CN102781456A - 用于具有改善的保护功效的疫苗的分枝杆菌属突变体 - Google Patents

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Abstract

结核(TB)是重要的健康问题，目前唯一获批的TB疫苗是牛分枝杆菌卡介苗(牛分枝杆菌BCG)。在本发明中，针对疫苗目的评价了报道为涉及吞噬体成熟抑制的分枝杆菌成分的突变，因为这类突变应导致更好的疫苗抗原加工和呈递。因此，在严格的小鼠模型中作为TB疫苗评价了编码ManLAM帽化α-1，2-甘露糖基转移酶和PI3P磷酸酶SapM的基因中的BCG突变型。与未接种的小鼠相比，接种ManLAM帽化突变体和SapM突变体都导致显著更长的存活，而接种亲本BCG则不然。此外，接种SapM突变体的小鼠存活显著长于接种亲本BCG的小鼠。突变体BCG菌株在巨噬细胞中显示未改变的吞噬、复制、溶酶体共定位和氧化剂活性，且在后者中相似地诱导自噬。此外，在小鼠中的复制和肉芽肿形成未受影响，表明这些疫苗等同于BCG的安全性。

Description

用于具有改善的保护功效的疫苗的分枝杆菌属突变体
技术领域
本发明涉及疫苗领域，最尤其是基于活减毒分枝杆菌属(Mycobacterium)的疫苗。本文中所公开的是基因，当在用于免疫动物，尤其是哺乳动物的分枝杆菌中突变时，其作为针对分枝杆菌属感染的疫苗赋予改善的保护功效，同时不干扰诸如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)BCG的已知接种菌株的有益特性。这类疫苗对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染尤其适宜。
背景技术
三分之一的世界人口受TB病原体结核分枝杆菌(M.tb)感染。世界卫生组织估计，全世界每年发生约八百万至一千万新的TB病例，TB发病率目前正不断增加。连同疟疾和HIV-AIDS，TB是死于单一感染因子的前三个原因之一，每年约有两百万例死亡可归因于TB(WHO Report，2008)。目前唯一获批的疫苗是牛分枝杆菌的减毒株牛分枝杆菌卡介苗(牛分枝杆菌BCG)，从首次使用它的1921年起，至今已对超过四十亿人施用。在出生时施用时，牛分枝杆菌BCG在10岁以前针对播散性疾病赋予一致而可靠的保护(Rodrigues等，1993)。但是，在青少年和成人中针对肺病赋予的保护更可变(Colditz等，1994)。目前研发改善的预防性TB疫苗的主要途径是以牛分枝杆菌BCG作为初始疫苗(priming vaccine)，用修饰的牛分枝杆菌BCG或结核分枝杆菌来改善，然后可能在随后某时间用选择的免疫显性抗原作为蛋白质或病毒载体疫苗来强化(Barker等，2009；STOP-TBPartnership，2009)。
在结核的情况下，尘细胞成功吞噬结核分枝杆菌，是感染的主要部位。但是，分枝杆菌干扰吞噬体(phagosomal)成熟，从而使分枝杆菌能够部分逃逸否则可以清除它们的许多免疫机制(50)。结核分枝杆菌胞内生长和存活必需的细菌基因和途径是有吸引力的药物靶点，已提出了这类细菌毒力机制中的几种(13，14)。但是，疑似涉及结核分枝杆菌-宿主相互作用的细菌成分的功能验证需要产生突变体。结核分枝杆菌的缓慢生长和低同源重组效率(39)及在昂贵的高生物安全性实验室中工作的需要阻碍了这些关键实验。这些特征的组合使突变体产生成为非常漫长、麻烦和昂贵的过程。因此，许多研究人员借助不致病的生长快速的分枝杆菌物种来产生突变体，得到并非必然外推至它们生长缓慢的亲戚的结果(24)。就结核分枝杆菌-宿主相互作用的许多方面而言，减毒疫苗株牛分枝杆菌BCG是更可靠，也更安全的模式生物(8，17)。它也生长缓慢，且基因组与结核分枝杆菌极其相似(＞99％)，只是缺乏少数基因组区域，其中RD1基因座主要导致其减毒作用(2，33)。各BCG菌株具有多个缺失，其中只有RD1基因座是所有菌株共有的缺失。
应指出，分枝杆菌不寻常的细胞壁是使分枝杆菌能够成功定居它们的宿主的因素之一。细胞壁由与巨噬细胞相互作用的脂质、糖脂和蛋白质的复合体组成(5)。这种胞外被膜的一种成分是脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)，其连同它的前体脂甘露聚糖(LM)和磷脂酰肌醇甘露糖苷(PIM)一起非共价锚着至质膜。LAM包含甘露糖基磷脂酰肌醇锚(MPI)、甘露聚糖核心和长的取代阿拉伯聚糖(arabinan)分枝。甘露聚糖主链由具有单残基α-1，2-Manp取代的α-1，6连接的甘露糖单元组成。阿拉伯聚糖聚合物由α-1，5连接的Araf单元组成，且被分枝六聚阿拉伯呋喃糖苷和线性四聚阿拉伯呋喃糖苷取代。这些阿拉伯聚糖侧链的非还原端以帽基序终止。在生长缓慢的致病菌株中，这些基序由1个、2个或3个α-1，2连接的Manp残基组成，二甘露糖苷丰度最高。相反，在不致病的菌株中，通常存在肌醇磷酸帽(耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)中的PILAM)或完全无帽(龟分枝杆菌(M.chelonae)中的AraLAM)(7)。已报道了ManLAM(甘露糖基化脂阿拉伯甘露聚糖)在破坏宿主细胞信号传导途径(18)和阻断宿主巨噬细胞中的吞噬体成熟(15)中发挥作用。
LAM由磷脂酰肌醇酯(PI)构成，PI的合成需要二酰基甘油激酶Mb2276的活性(45)。PI经历由PimA(Mb2642c)、PimB(Mb0572)、PimC(Mb1785c)和PimF(Mb1538)催化的一系列连续的α-甘露糖基化(25，26，38，57)。从PI合成ManLAM中的所有甘露糖基化的糖基供体底物是多萜醇磷酸甘露糖，该多萜醇磷酸甘露糖是通过多萜醇磷酸甘露糖合酶ppm1(Mb2077c)从GDP甘露糖合成的(19)。此过程中的GDP甘露糖合成涉及磷酸甘露糖变位酶pmmB(Mb3336)(55)。通过加入21-34个残基的线性α-1，6-甘露糖聚合物来在PIM4前体上合成LM。此修饰需要甘露糖基转移酶(mannosyltransferase)Mb2196(23)。之前的研究显示，Rv2181(Mb2203)是负责将单个α-1，2-Manp残基加至LM/LAM的甘露聚糖核心的甘露糖基转移酶(20)。在后一研究中，在耻垢分枝杆菌中失活对应的同源物导致截短LAM的产生和LM的缺乏。但是，更近的数据显示，结核分枝杆菌中类似的失活导致产生更低分子量LAM，但不影响LM的合成，揭示了此甘露糖基转移酶在LAM的末端帽化中的作用(24)。LAM通过聚α-1，5-araf链的加入衍生自LM，该链的合成需要embC(4，65)。丝氨酸苏氨酸激酶pknH通过磷酸化转录调节物EmbR来调节embC的转录(59)。线性阿拉伯聚糖分枝进一步被六聚和四聚阿拉伯呋喃糖苷结构取代。LAM的这些非还原阿拉伯聚糖末端在结核分枝杆菌和牛分枝杆菌BCG中帽化至不同的程度，具有1至3个(α-1，2)-Manp残基。涉及此α-1，2-甘露糖帽化的第一个甘露糖基转移酶由Rv1635c及其在牛分枝杆菌BCG中的同源物Mb1661c编码(11)。虽然基因Mb1661c可能负责加入帽的第一个甘露糖残基，但认为甘露糖基转移酶Mb2203加入另外一个或两个甘露糖残基来产生二-Manp和三-Manp帽化的LAM(24)。影响结核分枝杆菌毒力的其他因子包含脂蛋白信号肽酶LspA(Mb1566)(53)、脂质磷酸酶SapM(Mb3338)(42)和Zn金属蛋白酶Zmp1(Mb0204c)(35)。
结核疫苗领域的大多数工作受这样的理念指导：BCG“缺失结核分枝杆菌的某物”，必须将其加回BCG来改善疫苗诱导的保护，或者相反，应将结核分枝杆菌减毒至BCG的低毒力，同时保留其免疫显性抗原。前者的实例是过量表达免疫显性结核分枝杆菌抗原的重组BCG菌株(Castanon-Arreola等，2005；Horwitz&Harth，2003；Pym等，2003)，后者的实例是结核分枝杆菌的毒力因子突变体(Copenhaver等，2004)、营养突变体(Sambandamurthy等，2005；Sambandamurthy等，2002)或信号转导突变体(Martin等，2006)。此外，寻求巨噬细胞中吞噬体成熟和凋亡的改善诱导(Grode等，2005；Hinchey等，2007；Sadagopal等，2009；Sun等，2009；Velmurugan等，2007)来增加交叉呈递和随之提高疫苗效力。但是，与BCG疫苗直接比较，所有的改造活疫苗中只有5种已在实验动物中显示足够有希望，可进入I期临床试验(STOP-TBPartnership，2009)：过量表达抗原85b的BCG(rBCG30，豚鼠中延长的存活)(Horwitz&Harth，2003)；缺乏脲酶C的分泌利斯特菌溶胞素的重组BCG(Grode等，2005；Tchilian等，2009)(ΔureC hly+rBCG，小鼠肺中减少的CFU计数)；缺乏脲酶C的分泌产气荚膜梭菌细胞溶素(perfringiolysin)的重组BCG(Sun等，2009)(在SCID小鼠研究中比BCG安全)；结核分枝杆菌的phoP突变体(Martin等，2006；Verreck等，2009)(高剂量攻击下豚鼠中延长的存活，同时针对低剂量攻击的等同保护，在小鼠中等同的保护；猕猴肺中减少的CFU计数)；结核分枝杆菌的secA2突变体(Hinchey等，2007；Sadagopal等，2009)(小鼠中延长的存活)。由于牛分枝杆菌BCG是活疫苗，对与TB保护相关的大规模执行的转基因菌株存在法规和安全性担忧(例如转基因稳定性；转基因在疫苗和结核分枝杆菌本身间的水平基因转移的风险(Krzywinska等，2004)；世界范围内不同的谨慎环境释放GMO法规)(Kamath等，2005；Walker等，2010)。以减毒结核分枝杆菌作为疫苗也存在潜在的安全性问题，必须特别谨慎(如双突变，每个单突变导致充分减毒)(Kamath等，2005；Walker等，2010)。如果可以找到比获批的BCG菌株本身具有更好的保护能力的牛分枝杆菌BCG菌株，其中通过靶向失活内源基因而不是通过表达异源转基因来产生改善的保护，则可以减少这些担忧，临床执行和公众接受也可以更容易。
发明概述
据推测，报道为涉及吞噬体成熟抑制的分枝杆菌成分的突变可以产生更好的疫苗，因为这类突变应导致更好的疫苗抗原加工和展示。为此，产生了有序牛分枝杆菌BCG转座子插入突变体文库，并鉴定了15个基因中的突变体，其中包含细胞壁ManLAM的α-1，2-寡聚甘露糖基帽化必需的2个基因(Fratti等，2003；Hmama等，2004；Kang等，2005)和P13P磷酸酶基因SapM[21]。直到最近都认为α-1，2-寡聚甘露糖基结构帽化LAM主要由Rv1635c(Mb1661c)编码的α-1，2-甘露糖基转移酶介导(Dinadayala等，2006)。但是，Kaur和同事及我们实验室中最近的发现表明，另一甘露糖基转移酶(Rv2181或Mb2203)实际上更有选择性地影响α-1，2-寡聚甘露糖基帽结构合成，使细胞壁中的LAM水平完整(Kaur等，2006；Kaur等，2008)。因此，此突变体比Mb1661c突变体更适合用于确定α-1，2-寡聚甘露糖基帽化的具体作用(Appelmelk等，2008)，Mb1661c突变体可以具有补偿LAM缺乏的改变的细胞壁组成。已报道了ManLAM(甘露糖基化脂阿拉伯甘露聚糖)在破坏宿主细胞信号传导途径(18)和阻断宿主巨噬细胞中的吞噬体成熟(15)中发挥作用，诸如牛分枝杆菌BCG的生长缓慢的分枝杆菌中的ManLAM合成突变体是有利的。
ManLAM帽化和SapM二者在吞噬体成熟抑制中都被指定了重要功能，但这已通过突变体研究就ManLAM帽化产生了争论[22]，且尚未通过SapM的突变体研究进行验证。此外，现已首次在生物化学上表征了迄今未在生长缓慢的分枝杆菌中研究过的所提出的LM α-1，6-甘露糖基转移酶Mb2196。在严格模型中作为TB疫苗评价了牛分枝杆菌BCG的这些转座子插入突变体，可以显示，它们全都令人惊奇地具有改善的疫苗功效，SapM::T突变体接种者显示最长的存活。突变体BCG菌株在体外显示未改变的巨噬细胞和树突细胞摄入及在巨噬细胞中的溶酶体共定位。此外，它们在小鼠中的复制和肉芽肿形成与牛分枝杆菌BCG野生型相当，表明这些疫苗与BCG等同的安全性。接种SapM基因座突变体显著增加了CD11c+CD40+MHC-IIlo/med CD8α-DC向引流淋巴结的募集和它们的激活，解释了改善的免疫应答。引起突变体改善的疫苗功效的机制的进一步探查显示，与野生型BCG相比，突变体在感染巨噬细胞后诱导相似的氧化剂活性和自噬。
因此，根据第一方面，提供分枝杆菌，其在选自SapM、对应于牛分枝杆菌中Mb1661c的内源ManLAM α-1，2-甘露糖基转移酶、对应于牛分枝杆菌中Mb2203的内源ManLAM α-1，2-甘露糖基转移酶和对应于牛分枝杆菌中Mb2196的内源LM α-1，6-甘露糖基转移酶的至少一个内源基因中包含基因工程突变。这些ManLAM α-1，2-甘露糖基转移酶还分别等同于结核分枝杆菌H37Rv菌株中的Rv1635c和Rv2181。根据具体实施方案，该基因工程突变(即通过遗传工程方法获得的突变)是非天然存在的突变。根据具体实施方案，突变所述基因的组合和/或内源基因包含一个以上突变。根据具体实施方案，该基因工程突变编码具有减少的功能性(敲减)或缺乏功能性(敲除)的基因产物。这可以是因为不存在基因产物或存在比对应的野生型菌株中少的基因产物，和/或因为基因产物无功能或仅具有部分功能。根据具体实施方案，通过插入诱变来产生该基因工程突变。
根据具体实施方案，该分枝杆菌还可以具有其他突变。根据甚至更具体的实施方案，该分枝杆菌还包含至少一个降低毒力的突变。根据备选但不排他的实施方案，该分枝杆菌还在内源抗氧化剂基因中包含至少一个突变。根据其他实施方案，该内源抗氧化剂基因选自secA2、sigH和SodA(Sadagopal等，2009)。
根据具体实施方案，内源SapM基因、对应于Mb1661c基因的ManLAM α-1，2-甘露糖基转移酶、对应于Mb2203基因的ManLAM α-1，2-甘露糖基转移酶和对应于Mb2196基因的LM α-1，6-甘露糖基转移酶分别包含SEQ ID NO：1、3、5或7，其连续部分，或与之至少至少95％、至少98％或至少99％同一的序列；或分别包含编码SEQ ID NO：2、4、6或8，其连续部分的序列，或与之至少95％、至少98％或至少99％同一的编码序列。
根据具体实施方案，本文中所述的分枝杆菌选自结核分枝杆菌、牛分枝杆菌或牛分枝杆菌卡介苗(BCG)。
根据非常具体的实施方案，该分枝杆菌选自保藏菌株LMG P-25310、LMG P-25309、LMG P-25308和LMG P-25441。
在另一方面，提供本文中所述的分枝杆菌或其部分在制备重组疫苗，尤其是针对结核的疫苗中的用途。根据具体实施方案，该疫苗是基于牛分枝杆菌、牛分枝杆菌卡介苗(BCG)或结核分枝杆菌的疫苗。根据备选(但不排他)的具体实施方案，该疫苗包含活减毒疫苗。
因此，还提供制备疫苗(或疫苗组合物)的方法，其包括例如通过在可药用载体中提供活减毒分枝杆菌菌株来产生疫苗的步骤。
还根据另一方面，提供疫苗，其在可药用载体或赋形剂中包含本文中所述的分枝杆菌，因此在选自SapM、对应于牛分枝杆菌中Mb1661c的内源ManLAM α-1，2-甘露糖基转移酶、对应于牛分枝杆菌中Mb2203的内源ManLAM α-1，2-甘露糖基转移酶和对应于牛分枝杆菌中Mb2196的内源LM α-1，6-甘露糖基转移酶的至少一个内源基因中具有基因工程突变。根据备选实施方案，该疫苗包含所述分枝杆菌的部分。
