JP7307478B2 - ダイレクトリプログラミングによる肝幹細胞又は肝前駆細胞の製造方法 - Google Patents
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Description
また、マウス胚性線維芽細胞にHnf1β及びFoxa3を導入すると肝幹細胞にリプログラミングされること(非特許文献1)、FOXA3、HNF1A及びHNF4Aを発現させることにより、ヒト線維芽細胞から成熟肝細胞にリプログラミングする方法(非特許文献2)、HNF1A、HNF4A及びHNF6を、成熟因子であるATF5、PROX1及びCEBPAとともに過剰発現することにより、ヒト誘導肝細胞を作製する方法(非特許文献3)などが知られている。
しかしながら、従来法で誘導された肝細胞は増殖能に乏しく、また胆管上皮細胞にも分化できない。
(1)非肝幹細胞又は非肝前駆細胞に、以下の組合せを導入することを特徴とする、非肝幹細胞又は非肝前駆細胞から肝幹細胞又は肝前駆細胞への誘導方法:
(a)HNF1、HNF6及びFOXAの組合せ、
(b)HNF1遺伝子、HNF6遺伝子及びFOXA遺伝子の組合せ、
(c)HNF1、MYC及びFOXAの組合せ、又は
(d)HNF1遺伝子、MYC遺伝子及びFOXA遺伝子の組合せ。
(2)(1)に記載の方法によって肝幹細胞又は肝前駆細胞を誘導する工程を含む、肝幹細胞又は肝前駆細胞の製造方法。
(3)HNF1がHNF1Aである、(1)又は(2)に記載の方法。
(4)FOXAがFOXA3である、(1)~(3)のいずれか1項に記載の方法。
(5)組合せが(a)又は(b)であって、さらに、MYC又はMYC遺伝子を導入する、(1)~(4)のいずれか1項に記載の方法。
(6)MYCがL-MYCである、(1)~(5)のいずれか1項に記載の方法。
(7)非肝幹細胞又は非肝前駆細胞が、血管内皮細胞又は血液由来細胞である、(1)~(6)のいずれか1項に記載の方法。
(8)血管内皮細胞が臍帯静脈、末梢血又は臍帯血由来のものである(7)に記載の方法。
(9)血液由来細胞が末梢血T細胞又は臍帯血T細胞である(7)に記載の方法。
(10)(2)~(9)のいずれか1項に記載の方法により製造された、肝幹細胞又は肝前駆細胞。
(11)(a)(1)に記載の方法によって肝幹細胞又は肝前駆細胞を誘導する工程、及び
(b)誘導した肝幹細胞又は肝前駆細胞を肝細胞又は胆管上皮細胞に分化させる工程
を含む、肝細胞又は胆管上皮細胞の製造方法。
本発明において、使用の対象となる非肝幹/非肝前駆細胞は、目的とする肝幹/肝前駆細胞以外の細胞を意味する。非肝幹/非肝前駆細胞としては、例えば線維芽細胞、内皮細胞、血液細胞、臍帯血細胞、骨髄細胞、ケラチノサイト、肝細胞、胆管上皮細胞、筋線維芽細胞、神経系細胞、上皮系細胞などが挙げられる。本発明においては、例えば血管内皮細胞又は血液由来細胞を使用することができる。血管内皮細胞としては、臍帯静脈、末梢血又は臍帯血由来のものが挙げられ、血液由来細胞としては、末梢血細胞又は臍帯血細胞(例えば末梢血T細胞又は臍帯血T細胞)が挙げられる。本発明において用いられる非肝幹/非肝前駆細胞は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ヒトなどの哺乳動物由来の細胞である。本発明の一つの態様において、用いられる非肝幹/非肝前駆細胞はヒト由来の細胞である。
「リプログラミング」とは、細胞の分化状態を当該細胞とは異なる分化状態又は未分化状態に変更するプロセスである。本発明においては、上記非肝幹/非肝前駆細胞を、肝幹/肝前駆細胞に誘導する。本発明では、多能性幹細胞を経由せずに非肝幹/非肝前駆細胞から肝幹/肝前駆細胞に誘導させることができる。このようなリプログラミングに用いる因子(リプログラミング因子)は、以下の組合せである:
(a)HNF1、HNF6及びFOXAの組合せ、
(b)HNF1遺伝子、HNF6遺伝子及びFOXA遺伝子の組合せ、
(c)HNF1、MYC及びFOXAの組合せ、又は
(d)HNF1遺伝子、MYC遺伝子及びFOXA遺伝子の組合せ。
