WO2014038655A1 - 腸上皮由来体性幹細胞の製造方法 - Google Patents

腸上皮由来体性幹細胞の製造方法 Download PDF

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WO2014038655A1
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intestinal epithelium
cell
somatic stem
stem cells
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誠 土方
達哉 山口
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国立大学法人京都大学
東洋紡株式会社
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing intestinal epithelium-derived somatic stem cells and applied technology thereof.
  • Measures may be taken to immortalize differentiated cells in order to clear these problems, particularly those related to proliferation.
  • many attempts have been made to immortalize cells by various methods such as introducing SV (simian virus) 40 large T antigen gene and human telomerase gene into human hepatocytes (Non-patent Document 1).
  • SV simian virus
  • telomerase gene is hardly expressed in normal cells of human tissue.
  • oncogenes for the production of immortalized cells is considered to be unfavorable, including the possibility of deviating from normal cells.
  • somatic stem cells having high proliferative properties are isolated from a living body and cultured and proliferated outside the body.
  • somatic stem cells As a method for obtaining somatic stem cells, for example, a method has been reported in which somatic cells are collected from a living tissue and somatic stem cells are separated using a cell sorter based on the expression pattern of cell surface molecules.
  • a tissue containing a desired somatic stem cell and select an appropriate antibody against the somatic stem cell it is difficult to obtain a tissue containing a desired somatic stem cell and select an appropriate antibody against the somatic stem cell, and it is not easy to obtain a somatic stem cell population with high purity.
  • the number of stem cells present in the tissue is extremely small, in order to collect a certain amount of stem cells using a cell sorter, a very large number of cells (for example, 10 8 or more) are required as a starting material. It will be.
  • a somatic stem cell population with high purity it is difficult to culture and proliferate it (particularly, culture in a state in which the characteristics of the original somatic stem cells are maintained).
  • stem cells having pluripotency such as ES cells and iPS cells are proliferated and then induced to differentiate into target differentiated cells.
  • stem cells having pluripotency such as ES cells and iPS cells
  • the differentiation efficiency is not sufficient at the present stage, and there are many cases in which various cells are mixed and the differentiated function has high purity. It is still difficult to obtain a cell population.
  • an object of the present invention is to provide a method for obtaining intestinal epithelium-derived stem cells that can proliferate in a state having differentiation ability.
  • a gene containing a protein having an activity of passing through the G0 or G1 phase and transitioning to the S phase contains cells that constitute the intestinal epithelium.
  • somatic stem cells With clonal proliferative ability can be proliferated and proliferated without introducing other genes. It has been found that only somatic stem cells can be obtained simply and efficiently.
  • the present inventors have confirmed that intestinal epithelium-derived somatic stem cells thus obtained can be differentiated into specific target cells by culturing them in a medium suitable for differentiation. .
  • the inventors of the present invention have completed the present invention by further studying and improving the above knowledge.
  • Item 1 A method for producing intestinal epithelium-derived somatic stem cells, comprising the following steps (A) and (B): (A) in a cell group including cells constituting the intestinal epithelium, a step of expressing a gene of a protein having an activity of passing through the G0 phase or G1 phase and transferring to the S phase; and (B) obtained in the step (A). Culturing the obtained cells in the presence of an extracellular growth factor.
  • Item 2 Item 2. The method according to Item 1, wherein the expression is transient expression.
  • Item 3 Item 3. The method according to Item 1 or 2, wherein the step (A) and the step (B) are repeated twice or more.
  • Item 4 Item 4.
  • Item 5 Item 5.
  • the extracellular growth factor is epidermal growth factor (EGF), hepatocyte growth factor (HGF), fibroblast growth factor (FGF), platelet derived growth factor (PDGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), and insulin-like Item 6.
  • Item 7 Intestinal epithelium-derived somatic stem cells obtainable by the method according to any one of Items 1 to 6.
  • Item 8 Item 8. The cell according to Item 7, wherein the intestinal epithelium-derived somatic stem cell is positive for one or more markers selected from the group consisting of Bmi-1, Musahi-1, and Lgr-5.
  • Item 9 Item 9. A cell in which an exogenous gene is further introduced into the cell according to Item 7 or 8.
  • Item 10 Item 10. A method for producing a differentiated cell, comprising a step of differentiating the cell according to any one of Items 7 to 9 into a cell constituting an intestinal epithelium.
  • Item 11 Item 11.
  • Item 10 wherein the step of differentiating comprises a step of performing three-dimensional culture.
  • Item 12 Item 12.
  • Item 13 Item 13.
  • a pharmaceutical composition comprising the cell according to any one of Items 7 to 9 and 12.
  • Item 14 Intestinal epithelium-derived somatic stem cells are isolated from a group of cells containing cells that constitute the intestinal epithelium, including an expression vector that expresses a protein having an activity to pass through the G0 phase or G1 phase and enter the S phase, and an extracellular growth factor. Kit to release.
  • the method of the present invention even when only a very small number of intestinal epithelial somatic stem cells are present in a diverse cell population, by proliferating somatic stem cells derived from the intestinal epithelium out of them, It is possible to produce intestinal epithelium-derived somatic stem cells efficiently and with high purity as compared with a method that requires isolating somatic stem cells using a conventional cell sorter or the like.
  • stem cells can be efficiently obtained from a relatively small number of cells (for example, about 10 5 to the 6th power) without preparing a large number of cells as in a cell sorter.
  • Intestinal epithelium-derived somatic stem cells produced by the method of the present invention can be differentiated into differentiated intestinal epithelial cells.
  • a gene introduced to proliferate intestinal epithelial stem cells can be transiently expressed.
  • Intestinal epithelium-derived somatic stem cells produced in this way do not contain exogenous genes, and thus have substantially the same structure and properties as intestinal epithelial stem cells that proliferate in vivo. Therefore, the intestinal epithelium-derived somatic stem cells of the present invention are suitable for transplantation into a living body from the viewpoint of safety.
  • the intestinal epithelium-derived somatic stem cell obtained by the present invention also functions as a host cell that expresses an exogenous gene. Therefore, the exogenous gene is introduced into the intestinal epithelium-derived somatic stem cell and used as a drug for gene therapy. It is also possible to do.
  • FIG. 1 shows the acquisition results of intestinal epithelium-derived somatic stem cells obtained in Example 1.
  • FIG. 2 shows the results of obtaining intestinal epithelium-derived somatic stem cells obtained in Example 2.
  • FIG. 3 shows the property analysis results of the intestinal epithelium-derived somatic stem cells obtained in Example 3.
  • FIG. 4 shows the results of induction of differentiation of intestinal epithelium-derived somatic stem cells into intestinal epithelial cells in Example 4.
  • the method for producing intestinal epithelium-derived somatic stem cells of the present invention comprises the following steps (A) and (B): (A) in a cell group including cells constituting the intestinal epithelium, a step of expressing a gene of a protein having an activity of passing through the G0 phase or G1 phase and transferring to the S phase; and (B) obtained in the step (A). Culturing the obtained cells in the presence of an extracellular growth factor.
  • Step (A) is a step of expressing a gene of a protein having an activity of passing through the G0 phase or G1 phase and shifting to the S phase in a cell group including cells constituting the intestinal epithelium.
  • Cell group including cells constituting intestinal epithelium used as a raw material only needs to include cells constituting intestinal epithelium, and further includes other cells. May be.
  • the ratio of the cells constituting the intestinal epithelium in the cell group is not particularly limited, but it is preferable to use a cell group consisting only of cells constituting the intestinal epithelium from the viewpoint of production efficiency.
  • the cells constituting the intestinal epithelium include cells constituting so-called intestinal mucosal tissue, and include, for example, small intestinal epithelial cells, large intestine epithelial cells, goblet cells, panate cells, and the like. Among these are a small number of intestinal epithelial stem cells.
  • the cells constituting the intestinal epithelium preferably include intestinal epithelial stem cells, and the ratio thereof is not particularly limited, but for example, a ratio of 1/1000000 to 1/10000 is preferable.
  • the cell group including cells constituting the intestinal epithelium commercially available cells may be used, or cells collected from a living body by a surgical technique may be used.
  • the cell group including cells constituting the intestinal epithelium is, for example, a primary cultured cell or a subcultured cell obtained by repeating subculture in a range where the original function of the cell is maintained after being collected from the living body ( In this specification, it may be referred to as “early subcultured cells”).
  • the number of subcultures is not particularly limited as long as intestinal epithelium-derived somatic stem cells can be produced, but is preferably within 10 times, and within 5 times. More preferably, it is more preferably within 2 times.
  • An organism from which a cell group including cells constituting the intestinal epithelium is derived can be appropriately selected according to the purpose.
  • the obtained intestinal epithelium-derived somatic stem cells are used for research or treatment of human diseases, they are preferably derived from humans.
  • the cell group including cells constituting the intestinal epithelium preferably has high viability.
  • the viability is 70% or more, more preferably 80% or more, and further preferably 90% or more.
  • the viability of the cells can be measured using a commercially available analyzer.
  • the cell group containing the cells constituting the intestinal epithelium has a high adhesion rate (for example, 70% or more) to a plate coated with collagen or the like.
  • Viability of a cell group containing cells constituting the intestinal epithelium can be measured according to a known method. For example, a cell group containing cells constituting the intestinal epithelium is treated with trypan blue dye to turn blue. It can be determined by measuring the ratio of stained dead cells using a microscope or the like. *
  • a protein having an activity of passing through the G0 phase or the G1 phase and transferring to the S phase as a gene introduced into the cell “a protein having an activity of passing through the G0 phase or the G1 phase and transferring to the S phase” (this specification)
  • “cell cycle reactivation protein”) is not particularly limited as long as it has an activity of passing through the G0 phase or G1 phase and shifting to the S phase.