该疫苗可以用于治疗几种疾病，因为已知基于重组分枝杆菌的疫苗是优良的载体疫苗(Bastos等，2009，尤其是其中的表格)。根据最具体的实施方案，该疫苗是针对结核的疫苗。换言之，该疫苗适合用于保护动物，最尤其是哺乳动物免受选自牛分枝杆菌或结核分枝杆菌的毒性分枝杆菌攻击。哺乳动物可以例如选自人类(尤其是人类儿童)或牛，尤其是母牛。
根据具体实施方案，该疫苗是活减毒疫苗。
因此，根据具体方面，提供本文中所述的分枝杆菌用于治疗结核。根据其他实施方案，提供本文中所述的疫苗用于治疗结核。因此，提供保护哺乳动物免受毒性分枝杆菌属感染，尤其是免受结核分枝杆菌或牛分枝杆菌感染的方法，其包括用本文中所述的疫苗(或者可能用本文中所述的活减毒分枝杆菌)处理哺乳动物。备选地，提供在哺乳动物中诱导免疫应答的方法，该方法包括用本文中所述的分枝杆菌或本文中所述的疫苗接种该哺乳动物。
附图简述
图1.有序转座子插入突变体文库的产生和所选择的4个突变体的示意图
A.用供体噬菌粒ΦMycomarT7产生了转座子插入突变体文库。此噬菌粒包含编码卡那霉素抗性基因的转座子、如此取向以促进转录进入邻近染色体DNA中的T7启动子和末端29bp反向重复。此构建体理论上在每个“TA”后整合入分枝杆菌基因组中。B.在96孔板中培养个体突变体至中对数期(21天)，将来自96孔板各行的整分试样混合入二级库平板的单孔中。将来自二级PCR库平板的列中各孔的整分试样混合入三级PCR库平板的单孔中。将这些库冻存于-20℃，并用于分离基因组DNA进行PCR筛选。C.我们用杂交至转座子任一端的反向重复的引物(Himar引物)和靶基因ORF上游或下游(有时在其中)的基因特异性引物针对有序文库中的具体突变体进行了PCR筛选。D.此图中按其作用部位显示了本文在生物化学上表征的三种甘露糖基转移酶和脂质磷酸酶。问号表示基因在所示生物合成步骤中的功能目前尚不清楚(Mb1661c在甘露聚糖主链上加入单个α-1，2-甘露糖残基中的功能)或尚未在结核分枝杆菌复合群(M.tbcomplex)的菌株中确认。灰色填充的圆表示单个α-1，2连接的甘露糖残基。
图2.突变体的Southern印迹分析、缺损基因(disrupted gene)的定量PCR相对表达分析和磷酸酶测定
A.用BamH1和Pst1消化所有突变体的基因组DNA(数据未显示)，并用32P dCTP标记的转座子探测。条带的数目对应于转座子在突变体中的插入的数目。除三个突变体(即Mb2203(i)、Mb1547(i)和Mb2196(i)中的突变体)外，所有其他突变体都显示转座子的单整合。所使用的标记是通过用1U PstI酶(Fermentas，加拿大)37℃消化1μgλDNA 2小时自制的λPst1标记。B.野生型(WT)和Mb1661c、Mb2203、SapM、Mb2196(M)基因的突变体中Mb1661c、Mb2203、SapM(Mb3338)和Mb2196转录物的定量。通过用提取自野生型和突变体的对数期培养物的RNA制备的cDNA上的实时PCR来测量转录物水平。下表中给出了引物组。针对编码16S rRNA的持家基因的表达水平归一化所有值。将野生型与突变体的转录物比值随意设为1。数据代表平均值±SD(n＝3)。在用各转录物的第二引物组进行的独立的定量PCR中获得了相似的结果(数据未显示)。C.通过在A415测量pNPP的水解来测定牛分枝杆菌BCG野生型(黑条)对牛分枝杆菌BCG SapM突变体(灰条)的培养物上清中的磷酸酶活性。用培养基作为对照(白条)。
  引物名称   引物序列
  1661c FP   5′GACGTGGGCCGGAATCGAAGCA 3′(SEQ ID NO：9)
  1661c RP   5′GATCCACCCGACCTGCCAAACCTG 3′(SEQ ID NO：10)
  2203FP   5′AACGCTTCGCACTGTGGGTGG 3′(SEQ ID NO：11)
  2203RP   5′CGTAGGACATCCCCGCGAGTTGAC3′(SEQ ID NO：12)
  SapM FP   5′ACACACCCGAGCGAACCGAAC 3′(SEQ ID NO：13)
  SapM RP   5′CAAGCGGATGGGTACGAGGTCAGC 3′(SEQ ID NO：14)
  2196FP   5′GATGGGCGGGGTGCACAACGAGAT 3′(SEQ ID NO：15)
  2196RP   5′CACGCAGATGACGCAGCCAAACC 3′(SEQ ID NO：16)
  16S FP   5′ATGACGGCCTTCGGGTTGTAA 3′(SEQ ID NO：17)
  16S RP   5′CGGCTGCTGGCACGTAGTTG 3′(SEQ ID NO：18)
图3.生长速率和倍增时间
A.野生型和突变体在Middlebrook 7H9培养液(含甘油、OADC、0.05％tween-80和抗生素)中37℃无搅拌培养3周(504小时)。每24小时测量OD一次，并计算倍增时间。未观察到生长速率的显著性差异。B.从生长曲线计算倍增时间，观察到随着培养物密度增加，倍增时间也增加。
图4.牛分枝杆菌BCG野生型对突变体SapM::T(Mb3338)、Mb2203::T、Mb1661c::T和Mb2196::T在Balb/c小鼠中的保护功效
A.用亲本或突变体牛分枝杆菌BCG菌株皮下接种BALB/c小鼠。接种后3个月，用发光结核分枝杆菌H37Rv静脉内感染动物。感染后2、4和8周处死小鼠，并通过发光测定法测定肺中的细菌数目。(单因素方差分析，Bonferroni’s多重比较检验；＊＊＊P＜0,0001；＊＊P＜0,0012；＊P＜0,05；ns，不显著)。B-E.还在长期存活研究中跟踪小鼠11个月，并每周监测死亡率和体重减轻。图中显示了存活百分比。未接种的小鼠的中位存活时间为23.5周，接种BCG野生型、1661c::T、2203::T、2196::T和SapM::T的小鼠分别为26.5周、27.5周、29周、30周和32周(P＝0.0145)(Kaplan-Meier，Bonferroni)。F-G.用亲本或突变体牛分枝杆菌BCG菌株皮下接种BALB/c小鼠。接种后3个月，用发光结核分枝杆菌H37Rv气管内感染动物。感染后4和8周处死小鼠，并通过发光测定法测定脾和肺中的细菌数目。(单因素方差分析，Bonferroni’s多重比较检验；＊＊＊P＜0,0001；＊＊P＜0,0012；＊P＜0,05；ns，不显著)。
图5.牛分枝杆菌BCG野生型对突变体SapM::T(Mb3338::T)、Mb2203::T和Mb1661c::T在Balb/c小鼠中的保护功效
用105CFU的亲本或突变体牛分枝杆菌BCG菌株皮下接种BALB/c小鼠。接种后3个月，用5×104CFU的发光结核分枝杆菌H37Rv静脉内感染动物。感染后2、4和8周处死小鼠，并通过发光测定法测定脾中的细菌数目。未检测到显著性差异(单因素方差分析，Bonferroni’s多重比较检验)。
图6.再刺激来自接种小鼠的脾细胞和肺细胞后的IFN-γ产生
用亲本牛分枝杆菌BCG或SapM基因座突变体静脉内接种BALB/c小鼠。感染后4周，处死小鼠，并在无菌条件下取出肺和脾。测定了再刺激肺(A)和脾细胞(B)后，响应recAg85A(Rv3804c)和合成20聚体肽p11(Ag85A99-118aa，显性CD4T细胞表位)的IFN-γ产生。
图7.牛分枝杆菌BCG野生型和突变体与鼠巨噬细胞和BM-DC的结合及感染巨噬细胞后的清除
A.按10的MOI用FITC标记的分枝杆菌(牛分枝杆菌BCG野生型对图中所示的突变体)感染巨噬细胞6小时。FITC阳性巨噬细胞的量和平均FITC强度显示为具有所示SEM的6个独立实验的平均值。B.按2的MOI用FITC标记的分枝杆菌(牛分枝杆菌BCG野生型对图中所示的SapM::T突变体)感染BM-DC 24小时。FITC阳性DC的量和平均FITC强度显示为具有所示SEM的5个独立实验的平均值。C.通过共焦显微术测定了FITC标记的细菌和lysotracker染色的溶酶体在感染的鼠巨噬细胞(3小时感染)中的共定位。所显示的是具有所示SEM的3个独立实验的平均值。D.所示的时间点用牛分枝杆菌BCG野生型对突变体感染Mf4/4细胞(MOI 10)。裂解感染的细胞，并通过接种在7H10琼脂上来计数胞内分枝杆菌。在平行实验中，通过PI摄取检验感染后Mf4/4细胞的细胞死亡。巨噬细胞在感染后存活至少48小时(数据未显示)。此实验是重复实验(具有所示SEM)的平均值，代表3个其他独立的实验。Y轴以对数尺度表示。未在A、B、C和D中所示的实验中发现任意突变体和野生型BCG间的统计显著性差异(P＞0.1，Mann-Whitney U检验)。
图8.巨噬细胞内的胞内氧化活性及牛分枝杆菌BCG野生型对突变体感染的巨噬细胞和BM-DC的自噬诱导
按MOI 10用牛分枝杆菌BCG野生型对突变体感染Mf4/4细胞，并在37℃孵育。在感染后的所示时间点，用CMH2DCFDA处理细胞，洗涤，并在测定平均荧光强度(MFI)的FACSCalibur上分析。
图9.LN DC运输和激活
用牛分枝杆菌BCG野生型和牛分枝杆菌BCG SapM突变体皮下感染Balb/cJ小鼠。在感染后第1天和第7天，每组处死5只小鼠，取出腹股沟淋巴结(ILN)。制备细胞，用不同抗体标记，并通过流式细胞术分析。A.CD11c+细胞的测定。B.CD11c+细胞在总ILN群体中的百分比。C.CD11c+CD40+MHC-IIlo/med CD8α-DC的百分比。D.MHCIIlo CD40-(P3)、MHCIImed CD40+(P1)、MHCIIhi CD40+(P2)的图示(左列)，CD8a、MHCII、CD80和CD86在P1中的细胞中/上的表达水平的图示。(Kruskal-Wallis，Bonferroni’s多重比较检验；＊＊＊P＜0,005；＊＊P＜0,01；＊P＜0,05；ns，不显著)。
图10.牛分枝杆菌BCG野生型对突变体在小鼠的脾和肺中的细菌复制、感染小鼠后的细胞因子产生和肉芽肿形成
A-B.用牛分枝杆菌BCG野生型对突变体静脉内感染Balb/c小鼠，并在感染后2周(黑条)、4周(深灰色条)和12周(浅灰色条)处死(每组5只)。将肺和脾匀浆一式两份接种在7H10琼脂上进行CFU计数。图中显示了各组的平均值和标准误(SEM)。未在突变体和野生型之间检测到差异(P＞0.1，Mann-Whitney U检验)。C.用牛分枝杆菌BCG野生型和突变体气管内感染C57BL/6小鼠。感染后4周，每组处死5只小鼠，并进行支气管肺泡灌洗(BAL)。显示了各组的TNF和IFN-γ在BALF中的平均水平和标准误(SEM)，且代表2个独立的实验。(P＞0.05，Mann WhitneyU检验)。D.用牛分枝杆菌BCG野生型和突变体静脉内感染C57BL/6小鼠。3周后，每组处死5只小鼠，并在无菌条件下取出肝。通过直接镜检(3，5×放大率)和ImageJ软件分析进行了鉴定肉芽肿的苏木精/伊红(H&E)染色石蜡切片上的定量研究。图中显示了各组的平均值和标准误(SEM)。感染小鼠后，Mb1661c::T和Mb2203::T诱导比牛分枝杆菌BCG野生型少的肉芽肿(P＜0.01，Mann-Whitney U检验)。
图11.牛分枝杆菌BCG野生型对SapM::T感染BM-DC后的细胞因子产生
用牛分枝杆菌BCG野生型对突变体感染BM-DC(MOI 2)6小时。在所示的时间点，取出上清，并通过流式细胞术分析细胞因子的存在。
发明详述
定义
将就具体实施方案和参考某些附图来描述本发明，但本发明不限于这些具体实施方案和附图，仅受限于权利要求书。不应将权利要求书中的任意参考标记解释为限制范围。所述附图仅是示意性的，而非限制性的。在附图中，为了说明的目的，可以夸大一些要素的尺寸，而不按比例绘制。在本说明书和权利要求书中使用术语“包含”时，它不排除其他要素或步骤。提到单数名词时使用不定冠词或定冠词，例如“一”、“一个”、“该”时，除非明确地另有说明，这包含了多个该名词。
此外，本说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三等用来在相似的要素间进行区分，并非必然用于描述连续顺序或时间顺序。应理解，这样使用的术语在适当情况下可互换，本文中所述的本发明的实施方案能够以本文中描述或说明的顺序以外的顺序实施。
提供以下术语或定义仅是为了辅助理解本发明。除非本文中明确地定义，本文中使用的所有术语具有与本发明领域的技术人员的理解相同的含义。从业者尤其可从Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Press，Plainsview，New York(1989)；和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(增刊47)，JohnWiley&Sons，New York(1999)了解本领域的定义和术语。本文中提供的定义不应解释为具有小于本领域普通技术人员的理解的范围。
本文中使用的“分枝杆菌”指来自分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)的分枝杆菌属(本文中有时缩写为M.)的微生物。尤其考虑的分枝杆菌包含结核分枝杆菌复合群(UniProt或NCBI分类学数据库中的分类单位标识符77643)的成员，其包含物种结核分枝杆菌(人结核的主要病因)、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG(最常用于接种目的的菌株)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、田鼠分枝杆菌(M.microti)、M.canetti和M.pinnipedii。
本申请通篇使用的“基因工程突变”指遗传物质(即通常为DNA)中的突变，尤其是通过遗传工程技术获得的非天然存在的突变。这种突变可以是点突变、取代、缺失或插入。通常，本文中考虑的基因工程突变将导致功能性基因产物水平的降低或缺乏(即失功能突变)。其机制对本发明并不重要，但通常可以涉及受影响基因的转录和/或翻译的减少或丧失，或者只转录/翻译功能异常的基因产物。基因中的基因工程突变无需必然在外显子或可读框中，它们可以在内含子中，或甚至在起始密码子上游，只要它们影响功能性基因产物的水平。这可以例如通过基因转录水平的Q-PCR容易地检验。如本领域技术人员可知，还可以例如通过向受影响的酶提供天然底物来检验基因产物的功能性。
本文中使用的“内源基因”是天然存在于生物中，尤其是物种中的基因。
本文中使用的术语“SapM”指编码PI3P磷酸酶(酶分类3.1.3.2)的基因，或指所编码的蛋白质产物。该基因还在其他名称下已知，例如Rv3310(来自结核分枝杆菌H37Rv菌株；GeneID 887988)、Mb3338(来自牛分枝杆菌AF2122/97菌株；GeneID 1093156)、SapM假定的酸性磷酸酶或BCG_3375、SapM_1或JTY_3335、SapM_2或JTY_3355、SapM_3或JTY_3375(各自的GeneID为来自牛分枝杆菌BCG巴斯德1173P2菌株的4696502，来自牛分枝杆菌BCG东京172菌株的7561659、7561660和7561661。这些的蛋白质产物有一个氨基酸(A171T)不同于Rv3310)。还已知其他GeneID(通常作假定或临时的蛋白质，且尚未经验证)，但所有这些GeneID都可以定位至H37Rv菌株的Rv3310，因此对技术人员而言可容易地鉴定。实例包含GeneID 6698178、6820173和5224028。Rv3310和Mb3338基因及它们所编码的蛋白质显示100％序列同一性，DNA和蛋白质序列分别是SEQ ID NO：1和2。根据具体实施方案，SapM基因来自结核分枝杆菌复合群(分类学标识符77643)的成员。根据备选的非常具体的实施方案，SapM基因不编码假定的蛋白质MAP3432(GeneID2719192)。