HNF6(Hepatocyte Nuclear Factor 6)は、ヒトの組織発生に関わるホメオドメイン型転写因子であり、膵臓や肝臓など多様な組織の発生を制御するとともに、種々の肝遺伝子の発現制御を行う。
MYCファミリー遺伝子は、核内DNAに結合して働く転写因子として知られており、ヒトでは、c-MYC、L-MYC及びN-MYCがある。本発明では、これらのいずれも使用することができる。
本明細書において、HNF1Aをコードする遺伝子を「HNF1A遺伝子」、HNF6をコードする遺伝子を「HNF6遺伝子」という。他の因子をコードする遺伝子についても、上記と同様に表示する。
・NF1A、HNF6及びFOXA3
・NF1A、L-MYC及びFOXA3
・NF1A、HNF6、FOXA3及びL-MYC
(a) 表1に示されるアミノ酸配列において、1個又は数個(例えば10個以下、5個以下、4個以下、3個以下又は2個)のアミノ酸が、欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、それぞれのリプログラミング因子が有する本発明におけるリプログラミング因子としての機能を有するタンパク質
(b) 表1に示されるアミノ酸配列に対して80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上、又は99%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、それぞれのリプログラミング因子が有する本発明におけるリプログラミング因子としての機能を有するタンパク質
(c) 上記(a)のタンパク質をコードする核酸
(d) 上記(b)のタンパク質をコードする核酸
(e) 表1に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、それぞれのリプログラミング因子が有する本発明におけるリプログラミング因子としての機能を有するタンパク質をコードする核酸
宿主細胞である非肝幹/非肝前駆細胞にリプログラミング因子を導入するために、リプログラミング因子をコードする遺伝子を同一の又は異なるベクターに組み込んだ組換えベクターを構築してもよい。本発明において、ベクターは、挿入セグメントの複製をもたらすために挿入され得るレプリコンを使用することができる。ベクターは、1つ以上の発現制御配列を作動可能に連結させた発現ベクターとしてもよく、リプログラミング因子以外の他のDNA配列の転写及び/又は翻訳を制御するDNAを含めることができる。発現制御配列の例としては、プロモーター、エンハンサー、転写終結領域等が挙げられる。
in vivoで行う場合は、発現ベクターを既知の導入手法を用いて、例えば動物の皮膚組織や血管内、腹腔内から非肝幹/非肝前駆細胞に導入し、形質転換体を得てもよい。その後、動物組織中、又は動物組織より回収した細胞中において、肝幹/肝前駆細胞にリプログラミングした細胞を確認することができる。
得られた細胞が肝幹/肝前駆細胞にリプログラミングされたか否かは、これらの細胞に発現するマーカーにより確認することができる。マーカーとしては、例えばアルブミン、α-フェトプロテイン、E-カドヘリンなどが挙げられる。
また、本発明においては、下記因子のポリペプチドを直接細胞に導入することも可能である。
・HNF1A、HNF6及びFOXA3
・HNF1A、L-MYC及びFOXA3
・HNF1A、HNF6、FOXA3及びL-MYC
上記因子は、遺伝子工学的に製造することができ(例えば「Molecular Cloning, A Laboratory Manual (4th edition)」(Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)を参照)、得られたポリペプチドの細胞内への導入は、膜透過性ペプチド等に連結して細胞内に導入する方法、陽イオン性脂質を用いて細胞内に導入する方法などを採用することができ、細胞内導入試薬も市販されている(PULSin(PPU 社) 、Prote-IN(HYG 社)、BioPORTER Protein Delivery Reagent(GTS 社)等)。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
