CN1882687A - 心肌细胞的增殖方法 - Google Patents

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Abstract

通过使细胞周期蛋白和CDK在心肌细胞中表达，以及抑制Cip/Kip蛋白的功能或作用或抑制Cip/Kip蛋白的产生，诱导心肌细胞增殖。作为Cip/Kip家族蛋白，优选地抑制p27Kip1的作用或抑制其产生。作为本发明实施中使用的重组载体，提供了这样的载体，其含有(1)细胞周期蛋白基因、(2)细胞周期蛋白依赖性激酶基因、以及(3)一种或多种选自由编码抑制Cip/Kip蛋白功能或作用的因子的基因和抑制Cip/Kip家族蛋白产生的核酸序列组成的组中的基因和核酸序列。

Description

心肌细胞的增殖方法
技术领域
本发明涉及使哺乳动物的心肌细胞增殖的方法。
背景技术
由于成熟个体的心肌细胞丧失了细胞分裂能力，如果暴露于缺血和心肌炎等多种应激，心肌细胞就会坏死、丧失，心肌细胞不能补充。其结果，虽然残存的心肌细胞代偿性肥大以保持心功能，但这样的状态持续下去，一旦超过心肌组织的容许范围，不用说就会引起心肌细胞疲惫、死亡，最终表现出心肌功能低下即心力衰竭。
以心力衰竭为首的心脏疾病成了日本国人死亡原因的第2位。另外，心脏疾病患者预后非常差，5年存活率只不过50％程度。因此，有效的心力衰竭治疗法的开发从医疗福利以及医疗经济的观点考虑是非常有益的。到目前为止，作为心力衰竭治疗药，一直使用使心肌收缩力增加的毛地黄制剂和黄嘌呤制剂等强心剂，如果长期施与这些药剂，不用说有时会使病情恶化。另外，最近成为主流的治疗是使用β阻断药和ACE抑制药等减轻由于交感神经系统或肾素-血管紧张素系统的亢进导致过量的心脏负荷的药剂，但这些药剂只不过是对症的治疗法，并不能使受到伤害的心组织本身恢复。另外，虽然心脏移植是对重症心力衰竭的根本性治疗法，但由于脏器提供者不足和医疗伦理、患者的肉体上、经济上负担重等问题，所以作为一般的治疗法使用本法很难。
最近，正在研究对受伤害的心组织补充移植心肌细胞的方法。已知在使用动物的实验中，将从胎儿回收的心肌细胞移植到成熟个体心组织中，移植细胞可有效发挥心肌细胞的作用(例如，参见非专利文献1)。另外，由称为胚胎干细胞(ES细胞)的具有分化为包含心肌细胞在内的各种细胞能力的多功能性细胞制作心肌细胞，将它作为移植用细胞使用的研究也在进行中。然而，这些方法从伦理观点看，应用于临床医疗有困难。另外，最近，移植来自骨髓的干细胞，使该干细胞在心组织内分化为心肌细胞的尝试也在进行中，但其分化效率非常低，现状是作为再生和补充心肌细胞的方法还不具实用性(以上综述参见例如非专利文献2，3，4等)。
因此，本发明的发明者等就心肌细胞的细胞周期调节机制、特别是细胞周期蛋白-细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)系统的作用进行了研究，结果发现在心肌细胞中，虽然血清或生长因子等增殖刺激诱导D型细胞周期蛋白以及CDK4的表达，但这些蛋白分子只局限于细胞质，不向核内移动，结果作为细胞周期蛋白D-CDK4的核内靶分子RB蛋白的磷酸化以及细胞周期蛋白E-CDK2的活化不会发生。另外，制作整合了在细胞周期蛋白D1上添加了核定位信号(nucleus localizing signal：NLS)的基因(以下表示为D1NLS)以及编码CDK4的基因的腺病毒载体，感染培养的心肌细胞时，表明细胞周期蛋白D1蛋白以及CDK4蛋白在核内表达，通过RB的磷酸化引起心肌细胞的增殖、分裂。其结果成功地使在常规培养条件下几乎不增殖(有丝分裂)的心肌细胞增殖。另外，通过将D1NLS和CDK4基因导入成兽的心肌组织并使其表达，成功地使成兽的心肌细胞的细胞周期进行(例如，参见专利文献1、非专利文献5)。以下将通过该发明使心肌细胞增殖的方法称为DNLS/CDK法。另外，上述的专利文献1以及非专利文献5和这些文献中记载的其它文献中所有给出的内容都包括在本申请书中。
此外还进行了多次使心肌细胞的细胞周期进行，诱导该细胞分裂的尝试(以下、关于心肌细胞的细胞周期进行的综述，参见例如非专利文献6)。例如，据报道使来自腺病毒的E1A/E1B基因(非专利文献7)或E2F基因(参见非专利文献8)在从大鼠新生仔回收的培养心肌细胞中表达，可诱导心肌细胞的DNA合成。另外，在过量表达不带有核定位信号的通常型细胞周期蛋白D1基因的转基因小鼠中，确认CDK4在心肌细胞中的表达水平上升的同时也诱导DNA合成(例如，参见非专利文献9)。另外，最近在抑制细胞周期蛋白D1基因表达的jumonji基因缺失小鼠中，也观察到胎儿心肌细胞中的细胞增殖停止时期的延长(例如，参见非专利文献10)。这表明虽然在心肌细胞中也表现出可诱导DNA合成和细胞周期的进行，但在上述的实验例中，经常观察到心肌细胞中凋亡的诱导以及异常多核细胞的出现。促进出生后心肌细胞的细胞分裂，实际上使细胞数增加的方法除了DNLS/CDK法以外还没有其它方法。
因此，DNLS/CDK法是可以使通常“不能增加的”心肌细胞增加的划时代的方法，产业上利用的价值也很高。
已知在一般的真核细胞中多种正和负调节因子调节细胞周期的进行。正调节因子如上述的细胞周期蛋白和各种CDK，而作为负调节因子如称之为CDK抑制因子的一系列蛋白质组，已鉴定到作用方式不同的2个CDK抑制因子家族(作为综述，例如，参见非专利文献11)。第一组称之为Ink4家族蛋白，包括p16(也已知为Ink4A、Mts1、Cdkn2和Cdkn4i)、p15(也已知为Ink4B和Mts2)、p18(也已知为Ink4C和Ink6A)以及p19(也已知为p20、Ink4D和Ink6B)，与CDK4或CDK6选择性地结合，抑制细胞周期蛋白D-CDK4(或CDK6)复合体的功能(例如，参见非专利文献12，13，14)。CDK抑制蛋白的第二组称之为Cip/Kip家族蛋白，包括p21(也已知为Cip1、Pic1、Sdi1、mda6和Waf1；以下略为p21Cip1)、p27(也已知为Ick、Kip1和Pic2；以下略为p27Kip1)，以及p57(也已知为Kip2；以下略为p57Kip2)，已阐明与Ink4家族不同，通过抑制各种细胞周期蛋白-CDK复合体的功能，抑制细胞周期的进行(例如，参见非专利文献15，16，17，18)。
在心肌细胞的增殖抑制中，有关这些CDK抑制蛋白怎样参与，就Cip/Kip家族蛋白有几篇报告。即，已知从胎生后期至生后，在心肌细胞增殖能力降低的同时，p21Cip1蛋白和p27Kip1蛋白的表达量增高，作为该蛋白的靶分子CDK2和CDK4的活化降低(例如，参见非专利文献19)。另外，如果向使E2F-1基因过量表达的心肌细胞添加IGF-1(胰岛素样生长因子1；insulin-like growth factor-1)，p21Cip1蛋白和p27Kip1蛋白的表达量减少，与此同时DNA合成期(S期)的心肌细胞比例增加(例如，参见非专利文献20)。另外，据报道在p27KiP1基因缺失小鼠中，观察到心肌细胞的增殖停止的时期比通常的小鼠晚，心肌细胞的数量变多(例如，参见非专利文献21)。由此表明Cip/Kip家族蛋白、特别是p27Kip1有参与心肌细胞的增殖抑制的可能性。除了上述的使基因缺失的方法以外，还没有抑制Cip/Kip家族蛋白的表达和作用，由此使心肌细胞分裂和增殖的例子。
已知Cip/Kip家族蛋白在细胞内的表达水平主要受到通过遍在蛋白途径的分解体系调节(例如，参见非专利文献22，23，24)。遍在蛋白是由在进化上高度保守的76个氨基酸组成的多肽，在所有真核细胞中含量丰富。在遍在蛋白途径中，多聚遍在蛋白链与靶底物共价结合后，被多功能性蛋白酶体复合体分解。受到这样的遍在蛋白-蛋白酶体系分解的蛋白分子除了Cip/Kip家族蛋白之外还包括细胞周期蛋白、p53、p300、E2F、STAT-1、c-Myc、c-Jun、EGF受体、IκBα、NFκB以及β-联蛋白等多种分子。关于蛋白分子的遍在蛋白化机制进行了全力的研究，通常，由于一系列酶、即遍在蛋白活化酶(E1)、遍在蛋白复合酶(E2)以及遍在蛋白连接酶(E3)的作用而受到遍在蛋白修饰的蛋白分子最终被26S蛋白酶体分解(以上、作为综述，例如参见非专利文献25，26，27，28等)。
其中，认为与用于对特定靶蛋白进行遍在蛋白化的特异性有关的酶是遍在蛋白连接酶(E3)，已知有促后期复合物(Anaphase PromotingComplex)/细胞周期体(Cyclosome)(APC/C)复合体和VHL(vonHippel-Lindau protein-elongin B/C(VBC)复合体、Nedd4、Ufd4、Rad5、Rad18、Parkin等很多例子。近年来通过在酵母等低等生物中的研究，由称为SCF的复合体构成的新型遍在蛋白连接酶已被鉴定。这个SCF复合体型遍在蛋白连接酶(以下、有时记为遍在蛋白连接酶SCF复合体)是由称为Skp1、Cul1(别名Cdc53)、以及F盒(F-box)蛋白的3个亚基构成的3聚体蛋白质模块，取各亚基第一个字母称为SCF(作为综述，例如，参见非专利文献29，30等)。
作为SCF复合体构成因子之一的F盒蛋白是含有在细胞周期蛋白F中最初被鉴定的F盒基序，这个基序区对于与Skp1的相互作用是必需的。另外F盒蛋白还具有称为WD-40重复序列的40个左右氨基酸序列重复基序区或称为富含亮氨酸的富亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat)的基序区。在SCF复合体中，Skp1和Cul1/Cdc53无论对于什么样的靶底物都是一定的，但F盒蛋白由于遍在蛋白化的对象靶底物不同，其分子种类也不同，在WD-40重复序列或富亮氨酸重复序列中通过对靶底物识别和结合，决定SCF复合体的底物特异性(例如，参见非专利文献31、32、33)。这样一来，SCF复合体中由于作为构成因子含有的F盒蛋白不同，存在着SCFβTrCP、SCFCdc4、SCFMet30、SCFGrr1等多种(例如，参见非专利文献29、30)。
对于Cip/Kip家族蛋白，已知含有作为F盒蛋白Skp2的SCF复合体(SCFSkp2)参与该遍在蛋白-蛋白酶体分解(例如，参见非专利文献34，35，36，37)。Skp2起初被鉴定为与细胞周期蛋白A-CDK2复合体结合的因子，在一般的增殖细胞中，从细胞周期的G1后期开始蓄积，由于其表达量从S期(DNA合成期)开始至G2期达到最大，所以称之为S期激酶相关蛋白(S-phase kinase-associated protein)(例如，参见非专利文献38)。另外，据报道Skp2除了Cip/Kip家族蛋白以外，也可识别作为靶底物的E2F-1(参见非专利文献39)和细胞周期蛋白E(参见非专利文献40)、CDK9(参见非专利文献41)、c-Myc(参见非专利文献42，43)等蛋白分子，参与其分解。
因此，已知以Cip/Kip家族蛋白为首的CDK抑制因子与一般的增殖性细胞的增殖抑制有关，该细胞内表达量的调控是由SCFSkp2复合体介导的遍在蛋白-蛋白酶体系负责的。然而，在心肌细胞的增殖调控机制中，几乎不清楚有关遍在蛋白-蛋白酶体系是怎样参与的。
上述的DNLS/CDK法是现在已知的唯一的心肌细胞增殖方法，非常有用，产业上的利用价值也高。然而，为了进一步增加心肌再生治疗的实用化以及产业化的可能性，希望进一步提高心肌细胞的增殖效果和效率。
【专利文献1】
国际公开第02/095026号
【非专利文献1】
Soonpaa等人，Science 264：98，(1994)
【非专利文献2】
Murry等人，Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.67：519，(2002)
【非专利文献3】
Menasche、Ann.Thorac.Surg.75：S20，(2003)
【非专利文献4】
Nir等人，Cardiovasc.Res.58：313，(2003)
【非专利文献5】
Tamamori-Adachi等人，Circ.Res.92：e12，(2003)
【非专利文献6】
Kishore等人，Circ.Res.90：1044，(2002)
【非专利文献7】
Kirshenbaum等人，J.Biol.Chem.270：7791，(1995)
【非专利文献8】
Kirshenbaum等人，Dev.Biol.179：402，(1996)
【非专利文献9】
Soonpaa等人，Clin.Invest.99：2644，(1997)
【非专利文献10】
Toyoda等人，Dev.Cell 5：85，(2003)
【非专利文献11】
Sherr & Roberts、Genes Dev.9：1149，(1995)
【非专利文献12】
Hannon & Beach、Nature 371：257，(1993)
【非专利文献13】
Serrano等人，Nature 366：704，(1993)
【非专利文献14】
Hirai等人，Mol.Cell.Biol.15：2672，(1995)
【非专利文献15】
Harper等人，Cell 75：805，(1993)
【非专利文献16】
Polyak等人，Cell 78：59，(1994)
【非专利文献17】
Toyoshima & Hunter Cell 78：67，(1994)
【非专利文献18】
Matsuoka等人，Genes Dev.9：650，(1995)
【非专利文献19】
