JPWO2014104224A1 - PGC−1β蛋白質の機能調整剤,ミトコンドリア機能の調節剤,抗肥満剤及びそれらスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
Description
例えば,特開2008−74753号公報(特許第5008932号)には,プルムバギン(2−メチル−5−ヒドロキシ−1,4−ナフトキノン)及びケルセチン(2−(3,4−ジヒドロキシフェニル)−3,5,7−トリヒドロキシ−4H−1−ベンゾピラノ−4−オン)がシノビオリン蛋白質の自己ユビキチン化を阻害することが開示されている。シノビオリンの自己ユビキチン化とは,特開2008−74753号公報に開示されるように,シノビオリン同士の相互作用により生じるタンパク質のユビキチン化を意味する。タンパク質のユビキチン化は,タンパク質にシノビオリンが結合することにより生じる。
シノビオリンの発現阻害剤又はシノビオリンの活性阻害剤の例は,特許第5008932号に開示されるプルムバギン(2−メチル−5−ヒドロキシ−1,4−ナフトキノン)及びケルセチン(2-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-3,5,7-トリヒドロキシ-4H-1-ベンゾピラノ-4-オン),その製薬上許容可能な塩又はこれらの水和物である。
R1〜R4は,同一でも異なってもよく,水素原子,水酸基,C1−3アルキル基,C1−3アルコキシ基,及びハロゲン原子のいずれかを表わす。後述する実施例により実証されたとおり,R1〜R4の少なくともひとつは水酸基である。
R5及びR6は,同一でも異なってもよく,水素原子,C1−3アルキル基,及びハロゲン原子のいずれかを表わす。
X1及びX2は,同一でも異なってもよく,酸素原子又は硫黄原子を表す。
A1−A2は,C−C(単結合),又はC=C(二重結合)を表す。A1−A2が,C=C(二重結合)の場合,式(I)は,式(II)のように表される。
R1〜R4は,同一でも異なってもよく,水素原子,水酸基,メチル基,メトキシ基,又は塩素原子を示し,ここで,R1〜R4の少なくともひとつは水酸基であり,
R5及びR6は,同一でも異なってもよく,水素原子,又はメチル基を表し,
X1及びX2は,ともに酸素原子を表し,
A1−A2は,C=Cを表す,
シノビオリン蛋白質のユビキチン化活性阻害剤である。
R1及びR4は,同一でも異なってもよく,水素原子,水酸基,メチル基,メトキシ基,又は塩素原子を表し,ここで,R1〜R4の少なくともひとつは水酸基であり,
R2及びR3は,水素原子を表し,
R5及びR6は,ともに水素原子を表し,
X1及びX2は,ともに酸素原子を表し,
A1−A2は,C=Cを表す,
シノビオリン蛋白質のユビキチン化活性阻害剤である。
一般式(I)で示されるナフタレン誘導体が,
5,8-ジヒドロキシ-4a,8a-ジヒドロ-[1,4]ナフトキノン,
5-ヒドロキシ-4a,8a-ジヒドロ-[1,4]ナフトキノン,
5-ヒドロキシ-2,3,4a,8a-テトラヒドロ-[1,4]ナフトキノン,
5-ヒドロキシ-7-メトキシ-4a,8a-ジヒドロ-[1,4]ナフトキノン,
5-ヒドロキシ-8-メトキシ-4a,8a-ジヒドロ-[1,4]ナフトキノン,及び
5-クロロ-8-ヒドロキシ-4a,8a-ジヒドロ-[1,4]ナフトキノンのいずれか又は2つ以上である,
シノビオリン蛋白質のユビキチン化活性阻害剤である。
(a) シノビオリンをコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく,任意の領域を全てターゲット候補とすることが可能である。例えば,ヒトの場合では,GenBank アクセッション番号 AB024690(配列番号:1)の任意の領域を候補にすることができる。
(b) 選択した領域から,AAで始まる配列を選択し,その配列の長さは19〜25塩基,好ましくは19〜21塩基である。その配列のGC含量は,例えば40〜60%となるものを選択するとよい。
(a)シノビオリン遺伝子を発現する細胞に,被験化合物を接触させる工程
(b)前記細胞におけるシノビオリン遺伝子の発現量を測定する工程
(c)被験化合物の非存在下において測定した場合と比較して,発現量を低下させる化合物を選択する工程
配列番号3:5’−GGUGUUCUUUGGGCAACUG−3’
配列番号4:5’−GGUUCUGCUGUACAUGGCC−3’
配列番号5:5’−CGUUCCUGGUACGCCGUCA−3’
配列番号6:5’−GUUUTGGUGACUGGUGCUA−3’
1993, 319-347.)。
RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが,ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある(小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.)。
FEBS Lett, 1988, 239, 285.,小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.,Koizumi, M. et al., Nucl
Acids Res, 1989, 17, 7059.)。
323, 349.)。ヘアピン型リボザイムからも,標的特異的なRNA切断リボザイムを作出できることが示されている(Kikuchi, Y.& Sasaki, N., Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751.,菊池洋, 化学と生物, 1992, 30, 112.)。このように,リボザイムを用いて本発明におけるシノビオリン遺伝子の転写産物を特異的に切断することで,該遺伝子の発現を阻害することができる。
完全長のmPPARα,mPPARγ,mPGC-1α及びmPGC-1β遺伝子に対応するコード配列を,マウス3T3-L1細胞由来のcDNAからPCRで増幅することによって得た。PGC-1βの欠損変異体シリーズの断片を,PCRで増幅することによって得た。全長のPGC-1βとPGC-1βの各欠損変異体を,pcDNA3 HAベクター(invitrogen社製を改良)に挿入し,GSTプルダウンアッセイやトランスフェクトアッセイに用いた。なお,作製されたすべてのプラスミドの塩基配列は,配列解析によって確認した。PPRE ×3-TK-lucは,addgene Inc.から購入した。シノビオリンプラスミドのシリーズは,既報論文(Amano, T. et al. (2003).
Synoviolin/Hrd1, an E3 ubiquitin ligase, as a novel pathogenic factor for
arthropathy. Genes Dev 17, 2436-2449.及びYamasaki, S. et al. (2007). Cytoplasmic destruction of p53 by
the endoplasmic reticulum-resident ubiquitin ligase 'Synoviolin'. EMBO J 26,
113-122.)のものを用いた。
抗体として,抗FLAG抗体(M2)及び抗tublin抗体はいずれもSigma
Chemical Co製,抗HA-tag抗体(12CA5及び3F10)はRoche製,抗PGC-1β抗体はSant cruze bio製のものを使用した。抗シノビオリンウサギポリクローナル抗体は,既報論文(Yamasaki, S. et al. 2007)に記載されたものを使用した。
シノビオリンコンディショナルノックアウトマウス(syno cKO)を以下の方法で作製した。
Efficient recombination in diverse tissues by a tamoxifen-inducible form of
Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse.
Dev Biol 244, 305-318.参照)をホモ接合型で有する)を得た。
前記マウスは,シノビオリンノックアウトをタモキシフェン(Tam)によって誘導することができる。
なお,タモキシフェン投与によってシノビオリンがノックアウトされたことは,ゲノム上のシノビオリンをPCRする方法,シノビオリンmRNAをリアルタイムPCRする方法,シノビオリン蛋白質をウエスタンブロッティングする方法などで確認した。
シノビオリンが末梢性のエネルギー消費を変化させる可能性を検討するため,シノビオリンノックアウトマウス由来の白色脂肪細胞においてマイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現解析を行った。
なお,リアルタイムPCRの反応条件は,以下の通りとした。
Stage1(ポリメラーゼ活性化): 95℃ 10min
Stage2(熱変性): 95℃ 1sec
(アニーリング/伸長反応) 60℃ 20sec
Stage3:Stage2を40cycle
RNAを用いて標準化し,syno WTの平均値(n=3)を1として比で表わした。結果を図1に示す。