本文中使用的“对应于牛分枝杆菌中Mb1661c的内源ManLAM α-1，2-甘露糖基转移酶”是对应于(可以定位至)Mb1661c(来自牛分枝杆菌AF2122/97菌株的Gene ID 1092601)或Rv1635c(来自结核分枝杆菌H37Rv菌株的GeneID 885100)或所编码的蛋白质产物的基因。这两个基因彼此等同，在所编码的556aa基因产物(SEQ ID NO：4)中，以及在一级DNA序列(SEQ ID NO：3)中显示100％序列同一性。与SapM基因一样，还已知且可容易地(或已经)定位至H37RV Rv1635c基因的其他GeneID。实例包含GeneID 5222331、6822253和6701614。
本文中使用的术语“对应于牛分枝杆菌中Mb2203的内源ManLAMα-1，2-甘露糖基转移酶”是对应于(可定位至)Mb2203(来自牛分枝杆菌AF2122/97菌株的GeneID 1091304)或Rv2181(来自结核分枝杆菌H37Rv菌株的GeneID 888269)或所编码的蛋白质产物的基因。这两个基因彼此等同，在所编码的427aa基因产物(SEQ ID NO：6)中，以及在一级DNA序列(SEQ ID NO：5)中显示100％序列同一性。与SapM基因或Rv1635c基因一样，还已知且可容易地(或已经)定位至H37RV Rv2181基因的其他GeneID。实例包含GeneID 6701835、5222885和6822792。
本文中使用的术语“对应于牛分枝杆菌中Mb2196的内源LM α-1，6-甘露糖基转移酶”是对应于(可定位至)Mb2196(来自牛分枝杆菌AF2122/97菌株的GeneID 1091287)或Rv2174(来自结核分枝杆菌H37Rv菌株的GeneID 887528)或所编码的蛋白质产物的基因。这两个基因彼此等同，在所编码的516aa基因产物(SEQ ID NO：8)中——唯一的差异是位置451上的Ser→Ala取代——以及在一级DNA序列(SEQ ID NO：7)中显示99.8％序列同一性。与SapM基因或Rv1635c基因一样，还已知且可容易地(或已经)定位至H37RV Rv2174基因的其他GeneID。实例包含GeneID 909900。
本文中使用的术语“序列的连续部分”指还以与所提到的序列中相同的顺序存在的未中断的核酸或氨基酸序列。尤其考虑具有参考序列长度的至少25％、50％、70％、75％、80％或90％的长度的连续部分，连续部分通常是至少25个核酸或至少8个氨基酸。
本文中使用的“活减毒疫苗”是包含具有降低的毒力(减毒)的活的或能存活的微生物的疫苗；与灭活疫苗相对。
本文中使用的术语“序列同一性”指序列在比较窗内以核苷酸-核苷酸为基础或氨基酸-氨基酸为基础的同一程度。因此，这样计算“百分比序列同一性”：比较在比较窗内最佳比对的序列，测定在两条序列中存在相同核酸碱基(例如A、T、C、G)或相同氨基酸残基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数来产生匹配位置数，用匹配位置数除以比较窗中的位置总数(即窗口大小)，并将结果乘以100来产生百分比序列同一性。为了本发明的目的，“序列同一性”将理解为意指用软件所附参考手册中使用的标准默认值，通过DNASIS计算机程序(用于windows的2.5版；可从Hitachi Software engineering Co.，Ltd.，South San Francisco，Calif.，USA获得；或可通过互联网进入)计算的“匹配百分比”。“相似性”指同一或构成保守取代(例如用另一疏水性氨基酸残基取代疏水性氨基酸残基，或用另一带正电荷的氨基酸残基取代带正电荷的氨基酸残基)的百分比氨基酸数目。可以用诸如GAP(Deveraux等1984，Nucleic AcidsResearch 12，387-395)或BLAST的序列比较程序来测定相似性。这样，可以通过在比对中插入缺口来比较具有与本文中引用的那些相似长度或基本上不同长度的序列，例如通过GAP所使用的比较算法来测定这类缺口。
本发明尤其涉及在编码报道为涉及吞噬体成熟抑制的分枝杆菌成分的基因中突变的分枝杆菌，及它们在疫苗制剂中的用途。发现这类突变导致更好的疫苗抗原加工和呈递。这产生更有效的疫苗(在结核分枝杆菌感染的小鼠模型中提供延长的存活和/或增加的存活机会)，同时保持用于接种的菌株的其他特性(例如涉及生物安全性措施)。
因此，根据第一方面，提供分枝杆菌，其在选自SapM、对应于牛分枝杆菌中Mb1661c的内源ManLAM α-1，2-甘露糖基转移酶、对应于牛分枝杆菌中Mb2203的内源ManLAM α-1，2-甘露糖基转移酶和对应于牛分枝杆菌中Mb2196的内源LMα-1，6-甘露糖基转移酶的至少一个内源基因中包含基因工程突变。不同分枝杆菌物种中的基因命名不完善，尚未将功能归于各物种中的所有基因。为了避免混淆，选择了以这种方式表示基因。基于序列同源性，技术人员将能够容易地在其他物种中鉴定对应(或等同)的基因。例如，在结核分枝杆菌H37Rv参考菌株中，对应于Mb1661c的基因是Rv1635c，二者具有相同的序列(SEQ ID NO：3)，对应于Mb2203的基因表示为Rv2181，也具有同一的序列(SEQ ID NO：5)(见表1)。注意，这也适用于PI3P磷酸酶SapM：在牛分枝杆菌和结核分枝杆菌中分别表示为Mb3338和Rv3310，但具有同一的序列，该序列对应于SEQ ID NO：1。
因此，根据具体实施方案，内源SapM基因包含SEQ ID NO：1，其连续部分，或与SEQ ID NO：1或其连续部分至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一的序列。类似地，等同于Mb1661c基因的ManLAM α-1，2-甘露糖基转移酶可以包含SEQ ID NO：3，此序列的连续部分，或与SEQ IDNO：3或其连续部分至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一的序列。同样，在具体实施方案中，对应于Mb2203的ManLAM α-1，2-甘露糖基转移酶包含SEQ ID NO：5，其连续部分，或与之至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一的序列。或者，在具体实施方案中，对应于Mb2196的LM α-1，6-甘露糖基转移酶包含SEQ ID NO：7，其连续部分，或与之至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一的序列。
备选地，可以在蛋白质(氨基酸)水平定义百分比序列同一性或相似性。因此，内源SapM基因可以定义为这样的基因，该基因编码包含SEQID NO：2、此序列的连续部分的序列，或编码与SEQ ID NO：2或其连续部分至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一的序列。类似地，等同于Mb1661c基因的ManLAM α-1，2-甘露糖基转移酶可以编码包含SEQ ID NO：4、其连续部分的序列，或与SEQ ID NO：4或其连续部分至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一的序列。同样，在具体实施方案中，对应于Mb2203的ManLAM α-1，2-甘露糖基转移酶编码包含SEQ ID NO：6、其连续部分的序列，或与之至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一的序列。或者，在具体实施方案中，对应于Mb2196的LM α-1，6-甘露糖基转移酶编码包含SEQ ID NO：8、其连续部分的序列，或与之至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一的序列。
根据具体实施方案，突变这些基因的组合，例如突变两个ManLAMα-1，2-甘露糖基转移酶基因，或者内源SapM基因和一个或两个ManLAMα-1，2-甘露糖基转移酶基因或α-1，6-甘露糖基转移酶基因。此外和/或备选地，这些内源基因中的一个或多个可以包含一个以上突变。
根据具体实施方案，具有基因工程突变的基因编码具有减少的功能性(敲减)或缺乏功能性(敲除)的基因产物。这可以是因为不存在基因产物或存在比对应的野生型菌株中少的基因产物，和/或因为基因产物无功能或仅具有部分功能。因此，基因工程突变可以影响基因产物的表达水平、基因产物的稳定性，编码无效(defunctX)或无义基因产物(例如通过插入终止密码子)，编码不同的基因产物，或这些的任意组合。根据具体实施方案，基因产物的表达水平降低25％、50％、75％或更多。可以例如通过QPCR来评价基因产物的表达。突变可以是插入、取代或缺失，且大小可以从一个碱基对(或一个氨基酸)至整个基因(例如完全的基因缺失或取代)变化。注意，突变还包含起始密码子上游，如启动子区域中的突变，尤其是起始密码子上游30个核苷酸内的突变，只要这些突变影响基因产物的水平和/或功能。根据具体实施方案，通过插入诱变来产生基因工程突变。根据具体实施方案，不用等位基因交换诱变法来产生突变。
根据具体实施方案，分枝杆菌还可以具有其他突变。根据甚至更具体的实施方案，分枝杆菌还包含至少一个降低毒力的突变(注意这是例如牛分枝杆菌BCG菌株中的情况)。这些其他突变的另一实例是抗氧化剂基因中的突变。事实上，Sadagopal等已显示，降低微生物抗氧化剂的活性和分泌增强了BCG的免疫原性(Sadagopal等，2009)。这可以对肺TB尤其有益，因为传统BCG菌株在针对此形式的TB的保护中较不可靠。由于这些抗氧化剂独立于吞噬体成熟发挥作用，可以预期，在吞噬体成熟基因中(如在SapM、Mb1661c、Mb2203或Mb2196中)具有至少一个突变且在抗氧化剂基因中具有至少一个突变的分枝杆菌将更适合作为改善的疫苗组合物的基础。尤其考虑下调或敲除的抗氧化剂基因是选自secA2、sigH和SodA的一个或多个(或全部)。Sadagopal等(Sadagopal等，2009)中描述了可以如何产生这些抗氧化剂基因中的突变体。
根据具体实施方案，本文中所述的分枝杆菌选自结核分枝杆菌、牛分枝杆菌或牛分枝杆菌卡介苗(BCG)。注意，已知许多BCG菌株(包括但不限于BCG-俄罗斯、-日本、-Moreau、-瑞典、-Birkhaug、-中国、-布拉格、-Glaxo、-丹麦、Mérieux、-Tice、-Phipps、-Frappier、-Connaught和-巴斯德)，且考虑将它们中的全部用于本文中所述的应用。
Brosch等(Brosch等，2007)已显示，不同的BCG菌株包含不同的复制区。这是有益的，因为一些BCG菌株(例如BCG-巴斯德)不具有包含本文中所讨论的吞噬体成熟基因和抗氧化剂基因的区域的复制，而其他BCG菌株(例如BCG-丹麦)具有。由于它们不复制时更易于保证无功能基因，在具体实施方案中，考虑使用不包含含有吞噬体成熟基因(例如SapM)的区域的复制的菌株。备选地或此外，考虑菌株不具有抗氧化剂基因的复制。
根据非常具体的实施方案，分枝杆菌选自保藏菌株LMG P-25310(在SapM基因-Mb 3338中携带突变的牛分枝杆菌BCG)、LMG P-25309(在Mb1661c基因中携带突变的牛分枝杆菌BCG)、LMG P-25308(在Mb2203基因中携带突变的牛分枝杆菌BCG)和LMG P-25441(在Mb2196基因中携带突变的牛分枝杆菌BCG)。已在比利时微生物保藏中心(BCCM/LMG Bacteria Collection)，国立比利时根特大学(University ofGent)，比利时进行保藏。还作为LMG P-25307保藏了用于产生突变体的野生型牛分枝杆菌BCG菌株。
在另一方面，还提供本文中所述的分枝杆菌或其部分在制备重组疫苗，尤其是针对结核的疫苗中的用途。然而，通常将把整个(减毒)分枝杆菌用于疫苗中，考虑可以使用其部分(所谓的“亚单位疫苗”)，例如包含来自分枝杆菌的具体蛋白质。亚单位疫苗的非常具体的亚组是重组疫苗，其中至少一种来自分枝杆菌的蛋白质非内源地存在于用于接种的微生物中(例如通过重组过量表达)。在其他非内源蛋白质在分枝杆菌中表达为抗原时，也可以将重组疫苗用作针对结核以外的其他疾病的疫苗。
表达外来抗原的分枝杆菌遗传系统的发展和BCG的佐剂性是此减毒分枝杆菌作为重组疫苗的潜在用途的基础(Stover等，1991)。过去几年中，已发展了一系列策略来允许病毒、细菌和寄生虫抗原在BCG中受控且稳定地表达，导致针对这些异源抗原的细胞和体液免疫应答(Dennehy等，2005)。此外，已显示，过量表达结核分枝杆菌抗原的重组BCG在赋予针对结核的保护中比野生型BCG菌株更有效(Castanon-Arreola等，2005；Horwitz，2005)。
Bastos等(Bastos等，2009)中，尤其是表1-3中给出了可以作为疫苗载体成功用于重组BCG中的异源细菌抗原、寄生虫抗原和病毒抗原的良好概述。实例包括但不限于提供针对细菌感染(例如大肠杆菌(Escherichiacoli)、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、边缘无形体(Anaplasma marginale)、臂细螺旋体(Leptospira interrogans)、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens))的疫苗的细菌抗原、细菌毒素(例如百日咳毒素、破伤风毒素、霍乱毒素)、提供针对寄生虫病(例如利士曼原虫属(Leishmania)物种、曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)、埃及血吸虫(Schistosoma haematobium)、日本血吸虫(Schistosomajaponicum)、约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、刚果弓形虫(Toxoplasma gondii)、恰氏利什曼原虫(Leishmania chagasi)、多房棘球绦虫(Echinococus multilocularis)、柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella))的保护的寄生虫抗原和保护免受病毒病(例如HIV-1、FMDV(口蹄疫病毒)、SIV、麻疹病毒、乳头瘤病毒、狂犬病毒、PRRSV(猪生殖和呼吸综合症病毒)、HCV(丙型肝炎病毒)、HBV(乙型肝炎病毒)、CRPV(棉尾兔乳头瘤病毒)、轮状病毒、传染性支气管炎病毒、RSV(呼吸道合胞病毒))的病毒抗原。