hiHepPC誘導実験の概略図を図1Aに示す。
市販のヒト臍帯静脈内皮細胞(human umbilical vein endothelial cell: HUVEC)に対し、レトロウイルス感染によりレトロウイルスベクター(遺伝子発現ベクター)を導入した。その間、HUVECはMedium 200とFibrolife serum-free cell culture mediumを1:1で混合した培地(HUVEC medium)で培養した。ウイルス感染後、2日間Hepato-medium(DMEMとF12の1:1混合培地に4%ウシ胎児血清、1 μg/ml インスリン、10-7M デキサメタゾン、10 mM ニコチンアミド、2 mM L-グルタミン、50 μM β-メルカプトエタノール、ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したもの)に20% Fibrolife 血清フリー細胞培養培地、20 ng/ml HGF、1 μM A83-01、2 μM SB43852、5 μM Y27632を添加した培地(Hepato-medium (plus))で培養し、その後はHepato-medium (plus)にて細胞の継代を行いながら、随時解析を行った。
ALBは肝前駆細胞や肝細胞で発現するマーカーであり、E-CADは上皮細胞のマーカーである。ALB及びE-CADの免疫染色、細胞の位相差写真(Phase)、並びにALB陽性細胞の割合のグラフから、F3/H1A/H6を導入した場合において、増殖能をもった肝前駆細胞様の細胞が誘導されることがわかる。
また、F3/H1A/H6の遺伝子セットをHUVECに導入してhiHepPC を誘導する実験を3回独立して行った。
さらに、12回目の継代時におけるhiHepPCの染色体解析を行った結果を図1Dに示す。20個の細胞を解析したが、それらすべてにおいて染色体数は正常であった。
HUVEC由来hiHepPCについて、継代(P)1~6回目のそれぞれでALBとα-フェトプロテイン(AFP)の共免疫染色を行い、ALB陽性細胞中のAFP陽性率を算出した。
パネルAにおいて、hiHepPC誘導の初期過程では、肝前駆細胞の特徴であるALB及びAFP共陽性細胞の割合が多いが、継代を重ねることで肝細胞の特徴であるALB単独陽性細胞の割合が増加する。この結果から、HUVECはまずhiHepPCに変化し、その後hiHepPCから肝細胞様細胞が分化してくると考えられる。グラフは、独立した3回の実験で作製したhiHepPCの解析で得たデータの平均値±標準偏差(n=3)を表す。細胞のDNAはDAPI(青色)で染色した。スケールバー:50μm。
hiHepPCから分化した肝細胞様細胞の機能解析と遺伝子発現解析結果を図3に示す。
パネルAでは、HUVEC由来hiHepPCから分化した肝細胞様細胞は、肝細胞と同様にグリコーゲンの蓄積、脂質合成、及びインドシアニングリーン(ICG)の取込みと放出を行うことができることが示される。スケールバー:50μm。
まず、3週令の免疫不全マウス(NSGマウス)が7週令になるまで、レトロルシンを週に1回、計5回投与した。続いて、最後のレトロルシン投与から1週間後、当該マウスに四塩化炭素(CCl4)を1回投与し、肝障害を誘導した。そして、その次の日に1 x 107個のHUVEC由来hiHepPCを脾臓から門脈経由で肝臓に移植した。移植後2ヶ月が経った後、肝臓と血清の解析を行った。
パネルAは、hiHepPC移植実験の概略図を示す。
パネルBは、hiHepPC移植後のマウス血清中に存在するヒトアルブミン濃度を示し、また、hiHepPCを移植した5匹のマウスについて、それらの解析結果を示す。ネガティブコントロールとして、移植なしのNSGマウスの血清、並びにHUVECを移植したNSGマウスの血清の解析結果を示す。TPはtransplantationを表す。グラフは、平均値±標準偏差(n=2)を表す。
図5は、hiHepPCから胆管上皮細胞様細胞への分化を示す。