図1から,β酸化及びミトコンドリア生合成に関与する遺伝子群の転写が増加していることが分かった。したがって,白色脂肪細胞内のミトコンドリアがシノビオリンノックアウトマウスのターゲットとなっていることが示唆された。
実施例1で用いたシノビオリンノックアウトマウス(syno cKO)由来の白色脂肪細胞において電子顕微鏡を用いて常法によりミトコンドリアを観察した。対照としてシノビオリン野生型マウス(syno WT)由来の白色脂肪細胞も同様にして観察した。結果を図2左に示す。
また、脂肪細胞特異的にシノビオリンをノックアウトしたマウス(syno Adipose
KO)由来の白色脂肪細胞についても同様に観察した。結果を図2右に示す。なお、脂肪特異的シノビオリンノックアウトマウスの作製は,まずはSyvn1flox/floxマウスと脂肪酸結合蛋白質4(aP2)-Creマウス(Jackson Immunoresearch Laboratories)とを交配させてaP2-Cre-ER;Syvn1flox/+マウスなどを含む複合ヘテロ接合体を得、次に二次交配としてaP2-Cre;Syvn1flox/+マウスをSyvn1flox/floxマウスと交配させ,aP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスを得た。なお,Syvn1flox/floxの遺伝子型を持つ,Creトランスジーンを欠いたマウスを対照マウスとする。
図2A及びBから,シノビオリン野生型マウス由来の白色脂肪細胞に比べ,シノビオリンノックアウトマウス由来の白色脂肪細胞においてミトコンドリアの数が顕著に増加しており,更にミトコンドリアのサイズが顕著に増大していた。
これまで,β酸化とミトコンドリアの複製の両者を制御する活性を有する因子としては脂肪細胞の分化と活性に深くかかわる転写因子ファミリーPPAR(PPARα,PPARγ)とそれに対する転写コアクチベーターPGCファミリー(PGC−1α,PGC−1β,PRC)が知られていた。そこで,前記各因子とシノビオリン蛋白質との結合を確認した。
syno ΔTMは,HA PGC−1βと結合したが,HA PGC−1α,HA PPARγ及びHA PPARαとは結合しなかった。したがって,PGC−1βがシノビオリン蛋白質と選択的に結合することが示された。
シノビオリンと結合するPGC−1βの結合部位を特定するため,PGC−1βの断片化変異のシリーズ(図4参照)を用いてGSTプルダウンアッセイを行った。
具体的には,既報の論文(Aratani, S. st al., (2001). Dual roles of RNA helicase A in
CREB-dependent transcription. Mol Cell Biol 21, 4460-4469.)に準じた方法でPGC−1βの断片化をPCR法にて行った。各断片化PGC−1β変異体の概念図を図4に示す。in vitroで転写/翻訳されたHAタグ付きのPGC−1β断片化変異体とGST又はGST−synoviolin ΔTMとを用いてIn vitro結合アッセイを行った。これらの蛋白質を溶出し,SDS-PAGEで分離し,抗HA抗体でウエスタンブロッティングを行った。結果を図4に示す。
PGC−1βと結合するシノビオリンの領域を特定するため,シノビオリンの断片化変異のシリーズ(図5及び既報論文Yamasaki et al., 2007参照)を用いてGSTプルダウンアッセイを行った。In vitroで転写/翻訳させて作製したHA PGC-1βとGST又はGSTに融合させたシノビオリン断片化変異体とを実施例4と同様にインキュベートし,抗HA抗体でウェスタンブロットを行った。結果を図5に示す。
シノビオリンとPGC−1βとがin vivoで実際に複合体を形成しているか否かを検証した。具体的には,まず,HAタグを付けたPGC−1β(HA
PGC−1β)を発現するプラスミドとFLAGタグを付けたシノビオリン(SYVN1/FLAG)又はシノビオリン変異体(SYVN1ΔSyU/FLAG)を発現するプラスミドとをHEK−293T細胞にトランスフェクトした。前記発現プラスミドをトランスフェクトしたHEK−293T細胞からの全細胞抽出液を準備し,抗FLAG抗体で免疫沈降した。抗FLAG抗体と結合した蛋白質を溶出し,SDS−PAGEで分離し,抗HA抗体及び抗FLAG抗体でウェスタンブロッティングを行った。結果を図6Aに示す。
図6Aから,HA PGC−1βは,SYVN1/FLAGと共免疫沈降したが,SYVN1ΔSyU/FLAGとは共免疫沈降しなかった。このことは,in vivoでシノビオリン(SYVN1)がSyU領域を介してPGC−1βと結合していることを示している。