  • “Transfer to the S phase by passing the G0 phase or the G1 phase” means (1) acting on the cells in the G0 phase and being in a dormant state by deviating (escaping) from the cell cycle. Or (2) acting on a cell in the G1 phase to shift the cell cycle from the G1 phase to the S phase.
  • the presence / absence of “activity to pass through the G0 period or the G1 period and shift to the S period” can be confirmed by the following method. That is, confirmation of the transition to S phase (DNA synthesis phase) can be determined by examining the activity of 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU), which is an analog of thymidine, into the cells. Specifically, BrdU can be put into a cell culture medium, and then reacted with a fluorescently labeled anti-BrdU antibody to immunostain the cell surface, and the analysis can be carried out using a flow cytometer or the like.
  • PrdU 5-bromo-2-deoxyuridine
  • a protein having an action of promoting phosphorylation of Rb protein can be used.
  • examples include cyclin-dependent kinases and cyclins.
  • examples of cyclin-dependent kinases include CDK1, CDK2, CDK3, CDK4, CDK6, and CDK7.
  • An example of a cyclin is cyclin D. Among these, CDK4 and CDK6 are preferable, and CDK4 is more preferable.
  • Only one type of cell cycle reactivation protein gene may be used alone, or a plurality of types may be used in combination.
  • the origin of the cell cycle reactivation protein gene is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exhibited. It may be the same species as the animal species from which the cell group including cells constituting the intestinal epithelium used in step (A) is derived, or may be a different animal species. From the viewpoint of expression efficiency and the like, preferably, the gene for the cell cycle reactivation protein is derived from the same species as the animal from which the cell group including cells constituting the intestinal epithelium is derived.
  • the means for expressing the cell cycle reactivation protein gene is not limited as long as the cell cycle reactivation protein can be expressed.
  • transient expression means that a gene is introduced into a cell by a DNA transfection method or the like and expressed transiently. Transient usually refers to a period of hours to days.
  • stable expression means that a gene to be expressed is stably expressed in a chromosome. From the viewpoint that the intestinal epithelium-derived somatic stem cell and its differentiated cell produced by the method of the present invention have the same or as similar structure and properties as the intestinal epithelial stem cell or its differentiated cell in vivo. It is preferred that the gene for the cyclic reactivation protein is transiently expressed.
  • Transient expression is not particularly limited, and can be performed, for example, by introducing an expression vector having a target gene downstream of an expression promoter into a cell and expressing the gene from this expression vector.
  • an expression promoter for example, CMV promoter, SV40 promoter and the like can be used, but are not limited thereto.
  • expression vectors include, but are not limited to, plasmid vectors and liposomes as non-viral vectors, and adenovirus vectors and retrovirus vectors as virus vectors. It is preferable to use a non-viral vector from the viewpoint of safety when using the cells to be produced for pharmaceutical purposes and ensuring that the gene to be introduced is transiently expressed, and in particular, the origin of replication in the host cell.
  • Non-viral vectors that do not contain are preferred. In order to carry out transient expression more reliably, it is possible to add a step of confirming that the introduced cell is not incorporated into the chromosome.
  • plasmid vectors that can be used from such a viewpoint include pcDNA, pSVL, and the like.
  • a method for introducing an expression vector into a cell for example, a lipofection method, an electroporation method, a method in which a gene is incorporated into a viral vector and infected, and the like can be used, but not limited thereto.
  • stable expression is not particularly limited, it can be performed, for example, by the following method.
  • An expression vector having a target gene and a dominant selection marker downstream of the expression promoter is introduced into the cell, and a strain in which the target gene is integrated into the chromosome is established. In this established strain, stable expression is performed.
  • an expression promoter for example, CMV promoter, SV40 promoter and the like can be used, but are not limited thereto.
  • a dominant selection marker for example, various drug resistance genes can be used, but not limited thereto. When a drug resistance gene is used as a dominant selection marker, only cell lines that stably express the drug resistance gene can be selected by continuing cell culture in the presence of a drug exhibiting resistance. .
  • the target gene is considered to be stably expressed as well. Whether or not the target gene is actually stably expressed can be clarified by analyzing the base sequence of the chromosome by a DNA sequence or the like.
  • a lipofection method, an electroporation method, or the like can be used, but is not limited thereto.
  • a viral vector a method of incorporating a gene into a viral vector and infecting it can also be used.
  • transfection reagent that is considered to be relatively weak in cytotoxicity.
  • the step (A) is preferably performed while culturing in a medium that supports the proliferation of intestinal epithelium-derived somatic stem cells.
  • a medium that supports the proliferation of intestinal epithelium-derived somatic stem cells For example, DMEM (Doulbecco's modified Eagle's Medium) medium (manufactured by Gibco) used for normal mammalian cell culture is used as a basal medium, and a medium supplemented with fetal bovine serum, human serum or the like is preferably used. be able to.
  • Extracellular growth factor may be further added to the medium used when performing step (A).
  • the extracellular growth factor is a substance having an action of externally supporting the growth of intestinal epithelium-derived somatic stem cells, and is not particularly limited as long as it has such an action.
  • Examples of extracellular growth factors include cell growth factors and hormones that stimulate cell growth.
  • Examples of cell growth factors include epidermal growth factor (EGF), hepatocyte growth factor (Hepatocyte Growth Factor; HGF), platelet-derived growth factor (PDGF), insulin-like growth factor (IGF), vascular endothelial cells.
  • Examples include growth factors (Vascular Endothelial Growth Factor; VEGF) and fibroblast growth factors (FGF). Of these, EGF and HGF are preferred.
  • insulin can be preferably used. These may be used alone or in combination of two or more.
  • Proliferation can be improved synergistically.
  • the concentration of the extracellular growth factor added in the medium is not particularly limited. For example, it is preferably 0.1 to 200 ng / ml, more preferably 1.0 to 100 ng / ml, and 5 to 50 ng / ml. Further preferred.
  • the DNA encoding the cell cycle reactivation protein In addition to the DNA encoding the cell cycle reactivation protein, other genes must be included in the cell group including the cells constituting the intestinal epithelium, as long as they do not inhibit the proliferation ability and pluripotency of somatic stem cells derived from intestinal epithelium. It can be introduced and expressed. However, from the viewpoint that the intestinal epithelium-derived somatic stem cells proliferated by the following step (B) have structural and property characteristics that are the same as or infinitely similar to intestinal epithelial somatic stem cells in vivo.
  • exogenous DNA is not substantially included other than DNA of cell cycle activating protein (for example, cyclin dependent kinase).
  • the genes involved in the regulation of the cell cycle introduced into intestinal epithelium-derived somatic stem cells are only those of cell cycle activation proteins (eg, cyclin-dependent kinases, particularly CDK4 or CDK6) It is preferable.
  • the intestinal epithelium-derived somatic stem cells grown according to the present invention preferably do not contain a gene encoding human telomerase reverse transcriptase.
  • Step (B) is a step of culturing the cells obtained in step (A) in the presence of an extracellular growth factor.
  • intestinal epithelium-derived somatic stem cells proliferate predominantly from the group of cells containing cells constituting the intestinal epithelium as follows.
  • the cell cycle is shifted from the G0 phase or the G1 phase to the S phase by the action of the cell cycle reactivation protein introduced from the outside in the step (A).
  • Split phase the action of the cell cycle reactivation protein introduced from the outside in the step (A).
  • the action of the cell cycle reactivation protein is activated by the action of the extracellular growth factor present in the medium.
  • intestinal epithelium-derived somatic stem cells continue to proliferate.
  • intestinal epithelium-derived somatic stem cells proliferation activation as described above due to the action of cell cycle reactivation protein does not occur, or proliferation is temporary and does not continue.
  • intestinal epithelium-derived somatic stem cells proliferate predominantly from a group of cells containing cells constituting the intestinal mucosa.
  • the cell in which the gene for the cell cycle reactivation protein is expressed in the step (A) is cultured in the presence of an extracellular growth factor.
  • the medium used in the step (A) contains an appropriate extracellular growth factor from the beginning, cells expressing the cell cycle reactivation protein gene may be cultured as they are without changing the medium. Good. Further, the extracellular growth factor may be further added to the medium without changing the medium. The medium may be replaced with a medium containing the extracellular growth factor, or the medium may be replaced with a medium not containing the extracellular growth factor, and then the extracellular growth factor may be added to the medium.
  • the extracellular growth factor for example, EGF, HGF, VEGF, FGF, PDGF, IGF, etc.
  • EGF extracellular growth factor
  • the concentration of the extracellular growth factor added in the medium is not particularly limited. For example, it is preferably 0.1 to 200 ng / ml, more preferably 1.0 to 100 ng / ml, and 5 to 50 ng / ml. Further preferred.
  • intestinal epithelium-derived somatic stem cells are prepared using DMEM (Doulbecco's modified Eagle's Medium) medium (manufactured by Gibco), which is used for normal mammalian cell culture, as the basic medium. What further added the component which supports the proliferation of this can be used.
  • DMEM Doulbecco's modified Eagle's Medium
  • the medium may be changed at an appropriate interval.
  • the frequency of replacing the medium is not particularly limited, but the medium may be replaced once every two or three days.
  • the medium may be replaced with a medium containing the same concentration of extracellular growth factor, or may be replaced with a medium containing a different concentration of extracellular growth factor.
  • the medium may be replaced with a medium containing the same extracellular growth factor, or may be replaced with a medium containing a different extracellular growth factor.
  • culture conditions such as culture temperature can be appropriately set according to known methods according to the type of intestinal epithelium-derived somatic stem cells to be cultured.
  • Step (A) and Step (B) may be performed once each, or may be repeated a plurality of times with these as one set. When it is performed a plurality of times, it can be performed preferably 2 to 10 times, more preferably 3 to 8 times, and even more preferably 3 to 5 times. Repeating the steps (A) and (B) in this manner is preferable when the gene encoding the cell cycle reactivation protein is transiently expressed. This is because transient expression is the peak of expression about 3 days after transfection, and in order to shift intestinal epithelial-derived somatic stem cells to a proliferative state, This is because expression is considered preferable.
