JP5008932B2

JP5008932B2 - タンパク質のユビキチン化抑制剤

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Publication number: JP5008932B2
Application number: JP2006254888A
Authority: JP
Inventors: 利博中島; 忠之山寺; 美奈子中澤; 幸裕加藤
Original assignee: 利博中島
Priority date: 2006-09-20
Filing date: 2006-09-20
Publication date: 2012-08-22
Anticipated expiration: 2026-09-20
Also published as: JP2008074753A

Description

本発明は、プルムバギン及び/又はケルセチンを含む、タンパク質のユビキチン化抑制剤に関する。

プルムバギン（Plumbagin）は、２−メチル−５−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノンと呼ばれ、次式I：

で示される公知の低分子化合物である。プルムバギンはイソマツ科の植物Plumbago zeylamica L.から単離されたキノイド構成成分であり、キノン骨格を特徴とし、抗ガン作用、抗動脈硬化作用、抗細菌効果等を有することが知られている（非特許文献１〜４）。

Plumbaginは小細胞性肺がんにおいて、(i)In vitro 及びIn vivo実験モデルで細胞増殖抑制効果を有すること、(ii)この細胞増殖抑制効果はG2/M期の細胞周期停止及びアポトーシス誘導によるものであること、(iii)G2/M期の細胞周期進行停止はCdc2、Cdc25C及びCyclinB1発現減少によるp53依存性マナーにおけるp21発現の増加によるものであること、(iv)また、Plumbagin誘導性細胞増殖抑制は、JNK活性化により媒介され、それによりp53セリン15のリン酸化とp53とMDM2の相互作用の減少によるp53の安定化によるものであることが知られており、さらに、(v)JNKはBcl-2をリン酸化し、Bcl-2の機能であるアポトーシスを誘導することで、抗ガン作用を示すことが報告された（非特許文献５）。さらに、プルムバギンは、関節リウマチを含む炎症性疾患に対する医薬組成物として使用できることが知られている（特許文献１〜２）。

一方、ケルセチン（Quercetin：2-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-3,5,7-トリヒドロキシ-4H-1-ベンゾピラノ-4-オン）と呼ばれる化合物であり、次式II：

で示される公知の低分子化合物である。ケルセチンは、フラボノイドの一種であり、ケルセチン配糖体（ルチン、クエルシトリン、ヘスペリジン、ナリンギン、タンゲリジンなど）又は遊離の形で柑橘類、タマネギやソバなど多くの植物や食物に豊富に含まれている。ケルセチンは、抗ガン作用を有し、その作用機序としてp53発現上昇による細胞周期停止とp53のSer15のリン酸化の亢進が報告されている（非特許文献６）。

また、食餌性のフラボノイドであるケルセチンは、低酸素状態でHIF-1αと呼ばれるタンパク質の活性化経路のすべての段階で活性化し、通常酸素状態でHIF-1機能を制御していることが知られている（非特許文献７）。細胞内の通常酸素条件下で、HIF-1αサブユニット（HIF-1α）のタンパク質レベルは、ユビキチン化とそれに引き続くプロテオソーム分解により低く保たれているが、低酸素条件下では、HIF-1αの安定化が生じ、ユビキチン化が阻害される。

しかしながら、上記化合物の他の作用については明らかではない。
国際公開WO01/64214号パンフレット特表2003-525243号公報 Hsieh Y.J. et al., J Chromatogr A 1083:141-145, 2005; Mossa J.S. et al., Phytother Res., 18: 934-937, 2004; Srinivas P., et al., Mol Carcinog., 40:201-211, 2004; Ding X., et al., J Pharm Pharmacol., 57: 111-116, 2005 J Pharmacol Exp Ther. 2006 Aug;318(2):484-94. Epub 2006 Apr 21 Chao JI, Kuo PC, Hsu TS. J Biol Chem. 2004 May 7; 279(19): 20267-76. Epub 2004 Feb 26. Wilson W J, Poellinger L. Biochem Biophys Res Commun. 2002 Apr 26;293(1):446-50