Flink等人，J.Mol.Cell.Cardiol.30：563，(1998)
【非专利文献20】
von Harsdorf等人，Circ.Res.85：128，(1999)
【非专利文献21】
Poolman等人，Circ.Res.85：117，(1999)
【非专利文献22】
Pagano等人，Science 269：682，(1995)
【非专利文献23】
Maki & Howley，Mol.Cell Biol.17：355，(1997)
【非专利文献24】
Urano等人，J.Biol.Chem.274：12197，(1999)
【非专利文献25】
Coux等人，Annu.Rev.Biochem.65：801，(1996)
【非专利文献26】
Hochstrasser，Annu.Rev.Genet.30：405，(1996)
【非专利文献27】
Pagano，FASEB J.11：1067，(1997)
【非专利文献28】
Hershko等人，Annu.Rev.Biochem.67：425，(1998)
【非专利文献29】
Patton等人，Trends Genet.14：236，(1998)
【非专利文献30】
Jackson & Eldridge，Mol.Cell 9：923，(2002)
【非专利文献31】
Bai等人，Cell 86：263，(1996)
【非专利文献32】
Skowrya等人，Cell 91：209，(1997)
【非专利文献33】
Kobe等人，Curr.Opin.Struct.Biol.11725，(2001)
【非专利文献34】
Carrano等人，Nature Cell Biol.1：193，(1999)
【非专利文献35】
Tsvetkov等人，Curr.Biol.9：661，(1999)
【非专利文献36】
Bornstein等人，J.Biol.Chem.278：26752，(2003)
【非专利文献37】
Kamura等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：10231，(2003)
【非专利文献38】
zhang等人，Cell 82：915，(1995)
【非专利文献39】
Marti等人，Nat.Cell Biol.1：14，(1999)
【非专利文献40】
Nakayama等人，EMBO J.19：2069，(2000)
【非专利文献41】
Kiernan等人，Mol.Cell.Biol.21：7956，(2001)
【非专利文献42】
Kim等人，Mol.Cell 11：1177，(2003)
【非专利文献43】
von der Lehr等人，Mol.Cell 11：1189，(2003)
发明内容
发明要解决的课题
本发明的目的在于提供在心肌细胞的增殖方法中使增殖效率进一步提高的方法以及该方法中使用的重组载体等。
用于解决课题的手段
为了解决上述课题，发明者们对于心肌细胞中的细胞周期调节机制进行了分析。即，进行了着眼于在使细胞周期蛋白以及细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)基因强制表达的心肌细胞中的各种细胞周期调节因子、特别是CDK抑制因子作用的研究，结果发现在细胞周期蛋白以及CDK刺激下的心肌细胞的核内，作为CDK抑制因子的Cip/Kip家族蛋白中的1种即p27Kip1预料不到地过量蓄积。
在一般的增殖性细胞中，已知以p27Kip1为首的Cip/Kip家族蛋白可被遍在蛋白连接酶遍在蛋白化，受到蛋白酶体的分解。因此，当将编码遍在蛋白连接酶的构成分子之一的基因与细胞周期蛋白和CDK基因一起在心肌细胞共表达时，证实心肌细胞核内的p27Kip1蛋白显著减少。另外在该心肌细胞中，发现其细胞增殖性显著亢进，从而完成本发明。
即，本发明涉及特征如下的方法，即通过用细胞周期蛋白和CDK刺激抑制在心肌细胞内表达的Cip/Kip家族蛋白的产生和功能、作用，提高该细胞增殖的效率。应该抑制其作用的Cip/Kip家族蛋白没有特别限定，优选p27Kip1。
本发明中所谓的心肌细胞只要是可以表达作为一般心肌细胞形态学上、生理学上和/或免疫学上特征能够被识别的对心肌细胞特异的多个标志即可，不仅可以是从哺乳动物的心组织直接回收的心肌细胞和其原代培养细胞，而且从胚胎干细胞和骨髓间叶系干细胞、CMG细胞等干细胞分化诱导的心肌细胞也可以。
作为抑制Cip/Kip家族蛋白的产生和功能、作用的方法，没有特别限定，如抑制编码该蛋白的基因的表达、抑制该蛋白产生、抑制该蛋白的活性、或促进该蛋白的分解等。
特别地，作为促进该蛋白的分解的方法，希望是促使该蛋白遍在蛋白化的方法，其中所述遍在蛋白化可以通过将促进遍在蛋白化的药剂、蛋白、肽、低分子化合物、基因等导入目的分化细胞达到。
另外，作为促进Cip/Kip家族蛋白的遍在蛋白化的基因，优选如编码遍在蛋白连接酶构成因子的基因，更优选如可与Cip/Kip家族蛋白结合的F盒因子的基因，特别优选例如Skp2基因。
另外，在本发明的实施中，也可以利用抑制编码Cip/Kip家族蛋白基因的表达(mRNA的转录)或抑制该基因产物的翻译和产生的方法。例如使用对编码Cip/Kip家族蛋白的基因特异的siRNA等是合适的。
进一步地，在本发明的实施中，优选地在细胞周期蛋白基因和CDK基因中的至少一方添加编码核定位信号的碱基序列，并导入上述分化细胞。上述细胞周期蛋白是能够活化CDK4或CDK6的细胞周期蛋白，例如哺乳类的细胞周期蛋白D1、D2以及D3等合适。另外，上述CDK是被D型细胞周期蛋白活化的产物，例如哺乳类的CDK4和CDK6合适。
在另一实施方案中，本发明涉及含有上述细胞周期蛋白基因、CDK基因以及抑制Cip/Kip家族蛋白作用的因子的基因的载体。当将所述基因导入心肌细胞时，优选地使用病毒性载体或脂质体等进行，例如，作为病毒载体优选使用腺病毒载体。
在另一实施方案中，本发明涉及含有这样的载体的药物组合物，所述载体含上述细胞周期蛋白基因、CDK基因以及抑制Cip/Kip家族蛋白作用的因子的基因。
在另一实施方案中，本发明涉及通过上述心肌细胞增殖方法得到的心肌细胞。
在另一实施方案中，本发明涉及使用通过上述心肌细胞增殖方法得到的细胞，用于鉴定维持或促进心肌细胞等存活或功能的新因子或有可能性的化学治疗剂的筛选方法。
在另一实施方案中，本发明涉及心脏疾病的治疗方法，其包括将该药物组合物或该心肌细胞施与(移植至)患者心肌细胞衰弱、功能停止或死亡的部位，维持该细胞并使其增殖。
即，本申请发明主要涉及以下内容。
(1)心肌细胞的增殖方法，其特征是：将(a)细胞周期蛋白、(b)细胞周期蛋白依赖性激酶、以及(c)一种或多种选自由编码抑制Cip/Kip家族蛋白的产生、功能或作用的因子的基因和抑制Cip/Kip家族蛋白产生的核酸组成的组中的基因和核酸导入心肌细胞后，培养或维持该细胞。
(2)心肌细胞的增殖方法，其特征是：将(a)细胞周期蛋白、(b)细胞周期蛋白依赖性激酶、以及(c)一种或多种选自由编码抑制Cip/Kip家族蛋白的产生、功能或作用的因子的基因和抑制Cip/Kip家族蛋白产生的核酸组成的组中的基因和核酸在生物体外导入心肌细胞后，培养该细胞。
(3)心肌细胞的增殖方法，其特征是：将(a)细胞周期蛋白、(b)细胞周期蛋白依赖性激酶、以及(c)一种或多种选自由编码抑制Cip/Kip家族蛋白的产生、功能或作用的因子的基因和抑制Cip/Kip家族蛋白产生的核酸组成的组中的基因和核酸导入生物体内的心肌细胞后，维持该细胞。
(4)上述(1)至(3)中任一项所述的方法，其中细胞周期蛋白是可活化哺乳类的CDK4或CDK6的细胞周期蛋白。
(5)上述(4)所述的方法，其中细胞周期蛋白是哺乳类的细胞周期蛋白D。
(6)上述(1)至(5)中任一项所述的方法，其中细胞周期蛋白依赖性激酶是被细胞周期蛋白D活化的细胞周期蛋白依赖性激酶。
(7)上述(6)所述的方法，其中细胞周期蛋白依赖性激酶是CDK4或CDK6。
(8)上述(1)至(7)中任一项所述的方法，其中Cip/Kip家族蛋白是p27Kip1。
(9)上述(1)至(8)中任一项所述的方法，其中抑制Cip/Kip家族蛋白的产生、功能或作用的因子是具有促进Cip/Kip家族蛋白分解作用的因子。
(10)上述(9)所述的方法，其中具有促进Cip/Kip家族蛋白分解作用的因子是遍在蛋白连接酶构成因子。
(11)上述(10)所述的方法，其中遍在蛋白连接酶构成因子是可与Cip/Kip家族蛋白结合的F盒因子。
(12)上述(11)所述的方法，其中可与Cip/Kip家族蛋白结合的F盒因子是Skp2。
(13)上述(1)至(12)任一项所述的方法，其中抑制Cip/Kip家族蛋白产生的核酸或其衍生物是对编码Cip/Kip家族蛋白的基因特异的siRNA。
(14)上述(13)所述的方法，其中抑制Cip/Kip家族蛋白产生的核酸是对p27Kip1基因特异的siRNA。
(15)上述(1)至(14)中任一项所述的方法，其包括使用病毒载体或脂质体，将基因导入心肌细胞。
(16)上述(1)至(15)任一项所述的方法，其包括在细胞周期蛋白基因以及细胞周期蛋白依赖性激酶基因中的至少一方添加编码核定位信号的碱基序列。
(17)载体，其含有(a)细胞周期蛋白基因、(b)细胞周期蛋白依赖性激酶基因、以及(c)一种或多种选自由编码抑制Cip/Kip家族蛋白作用的因子的基因和抑制Cip/Kip家族蛋白产生的核酸序列组成的组中的基因和核酸序列。
(18)上述(17)所述的载体，其中细胞周期蛋白是可活化哺乳类的CDK4或CDK6的细胞周期蛋白。
(19)上述(18)所述的载体，其中细胞周期蛋白是哺乳类的细胞周期蛋白D。
(20)上述(17)至(19)中任一项所述的载体，其中细胞周期蛋白依赖性激酶是被细胞周期蛋白D活化的细胞周期蛋白依赖性激酶。
(21)上述(20)所述的载体，其中细胞周期蛋白依赖性激酶是CDK4或CDK6。
(22)上述(17)至(21)中任一项所述的载体，其中抑制Cip/Kip家族蛋白作用的因子是具有促进Cip/Kip家族蛋白分解作用的因子。
(23)上述(22)所述的载体，其中具有促进Cip/Kip家族蛋白分解作用的因子是遍在蛋白连接酶构成因子。
(24)上述(23)所述的载体，其中遍在蛋白连接酶构成因子是可与Cip/Kip家族蛋白结合的F盒因子。
(25)上述(24)所述的载体，其中可与Cip/Kip家族蛋白结合的F盒因子是Skp2。
(26)上述(17)至(25)中任一项所述的载体，其中抑制Cip/Kip家族蛋白产生的核酸是对编码Cip/Kip家族蛋白的基因特异的siRNA。
(27)上述(26)所述的载体，其中抑制Cip/Kip家族蛋白产生的核酸是对p27kip1基因特异的siRNA。
(28)上述(17)至(27)中任一项所述的载体，其中包含在细胞周期蛋白基因和细胞周期蛋白依赖性激酶基因中的至少一方添加编码核定位信号的碱基序列。
(29)含有上述(17)至(28)中任一项所述载体的心脏疾病治疗用药物组合物。
(30)上述(29)所述的药物组合物，其中心脏疾病是心肌梗塞、缺血性心脏病、淤血性心力衰竭、肥大型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎或慢性心力衰竭。
(31)通过上述(1)至(16)中任一项所述的方法得到的心肌细胞。
(32)心脏疾病的治疗方法，作为患有心脏疾病的个体的治疗方法，其特征是通过将上述(29)所述的药物组合物或上述(31)所述的心肌细胞注入或移植到损伤部位，在该部位维持心肌细胞，使其增殖。
(33)上述(32)所述的治疗方法，其中心脏疾病是心肌梗塞、缺血性心脏病、淤血性心力衰竭、肥大型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎或慢性心力衰竭。
发明的效果
通过使用本发明的方法，可以抑制Cip/Kip家族蛋白在心肌细胞核内的作用，促进心肌细胞的增殖。另外，本发明涉及的优点和特征在以下合适的实施方案的详细说明中有充分记载。
附图简述
图1
p27Kip1蛋白在转染了D1NLS和CDK4基因的心肌细胞中的表达。制备核蛋白质，通过免疫印迹法研究p27Kip1蛋白的表达。
CM：原代培养的大鼠心肌细胞；REF：大鼠成纤维细胞株(REF52细胞)
图2
p27Kip1蛋白在转染了D1NLS和CDK4基因的心肌细胞中的定位。使含有LacZ基因(上段；对照)或D1NLS基因和CDK4基因(下段)的重组腺病毒感染心肌细胞，通过免疫荧光染色法研究p27Kip1蛋白在细胞内的表达。图中绿色表示p27Kip1、红色表示肌节肌动蛋白。另外细胞核用DAPI染色。
图3
p27Kip1蛋白在心肌细胞中的表达调控。将在FBS刺激或D1NLS+CDK4刺激下的心肌细胞用蛋白酶体抑制剂lactacystin(LC)处理，比较p27Kip1蛋白的表达。
图4
p27Kip1蛋白在心肌细胞中的遍在蛋白化。使用在FBS刺激或D1NLS+CDK4刺激下的心肌细胞(CM)或成纤维细胞(REF)的细胞提取物，在体外进行遍在蛋白化反应，然后通过免疫印迹法检测p27Kip1蛋白。图中IB表示免疫印迹分析中使用的抗体。在高分子量位置看到的带是被遍在蛋白化的p27Kip1蛋白(p27-GST-Ub)。
图5
Skp2蛋白在心肌细胞中的表达。将在FBS刺激或D1NLS+CDK4刺激下的心肌细胞用蛋白酶体抑制剂lactacystin(LC)处理，比较Skp2蛋白的表达。
图6