  • Process (A) and process (B) can be performed successively in this order, or other processes may be performed after process (A), and then process (B) may be performed. Repeating step (B) or steps (A) and (B) can be continued until the required amount of intestinal epithelial derived somatic stem cells is obtained. For example, as shown in Example 1 described later, it is preferable to continue the steps (A) and (B) for about 20 to 60 days while repeating the steps (A) and (B).
  • the intestinal epithelium-derived somatic stem cell group can be easily collected by continuing the step (B) until colony formation by the intestinal epithelium-derived somatic stem cells is sufficiently performed.
  • the end point of the step (B) is preferably a time point at which a colony of intestinal epithelium-derived somatic stem cells can be confirmed with a microscope or the naked eye, or a colony of intestinal epithelial-derived somatic stem cells consisting of 10 to 10,000 cell groups is formed. More preferably, a colony of intestinal epithelium-derived somatic stem cells consisting of a group of 100 to 1000 cells is formed.
  • step (A) and step (B) are repeated, for example, if step (A) and step (B) are repeated until colony formation by intestinal epithelium-derived somatic stem cells is sufficiently performed, intestinal epithelium-derived somatic A stem cell group can be easily collected, which is preferable.
  • the number of times the step (A) and the step (B) are repeated is preferably the time when colonies of intestinal epithelium-derived somatic stem cells can be confirmed with a microscope or the naked eye, or the intestinal epithelium-derived somatic stem cells consisting of 10 to 10,000 cell groups. Until a colony is formed, and more preferably until a colony of intestinal epithelium-derived somatic stem cells composed of a group of 100 to 1000 cells is formed.
  • a colony is usually formed within a few weeks to a month from the start of the step (B).
  • Cells different from the intestinal epithelial stem cells that were originally included in the cell group including cells constituting the intestinal epithelium are stopped at the latest due to the cell division life by the end of the last step (B).
  • many of them have dropped out, or even if they remain, the form has changed greatly from the beginning.
  • it can be easily distinguished from the intestinal epithelium-derived somatic stem cells forming a colony, and a highly purified intestinal epithelium-derived somatic stem cell group can be obtained.
  • each step (B) can be continued as long as the cells continue to grow. However, it can be terminated during the growth.
  • intestinal epithelial stem cells eventually form colonies in order to maintain good proliferative ability from the cell group including cells constituting the intestinal epithelium.
  • the other cells have a cell division lifetime at the end of the step (B), so that the cell division is stopped, and many of them have dropped or remain, but the shape has changed greatly from the beginning. Therefore, it can be easily distinguished from the intestinal epithelium-derived somatic stem cells forming a colony, and by collecting this colony, the intestinal epithelium-derived somatic stem cell population can be isolated as a clone.
  • Intestinal epithelium-derived somatic stem cells can be obtained by performing a step of collecting colonies after the step (B). Colony recovery can be performed by a conventionally known method. Although not limited, it can be performed by, for example, a limiting dilution method or a method using a micropipette under a microscope.
  • an intestinal epithelium-derived somatic stem cell group preferably containing intestinal epithelium-derived somatic stem cells in an amount of 50% or more, more preferably intestinal epithelium-derived somatic stem cells containing 80% or more of intestinal epithelial-derived somatic stem cells.
  • Sex stem cell populations can be produced.
  • determination of intestinal epithelium-derived somatic stem cells is not particularly limited, but can be performed, for example, by examining whether or not the cells differentiate into target cells.
  • intestinal epithelium-derived somatic stem cells can also be determined by confirming the presence or absence of a cell surface marker.
  • determination of an intestinal epithelium-derived somatic stem cell can be carried out based on the positiveness of one or more molecular markers selected from the group consisting of Bmi-1, Musahi-1 and Lgr-5. it can.
  • the intestinal epithelium-derived somatic stem cells obtained by the method of the present invention have the same properties as in vivo intestinal epithelial stem cells and can be used to stably supply a high-purity population of intestinal epithelial differentiated cells.
  • the intestinal epithelium-derived somatic stem cells obtained by the method of the present invention include not only cells derived from somatic stem cells that are originally present in the intestinal epithelium but also cells other than somatic stem cells in the above steps (A) and ( Cells that have acquired clonal proliferation and pluripotency by B) are also included.
  • Intestinal epithelial differentiated cells can be finally used in clinical applications such as cell preparations, or in various research and development such as new drug development or disease research.
  • the method for producing differentiated cells constituting intestinal epithelium includes a step of differentiating intestinal epithelium-derived somatic stem cells obtained by the production method of A above.
  • the step of differentiation can be performed in vitro or in vivo according to a known method.
  • intestinal epithelium-derived somatic stem cells can be cultured in a medium suitable for differentiation, and differentiation into various differentiated cells constituting the intestinal epithelium can be induced.
  • a medium and other culture conditions suitable for differentiation can be appropriately selected and set from known conditions according to the type of target differentiated cells.
  • fetal bovine serum 1-20%
  • FGF 1-50 ng / ml
  • insulin 1-100 ⁇ g / ml
  • transferrin 1-100 ⁇ g / ml
  • nicotinamide 1-50 mM
  • selenium Intestinal epithelium-derived somatic stem cells can be cultured in a medium (for example, DMEM / F12 medium) suitable for culturing stem cells containing (0.1 to 10 ng / ml) and gentamicin (10 to 100 ⁇ g / ml).
  • Confirmation of differentiation can be confirmed by, for example, expression of Villin, a cell marker with microvilli, secretin, an endocrine cell marker, trefoil factor-3, a goblet cell marker, Musashi-1, a stem cell marker, and the like. it can.
  • the culture for differentiating intestinal epithelium-derived somatic stem cells may be two-dimensional culture or three-dimensional culture, but three-dimensional culture is preferable from the viewpoint of inducing differentiation more quickly.
  • the three-dimensional culture is literally a three-dimensional culture of cells, and various substrates and kits for three-dimensional culture can be used.
  • the culture time can be appropriately set according to the type of differentiated cells for the purpose.
  • Intestinal epithelium-derived somatic stem cells are preferably cultured in advance for a certain period (priming culture) in the presence of an activating substance prior to culturing in a medium suitable for differentiation.
  • the priming culture is a process in which differentiation is advanced by one step, and this makes it possible to shorten the culture period necessary for subsequent differentiation.
  • the priming culture can be performed, for example, in the presence of BMP or FGF.
  • the cells constituting the differentiated intestinal epithelium can be used for various research materials and transplantation related to the small and large intestines.
  • compositions Another embodiment of the present invention is a pharmaceutical composition (cell preparation) comprising intestinal epithelium-derived somatic stem cells obtained by the method of the present invention and / or intestinal epithelial differentiated cells obtained by further differentiation thereof. is there.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used, for example, for repairing damaged intestines.
  • the cells contained in the pharmaceutical composition of the present invention may be those into which an exogenous gene has been introduced.
  • Introduction of exogenous genes into intestinal epithelium-derived somatic stem cells or intestinal epithelial differentiated cells produced by the method of the present invention can be performed using methods known in the art.
  • the exogenous gene to be introduced can be appropriately selected according to the purpose of use of the cell preparation (for example, gene therapy).
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is appropriately set according to the affected area to be applied.
  • Examples include intravenous injection, intraarterial injection, intraportal injection, intradermal injection, subcutaneous injection, submucosal injection, intraperitoneal injection, and the like.
  • a method of administration by attaching cells formed into a sheet form by culturing to the affected area to be applied can also be mentioned.
  • a tissue-like structure in which cells are three-dimensionally cultured using a so-called scaffold having biocompatibility can be attached or transplanted to the affected tissue.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is appropriately set according to the dosage form and the like.
  • examples thereof include a liquid agent in which cells are suspended in a liquid, a gel agent in which cells are suspended in a gel, a cell sheet, and a tissue-like cell aggregate.
  • the dosage and administration frequency of the pharmaceutical composition of the present invention are appropriately set according to the administration form, dosage form, recipient's condition, cell activity level, disease type, and the like.
  • the dose per administration may be a therapeutically effective amount.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered at a frequency of once per day or divided into 2 or 3 times, and doses for 2 days to 1 week may be administered at a time. Also good.
  • the proportion of intestinal epithelium-derived somatic stem cells or intestinal epithelial differentiated cells contained in the pharmaceutical composition can be appropriately set according to the administration form, dosage form, dosage, administration frequency, and the like.
  • the cell preparation of the present invention may further contain other components as required in addition to the active ingredient (intestinal epithelium-derived somatic stem cells or intestinal epithelial differentiated cells).
  • intestinal epithelium-derived somatic stem cells or intestinal epithelial differentiated cells examples include excipients necessary for formulation depending on the dosage form, storage-stable components necessary for storage stability, and other medicinal ingredients.
  • other medicinal ingredients include anti-inflammatory agents, antibacterial agents, immunosuppressive agents, cell growth factors, hormones and the like.
  • kits for isolating intestinal epithelium-derived somatic stem cells of the present invention constitutes the intestinal epithelium including an expression vector for expressing a cell cycle reactivation protein and an extracellular growth factor
  • a kit for isolating intestinal epithelial-derived somatic stem cells from a cell group containing cells constitutes the intestinal epithelium including an expression vector for expressing a cell cycle reactivation protein and an extracellular growth factor
  • a cell group including cells constituting the intestinal epithelium, an extracellular growth factor, a cell cycle reactivation protein, and an expression vector are described in A. above. This is the same as described in.
  • the kit includes A.I. It may contain a suitable extracellular growth factor described in.