技术人员将易于理解重组BCG的潜能，并认识到此列表是不详尽的，可以容易地测试其他抗原来为其他(或甚至相同的)疾病提供疫苗(例如，在结核分枝杆菌气溶胶攻击后，与亲本BCG菌株相比，具有单核细胞增生李斯特氏菌的膜穿孔利斯特菌溶胞素(Hly)的BCG在小鼠模型中显示显著改善的保护(Grode等，2005))。
此外，重组BCG还可以用作免疫调制剂。免疫调制剂是加速、延长或增强对抗原的特异性免疫应答的质量的物质或活生物。活减毒重组细菌疫苗已主要用来调制免疫系统以特异性谱应答特异性抗原。已良好地描述了野生型BCG的免疫调制剂作用，最近，细胞因子的表达已甚至改善了此作用。此途径允许调制免疫系统以细胞因子的特异和希望的模式应答。可以在重组BCG中表达的细胞因子的实例包括但不限于IFN-γ、IL-2、IL-18、IFN-α-2b(见Bastos等，2009的表4)。
通过免疫调制，BCG还可以是癌症治疗中的有用疗法，例如通过增强特定免疫应答。甚至非重组BCG也可以用于治疗癌症，因为已在例如白血病、黑素瘤、结肠癌、肺癌、皮肤癌和膀胱癌中显示了有希望的结果。考虑可以用本文中所述的分枝杆菌来研发针对这些疾病的疫苗(重组或非重组)。最具体而言，考虑可以将本文中提供的分枝杆菌用于针对膀胱癌的疫苗。事实上，FDA已于1990年批准BCG用于治疗膀胱癌。最具体而言，考虑治疗浅表性膀胱癌(即未侵入膀胱的肌肉壁的膀胱癌)，因为认为BCG是此疾病的最有效的治疗。这甚至可以通过提供重组表达IL-18的BCG来进一步提高(Luo等，2004)。
根据具体实施方案，该疫苗是基于牛分枝杆菌、牛分枝杆菌卡介苗(BCG)或结核分枝杆菌的疫苗。根据备选(但不排他)的具体实施方案，该疫苗包含活减毒疫苗。
因此，还提供用于制备疫苗(或疫苗组合物)的方法，其包括例如通过在可药用载体中提供活减毒分枝杆菌菌株来产生疫苗的步骤。
还根据另一方面，提供疫苗，其在可药用载体或赋形剂中包含本文中所述的分枝杆菌，因此在选自SapM、对应于牛分枝杆菌中Mb1661c的内源ManLAM α-1，2-甘露糖基转移酶、对应于牛分枝杆菌中Mb2203的内源ManLAM α-1，2-甘露糖基转移酶和对应于牛分枝杆菌中Mb2196的内源LM α-1，6-甘露糖基转移酶的至少一个内源基因中具有非天然存在的突变。根据备选实施方案，该疫苗包含所述分枝杆菌的部分。
根据最具体的实施方案，该疫苗是针对结核的疫苗。换言之，该疫苗适合用于保护动物，尤其是哺乳动物免受选自牛分枝杆菌或结核分枝杆菌的毒性分枝杆菌攻击。已知许多哺乳动物患有结核，尤其是患有结核分枝杆菌或牛分枝杆菌感染，这些动物可以从疫苗受益。这类哺乳动物包含宠物(如但不限于猫、狗、兔、仓鼠、豚鼠等)、家畜(如但不限于马、驴、骡、牛、母牛或其他牛、羊驼、骆驼或其他camelids、猪、绵羊、山羊、鹿、驼鹿、驯鹿)、非驯养动物或动物园动物(如但不限于象、非人灵长类(例如大狒狒、狒狒、猕猴...)、野生猫科动物(虎、狮...)、熊、羚羊、海狮、獾、负鼠等)和人类。结核可以表现为人兽共患病。本文中所述的疫苗尤其考虑的哺乳动物是牛，最具体而言是母牛。还尤其考虑人类，尤其是儿童。一般而言，本文中所述的疫苗尤其考虑用于幼小动物。幼小动物通常意指它们尚未达到生殖年龄。
根据具体实施方案，该疫苗是活减毒疫苗。
因此，提供本文中所述的分枝杆菌用于治疗结核。根据其他实施方案，提供本文中所述的疫苗用于治疗结核。因此，提供保护动物，尤其是哺乳动物，尤其是有需要的动物免受毒性结核分枝杆菌或牛分枝杆菌的方法，其包括用本文中所述的疫苗(或者可能用本文中所述的活减毒分枝杆菌)处理哺乳动物。备选地，提供在哺乳动物中诱导免疫应答的方法，该方法包括用本文中所述的分枝杆菌或本文中所述的疫苗接种该哺乳动物。
施用疫苗的方式可以由技术人员根据本领域已知的给药途径来确定。这些包括但不限于皮下施用、皮内施用、鼻内施用、口腔施用、肠胃外施用、肌内施用、注射等。
剂量方案也可以由技术人员用他的专业知识来确定(例如单次施用、反复施用(按规律或不规律的间隔施用两次或多次)等)。这通常还将取决于待治疗的疾病和接受治疗的个体(例如，在人类膀胱癌中，已将低剂量BCG方案描述为75mg，而标准剂量是150mg。但是，已记录到低至1mg的BCG剂量长时期(5年)有效支持免疫应答。在结核中，典型剂量的实例更低：0.075mg，对应于0.3-1.2百万活分枝杆菌)。粗略地说，典型剂量可以落在0.01μg/kg体重和10mg/kg体重之间。在结核的治疗中，一次治疗通常保护许多年。但是，还考虑提供重复剂量(例如膀胱癌治疗中的情况通常如此)。
由于本文中所述的疫苗比标准疫苗更有效，还考虑治疗方案可以比使用等同的WT分枝杆菌菌株的治疗方案短；或者可以使用亚适剂量(即低于通常用于等同的WT分枝杆菌或基于WT分枝杆菌的疫苗的剂量的剂量)。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。虽然类似或等同于本文中所述的那些的方法和材料可以用于实施或测试本发明，但下文描述有用的方法和材料。材料、方法和实施例仅是说明性的，并非旨在限制。本发明的其他特征和优势将从发明详述和权利要求书显而易见。
实施例
材料和方法
分枝杆菌菌株和培养基
在液体培养物中培养时，将链霉素抗性牛分枝杆菌BCG菌株1721(RpsL，42 Lys→Arg；Institute for Medical Microbiology，苏黎世的P.Sander教授惠赠)及其突变体培养在添加了0.05％Tween80、MiddlebrookOADC(Becton Dickinson)和适当抗生素选择(野生型为100μg/ml链霉素，突变体额外加入50μg/ml卡那霉素)的Middlebrook 7H9培养液(Difco)中。Difco Middlebrook 7H10琼脂(类似地添加)用于固体培养物上的生长。我们在添加了20μg/ml卡那霉素的7H10平板上选择突变体。对于噬菌体的繁殖，使用链霉素抗性耻垢分枝杆菌菌株(也获自P.Sander教授)，并培养在添加了Middlebrook ADC(Becton Dickinson)而不含Tween80或抗生素的的Middlebrook 7H9培养液(Difao)中。在此研究的整个过程中，在配有透气滤盖的组织培养瓶中将牛分枝杆菌BCG培养在静置培养物中(即不摇动)。直立孵育培养瓶，T25瓶(Falcon)中装10mL培养物。
有序转座子突变体文库的构建和突变体的产生
按描述在耻垢分枝杆菌中繁殖转座子供体噬菌粒ΦmycomarT7(Harvard School of Public Health，Boston的Dr.Eric Rubin教授惠赠)来产生噬菌体原种(43)。按之前所述在培养至OD6001.0的牛分枝杆菌BCG中进行转导(54)。由于转座子包含卡那霉素抗性基因，将文库接种在包含20μμg/ml卡那霉素的7H10琼脂平板上。按适当的稀释度进行平板接种来获得良好分开的单菌落。一旦在7H10琼脂平板上良好地培养出菌落，即用无菌牙签将它们手工挑入96深孔板中，每块平板包含96个个体突变体。特别小心，仅挑取明显是克隆的那些菌落，以避免在随后的突变体排序中污染。
文库排序入库
于96孔板中在200μl添加了10％OADC及50μg/ml卡那霉素和100μg/ml链霉素的Middlebrook 7H9培养液中培养个体突变体至中对数期(21天)，并将整分试样于50％甘油中冻存在-80℃。其余培养物分为两份，再培养3周。将来自96深孔板各行(来自一级平板的12个个体突变体)的10μl培养物整分试样混合在单孔中形成“二级库”(图1B)，将来自二级库平板各列的10μl培养物整分试样混合在单孔中形成“三级库”。沉淀8块二级库平板和1块三级库平板中的培养物，并冻存在-20℃。两套96深孔板中剩余的培养物于50％甘油中保存在-80℃(一个工作文库，第二个作为备份)。
PCR筛选
对于各目的基因，用以下软件包之一设计在编码序列上游或下游1000碱基中的任一处杂交的引物：Primer Excel、Oligo或DNA Star。针对牛分枝杆菌BCG基因组(http://genolist.pasteur.fr/BoviList/)比对引物来确保引物尽可能基因特异。用此引物和在转座子侧翼反向重复内杂交的第二引物进行PCR(图1C)。无论它就靶序列而言的取向如何，此引物都阅读离开转座子，并进入插入的邻近基因组序列。我们首先针对转座子插入在各靶基因座中的存在筛选三级库，然后筛选二级库。然后从甘油原种培养起最终的12个突变体(每孔包含1个突变体的一级文库平板中的一行)，并再次筛选来鉴定具有插入的个体突变体(图1B)。测序由引物扩增的基因组区域来确认目的基因中的插入。按描述(37)制备突变体的基因组DNA，每个PCR反应使用约30ng。用Amplitaq Gold(Amersham，Uppsala)聚合酶和缓冲液组建立PCR。
突变体的Southern印迹表征
顺次用BamHI和PstI(在转座子中缺乏限制位点)消化突变体的基因组DNA。通过中性变性法(按照厂家的说明)将消化的样品印迹至Hybond N+膜(Amersham，Uppsala)。我们用通过随机引发(RandomPrime Kit，Amersham，Uppsala)用250μCi[α-32P]dCTP(Amersham，Uppsala)标记的全长转座子序列杂交膜。
定量实时PCR
沉淀野生型牛分枝杆菌BCG和突变体的对数期培养物(OD6000.8-1.0)，并按每50mg沉淀1ml试剂的比例重悬在TRI试剂(MolecularResearch Center，Inc，美国)中。加入0.1μM烘烤玻璃珠，并在4℃下以最大振幅在Retsch MM2000珠磨机(Retsch GmbH，德国)中破碎沉淀3分钟。通过在4℃13000转/分钟离心2分钟来收集上清，并用等体积的氯仿萃取。收集水性层，并用0.6体积的异丙醇沉淀RNA。将此溶液上样在Rneasy微型柱(RNeasy Mini kit，Qiagen，美国)上，除在DNA酶处理后将RNA洗脱在50μl终体积的DEPC水中以外，随后按照Qiagen的RNA提取流程进行其他步骤。使用iScript cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad，美国)，用10μl所获得的RNA作模板进行cDNA合成。1∶5稀释所获得的cDNA，并将2μl用于使用Fast SYBR Green Master Mix(AppliedBiosystems，美国)的Q-PCR反应中。在LightCycler Real Time PCRSystem(Roche Applied Science，瑞士)上分析样品。用于该分析的引物设计在突变体中转座子插入位点(通过测序确定)的下游。各样品总计进行三次PCR，用平均结果作为各样品的值。
磷酸酶活性分析
沉淀野生型牛分枝杆菌BCG和牛分枝杆菌BCG SapM突变体的晚对数期培养物(OD6004)，用对硝基苯磷酸(pNPP)作为底物来评价上清的磷酸酶活性(52)。向50μL培养物上清中加入15μL pNPP(5mM终浓度)，总体积为150μL(用0.1M乙酸钠pH 6调节)。37℃孵育样品所示的时间点，然后用50μL 1M Na2CO3终止反应。通过在415nm定量所释放的pNP和Pi来测定pNPP的相对水解速率。
生长曲线和超微结构
我们在37℃下在10ml Middlebrook 7H9培养液(无抗生素选择)中培养所有菌株，并在4周的时间内每24小时记录一次600nm吸光度。对于电子显微镜术，在高压冷冻机(EM Pact，Leica Microsystems，Vienna，奥地利)中将分枝杆菌细胞冷冻在膜载体中。在Leica EM Automatic FreezeSubstitution(AFS)中进行冷冻置换。在4天的时间内，按以下在含有1％锇、0.2％戊二醛和0.1％乙酸双氧铀(UrAc)的干燥丙酮中置换细胞：-90C26小时、2℃/小时升温15小时、-60℃8小时、2℃/小时升温15小时、-30℃8小时。在-30℃用丙酮漂洗载体3次，每次20分钟。最后，缓慢加热细胞至4℃。随后，我们在我们于70℃聚合了9小时的Spurr’s树脂中逐步浸渗细胞。我们用超薄切片机(ultracut E，Reichert-Jung)切下金干涉色的超薄切片，并将它们收集在聚醋酸甲基乙烯酯(formvar)包被的铜质狭缝载网上。我们用50∶50(v/v)的4％戊二醛和含1.5g/L钌红的0.2M二甲胂酸盐缓冲液染色切片1小时，然后在0.2M二甲胂酸盐缓冲液中漂洗。我们随后用新鲜配制的50∶50(v/v)ddH2O中的4％四氧化饿和包含1.5g/L钌红的0.2M二甲胂酸盐缓冲液的溶液染色切片4小时，然后在二甲胂酸盐缓冲液中漂洗，然后在ddH2O中漂洗。我们用以90kV运行的JEOL 1010TEM来显示载网。
Cyanovirin-N结合和甘露糖苷酶处理
用1μl偶联至Alexa-488(按照厂家的说明，Molecular Probes)的Cyanovirin-N(702.9μg/ml，NIH，Bethesda的B O’Keefe博士惠赠)在100μl凝集素缓冲液(50mM Tris/Cl pH 7.5、150mM NaCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、1mM MnCl2)中冰上孵育1mg(湿重)牛分枝杆菌BCG野生型或突变体细胞(培养物OD600～1.0)1小时，并通过FACS Calibur(Becton Dickinson)流式细胞仪上的流式细胞术来评估。分析前，向样品中加入15μM碘化丙锭(PI)。对于α-1，2-甘露糖苷酶处理，用50uL中的33ng重组里氏木霉(Trichoderma reesei)α-1，2-甘露糖苷酶(无LPS，内部在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中产生)在100mM乙酸铵缓冲液(pH 5.0)中37℃过夜孵育1mg细胞(34)。然后用缓冲液洗涤细胞一次，按上文所述进行Cyanovirin-N染色，然后进行流式细胞术分析。
CS-35标记
用1∶100稀释的CS-35单克隆抗体(TBVTRM，Colorado StateUniversity)(22)在100μl反应体积中在1×PBS pH 7.4中孵育1mg(湿重)牛分枝杆菌BCG野生型或突变体细胞(培养物OD600～1.0)15分钟，然后加入抗-小鼠IgG-PE(藻红蛋白，Molecular Probes，美国)，再孵育15分钟。在1×PBS中短暂洗涤细胞，并通过流式细胞术分析。
LM和LAM的分离
我们按照已述流程(23)小规模分离了脂聚糖。简言之，于50℃在氯仿∶甲醇∶水(10∶10∶3)中萃取来自OD 1.0(或者在低OD培养物的情况下为0.4-0.5)的培养物的50mg细胞(湿重)30分钟。然后用缓冲液饱和苯酚80℃孵育沉淀2小时，并用等体积的氯仿萃取。收集水相，并对水透析。
SDS-PAGE和凝胶内凝集素印迹(凝胶内Western)
在无积层胶的12％SDS-PAGE凝胶上分析脂聚糖样品(衍生自10mg细胞)，然后进行过碘酸希夫染色(48)。通过在封闭缓冲液(In-gel westernkit，Westburg，Leusden，荷兰)中孵育凝胶1小时，然后用偶联至Alexa-633(按照厂家的说明，Molecular Probes)的Cyanovirin-N(NIH，Bethesda的O’Keefe博士惠赠)在凝集素缓冲液中4℃孵育过夜来进行凝胶内Western。尝试了更短的孵育时间，但产生非常低的信号强度。在凝集素缓冲液中充分洗涤凝胶1小时，用Odyssey Infrared Imaging System(Westburg，Leusden，荷兰)在700nm显示，并以灰度等级产生读出值。