由于Skp2基因的共表达导致p27Kip1蛋白的减少。用D1NLS、CDK4和Skp2基因转染心肌细胞，研究p27Kip1蛋白的表达。
图7
p27Kip1蛋白在使D1NLS、CDK4和Skp2基因共表达的心肌细胞中的定位。使含有D1NLS+CDK4基因(上段；对照)或D1NLS+CDK4+Skp2基因(中、下段)的重组腺病毒感染心肌细胞，一部分用蛋白酶体抑制剂lactacystin(LC)处理后(下段)通过免疫荧光染色法研究p27Kip1蛋白在细胞内的表达。图中绿色表示p27Kip1、红色表示肌节肌动蛋白。另外细胞核用DAPI染色。
图8
Skp2基因的强制表达促进心肌细胞增殖的效果。使含有LacZ基因(对照)、D1NLS+CDK4基因、D1NLS+CDK4+Skp2基因、或只含有Skp2基因的重组病毒感染心肌细胞，经时地计测心肌细胞的数目。
图9
通过p27Kip1基因特异的siRNA的共表达减少p27Kip1蛋白。使D1NLS、CDK4基因和p27Kip1基因特异的siRNA转染心肌细胞，研究p27Kip1蛋白的表达。
图10
通过p27Kip1基因特异的siRNA的强制表达促进心肌细胞增殖的效果。使含有LacZ基因(对照)、D1NLS+CDK4基因、D1NLS+CDK4基因+p27Kip1基因特异的siRNA、或只含有p27Kip1基因特异的siRNA的重组病毒感染心肌细胞，经时地计测心肌细胞的数目。
图11
研究通过Skp2基因强制表达降低肺重量的效果。测定心肌缺血再灌流6周后的大鼠肺重量，算出其体重比。※：对于Sham组p＜0.05。#：对于D1NLS组p＜0.05。
图12
由于Skp2基因强制表达导致被动的左室压-体积曲线的变化。使用心肌缺血再灌流6周后的大鼠心脏制作被动的左室压-体积曲线。※：对Sham组，p＜0.05。#：对Cont组p＜0.05。：对D1NLS组p＜0.05。
图13
研究通过Skp2基因强制表达引起的心肌梗塞区域减少的效果。测定心肌缺血再灌流6周后的大鼠心脏中心肌梗塞区域，算出占左室的比例。#：对于Cont组p＜0.05。
符号说明
+：表示添加了FBS和药剂，或使各种重组腺病毒感染。
-：表示没有添加FBS和药剂，或没有使各种重组腺病毒感染。
p27：表示p27Kip1蛋白质。
用于实施发明的最佳方案
在本发明的实施中，有关分子生物学、微生物学、细胞生物学以及重组DNA技术等常规方法和现有技术，只要实施者没有特别给出，都可参照该领域的标准参考书籍。其中例如可参照Molecular Cloning：ALaboratory Manual第3版(Sambrook & Russell，Cold Spring HarborLaboratory Press、2001)；Current Protocols in Molecular biology(Ausubel等人编，John Wiley & Sons，1987)；Methods in Enzymology系列(Academic Press)；PCR Protocols：Methods in Molecular Biology(Bartlett & Striling编，Humana Press、2003)；Animal Cell Culture：APractical Approach第3版(Masters编，Oxford University Press、2000)；Antiboides：A Laboratory Manual(Harlow等人& Lane编，Cold SpringHarbor Laboratory Press、1987)。另外，在本说明书中所参见的用于细胞培养、细胞生物学实验的试剂和试剂盒类可从Sigma公司和Aldrich公司、Invitrogen/GIBCO公司、Clontech公司、Stratagene公司等的销售人员处购买。
(心肌细胞的制备)
作为使用本发明方法而增殖的对象的心肌细胞包括胎儿型心肌细胞、幼体型心肌细胞、以及成体型心肌细胞等所有发育阶段的细胞，通过以下所述的至少一种、优选多种方法定义能够确认至少1个、优选多个标志或基准的细胞。
心肌细胞中特异的多种标志的表达可以通过现有的生物化学或免疫化学方法检测。对该方法没有特别限定，优选使用象免疫组织化学染色法或免疫电泳法那样的免疫化学方法。在这些方法中，可以使用与心肌前体细胞或心肌细胞结合的标志特异的多克隆抗体或单克隆抗体。以各个特异标志作为靶的抗体有商品销售，容易使用。心肌前体细胞或心肌细胞中特异的标志，例如肌球蛋白重链/轻链和α-辅肌动蛋白、肌钙蛋白I、ANP、GATA-4、Nkx2.5、MEF-2c等。
或者，检测心肌前体细胞或心肌细胞特异性标志的表达具体地与上述方法无关，可以通过逆转录酶介导的聚合酶链反应(RT-PCR)和称为杂交的分析，用于对编码任意标志蛋白质的mRNA进行扩增、检测、解析的现在常用的分子生物学方法确认。编码心肌前体细胞或心肌细胞特异性标志(例如、肌球蛋白重链/轻链和α-辅肌动蛋白、肌钙蛋白I、ANP、GATA-4、Nkx2.5、MEF-2c)蛋白质的核酸序列已知，在象National Centerfor Biotechnology information基因库(GenBank)那样的公共数据库中是可以获得的，可以很容易地确定为了作为引物或探针使用而认为必需的标志特异性序列。
另外也可再使用生理学的基准。即，心肌细胞具有的自主博动性，以及表达各种离子通道，可对电生理的刺激反应等作为它的有用指标。
本发明公开的方法可以将存在于哺乳动物心脏组织内的心肌细胞作为直接的对象，也可以使用从生物体心组织经酶处理等多种方法分离的心肌细胞、或将它们在适当的培养条件下培养了1～5日左右的原代培养细胞。具体的心肌细胞培养法在许多参考文献中都有记载，其中作为代表性方法，如Chien的方法以及其改变法(Chien等人，J.Clin.Invest.75：1770，1985；Meidell等人，Am.J.Physiol.251：H1076，1986；Tamamori等人，Am.J.Physiol.275：H2036，1998)。
另外，作为培养心肌细胞，不限于上述的例子，也包括从干细胞分化诱导得到的心肌细胞。所谓本发明实施可使用的干细胞，指的是具有在试管内培养下可分化为具有心肌细胞样性状细胞性质的细胞，具体来说，如已经作为培养细胞广泛使用的来自小鼠、猴、人等哺乳动物的胚胎干细胞(ES细胞)和胚胎生殖细胞(EG细胞)、成人型多能性干细胞(MAPC)等多能性干细胞。有关这些细胞的制作、传代、保存法已经确立了标准的程序，实施者通过参照许多参考书籍，例如Manipulating the MouseEmbryo：A laboratory manual(Hogan等人编，Cold Spring HarborLaborayory Press，1994)和Embryonic Stem Cells(Turksen编，HumanaPress，2002)、以及许多参考文献(Matsui等人，Cell 70：841，1992；Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726，1998；美国专利第6,090,622号；Jiang等人，Nature 418：41，2002；国际公开第01/11011号)，容易地使用这些多能性干细胞。
另外，本发明可使用的干细胞不限于上述3种，只要是具有与ES细胞类似性质的干细胞都可以使用。此处所谓与ES细胞类似性质可以定义为具有ES细胞中存在的特异表面(抗原)标志或ES细胞特异基因的表达、以及具有称为形成畸胎瘤(teratoma)能力和形成嵌合小鼠能力的ES细胞特异的细胞生物学性质，作为具体例子，如将毛根鞘细胞或表皮细胞用5-氮胞苷等药剂处理得到的干细胞(Sharda & Zahner，国际公开第02/051980号)或将单核球细胞用CR3/43抗体处理得到的干细胞(AbuLjadayel，Curr.Med.Res.Opinion 19：355，2003)、以及来自成体内耳细胞的干细胞(Li等人，Nature Med.、Advance online publication)等与ES细胞类似性状的干细胞。
另外，即使是不具有与ES细胞类似性状的细胞、或不是多能性干细胞的细胞，只要是在试管内培养下可分化为具有心肌细胞样性状的细胞性质的细胞，可以使用本发明所述的方法。作为这样细胞的例子，如来自骨髓细胞的骨髓间叶系干细胞(Bruder等人，美国专利第5,736,396号；Pittenger等人，Science 284：143，1999)和CMG细胞(Makino等人，J.Clin.Invest.103：697，1999；国际公开第01/048151号)、来自肌肉组织的Spoc细胞(国际公开第03/035382号)。
在本发明中作为由干细胞制作心肌细胞的培养法，只要是适合心肌细胞的分化诱导的方法都可以使用。例如使用ES细胞时的悬浮培养法、悬滴(hanging drop)培养法、与支持细胞的共培养法、旋转培养法、软琼脂培养法、微载体培养法等。有关具体的分化诱导法已经确立了很多方法，实施者可参照例如象Embryonic Stem Cells(Turksen编，Humana Press，2002)那样的参考书籍、以及许多参考文献(Klug等人，J.Clin.Invest.98：216，1996；Wobus等人，J.Mol.Cell.Cardiol.29：1525，1997；Kehat等人，J.Clin.Invest.108：407，2001；Chunhui等人，Circ.Res.91：508，2002；Takahashi等人，Circulation 107：1912，2003；Field等人，美国专利第6,015,671号；Chunhui等人，国际公开第03/06950号)。
(使心肌细胞增殖的方法)
本发明的实施方案之一是心肌细胞的增殖法，其特征是使细胞周期蛋白和CDK导入心肌细胞并使其表达，和抑制Cip/Kip蛋白的产生和功能、作用。作为心肌细胞，如上所述，可以使用从生物体心组织通过酶处理等各种方法分离的心肌细胞、或将它们在适当的培养条件下培养1～5日左右的原代培养细胞、以及由各种干细胞分化诱导的心肌细胞，也可以对存在于哺乳动物心脏组织内的心肌细胞直接用下面叙述的各种方法实施处理，将该细胞维持在生物体内，使其增殖。这里本发明中所谓“维持”指的是在适度的体温和必要量的血流等生理性体内环境下，不损坏生理功能地使该细胞存活，维持细胞。
作为用于使细胞周期蛋白和CDK导入心肌细胞和/或表达的最适方法之一如发明者等人以前报告的DNLS/CDK法(参见前面的专利文献1和非专利文献5)。即，通过制作整合了在细胞周期蛋白D1添加了NLS的D1NLS基因或CDK4基因的2种腺病毒载体，使这两种病毒感染心肌细胞，从而细胞周期蛋白D1蛋白以及CDK4蛋白定位于核内，其结果，可以促使通常几乎不分裂和增殖的心肌细胞分裂并增殖。另外上述的专利说明书以及论文所述的内容也包括在本申请说明书中。
在本发明的实施中，使细胞周期蛋白和CDK导入心肌细胞和/或表达的方法只要是能够导致与上述DNLS/CDK法同样效果的方法即可，没有特别限定。例如作为向心肌细胞导入、表达的细胞周期蛋白，只要是能够活化CDK4或CDK6的蛋白即可，除了细胞周期蛋白D1以外也可以使用细胞周期蛋白D2或细胞周期蛋白D3基因。
另外，作为CDK，只要能被D型细胞周期蛋白活化即可，不仅可以使用CDK4，也可以使用CDK6。这些细胞周期蛋白或CDK基因已经从以人为首的各种生物中分离并鉴定、其碱基序列由于是可在基因库等公共DNA数据库中获得，所以只要是本领域技术人员，通过设计特异的引物或探针，使用常规的分子生物学方法，获得期待的基因是容易的。
作为将细胞周期蛋白和CDK导入心肌细胞的方法，可以是显微注入等物理方法，但考虑到导入效率，优选使用基因导入法。或通过所导入基因的表达，希望在心肌细胞细胞质内合成的蛋白分子移动到核内。作为用于此目的的方法，没有特别限定，如对上述各基因添加编码NLS的碱基序列。由于通过这些基因产生的2种蛋白即细胞周期蛋白和CDK在细胞质内形成复合体，如果其中的任一方，优选地如果是细胞周期蛋白基因含有NLS序列，该复合体就可以移动到核内。现在已知有3种NLS序列。即，第一个例子是几乎不带有赖氨酸和精氨酸等碱性氨基酸的类型，例如流感病毒核蛋白(nucleoprotein)的NLS(Davy等人，Cell 40：667，1985)。第二个例子是含有很多碱性氨基酸的类型，例如SV40T抗原的NLS序列(N-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-C；序列编号1)(Kalderon等人，Nature 311：33，1984)。第三个例子是碱性氨基酸约隔10个氨基酸制造一个簇的类型，称为等分(Bipartite)类型的NLS(Robbins等人，Cell 64：615，1991)。在本发明的实施中使用的NLS可以是上述3种中的任一种，也可以使用上述3种以外的NLS，从NLS序列的长度、使期望的蛋白分子向核移动的能力、和NLS序列基因的获得和利用的容易性等观点考虑，使用SV40 T抗原的NLS序列合适。例如含有SV40 T抗原NLS序列的质粒pEF/myc/nuc可从Invitrogen公司买到。
