：GGTCTAGACGGCAACGTCCTCTCGCCGGCA（SEQ ID NO：7）。
优选地，S3所述质粒表达载体为PAC5.1/V5-His A。
本发明还请求保护所述EST-SSR分子标记或检测所述分子标记的特异性引物在凡纳滨对虾抗病能力检测中的应用。
优选地，所述应用包括如下步骤：
S1.提取凡纳滨对虾基因组DNA；
S2.采用PCR引物扩增获得上述包含SSR位点的LvIRF基因5' UTR序列，所述PCR扩增引物5'端连接有荧光标记；
S3.对PCR扩增产物进行测序分型；
S4.对测序结果进行生物信息学分析，比较SSR标记在凡纳滨对虾中的基因型和基因频率差异。
优选地，S2所述PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2~3或SEQIDNO：8~9所示；
本发明还保护所述EST-SSR分子标记或检测所述分子标记的特异性引物在制备凡纳滨对虾抗病能力检测试剂盒中的应用。
本发明还提供一种凡纳滨对虾抗病能力检测试剂盒，所述试剂盒含有SEQ ID NO：2~3或SEQIDNO：8~9所示特异性引物。
同时，本发明还保护所述EST-SSR分子标记或检测所述分子标记的特异性引物在凡纳滨对虾种群遗传结构分析、分子标记辅助育种和/或凡纳滨对虾抗病性优良品种选育中的应用。
本发明从凡纳滨对虾抗病毒免疫通路相关基因的EST序列入手，使用SSR Hunter软件进行微卫星位点的查找，发现与抗病性相关功能基因LvIRF的5' UTR区存在一个微卫星（SSR）多态性位点。使用引物设计软件对该基因的SSR位点设计引物，并使用这对引物对凡纳滨对虾基因组DNA进行PCR扩增，构建多态性表达载体，进行双荧光素酶报告基因检测。在细胞水平上确定了LvIRF 5' UTR区中的SSR位点多态性能够影响LvIRF基因的表达。同时，使用这对引物在不同群体的对虾基因组DNA进行PCR扩增，ABI测序仪对PCR产物进行分型，通过关联性分析方法分析SSR位点的分型结果与感染对虾死亡率的关系，最终确定了与感染对虾死亡率关联性最强的基因型，所述基因型如SEQ ID NO：1所示。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次报道了与凡纳滨对虾抗病相关的EST-SSR分子标记，根据该区域的序列特征设计特异性引物，通过PCR扩增及测序分型，建立了一套检测该位点多态性的分析方法。此外该位点中的核心重复序列（CT）的重复数量直接与对虾的抗病能力相关联，因此该位点可以作为一个快速、高效、便捷的分子标记，以应用于筛选与抗病相关的对虾。同时该分子标记也可以与其他分子标记联用，用来分析对虾种群遗传结构等。本发明提供的凡纳滨对虾抗病性相关功能基因EST-SSR标记及其应用方法，可直接用于选择抗病的凡纳滨对虾个体，同时也可以用于种群遗传结构分析和分子标记辅助育种，尤其是在凡纳滨对虾抗病性优良品种选育中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例提供的细胞水平验证SSR位点多态性对LvIRF表达量的影响（CT19及CT25分别为在IRF基因5' UTR中的CT重复数，PAC-IRF为不含5' UTR，PAC5.1为空质粒对照）。
图2为本发明实施例提供的LvIRF微卫星DNA标记在三个不同个体中的多态性分型结果。
图3为本发明实施例提供的微卫星分子标记多态性与WSSV感染对虾致死（生存率）的关系。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1凡纳滨对虾抗病性相关功能基因的SSR位点发现及EST-SSR分子标记引物设计
发明人使用微卫星查找软件SSR Hunter分析LvIRF基因EST序列得到核心重复序列(CT)X，x = 10～30，当 x = 19时，所述LvIRF-SSR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
使用引物设计软件PrimerPrimer 5.0对上述序列的核心重复序列上下游进行引物设计，得到特异性扩增包含SSR位点的LvIRF基因5' UTR序列的特异性扩增引物：LvIRF-5'UTR：
正链5'-ATCGGGATCCACTCGCAGAT-3'（SEQ ID NO：2），
负链5'-GGCGACCTTAGACCGACGAG-3'（SEQ ID NO：3）；退火温度56 ℃。
实施例2 细胞水平验证SSR位点多态性对LvIRF表达量的影响
1、凡纳滨对虾基因组DNA的提取按照OMEGA的动物组织DNA提取试剂盒说明进行。将提取获得的DNA使用Nanovue分光光度计测定DNA纯度和浓度，纯度OD260/280为1.7~1.9，浓度＞100 ng/μl，再经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳检测DNA片段的完整性，将合格的DNA样品保存在-20 °C待用。
2、凡纳滨对虾总RNA的提取按照QIAGEN的动物组织RNA提取试剂盒说明进行。按照上述方法测定RNA纯度和浓度，纯度OD260/280为1.9~2.0。将合格的RNA样品使用Takara反转录试剂盒合成cDNA，操作按照试剂盒说明书进行。
3、利用LvIRF 5' UTR的特异性引物对多个凡纳滨对虾基因组DNA进行扩增，获得含有SSR位点的基因片段，扩增引物如下：
LvIRF-5' UTR -KpnI-F：GGGGTACCATCGGGATCCACTCGCAGAT（SEQ ID NO：4），