本発明は、タンパク質のユビキチン化抑制剤及び線維症治療剤を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決するため、in vitro ユビキチン化反応を用いて、ウェスタンブロット法を利用したスクリーニングを行った。その結果、自己ユビキチン化を抑制する化合物を見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、プルムバギン及びケルセチンからなる群から選ばれる少なくとも１つ、その製薬上許容可能な塩又はこれらの水和物を含む、タンパク質のユビキチン化抑制剤である。

本発明において、タンパク質のユビキチン化は、シノビオリン同士の相互作用により生じ（これをシノビオリンの自己ユビキチン化という）、また、タンパク質のユビキチン化は、該タンパク質にシノビオリンが結合することにより生じるものである。

さらに、本発明は、プルムバギン、その製薬上許容可能な塩又はこれらの水和物を含む、線維症治療剤である。

本発明により、シノビオリンタンパク質又はその他のタンパク質のユビキチン化抑制剤、及び線維症治療剤が提供される。本発明において、プルムバギン及び/又はケルセチンは、シノビオリンの自己ユビキチン化又は他のタンパク質のユビキチン化を抑制し、これにより線維症などの疾患の治療に寄与することができる点で極めて有用である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、シノビオリンタンパク質又はその関連タンパク質の自己ユビキチン化抑制剤、及び線維症治療剤である。
１．ユビキチン化抑制剤
本発明においては、自己ユビキチン化抑制活性を有する低分子化合物を取得する事を目的とし、in vitro ユビキチン化反応を利用して、ウェスタンブロット法によりスクリーニングを行なった。
スクリーニングの結果、シノビオリンの自己ユビキチン化反応を強く阻害する活性を有する化合物が取得された。
この化合物は、プルムバギン及びケルセチンと呼ばれる低分子化合物であり、それぞれ、式I、式IIで示される。本明細書において、プルムバギンは、「低分子化合物302」ともいう。

本発明者らは、上記低分子化合物がコラーゲン代謝に関与する酵素P4HA1のユビキチン化活性酵素へどのような影響を与えるかを検討した。

プルムバギンは、細胞内において非常に低濃度でP4HA1のSynoviolinによるユビキチン化を特異的に抑制する活性を有し、さらに、P4HA1のユビキチン化抑制作用による、コラーゲン産生酵素の制御を示す。また、シノビオリンの自己ユビキチン化を抑制するだけでなく、他のタンパク質のユビキチン化をも抑制する。

一方、ケルセチンは細胞内でP4HA1のSynoviolinによるユビキチン化を特異的に抑制する活性を有し、さらに、P4HA1のユビキチン化抑制作用による、コラーゲン代謝酵素の制御を示す。コラーゲン産生にはプロリン4水酸化酵素が必須である。プロリン4水酸化酵素は2つのαサブユニットとβサブユニットが会合し構成された4量体構造を有する。αサブユニットはP4HA1と記載される。

本発明において、シノビオリン以外の他の細胞内タンパク質のユビキチン化は、シノビオリンが結合することにより引き起こされるが、上記化合物はこのユビキチン化を抑制することも可能である。
プルムバギン及びケルセチンを自己ユビキチン化抑制剤として使用する場合は、使用の態様は限定されるものではない。
例えば、細胞内タンパク質の相互作用を調べるための実験用試薬として、ウエスタンブロッティング、ELISA、免疫沈降等に使用することができる。
実験用試薬の場合の使用態様（使用量、使用時間、実験の対象物など）は、目的に応じて当業者が適宜設定することができる（例えば実施例を参照）。

ここで、プルムバギンは、通常の化学合成により得ることができるが、市販品を使用することもできる（ナミキ商事(Aplollo社)、カタログ番号OR1174）。
ケルセチンは、通常の化学合成により得ることができるが、市販品を使用することもできる（シグマ・アルドリッチ社、カタログ番号Q0125）。