在本发明中，所谓Cip/Kip家族蛋白是在一般的真核细胞中对细胞周期的进程进行负调节的CDK抑制因子构成的1个家族的一系列蛋白质组，包括p21cip1、p27Kip1、和p57Kip23种分子。已知Cip/Kip家族蛋白抑制多种细胞周期蛋白-CDK复合体，例如细胞周期蛋白D-CDK4/CDK6、细胞周期蛋白A/E-CDK2等功能(作为综述参见Sherr & Roberts，GenesDev.9：1149，1995)。
在Cip/Kip家族蛋白中，特别是p27Kip1，进行了有关它的功能以及特性的解析。众所周知p27Kip1在TGF-β刺激而使细胞周期停滞的细胞中，最初被鉴定为与细胞周期蛋白E-CDK2复合体结合的因子(Koff等人，Cell 66：1217，1991)，是参与G1期停止的负的细胞周期调节因子。例如p27Kip1蛋白在哺乳动物细胞中过量表达诱发处于G1期的细胞周期停止(Polyak等人，Cell 79：59，1994；Toyoshima & Hunter Cell 78：67，1994)。另外在静止期的细胞中，由于p27Kip1的表达高，表明对于细胞G0期维持p27Kip1也起着重要的作用(Nourse等人，Nature 372：570，1994)。通过以后的研究，阐明了p21cip1和p57kip2具有与p27Kip1类似的构造、功能以及特性(Mainprize等人，J.Neurooncol.51：205，2001；Conqueret，Trends.Cell Biol.13：65，2003)。在此没有特别限定的记载，以下所谓Cip/Kip(家族)蛋白指的是p21cip1、p27Kip1、和p57kip2 3种，更优选p27Kip1。
在本发明的实施中，抑制Cip/Kip家族蛋白的功能或作用的方法没有特别限定，作为一个例子，抑制Cip/Kip蛋白活性的方法例如抑制该蛋白的功能和作用的中和抗体、以及将低分子化合物等导入细胞内的方法。另外，作为可诱导促进Cip/Kip蛋白分解的方法，没有特别限定，但促进该蛋白遍在蛋白化的方法合适。
遍在蛋白是在所有真核细胞中存在丰富的多肽，Cip/Kip家族蛋白在细胞内的表达水平主要由通过遍在蛋白途径的分解体系调节(Pagano等人，Science 269：682，1995；Maki & Howley、Mol.Cell Biol.17：355，1997；Urano等人，J.Biol.Chem.274：12197，1999)。即，通过遍在蛋白活化酶(E1)、遍在蛋白复合酶(E2)以及遍在蛋白连接酶(E3)的功能和作用，将多聚遍在蛋白链与Cip/Kip蛋白共价结合(遍在蛋白化)后，最终被26S蛋白酶体分解。因此，将可以促进Cip/Kip蛋白遍在蛋白化的分子导入心肌细胞内的方法对实施本发明合适。作为导入心肌细胞的物质，只要是具有促进Cip/Kip蛋白遍在蛋白化作用的物质都可以，具体来说如药剂或蛋白、肽、低分子化合物等，优选使用核酸、即使用基因。作为这样的基因，如编码构成遍在蛋白活化酶、遍在蛋白复合酶以及遍在蛋白连接酶的蛋白质的基因，但由于认为与使特定的靶蛋白遍在蛋白化的特异性有关的酶是遍在蛋白连接酶(复合体)，所以优选使用编码构成遍在蛋白连接酶(复合体)的蛋白分子的基因。
现在，作为遍在蛋白连接酶已知有APC/C复合体和VBC复合体、SCF复合体、以及Nedd4、Ufd4、Rad5、Rad18、Parkin等许多种类分子。另外，在SCF复合体中由于作为构成因子含有的F盒蛋白不同，存在着SCFβTrCP、SCFCdc4、SCFMet30、SCFGrr1等许多种类(Patton等人，Trends Genet.14：236，1998；Jackson & Eldridge，Mol.Cell 9：923，2002)。作为参与Cip/Kip蛋白遍在蛋白化的遍在蛋白连接酶(复合体)，称为SCFskp2的分子已众所周知，虽然优选使用编码该复合体的构成因子的基因，但并不限于此，只要是具有促进Cip/Kip蛋白遍在蛋白化作用的遍在蛋白连接酶即可，也可以使用编码其构成因子的基因。已知在构成SCFskp2的分子中，特别是称为Skp2的F盒蛋白识别、结合Cip/Kip蛋白，并将多聚遍在蛋白链添加至该蛋白(Carrano等人，Nature Cell Biol.1：193，1999；Tsvetkov等人，Curr.Biol.9：661，1999；Bornstein等人，J.Biol.Chem.278：26752，2003；Kamura等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：10231，2003)。因此，当实施本发明时，作为导入心肌细胞内的基因，使用编码Skp2蛋白的基因(以下有时称为Skp2基因)合适。
已经报告了在人(Zhang等人，Cell.82：915，1995)、小鼠(Nakayama等人，EMBO J.19：2069，2000；中山等人，特开2001-224380号公报)、大鼠等动物中分离和鉴定的Skp2基因及其碱基序列。另外，其序列情报可在基因库等公共的DNA数据库(人Skp2：U33761、AY029177；小鼠Skp2：AF083215、BC003468)利用。因此，只要是本领域技术人员，通过设计对Skp2基因特异的引物或探针，使用常规的分子生物学手法，都可取得并使用Skp2基因。在本发明的实施中使用的Skp2基因如果是来自人、小鼠、或大鼠等哺乳动物的Skp2基因，都可获得同样的结果。
在本发明的实施中，作为导入心肌细胞的基因，不止是Skp2基因，只要是编码与Skp2同样的促进Cip/Kip蛋白的遍在蛋白化和/或分解的因子的基因(以下称为Cip/Kip蛋白的分解促进基因)都可以使用。例如对于可识别并结合Cip/Kip蛋白的F盒蛋白、或认为是Skp2的底物识别和结合部位的称之为WD-40重复序列或富亮氨酸重复序列的基序区域的氨基酸序列，具有80％或以上、优选90％或以上同源性的F盒蛋白、以及编码具有促使Cip/Kip蛋白遍在蛋白化这一性质的遍在蛋白连接酶复合体的构成因子等的基因等也可以使用。
另外，即使不直接参与Cip/Kip蛋白的遍在蛋白化，但只要是与p27Kip1蛋白特异结合和/或作用，具有促使其分解作用的因子，编码这些蛋白的基因也可以在本发明的方法中利用。作为这样的基因，报告了作为核膜孔结合蛋白的核孔蛋白(Nucleoporin)50(也称为Nup50、NPAP60、p163)(Buergin等人，欧州专利第926,236号；Mueller等人，EMBO J.19：2168，2000；Smitherman等人，Mol.Cell.Biol.20：5631，2000；Buergin等人，美国专利第6,265,562号)和作为Cop9信号体构成因子的Jab1/CSN5(Tomoda等人，J.Biol.Chem.277：2302，2002)等。另外，已知p27Kip1当10位丝氨酸残基被磷酸化后，与向核外移动的转运蛋白CRM1结合，移动到核外并被分解(Ishida等人，J.Biol.Chem.277：14355，2002；Connor等人，Mol.Biol.Cell 14：201，2003)。作为对该蛋白的10位丝氨酸残基进行特异磷酸化的酶，KIS(Kinase interacting stathmin)已被鉴定(Boehm等人，EMBO J.21：3390，2002)，利用编码这个KIS的基因的方法也可包括在本发明的实施方案中。在本发明中为了促使Cip/Kip家族蛋白的分解，可以单独或多个组合使用上述因子或该因子的基因。
如上所述，作为用于实施本发明合适的方法的一个例子，其特征是将在细胞周期蛋白和CDK中的至少一方添加了NLS的基因以及上述Cip/Kip蛋白的分解促进基因导入心肌细胞，使其表达。这些基因优选地是与在以心肌细胞为首的广泛的哺乳动物细胞中可进行基因转录和表达的核酸序列、所谓的启动子序列以在该启动子的调控下可转录和表达那样的形式连接。另外最好是使转录·表达的基因再与加聚A信号连接。作为合适的启动子，如来自SV(猿猴病毒)40病毒和巨细胞病毒(Cytomegarovirus；CMV)、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)等病毒的启动子以及β-肌动蛋白启动子、EF(延伸因子)1α启动子等。另外在鸟β-肌动蛋白启动子中整合了CMV增强子以及兔β-珠蛋白基因的加聚A信号序列的杂合启动子--CAG启动子(Niwa等人，Gene 108：193，1991)特别合适。
在另一个实施方案中，所使用的用于基因转录·表达的启动子是心肌细胞特异的启动子。此时也希望使转录·表达的基因再与加聚A信号连接。作为心肌特异的启动子，例如心肌特异的肌球蛋白轻链启动子(Lee等人，J.Biol.Chem.267：15876，1992)或肌球蛋白重链启动子、以及心肌特异的心脏锚蛋白重复蛋白(cardiac ankyrin repeat protein：CARP)启动子(Cuo等人，Development 126：4223，1999；国际公开第WO00/15821号)。这些启动子的碱基序列可在基因库等公共DNA数据库中利用，通过使用常规的分子生物学手法，可以制作利用了期望基因序列的基因载体。
在本发明中也可以利用抑制编码上述Cip/Kip家族蛋白的基因表达(mRNA的转录)的方法、或抑制该基因产物的翻译·产生的方法代替促使上述Cip/Kip家族蛋白分解的方法。即，可以将可抑制或停止编码Cip/Kip家族蛋白的基因(以下称为Cip/Kip蛋白基因)表达或可抑制或停止编码能够诱导该蛋白表达的因子的基因表达的寡核酸或其衍生物等导入细胞内。在本发明中所谓寡核酸的衍生物，指的是以提高该核酸在细胞内的稳定性和摄入细胞内的效率为目的，在核酸的任意部位实施了化学修饰·添加·置换的化合物。例如将硫代磷酸酯化的寡核酸、或尿苷或胞苷分别置换为2′-氟尿苷或2′-氟胞苷的寡核酸等。
作为可用于本目的的寡核酸，众所周知的有反义DNA或编码具有核酶活性的RNA的DNA、诱饵DNA等，最近确立了使用双链RNA的RNA干扰(RNA interference；以下称为RNAi)法。所谓RNAi是如果将具有与靶基因相同或类似序列的双链RNA导入细胞内，靶基因的内源性mRNA被特异分解的现象。当初，认为在哺乳动物中利用RNAi作为特异的基因抑制手法是困难的，但已阐明通过利用作为RNAi中间产物的短双链RNA(short/small interfering RNA；称为siRNA)，对于哺乳动物细胞可以使用RNAi(Hammond等人，Nat.Rev.Genet.2：110，2001：Elbashir等人，Nature 411-494，2002)。关于siRNA的综述以及有关的制备法和使用法可以参见很多参考书籍，例如RNA Interference(RNAi)：The Nuts & Bolts ofsiRNA Technology(Engelke编，DNA Press，2004)和RNA Interference，Editing，and Modification；Methods and Protocols(Gott编，Humana Press，2004)等。
siRNA通过常规的聚合酶链反应(PCR)法或化学合成容易制作。已知siRNA的效果依赖于序列特性，对Cip/Kip蛋白基因特异的siRNA可以以该基因的基因序列、优选地以从起始密码子开始的300个碱基的序列为基础制作。用于RNAi的基因虽然不需要完全与靶基因同一，但至少具有70％或以上、优选80％或以上、更优选90％或以上、特别优选95％或以上序列的同一性。该基因的碱基序列情报可在基因库等公共DNA数据库利用，例如人和小鼠、大鼠的p27KiP1基因分别以存取号：U10906、U10440、D83792登录。另外用于更有效设计siRNA的方法或程序已有很多报告(Chalk等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.319：264，2004；Ui-Tei等人，Nucl.Acids Res.32：936，2004：Reynolds等人，Nat.Biotechnol.22：326，2004)。因此，只要是本领域技术人员，都可以制作和使用对p27KiP1基因等Cip/Kip蛋白基因特异的siRNA。
用上述方法制作的siRNA也可以以寡核酸或其衍生物的形式使用，但考虑到其表达效率和效果持续期间等方面，优选地使用整合到RNA表达载体的形式。作为RNA表达载体，只要是具有可表达siRNA的启动子的载体，并没有限定，可以利用适合短的RNA表达的Pol.III启动子，优选利用其中的U6和H1启动子。另外使用可使转录产物有利地定位于细胞质的tRNA启动子是优选的。可利用这些启动子的siRNA表达用载体可从Ambion公司或Invitrogen公司、TAKARA BIO公司、iGENE公司等买到。
作为用于导入上述基因或基因载体的方法，可以使用所有众所周知的方法，例如使用磷酸钙和电脉冲的转染法，以及通过将目的基因封入脂质体等转染细胞的方法、以及将目的基因整合到逆病毒或腺病毒等病毒载体，使该重组病毒感染细胞的方法等。所谓病毒载体是在使病毒DNA或RNA的全长或一部缺失或变异的核酸序列中可整合、表达目的基因那样的构建体。