パネルAは、HUVEC及びHUVEC由来hiHepPCをマトリゲル内で1週間三次元培養すると、hiHepPCのみが上皮管腔構造をもった球状組織(スフェロイド)を形成することを示す。これらスフェロイドは継代(P)することも可能である。スケールバー:100μm。
独立した3回の実験で作製したhiHepPC(hiHepPC-1、hiHepPC-2、hiHepPC-3)のそれぞれについて、フローサイトメトリー(FACS)によるクローンソーティングを行い、96ウェル培養プレートの各ウェルに1つずつ細胞を播種し、1細胞培養を行った。その後、1細胞(hiHepPCクローン)から増殖した細胞について解析を行った。
パネルBでは、hiHepPC-1、hiHepPC-2及びhiHepPC-3のそれぞれについて、1細胞培養の結果形成されるコロニーの割合(それぞれ570ウェル当たり)、及び、その後増殖を続けるクローンの割合(それぞれ570ウェル当たり)を左図、右図のそれぞれのグラフで示す。
HUVECに対し、FOXA3、HNF1A及びHNF6に加え、L-MYCも同時に導入し、解析を行った。
パネルAでは、1~6回目の継代(P)ごとにALBの免疫染色を行い、P6においてはE-CADの免疫染色と位相差写真(Phase)の撮影も行った。細胞のDNAはDAPI(青色)で染色した。スケールバー:50μm。
パネルBは、HUVECにF3/H1A/H6+L-MYCの組み合わせを導入後、1~6回目の継代ごとにALB陽性細胞数の計測を行い、ALB陽性細胞の割合をグラフ化した結果を示す。グラフ中のPHはparental HUVECを、PNはpassage number(継代数)を表す。独立した2回の実験を行い、それぞれの結果をグラフ上の青線と赤線で示す。F3/H1A/H6+L-MYCの組み合わせでは、F3/H1A/H6の組み合わせ(図1B参照)よりも早くALB陽性細胞が誘導される。
HPBECからhiHepPCを誘導する実験の概略図を図8Aに示す。まず、健常人ボランティアから採取した末梢血から単核細胞を分離し、HPBEC medium(EGMTM-2MV BulletKitTM Mediumに20%ウシ胎児血清を添加したもの)で培養してHPBECを得た。次に、HPBECに対し、レトロウイルス感染によりF3/H1A/H6の組み合わせ(3F)又はF3/H1A/H6+L-MYCの組み合わせ(4F)を導入した。ウイルス感染後、HPBEC mediumとHepato-medium (plus)との1:1混合培地で2日間培養した。続いてHepato-medium (plus)にて43日間そのまま培養し、その後は細胞の継代を行いながら、随時解析を行った。
パネルBは、ウイルス感染を行っていないHPBEC、及び3F又は4Fを導入したHPBEC(ウイルス感染後45日目)の位相差像(Phase)、並びにALB免疫染色像を示す(注:それぞれの写真は同一視野ではない)。点線で囲われている細胞群が誘導したhiHepPC(3F又は4Fで誘導したhiHepPCを、それぞれ3F-hiHepPC、4F-hiHepPCと表記する)である。右のグラフは、ウイルス感染を行っていないHPBEC、及び3F又は4Fを導入したHPBEC(ウイルス感染後45日目と継代(P)3回目)で観察されるALB陽性細胞の割合を示す。健常人2名の末梢血を使って独立した実験を行い、それぞれの結果をグラフ上の青バーと赤バーで示した。スケールバー:100μm。
細胞のクローン解析手法及び結果を図9に示す。
パネルAにおいて、点線で囲われたHPBEC由来4F-hiHepPCのコロニーをピックアップし、細胞を分散させた上で96ウェル培養プレートの各ウェルに1つずつ細胞を播種し、1細胞培養を行った。その後、1細胞(4F-hiHepPCクローン)から増殖した細胞について解析を行った。スケールバー:100μm。
図10は、hiHepPC誘導因子の1つであるFOXA3が、FOXA1やFOXA2に置き換えることができることを示す。