本発明において、「製薬上許容可能な塩」としては、例えばハロゲン化水素酸塩（例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩等）、無機酸塩（例えば硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩等）、有機カルボン酸塩（例えば酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩等）、有機スルホン酸塩（例えばメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等）、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム塩、カルシウム塩等）等を挙げることができる。本発明において使用される化合物又はその製薬上許容可能な塩は、無水物であっても水和物であってもよい。

２．線維症治療剤
本発明者らは、P4HA1がシノビオリンのユビキチンリガーゼ活性によってユビキチン化されることを明らかにした。シノビオリンによりユビキチン化されたP4HA1はプロテアソームで分解される。そのため、シノビオリンのP4HA1ユビキチン化を介するプロリン4水酸化酵素活性の制御を介して、線維症の発症に関与する事が考えられた（WO2005019472）。

シノビオリンのユビキチン化阻害によりP4HA1ユビキチン化が抑制され、これにより、コラーゲン産生が制御される。このコラーゲン制御は、線維症の治療や予防に有用である。したがって、本発明はプルムバギン及びケルセチンから選ばれる少なくとも１つ、これらの薬学的に許容可能な塩、あるいはこれらの水和物を含む線維症治療剤を提供する。
「薬学的に許容可能な塩」の定義は前記と同様である。
プルムバギン、ケルセチンまたはこれらの組み合わせは、線維症などの細胞増殖性疾患を治療するために医薬組成物として使用することができる。

本発明の医薬組成物を線維症の治療剤として使用する場合は、適用部位は特に限定されず、血管、口腔、関節、皮膚、肝臓、すい臓、腎臓、肺、心筋、膀胱、腹膜、神経根、子宮等を対象として適用される。

本発明の治療剤の投与形態は、経口、非経口投与のいずれでも可能である。経口投与の場合は、液剤として、または適当な剤型により投与が可能である。非経口投与の場合は、注射剤型、経肺剤型(例えばネフライザーなどを用いたもの)、経鼻投与剤型、経皮投与剤型(例えば軟膏、クリーム剤)等が挙げられる。注射剤型の場合は、例えば点滴等の静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身又は局部的に投与することができる。

また、上記化合物をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。本発明の医薬組成物を保持させた小胞体を例えば静脈内、動脈内等から全身投与する。線維症組織等に局所投与することもできる。

本発明の医薬組成物は、常法にしたがって製剤化することができ、医薬的に許容される担体や添加物を含むものであってもよい。このような担体及び添加物として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。

上記添加物は、本発明の治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された化合物を例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解して使用することができる。あるいは、使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。

本発明の医薬組成物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なる。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。有効投与量は、一回につき体重1kgあたり１〜１５０mg、好ましくは１５〜８０ｍgである。但し、上記治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例において使用された以下の物質の概要は次の通りである。

MBP-Syno ΔTM-His：N末端側にマルトース結合タンパク質（MBP）、C末端側にHisタグを融合させた膜貫通領域欠損させたシノビオリン
His-UbcH5C：Hisタグを融合したユビキチン結合酵素（UbcH5C）
His-UBE2G2：Hisタグを融合したユビキチン結合酵素E2G2（UBE2G2）
His-PK-HA-ubiquitin：Hisタグ、リン酸化サイト、HAタグを融合させたユビキチン
GST-Syno ΔTM：GST融合、膜貫通領域欠損シノビオリン
GST-AMFR ΔTM-HA：N末端側にGST、C末端側にHAタグを融合させた膜貫通領域欠損E3ユビキチンリガーゼ（AMFR）
FLAG-Ub：FLAGタグを融合させたユビキチン
sp-FLAG-P4HA1：シグナルペプチドとP4HA1の間にFLAGタグを付加したタンパク質
FLAG-P4HA1：シグナルペプチドを有さないFLAG融合P4HA1