牛分枝杆菌BCG及分离的LM和LAM样品的DSA-FACE分析
通过在10μl 10mM HCl中煮沸它们5分钟来对脂聚糖样品进行温和酸水解，然后用等体积的10mM NaOH中和。我们按之前已述(46)用多孔石墨化炭黑(Nu-tip)吸头(SunChrom GmbH，Friedrichsdorf，德国)对样品进行了脱盐。我们对脱盐样品进行了真空蒸发，然后用APTS标记，然后通过已述ABI 3130DNA测序仪(Applied Biosystems，Foster City，美国)上的毛细管电泳(30)来分析。然后在以下中37℃过夜消化1.0μl APTS标记的样品：0.1μl 100mM乙酸铵缓冲液(pH 5.0)、6ng重组里氏木霉α-1，2-甘露糖苷酶，用milli-Q水补足体积至2μl。然后通过以上毛细管电泳来分析样品。
脂质萃取和分枝菌酸的薄层层析分析
我们在37℃培养分枝杆菌菌株(在存在含0.05％Tween 80的Middlebrook 7H9培养液(Difco)和含适当抗生素(野生型：100μg/ml链霉素；突变体：100μg/ml链霉素和50μg/ml卡那霉素)的10％ADC(Difco)的情况下培养5ml至OD600nm为0.4)。此时向培养物中加入1μCi/ml[1，2-14C]乙酸盐(57mCi/mmol，GE Healthcare，AmershamBioscience)，并进一步在37℃孵育24小时。2000×g离心收获[14C]标记的细胞，用PBS洗涤，并按下文所述处理。
我们首先将[14C]标记的细胞重悬在CH3OH/0.3％NaCl(2ml，100∶10，v/v)中，并使它们与1ml石油醚(60-80℃)混合15分钟。取出上面的石油醚层，再加入1ml石油醚，然后再混合15分钟。组合石油醚萃取物，并用加热块在氮气下蒸发。将干燥的非极性脂质萃取物重悬在200μlCH2Cl2中，然后进行薄层层析(TLC)和放射自显影。通过向下面的甲醇盐水相中加入CHCl3/CH3OH/0.3％NaCl(2.3ml，9∶10∶3，v/v/v)并混合1小时来萃取极性脂质。离心混合物，并用CHCl3/CH3OH/0.3％NaCl(750μl，5∶10∶4，v/v/v)再萃取沉淀两次。向组合的萃取物中加入CHCl3(1.3ml)和0.3％NaCl(1.3ml)并离心混合物。回收并干燥包含极性脂质的下层。将极性脂质萃取物重悬在CHCl3/CH3OH(2∶1，v/v)中。我们将非极性和极性脂质萃取物(各50,000cpm)应用于硅胶60F254(Merck 5554)TLC平板的6.6×6.6cm平板的角落。在一系列设计用于覆盖所述脂质极性的整个范围的溶剂系统中显色平板。对于非极性脂质萃取物，这些系统称为系统A-D，对极性脂质萃取物为系统E。系统A TLC在方向1(石油醚60-80∶乙酸乙酯98∶2)运行三次，在方向2(石油醚60-80∶丙酮98∶2)运行1次。系统B TLC在方向1(石油醚60-80∶丙酮92∶8)运行3次，在方向2(甲苯∶丙酮95∶5)运行1次。系统C、D和E TLC在各方向运行1次，对于系统C，第一方向使用CHCl3∶CH3OH(96∶4)，第二方向使用甲苯∶丙酮(80∶20)，对于系统D，第一方向使用CHCl3∶CH3OH∶H2O(100∶14∶0.8)，第二方向使用氯仿∶丙酮∶CH3OH∶H2O(50∶60∶2.5∶3)，对于系统E，第一方向使用CHCl3∶CH3OH∶H2O(60∶30∶6)，第二方向使用CHCl3∶乙酸∶CH3OH∶H2O(40∶25∶3∶6)。使Kodak X-Omat AR胶片过夜暴露于平板来产生放射自显影图，以显示[14C]标记的非极性和极性脂质。对于分枝菌酸甲酯(MAME)的萃取，用5％水性TBAH在100℃过夜碱水解来自5ml培养物的脱脂细胞，然后加入4ml CH2Cl2、500μl CH3I、2ml水，然后混合30分钟。离心后吸弃上面的水相，用水洗涤下面的有机相3次，并蒸发至干燥。将得到的MAME溶解在乙醚中，通过离心去除不可溶性残余物，蒸发醚溶液至干燥，再溶解在200μl CH2Cl2中。用硅胶平板(5735硅胶60F254；Merck)对等体积(5μl)的得到的MAME溶液进行TLC，在石油醚-丙酮(95∶5)中显色。通过使Kodak X-Omat AR胶片过夜暴露于平板来产生放射自显影图，以显示[14C]标记的MAME。
巨噬细胞
之前已描述了鼠巨噬细胞克隆Mf4/4的分离和常规培养(Desmedt等，1998)。将细胞培养在添加了10％胎牛血清、L-谷氨酰胺(0.03％)、0.4mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸和50μM β-巯基乙醇的RPMI 1640培养基中。
骨髓衍生树突细胞的产生
在DC培养基(含GlutaMAX-I的RPMI 1640，添加了5％(体积/体积)FCS、50μM β-巯基乙醇和20ng/mL GM-CSF(自制))中培养骨髓细胞8天。
实验动物
雌性C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠购自Janvier(法国)，并居住在微分隔单元中的无特定病原体的条件下。开始实验时使用7-8周龄的动物。所有实验都经Ghent University动物伦理委员会和比利时SIPH批准并按其指导进行。
牛分枝杆菌BCG接种和结核分枝杆菌攻击
用105CFU培养在7H9-OADC培养基上的亲本或突变体牛分枝杆菌BCG菌株皮下接种雌性BALB/c小鼠(30只小鼠/组)。接种BCG后3个月用5.104CFU在液体7H9-OADC培养基上培养了两周的发光结核分枝杆菌H37Rv静脉内攻击小鼠(Tanghe等，2001)。通过发光测定法监测脾和肺中的细菌复制。如文中所示，感染后第2、4和8周处死小鼠(4-5只小鼠/组)。用含1％正葵醛(Sigma)的乙醇作底物，在Turner DesignLuminometer中将发光测量为闪光发射(15秒积分时间)。在此测定中，仅计数活细菌，因为光的发射依赖于还原型黄素单核苷酸(FMNH2)的存在，其是仅见于活细胞中的辅因子。按之前的报道(Romano等，2006)在长期存活实验中监测至少10只其他小鼠/组的体重减轻和死亡率。
脾细胞和肺细胞刺激后的细胞因子产生
6用牛分枝杆菌BCG野生型或突变体静脉内感染BALB/c小鼠(200μl中的106细胞/小鼠，尾静脉中)。感染后4周，通过颈脱位法处死小鼠，并在无菌条件下取出肺和脾。用松散安装的Dounce匀浆器分离细胞，洗涤并调节至2.106细胞/mL的浓度，在圆底微孔板(Nunc)中培养在添加了10％胎牛血清、L-谷氨酰胺(0.03％)、0.4mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸和50μM β-巯基乙醇的RPMI 1640培养基中。用重组Ag85a(5μg/mL；Colorado State University)和合成20聚体肽p11(Ag85A99-118aa，显性CD4T细胞表位(Denis等，1998))按100μL体积对100μL细胞悬液刺激细胞(三个重复)。在增湿CO2培养箱中37℃孵育细胞，72小时后收获上清。上清冻存在-20℃直至测定。通过ELISA测定IFNγ浓度。
巨噬细胞和BMDC结合/摄取分枝杆菌的流式细胞术分析
在24孔板中37℃培养Mf4/4巨噬细胞至感染时达到2×105细胞/孔。按以下用FITC标记对数期牛分枝杆菌BCG野生型和突变体(OD～0.8-1.2)：将细菌沉淀(10mg湿重)重悬在200μL FITC溶液(稀释在0.1M NaHCO3pH 9中的0.1mg/mL FITC异构体1(Sigma Aldrich))中，并在25℃轻轻摇动孵育此细菌悬液1小时。此孵育期后，在PBS中洗涤细菌，直至上清中无残余FITC。分别按10或2的MOI用细菌感染Mf4/4细胞单层或BM-DC，并在37℃孵育所示的时间点。感染后洗涤巨噬细胞，加入新鲜培养基，并进一步在37℃孵育感染的细胞。测量前，用PBS洗涤巨噬细胞2次，并在非酶解离缓冲液(Gibco，Invitrogen NV)中脱附。150×g离心感染的BM-DC 10分钟，并在PBS中洗涤。在配有488nm氩离子激光器的FACScalibur流式细胞仪(Becton Dickinson)上在FL1中测定FITC阳性巨噬细胞/BM-DC的量。
牛分枝杆菌BCG感染巨噬细胞，及存活和吞噬溶酶体融合的评价
按上文所述感染巨噬细胞。测定所示时间点后的CFU数目。为了通过共焦显微术评价吞噬溶酶体形成，用FITC标记的BCG感染细胞。感染后3小时，用Lyso示踪红DND-99(200nM)孵育细胞30分钟。洗涤细胞，然后放置在不含Lysotracker的培养基中。在透射光(非荧光)下随机挑选影像野，每个影像野包含至少20个巨噬细胞。实验细节见下文。
氧化剂活性的测量
用对数期牛分枝杆菌BCG野生型和突变体来感染Mf4/4细胞(MOI10)。在所示的时间点，用PBS洗涤细胞，并用100nM CM-H2DCFDA(Molecular Probes)孵育30分钟。然后，再次在PBS中洗涤细胞，并在配有488nm氩离子激光器的FACScalibur流式细胞仪上分析胞内荧光。
自噬的诱导
为了分析牛分枝杆菌BCG感染巨噬细胞或BM-DC后的自噬，分别按MOI 10或MOI 2用牛分枝杆菌BCG野生型对突变体感染后者4小时或24小时。还按之前已述(Gutierrez等，2004)用雷帕霉素诱导自噬。在NP-40裂解缓冲液(1％NP-40、200mM NaCl、5mM EDTA、10％甘油、10mM Tris-HCl pH 7.5、蛋白酶抑制剂)中裂解细胞。我们在用单克隆抗-LC3抗体克隆5f10(Nanotools，Enzo Life Sciences)和抗-小鼠-HRP(Amersham)显示的Western印迹(17.5％SDS-PAGE)上分析了40μg总蛋白质。
LC3-I(18kD)、LC3-II(16kD)。
淋巴结DC运输和激活
用含1.106CFU牛分枝杆菌BCG野生型和牛分枝杆菌BCG SapM突变体的100μL PBS在尾根处皮下感染8周龄雌性Balb/cJ小鼠(Janvier，法国)(5只小鼠/组)。感染后第1天和第7天，每组处死5只小鼠；在无菌条件下取出腹股沟淋巴结和肱/腋淋巴结，并在含1％胶原酶的RMPI中匀浆(RT摇动45分钟)。制备细胞，用CD11c-APC、MHCII-FITC、CD80-V450、CD40-PE、CD8a-PerCP、CD86-PE-Cy7标记，并在LSRII流式细胞仪(BDTM)上分析。用FACSdiva软件进行分析。
统计分析
对于统计分析，将以milliRelative Light Units(mRLU)获得的结果转化为平均log10mRLU/器官。用Kaplan-Meier的方法和4.0版Prism(GraphPad)中的Logrank检验来分析存活数据。按所示用单因素方差分析或Kruskal-Wallis分析其他数据，然后进行Bonferroni’s多重比较检验或Mann-Whitney U检验。P值＜0.05视为统计上显著。
细胞
用于这些实验中的巨噬细胞衍生自克隆永生化C57BL/6衍生群体，其在功能上和表型上都表达表征成熟巨噬细胞的特征。因此，这些Mf4/4细胞表达已针对成熟巨噬细胞描述的表面分子BM-8、F4/80、Mac-1、Mac-2和CD14；它们可以响应LPS而非IFN-γ来施加受体介导的吞噬，并产生IL-1、IL-6、IL-12和TNF。此外，Mf4/4细胞在用IFN-γ处理后表达提高水平的MHC II类抗原，同时获得将外源抗原呈递至CD4+T细胞的能力。这些特征表明，虽然它们处于转化状态，但Mf4/4细胞保留了它们的巨噬细胞特异性组成型和诱导型功能。我们还可以通过竞争FITC-甘露糖BSA与α-甲基-D-甘露吡喃糖苷的结合来显示甘露糖受体的表达(数据未显示)。
牛分枝杆菌BCG摄取的共焦显微术分析
用FITC标记的牛分枝杆菌BCG感染培养在1孔玻璃底平皿(WillcoWells B.V.，Amsterdam，荷兰)上并用细胞示踪红(cell tracker red，Molecular Probes，10μM终浓度，在无血清培养基中预孵育30分钟)标记的Mf4/4细胞(MOI 10)。37℃3小时后，在Leica TCS sp5AOBS激光扫描倒置DMi6000显微镜上用63x HCX PL APO 1，4NA OIL UV校正物镜获取共焦图像。用MultiArgon激光的488nm线激发FITC，用HeNe的543nm线激发细胞示踪红。进行逐行扫描来排除交叉激发渗透。用各自的发射带宽来检测FITC和细胞示踪红：500nm至540nm，和550nm至700nm。用4×变焦以512×512像素分辨率采集图像，产生123nm的像素大小。以0.26μm的步长记录23个z层。
牛分枝杆菌BCG野生型和突变体感染的巨噬细胞的电子显微镜术
用牛分枝杆菌BCG野生型和突变体感染Mf4/4(MOI 10)3小时。感染后，在PBS中洗涤细胞2次，在含4％多聚甲醛和2.5％戊二醛的0.1M二甲胂酸钠缓冲液pH 7.2中室温(RT)固定4小时，然后4℃过夜(O/N)固定。在缓冲液中洗涤3次20分钟后，通过梯度乙醇系列脱水细胞(包括在50％乙醇步骤用1％乙酸双氧铀进行批染色)，然后包埋在Spurr’s树脂中。用超薄切片机(Leica EM UC6)切下金干涉色的超薄切片，然后在Leica EM AC20中进行乙酸双氧铀和柠檬酸铅后染色，并收集在聚乙烯醇缩甲醛(formvar)包被的铜质狭缝载网上。用透射电子显微镜1010(JEOL，东京，日本)观察它们。
吞噬溶酶体融合的评价
在配有37℃培养室的Leica TCS sp5AOBS激光扫描倒置DMi6000显微镜(Leica Microsystems，Wetzlar，德国)上用63x HCX PL APO 1，4NAOIL UV校正物镜获取共焦图像。用Multi Argon激光的488nm线激发FITC，在500和540nm之间捕获发射光。用543nm HeNe激光线激发Lyso示踪红(Molecular Probes)，在560和620nm之间捕获发射光。总是进行逐行扫描，扫描变焦设为2.0，在巨噬细胞的整个厚度(z轴中)内收集z系列图像堆叠。取决于实验，使用了两种不同的成像设置：在第一(低分辨率)设置中，图像大小为512×512像素，z间隔设为1.0μm，产生240×240×1000nm3体素(voxel)。在第二和第三(高分辨率)成像设置中，以0.25μm的z步长采集1024×1024像素图像，产生120×120×250nm3体素。通过用ImageJ 1.3i无版权成像软件(Abramoff等，2004；Rasband&ImageJ，2008)的JaCoPplugin分析FITC和lyso示踪红间的共定位来评价吞噬溶酶体融合。用设定阈值的Manders，M1系数来测量经历了吞噬溶酶体融合的细菌的量，并定义为“来自在lyso示踪红通道中强度大于0的FITC通道的总和像素强度”与“FITC通道中的总强度”之比(Bolte&Cordelières，2006)。Manders，M1系数的阈值根据图像直方图自动设定，无需用户干预。进行了三个独立的实验，其中每个菌株采集20(第一个实验；低分辨率设置)或10(第二和第三个实验；高分辨率设置)个z系列图像堆叠。
感染小鼠后牛分枝杆菌BCG的复制