LvIRF-5' UTREcoRI-R：GGGAATTCGGCGACCTTAGACCGACGAG（SEQ ID NO：5）；
其中，加粗标注序列为保护碱基，下划线标注序列为酶切位点。同时用特异性引物扩增LvIRF的编码序列（不包含终止密码子），扩增引物如下：
LvIRF-CDS-EcoRV-F：GGTATCCAATGCCGCCATCTTTCACCAATG（SEQ ID NO：6），
LvIRF-CDS-Xba I-R：GGTCTAGACGGCAACGTCCTCTCGCCGGCA（SEQ ID NO：7）；其中，加粗标注序列为保护碱基，下划线标注序列为酶切位点，片段大小1086 bp。
4、LvIRF CDS序列扩增和纯化：PCR反应液使用TaKaRa Taq™ Hot StartVersion，反应液成分为0.3 μl TaKaRa Taq HS (5 U/μl)，4.8 μl dNTP Mixture，4 μl 10×PCR Buffer，正反向引物各0.5 μM，cDNA模板100 ng，用无菌蒸馏水补足到40 μl。PCR反应扩增程序为：94 °C预变性5 min，35个循环：94 °C变性30 s，60 °C退火30 s，72 °C延伸60 s，最后72 °C延伸10 min，16 °C保存。经过1％的琼脂糖凝胶电泳后，使用凝胶成像系统照相并观察结果并回收产物。PCR扩增产物回收按照OMEGA的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明进行。回收产物浓度按上述方法检测。
5、将纯化后的LvIRF-CDS PCR产物和PAC5.1/V5-His A载体质粒同时进行（EcoR V和Xba I）双酶切，40 μl酶切反应体系包括：1 μg回收PCR产物和500 ng PAC5.1/V5-His A载体质粒，10×Buffer 4 μl，2 μl EcoR V内切酶和2 μl Xba I内切酶，补充ddH2O至40 μl，反应3~5 h。将双酶切后的PCR产物与质粒使用OMEGA的PCR产物回收试剂盒回收并按上述方法测定浓度。用Takara公司的T4连接酶做酶连反应，10 μl反应体系包括：纯化后PCR产物600 ng，纯化后线性质粒300 ng，1 μl 10×Buffer，1 μl T4连接酶，补充ddH2O至10 μl，16°C连接过夜。
6、将保存于-80 °C的感受态细胞DH5α置于冰上融化，将10 μl酶连产物加入100 μl感受态细胞中，混匀后置于冰上30 min，让其充分接触；将反应物放入42 °C水浴中热激60s，取出后迅速置于冰上冷却；加入200 μl LB培养基，在37 °C 200 rpm的摇床震荡1 h；将复苏的感受态细胞均匀涂布在添加氨苄青霉素（浓度为100 mg/L）的平板培养基中，于37 °C培养箱中倒置培养12-16 h。
7、挑取独立的单菌落至500 μl的含氨苄青霉素的LB培养基中，37 °C 200 rpm的摇床震荡2 h扩大培养后进行菌落PCR检测，PCR反应液体系为0.15 μl TaKaRa Taq HS (5U/ μl)，2.4 μl dNTP Mixture，2 μl 10×PCR Buffer，PAC5.1/V5-His A正反向检测引物各0.5 μM，菌液1 μl，用无菌蒸馏水补足到20 μl。PCR反应扩增程序为：94 °C预变性5 min，30个循环：94 °C变性30 s，56 °C退火30 s，72 °C延伸60 s，最后72 °C延伸10 min，16 °C保存。按上述琼脂糖凝胶电泳方法进行电泳检测，挑选含阳性质粒的菌液送至华大基因测序公司进行测序验证，获得PAC-IRF-CDS质粒。
8、安照上述方法，将LvIRF-5' UTR序列连接入PAC-IRF-CDS质粒，LvIRF 5' UTR位点序列PCR反应扩增程序为：94 °C预变性5 min，30个循环：94 °C变性30 s，56 °C退火30s，72 °C延伸30 s，最后72 °C延伸5 min，16 °C保存。酶切位点为KpnI和EcoR I，将阳性质粒送至华大基因测序公司进行测序验证，获得PAC-IRF-5' UTR -CDS质粒，记录SSR位点核心重复序列（CT）数。
9、挑选无碱基突变、仅SSR位点核心重复序列（CT）数不同的PAC-IRF-5' UTR-CDS质粒在果蝇S2细胞上进行双荧光素酶报告基因分析，本实施例选用了2个质粒作为实验对象，其核心重复序列（CT）数分别为19、25，PAC-IRF-CDS质粒和PAC5.1/V5-His A质粒分别为阳性和阴性对照。双荧光素酶报告基因按照Promega双荧光素酶报告基因试剂盒说明进行。在96孔板中进行操作，每孔包含报告基因质粒0.05 μg，表达基因质粒0.05 μg，内参基因质粒pRL-TK 0.005 μg，其中表达基因为Vago4 (Genbank No. AEB54794.1)，内参基因为海肾荧光素酶（试剂盒提供），每孔做6个平行试验，转染48 h后进行报告基因检测。
10、计算不同报告基因质粒与内参基因质粒的相对表达量，使用T test检验进行差异性分析，结果如图1所示，当LvIRF的表达质粒含有(CT)19重复序列时，其促进报告基因Vago4的表达显著高于含(CT)25、不含CT重复的LvIRF基因对及空白质粒PAC5.1/V5-His A对报告基因Vago4的表达。
实施例3 LvIRF SSR位点多态性对对虾死亡率的影响