  • Example 1 Acquisition of somatic stem cells derived from human intestinal epithelial cells (1) Culture of primary human intestinal epithelial cells After resuscitation, human small intestinal epithelial cells (Cell Systems, CS-ABI-519) were suspended in DMEM medium containing 10% FCS. The cells were seeded on a collagen-coated 12-well cell culture plate at a cell density of about 1.0 ⁇ 10 5 cells / well. The seeded cells were cultured in an incubator under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • transfection Two days after seeding human small intestinal epithelial cells, transfection was carried out under the conditions of the following medium and transgene.
  • a commercially available protein expression plasmid pcDNA3 (Invitrogen) was used, and human CDK4 was cloned into the cloning site between EcoRI and XbaI, or DNA encoding CDK6 was cloned into the cloning site between HindIII and BamHI. Inserted.
  • DNA encoding human CDK4 or CDK6 is a primer based on the nucleotide sequence registered in NCBI (National Center for Biotechnology Information) (CDK4 gene accession number: CAG47043, CDK6 gene accession number: NP-001138778) And using total RNA purified from HuS-E / 2 cells (human hepatocyte-derived cells, deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Depositary: FERM ABP-10908) as a template Obtained by RT-PCR.
  • a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 were used.
  • a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 were used.
  • the base sequences of SEQ ID NOs: 1 and 3 include a sequence corresponding to Flag Tag.
  • Group 1 20 ng / ml hepatocyte growth factor (HGF) in DMEM-based medium containing 5% fetal bovine serum, 5% human serum (human HGF, Toyobo, Code: HGF-101, CHO cell recombinant) Medium supplemented with The transgene is CDK4 or CDK6 (pcDNA-FLAG-CDK4 or pcDNA-FLAG-CDK6).
  • Group 2 Same medium as Group 1. The only transgene is a plasmid (pcDNA3).
  • Example 2 Obtaining human intestinal epithelium-derived somatic stem cells
  • the growth factor added to the medium used for transfection was 10 ng / ml FGF (fibroblast growth factor), and the same experimental procedure was performed.
  • the number of intestinal epithelium-derived somatic stem cells obtained is shown in FIG.
  • Example 3 Characterization of somatic stem cells derived from human intestinal epithelium Some of the stem cell clones obtained in Example 1 were examined mainly on differentiation markers related to intestinal epithelial stem cells. That is, for Bmi-1, Musashi-1, and Lgr-5, RT-PCR was performed using total RNA extracted by collecting cells, and mRNA expression was examined. The result is shown in FIG. In the figure, positive is represented as (+) and negative as ( ⁇ ).
  • the obtained cells showing clonal growth were positive for Bmi-1, Musashi-1, Lgr-5, or a plurality of these markers. From these results, it was found that the cells exhibiting clonal proliferation obtained by the present invention expressed markers that are characteristic of intestinal epithelial stem cells and intestinal epithelial progenitor cells.
  • Example 4 Induction of human intestinal epithelium-derived somatic stem cells into intestinal epithelial cells
  • the intestinal epithelium-derived somatic stem cells obtained in Example 1 were seeded in a 12-well plate and 10% fetal bovine serum, EGF (10 ng / ml), insulin (10 ⁇ g / ml), transferrin (10 ⁇ g / ml) in DMEM / F12 medium. ), Nicotinamide (10 mM), selenium (30 nM), and gentamicin (50 ⁇ g / ml) for 7 days. After growing to confluence, the culture was transferred to DMEM / F12 medium with 1% fetal bovine serum.
  • the medium was replaced with a culture medium containing insulin (10 ⁇ g / ml), transferrin (10 ⁇ g / ml), selenium (30 nM), and gentamicin (50 ⁇ g / ml), followed by further culturing for 14 days.
  • the cultured cells were collected after washing with PBS, RNA was extracted, and gene expression analysis was performed by real time PCR.
  • Expression markers were examined for Villin, a cell marker with microvilli, secretin, an endocrine cell marker, trefoil factor-3, a goblet cell marker, and Musashi-1, a stem cell marker.
  • the expression intensity of each marker was compared with the state before differentiation induction, the expression of all markers except Musashi-1 was remarkably increased.
  • FIG. This result shows that the intestinal epithelium-derived somatic stem cells obtained by the present invention have the ability to differentiate into a plurality of types of cells constituting the intestinal epithelium, that is, the intestinal epithelium-derived somatic stem cells.

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Abstract

腸上皮由来体性幹細胞を効率的に増殖する方法等を提供することを課題とする。以下の工程（Ａ）及び（Ｂ）を含む、腸上皮由来体性幹細胞の製造方法： （Ａ）腸上皮を構成する細胞を含む細胞群において、Ｇ０期又はＧ１期を通過させＳ期へと移行させる活性を有するタンパク質の遺伝子を発現させる工程；及び （Ｂ）工程（Ａ）で得られた細胞を細胞外増殖因子の存在下で培養する工程。

Description

腸上皮由来体性幹細胞の製造方法
　本発明は、腸上皮由来体性幹細胞の製造方法、及びその応用技術に関する。