用含1.106CFU牛分枝杆菌BCG野生型和突变体的200μL PBS静脉内感染8周龄雌性Balb/cJ小鼠(Janvier，法国)。感染后2周、4周和12周，每组处死5只小鼠；在无菌条件下取出肺和脾，并在PBS中匀浆。制备纯的(neat)1/10和1/500稀释液，用100μl一式两份接种在7H10-OADC琼脂上，并在第21天计数菌落。CFU计数基于显示明显菌落的最高稀释度。
牛分枝杆菌BCG感染小鼠后的肉芽肿形成和细胞因子测量
麻醉C57BL/6小鼠，并用1.106CFU牛分枝杆菌BCG野生型和突变体静脉内感染，或用0.5.106CFU牛分枝杆菌BCG野生型和突变体气管内感染。分别在3和4周后，每组处死5只小鼠，在无菌条件下取出肝和肺，在3.7％多聚甲醛中固定，然后包埋在石蜡中进行薄切。通过苏木精/伊红染色(Merck，VWR international)来检查一般形态和炎症。通过直接镜检和ImageJ软件分析来进行定量研究。感染后4周进行支气管肺泡灌洗(BAL)，按照厂家的说明(BD Biosciences)用Cytometric Bead Array andFlex sets测定BAL液中的细胞因子水平。
牛分枝杆菌BCG野生型对SapM::T感染BM-DC后的细胞因子产生
用牛分枝杆菌BCG野生型对突变体感染BM-DC 6小时。感染后，4℃下150×g离心10分钟收集BM-DC。在PBS中洗涤细胞，恢复培养24小时和48小时。在所示的时间点，取出上清，并通过流式细胞术(BioPlexPro Cytokine Express Assay，Biorad)分析细胞因子的存在。
BM-DC和iNKT杂交瘤的共培养
用牛分枝杆菌BCG野生型对突变体感染野生型和CD1d-/-BM-DC(1.106细胞)24小时。感染后，用PBS洗涤细胞，并将其与iNKT细胞杂交瘤2C12(Brossay等，1998a；Brossay等，1998b)共培养(50.103BM-DC：25.103iNKT)。作为对照，在建立与2C12细胞的共培养之前，用α-GalCer(100ng/mL/1.106细胞)装载BM-DC细胞，并在37℃孵育2小时。在所示的时间点，收集上清，并通过流式细胞术(BioPlex Pro CytokineExpress Assay，Biorad)分析IL-2和IL-12p40的产生。用系列1(CD11c-PerCP-Cy5.5、MHCII-FITC、PD-L1-PE、CD86-PE-Cy7、CD80-V450、CD40-APC)、系列2(CD11c-PerCP-Cy5.5、MHCII-FITC、CD1d-PE)和系列3(CD11c-PerCP-Cy5.5、TCRβ-FITC、CD1d aGalCertetramer-PE、CD69-V450)标记细胞，并在LSRII流式细胞仪(BDTM)上分析。用FACSdiva和Flowjo软件(Tree Star，Inc.)进行分析。
实施例1.牛分枝杆菌BCG突变体的产生和筛选
通过真菌噬菌体传递转座子是用于产生分枝杆菌饱和诱变文库的高效方法(54)。该方法使得可能在适合用于比较不同基因突变的作用的同基因背景中产生多种突变体。转座子插入基因中最常导致其失活，且回复频率通常非常低(47)。还可以用转座子来传递其他标记，如抗生素抗性基因。它还允许转座子位于待扩增并通过测序鉴定的基因组区域侧翼(27)。转座子诱变已成功用于生长快速和生长缓慢的分枝杆菌菌株二者中(1，10，32，51)。在此，我们用通过温度敏感MycomarT7噬菌体传递的Himar1衍生微型转座子(49)产生了96×96个克隆的有序牛分枝杆菌BCG转座子插入突变体文库。
此外，我们研发了此有序文库的基于PCR的筛选来快速鉴定靶向的目的可读框中的插入。通过针对涉及细胞壁成分生物合成或报道为对分枝杆菌毒力重要的基因中的插入筛选文库来验证该系统。
文库构建和排序
在用基于Himar1的mariner转座子和mycomarT7供体噬菌粒(56)(图1A)在牛分枝杆菌BCG中构建有序转座子插入文库中，用牛分枝杆菌BCG 1721(36)(牛分枝杆菌BCG巴斯德的衍生物，携带产生链霉素抗性的非限制性rpsL改变)作为亲本菌株。针对双抗生素抗性(卡那霉素和链霉素)选择突变体。文库产生约100,000个突变体，按之前所述手工挑取了其中的9216个(96×96孔板)来产生有序文库(29)(图1B)。简言之，混合来自96孔板各行的单克隆形成“二级库”(图1B)，将来自此二级库平板各列的整分试样混合入单孔形成“三级库”。由于分枝杆菌聚集，从而通常形成融合菌落的特性，自动克隆挑取将非常困难。认为有必要从平板手工挑取清晰的单克隆来降低混合培养物在有序文库中的频率。牛分枝杆菌BCG的基因组大小为4.4Mb，由于转座子可以在每个TA序列中插入(28)，理论上，预期我们的文库中每～460bp有一个插入。
PCR筛选
我们用杂交至转座子任一端的反向重复的引物和靶基因ORF上游或下游(有时在其中)的基因特异性引物进行了有序文库的PCR筛选(图1C)。为了能够进行有效的PCR筛选，已将文库手工排序入一系列库中。因此，仅需要两轮PCR(先进行96个反应，然后进行8个反应)来鉴定存在希望的突变体的12个克隆的行(图1B)。然后培养这12个克隆，并制备基因组DNA进行最后一轮PCR来鉴定突变体。如果在第一轮PCR中鉴定出产生基因特异性扩增的引物，则整个筛选在约4-5周(该段时间的大部分为培养12个最终的培养物所需)内完成。我们完成了针对19个ORF(基于这些基因中的转座子突变体在通过TRASH分析的结核分枝杆菌文库中的存在注释为并非体外生长必需(55))中的插入的筛选。我们的筛选集中于涉及(Man)LAM生物合成和/或干扰吞噬体-溶酶体融合事件的基因。这些ORF的总筛选大小为～11，120bp。在这些ORF中，我们发现总计22个转座子插入(约1/500bp)，提供19个ORF中的15个中的突变体。毫不奇怪，4个不成功的筛选中的3个是针对3个最小的ORF(小于750bp)的筛选。在此筛选中，引物设计很关键。对于大多数筛选，必须测试几条基因特异性引物来找到产生基因特异性扩增的引物。这主要是由于这一事实，牛分枝杆菌BCG基因组具有非常高的GC含量，平均百分比G+C超过65％(16)。这使得难以设计不在基因组中其他地方非特异性结合的引物。
实施例2.转座子插入突变体的生物化学表征
确认单转座子插入的Southern分析
通过以全长转座子为探针的Southern印迹进一步表征序列确认的突变体来确认单转座子插入在基因组中的存在。为了确保所观察到的突变体表型是由导致目的基因单独失活的转座子插入引起，这是必不可少。除三个突变体(图2A)外，其余所有突变体都显示单转座子插入。
Mb1661c、Mb2203、Mb2196和SapM中的突变体
在我们的文库筛选中，我们针对基因Mb1661c、Mb2203和Mb2196获得了各2个突变体。基因Mb2203和Mb2196的突变体之一在通过Southern印迹分析来分析时显示多个转座子插入，从进一步的使用去除。在基因Mb1661c的两个突变体中，我们决定研究转座子的插入更靠近编码序列(CDS)5’端的突变体，因为靠近CDS的起点更有可能失活其功能性。除ManLAM生物合成中的突变体外，我们还选择了分泌性酸性磷酸酶SapM中的突变体作为对照来评估仅转座子存在可能对细胞壁组成具有的任意影响。对于基因SapM，我们仅获得了1个突变体(表1)。通过用Topo
Figure BDA00001473828200371
Cloning Kit(Invitrogen，美国)克隆通过PCR筛选获得的片段和测序克隆确定转座子插入可读框中的精确位置来确认最终选择的4个突变体中的转座子插入位点(表1)。
表1-在有序牛分枝杆菌BCG转座子插入突变体文库中通过PCR筛选并在此研究中描述的突变体的列表
Figure BDA00001473828200381
突变体显示目的基因转录的强烈降低而SapM中的突变体显示降低的磷酸酶活性
在野生型牛分枝杆菌BCG 1721和突变体上进行了定量实时PCR(qRT-PCR)来比较目的基因的表达水平。从中对数期培养物提取RNA，并用标准流程合成cDNA。以16S rRNA为参考进行Q-PCR。与野生型相比，所有突变体都具有丰度强烈降低的来自突变基因的转录物。可能是由于正好在ORF上游插入，有效地将启动子与ORF分开，SapM突变体几乎没有可检测到的SapM基因转录(图2B)。还通过与野生型培养物上清中的磷酸酶活性相比，牛分枝杆菌BCG SapM::T培养物上清中降低的磷酸酶活性确认了SapM的失活(图2C)。SapM突变体上清中的残余磷酸酶活性还可以由其他磷酸酶的存在引起(3，9)。
突变体具有未改变的超微结构和体外生长速率
由于LAM分子形成细胞壁的部分(它锚着在细胞膜中，并伸展通过内侧和外侧细胞壁进入荚膜)，我们想评估LAM生物合成中的突变体与野生型相比是否显示细胞壁超微结构的差异。但是，染色来增强细胞壁中极性脂质和多糖的对比的薄切片的电子显微镜术证明，细胞壁超微结构中不存在明显差异(数据未显示)。如在生长曲线分析中所观察，突变体也未在液体培养基中显示生长迟缓(图3A)。但是，在固体培养基上培养时，我们确实在突变体Mb1661c中观察到轻微的生长迟缓(数据未显示)。虽然所有培养物都以相同的速率生长，但在我们的静置培养条件下，倍增时间随时间和培养物密度增加(图3B)。在达到1-1.2的OD前，倍增时间为约20-24小时，其后倍增时间稳步增加至更高OD(～6)下的48-96小时(对于突变体以及野生型)
Cyanovirin-N染色和DSA-FACE分析显示Mb2203和Mb1661c突变体中α-1，2-甘露糖帽结构的差异
我们用特异性结合寡聚-α-1，2-甘露糖结构的Cyanovirin-N凝集素通过流式细胞术分析了α-1，2-寡聚-甘露糖基糖表位(glycotope)的密度(60)。作为结合特异性对照，还在凝集素染色前用重组α-1，2-甘露糖苷酶处理了分枝杆菌细胞。与野生型相比，Mb1661c和Mb2203中的突变体显示更低的染色，表明这些突变体展示更少的α-1，2-甘露糖连接(数据未显示)。SapM和Mb2196中的突变体显示与野生型相似的染色谱，表明它们在其细胞壁结构中具有相似水平的α-1，2-寡聚甘露糖苷连接。以下观察结果强化了这些结果：用α-1，2-甘露糖苷酶处理野生型菌株或SapM或Mb2196突变体时，它在随后的Cyanovirin-N染色中显示降低(数据未显示)。在突变体Mb1661c::T和Mb2203::T中未观察到此降低。这表明，野生型菌株具有酶可作用的α-1，2-甘露糖连接，但突变体Mb1661c::T和Mb2203::T不具有。
为了评估Mb1661c::T和Mb2203::T中降低的Cyanovirin-N染色是否反映在ManLAM帽化结构中，用DNA测序仪辅助荧光团辅助糖类电泳(DSA-FACE)(31)研究了ManLAM的帽结构。我们用萃取法从细胞分离了脂聚糖级分，该方法可以以小规模进行，且产生所有脂聚糖种类，而不是只产生ManLAM，使得它更适合用于可以在ManLAM的精确结构中受影响的突变体的比较分析。这样获得的制备物纯度低于通过漫长、非常具有选择性的方法(62)纯化的标准ManLAM，但具有使得能够进行更广泛的脂聚糖谱分析的益处。此分离后，我们进行了脂聚糖的温和酸水解，其导致对酸敏感的α-1，5-araf连接水解，而α-1，2-和α-1，6-甘露糖连接是酸稳定的，因此不水解(41)。这导致ManLAM的α-1，2-寡聚甘露糖苷帽化的末端结构的释放。在α-1，2-甘露糖苷酶消化之前和之后分析了这些样品。对于野生型及突变体SapM::T和Mb2196::T，几个峰对α-1，2-甘露糖苷酶消化敏感(数据未显示)。这些峰具有与高度纯化的标准ManLAM的谱中的α-1，2-甘露糖苷酶敏感峰相同的迁移率，将它们鉴定为包含此分子的耐酸片段的α-1，2-甘露糖帽。大小减少一个或两个己糖单元对应于从这些ManLAM片段去除一个或两个α-1，2-甘露糖残基。在突变体Mb2203::T中，未发现这类α-1，2-甘露糖苷酶敏感结构，相反，发现始终与野生型的α-1，2-甘露糖苷酶后谱相同的谱。对于Mb1661c::T，发现α-1，2-甘露糖苷酶敏感结构的水平比野生型、SapM::T或Mb2196::T中低。但是，这些结构仍然存在，表明一定存在另一尚待鉴定的甘露糖基转移酶，其正好可以部分弥补Mb1661c突变。令人惊奇地，观察到有规律的峰系列，具有泊松样强度分布，具有增加的聚合度。这暗示寡糖分析中常用作大小标准的α-葡聚糖酸水解产物(数据未显示)。事实上，我们通过淀粉葡糖苷酶消化确认，这是α-1，4连接的葡萄糖-寡糖梯。已报道这种葡聚糖是分枝杆菌细胞壁荚膜层的主要组分(44)。因此，我们的样品制备方法可能导致部分此葡聚糖的共纯化。事实上，它的存在允许估计ManLAM衍生寡糖在来自不同突变体的制备物中的相对丰度。因此，我们将我们的cyanovirin配体在分枝杆菌细胞壁上的丰度较低的发现解释为较低的ManLAM丰度和较低但并非绝对缺乏合成寡聚-α-1，2-甘露糖基帽结构二者的复合结果。
突变体不显示包含细胞壁阿拉伯聚糖的成分的差异
单克隆抗体CS-35特异性结合α-1，5连接的阿拉伯呋喃糖苷(araf)(22)。此糖表位存在于LAM分子的阿拉伯聚糖侧链中和阿拉伯半乳聚糖中。因此，用此抗体染色将产生关于突变体中细胞壁阿拉伯聚糖含量改变的一些信息。所有突变体的使用CS-35抗体的流式细胞术谱未显示与野生型谱的差异(数据未显示)。
突变体Mb1661c::T和Mb2203::T展示更低分子量和结合noncyanovirin-N的LAM
为了测定来自突变体的LAM和LM在与野生型相比时的大小，进行了来自突变体对野生型的纯化脂聚糖样品的SDS-PAGE分析(数据未显示)。分析显示，突变体Mb1661c::T和Mb2203::T具有尺寸更小的LAM，而Mb2203::T LAM最小。来自突变体SapM::T和Mb2196::T的LAM的大小与野生型的大小相同。可能除Mb2203::T突变体外，来自所有样品的LM都显示具有相同的大小，Mb2203::T突变体的LM显得更大。用凝集素Cyanovirin-N-Alexa-633进行了这些LAM样品上的凝胶内Western(数据未显示)。结果显示，凝集素结合野生型LAM和来自突变体SapM::T的LAM，但它不结合来自三种LAM突变体的LAM样品，表明这些突变体缺乏凝集素在这些条件下结合的基序。
来自低OD培养物的LAM的分析
文献中描述的使用分枝杆菌的体外和体内感染研究通常都用在中对数期早期生长的OD 0.3-0.6(本文中称为低OD)的培养物进行。以上观察的生物化学分析中的大部分用在OD6001.0生长的培养物进行。我们观察到，此培养密度下的细胞具有比低OD下高的巨噬细胞体外感染效率。我们想分析在低OD6000.5下生长的培养物和培养至OD6001.0的那些培养物间的LAM含量差异(如果存在)。为了这样做，我们从同一甘油原种培养培养物至两个不同的OD，分离脂聚糖，并在SDS-PAGE后进行银-PAS染色来分析它们。我们观察到，在低OD下，产生的LAM的量明显低于分离自较高OD下的细胞的量(数据未显示)。我们还在低OD下观察到LM/LAM前体PIM以更大的量存在。我们未在来自OD6001.0的培养物的脂聚糖样品中观察到任何PIM。这表明从前体PIM合成LAM仅在细胞更缓慢地分裂时有效地发生，如我们的OD6001.0的培养条件中所发生。LAM含量的差异可以解释感染效率的差异，因为ManLAM与巨噬细胞甘露糖受体的相互作用是细菌的重要进入途径之一(58)。
ManLAM生物合成突变体不显示细胞壁脂质组成的差异