作为病毒载体，如来自腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、逆病毒、日本血球凝集性病毒(HVJ；别名仙台病毒)、慢病毒、痘苗病毒、水痘病毒、以SV40为代表的乳多空病毒等的载体，优选地通过使用腺病毒载体或AAV载体、HVJ载体、或慢病毒载体，可以进行有效地基因导入和进行导入基因的高水平表达。通过这些病毒载体导入基因是向哺乳动物细胞导入基因的最强有力的方法之一，事实上，可以使用该方法向所有种类的人细胞以及很多非人细胞导入基因。另外，由于通过这些病毒感染不依赖于细胞周期，所以可以在各种各样的原代培养细胞系和转化细胞系中使基因表达。特别是在象心肌细胞这样不引起DNA合成和细胞分裂的细胞中可有效地导入基因。由于感染后许多细胞接受了多个重组DNA(或RNA)拷贝，所以被导入的基因暂时高水平表达。在为腺病毒载体或HVJ载体等时，通常DNA/RNA停留在细胞质，不进入核内。因此，使用这些病毒载体时，还具有在外源基因整合到宿主细胞基因组时，几乎不会出现随机发生的突变诱发性错误的优点。
作为本发明优选的方案之一使用的腺病毒载体可以通过使用以人胎儿肾脏293细胞或大肠菌作为宿主的同源重组方法(Miyake等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1320，1996)或通过简单的体外连接反应的方法(Mizuguchi等人，Hum.Gene Ther.9：2577，1998)制备。腺病毒是具有双链DNA基因组的DNA病毒之一，研究比较深入的是人腺病毒5型和2型。通过对这些野生型腺病毒的E1和E3基因的大部分进行缺失，可以制作没有复制能力的病毒载体，对病毒粒子形成不产生有害作用，可以插入数kb的外源DNA。该重组腺病毒虽然缺失了作为转录调节因子的E1基因，但通过插入的基因特异的转录单位，可以不依赖于靶细胞的增殖和有无其它病毒基因地只使插入的目的基因表达。
有关腺病毒载体和其它病毒载体的综述、以及制作法和使用法，实施者可参见许多参考书籍。例如、Gene Therapy Protocols：Methods inMolecular Medicine(Robbins编，Humana Press、1997)、Gene Transferin Cardiovascular System：Experimental Approaches & TherapeuticImplications(March编，Kluwer Academic Publishers、1997)、AdenoviralVectors for Gene Therapy(Curiel & Douglas编，Academic Press、2002)等。另外，用于制作腺病毒载体的试剂盒也有销售，例如Takara Bio公司销售的Adenovirus Expression Vector Kit(#6170)可运用于本发明的实施中，本发明者等报告了实际成功例子(Nakayama等人，EMBO J.19：2069，2000；参照前面的专利文献1和非专利文献5)。
在本发明中，当使细胞周期蛋白基因和CDK基因、以及上述Cip/Kip蛋白的分解促进基因的多个基因表达时，可以使这2种或3种基因整合在同一个病毒载体后感染，或也可以以各个重组病毒感染。通过多个重组病毒共感染时，可以使它们同时感染，也可以隔一定时间分别感染。在本发明中感染的病毒量使用例如107～1013pfu/mL、优选109～1012pfu/mL的病毒保存液，对于培养细胞，希望调整到每个细胞100个左右(moi＝100)后感染。另外，病毒量的测定(效价测定)通过噬菌斑测定法很容易进行。
作为本发明的另一个方案，替代(1)细胞周期蛋白基因、(2)CDK基因、(3)Cip/Kip蛋白的分解促进基因或抑制Cip/Kip家族蛋白产生的核酸(或其衍生物)中的任一个或多个，使用具有与该基因表达的效果同等作用的低分子化合物，即，表现出与细胞周期蛋白类似作用的化合物或表现出与CDK蛋白类似作用的化合物、表现出Cip/Kip蛋白的分解促进作用的化合物、或表现出Cip/Kip蛋白的产生抑制作用的化合物等。此时，作为将该化合物导入心肌细胞内的方法，没有特别限定，一般来说可以使用将该化合物溶解于缓冲生理盐水等药学上容许的药剂载体或稀释液中，经口施与、静脉注射、腹腔内注射、经皮施与、皮下注射、以及直接注入心组织内等施与方式。另外，心肌细胞为培养细胞时，也可以直接将该化合物添加到培养基中。
(作为基因治疗法的应用)
作为本发明的另一个方案，提供了包含在本发明实施中使用的基因载体、优选病毒载体、更优选腺病毒载体或HVJ载体、AAV载体、慢病毒载体等的基因治疗用药物组合物。该基因治疗用药物组合物可用作心肌再生药或心脏疾病治疗药，作为治疗对象的心脏疾病，只要是伴随心肌细胞衰弱、功能停止或死亡的疾病即可，并没有特别限定，作为具体例子，如心肌梗塞、缺血性心脏病、淤血性心力衰竭、肥大型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎、慢性心力衰竭等。
对药物组合物的形态没有特别限定，可以通过惯用的方法制剂化。例如可以是在灭菌水或缓冲生理盐水等药学上容许的药剂载体和稀释液中含有本发明基因表达载体的可注射制备物形态。作为药剂载体，还可以含有适当的稳定剂(例如核酸酶抑制剂等)、鳌合剂(例如EDTA等)、和/或其它的助剂。含有上述成分的药物组合物根据需要可以通过过滤等方法灭菌，灌到无菌安瓿瓶等容器中。另外，可使用渗透泵或渗透管等，连续地将制剂输送到损伤部位。本发明药物组合物的施与量需要根据患者的年龄、性别、体重、症状、以及施与途径等条件适当增减后使用，只要是本领域技术人员，可以设定需要的适当用量。一般来说，成人1次，作为有效成分的DNA量在1.0μg/kg～1.0g/kg左右的范围，优选10μg/kg～100mg/kg左右的范围。而使用腺病毒载体等病毒载体时，病毒的最终效价希望优选107～1013pfu/mL、更优选109～1012pfu/mL。
本发明的药物组合物，特别是基因表达载体为非病毒性载体时，可以以与脂质体的复合体形式供给。通过这样的形式，有可能特别是在心肌细胞中实现高的转染效率。作为脂质体的具体例子，已开发了包括N-[2，3-(二油基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)等在内的许多新的脂类制剂，进行了使用各种细胞系的转染试验(Banerjee，J.Biomater.Appl.16：3，2001；Maurer等人，Expert Opin.Biol.Ther.1：923，2001)。另外使用带有来自HVJ的融合形成性包膜的融合形成性病毒脂质体的方法，所谓的HVJ-脂质体法(Yonemitsu等人，Int.J.Oncol.12：1277，1998；Kaneda等人，Mol.Med.Today 5：298，1999)也有效。
上述的基因表达载体或含有该载体的药物组合物可以导入心脏病患者的整个心脏，但优选是进行局限于损伤部位的导入。在本申请发明中，所谓损伤部位指的是个体(人或非人动物：以下同)的心肌细胞衰弱、功能停止或死亡的部位及其附近区域、或预计的个体心肌细胞衰弱、功能低下或死亡的部位。此时，作为将基因表达载体或含有该载体的药物组合物导入损伤部位的方法，如开胸后使用注射器直接注入心脏的方法或在X线透视下用导管经血管注入的方法。经血管注入的方法由于可以将基因的导入局限于心脏，所以比较理想，此时，基因表达载体或含有该载体的药物组合物既可以注入血管内，通过血流输送到心肌细胞，也可以直接注入心肌层内后使它们与心肌细胞接触。这样的使用导管等的外科手术手技在该领域众所周知，作为参考书籍，例如Gene Transfer jn Cardiovascular System：Experimental Approaches & Therapeutic Implications(March编，KluwerAcademic Publishers、1997)以及Vascular Surgery第5版(Rutherford、W.B.Saunders，2000)、Textbook of Interventional Cardiology第4版(Topol编，W.B.Saunders、2002)等著作。另外，用于实施上述方法的导管可从Boston Scientific公司或Edwards Lifesciences Corporation公司等购买。
(通过本发明方法增殖的心肌细胞的利用)
通过本发明方法增殖的心肌细胞接下来可以通过使用众所周知方法中的细胞回收、分离、纯化法，可以高效、且大量获得高纯度的心肌细胞。以下将这样得到的心肌细胞称为通过本发明制备的心肌细胞。
心肌细胞的纯化方法可以使用任一种众所周知的细胞分离纯化方法，具体的例子，如流式细胞术和磁珠、淘选法等依据抗原-抗体反应的方法以及通过使用蔗糖、珀可(percoll)等载体进行密度梯度离心的细胞分级法。作为另一种心肌细胞筛选法，预先对作为心肌细胞源的动物或ES细胞等干细胞的基因人为地添加赋予药剂耐性和异地性蛋白表达能力那样的修饰，以这些指标作为基础有选择地回收心肌细胞的方法。例如，据报道Field和共同研究者们通过将在α型肌球蛋白重链启动子调控下可表达新霉素(G418)耐性基因的基因盒导入小鼠ES细胞，构建只在该ES细胞向心肌细胞分化，同时表达α型肌球蛋白重链基因时，在添加了G418的培养基中可存活的体系。通过该方法作为G418耐性细胞筛选的细胞99％或以上概率是心肌细胞(美国专利第6,015,671号；J.Clin.Invest.98：216，1996)。
作为本发明的另一种方案，根据本发明制备的心肌细胞可用于各种生理活性物质(例如药物)或功能未知的新基因产物等的药理评价和活性评价中。例如，可在对与心肌细胞的功能调节有关的物质和药剂、或对心肌细胞具有毒性或伤害性的物质或药剂的筛选中利用。当然在该方案中，包含根据本发明制备的心肌细胞的评价试剂盒也可以在上述筛选中利用。
作为供筛选的被试验物质，只要是可以添加到培养体系的物质都可以，不管其种类为何，例如低分子化合物、高分子化合物、有机化合物、无机化合物、蛋白质、肽、基因、病毒、细胞、细胞培养液、微生物培养液等。作为将基因有效地导入培养体系的方法，如使用逆病毒、腺病毒等的病毒载体添加到培养体系的方法、或封入脂质体等后添加到培养体系的方法等。
被试验物质的评价可以通过测定心肌细胞功能质或量的变化来进行。以心肌细胞的存活率作为一个例子，将根据本发明制备的心肌细胞按照适当的细胞密度接种到培养板上，在不含有血清的培养基中进行培养，可诱导细胞死亡(凋亡)，此时，将适当量的被试验物质添加到培养基中，可以测定心肌细胞的存活率或死亡率。作为心肌细胞存活率或死亡率的测定方法，可以通过台盼蓝等色素的掺入作为指标的肉眼观察，也可以使用以脱氢酶活性(还原活性)作为指标的方法，以及以凋亡细胞中特异的胱天蛋白酶活性和膜联蛋白V的表达作为指标的方法。利用该机制的试剂盒由Sigma公司或Clonetech公司、Promega公司等多个生产商销售，可容易地使用利用该机制的试剂盒。
通过上述筛选方法得到的物质和药剂由于具有心肌细胞的分化诱导作用和功能调节作用，所以可以作为例如心肌梗塞、缺血性心脏病、淤血性心力衰竭、肥大型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎、慢性心力衰竭等心脏病的预防药或治疗药使用。这些化合物可以是新的化合物，也可以是众所周知的化合物。
另外，根据本发明制备的心肌细胞也可以作为心肌再生或心脏疾病治疗用的移植用细胞使用。作为心脏疾病，如心肌梗塞、缺血性心脏病、淤血性心力衰竭、肥大型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎、慢性心力衰竭等。作为移植用细胞，只要是含有高纯度的根据本发明制备的心肌细胞，无论是使细胞悬浮于培养基等水性载体的细胞，还是将细胞包埋于生物体分解性基质等固相载体中的细胞，或加工成单层或多层心肌细胞片(Shimizu等人，Circ.Res.90：e40，2002)的细胞等任意形式的细胞都可以使用。
作为将上述移植用心肌细胞移植到损伤部位的方法，如开胸、使用注射器直接注入心脏的方法、通过外科手术切开心脏的一部分进行移植的方法、以及通过使用导管的经血管方法进行移植的方法等(Murry等人，ColdSpring Harb.Symp.Quant.Biol.67：519，2002；Menasche、Ann.Thorac.Surg.75：S20，2003；Dowell等人，Cardiovasc.Res.58：336，2003)，没有特别限定。据报道通过这样的方法，将从胎儿心脏回收的心肌细胞移植到心损伤动物的心脏中显示出非常好的治疗效果(Menasche，Ann.Thorac.Surg.75：S20，2003；Reffelmann等人，Heart Fail.Rev.8：201，2003)。来自ES细胞的心肌细胞呈现出与来自胎儿心脏的心肌细胞非常类似的性状(Maltsev等人，Mech.Dev.44：41，1993；Circ.Res.75：233，1994)。而实际上在将来自ES细胞的心肌细胞移植到成体心脏的动物实验例中，确认与移植了胎儿心肌的情形几乎没有什么不同，表现出极高的存活性(Klug等人，J.Clin.Invest.98：216，1996)。因此，在起因于心肌细胞的疲惫和脱落的上述心脏病中，通过将根据本发明所述方法制备的心肌细胞补充性地移植到有病的心脏组织，预期可以促进心功能的改善。
实施例
以下给出实施例对本发明进行更具体说明，但以下的实施例仅代表本发明的例示，并不用于对本发明的范围进行限定。
〔实施例1：重组腺病毒的制备〕