図6Bから,内在性のPGC−1βは抗シノビオリン抗体と沈殿し,検出された。一方,非免疫マウスIgGでは検出されなかった。このことから,シノビオリンがPGC−1βとin vivoで物理的に結合することが示された。
シノビオリンはER常在性の蛋白質であること,PGC−1βは核内に移行することが知られているため,シノビオリン及びPGC−1βの細胞内局在を調べた。HEK-293T細胞にHA PGC-1β及び/又はsyno/FLAG,synoviolin 3S/FLAG若しくはSynoviolin ΔSyU/FLAG発現プラスミドをトランスフェクトし,24時間後に抗HA抗体及び抗FLAG抗体を用いて免疫蛍光染色によりシノビオリン及びPGC−1βの細胞内局在を調べた。結果を図7に示す。
et al., 2009)されているように,HA PGC−1βは主に核に局在することが分かった。一方,HA
PGC−1βがsyno/FLAGと共発現された場合には,HA PGC-1βは核内ではなく,主に核周辺領域にsyno/FLAGと共局在することが分かった。更に,HA
PGC−1βとSynoviolin ΔSyU/FLAGとを共発現させた場合には,HA PGC−1βは核に局在した。したがって,これらの結果は,シノビオリンがPGC−1βを核周辺領域で捕捉していること,及びin vivoにおけるこの隔離には,SyUドメインが必要であることが示唆された。
シノビオリンは,E3ユビキチン化酵素であることが知られている(Amano, T., et al. (2003). Synoviolin/Hrd1, an E3 ubiquitin ligase, as a novel pathogenic factor for arthropathy. Genes Dev 17, 2436-2449.参照)ため,PGC−1βがE3ユビキチン化酵素としてのシノビオリンの基質になっていないかを検証した。in vitroで転写及び翻訳させたPGC−1β(FLAG‐PGC),ユビキチン活性化酵素E1(E1−His),ユビキチン結合酵素E2(UBE2G2−His),及びユビキチン(PK−His−HA−Ub)とGST結合シノビオリン変異体(Syno(236−338))とを用いてin vitroユビキチン化アッセイを行った。結果を図8Aに示す。
図8Aから,ATP,PK−His−HA−Ub,E1−His,UBE2G2−His及びSyno(236−338)のすべてが存在する条件下ではポリユビキチン化されたPGC−1βが検出された。このことから、in
vitroにおいてPGC−1βがシノビオリンの基質になっていることが確認された。
図8Bから,シノビオリンWTを発現させた細胞ではHA PGC−1βがユビキチン化されたが,シノビオリン3Sを発現させた細胞ではユビキチン化されなかった。
これらの結果から,PGC−1βはin vitro及びin vivoにおけるシノビオリンの推定上の基質であることが示唆された。
新生後にシノビオリンをノックアウトしたマウス(syno cKO)において,精巣上体及び腸間膜におけるシノビオリン及びPGC−1βの蛋白質レベルをウェスタンブロッティングにより調べた。
図8Cから,シノビオリンノックアウトマウス由来の白色脂肪細胞におけるPGC−1βの蛋白質レベルは,野生型マウス由来のものに比べ,劇的に上昇していた。なお,PGC−1βの転写レベルはシノビオリンノックアウトマウスと野生型マウスとでほとんど差がなかった。
syno CKOマウス由来の皮膚線維芽細胞をDMEM培地で培養し,タモキシフェン(Tam)又は溶媒(DMSO)で48時間処理した。細胞収抽出液又は総RNAを収集し,ウェスタンブロッティング及びリアルタイムPCRをそれぞれ行った。結果を図8Dに示す。
シノビオリンコンディショナルノックアウトマウス由来の皮膚線維芽細胞においてTam処理をした場合PGC−1βの蛋白質レベルは顕著(1.4倍)に上がった。なお,PGC−1βのmRNAレベルは予想通り変化が見られなかった。
これらの結果は,PGC−1βの蛋白質レベルは,転写後のプロセスにおいてシノビオリンによって負に制御されていることを示唆している。また,シノビオリンが細胞内でPGC−1βに対する主なE3であることを強く示唆している。
これまでの遺伝子欠失の効果に加えて,シノビオリンに対するsiRNA(Syno
siRNA)の効果を次の試験により確認した。
まず,HEK 293細胞においてsiRNAによるシノビオリンノックダウンを行った。シノビオリンに対するsiRNAは,既報の論文(Yamasaki, S., et al.