如之前所述，分枝杆菌胞外被膜对其毒力很重要，由肽聚糖/阿拉伯半乳聚糖/分枝菌酸核心组成，该核心与极性从非极性三酰甘油(TAG)和分支菌蜡dimycocerosates(PDIM)至极性糖脂和脂寡糖变动的复合脂相互作用(40)。我们通过双向薄层层析分析了来自牛分枝杆菌BCG野生型及其ManLAM生物合成突变体的非极性和极性脂质。用SapM突变体作为对照来评估仅转座子存在可能具有的任意影响。在设计用于覆盖脂质极性的整个范围的一系列溶剂系统中显示平板(数据未显示)。从脱脂细胞萃取分枝菌酸甲酯(MAME)，同样在TLC上分析(数据未显示)。我们未在野生型分枝杆菌BCG和突变体间观察到脂质组成的任何差异，表明ManLAM生物合成基因的转座子诱变导致此分子的选择性缺损，既不从根本上改变其他细胞壁组分的生物合成，也不改变细胞壁脂质组成。
讨论
许多途径涉及辅助致病分枝杆菌甚至在存在精细免疫应答的情况下在宿主中成功存活(7)。此存活策略的一个重要方面是细菌抑制巨噬细胞吞噬体成熟。在改善的TB疫苗设计的背景中，涉及例如吞噬体成熟抑制的毒力因子的失活是有吸引力的策略。由于目前唯一获批的TB疫苗是牛分枝杆菌BCG，为了快速评价这类突变对靶途径及对免疫原性的影响，我们选择建立快速系统来在牛分枝杆菌BCG中获得突变体。此外，在从毒性牛分枝杆菌衍生BCG菌株中发生的缺失已失活了涉及阻断吞噬体-溶酶体融合的途径之一(2，61)，使得涉及此过程的其他途径中的突变更有可能在此背景中产生比在结核分枝杆菌或牛分枝杆菌中明显的表型，因为预期具有更少的表型互补。此外，疫苗株在遗传学(99.9％)和生理学上与结核分枝杆菌非常相似，同时具有对有免疫能力的人类不致病的优势，从而允许其在标准生物安全条件下的操作。这使得可快速筛选的突变体标本收藏(collection)成为更广的TB研究团体的非常有用的资源。由于所有这些原因，我们在牛分枝杆菌BCG背景中产生了约100,000个突变体的转座子插入文库，手工挑取其中的96×96个克隆，并混合形成有序文库。在基因并非体外生长必需的情况下，这使得能够针对任意目的基因中的突变体对文库进行快速和有效的PCR筛选。我们针对我们所筛选的大多数基因(19个中的15个)获得了突变体。针对其他几个基因的筛选目前正在进行中。为了验证此方法，我们筛选了涉及ManLAM生物合成途径的基因中的突变体，ManLAM是已知促进结核病理的主要方面的分子(6，63)。我们还筛选了分泌性酸性磷酸酶SapM中的突变体，SapM也疑似对巨噬细胞内存活重要(64)。对于ManLAM突变体的生物化学表征，用PI3P磷酸酶SapM中的突变体作为对照来排除仅存在转座子可能对脂聚糖生物合成具有的任意影响。基于它们在结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌中的直向同源物的分析(12，21)，预测基因Mb1661c和Mb2203是涉及ManLAM修饰(聚-α-1，6-甘露糖基主链中或末端帽结构上)的α-1，2-甘露糖基转移酶。目前的理解是，在生长缓慢的致病分枝杆菌中，Mb1661c主要负责加入帽结构中的第一个α-1，2-甘露糖残基，而Mb2203编码的酶合成二甘露糖基帽(且还可以将它们延长至三甘露糖苷)(24)。但是，在报道Mb1661c同源物在结核分枝杆菌中的功能的研究中，注意到敲除菌株中每个细胞的ManLAM水平比野生型中低约10倍(11)，表明此突变对LAM生物合成具有更深远的影响，不仅仅影响ManLAM帽化。与此一致，我们发现Mb2203::T和Mb1661c::T突变体都具有强烈降低的细胞表面α-1，2-寡聚甘露糖苷丰度，但这不同地反映在直接化学脂聚糖分析中。Mb2203失活产生明显的二甘露糖苷和三甘露糖苷帽合成缺损，而Mb1661c失活导致强烈降低的帽丰度，同时保留的帽仍具有完整结构，很可能是由于另一尚待鉴定的转移酶部分弥补了该缺损。显然，Mb2203::T突变体在ManLAM的α-1，2-寡聚甘露糖基帽化中更特异地受影响，因此更适合用于分析这些帽在分枝杆菌病理中的作用。迄今仅在生长快速的非致病物种耻垢分枝杆菌中表征了Mb2196的直向同源物，其中它的突变导致截短LM的累积和LAM的缺乏(23)。就Cyanovirin-N细胞壁染色和脂聚糖大小分析而言，我们的牛分枝杆菌BCG中的突变体Mb2196::T完全展示野生型行为。在脂聚糖萃取物的酸水解产物的聚糖分析中，ManLAM帽结构丰度低于野生型，但不如Mb1661s突变体明显。这与所报道的同源基因在耻垢分枝杆菌中的功能部分不一致(预期无LAM合成可以是事实，预期截短LM的累积在此不是事实)。所发现的与野生型的另一差异是，Mb2196::T突变体的ManLAM在SDS-PAGE条件下不着色Cyanovirin-N。我们推测这可以是由于α-1，2-寡聚甘露糖苷帽沿该分子定位的精细改变。Cyanovirin-N以高亲和力同时结合N-聚糖的几个α-1，2-寡聚甘露糖苷分枝(60)，但与单个分枝的结合较弱。因此，可以是这样，在SDS-PAGE条件下，Mb2196ManLAM未正确构成来进行高亲和力结合。需要进行进一步分析，但显然，Mb2196突变在牛分枝杆菌BCG中比在耻垢分枝杆菌中导致更精细的脂聚糖合成表型。它还表明，最好在生长缓慢的结核分枝杆菌复合群菌株中验证在病理中具有潜在重要性的途径，在这方面，我们的易于筛选的牛分枝杆菌BCG突变体文库是有效的工具。总之，带着改善用目前唯一可得的疫苗(牛分枝杆菌BCG)预防结核获得的亚适保护的希望，可筛选的牛分枝杆菌BCG中的突变体标本收藏允许快速鉴定和表征目的突变体，例如突变对BCG疫苗效力的影响。
实施例3.牛分枝杆菌BCG野生型对突变体SapM::T(Mb3338::T)、Mb2203::T、Mb1661c::T和Mb2196::T在BALB/c小鼠中的保护功效
用105CFU的亲本或突变体牛分枝杆菌BCG菌株皮下接种BALB/c小鼠。接种后3个月，用5.104CFU的发光结核分枝杆菌H37Rv静脉内感染动物。感染后2、4和8周处死小鼠，通过发光测定法测定脾和肺中的细菌数。与未接种的TB感染小鼠相比，脾和肺中减少10至100倍的细菌数目表明，亲本和三个突变体BCG菌株都提供显著的针对结核分枝杆菌的保护(Mb2196突变体目前正在此背景中进行测试，尚未包含在内)(图4A和图5)。在脾中，亲本和突变体菌株间不存在功效的差异(图5)，而在肺中，感染后8周发现接种SapM::T突变体的小鼠中的细菌数显著低于接种亲本BCG的小鼠中的细菌数(图4A)。值得注意的是，感染后8周，亲本BCG的保护功效开始降低，而全部三种突变体的细菌计数保持稳定。
还在长期存活研究中跟踪了小鼠11个月，并每周监测死亡率和体重减轻。与未接种的小鼠相比，接种ManLAM帽化突变体(P＜0.05)和SapM::T突变体(P＜0.005)都导致显著更长的存活，而接种亲本BCG则不然。此外，接种SapM::T突变体的小鼠存活显著比接种亲本BCG的小鼠长(SapM::T突变体的中位存活时间为32周，cfr接种亲本BCG的小鼠中为26.5周，P＝0.0145)(图4B-C)。
应指出，还在此背景中测试了Mb2196::T突变体，并观察到显著更长的存活，存活时间在ManLAM帽化突变体和SapM::T突变体之间(图4D)。与仅用TB感染的小鼠相比，接种所有BCG菌株都延迟了恶病质的出现。TB感染的小鼠在感染后约15周开始显示体重减轻，接种BCG的动物保持其最初的体重长约10周。随后，接种BCG的小鼠中也发展恶病质，与存活的情况一样，接种Mb1661c::T、2196::T和SapM::T突变体的小鼠显示最小的平均体重减少(图4E)。
我们随后检验了接种后3个月用气管内感染代替静脉内感染是否可以确认结果。感染后4和8周测定了脾和肺中的细菌数。我们可以清楚地看到，与未接种的TB感染小鼠相比，脾和肺中减少10至100倍的细菌数目显示，亲本和全部四种突变体BCG菌株都提供显著的针对结核分枝杆菌的保护。感染后8周在脾和肺中都发现了接种SapM::T突变体的小鼠中的细菌数显著低于接种亲本BCG的小鼠中的细菌数(图4F-G)。
接种后4周，我们还通过比较肺细胞和脾细胞的抗原特异性干扰素(IFN)-γ产生来评估T细胞免疫(图6)。在来自接种牛分枝杆菌BCG野生型和SapM基因座突变体的BALB/c小鼠的脾细胞和肺细胞培养物上清中都可以测量到响应recAg85A(Rv3804c)和合成20聚体肽p11(Ag85A99-118aa，，显性CD4T细胞表位(Denis等，1998))的显著的IFNγ产生，显示明显的Th1应答。与来自接种牛分枝杆菌BCG的小鼠的肺细胞相比，来自接种牛分枝杆菌BCG SapM::T的小鼠的肺细胞响应p11诱导更低的IFN-γ水平。未在来自接种牛分枝杆菌BCG野生型对突变体的小鼠的脾细胞间观察到显著差异。未接种的小鼠只产生最小量的IFNγ。
突变对巨噬细胞和树突细胞的摄取的影响
由于已将ManLAM帽化和SapM描述为涉及分枝杆菌的摄取(Briken等，2004；Torrelles等，2006)和/或吞噬体-溶酶体融合的阻断(Vergne等，2005)，我们研究了这些途径是否确实受所研究的突变影响，并因此促成所观察到的改善的保护。为了研究SapM基因座破坏或ManLAM帽化缺乏对分枝杆菌的结合和吞噬效率的影响，用FITC标记牛分枝杆菌BCG野生型和突变体，并通过流式细胞术分析了鼠巨噬细胞的摄取。FITC阳性巨噬细胞的百分比是有多少巨噬细胞已结合或摄取了FITC标记的分枝杆菌的指示。我们可以显示，鼠巨噬细胞相似地摄取野生型牛分枝杆菌BCG、SapM::T和帽化突变体(感染后6小时～60-70％FITC阳性巨噬细胞；图7A)。共焦显微术和电子显微镜术分析表明，分枝杆菌被巨噬细胞摄取，而不是仅仅附着于细胞表面(数据未显示)。通过计算平均FITC强度，我们还显示巨噬细胞在所测试的所有条件中都摄取相似量的细菌(图7A)。我们得出结论，SapM基因座破坏和ManLAM帽化缺乏都不强烈影响巨噬细胞对细菌的结合和摄取。
类似地，我们分析了骨髓衍生树突细胞(BM-DC)对亲本牛分枝杆菌BCG和SapM::T突变体的摄取。我们可以显示，鼠DC相似地摄取野生型牛分枝杆菌BCG和SapM::T突变体(感染后24小时～25％FITC阳性DC；图7B)。可比较的平均FITC强度显示，DC在所测试的两种条件中都摄取相似量的细菌，表明SapM基因座破坏和ManLAM帽化缺乏都不强烈影响树突细胞对细菌的摄取。
突变对吞噬体-溶酶体融合的影响
认为ManLAM对感染的巨噬细胞中吞噬溶酶体融合的抑制是分枝杆菌毒力的标志(Fratti等，2003；Hmama等，2004；Kang等，2005；Vergne等，2003)。已显示结核分枝杆菌PI3P磷酸酶为降低吞噬体PI3P水平和抑制包含活分枝杆菌的吞噬体成熟所需(Vergne等，2005)。为了确定牛分枝杆菌BCG突变体(SapM::T、Mb2203::T和Mb1661c::T)是否在巨噬细胞吞噬体成熟中受影响，我们进行了共定位实验。因此，用FITC标记的牛分枝杆菌BCG感染巨噬细胞，随后用Lyso示踪红标记。通过共焦显微术检查了包含BCG的吞噬体与溶酶体的共定位(图7C)。未在亲本菌株和突变体感染的巨噬细胞之间观察到包含FITC的吞噬体与溶酶体的共定位的显著性差异。通过分析Mb2203::T、Mb1661c::T和SapM::T突变体在巨噬细胞中的存活确认了这些发现。在感染后48小时的时间内，与野生型相比，牛分枝杆菌BCG突变体在Mf4/4巨噬细胞中的存活和复制无显著性差异(图7D)。突变体BCG菌株改善的保护功效与改变的摄取或在体外巨噬细胞内的存活不相关。
牛分枝杆菌BCG野生型对突变体感染后的氧化剂活性
分枝杆菌在巨噬细胞的有害环境内存活的能力还取决于它们清除活性氧类别(ROS)的能力。最近显示，可以通过降低细菌抗氧化剂的活性和分泌来增强牛分枝杆菌BCG的免疫原性(Sadagopal等，2009)。因此，我们利用二氢-二氯-荧光素二乙酯(CM-H2DCFDA)比较了牛分枝杆菌BCG野生型对突变体感染巨噬细胞后的胞内ROS产生，CM-H2DCFDA是ROS的细胞透膜体指示剂，其在通过胞内酯酶去除乙酸基并在细胞内发生氧化后才具有荧光。我们在感染后的时间内记录到ROS产生的增加(图8)，但未在牛分枝杆菌BCG野生型和所测试的突变体间观察到显著性差异。
突变对牛分枝杆菌BCG感染后巨噬细胞和BM-DC中自噬的诱导的影响
最近表明，自噬(细胞维持和生存必需的大量蛋白质和细胞器降解过程)可以通过增加小鼠树突细胞中的抗原呈递来增强BCG作为疫苗的功效(Jagannath等，2009)。微管相关蛋白质1轻链3(LC3)(酵母Atg8的哺乳动物同源物)涉及自噬过程中的自噬体形成。跟踪LC3-I向LC3-II的转化是自噬活性的指示。LC3-II的量良好地与自噬体的数目相关。牛分枝杆菌BCG野生型对突变体感染巨噬细胞和BM-DC后用LC3的此特征性转化来监测自噬活性。我们未在所测试的野生型对突变体BCG中观察到向LC3-II转化的任何差异(数据未显示)，表明改善的疫苗功效不可归因于所测试的抗原呈递细胞(APC)中更高的自噬诱导程度。
对淋巴结DC运输和激活的影响
树突细胞具有从抗原摄取部位迁移至淋巴器官，从而起始适应性免疫应答的特性。DC运输至淋巴结和/或激活的差异可以对最终免疫结果具有重要影响。在此背景中，我们评价了用亲本牛分枝杆菌BCG对SapM基因座突变体接种小鼠的作用。因此，用106CFU的亲本或牛分枝杆菌BCG
SapM突变体菌株皮下感染BALB/c小鼠。感染后第1天和第7天处死小鼠，通过流式细胞术检查了DC在腹股沟淋巴结和肱/腋淋巴结中的浸润及它们的激活状态。感染后第7天，与对照和牛分枝杆菌BCG WT感染的小鼠相比，可以在来自牛分枝杆菌BCG SapM突变体感染的小鼠的腹股沟(图9A-B)淋巴结和肱/腋淋巴结(数据未显示)中观察到CD11c+DC的量明显减少。感染后第1天，与牛分枝杆菌BCG WT感染的小鼠相比，牛分枝杆菌BCG SapM感染的小鼠中CD40+MHC-IIlo/med CD8α-DC的量已经上升，感染后第7天也可以观察到该差异(图9C)。降低的MHC-II表达指引流淋巴结中减少的驻留DC量。除接种牛分枝杆菌BCG SapM后增加的DC向引流淋巴结的募集外，DC还显示增加的CD80和CD86的表达，表明改善的激活(图9D)。因此，我们可以得出结论，接种牛分枝杆菌SapM基因座突变体增加了DC向淋巴结的募集和它们的激活，其因此可以导致增加的抗原呈递和T细胞激活。
突变对牛分枝杆菌BCG在感染小鼠中的细菌复制的影响
用牛分枝杆菌BCG和牛分枝杆菌BCG突变体(Mb2203::T、Mb1661c::T和SapM::T)静脉内感染BALB/c小鼠。感染后第2、4和12周测定肺和脾中的细菌接种量。感染后2周，可以在肺中测量到与突变体相比略高的亲本菌株计数。感染后4周，突变体在肺和脾中达到与野生型牛分枝杆菌BCG细胞相似的CFU数目(图10A-B)。总体上，肺和脾中的细菌数目随时间减少，表明清除。
突变对体内细胞因子产生和肉芽肿形成的影响
尘细胞摄取结核分枝杆菌通常导致由IL-12、IFNγ和TNF的产生介导的局部炎症反应(van Crevel等，2002)。此反应最终导致肉芽肿形成(Cooper等，1993；Dalton等，1993；Kamijo等，1993；Kindle等，1989)。进行性肉芽肿形成是慢性分支杆菌感染的标志，其伴随着部分转变为Th2型免疫(Harris等，2008；Jiao等，2003；Orme等，1993；Rhodes等，2000)。因此，我们研究了改变的(Man)LAM结构或P13P磷酸酶SapM的失活对肺中局部炎症反应的影响。用牛分枝杆菌BCG野生型或突变体气管内灌输(instill)C57BL/6小鼠，感染后4周在支气管肺泡灌洗(BAL)中定量IFNγ、TNF、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10或ILS212p70水平。