　疾患研究や新薬開発において、細胞、特にヒト細胞を利用することは、今や必須のことであり、今後益々その需要は高まると考えられている。細胞は生体から採取した組織から分離調製され、これを培養して試験研究に広く使用される。この場合、目的に応じた分化細胞（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｃｅｌｌ）が使用されることが多い。しかしながら、生体外に取り出した分化細胞は増殖させることが困難な場合がある。また、本来の活性が短時間で失われてしまうこと、採取コストが非常に高いこと、及びドナーによりその特性に大きなバラツキがあること等問題点は多い。
　これらの問題、特に増殖性に関する問題をクリアするため、分化細胞を不死化する手段がとられることがある。例えば、ヒト肝細胞にＳＶ（ｓｉｍｉａｎ　ｖｉｒｕｓ）４０ラージＴ抗原遺伝子やヒトテロメラーゼ遺伝子を導入する等種々の方法により細胞を不死化する試みが数多くなされてきた（非特許文献１）。しかしながら、不死化して得られた細胞は本来の分化形質を持たない場合がほとんどであって、不死化細胞で本来の機能を十分に保持しているものはこれまで知られていない。例えば、テロメラーゼ遺伝子はヒト組織の正常細胞では殆ど発現していない。また、不死化細胞作出のために、いわゆるがん遺伝子を使用することは、正常細胞から逸脱する可能性を含み好ましいことではないと考えられている。
　一方、目的の正常初代細胞を大量に得る手段として、生体から増殖性が高い体性幹細胞を分離し、これを体外で培養・増殖させて利用する方法がある。
　体性幹細胞の取得方法としては、例えば生体組織から体細胞を採取し、細胞表面分子の発現パターンに基づきセルソーターを用いて体性幹細胞を分離する方法が報告されている。しかしながら、目的とする体性幹細胞を含む組織を入手し、かつその体性幹細胞に対する適切な抗体を選択することは困難であり、純度の高い体性幹細胞集団を得ることは容易ではない。また、組織中に存在する幹細胞の数は極めて少数であるため、セルソーターを使ってある程度の幹細胞を集めるためには出発材料として非常に多くの細胞（例えば１０の８乗個又はそれ以上）を要することとなる。更に、純度の高い体性幹細胞集団が得られたとしても、それを培養して増殖させること（特に、本来の体性幹細胞の特性を維持した状態での培養）は困難である。
　他の手段として、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞といった多分化能を有する幹細胞を増殖させた後に、目的の分化細胞へと分化誘導するという方法がある。ＥＳ細胞、又はｉＰＳ細胞も一部の細胞が分化することは確認されているものの、現在の段階では分化効率が充分とは言えず、種々の細胞が混在する場合が多く純度の高い分化した機能細胞集団を得ることはまだまだ困難であるとされる。
　このように、一定の分化能を保持する体性幹細胞の高純度集団を安定的に供給できる方法が真に望まれていた。
特表２００２－５１２７８８ 特表２００３－５０１０８１ 特表２００９－５２０４７４
Ｒａｍｉｒｅｚ，　Ｄ．Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　６４，　９０２７－９０３４，　２００４
　本発明は、上記従来技術の課題を解決することを課題とする。より詳細には、本発明は、分化能を有する状態で増殖可能な腸上皮由来幹細胞を取得する方法等を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記の課題に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、Ｇ０期又はＧ１期を通過させＳ期へと移行させる活性を有するタンパク質の遺伝子を、腸上皮を構成する細胞を含む細胞群に導入し、細胞外増殖因子の存在下で培養することにより、その他の遺伝子を導入しなくても、クローン性増殖能を有する体性幹細胞だけを優勢的に増殖させることができ、増殖した体性幹細胞だけを簡便且つ効率的に取得することが可能であることを見出した。また、本発明者等は、そのようにして取得した腸上皮由来体性幹細胞を分化に適した培地で培養することにより、目的とする特定の細胞に分化させることが可能であることを確認した。本発明者らは、以上のような知見にさらなる検討と改良を重ねることにより、本発明を完成するに至った。
　代表的な本願発明は以下の通りである。
項１
　以下の工程（Ａ）及び（Ｂ）を含む、腸上皮由来体性幹細胞の製造方法：
（Ａ）腸上皮を構成する細胞を含む細胞群において、Ｇ０期又はＧ１期を通過させＳ期へと移行させる活性を有するタンパク質の遺伝子を発現させる工程；及び
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた細胞を細胞外増殖因子の存在下で培養する工程。
項２
前記発現が一過性発現である、項１に記載の方法。
項３
　前記工程（Ａ）及び前記工程（Ｂ）を二回以上繰り返す、項１又は２に記載の方法。
項４
　前記タンパク質がサイクリン依存性キナーゼである、項１～３のいずれかに記載の方法。
項５
　前記タンパク質がサイクリン依存性キナーゼ４及びサイクリン依存性キナーゼ６からなる群より選択される少なくとも一種のタンパク質である、項１～４のいずれかに記載の方法。
項６
　前記細胞外増殖因子が上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、及びインスリン様成長因子（ＩＧＦ）からなる群より選択される少なくとも一種の細胞外増殖因子である、項１～５のいずれかに記載の方法。
項７
　項１～６のいずれかに記載の方法により得られうる、腸上皮由来体性幹細胞。
項８
腸上皮由来体性幹細胞がＢｍｉ－１、Ｍｕｓａｈｉ－１、及びＬｇｒ－５から成る群から選択される一種以上のマーカーについて陽性である、項７に記載の細胞。
項９
項７又は８に記載の細胞に、さらに外因性遺伝子が導入された細胞。
項１０
項７～９のいずれかに記載の細胞を、腸上皮を構成する細胞に分化させる工程を含む、分化細胞の製造方法。
項１１
　前記分化させる工程が３次元培養を行う工程を含む、項１０に記載の方法。
項１２
　項１０又は１１に記載の方法により得られうる、腸上皮を構成する細胞。
項１３
項７～９及び１２のいずれかに記載の細胞を含む、医薬組成物。
項１４
　Ｇ０期又はＧ１期を通過させＳ期へと移行させる活性を有するタンパク質を発現させる発現ベクター及び細胞外増殖因子を含む、腸上皮を構成する細胞を含む細胞群から腸上皮由来体性幹細胞を単離するためのキット。
　本発明の方法により、雑多な細胞集団の中に腸上皮の体性幹細胞が極少数しか存在しない場合であっても、その中から腸上皮由来の体性幹細胞を優勢的に増殖させることにより、従来のセルソーター等を用いて体性幹細胞を単離することを必要とする方法と比較して、腸上皮由来体性幹細胞を効率的且つ高純度で製造することが可能である。本発明を用いればセルソーターのように多数の細胞を用意しなくても比較的少数の細胞（例えば１０の５乗から６乗個程度）から効率的に幹細胞を得ることが出来る。また、本発明の方法で製造された腸上皮由来体性幹細胞は、目的に応じた腸上皮分化細胞に分化させることが可能である。
　本発明において腸上皮由来の幹細胞を増殖させるために導入される遺伝子は、一過性の発現とすることが可能である。このようにして製造された腸上皮由来体性幹細胞は、外因性の遺伝子を含まないため、生体内で増殖する腸上皮幹細胞と実質的に同一の構造・性質を有する。従って、本発明の腸上皮由来体性幹細胞は、安全性の観点から生体への移植に適している。本発明によって得られる腸上皮由来体性幹細胞は、外因性の遺伝子を発現する宿主細胞としても機能するため、外因性の遺伝子を当該腸上皮由来体性幹細胞に導入し、遺伝子治療用医薬として利用することも可能である。
図１は、実施例１で得られた腸上皮由来体性幹細胞の取得結果を示す。 図２は、実施例２で得られた腸上皮由来体性幹細胞の取得結果を示す。 図３は、実施例３で得られた腸上皮由来体性幹細胞の性状解析結果を示す。 図４は、実施例４における腸上皮由来体性幹細胞の腸上皮細胞への分化誘導結果を示す。
　以下に本発明の具体的な実施の形態を説明する。
　Ａ．腸上皮由来体性幹細胞の製造方法
　本発明の腸上皮由来体性幹細胞の製造方法は、以下の工程（Ａ）及び（Ｂ）を含む：
（Ａ）腸上皮を構成する細胞を含む細胞群において、Ｇ０期又はＧ１期を通過させＳ期へと移行させる活性を有するタンパク質の遺伝子を発現させる工程；及び
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた細胞を細胞外増殖因子の存在下で培養する工程。
　１．工程（Ａ）
　工程（Ａ）は、腸上皮を構成する細胞を含む細胞群において、Ｇ０期又はＧ１期を通過させＳ期へと移行させる活性を有するタンパク質の遺伝子を発現させる工程である。
（１）腸上皮を構成する細胞を含む細胞群
　原材料として用いる「腸上皮を構成する細胞を含む細胞群」は、腸上皮を構成する細胞を含んでいればよく、他の細胞をさらに含んでいても良い。当該細胞群中に腸上皮を構成する細胞が含まれる割合は特に制限されないが、製造効率の観点から腸上皮を構成する細胞のみからなる細胞群を使用することが好ましい。腸上皮を構成する細胞には、いわゆる腸粘膜組織を構成する細胞を含み、例えば、小腸上皮細胞、大腸上皮細胞、杯細胞、パネート細胞等が含まれる。これらの中に少数の腸上皮幹細胞が含まれる。腸上皮を構成する細胞には、腸上皮幹細胞が含まれることが好ましく、その割合は特に制限されないが、例えば、１／１００００００～１／１００００個の割合であることが好ましい。
　腸上皮を構成する細胞を含む細胞群は、市販のものを使用しても良く、生体から外科的手法で採取したものを使用しても良い。腸上皮を構成する細胞を含む細胞群は、例えば、初代培養細胞、又は生体から採取した後、生体内における細胞本来の機能が維持される範囲内で継代培養を繰り返した継代培養細胞（本明細書において、「初期継代培養細胞」ということがある。）等を用いることができる。初期継代培養細胞を使用する場合は、その継代培養回数は、腸上皮由来体性幹細胞の製造が可能である限り特に制限されないが、１０回以内であれば好ましく、５回以内であればより好ましく、２回以内であればさらに好ましい。
　腸上皮を構成する細胞を含む細胞群が由来する生物は、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、サル、ヒト等の哺乳類が挙げられる。得られる腸上皮由来体性幹細胞をヒトの疾患の研究又は治療に用いる場合は、ヒト由来であることが好ましい。
　腸上皮を構成する細胞を含む細胞群は、高いバイアビリティーを有することが好ましく、例えば、バイアビリティーは７０％以上であり、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上である。当該細胞のバイアビリティーは、市販される分析器を用いて測定することが可能である。また、腸上皮を構成する細胞を含む細胞群は、コラーゲン等でコートしたプレートに対する接着率が高いこと（例えば、７０％以上）が好ましい。