(2007). Cytoplasmic destruction of p53 by the endoplasmic reticulum-resident
ubiquitin ligase 'Synoviolin'. EMBO J 26, 113-122.参照)に従って行った。siRNAの細胞へのトランスフェクトは,Lipofectamine 2000
(Invitrogen社製)を用いてプロトコルに従って行った。結果を図9Aに示す。
paradigms in mammalian mitochondrial biogenesis and function. Physiol Rev 88,
611-638.参照)。そこで,PGC-1βがsyno
cKOマウスで観察された事象の原因因子であると考えられた。この考えを検証するため,syno cKOにおいて阻害されたPGC-1βを介した2つの代表的な細胞事象を解析した。一つはPGC-1βのコアクチベーター活性であり,もう一つはミトコンドリアの生合成である。
siRNAを一時的にトランスフェクトした。また,PPAR結合部位を含むレポータープラスミド(PPRE ×3-TK-luc),CMV-β-gal発現コンストラクト又はsiRNAをHEK-293細胞に一時的にトランスフェクトした。16時間後 DMSO
または Wy-14643 で 6時間処理しルシフェラーゼアッセイを行った(図9B)。
activates PPARgamma through the production of endogenous ligand. Proc Natl Acad
Sci U S A 95, 4333-4337.参照)。
また,シノビオリンを過剰発現させた効果を調べるため,シノビオリン発現ベクターの量を段階的に増やして同時にトランスフェクトする試験も行った(図9C)。
トランスフェクトした16時間後,細胞を溶媒(DMSO)又はWy-14643で6時間処理し,ルシフェラーゼアッセイを行った。
J., et al. (2003). PGC-1beta in the regulation of hepatic glucose and energy
metabolism. J Biol Chem 278, 30843-30848.参照)の通り,PPARαのアゴニストの一つであるWy-14643は,PPRE ×3-TK-lucレポーター活性を誘導した。Wy-14643誘導条件下において,形質移入されたSyno siRNAは,前記レポーター活性を非常に亢進したが,対照のsiRNAは亢進しなかった。Syno siRNAと同時形質移入されたPGC−1βは,前記レポーター活性を更に亢進した。
図9Cから,シノビオリン過剰発現によってPGC-1βを介したコアクチベーター機能が阻害されることが分かった。
これらの結果から,シノビオリンのノックダウンがPGC-1βに依存した経路を通してPPARαを介した転写を亢進することが示唆された。
図9Dから,syno cKO由来の白色脂肪細胞の場合(図2)と同様に,対照のsiRNA処理細胞に比べてSyno siRNA処理細胞においてミトコンドリアの数及び体積密度が増加した。
シノビオリンのE3ユビキチンリガーゼ活性阻害剤によるPGC−1β機能への影響を調べるため,まずはシノビオリンとPGC−1βとの結合阻害効果を調べた。具体的には,
MBP-PGC―1β-His蛋白質とGST-Syno ΔTM蛋白質とを用いた常法の結合アッセイにおいて,LS−102(PARMACOPIEA社)を添加して12時間結合させ,ゲル濃度12%のSDS−PAGEを行い,次いでウェスタンブロットを行った。一次抗体としては,2500倍希釈した抗GST抗体,二次抗体としては,10000倍希釈した抗ラットHRPを用いた。結果を図10に示す。
なお,LS−102は下記構造式で示される化合物であり,シノビオリンのE3ユビキチンリガーゼ活性に対する選択的阻害化学物質である。
シノビオリンとPGC−1βとの結合を阻害する物質を得るため,E3ユビキチンリガーゼ関連のスクリーニング用ライブラリの中から下記表2に示す物質について,シノビオリンとPGC−1βとの結合への影響を調べるため,実施例3〜6と同様のin
vitroでの結合アッセイを行った。結果を図11−1,図11−2,図11−3及び図11−4に示す。なお,本実施例における蛋白質としては,2μgのPGC−1βB(図4参照),及び2μgのGST-Syno ΔTM(図6参照)を用いた。