含有CDK4基因、添加了编码核定位信号(NLS)的碱基序列的细胞周期蛋白D1(D1NLS)基因、或Skp2基因的腺病毒载体使用重组腺病毒制作试剂盒(Adenovirus Expression Vector Kit；Takara Bio)制作。
即，在制备含有CDK4基因的腺病毒载体即Ad-CDK4时，通过将质粒pCMV-CDK4(从Sander van den Heuvel博士〔Massachusetts GeneralHospital Cancer Center；美国〕获得；van den Heuvel等人，Science262：2050，1993)用BamHI切断，制备小鼠CDK4cDNA片段，使用T4 DNA聚合酶将其末端补平后，按照上述重组腺病毒制作试剂盒附带的操作说明，插入到粘粒pAxCAwt的SwaI部位，制作粘粒pAd-CDK4。然后通过使该粘粒和来自人腺病毒5型基因组DNA的经限制性酶处理过的DNA-TPC(末端肽复合体)转染来自人胎儿肾脏的293细胞，制作重组腺病毒Ad-CDK4。
含有D1NLS基因的质粒通过将来自pRSV-cyclinD1(Matsushime等人，Cell 65：701，1991)的小鼠细胞周期蛋白D1 cDNA片段与来自pEF/myc/nuc(Invitrogen)的NLS连接后构建。即，将质粒pEF/myc/nuc用限制性酶NcoI和XhoI切断后制备含有NLS序列的第一DNA片段。然后将质粒pRSV-cyclinD1用限制性酶NcoI切断，制备含有细胞周期蛋白D1序列的第二DNA片段。再以质粒pRSV-cyclinD1作为模板，使用以下2种引物进行PCR，制备编码细胞周期蛋白D1 cDNA的C末端侧的第三DNA片段。
5’-引物：5’-ACCCTCCATGGTAGCTGCTGGGA 3’(序列编号2)
3’-引物：5’-TGATCTCGAGGTCGATGTCCACATCTCGCACGT-3’(序列编号3)
使用T4 DNA连接酶将这3种DNA片段连接，构建在小鼠细胞周期蛋白D1 cDNA的C末端侧具有编码重复3次的来自SV40 Large T抗原的核定位信号(NLS)的碱基序列的质粒。将用限制性酶PmaCI和SmaI从该质粒切出的DNA片段与上述同样插入到粘粒pAxCAwt的SwaI部位，用该粘粒(pAd-D1NLS)和限制性酶处理过的DNA-TPC转染293细胞，制作重组腺病毒Ad-D1NLS。
含有Skp2的腺病毒载体Ad-Skp2以小鼠Skp2 cDNA为基础制作。小鼠Skp2 cDNA以登录在GenBank的小鼠EST(表达序列标签)克隆(登录号AA511897)作为探针，从小鼠胸腺cDNA文库(Stratagene)分离(中山等人，特开2001-224380号说明书)。即，根据常规方法从上述EST克隆制作32P标记探针，与以cDNA文库为基础制作的影印滤膜在缓冲液中于68℃杂交24小时后，使用含有0.1％SDS的缓冲液在68℃进行清洗。将得到的阳性克隆亚克隆到pBluescript SK(Stratagene)质粒，确定其碱基序列。这样确定的小鼠Skp2 cDNA的碱基序列已登录在GenBank(登录号AF083215)(Nakayama等人，EMBO J.19：2069，2000；中山等人，特开2001-224380号说明书)。以上述小鼠Skp2 cDNA为模板，使用以下2种引物进行PCR，制备在N末端具有Flag标签序列(N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C；序列编号4)的小鼠Skp2cDNA片段后，插入到pcDNA-3载体(Invitrogen)的xhoI部位，制作pcDNA3-Flag-Skp2载体。
5’-引物：
5’-ATACTCGAGGCCACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGCATAGGAAGCACCTTCAGGAGATT-3’(序列编号5)
3’-引物：5’-ATACTCGAGTCATAGACAACTGGGCTTTTGCAG-3’(序列编号6)
然后将含有用XhoI切断pcDNA3-Flag-Skp2载体得到的Skp2 cDNA片段与上述同样插入到粘粒pAxCAwt的SwaI部位，通过使该粘粒和来自人腺病毒5型基因组DNA的经限制性酶处理过的DNA-TPC(末端肽复合体)转染来自人胎儿肾脏的293细胞，制作重组腺病毒Ad-Skp2。
用上述方法制作的3种重组腺病毒(Ad-CDK4、Ad-D1NLS、以及Ad-Skp2)已成为在CAG启动子(CMV增强子、鸟β-肌动蛋白启动子、兔β-珠蛋白基因的加聚A信号序列)的调控下各插入基因表达的构建，可使这些基因在哺乳动物的细胞内高表达。
然后，回收各重组病毒的高效价病毒液。将上述3种粘粒(pAd-CDK4、pAd-D1NLS以及pAd-Skp2)各4μg与上述重组腺病毒制作试剂盒附带的经限制性酶处理过的DNA-TPC 2.5μl混合，通过使用FuGENETM6Transfection Reagent(Roche)的脂转染法转染分别在培养皿(直径60mm)中培养的293细胞。第二天，剥离细胞，将回收的细胞悬浮液接种到分别用胶原包被的培养板(96孔)上。由于病毒增殖，细胞死亡的孔出现在7～15日之间，将细胞完全死绝的孔中的培养液无菌下移到灭菌管，反复冻融6次，将经离心分离(5000转/分钟，5分钟)回收的上清作为1次病毒液，于-80℃保存。用10μl该1次病毒液感染于胶原包被的培养板(24孔)培养的293细胞，将3～4日后细胞死绝的孔的培养液无菌下移至灭菌管后，反复冻融6次，将经离心分离(5000转/分钟，5分钟)回收的上清作为2次病毒液，于-80℃下保存。用15μl该2次病毒液感染于胶原包被的培养用烧瓶(25cm2)培养的293细胞，将3～4日后细胞死绝的孔的培养液无菌下移至灭菌管后，冻融或用密封型超声机破碎之后使病毒游离。将离心分离(3000转/分钟，10分钟、4℃)后回收的上清作为3次病毒液保存在-80℃。用50μl该3次病毒液感染于胶原包被的培养用烧瓶(75cm2)中培养的293细胞，将3～4日后细胞死绝的孔的培养液无菌下移至灭菌管后，冻融或用密封型超声波发生器破碎之后使病毒游离。将离心分离(3000转/分钟，10分钟、4℃)后回收的上清作为4次病毒液保存在-80℃。该4次病毒液的效价使用293细胞通过噬菌斑测定法确定，无论那一次的效价都处于109～1011pfu/mL范围内。另外在本说明书内容中，以下用感染复数(multiplicity of infection；moi)表示平均感染每个细胞的活病毒粒子数。即，将用一个病毒粒子感染1个细胞时表示为moi＝1。
〔实施例2：p27Kip1蛋白质在DNLS/CDK处理的心肌细胞中的蓄积〕
从出生后2～4日的大鼠(Sprague-Dawley品系)分离心肌细胞，通过珀可浓度梯度离心分离回收心肌细胞级分(Tamamori等人，Am.J.Physiol.275：H2036，1998)。这样得到的95％或以上细胞通过使用抗肌节肌动蛋白抗体的免疫染色确认是心肌细胞。该新生仔大鼠心肌细胞在悬浮于添加了5％胎牛血清(FBS；Flow Laboratories)的Eagle基本培养基(Flow Laboratories)后接种到培养用皿上，于二氧化碳培养箱中，37℃下培养24小时。第二天，将培养液换成无血清的Eagle基本培养基，再培养24小时后，将实施例1制备的重组病毒Ad-D1NLS(moi＝10～100)和Ad-CDK4(moi＝100)添加到培养基中，培养48小时。以下，使重组病毒Ad-D1NLS和Ad-CDK4感染并导入(转染)心肌细胞，使细胞周期蛋白D1蛋白和CDK4蛋白在心肌细胞的核内表达，有时将这样的过程称之为D1NLS+CDK4刺激、或D1NLS+CDK4处理。作为对照，使用大鼠成纤维细胞株REF52细胞进行同样的实验。
首先使用Western印迹法研究p27Kip1蛋白在导入了D1NLS和CDK4基因的心肌细胞中的表达。转染了Ad-D1NLS和Ad-CDK4病毒的细胞用冰冷的PBS(磷酸缓冲盐溶液)进行清洗后，用细胞刮棒刮下，离心分离后弃去上清。将得到的沉淀用少量的PBS再清洗一次后，移到1.5mL的Eppendorf管中，加5倍沉淀体积的冰冷缓冲液A(10mM HEPES(pH7.9)，1.5mM MgCl2，10mM KCl，0.5mM DTT)，搅拌后于冰上静置10分钟。然后按照终浓度达到0.2％那样加NONIDET P-40，搅拌后，于冰上静置5分钟。再向离心分离(5,000转、5分钟)得到的沉淀中加等体积的缓冲液C(20mM HEPES(pH7.9)，25％甘油，0.42M NaCl，1.5mM MgCl2，0.2mM EDTA)，搅拌，于冰上静置30分钟后，离心分离(15,000转/分钟、10分钟)回收上清，作为核蛋白级分使用。而对于上述缓冲液A和缓冲液C，无论那一个都是在临使用前添加1mM DTT，1mM PMSF，1μg/ml抑酶肽，1μg/ml亮抑蛋白酶肽，1μg/ml抑胃酶肽(都来自Sigma)。
这样得到的核蛋白质每1样品制备成来自1×106个细胞的量后，进行SDS-PAGE用凝胶电泳，转移到硝酸纤维素膜上进行免疫印迹分析。即，使作为1级抗体的抗细胞周期蛋白D1抗体(Oncogene Science；Ab-3)或抗p27Kip1抗体(Santa Cruz；sc-528)反应后，然后使作为2级抗体的辣根过氧化物酶标记的抗小鼠Ig抗体(Amersham LifeScience；NA931)或抗兔Ig抗体(Amersham LifeScience；NA934)反应，使用化学发光试剂盒(Amersham Life Science；RPN2109)检测与抗体结合的抗原分子的存在。
结果如图1所示。与以前的报告(Nakayama等人，EMBO J.19：2069，2000；参见前面的专利文献1和非专利文献5)同样，能够确认用D1NLS和CDK4基因转染心肌细胞提高了心肌细胞核内的细胞周期蛋白D1蛋白和CDK4蛋白的表达量。此时p27Kip1蛋白的表达伴随着细胞周期蛋白D1蛋白表达量的提高，被强力诱导。另外，在成纤维细胞(REF52细胞)中，如果细胞周期蛋白D1蛋白的表达增加，不用说p27Kip1的表达量就减少，看到在两细胞中p27Kip1蛋白在D1NLS+CDK4刺激下的表现存在差异。
接下来，通过抗体染色法研究p27Kip1蛋白在心肌细胞内中的表达及其定位。与上述方法同样，将转染了Ad-D1NLS和Ad-CDK4病毒(moi＝100)的心肌细胞于病毒感染48小时后用70％乙醇固定。然后使抗p27Kip1抗体(同上)(1∶1000稀释)以及抗肌节肌动蛋白抗体(DAKO；M0874)(1∶100稀释)反应后，使用Alexa FluorTM标记抗体(Alexa-488和Alexa-568；Molecular Probes)(都为1∶200稀释)进行染色。而细胞核用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液(1μg/mL)染色。在荧光显微镜(激光扫描共聚焦成像系统；ZEISS社LSM510)下观察这些抗体或色素的染色图像。
结果如图2所示。在通常的心肌细胞(图中肌节肌动蛋白阳性的细胞)中，虽然在核内可看到p27Kip1的表达，但其表达不那么强。在将D1NLS和CDK4基因导入并表达的心肌细胞中，确认p27Kip1的强表达以及核内集积。以上图1和图2的结果表明通过使D1NLS和CDK4基因在心肌细胞强制表达，诱导了抑制心肌细胞核内细胞周期进行的p27Kip1蛋白的蓄积，结果暗示可能由于D1NLS+CDK4刺激，被诱导的心肌细胞的分裂·增殖能力被抑制。
然后，为了研究D1NLS+CDK4刺激导致的p27Kip1表达量增加是否在转录水平被调控，进行了Northern印迹分析，在心肌细胞以及成纤维细胞中的任一种细胞中，D1NLS和CDK4基因的强制表达都不影响p27Kip1mRNA的表达水平。已知p27Kip1表达蛋白量被增殖性细胞中遍在蛋白-蛋白酶体分解系统抑制(Carrano等人，Nature Cell Biol.1：193，1999；Tsvetkov等人，Curr.Biol.9：661，1999)。因此，对于在心肌细胞中p27Kip1蛋白的表达量是否也受到蛋白酶体分解系统的调节进行了研究。将用上述方法制备的心肌细胞于血清饥饿状态下培养24小时后，将Ad-D1NLS和Ad-CDK4(moi＝100)添加到培养基后培养48小时。另外，在另一个组，将心肌细胞于血清饥饿状态下培养48小时后，将10％量的FBS添加到培养基中后培养24小时。此时，同时设置添加和不添加作为蛋白酶体抑制剂的lactacystin(20μM)(Santa Cruz)组，通过免疫印迹法研究p27Kip1蛋白在各处理组中的表达量。
结果可以确认在D1NLS+CDK4刺激组，与图1同样，p27Kip1蛋白的表达量显著增加(图3)。而在FBS刺激下p27Kip1的表达量减少。在心肌细胞中，发明者们以前的研究表明虽然由于FBS刺激增加了细胞周期蛋白D1蛋白以及CDK4蛋白的表达，但不会引起这些分子向核内移动，其结果不能使细胞周期活化(参照前面的专利文献1和非专利文献5)，这暗示p27Kip1蛋白量在心肌细胞中增加对刺激细胞周期蛋白D1蛋白和/或CDK4蛋白向核内移动是特异的。另外，当通过lactacystin处理抑制蛋白酶体的功能和作用时，在未添加组、FBS处理组、D1NLS+CDK4处理组中的任一个组都没有看到p27Kip1蛋白在表达水平上的差别。这一结果意味着在未添加组和FBS处理组，p27Kip1蛋白被常规分解，但在D1NLS+CDK4处理组，其功能和作用被抑制。