シノビオリンの自己ユビキチン化を抑制する活性を有する化合物のスクリーニング
本実施例は、ELISAおよびWesternを用いたin vitro自己ユビキチン化反応検出系を用いたスクリーニングにより、自己ユビキチン化抑制作用を有する事が予測される市販の化合物からシノビオリン自己ユビキチン化阻害活性を有する化合物を見出す事を目的とする。

市販の低分子化合物のライブラリー(No.298~304,各200 μM)をMBP-Syno ΔTM-Hisのin vitro自己ユビキチン化反応液に添加し、37℃で30分間反応を行った。

反応液組成：50 mM Tris-HCl(7.5), 5 mM MgCl₂, 2 mM ATP, 0.6 mM DTT, 0.1% NP-40, 0.75 μg PK-His-HA-Ub, 6.25 ng E1(yeast), 250 ng His-UbcH5C, 200 ng MBP-Syno ΔTM-His, 全量15 μl
反応後、抗HA抗体を用いたウエスタンブロット法によりユビキチン化タンパク質を検出した。

その結果、シノビオリンin vitro自己ユビキチン化反応により、7種類の化合物のうち、化合物(No.302)に強い阻害活性が認められ（図１）、また再現性も得られた。
この結果より、取得された化合物には強いシノビオリン自己ユビキチン化抑制活性を有することが示された。

低分子化合物302の解析
（１）MBP-SynoΔTM自己ユビキチン化抑制活性
本項は、MBP-Syno ΔTM-His を基質とした場合でも、低分子化合物302がシノビオリンの自己ユビキチン化反応阻害活性を有するか否かの検討を行い、そのIC50値を算出したものである。

実施例１により、シノビオリンの自己ユビキチン化を抑制する作用を有することが示された低分子化合物302（各100,200 μM)を用い、MBP-Syno ΔTM-Hisのin vitro自己ユビキチン化反応をいった。反応液組成は以下の通りである。

50 mM Tris-HCl(7.5), 5 mM MgCl₂, 2 mM ATP, 0.6 mM DTT, 0.1% NP-40, 0.75 μg PK-His-HA-Ub, 6.25 ng E1(yeast), 250 ng His-UbcH5C, 100 ng MBP-Syno ΔTM-His, 全量 15 μl
上記反応液を37℃で30分間反応させた後、抗HA抗体を用いたウエスタンブロット法により、ユビキチン化タンパク質を検出した(図２)。また、低分子化合物302の濃度系列6.25, 12.5, 25, 50 μM存在下で、上記と同様にしてMBP-Syno ΔTM-Hisによるin vitro自己ユビキチン化反応を行った。検出後のフィルムの黒化度をImageJにより解析後、グラフ化してIC50を算出した。

その結果、MBP-SynoΔTMのin vitroユビキチン化反応でも低分子化合物302はシノビオリンの自己ユビキチン化阻害活性が確認された(図２)。また、IC50は約20 μMと非常に低値を示し、より強い自己ユビキチン化抑制作用を有する事が確認された（図３）。

（２）化合物のHis-UBE2G2を用いたユビキチン化反応に与える影響
本稿は、GST-Syno ΔTM又はGST-AMFRを基質とした場合において、低分子化合物302がシノビオリンの自己ユビキチン化反応阻害活性を有するか否か、及び、自己ユビキチン化反応の素過程であるE2-ubiquitin複合体形成反応に対する低分子化合物302の影響を検討したものである。

種々の濃度の低分子化合物302(各12.5,25,50,100,200 μM)を用い、GST-Syno ΔTM又はGST-AMFR ΔTM-HAのin vitro自己ユビキチン化反応をいった。反応液組成は以下の通りである。

50 mM Tris-HCl(7.5), 5 mM MgCl₂, 2 mM ATP, 0.6 mM DTT, 0.1% NP-40, 0.75 μg FLAG-Ub, 6.25 ng E1(yeast), 250 ng His-UBE2G2, 25 ng GST-Syno ΔTM又は GST-AMFR ΔTM-HA, 全量 15 μl
反応液を37℃で30分間の反応させた後、ユビキチン化タンパク質を7.5% SDS-PAGEで分離し、抗Flag抗体を用いたウエスタンブロット法により検出した(図4A)。