　腸上皮を構成する細胞を含む細胞群のバイアビリティーは、公知の方法に従って測定することが可能であり、例えば、トリパンブルー色素を用いて腸上皮を構成する細胞を含む細胞群を処理し、青く染色された死細胞の割合を顕微鏡等を用いて測定することによって求めることができる。　
　（２）Ｇ０期又はＧ１期を通過させＳ期へと移行させる活性を有するタンパク質
　細胞に遺伝子として導入する「Ｇ０期又はＧ１期を通過させＳ期へと移行させる活性を有するタンパク質」（本明細書において、「細胞周期再活性化タンパク質」ということがある。）は、Ｇ０期又はＧ１期を通過させＳ期へと移行させる活性を有していればよく、特に限定されない。
　「Ｇ０期又はＧ１期を通過させＳ期へと移行させる」とは、（１）細胞周期から逸脱（脱出）することによりＧ０期にあり休止状態となっている細胞に対して働きかけ、Ｓ期へと移行させることにより再び細胞周期へと進入させること、又は（２）Ｇ１期にある細胞に対して働きかけ、その細胞周期をＧ１期からＳ期へと移行させることをいう。
　「Ｇ０期又はＧ１期を通過させＳ期へと移行させる活性」の有無は、以下の方法によって確認することができる。即ち、Ｓ期（ＤＮＡ合成期）への移行の確認は、ｔｈｙｍｉｄｉｎｅのアナログである５－Ｂｒｏｍｏ－２－ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ（ＢｒｄＵ）の細胞への取り込み活性を調べることで判断できる。具体的には、細胞培養培地にＢｒｄＵを入れ、その後、蛍光標識した抗ＢｒｄＵ抗体で反応させて細胞表面を免疫染色する等し、フローサイトメーター等を使った解析によって実施することができる。
　細胞周期再活性化タンパク質としては、例えば、Ｒｂタンパク質のリン酸化を促進する作用を有するものを用いることができる。例えば、サイクリン依存性キナーゼ及びサイクリン等が挙げられる。サイクリン依存性キナーゼとしては、例えば、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６及びＣＤＫ７が挙げられる。サイクリンとしては、例えば、サイクリンＤが挙げられる。これらの中でもＣＤＫ４及びＣＤＫ６が好ましく、ＣＤＫ４がより好ましい。
　細胞周期再活性化タンパク質の遺伝子は、１種のみを単独で使用しても良く又は複数種を組み合わせて使用しても良い。
　細胞周期再活性化タンパク質の遺伝子の由来は、本発明の効果が奏される限り特に限定されない。工程（Ａ）で用いる腸上皮を構成する細胞を含む細胞群が由来する動物種と同一種であってもよいし、異なる動物種であってもよい。発現効率等の観点から、好ましくは、細胞周期再活性化タンパク質の遺伝子の由来は、腸上皮を構成する細胞を含む細胞群が由来する動物と同一種に由来する。
　細胞周期再活性化タンパク質遺伝子を発現させる手段は、細胞周期再活性化タンパク質を発現させることができればよく、限定されない。例えば、一過性発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）させてもよいし、安定発現（ｓｔａｂｌｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）させてもよい。一過性発現とは、遺伝子をＤＮＡトランスフェクション法等により細胞に導入し、一過性に発現させることをいう。一過性とは通常、数時間から数日以内の期間をいう。これに対して安定発現とは、発現させようとする遺伝子が安定に染色体中に組み込まれた状態で発現することをいう。本発明の方法によって製造される腸上皮由来体性幹細胞及びその分化細胞が、生体内の腸上皮幹細胞又はその分化細胞と同一又は可能な限り類似する構造及び性質を有するという観点からは、当該細胞周期再活性化タンパク質の遺伝子は、一過性に発現されることが好ましい。
　一過性発現は、特に限定されないが、例えば、発現プロモーターの下流に目的の遺伝子を持つ発現ベクターを細胞に導入し、この発現ベクターから当該遺伝子を発現させること等によって行うことができる。この場合、発現プロモーターとしては、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等を用いることができるが、これらに限定されない。また、発現ベクターとしては、例えば、非ウイルスベクターとしてプラスミドベクターやリポソーム等、ウイルスベクターとしてアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を用いることができるが、これらに限定されない。製造する細胞を医薬の目的で使用する場合の安全性や導入する遺伝子をより確実に一過性発現とするという観点から、非ウイルスベクターを用いることが好ましく、中でも宿主細胞中での複製開始点を含まない非ウイルスベクターが好ましい。より確実に一過性発現を実施するために、導入した細胞が染色体に取り込まれていないことを確認する工程を加えることも可能である。このような観点から使用可能なプラスミドベクターとしては、例えばｐｃＤＮＡ、ｐＳＶＬ等を挙げることができる。細胞への発現ベクターの導入方法としては、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、ウイルスベクターに遺伝子を組み込み感染させる方法等を用いることができるが、これらに限定されない。
　安定発現は、特に限定されないが、例えば、次の方法等によって行うことができる。発現プロモーターの下流に目的の遺伝子と優性選択マーカーを持つ発現ベクターを細胞に導入し、目的の遺伝子が染色体に組み込まれた株を樹立する。この樹立された株では安定発現が行われている。この場合、発現プロモーターとしては、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等を用いることができるが、これらに限定されない。優性選択マーカーとしては、例えば、各種の薬剤耐性遺伝子等を用いることができるが、これらに限定されない。優性選択マーカーとして薬剤耐性遺伝子を用いた場合は、耐性を示す薬剤の存在下で細胞培養を継続して行うことにより、当該薬剤耐性遺伝子を安定発現している細胞株のみを選別することができる。通常、そのような細胞株においては同様に目的の遺伝子も安定発現していると考えられる。なお、実際に目的の遺伝子が安定発現しているか否かについては、染色体の塩基配列をＤＮＡシークエンス等によって解析すること等によって明らかにすることができる。また、細胞への発現ベクターの導入方法としては、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等を用いることができるが、これらに限定されない。また、ウイルスベクターを用いる場合は、ウイルスベクターに遺伝子を組み込み感染させる方法も用いることができる。
　なお、初代培養細胞に対して遺伝子導入を行う場合は、細胞毒性が比較的弱いとされるトランスフェクション試薬を用いることが好ましい。トランスフェクション効率を向上させるため、例えば、良好な状態にある細胞に対してトランスフェクションを行うことが好ましい。初代細胞の場合は、培養プレート上に播種した後、２～３日以内であれば細胞の状態が比較的良好である。
　工程（Ａ）は、腸上皮由来体性幹細胞の増殖をサポートする培地で培養しながら行うことが好ましい。例えば、通常の哺乳類細胞培養に用いられるＤＭＥＭ（Ｄｏｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）培地（ギブコ社製）等を基礎培地とし、これにウシ胎児血清、ヒト血清等を添加した培地を好適に用いることができる。
　工程（Ａ）を行う際に使用する培地には、さらに、細胞外増殖因子を添加してもよい。細胞外増殖因子とは、腸上皮由来体性幹細胞の増殖を外的にサポートする作用を有する物質であり、そのような作用を有しているものであればよく、特に限定されない。細胞外増殖因子としては、例えば、細胞増殖因子、細胞増殖を刺激するホルモン類等を挙げることができる。細胞増殖因子としては、例えば、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）及び繊維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ；ＦＧＦ）等を挙げることができる。中でもＥＧＦ及びＨＧＦが好適である。ホルモン類としては、例えばインスリン等を好適に用いることができる。これらを単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。例えば、ＥＧＦ及びＨＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の細胞増殖因子に、ＶＥＧＦ及びＦＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の細胞増殖因子をさらに組み合わせて用いることにより、相加的あるいは相乗的に増殖を向上させることができる。
　細胞外増殖因子の培地中における添加濃度は特に限定されないが、例えば０．１～２００ｎｇ／ｍｌであれば好ましく、１．０～１００ｎｇ／ｍｌであればより好ましく、５～５０ｎｇ／ｍｌであればさらに好ましい。
　腸上皮を構成する細胞を含む細胞群には、細胞周期再活性化タンパク質をコードするＤＮＡ以外にも、腸上皮由来体性幹細胞の増殖能と多分化能とを阻害しない限り、他の遺伝子を導入し発現させることができる。しかしながら、下記の工程（Ｂ）によって増殖された腸上皮由来体性幹細胞が、生体内の腸上皮体性幹細胞と同一又はそれと限りなく類似する構造上及び性質上の特性を有するという観点からは、細胞周期活性化タンパク質（例えば、サイクリン依存性キナーゼ）のＤＮＡ以外に外因性のＤＮＡを実質的に含んでないことが好ましい。同様の観点から、例えば、腸上皮由来体性幹細胞に導入される細胞の周期の調節に係る遺伝子は、細胞周期活性化タンパク質（例えば、サイクリン依存性キナーゼ、特にＣＤＫ４又はＣＤＫ６）の遺伝子のみであることが好ましい。一実施形態において、本発明によって増殖される腸上皮由来体性幹細胞は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素をコードする遺伝子を含まないことが好ましい。
　２．工程（Ｂ）
　工程（Ｂ）は、工程（Ａ）で得られた細胞を細胞外増殖因子の存在下で培養する工程である。
　工程（Ｂ）により、腸上皮を構成する細胞を含む細胞群の中から腸上皮由来体性幹細胞が次の通り優勢的に増殖する。腸上皮由来体性幹細胞では、まず、工程（Ａ）で外部から導入された細胞周期再活性化タンパク質の働きによって、細胞周期がＧ０期又はＧ１期からＳ期へと移行し、さらにＭ期（分裂期）、続いて再びＧ１期へと進む。同時に、培地中に存在する細胞外増殖因子の働きにより、細胞周期再活性化タンパク質の働きが活性化される。その結果、腸上皮由来体性幹細胞は増殖を続ける。一方、腸上皮由来体性幹細胞とは異なる細胞においては、細胞周期再活性化タンパク質の働きによる上記のような増殖活性化は起こらないか、又は増殖が一時的なものに止まり継続しない。この結果、腸粘膜を構成する細胞を含む細胞群の中から腸上皮由来体性幹細胞が優勢的に増殖する。