我们可以检测到IFN-γ和TNF的产生，但不能测量到IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10或IL-12p70，或可以测量到非常低的量。野生型对突变体BCG感染后未观察到肺中引出的细胞因子反应的显著性差异(图10C，表2)。
平均值
  细胞因子   PBS   野生型   1661c   2203   SapM
  IFNγ   0.06   96.45   84.86   146.86   116.80
  TNF   0.00   102.53   123.73   145.83   106.53
  IL-2   0.10   0.86   1.34   0.89   0.79
  IL-4   0.18   0.83   0.67   0.17   0.20
  IL-5   0.09   1.03   1.11   0.29   0.43
  IL-6   0.28   11.50   5.43   7.09   4.18
  IL-10   13.29   4.65   3.71   5.78   4.07
  IL-12p70   0.48   0.65   1.15   0.77   0.17
SEM
  细胞因子   PBS   野生型   1661c   2203   SapM
  IFNγ   0.03   22.10   21.00   47.34   28.17
  TNF   0.00   33.43   32.97   46.01   26.34
  IL-2   0.05   0.38   0.45   0.30   0.29
  IL-4   0.13   0.48   0.37   0.08   0.14
  IL-5   0.09   0.55   0.43   0.15   0.31
  IL-6   0.19   2.85   1.78   2.35   0.83
  IL-10   2.34   2.18   1.21   1.33   1.26
  IL-12p70   0.25   0.28   0.63   0.35   0.17
范围
表2：用牛分枝杆菌BCG野生型对突变体感染小鼠后BALF中的细胞因子测量
我们还检查了突变对牛分枝杆菌BCG诱导的保护性肉芽肿形成的影响。用牛分枝杆菌BCG野生型对突变体静脉内感染或气管内灌输C57BL/6小鼠。感染后3周和4周分别取出肝和肺。这些器官的石蜡切片上的苏木精-伊红染色允许显示和计数肉芽肿。与牛分枝杆菌BCG野生型和SapM::T感染的小鼠相比，Mb1661c::T和Mb2203::T感染的小鼠的肝显示略低的肉芽肿数目(图10D)。但是，评价肉芽肿的大小后，我们观察到，与SapM::T或野生型感染的小鼠的肝中发生的情况相比，用这些突变体感染看起来诱导形成略大的肉芽肿(数据未显示)。
牛分枝杆菌BCG野生型对SapM::T感染BM-DC后的细胞因子产生
鉴于SapM::T突变体感染小鼠后增加的DC向引流淋巴结的募集和/或在引流淋巴结中的激活，我们分析了体外感染BM-DC后的细胞因子产生。用牛分枝杆菌BCG野生型对SapM::T感染BM-DC所示的时间点，在该时间点取上清来测定IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p40、IFNγ、TNFα的水平。我们未检测到显著水平的IL-2、IL-4、IL-10或IFNγ，但确实观察到与野生型相比，用牛分枝杆菌BCG SapM::T感染后增加的IL-1β、IL-6、IL-12p40和TNFα产生(图11)，表明增加的促炎症反应。
SapM::T突变对iNKT细胞激活的影响
尚未清楚描绘非MHC限制T细胞在TB中的作用。包括结核分枝杆菌的多种病原体常激活γδT细胞。用毒性结核分枝杆菌静脉内攻击后，缺乏γδT细胞的小鼠比对照小鼠更快死亡，而在感染经气溶胶途径发生时未观察到此差异(D′Souza等，1997；Ladel等，1995)。虽然γδT细胞可以不为肺部感染后细菌复制的最佳控制所需，但缺乏γδT细胞的小鼠形成由泡沫状巨噬细胞和粒细胞代替淋巴细胞主导的紊乱肉芽肿(D′Souza等，1997)。恒定型(i)NKT(invariant(i)NKT)细胞识别由抗原呈递分子CD1d呈递的脂质。已显示，小鼠中皮下注射结核分枝杆菌的脱蛋白质细胞壁后的肉芽肿形成取决于iNKT细胞(Apostolou等，1999)。α-半乳糖神经酰胺(αGalCer)对NKT细胞的特异性激活保护易感小鼠免受结核。虽然之前已显示CD1d-/-小鼠并非更易感结核(Chackerian等，2002)，但Sada-Ovalle和同事表明，CD1d限制iNKT细胞在介导针对气溶胶结核分枝杆菌体内感染的保护中发挥生理作用(Sada-Ovalle等，2008)。多样的CD1d限制T细胞中的绝大多数不识别αGalCer，相反，人和小鼠iNKT细胞都识别CD1d呈递的αGalCer(Behar&Porcelli，2007)。小鼠中牛分枝杆菌BCG感染过程中，NKT细胞的激活发生在MHC限制T细胞的激活之前(10)。我们已通过在共培养牛分枝杆菌BCG感染的BM衍生DC和iNKT杂交瘤后分析细胞因子应答和细胞表面标志表达来研究了用牛分枝杆菌BCG WT对突变体感染后iNKT细胞的作用。和与牛分枝杆菌BCGWT共培养相比，与牛分枝杆菌BCG SapM::T感染的DC共培养确实诱导了相似的IL-2和IL-12p40的表达水平。我们也未观察到细胞表面标志表达的明显差异(数据未显示)。此结果还与以下发现一致：亲本牛分枝杆菌BCG和突变体菌株的脂质和分枝菌酸组成相似(实施例2)；不同菌株感染BM-DC后的CD1d表达也可比较(数据未显示)。
讨论
本文中提供牛分枝杆菌BCG中的单个无效突变可以产生在肺结核过程中具有改善的长期存活的疫苗这一重要概念的证据。这种突变体BCG菌株的使用易于执行，且将面临比转基因BCG或减毒结核分枝杆菌少的安全性和法规问题，已针对转基因BCG或减毒结核分枝杆菌报道了实验动物相似(但并非更好)的长期存活改善，其现在处于临床研发的第一阶段(STOP-TB-Partnership，2009)。我们假定报道为涉及吞噬体成熟抑制的分枝杆菌成分的突变可以产生更好的疫苗，因为这类突变应导致更好的疫苗抗原加工和展示。因此，我们产生了有序牛分枝杆菌BCG转座子插入突变体文库，我们在其中鉴定并在生物化学上表征了细胞壁ManLAM的α-1，2-寡聚甘露糖基帽化必需的两个基因(Fratti等，2003；Hmama等，2004；Kang等，2005)、LM合成中将21-34个残基的线性α-1，6-甘露糖聚合物加至PIM4前体所需的基因(参考文献23)及PI3P磷酸酶SapM基因座(Vergne等，2005)等中的突变体(见实施例2)。之前已报道了ManLAM和SapM具有干扰巨噬细胞吞噬体-溶酶体融合的潜能，吞噬体-溶酶体融合是主要的分枝杆菌清除机制(Fratti等，2003；Hmama等，2004；Kang等，2005；Vergne等，2003；Vergne等，2005)。我们显示，与未接种的小鼠相比，接种ManLAM帽化突变体、LM合成突变体和SapM::T突变体都导致结核分枝杆菌感染后显著更长的存活。此外，与亲本BCG接种者相比，SapM::T突变体接种者存活显著更长，与目前处于临床试验中的其他改造活疫苗相当。
体外研究显示，突变体BCG菌株在巨噬细胞中的存活和复制与亲本BCG同样好。感染的有免疫能力的小鼠中的体内细菌复制分析未在野生型和突变体间显示任何差异(图10A-B)。类似地，用野生型对突变体BCG感染后未观察到肺中引出细胞因子应答的显著性差异(图10C)。(注意，虽然尚未重复Mb2196::T突变体的结果，但最初的结果与用其他BCG突变体获得的那些相似)。
但是，一些细胞因子的水平存在大的变异性，这是之前已报道过的问题(Appelmelk等，2008)。我们也未检测到感染后，肝和肺中形成的肉芽肿的量的巨大差异。Mb1661c::T和Mb2203::T感染的小鼠的肝显示略低的肉芽肿数目(图10D)。但是，评价肉芽肿的大小后，我们观察到，与SapM::T或野生型感染的小鼠的肝中发生的情况相比，用这些突变体感染看起来诱导形成略大的肉芽肿(数据未显示)。重要地，所有这些数据显示，这些突变BCG菌株在有免疫能力的小鼠中表现得与亲本野生型BCG无差异，这确认了其预期的安全性。此外，这些结果表明，与被接受的理念相反，SapM和ManLAM帽化在吞噬体成熟阻断中都不发挥主要作用，可能不能解释突变体的改善的疫苗效力。不清楚关于ManLAM和SapM在吞噬体成熟中的作用的这种不一致的原因。但是，之前描述的大部分研究的严重问题是仅用纯化的ManLAM或ManLAM包被的小球来证明他们的观点。SapM的情况同样如此，其中通过在吞噬体-晚期内体体外融合反应中使用纯化的SapM来显示其在吞噬体成熟中的作用(Vergne等，2005)。省略选择性缺乏ManLAM或SapM的完整细菌的使用，无法弄清这些研究中鉴定的ManLAM和SapM的潜在活性是否与分枝杆菌感染的过程具有任何相关性。Appelmelk和同事通过研究牛分枝杆菌BCG和海分枝杆菌(M.marinum)的Rv1635c帽化突变体开始解决这一重要问题(Appelmelk等，2008)。事实上，他们显示，这些突变体在巨噬细胞中的存活未受影响(Appelmelk等，2008)，表明ManLAM不主导分枝杆菌和宿主间的相互作用，这与长期假定的情况相反。但是，此突变还诱导细胞壁中低10倍的LAM丰度(Dinadayala等，2006)，这可以导致补偿掩盖LAM帽化表型的细胞壁中的改变。为了解决此问题，我们还利用了Mb2203突变体(或结核分枝杆菌中的Rv2181)，其实际上比Rv1635c的突变更具选择性地影响α-1，2-寡聚甘露糖基帽结构合成，并使LAM水平不受损(Kaur等，2006；Kaur等，2008)。因此，Mb2203突变体更适合用于阐明α-1，2-寡聚甘露糖基帽化在巨噬细胞摄取分枝杆菌及摄取后的分枝杆菌存留中的作用。
我们不能不提到结核分枝杆菌在巨噬细胞的有害环境内存活的能力还取决于它清除活性氧类别的特性。氧化剂在树突细胞的成熟(Kantengwa等，2003)、T细胞的增殖(van der Veen等，2004)及巨噬细胞的激活和凋亡(Forman&Torres，2001)中具有重要的信号发放作用。分枝杆菌抗氧化剂失活宿主产生的氧化剂可以破坏早期感染过程中的氧化还原信号发放，并通过减弱宿主免疫应答和促进组织损伤免疫病理来促进TB病理。我们分析了牛分枝杆菌SapM::T突变体改善的针对结核分枝杆菌感染的保护是否可以由减少的氧化剂产生引起。但是，在测试的所有突变体中，我们未观察到感染巨噬细胞后氧化剂活性的任何变化，表明此特征也不促成牛分枝杆菌SapM::T疫苗的更高功效。我们还可以排除后者由感染巨噬细胞后增加的自噬诱导引起，因为我们未在牛分枝杆菌BCG野生型对突变体感染后观察到从LC3-I向LC3-II转化(自噬活性的指示)的差异。
但是，我们确实清楚地显示，与接种亲本疫苗株相比，皮下接种牛分枝杆菌BCG SapM::T诱导增加的CD11c+DC向引流淋巴结的募集。此外，这些DC还处于提高的激活状态，这可以促成增加的抗原呈递和免疫应答，其似乎是促炎症的(图11)。已在体外排除了iNKT的可能的贡献(数据未显示)。鉴于最近的模型，我们的观察也具有极其重要的意义，该模型描述，针对肺结核的BCG疫苗的有效性的降低不是过度减毒的结果，而可以是由于增加的免疫抑制(Kernodle，2010)。如果我们留意东京172菌株和丹麦1331菌株的基因组，我们将看到，它们包含含有抗氧化剂基因的DU2重复单元和Mb3338(SapM)(Brosch等，2007)。但是，此重复单元在BCG巴斯德菌株中不存在。因此，东京172菌株和丹麦1331菌株对肺结核的有效性较低的事实可以解释为存在多个拷贝的抗氧化剂基因(Kernodle，2010；Sadagopal等，2009)和SapM，其在BCG中似乎全是免疫逃逸基因。因此，将Sadagopal等(Sadagopal等，2009)中所述的抗氧化剂基因的敲除与SapM敲除组合可以是有价值的，因为预期这进一步改善疫苗效力。通过标准的“干净、无抗性标记”的基因破坏来执行这些突变进行临床试验很重要，且正在进行中。
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Claims (15)

1.分枝杆菌，其在选自SapM、对应于牛分枝杆菌中Mb1661c的内源ManLAM α-1，2-甘露糖基转移酶、对应于牛分枝杆菌中Mb2203的内源ManLAM α-1，2-甘露糖基转移酶和对应于牛分枝杆菌中Mb2196的内源LM α-1，6-甘露糖基转移酶的至少一个内源基因中包含基因工程突变。
2.权利要求1的分枝杆菌，其中所述内源SapM基因、对应于Mb1661c基因的ManLAM α-1，2-甘露糖基转移酶、对应于Mb2203基因的ManLAMα-1，2-甘露糖基转移酶或对应于Mb2196基因的内源LM α-1，6-甘露糖基转移酶分别包含SEQ ID NO：1、3、5或7，其连续部分，或与之至少95％、至少98％或至少99％同一的序列；或者分别包含编码NO：2、4、6或8，其连续部分，或与之至少95％、至少98％或至少99％同一的序列的序列。
3.权利要求1或2的分枝杆菌，其是结核分枝杆菌复合群的成员。
4.权利要求1至3中任一项的分枝杆菌，其是结核分枝杆菌、牛分枝杆菌或牛分枝杆菌卡介苗(BCG)。
5.权利要求1至4中任一项的分枝杆菌，其中通过插入诱变来产生所述基因工程突变。
6.权利要求1至5中任一项的分枝杆菌，其选自保藏菌株LMGP-25310、LMG P-25309、LMG P-25308和LMG P-25441。
7.权利要求1至6中任一项的分枝杆菌，其进一步在选自secA2、sigH和SodA的至少一个内源基因中包含基因工程突变。
8.权利要求1至7中任一项的分枝杆菌或其部分的用途，用于制备重组疫苗。
9.权利要求8的用途，其中所述疫苗是针对结核的疫苗。
10.权利要求8或9的用途，其中所述疫苗是基于牛分枝杆菌、牛分枝杆菌卡介苗(BCG)或结核分枝杆菌的疫苗。
11.权利要求8至10中任一项的用途，其中所述疫苗包含活减毒疫苗。
12.疫苗，其在可药用载体或赋形剂中包含分枝杆菌或该分枝杆菌的部分，所述分枝杆菌在选自SapM、对应于牛分枝杆菌中Mb1661c的内源ManLAM α-1，2-甘露糖基转移酶、对应于牛分枝杆菌中Mb2203的内源ManLAM α-1，2-甘露糖基转移酶和对应于牛分枝杆菌中Mb2196的内源LM α-1，6-甘露糖基转移酶的至少一个内源基因中包含基因工程突变。
13.权利要求12的针对结核的疫苗，其中所述疫苗适合用于保护哺乳动物免受选自牛分枝杆菌或结核分枝杆菌的毒性分枝杆菌攻击。
14.权利要求12或13的疫苗，其中所述疫苗包含活减毒疫苗。
15.权利要求1至7中任一项的分枝杆菌或权利要求12至14中任一项的疫苗用于治疗结核。
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