実施例9において,Syno siRNAをトランスフェクトする代わりに5μMのLS−102,0.1μM及び0.5μMの348,0.1μM及び5μMの349,並びに5μMの351及び355を用いた以外は実施例9と同様にして,ルシフェラーゼアッセイを行った。対照としては,各化合物の溶媒であるDMSOのみを同体積添加した。結果を図12に示す。
図12から,前記化合物で処理した場合において351で処理した場合のみルシフェラーゼ活性が低下した。これらの結果から,シノビオリンとPGC−1βとの結合を阻害することで,PGC−1βの機能を亢進する物質が得られたことが示された。
また,確認としてPGC−1β蛋白質レベルを調べたところ,LS−102処理細胞においてPGC−1βの蛋白質レベルは約2倍に上がった。一方,LS−102処理によってPGC-1βmRNAの発現は変化しなかった。
実施例9において,Syno
siRNAをトランスフェクトする代わりに1μMの348,349,351及び355を細胞に添加し72時間後に観察した以外は,実施例9と同様にしてミトコンドリアを観察した。写真を図13に示す。 図13から,348,349,355においてミトコンドリアの増殖(数の増加)またはミトコンドリアのサイズの増大が観察された。以上から,シノビオリンを抑制することは,転写コアクチベーターPGC−1βの活性をあげ,ミトコンドリアを活性化する,すなわちアゴニストという全く新しい創薬の分子標的となることが示唆された。
マウスの脂肪前駆細胞である3T3−L1細胞を,10%FBS(ウシ胎児血清)含有DMEM(ダルベッコ変法イーグル培地;High Glucose)でconfluentに達した後3日間培養した。500μM IBMX(isobutyl-methylxanthine),1μM Dexamethasone,5 μg/mL Insulinを添加し分化を誘導した。同時に10μM LS−102(シノビオリンのユビキチン化活性阻害剤)もしくはDMSOを添加した。3日間培養後,4μg/mL Insulinを含む培地に置換し10μM LS−102もしくはDMSOを添加した。3日間培養後,10%FBS含有DMEM(High Glucose)に置換し3日間培養した。siRNAに関しては,分化誘導2日前に200pmolのsiRNA Syno770(センス鎖が下記配列番号2の配列からなる)をLipofectamine2000により導入した。
配列番号2:5’−GCUGUGACAGAUGCCAUCA−3’
CAG-Cre-ER;Syvn1flox/flox マウスにおいてミトコンドリアの機能が活性化されているか否かを調べるため,脂肪細胞1細胞の酸素消費量を測定した。
酸素消費量の測定方法は,以下のとおりであった。CAG-Cre-ER;Syvn1flox/flox
マウス及び対照マウスより皮下脂肪を採取し,0.1% (w/v)コラーゲナーゼを用いて37°Cで1時間処理することでシングル細胞化した。得られたシングル細胞の懸濁液について,MitoXpress(登録商標)-Xtra−HS (Luxcel Biosciences Ltd. Ireland)を用い,キットに付属の説明書に従い,酸素消費量を測定した。その結果を図14に示す。図14は,シノビオリンノックアウトマウスにおける脂肪細胞の酸素消費量を示すグラフである。初代マウス脂肪細胞を単離し,脂肪細胞1細胞の酸素消費量を測定した。統計処理は,独立t-検定で行った。
CAG-Cre-ER;Syvn1flox/flox マウスにおいてミトコンドリアの機能が活性化されているか否かを調べるため,CAG-Cre-ER;Syvn1flox/floxマウスの基礎代謝量を測定した(図15)。
基礎代謝量の測定方法は以下のとおりであった。Tam投与後7日目のマウスを用い,4時間絶食させ安静にさせた場合の酸素消費量(VO2)
及び二酸化炭素産生量 (VCO2)を,Oxymax
Equal Flow System (Columbus Instruments, 950 N. Hague Ave; Columbus, OH USA)を用いて測定した。更に,運動活性(運動の数)も一緒にDAS system