また低分子化合物302(各25, 50, 100, 200 μM)を用い、His-UBE2G2のin vitroユビキチン化反応を行なった。反応液組成は以下の通りである。

50 mM Tris-HCl(7.5), 5 mM MgCl₂, 2 mM ATP, 0.1% NP-40, 0.75 μg FLAG-Ub, 6.25 ng E1(yeast), 250 ng His-UBE2G2, 全量15 μl
反応液を37℃で30分間反応させた後、ユビキチン化タンパク質を15% SDS-PAGEで分離し、抗Flag抗体を用いたウエスタンブロット法により検出した(図4B)。

その結果、低分子化合物302は濃度依存的にGST-Syno dTMとGST-AMFR dTMの自己ユビキチン化抑制活性を示した（図4A）。また、UBE2G2のin vitroユビキチン化反応において、自己ユビキチン化反応の素過程であるE2-ユビキチン複合体形成反応に対しては影響が無いことが示された（図4B）。

（３）加熱処理ビオチン化（boiled biotinylated） BSA を用いたin vitro ユビキチン化反応
本項では、低分子化合物302の特異性を調べることを目的とし、加熱処理したビオチン化BSA（boiled biotinylated BSA）のユビキチン化反応に与える影響を調べた。

種々の濃度の低分子化合物No.302（25, 50, 100 μM）を、GST- SYNO ΔTMによるboiled Bio-BSAのin vitroユビキチン化反応液に添加し、37℃で60分間インキュベートした。
反応液組成は以下の通りである。

50 mM Tris-HCl (pH7.5), 5 mM MgCl₂, 0.6 mM DTT, 2 mM ATP, 0.1% NP-40, 0.75 μg His-PK-HA-ubiquitin, 6.25 ng His-E1 (ヒト), 250 ng His-UBE2G2, 100 ng boiled Bio-BSA, GST- SYNO ΔTM, 全量15 μL
反応液中のタンパク質を7.5% SDS-PAGEによる分離後、PVDF膜に転写し、ストレプトアビジン/ HRPを用いたウエスタンブロットを行った（図 5）。

その結果、GST- SYNO ΔTMによるboiled Bio-BSAのユビキチン化反応に与える低分子化合物302の影響を調べた結果、低分子化合物302は濃度依存的にユビキチン化を阻害した（図 5）。

（４）種々のRING型E3ユビキチンリガーゼを用いたin vitro自己ユビキチン化反応
本項では、低分子化合物302について、自己ユビキチン化活性阻害の特異性を明らかにするため、RING型E3ユビキチンリガーゼであるSYNO ΔTM, AMFR ΔTM-HA, MDM2又はARIH1の自己ユビキチン化反応に与える影響を調べた。

低分子化合物302の濃度系列（3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 μM）を、in vitro自己ユビキチン化反応液に添加し、37℃で60分間インキュベートした。反応液組成は以下の通りである。

50 mM Tris-HCl (pH7.5), 5 mM MgCl₂, 0.6 mM DTT, 2 mM ATP, 0.1% NP-40, 0.75 μg His-PK-HA-ubiquitin, 6.25 ng His-E1 ヒト), 250 ng E2 (His-UBE2G2, His-UbcH5C, UbcH7), GST-proteins (SYNO ΔTM, AMFR ΔTM -HA, MDM2, ARIH1), 全量15 μL
反応液中のタンパク質を7.5% SDS-PAGEによる分離後、PVDF膜に転写し、抗HA抗体を用いたウエスタンブロットを行った（図6）。