　工程（Ｂ）では、工程（Ａ）で細胞周期再活性化タンパク質の遺伝子を発現させた細胞を、細胞外増殖因子の存在下で培養する。工程（Ａ）で使用した培地が当初から適切な細胞外増殖因子を含んでいる場合は、細胞周期再活性化タンパク質の遺伝子を発現させた細胞を、培地を交換せずにそのまま培養してもよい。また、培地を交換せずにさらに当該細胞外増殖因子を培地中に添加してもよい。当該細胞外増殖因子を含む培地に交換してもよいし、当該細胞外増殖因子を含まない培地に交換した後に、当該細胞外増殖因子を当該培地に添加してもよい。
　細胞外増殖因子としては、上記工程（Ａ）に関して説明した細胞外増殖因子（例えば、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ等）を用いることができる。
　細胞外増殖因子の培地中における添加濃度は特に限定されないが、例えば０．１～２００ｎｇ／ｍｌであれば好ましく、１．０～１００ｎｇ／ｍｌであればより好ましく、５～５０ｎｇ／ｍｌであればさらに好ましい。
　工程（Ｂ）において新たな培地を用いる場合は、通常の哺乳類細胞培養に用いられるＤＭＥＭ（Ｄｏｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）培地（ギブコ社製）等を基礎培地とし、腸上皮由来体性幹細胞の増殖をサポートする成分をさらに添加したもの等を用いることができる。
　工程（Ｂ）においては、適当な間隔で培地を交換してもよい。培地を交換する頻度は、特に制限されないが、２又は３日に一度の頻度で培地交換を行ってもよい。同じ濃度の細胞外増殖因子を含む培地へと交換してもよいし、異なる濃度の細胞外増殖因子を含む培地へと交換してもよい。同じ細胞外増殖因子を含む培地へと交換してもよいし、異なる細胞外増殖因子を含む培地へと交換してもよい。
　培養温度等その他の培養条件は、培養する腸上皮由来体性幹細胞の種類に応じて公知の方法に従って適宜設定することができる。
　工程（Ａ）及び工程（Ｂ）はそれぞれ一回ずつ行ってもよいし、これらを１セットとしてそれを複数回繰り返し行ってもよい。複数回行う場合、好ましくは２～１０回、より好ましくは３～８回、さらに好ましくは３～５回行うことができる。このように工程（Ａ）及び（Ｂ）を繰り返すことは、細胞周期再活性化タンパク質をコードする遺伝子を一過性に発現させる場合に好ましい。これは、一過性の発現は、トランスフェクション後約３日が発現のピークであること、腸上皮由来体性幹細胞を増殖性の状態にシフトさせるためには、一定期間の継続した当該遺伝子の発現が好ましいと考えられるためである。
　工程（Ａ）及び工程（Ｂ）はこの順に連続して行うこともできるし、工程（Ａ）の後にその他の工程を実施し、その後に工程（Ｂ）を実施してもよい。工程（Ｂ）又は工程（Ａ）と（Ｂ）の繰り返しは、必要な量の腸上皮由来体性幹細胞が得られるまで続けることができる。例えば、後述する実施例１に示されるように、２０～６０日程度、工程（Ａ）と（Ｂ）とを繰り返しながら継続することが好ましい。
　工程（Ｂ）を一度だけ行う場合は、例えば、腸上皮由来体性幹細胞によるコロニー形成が十分に行われるまで工程（Ｂ）を続ければ、腸上皮由来体性幹細胞群を容易に採取することができるため好ましい。工程（Ｂ）の終了時点は、好ましくは顕微鏡若しくは肉眼で腸上皮由来体性幹細胞のコロニーが確認できる時点、又は１０～１００００個の細胞群からなる腸上皮由来体性幹細胞のコロニーが形成される時点であり、より好ましくは、１００～１０００個の細胞群からなる腸上皮由来体性幹細胞のコロニーが形成される時点である。腸上皮由来体性幹細胞を含む細胞群に当初含まれていた、腸上皮幹細胞とは異なる細胞は、遅くとも工程（Ｂ）の終了時点までには細胞分裂寿命のため細胞分裂は停止し、その多くは脱落するか、あるいは残存していても当初とは大きく形態が変化している。このため、コロニーを形成している腸上皮由来体性幹細胞とは容易に区別可能であり、純度の高い腸上皮由来体性幹細胞群を取得することができる。
　工程（Ａ）及び工程（Ｂ）を繰り返し行う場合は、例えば、腸上皮由来体性幹細胞によるコロニー形成が十分に行われるまで工程（Ａ）及び工程（Ｂ）を繰り返せば、腸上皮由来体性幹細胞群を容易に採取することができるため好ましい。工程（Ａ）及び工程（Ｂ）を繰り返す回数は、好ましくは顕微鏡若しくは肉眼で腸上皮由来体性幹細胞のコロニーが確認できる時点、又は１０～１００００個の細胞群からなる腸上皮由来体性幹細胞のコロニーが形成されるまでであり、より好ましくは、１００～１０００個の細胞群からなる腸上皮由来体性幹細胞のコロニーが形成されるまでである。コロニーは、工程（Ｂ）の開始から通常数週間～１ヶ月程度で形成される。腸上皮を構成する細胞を含む細胞群に当初含まれていた、腸上皮幹細胞とは異なる細胞は、遅くとも最後の回の工程（Ｂ）の終了時点までには細胞分裂寿命のため細胞分裂は停止し、その多くは脱落するか、あるいは残存していても当初とは大きく形態が変化している。このため、コロニーを形成している腸上皮由来体性幹細胞とは容易に区別可能であり、純度の高い腸上皮由来体性幹細胞群を取得することができる。また、この場合、各回の工程（Ｂ）は、細胞が増殖し続けている限り継続することができる。ただし、増殖している途中に終了させることもできる。
　先述の通り工程（Ｂ）により、腸上皮を構成する細胞を含む細胞群の中から腸上皮幹細胞は良好な増殖性を維持するためやがてコロニーを形成する。その他の細胞は工程（Ｂ）の終了時点には細胞分裂寿命のため細胞分裂は停止し、その多くは脱落するか、あるいは残存していても当初とは大きく形態が変化している。したがって、コロニーを形成している腸上皮由来体性幹細胞とは容易に区別可能であり、このコロニーを回収することによって、腸上皮由来体性幹細胞集団をクローンとして分離できる。
　３．その他
　工程（Ｂ）の後に、コロニーを回収する工程を行うことによって、腸上皮由来体性幹細胞を取得できる。コロニーの回収は、従来公知の方法によって行うことができる。限定されないが、例えば限界希釈法や顕微鏡観察下においてマイクロピペットを使用する方法等によって行うことができる。
　本発明の製造方法により、好ましくは腸上皮由来体性幹細胞を細胞数換算で５０％以上含む腸上皮由来体性幹細胞群、より好ましくは腸上皮由来体性幹細胞を８０％以上含む腸上皮由来体性幹細胞群を製造することができる。本発明の製造方法により、さらに好ましくは実質的に腸上皮由来体性幹細胞のみから構成されてなる体性幹細胞群、よりさらに好ましくは単離された腸上皮由来体性幹細胞群を製造することができる。
　本発明において腸上皮由来体性幹細胞の判定は、特に限定されないが、例えば目的の細胞へと分化するか否かを調べることによって行うことができる。また、本発明において腸上皮由来体性幹細胞の判定は、細胞表面マーカーの有無を確認すること等によっても行うことができる。例えば、腸上皮由来体性幹細胞であることの判定は、Ｂｍｉ－１、Ｍｕｓａｈｉ－１及びＬｇｒ－５から成る群から選択される一種以上の分子マーカーが陽性であることに基づいて実施することができる。
　本発明の方法により得られる腸上皮由来体性幹細胞は、生体内の腸上皮幹細胞と同等の性質を持つため、腸上皮分化細胞の高純度集団を安定的に供給するために利用することができる。尚、本発明の方法によって得られる腸上皮由来体性幹細胞は、腸上皮に本来的に存在する体性幹細胞に由来する細胞だけでなく、体性幹細胞以外の細胞が上記工程（Ａ）及び（Ｂ）によってクローン増殖性及び多分化能を獲得した細胞も含まれる。腸上皮分化細胞は、最終的に細胞製剤等の臨床応用、又は新薬開発若しくは疾患研究等の様々な研究開発において活用することができる。
　Ｂ．腸上皮を構成する分化細胞の製造方法
　腸上皮を構成する分化細胞の製造方法は、上記Ａの製造方法によって得られる腸上皮由来体性幹細胞を分化させる工程を含む。
　分化させる工程は、公知の手法に従ってin vitro 又はin vivoで実施することができる。例えば、分化に適した培地で腸上皮由来体性幹細胞を培養し、腸上皮を構成する各種の分化細胞への分化を誘導することができる。分化に適切な培地及びその他の培養条件は、目的とする分化細胞の種類に応じて公知の条件から適宜選択して設定することができる。具体的に、ウシ胎児血清（１～２０％）、ＦＧＦ（１～５０ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（１～１００μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１～１００μｇ／ｍｌ）、ニコチンアミド（１～５０ｍM）、セレン（０．１～１０ｎｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（１０～１００μｇ／ｍｌ）を含む幹細胞の培養に適した培地（例えば、DMEM/F12培地）で、腸上皮由来体性幹細胞を培養することができる。分化の確認は、例えば、微絨毛を持つ細胞のマーカーであるＶｉｌｌｉｎ、内分泌細胞マーカーであるｓｅｃｒｅｔｉｎ、杯細胞マーカーであるｔｒｅｆｏｉｌ　ｆａｃｔｏｒ－３、幹細胞マーカーであるＭｕｓａｓｈｉ－１等の発現によって確認することができる。
　腸上皮由来体性幹細胞を分化させるための培養は、２次元培養でも３次元培養でも良いが、より速く分化を誘導するという観点からは、３次元培養が好ましい。３次元培養とは、文字通り立体的に細胞を培養することであり、３次元培養をするための種々の基材やキットを用いることができる。培養時間は、目的に分化細胞の種類に応じて、適宜設定することができる。
　腸上皮由来体性幹細胞は、分化に適した培地での培養に先立って、活性化物質の存在下で予め一定期間培養（プライミング培養）することが好ましい。プライミング培養は分化を一段階進める処理であり、これによってその後の分化に必要な培養期間を短縮することが可能となる。プライミング培養は、例えば、ＢＭＰやＦＧＦの存在下で実施することができる。
　分化した腸上皮を構成する細胞は、小腸や大腸に関する種々の研究材料や移植等に利用することができる。
Ｃ．医薬組成物
　本発明の他の実施形態は、本発明の方法で得られる腸上皮由来体性幹細胞及び／又はそれを更に分化させて得られる腸上皮分化細胞を含む医薬組成物（細胞製剤）である。本発明の医薬組成物は、例えば、損傷した腸の修復等に用いることができる。
　本発明の医薬組成物に含まれる細胞は、外因性の遺伝子が導入されたものでもよい。本発明の方法で製造される腸上皮由来体性幹細胞又は腸上皮分化細胞への外因性遺伝子の導入は、当該技術分野に公知の方法を用いて行うことができる。導入される外因性遺伝子は、細胞製剤の使用目的（例えば、遺伝子治療）に応じて適宜選択することができる。
　本発明の医薬組成物の投与形態は、適用対象患部等に応じて適宜設定される。例えば、静脈内注射、動脈内注射、門脈内注射、皮内注射、皮下注射、粘膜下注射又は腹腔内注射等が挙げられる。この他にも、例えば培養によりシート状にした細胞を適用対象患部に対して貼付することによって投与する方法も挙げることができる。あるいは生体適合性を持ついわゆる足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を用いて細胞を３次元的に培養し構築した組織様のものを患部組織に貼付、あるいは移植することができる。
　本発明の医薬組成物の剤型は、投与形態等に応じて適宜設定される。例えば、液体中に細胞を懸濁させてなる液剤、ゲル中に細胞を懸濁させたゲル剤、細胞シート、及び組織様の細胞凝集体等が挙げられる。