(Neuro Science, Inc., Japan)を用いて測定した。図15は,シノビオリンノックアウトマウスにおける基礎代謝量を示すグラフである。統計処理は,独立t-検定で行った。
この結果は, SYVN1が in vivoでミトコンドリア活性を亢進することを示唆している。
野生型WTマウスとシノビオリンKOマウスの各組織におけるアディポネクチンとシノビオリンのウエスタンブロッティングを行った。図16は,野生型WTとシノビオリンKOの各組織におけるアディポネクチンとシノビオリンのウエスタンブロッティングを示す図面に替わる写真である。図中アルファ−チューブリンは,内部標準である。図16から,シノビオリンをノックアウトすることによりアディポネクチンの量が増加し,脂肪酸燃焼が促進されていると考えられる。
SYVN1とPGC−1βとの相互作用がSYVN1を介したPGC−1βの分解に重要であるか否かを確かめるため,PGC−1βの半減期を測定した。
試験は,従来公知の方法(Yamasaki,
S., et al. EMBO J. 26, 113-122 (2007) 及びBernasconi,
R., et al. J. Cell Biol. 188, 223-235 (2010) )を次のように修正して行った。シノビオリンノックアウトマウス由来のマウス胚性線維芽細胞(MEF Syno-/-) に1μg のpcDNA3 Synoviolin/FLAG,空のベクター,又は1.5 μgのpcDNA3 Synoviolin デΔSyU/FLAGと,0.75 μg
pcDNA3 HAPGC−1βとをトランスフェクションした。トランスフェクションから48時間後 ,細胞を40 μM Cycloheximideで
0.5,1,2,又は4時間処理し,細胞をバッファ(10 mM Tris-HCl pH8.0, 150 mM
NaCl, 1mM EDTA, 1 % NP-40, 1 mM DTT, protease inhibitors)で溶解し,抗PGC−1β,抗-SYVN1,又は抗 アルファ−チューブリン抗体で免疫ブロット解析を行った。各試験は少なくとも3回行った。結果を図17に示す。図17から,野生型のシノビオリン(SYVN1 WT)は,PGC−1βの半減期を非常に短縮したが,SYVN1
ΔSyUはPGC−1βの分解をあまり促進していなかった。このことから,PGC−1βの蛋白レベルは転写後のプロセスにおいてシノビオリンとの結合を介した負の制御を受けることが示された。また,シノビオリンがPGC−1βの主要なE3リガーゼであることが強く示唆された。
7〜8週齢のC57BL/6Jマウスに,1日当たり50 mg/kg体重のLS-102又は対照としての溶媒(DMSO)を腹腔内に投与し,57日目のマウスの脂肪組織切片を電子顕微鏡で観察した。その結果を図18に示す。図18は,LS−102による脂肪組織のミトコンドリアの形態変化を示す電子顕微鏡写真である。電子顕微鏡の倍率は2,500倍及び10,000倍であり,白抜きのバーはスケールバー(2,500倍の方は2μm,10,000倍の方は500nm)を示す。
図18から,LS-102処理により,脂肪組織細胞におけるミトコンドリアの数と体積密度の増加が起きていることが分かった。このことは,LS-102によりシノビオリンのE3リガーゼ活性が阻害されるとPGC−1βの超活性化が引き起こされミトコンドリアの生合成が促進されることを示唆している。
シノビオリンのKOマウスより樹立したMEF(mouse embryoinic
fibriblasts)にPGC−1βの発現ベクターとともに空ベクター(コントロール:CONT),シノビオリン野生型(SYVN1 WT),シノビオリンユニークドメイン(βとの結合領域を欠失した変異型シノビオリン(SYVN1 ΔSyU)をそれぞれ定法に従い,トランスフェクションした。48時間経過した後に,代表的なタンパク質翻訳阻害剤であるサイクロヘキサミド(40μM)を図に示す時間(0.5時間,1時間,2時間及び4時間)処理し,各細胞抽出液についてウェスタンブロッテングを行った。その結果を図19に示す。図19は,PGC−1βの半減期を示すウエスタンブロッテングである。図19に示されるように,PGC−1βの細胞内での半減期がそれぞれ4.8時間,1.6時間,3.6時間となることが証明された。