接下来，为了研究p27Kip1蛋白质在心肌细胞中的遍在蛋白化能力，在体外进行遍在蛋白测定。详细的实验方法基本上根据本发明者们已报告论文(Nakayama等人，EMBO J.19：2069，2000；中山等人，特开2001-224380号明细书；Hara等人，J.Biol.Chem.276：48937，2001；Ishida等人，J.Biol.Chem.277：14355，2002)所述的方法。首先，将用上述方法制备的心肌细胞于血清饥饿状态下培养24小时后，将Ad-D1NLS和Ad-CDK4(moi＝100)添加到培养基后培养48小时。另外，另一个组于血清饥饿状态下培养48小时后，将10％量的FBS添加到培养基后培养24小时。而作为对照，使用于添加10％FBS的培养基中培养的REF52细胞。将这些细胞用冰冷的PBS清洗后，用细胞刮棒刮下，离心分离后弃去上清。向得到的沉淀中加入添加了0.5％NONIDET P-40的2倍量缓冲液C(前述)，搅拌，并于冰上静置30分钟后，进行超声破碎处理。然后，将离心分离(15,000转/分钟、20分钟)回收的上清作为细胞提取物使用。
作为遍在蛋白化反应底物使用的重组p27Kip1蛋白通过使用兔网织红细胞的细胞提取物(网织红细胞裂解物)的体外翻译系统制作。即，使用市售的在体外转录·翻译试剂盒(TnT coupled Reticulocyte LasateSystem；Promega)，按照附带的操作说明，以添加了Flag标签序列的小鼠p27Kip1cDNA作为模板，进行体外转录和翻译。将这样制作的重组p27Kip1蛋白和各细胞提取样品(作为蛋白量为20～40μg)与小鼠E1蛋白(50μg/mL)、小鼠E2/Ubc5蛋白(100μg/mL)、GST-Ub蛋白(4mg/mL)(都来自Calbiochem)一起制备成最终量10μL的反应液(4mM Tris-HCl(pH7.5)，6mM NaCl，5mM MgCl2，0.1mM DTT，0.1mg/mL肌酸磷酸激酶，10mM磷酸肌酸，1.5mM ATP)，于26℃下反应30分钟。然后该样品经SDS-PAGE凝胶电泳，转印到硝酸纤维素膜上后，进行免疫印迹分析。即，使作为1级抗体的抗Flag抗体(Sigma；F-3165)或抗GST抗体(Santa Cruz；sc-138)(都进行1∶1000稀释)反应后，使作为2级抗体的辣根过氧化物酶标记的抗小鼠Ig(同上)(1∶1000稀释)反应，使用化学发光试剂盒(同上)检测与抗体结合的抗原分子的存在。
结果如图4所示。首先，作为阳性对照，使用增殖中的(FBS刺激下)成纤维细胞的细胞提取物进行了p27Kip1蛋白的体外遍在蛋白化反应(图中为REF)，其中通过使用识别添加在重组p27Kip1蛋白上的Flag肽的抗体(图中，IB：Flag)、以及识别添加在重组遍在蛋白上的GST蛋白的特异抗体(图中，IB：GST)，可以明确检测受到遍在蛋白化的p27Kip1蛋白的存在。然而，当使用由用FBS刺激的心肌细胞制备的细胞提取物时，只看到对p27Kip1蛋白有弱的遍在蛋白化，在转染了D1NLS和CDK4基因的心肌细胞中，只检测到非常弱的遍在蛋白化p27Kip1蛋白的条带。图3和图4所示的结果强烈暗示，在D1NLS+CDK4刺激下的心肌细胞中，p27Kip1蛋白的遍在蛋白化被显著抑制，结果由于难于引起蛋白酶体分解，p27Kip1蛋白在核内蓄积。
〔实施例3：Skp2强制表达导致心肌细胞中蓄积的p27Kip1蛋白减少〕
已知在一般的增殖性细胞中，p27Kip1蛋白被含有作为F盒蛋白的Skp2的遍在蛋白连接酶即SCFSkp2复合体遍在蛋白化，被蛋白酶体分解(Carrano等人，Nature Cell Biol.1：193，1999；Tsvetkov等人，Curr.Biol.9：661，1999)。因此，通过免疫印迹法对Skp2蛋白在心肌细胞中的表达进行了研究。心肌细胞的制备、Ad-D1NLS以及Ad-CDK4的转染法、核蛋白质的制备、免疫印迹分析等与上述方法相同，为了检测Skp2蛋白使用上述的抗Skp2抗体。
结果如图5所示。在作为对照细胞使用的成纤维细胞(REF52细胞)中，通过促使增殖的FBS刺激和D1NLS+CDK4刺激，Skp2蛋白的表达显著亢进。然而，在心肌细胞中几乎看不到Skp2蛋白的表达诱导，在转染了D1NLS和CDK4基因的心肌细胞中只检测到极微量的Skp2蛋白。由该结果可以认为在心肌细胞中由于没有引起Skp2的表达诱导，所以可能存在着由于D1NLS+CDK4刺激所蓄积的p27Kip1蛋白的分解被抑制。
因此，再使Skp2基因在转染了D1NLS和CDK4基因的心肌细胞共表达，研究对p27Kip1蛋白表达的影响。用实施例1制备的Ad-D1NLS(moi＝100)、Ad-CDK4(moi＝100)和Ad-Skp2(moi＝50、100)转染心肌细胞，培养48小时后，通过免疫印迹法对细胞周期蛋白D1、Skp2以及p27Kip1蛋白的表达进行解析。心肌细胞的制备、核蛋白质的制备、免疫印迹分析等方法与上述所述的方法相同。
图6给出了使D1NLS、CDK4、Skp23个基因在心肌细胞中共表达的结果。用D1NLS和CDK4基因转染心肌细胞，与上述的实验(图1、3)同样，p27Kip1蛋白的表达被强力诱导。此时，用Ad-Skp2转染心肌细胞，使Skp2基因共表达，p27Kip1蛋白的表达量显著减少，在用高浓度(moi＝100)的Ad-Skp2感染的心肌细胞中，几乎看不到p27Kip1蛋白的表达。
在图7中，在转染了D1NLS和CDK4基因的心肌细胞中p27Kip1蛋白的蓄积由于Skp2基因的共表达导致的减少可以再使用免疫组织染色法确认。免疫组织染色方法与上述实验(图2)的方法相同。与图2同样，在转染了D1NLS和CDK4基因的心肌细胞中观察到p27Kip1的强力表达以及核内集积。另外当使Skp2基因共表达时，确认细胞核内的p27Kip1蛋白显著减少。另外，对于共表达了D1NLS、CDK4和Skp2基因的心肌细胞进行lactacystin处理时，p27Kip1蛋白的表达水平恢复到与D1NLS+CDK4刺激时的同等程度，也确认由于Skp2蛋白的强制表达导致的p27Kip1蛋白减少是通过遍在蛋白-蛋白酶体分解系统介导的。
〔实施例4：通过Skp2强制表达促进心肌细胞增殖的效果〕
通过用Ad-D1NLS、Ad-CDK4、和Ad-Skp2(都为moi＝100)转染心肌细胞，经时测定转染后的细胞数，从而研究Skp2基因导入对心肌细胞的增殖能力的影响。与已报告(参见上述专利文献1及非专利文献5)的结果同样，使D1NLS和CDK4基因表达的心肌细胞在培养7日后其细胞数增加到约3倍(图8)。而在使D1NLS、CDK4、Skp2三者表达的心肌细胞中，确认细胞数可增至5倍或以上。作为阴性对照的只使载体腺病毒感染的心肌细胞、以及只使Ad-Skp2感染的心肌细胞中几乎没有观察到细胞数的增加。以上结果表明Skp2可更有意义地促进由于D1NLS+CDK4刺激被促进的心肌细胞增殖能力。
[实施例5：通过p27siRNA处理促进心肌细胞增殖的效果]
为了进一步阐明在D1NLS+CDK4处理的心肌细胞中p27Kip1蛋白的影响，在心肌细胞内使对p27Kip1基因特异的siRNA(以下称为“p27siRNA”)表达，研究其效果。
为了构建p27siRNA表达用载体，以大鼠p27Kip1cDNA的碱基序列情报(基因库的存取号：D83792)为基础进行靶序列的确定、以及构建表达相当于该序列的siRNA的载体时使用的寡DNA的设计和制作。作为该靶序列，采用大鼠p27Kip1cDNA的核苷酸编号830～847(5’-GGCAGAAGATTCTTCTTC-3’；序列编号7)、532～550(5’-AGCGCAAGTGGAATTTCGA-3’；序列编号8)、372～390(5’-GTGAGAGTGTCTAACGGGA-3’；序列编号9)3种。以下将基于序列编号7～9的siRNA定为#1、#4、#6。构建表达基于序列编号7～9的siRNA-#1、#4、#6的载体时使用的插入寡DNA序列如下所示。
siRNA-#1：5’-CACCGGTAGG AGGTTCTTCT TCAACGTGTGCTGTCCGTTG AAGAAGAATC TTCTGCCTTT TT-3’(序列编号10)和5’-GCATAAAAAG GCAGAAGATT CTTCTTCAAC GGACAGCACACGTTGAAGAA GAACCTCCTA CC-3’(序列编号11)。
siRNA-#4：5’-CACCAGTGTA AGTGGAGTTT CGAACGTGTGCTGTCCGTTC GAAATTCCAC TTGCGCTTTT TT-3’(序列编号12)和5’-GCATAAAAAA GCGCAAGTGG AATTTCGAACGGACAGCACA CGTTCGAAAC TCCACTTACA CT-3’(序列编号13)。
siRNA-#6：5’-CACCGTGGGA GTGTTTAATG GGAACGTGTGCTGTCCGTTC CCGTTAGACA CTCTCACTTT TT-3’(序列编号14)和5’-GCATAAAAAG TGAGAGTGTC TAACGGGAACGGACAGCACA CGTTCCCATT AAACACTCCC AC-3’(序列编号15)。
使上述3组含有siRNA靶序列的寡DNA退火后，插入到RNA表达用载体(pcPURU6βicassette、iGENE公司)的BsmMI部位。该载体成为了在人U6启动子调控下开始转录相当于插入基因的RNA的构建，在哺乳动物的细胞内可使目的RNA高效表达。然后，将该载体用EcoRI和HindIII进行酶切，对含有U6启动子和插入基因序列的片段进行纯化，其末端用T4 DNA聚合酶修平后，插入到粘粒pAxcwit(TAKARA BIO公司)的SwaI部位。然后通过使该粘粒和来自人腺病毒5型基因组DNA的经限制性酶处理过的DNA-TPC转染来自人胎儿肾脏的293细胞，制作表达p27Kip1 siRNA的重组腺病毒(Ad-p27 siRNA-#1、#4、#6)。然后对于该病毒载体，通过与实施例1同样的方法，回收高效价病毒液。
首先使上述p27 siRNA在转染了D1NLS和CDK4基因的心肌细胞中共表达，然后通过免疫印迹法研究影响p27Kip1蛋白表达的效果。即，用Ad-D1NLS、Ad-CDK4、以及Ad-p27siRNA(分别为moi＝100)转染心肌细胞，培养48小时后，通过免疫印迹法对p27Kip1蛋白表达进行分析。心肌细胞的制备、核蛋白质的制备、免疫印迹分析等方法与上述(实施例1和3)所述的方法相同。
结果如图9所示。如果用D1NLS和CDK4基因转染心肌细胞，与上述实验(图1、3、7)同样，p27Kip1蛋白的表达被强力诱导。此时通过使p27 siRNA(#1、#4、#6)在心肌细胞中表达，p27Kip1蛋白的产生显著减少，特别是使用p27 siRNA-#6，几乎看不到p27Kip1蛋白的表达。p27siRNA的表达对p27Kip1蛋白表现出特异的抑制效果，对p21Cip1蛋白和细胞周期蛋白D1蛋白、肌节肌动蛋白的细胞内含有量没有影响。另外，即便免疫组织染色的结果也几乎观察不到由于p27 siRNA的表达，p27Kip1蛋白在心肌细胞核内的集积。
接下来，用Ad-D1NLS、Ad-CDK4、以及Ad-p27siRNA-#6(都为moi＝100)转染心肌细胞，对转染后的细胞数进行经时测定。与实施例4的结果同样，使D1NLS和CDK4基因表达的心肌细胞，在培养7日后，其细胞数约增加到3倍(图10)。而，在使D1NLS、CDK4、p27siRNA三者表达的心肌细胞中，能够确认细胞数有意义增加。另外，作为阴性对照，在感染LacZ表达病毒的心肌细胞、以及只使Ad-p27 siRNA感染的心肌细胞中几乎看不到细胞数增加。以上结果表明通过p27 siRNA的表达可更有意义地促进由于D1NLS+CDK4刺激被促进的心肌细胞的增殖能力。
〔实施例6：Skp2基因强制表达的心治疗效果〕
为了确认通过D1NLS+CDK4十Skp2基因的强制表达导致受损伤心组织中心肌细胞增殖效果表现出治疗效果，利用大鼠心肌缺血再灌流模型进行了研究。该模型的制作根据Dairaku等人的方法(Circ.J.66：411、2002)进行。通过对Wistar品系雄性大鼠(8周龄)进行腹腔内注射戊巴比妥钠(Nembutal：大日本制药)(55mg/kg)麻醉后，在人工呼吸下开胸，使心脏露出。然后用带有缝合线的5-0号针将左冠状动脉结扎，放置30分钟后，解除结扎，再接通血流(再灌流)。作为假手术组(以下称为Sham组)，使用仅将缝合线通过冠状动脉这一处置的动物作为对照。
腺病毒载体向心脏的导入在缺血后25～30分钟期间进行。将与上述实施例制作·使用的载体同批号的高效价腺病毒液(1×109～pfu/mL)使用30G注射针，按照1处50μL，共5处(总量250μL)直接注入缺血中心部分以及周边部分的心肌层。