1、从养殖基地采集2种不同来源的对虾各120尾，置于养殖桶中养殖24 h，待对虾状态稳定后，注射WSSV病毒液10 μl（WSSV病毒含量为105 copies/ μl），攻毒后每4 h检查一次并收集死虾，将攻毒后96 h内死亡的对虾标记为A组，攻毒96 h后存活且情况稳定的对虾标记为B组。按上述方法提取对虾的基因组DNA和检测纯度与浓度。
2、使用引物设计软件PrimerPrimer 5.0对上述序列的核心重复序列上下游进行引物设计，得到LvIRF SSR位点引物核酸序列：LvIRF-SSR：
正链5' -GATCCACTCGCAGATACAGAT - 3'（SEQ ID NO：8），
负链5' -ATCCGAAGCAGTGAAGCAG - 3'（SEQ ID NO：9），退火温度56 °C；在正向引物5' 端添加荧光标记FAM（羧基荧光素），按上述操作对每个对虾个体DNA进行PCR扩增。PCR产物由华大基因公司使用ABI测序分析仪检测荧光标记DNA片段，根据检测得到的DNA片段大小分离等位基因，图2为LvIRF标记在3个随机个体中的测序分型结果。将分型获得的每个SSR位点的基因数据在两个对虾组中进行分型统计，比较SSR标记在AB两组中的基因型和基因频率差异。
3、使用关联性分析方法分析SSR位点的分型结果与死亡率的关系，最终发现当LvIRF基因SSR位点核心重复序列（CT）重复数为19，片段大小为177 bp时（序列如SEQIDNO：1所示），对虾对疾病具有较高的抗性，表现为死亡率降低，且这种现象存在于两个不同来源的对虾群体中（见图3），表明该标记可以作为一种辅助WSSV抗病性品种选育的分子标记。
上述实施例数据说明，本发明的凡纳滨对虾抗病性相关功能基因EST-SSR标记不仅可用于凡纳滨对虾遗传结构分析，还可用于凡纳滨对虾优良品种的选育，特别是凡纳滨对虾抗病性品种的选育中具有重要的价值。
序列表
<110> 中山大学
<120> 凡纳滨对虾抗病性相关EST-SSR分子标记及其应用
<130> YG18103629AA042
<141> 2018-05-10
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 204
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)
<400> 1
atcgggatcc actcgcagat acagatctct ctctctctct ctctctctct ctacctgcct 60
tcctcgctgt gtctctctct ctcttattcg cactttgtgt ttctgtaatt cgcaccaggt 120
atttgtttgc ttcattggag ttgtttcgga atctcggatc tcgctgcttc actgcttcgg 180
ataactcgtc ggtctaaggt cgcc 204
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)
<400> 2
atcgggatcc actcgcagat 20
<210> 3
<211> 20
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<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)
<400> 3
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<211> 28
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<212> DNA
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<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)
<400> 7
ggtctagacg gcaacgtcct ctcgccggca 30
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)
<400> 8
gatccactcg cagatacaga t 21
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)
<400> 9
atccgaagca gtgaagcag 19

Claims (3)

1.凡纳滨对虾抗病性相关的EST-SSR分子标记，其特征在于，所述EST-SSR分子标记的序列如SEQ ID NO：1所示。
2.检测权利要求1所述EST-SSR分子标记的特异性引物在制备凡纳滨对虾抗病能力检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述特异性引物包括上游引物F和下游引物R，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：2～3或SEQ ID NO：8～9所示。
3.检测权利要求1所述EST-SSR分子标记的特异性引物在凡纳滨对虾种群遗传结构分析和/或分子标记辅助育种中的应用，其特征在于，所述特异性引物包括上游引物F和下游引物R，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：2～3或SEQ ID NO：8～9所示。
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