結合アッセイは,以下のアッセイ系を用いた。2μgMBP−PGC−1β His(1−367aa),2μgGSTシノビオリン変異体をバッファ(20 mM Tris-HCl pH8.0,100 mM NaCl、1 mM EDTA、0.1 % NP-40、5% グルコールl、プロテアーゼ阻害剤) 内で 12 時間結合させ,抗PGC−1β抗体でPGC−1βを検出した。
被検物質348,349による,シノビオリン(SYVN1)によるPGC−1βのユビキチン化阻害活性の濃度依存性を検討するため,実施例11と同様のインビトロでの結合アッセイを行った。図21は,被検物質348,349によるPGC−1βのユビキチン化阻害活性の濃度依存性を示すウェスタンブロットである。図21から,いずれの被検物質も1μMに比べて10μMにおいてPGC−1βのユビキチン化阻害活性が高いことがわかる。すなわち,被検物質のユビキチン化抑制活性は,濃度依存性があることが示された。
実施例5においてシノビオリン(SYVN1)は236〜270番目の領域(SyUドメイン)においてPGC−1βと結合する可能性が高いことが示された。本実施例では,SyUドメインのうちPGC−1βと結合する可能性が高い部位を見出すため,以下の実験を行った。
図22は,複数の種におけるSyUドメインのアミノ酸配列である。シノビオリン(SYVN1)の236−240,241−245,246−250,251−255,256−260,261−265,266−270の部位に相当する5アミノ酸ずつをアラニンに置換したSYVN1 SyU変異体とPGC−1βの結合をおこなった。その結果を図23に示す。図23は,SYVN1 SyU変異体のウェスタンブロットである。図23から,256−260,266−270aaの部位が,PGC−1βとの結合に重要であることが示された。
266−270aaの部位のアミノ酸配列は,RRAIRである。アミノ酸配列がAAAAAであるもの(対照),266番目のRをAに置換したもの(R266A),267番目のRをAに置換したもの(R267A),270番目のRをAに置換したもの(R270A),266番目及び267のRをAに置換したもの(R266,267A),266番目及び270番目のRをAに置換したもの(R266,270A),267番目及び270のRをAに置換したもの(R267,270A),3つのRを全てAに置換したもの(3A)からなるペプチドを用意し,実施例5と同様にしてウェスタンブロットを行った。その結果を図24に示す。図24は,SYVN1266−270aaの変異体のウェスタンブロットである。図24からSYVN1266−270aaを介したPGC−1βとの結合には,少なくとも2つのアルギニン残基が望ましいことがわかる。
配列番号3:合成RNA
配列番号4:合成RNA
配列番号5:合成RNA
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Claims (7)
- シノビオリンの発現阻害剤又はシノビオリンの活性阻害剤を有効成分として含有するPGC−1β蛋白質の機能を調整するPGC−1β蛋白質の機能調整剤。
- 請求項1に記載のPGC−1β蛋白質の機能調整剤であって,
PGC−1β蛋白質による脂肪酸β酸化の促進,及びミトコンドリアの発現又は活性促進のいずれか又は両方のために用いられる,
PGC−1β蛋白質の機能調整剤。 - 請求項1に記載のPGC−1β蛋白質の機能調整剤を含む,
ミトコンドリアの活性化剤。 - 請求項3に記載のミトコンドリアの活性化剤であって,
ミトコンドリアの発現数の増加及びミトコンドリアのサイズの増大のいずれか又は両方を惹き起こすために用いられる,
ミトコンドリアの活性化剤。 - 脂肪組織の細胞又は動物個体に被験物質を作用させ,脂肪組織の細胞における
シノビオリンの発現量,
シノビオリンとPGC−1β蛋白質との結合,及び
シノビオリンによるPGC−1β蛋白質のユビキチン化,
の少なくともいずれかを測定又は検出する工程を含む,
PGC−1β蛋白質の機能調整剤をスクリーニングする方法。 - 請求項5に記載のスクリーニング方法を用いた,ミトコンドリアの活性化剤の検出方法。
- 請求項5に記載のスクリーニング方法を用いた,肥満症の治療剤又は予防剤の検出方法。
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