パネルAでは、FOXA1、HNF1A及びHNF6の組み合わせでHUVECから誘導したhiHepPC (FOXA1)、並びにFOXA2、HNF1A及びHNF6の組み合わせでHUVECから誘導したhiHepPC (FOXA2)が、どちらもFOXA3、HNF1A及びHNF6の組み合わせで誘導したhiHepPCと同様に上皮細胞形態を有し、血管内皮細胞マーカーであるCD31は発現せず、一部の細胞はAFP陽性であることが示される。一方で、hiHepPC (FOXA1)とhiHepPC (FOXA2)から分化した肝細胞様細胞は、ALBだけでなく、肝細胞マーカーであるAAT、ASGPR1及びCYP3A4を発現している。細胞のDNAはDAPI(青色)で染色した。スケールバー:50μm。
ヒト末梢血から単核細胞を分離後、T細胞培地(HPBEC mediumとFibrolife serum-free cell culture mediumの1:1混合培地に10 ng/ml rIL-2、0.05 pl/cell Dynabeads HumanT-Activator CD3/CD28を添加したもの)で培養し、T細胞の増殖を促進させた。
パネルAの写真は、hiHepPC誘導前のHPBTC位相差像(Phase)を示す。スケールバー:50μm。
パネルBは、HPBTCにF3/H1A/H6の組み合わせ(3F)、又はF3/H1A/H6+L-MYCの組み合わせ(4F)を導入して作製した3F-hiHepPC及び4F-hiHepPCの位相差像(Phase)、並びにALB及びE-CAD共免疫染色像である。細胞のDNAはDAPI(青色)で染色した。スケールバー:50μm。
Claims (11)
- 非肝幹細胞又は非肝前駆細胞に、以下の組合せを導入することを特徴とする、非肝幹細胞又は非肝前駆細胞から肝幹細胞又は肝前駆細胞への誘導方法:
(a)HNF1A、HNF6及びFOXAの組合せ、又は
(b)HNF1A遺伝子、HNF6遺伝子及びFOXA遺伝子の組合せ、
(但し、(a)は、HNF4Aを含む組合せを除き、(b)は、HNF4A遺伝子を含む組合せを除く。)
であって、非肝幹細胞又は非肝前駆細胞が、血管内皮細胞又は血液由来細胞であり、血管内皮細胞が臍帯静脈、末梢血又は臍帯血由来のものであり、血液由来細胞が末梢血T細胞又は臍帯血T細胞である、方法(但し、ヒトの体内で行う方法を除く)。 - 請求項1に記載の方法によって肝幹細胞又は肝前駆細胞を誘導する工程を含む、肝幹細胞又は肝前駆細胞の製造方法。
- FOXAがFOXA3である、請求項1~2のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、MYC又はMYC遺伝子を導入する、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- MYCがL-MYCである、請求項4に記載の方法。
- 請求項2~5のいずれか1項に記載の方法により製造された、ヒト肝幹細胞又は肝前駆細胞。
- (a)請求項1に記載の方法によって肝幹細胞又は肝前駆細胞を誘導する工程、及び
(b)誘導した肝幹細胞又は肝前駆細胞を肝細胞又は胆管上皮細胞に分化させる工程
を含む、肝細胞又は胆管上皮細胞の製造方法(但し、ヒトの体内で行う方法を除く)。 - 非肝幹細胞又は非肝前駆細胞に、以下の遺伝子の組合せを導入することを特徴とする、非肝幹細胞又は非肝前駆細胞から肝幹細胞又は肝前駆細胞への誘導方法に用いるための、ベクターを含む組成物又はベクターの組合せ:
(a)HNF1A遺伝子、HNF6遺伝子及びFOXA遺伝子の組合せ
(但し、HNF4A遺伝子を含む組合せを除く。)
であって、前記ベクター又はベクターの組合せは、(a)の遺伝子の組合せを同一の又は異なるベクターに含み、
非肝幹細胞又は非肝前駆細胞が、血管内皮細胞又は血液由来細胞であり、血管内皮細胞が臍帯静脈、末梢血又は臍帯血由来のものであり、血液由来細胞が末梢血T細胞又は臍帯血T細胞である、組成物又は組合せ。 - FOXAがFOXA3である、請求項8に記載の組成物又は組合せ。
- 前記(a)の遺伝子の組合せが、さらにMYC遺伝子を含む、請求項8又は9に記載の組成物又は組合せ。
- MYCがL-MYCである、請求項10に記載の組成物又は組合せ。
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