　本発明の医薬組成物の投与量及び投与頻度は、投与形態及び剤型の他、被投与者の状態、細胞の活性の程度、疾患の種類等に応じて適宜設定される。一回あたりの投与量は治療有効量であればよい。例えば、本発明の医薬組成物は、１日当たり１回の頻度で若しくは２又は３回程度に分割して投与してもよく、２日～１週間分の投与量を一度にまとめて投与してもよい。医薬組成物中に含まれる腸上皮由来体性幹細胞又は腸上皮分化細胞の割合は、投与形態、剤型、投与量、及び投与頻度等に応じて適宜設定することができる。
　本発明の細胞製剤は、有効成分（腸上皮由来体性幹細胞又は腸上皮分化細胞）に加えて必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。そのような成分としては例えば、剤型に応じて製剤化のために必要となる賦形剤、保存安定のために必要となる保存安定成分、及びその他の薬効成分等が挙げられる。その他の薬効成分としては、例えば、抗炎症剤、抗菌剤、免疫抑制剤、細胞成長因子、ホルモン等が挙げられる。
Ｄ．腸上皮由来体性幹細胞単離用キット
　本発明の腸上皮由来体性幹細胞を単離するキットは、細胞周期再活性化タンパク質を発現させる発現ベクター及び細胞外増殖因子を含む、腸上皮を構成する細胞含む細胞群から腸上皮由来体性幹細胞を単離するキットである。
　腸上皮を構成する細胞を含む細胞群、細胞外増殖因子、細胞周期再活性化タンパク質、及び発現ベクターは、上記Ａ．で説明したのと同様である。当該キットは、その他に、Ａ．で説明した適当な細胞外増殖因子を含んでいてもよい。
　以下、実施例及び試験例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１．ヒト腸上皮細胞由来の体性幹細胞の取得
（１）初代ヒト腸上皮細胞の培養
　ヒト小腸上皮細胞（Ｃｅｌｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社，ＣＳ－ＡＢＩ－５１９）を蘇生後、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地に懸濁し、コラーゲンコートした１２ウェル細胞培養プレートに約１．０×１０５個／ウェルの細胞密度で播種した。播種した細胞を３７℃、５％ＣＯ２の条件下、インキュベーター内で培養した。
（２）トランスフェクション
　ヒト小腸上皮細胞を播種した２日後に、以下の培地及び導入遺伝子の条件でトランスフェクションを実施した。トランスフェクションには、市販のタンパク質発現用プラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、そのＥｃｏＲＩとＸｂａＩの間のクローニングサイトにヒトＣＤＫ４を、又はそのＨｉｎｄIIIとＢａｍＨＩの間のクローニングサイトにCDK６をコードするＤＮＡを挿入した。ヒトＣＤＫ４、又はＣＤＫ６をコードするＤＮＡは、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に登録された塩基配列（ＣＤＫ４遺伝子のアクセッション番号：ＣＡＧ４７０４３、ＣＤＫ６遺伝子のアクセッション番号：ＮＰ－００１１３８７７８）を基にプライマーを設計し、ＨｕＳ－Ｅ／２細胞（ヒト肝細胞由来の細胞で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている：ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１０９０８）から精製したｔｏｔａｌ　ＲＮＡを鋳型としてＲＴ－ＰＣＲを行って得た。ＣＤＫ４をコードするＤＮＡを取得するためのプライマーには、配列番号１に示される塩基配列から成るフォワードプライマーと配列番号２に示される塩基配列から成るリバースプライマーを用いた。ＣＤＫ６をコードするＤＮＡを取得するためのプライマーには、配列番号３に示す塩基配列から成るフォワードプライマーと配列番号４に示す塩基配列から成るリバースプライマーを使用した。配列番号１及び３の塩基配列にはＦｌａｇ　Ｔａｇに相当する配列が含まれる。
　このようにして取得したヒトＣＤＫ４又はＣＤＫ６をコードするＤＮＡのＯｐｅｎ　Ｒｅａｄｉｎｇ　ＦｒａｍｅのＮ末端側にＦＬＡＧ　ｔａｇが導入されたプラスミド（ｐｃＤＮＡ－ＦＬＡＧ－ＣＤＫ４又はｐｃＤＮＡ－ＦＬＡＧ－ＣＤＫ６）を１ウェルあたり０．２μｇとなるようＥｆｆｅｃｔｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）と共に添加し、細胞内に遺伝子を導入した。トランスフェクションは以下の２条件で行い、３～５日間に一度の頻度で計３回繰り返し実施した。
第１群：５％ウシ胎児血清、５％ヒト血清を含むＤＭＥＭベースの培地に２０ｎｇ／ｍｌの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（ｈｕｍａｎ　ＨＧＦ、東洋紡、Ｃｏｄｅ：ＨＧＦ－１０１、ＣＨＯ細胞組換え体）を添加した培地。導入遺伝子はＣＤＫ４又はＣＤＫ６（ｐｃＤＮＡ－ＦＬＡＧ－ＣＤＫ４又はｐｃＤＮＡ－ＦＬＡＧ－ＣＤＫ６）。
第２群：第１群と同じ培地。導入遺伝子はプラスミドのみ（ｐｃＤＮＡ３）。
（３）腸上皮幹細胞の取得
　上記（１）の細胞調製をヒト細胞のロットを替えて合計３回実施し、それぞれの細胞において（２）のトランスフェクションを実施した。
　培養４８日目には、第２群の条件（ネガティブコントロール）のトランスフェクションした細胞はすべて脱落して無くなった。この時点でｐｃＤＮＡ－ＦＬＡＧ－ＣＤＫ４トランスフェクションした細胞群から、クローン性増殖を示す細胞からなる数個のコロニー形成が見られた。同様にｐｃＤＮＡ－ＦＬＡＧ－ＣＤＫ６でトランスフェクションした細胞からも数個のコロニー形成が見られた。これらのコロニーを限界希釈法にてクローニングを実施し、クローン性増殖を示す細胞を得た。これら一連の操作により得られたクローンは、樹立後半年以上継続した増殖が認められ、自己複製能力を有していることが確認された。３回の実験の結果、取得したクローン細胞数を図１に示す。
実施例２．ヒト腸上皮由来体性幹細胞の取得
　実施例１において、トランスフェクション時に使用する培地に添加する増殖因子を、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子）とし、同様の実験操作を実施した場合に取得した腸上皮由来体性幹細胞数を図２に示す。
実施例３．ヒト腸上皮由来の体性幹細胞の性状解析
　実施例１において得られた幹細胞クローンの一部について腸上皮幹細胞関連の分化マーカーを中心に調べた。即ち、Ｂｍｉ－１、Ｍｕｓａｓｈｉ－１、Ｌｇｒ－５について、細胞を回収して抽出したｔｏｔａｌ　ＲＮＡを用いてＲＴ－ＰＣＲを実施し、ｍＲＮＡの発現を調べた。その結果を図３に示す。図中、陽性を（＋）、陰性を（－）として表す。
　得られたクローン性増殖を示す細胞は、Ｂｍｉ－１、Ｍｕｓａｓｈｉ－１、Ｌｇｒ－５のいずれか、あるいはこれらのうち複数のマーカー発現陽性を示した。この結果から、本発明によって得られたクローン性増殖を示す細胞は、腸上皮幹細胞や腸上皮前駆細胞が持つ特徴であるマーカーを発現していることが分かった。
実施例４．ヒト腸上皮由来体性幹細胞の腸上皮細胞への分化誘導　
　実施例１において取得した腸上皮由来体性幹細胞を、１２ウェルプレートに播種しDMEM/F12培地に１０％ウシ胎児血清、EGF（10ng/ml）、インスリン（10μg/ml）、トランスフェリン（10μg/ml）、ニコチンアミド（10mM）、セレン（30nM）、ゲンタマイシン（50μg/ml）を含む培養液で７日間培養し、コンフルエントまで増殖させた後に、培養液を、DMEM/F12培地に１％ウシ胎児血清、インスリン（10μg/ml）、トランスフェリン（10μg/ml）、セレン（30nM）、ゲンタマイシン（50μg/ml）を含む培養液に交換して更に１４日間培養を行った。
　上記の培養した細胞をPBSで洗浄後に回収し、ＲＮＡを抽出してｒｅａｌ　ｔｉｍｅＰＣＲにて遺伝子発現解析を実施した。発現マーカーは、微絨毛を持つ細胞のマーカーであるＶｉｌｌｉｎ、内分泌細胞マーカーであるｓｅｃｒｅｔｉｎ、杯細胞マーカーであるｔｒｅｆｏｉｌ　ｆａｃｔｏｒ－３、幹細胞マーカーであるＭｕｓａｓｈｉ－１について調べた。各マーカーの発現強度を、分化誘導を実施する前の状態に比べ比較したところ、Ｍｕｓａｓｈｉ－１を除くマーカーはいずれも顕著に発現が増加していた。その結果を図４に示す。この結果は、本発明によって得られた腸上皮由来体性幹細胞が、腸上皮を構成する複数種の細胞への分化能を持つこと、すなわち腸上皮由来体性幹細胞であることを示す。

Claims (14)

  1. 　以下の工程（Ａ）及び（Ｂ）を含む、腸上皮由来体性幹細胞の製造方法：
    （Ａ）腸上皮を構成する細胞を含む細胞群において、Ｇ０期又はＧ１期を通過させＳ期へと移行させる活性を有するタンパク質の遺伝子を発現させる工程；及び
    （Ｂ）工程（Ａ）で得られた細胞を細胞外増殖因子の存在下で培養する工程。
  2. 前記発現が一過性発現である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記工程（Ａ）及び前記工程（Ｂ）を二回以上繰り返す、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記タンパク質がサイクリン依存性キナーゼである、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　前記タンパク質がサイクリン依存性キナーゼ４及びサイクリン依存性キナーゼ６からなる群より選択される少なくとも一種のタンパク質である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　前記細胞外増殖因子が上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、及びインスリン様成長因子（ＩＧＦ）からなる群より選択される少なくとも一種の細胞外増殖因子である、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 　請求項１～６のいずれかに記載の方法により得られうる、腸上皮由来体性幹細胞。
  8. 腸上皮由来体性幹細胞がＢｍｉ－１、Ｍｕｓａｈｉ－１及びＬｇｒ－５から成る群から選択される一種以上のマーカーについて陽性である、請求項７に記載の細胞。
  9. 請求項７又は８に記載の細胞に、さらに外因性遺伝子が導入された細胞。
  10. 請求項７～９のいずれかに記載の細胞を、腸上皮を構成する細胞に分化させる工程を含む、分化細胞の製造方法。
  11. 　前記分化させる工程が３次元培養を行う工程を含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 　請求項１０又は１１に記載の方法により得られうる、腸上皮を構成する細胞。
  13. 請求項７～９及び１２のいずれかに記載の細胞を含む、医薬組成物。
  14. 　Ｇ０期又はＧ１期を通過させＳ期へと移行させる活性を有するタンパク質を発現させる発現ベクター及び細胞外増殖因子を含む、腸上皮を構成する細胞を含む細胞群から腸上皮由来体性幹細胞を単離するためのキット。
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