以下将为了观察D1NLS+CDK4处理的效果，注入了Ad-D1NLS(1×109pfu)和Ad-CDK4(1×108pfu)、Ad-LAcZ(1×109pfu)3种腺病毒混合液的动物组称为“D1NLS组”。另外，以下将为了观察D1NLS+LCDK十Skp2处理的效果，注入了Ad-D1NLS(1×109pfu)和Ad-CDK4(1×108pfu)、Ad-Skp2(1×109pfu)3种腺病毒混合液的动物组称为“Skp2组”。作为阴性对照组，设置注入了Ad-LacZ(2×109pfu)的动物组(以下称为“Cont组”)。而对于Sham组不注入腺病毒液。闭胸后、使大鼠从麻醉回复，在通常饲养条件下饲养6周。
首先，作为伴随缺血再灌流损伤出现的心肌坏死的指标，测定血浆中的心肌肌钙蛋白T(cTnT)值(O′brien等人，Lab.Anim.Sci.47：486、1997；森本等人，J.Pharmacol.Sci.91：151[Suppl.I]，2003)。将再灌流2小时后从眼底采血的血液经离心处理，获得血浆，使用心脏读取仪(RocheDiagnostics)测定cTnT值。其结果表明，缺血再灌流后的cTnT值与Sham组比较，在Cont组、D1NLS组以及Skp2组观察到显著增加(Sham组：0.2±0.0ng/mL、Cont组：8.8±0.5ng/mL、D1NLS组：9.1±0.7ng/mL、Skp2组：9.9±1.3ng/mL)。在Sham组以外的3组之间cTnT值没有差别，暗示诱发同程度的心肌坏死。
再灌流6周后，使用超声诊断仪(Power Vision 8000：东芝药业)，通过断层法(B模式法)和经时表示断层法的M模式法进行心功能测定。对大鼠进行腹腔内注射氯胺酮(ケタラ-ル：三共)和甲苯噻嗪(Sigma)，麻醉后，使用15MHz的线性探针，通过用M模式法计测左室短轴乳头肌部，测定左室舒张末期径以及收缩末期径，算出左室内径短缩率(FS)。
左室内径短缩率(FS)＝(舒张末期径-收缩末期径)/舒张末期径×100(％)。
另外，通过用B模式法计测左室长轴，测定左室舒张末期面积、收缩末期面积，算出左室腔内面积变化率(FAC)，作为收缩功能的指标。
左室腔内面积变化率(FAC)＝(舒张末期面积-收缩末期面积)/舒张末期面积×100](％)。
再使用10MHz扇形探针，通过Doppler法测定舒张早期(E)和心房收缩期(A)的左室流入血流，算出E/A值，作为舒张功能的指标。以上测定试验者都是在不知道各动物个体的处置内容那样的盲检下进行的。
通过上述方法测定心肌缺血再灌流6周后的心功能，结果相对于Sham组而言，Cont组左室短缩率(FS)以及面积变化率(FAC)表现出低值，另外舒张早期和心房收缩期的左室流入血流比(E/A)表现出高值，确认收缩功能以及舒张功能明显降低。与此相反，在D1NLS组或Skp2组，FS和FAC表现出比Cont组高的值，E/A值确认有更明确的改善效果，Skp2组相对于Cont组表现出有意义的低值。D1NLS组虽然表现出比Cont组低的E/A值，但不能确认为统计上有意义的差值(Sham组：2.30±0.25、Cont组：5.49±0.86、D1NLS组＝3.69±0.68、Skp2组：3.44±0.57：n＝9～12)。
接下来，于心脏超声检查测定的第二天进行心脏血流动力学的分析。将戊巴比妥钠注入大鼠腹腔内，进行麻醉后，从右颈动脉将带有微芯片压力转换器的导管(SPC-320：Millar Instruments)插入左心室内，计测作为左室收缩能力指标的左心室压(LVP)的最大微分速度(dP/dt max)以及dP/dtmax用同时计测的LVP除后的dP/dt/P max。另外计测作为左室舒张能力指标的LVP的最小微分速度(dP/dt min)以及左室舒张末期压(LVEDP)。以上的测定是在试验者不知道各动物个体的处置内容那样的盲试验下进行的。
结果如表1所示。
表1
  实验组   Sham   Cont   D1NLS   Skp2
  例数LVEDP(mmHg)LV dP/dt max(mmHg/sec)LV dP/dt min(-mmHg/sec)LV dP/dt/P max(1/sec)   93.4±1.27457±3086492±31275±5   1013.3±2.5※5572±230※3631±182※40±3※   129.5±2.36022±264※4047±270※51±5※   108.5±1.76183±250※4449±248※#54±4※#
※：相对于Sham组p＜0.05。#：相对于D1NLS组p＜0.05。
相对于Sham组，Cont组左室舒张末期压(LVEDP)表现出有意义的高值。另外左心室压(LVP)的最大微分速度(dP/dt max)、最小微分速度(dP/dtmin)、或dP/dt/P max表现出有意义的低值。以上结果意味着在该动物中，左室收缩能力和舒张能力降低。在D1NLS组，dP/dt max、dP/dt min和dP/dt/P max3个指标与Cont组相比都表现出高值。在Skp2组，各指标与D1NLS组相比都表现出更高的值，dP/dt min和dP/dt/P max与Cont组相比表现出有意义的高值。
对心脏血流动力学计测后，摘出肺，测定其湿重量(图11)。相对于Sham组，在Cont组表现出有意义的高肺重量。这表明在该动物中有引起肺充血的可能性。D1NLS组与Cont组比，肺重量低，Skp2组表现出有意义的低值，暗示肺充血有改善。
另外，使用心功能测定后的摘出心脏，做成被动的(左室)压-体积曲线。基本的方法根据Pfeffer等人的报告(Circ.Res.57：84、1985)。即，心功能测定后，从大鼠的尾静脉注入肝素(Novo-heparin：Aventis Pharma)和饱和氯化钾液，使心脏在舒张期停止。立即摘出心脏，从大动脉将双腔导管(DP-8：夏目制作所)插入左心室内。将管的一端与压力转换器相连，一边测定左心室压，一边从管的另一端以0.72mL/分钟的速度注入生理盐水，将压力-体积曲线纪录在图表中。对一个摘出心进行3次试验，算出平均值。另外，由各个体的压力-体积曲线算出对应于用附带微芯片压力转换器的导管测定的左室舒张末期压的体积，通过用体重进行修正，算出左室舒张末期体积系数(LVEDVI)。
结果如图12所示。观察到相对于Sham组，Cont组被动的压力-体积曲线显著向右方移动。该结果表明心肌缺血再灌流后可能进行称为增大左室体积以及使梗塞部薄化的左室重建。D1NLS组与Cont组相比，被动的压力-体积曲线向右方的移动减弱。观察到Skp2组无论相对于Cont组，还是相对于D1NLS组，压力-体积曲线都向右方移动的有意义减弱。而左室舒张末期体积系数(LVEDVI)在Cont组表现出高值，而与此相反在D1NLS组表现出比Cont组更低的值。另外，Skp2组在表现出比D1NLS组低的值的同时，相对于Cont组也表现出有意低值(Sham组：0.80±0.12mL/kg、LacZ组：2.18±0.16mL/kg、D1NLS/CDK4组：1.72±0.19mL/kg、Skp2组：1.54±0.17mL/kg；n＝9～12)。
最后研究了缺血再灌流6周后心脏中的心肌梗塞程度。将摘出心脏于10％中性缓冲福尔马林液中固定，石蜡包埋后，从各标本制作6块横断面方向2mm间隔的切片，进行麦氏三色(Masson trichrome)染色，使心肌梗塞区域视觉化后、使用图像分析软件(Lumina vision：三谷商事)测定梗塞区域。梗塞区域的测定参考Jain等人的报告(Circulation103：1920、2001)，测定左室内膜侧全周长、外膜侧全周长以及左室内膜侧瘢痕化周长、外膜侧瘢痕化周长，用以下的计算式算出。
梗塞区域＝[(内膜瘢痕化长+外膜瘢痕化长)/(内膜全周长+外膜全周长)]×100(％)
结果如图13所示。相对于Cont组，D1NLS组梗塞区域显著减少。在Skp2组，观察到与D1NLS组相比，梗塞区域进一步减少，与Cont组比较表现出有意义低的值。
由以上结果确认通过导入D1NLS+CDK4十Skp2基因，改善了伴随心肌梗塞发症的心功能低下或血流动力学的恶化，在抑制肺充血和左室重建的同时，也带来了心肌梗塞区域的缩小效果。
产业上的可利用性
根据本发明的方法，可以比现有方法更有效地诱导心肌细胞的细胞分裂，使细胞增殖，这样制作的细胞可以作为各种药剂的筛选用以及移植治疗用的细胞利用。另外，通过将本法应用于基因治疗，预期可用于起因于心肌细胞缺失等心脏病的再生医学治疗。

Claims (33)

1、心肌细胞的增殖方法，其特征在于：将(1)细胞周期蛋白、(2)细胞周期蛋白依赖性激酶、以及(3)一种或多种选自由编码抑制Cip/Kip家族蛋白的产生、功能或作用的因子的基因和抑制Cip/Kip家族蛋白产生的核酸组成的组中的基因和核酸导入心肌细胞后，培养或维持该细胞。
2、心肌细胞的增殖方法，其特征在于：将(1)细胞周期蛋白、(2)细胞周期蛋白依赖性激酶、以及(3)一种或多种选自由编码抑制Cip/Kip家族蛋白的产生、功能或作用的因子的基因和抑制Cip/Kip家族蛋白产生的核酸组成的组中的基因和核酸在生物体外导入心肌细胞后，培养该细胞。
3、心肌细胞的增殖方法，其特征在于：将(1)细胞周期蛋白、(2)细胞周期蛋白依赖性激酶、以及(3)一种或多种选自由编码抑制Cip/Kip家族蛋白的产生、功能或作用的因子的基因和抑制Cip/Kip家族蛋白产生的核酸组成的组中的基因和核酸导入生物体内的心肌细胞后，维持该细胞。
4、权利要求1至3中任一项所述的方法，其中细胞周期蛋白是可活化哺乳类的CDK4或CDK6的细胞周期蛋白。
5、权利要求4所述的方法，其中细胞周期蛋白是哺乳类的细胞周期蛋白D。
6、权利要求1至5中任一项所述的方法，其中细胞周期蛋白依赖性激酶是被细胞周期蛋白D活化的细胞周期蛋白依赖性激酶。
7、权利要求6所述的方法，其中细胞周期蛋白依赖性激酶是CDK4或CDK6。
8、权利要求1至7中任一项所述的方法，其中Cip/Kip家族蛋白是p27Kip1。
9、权利要求1至8中任一项所述的方法，其中抑制Cip/Kip家族蛋白的产生、功能或作用的因子是具有促进Cip/Kip家族蛋白分解作用的因子。
10、权利要求9所述的方法，其中具有促进Cip/Kip家族蛋白分解作用的因子是遍在蛋白连接酶构成因子。
11、权利要求10所述的方法，其中遍在蛋白连接酶构成因子是可与Cip/Kip家族蛋白结合的F盒因子。
12、权利要求11所述的方法，其中可与Cip/Kip家族蛋白结合的F盒因子是Skp2。
13、权利要求1至12中任一项所述的方法，其中抑制Cip/Kip家族蛋白产生的核酸是对编码Cip/Kip家族蛋白的基因特异的siRNA。
14、权利要求13所述的方法，其中抑制Cip/Kip家族蛋白产生的核酸是对p27Kip1基因特异的siRNA。
15、权利要求1至14中任一项所述的方法，其包括使用病毒载体或脂质体将基因导入心肌细胞。
16、权利要求1至15中任一项所述的方法，其包括在细胞周期蛋白基因以及细胞周期蛋白依赖性激酶基因中的至少一方添加编码核定位信号的碱基序列。
17、载体，其含有(1)细胞周期蛋白基因、(2)细胞周期蛋白依赖性激酶基因、以及(3)一种或多种选自由编码抑制Cip/Kip家族蛋白产生、功能或作用的因子的基因和抑制Cip/Kip家族蛋白产生的核酸序列组成的组中的基因和核酸序列。
18、权利要求17所述的载体，其中细胞周期蛋白是可活化哺乳类的CDK4或CDK6的细胞周期蛋白。
19、权利要求18所述的载体，其中细胞周期蛋白是哺乳类的细胞周期蛋白D。
20、权利要求17至19中任一项所述的载体，其中细胞周期蛋白依赖性激酶是被细胞周期蛋白D活化的细胞周期蛋白依赖性激酶。
21、权利要求20所述的载体，其中细胞周期蛋白依赖性激酶是CDK4或CDK6。
22、权利要求17至21中任一项所述的载体，其中抑制Cip/Kip家族蛋白的产生、功能或作用的因子是具有促进Cip/Kip家族蛋白分解作用的因子。
23、权利要求22所述的载体，其中具有促进Cip/Kip家族蛋白分解作用的因子是遍在蛋白连接酶构成因子。
24、权利要求23所述的载体，其中遍在蛋白连接酶构成因子是可与Cip/Kip家族蛋白结合的F盒因子。
25、权利要求24所述的载体，其中可与Cip/Kip家族蛋白结合的F盒因子是Skp2。
26、权利要求17至25中任一项所述的载体，其中抑制Cip/Kip家族蛋白产生的核酸是对编码Cip/Kip家族蛋白的基因特异的siRNA。
27、权利要求26所述的载体，其中抑制Cip/Kip家族蛋白产生的核酸是对p27kip1基因特异的siRNA。
28、权利要求17至27中任一项所述的载体，其包含在细胞周期蛋白基因和细胞周期蛋白依赖性激酶基因中的至少一方添加编码核定位信号的碱基序列。
29、心脏疾病治疗用药物组合物，其含有权利要求17至28中任一项所述的载体。
30、权利要求29所述的药物组合物，其中心脏疾病是心肌梗塞、缺血性心脏病、淤血性心力衰竭、肥大型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎或慢性心力衰竭。
31、通过权利要求1至16中任一项所述的方法得到的心肌细胞。
32、心脏疾病的治疗方法，作为对患有心脏疾病的个体的治疗方法，其特征是通过将权利要求29所述的药物组合物或权利要求31所述的心肌细胞注入或移植到损伤部位，在该部位维持心肌细胞，并使其增殖。
33、权利要求32所述的治疗方法，其中心脏疾病是心肌梗塞、缺血性心脏病、淤血性心力衰竭、肥大型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎或慢性心力衰竭。
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