その結果、低分子化合物302はシノビオリンの自己ユビキチン化だけではなく、いずれのE3 ユビキチンリガーゼの自己ユビキチン化反応も阻害した（図 6）。

GST-SYNO ΔTMと、His-UBE2G2又はboiled biotinylated BSAとのプルダウン・アッセイ
本実施例では、低分子化合物302の作用機序の解明を試みることを目的とし、プルダウン・アッセイ（pull-down assay）による低分子化合物とシノビオリンとの相互作用を解析した。

GST又はGST-SYNO ΔTMを用いて、His-UBE2G2（図7）, boiled biotinylated BSA（図8）のpull-down assayをいった。アッセイ用の反応液組成物は以下の通りである。

20 mM Tris-HCl (pH7.5), 0.1% NP-40, 200 mM NaCl, 5 μL GSH-Sepharose resin, 100 ng GST-proteins, 100 ng interacting proteins, 全量100 μL
Interacting proteinsとは、 GST-ΔSynoとHis-UBE2G2との相互作用タンパク質、又はGST-ΔSynoとboiled biotinylated BSAとの相互作用タンパク質をいう。

より具体的には、20 mM Tris-HCl (pH7.5), 0.1% NP-40, 200 mM NaCl, 5 μL GSH-Sepharose resin, 100 ng GST-ΔSynoとHis-UBE2G2,全量100 μLとの反応液、又は20 mM Tris-HCl (pH7.5), 0.1% NP-40, 200 mM NaCl, 5 μL GSH-Sepharose resin, 100 ng GST-ΔSynoとboiled biotinylated BSA,全量100 μLとの反応タンパク質である。

上記反応液を4℃で60分間ローテーターを用いて転倒混和後、回収したGSHレジンを500 μLの洗浄用緩衝液（20 mM Tris-HCl (pH7.5), 0.1% NP-40, 200 mM NaCl）で3回洗浄した。GSHレジンに吸着したタンパク質を12.5%（図7A、7B）又は10%（図8A、8B）SDS-PAGEによる分離後、PVDF膜に転写し、抗His tag抗体（図 7A）又はStreptavidine / HRP（図 8A）を用いたウエスタンブロットを行った。

検出後のPVDF膜をCBB染色した（図 7B、8B）。

その結果、低分子化合物302の濃度を変化させてpull-down assay系に添加したところ、その濃度に依存して沈降するHis-UBE2G2の量が減少した（図 7A）。沈降したGST- SYNO ΔTMの量はほとんど影響が無いことから（図 7B）、低分子化合物302は、GSH-resinとGST- SYNO ΔTMとの相互作用に対して影響するのでは無く、GST-SYNO ΔTMとHis-UBE2G2との相互作用に対して影響することが考えられる。

また、SYNO ΔTMとboiled biotinylated BSAとのプルダウン・アッセイにおける低分子化合物302の影響を調べるために、上記と同様の実験を行った。その結果、沈降するboiled biotinylated BSAの量は、低分子化合物302の濃度に依存してわずかに減少した（図8A、8B）。

これらの結果より、化合物No.302がSynoviolin以外のRING型E3 ubiquitin ligase（GST-AMFR ΔTM -HA, GST-MDM2, GST-ARIH）の自己ubiquitin化反応も阻害すること、RINGドメインが重要な役割を担っているSynoviolinとUBE2G2あるいはboiled biotinylated BSAとの相互作用を阻害することから、化合物No.302の作用点はRINGドメインであることが示された。

GST活性の測定
本実施例では、低分子化合物302がユビキチンリガーゼ特異的か否かを調べることを目的として、GST活性に与える影響を調べた。

GST活性の測定は、GST detection module（GE healthcare）を用いて行った。低分子化合物302の濃度系列（3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 μM）をGST活性測定用溶液に添加し、GST存在下又は非存在下で反応させた。反応開始から340 nmにおける吸光度を測定し、約7分間の吸光度変化を測定した。GST存在下での測定値から非存在下での測定値を差し引いた値と、モル吸光係数をもとに単位時間当たりのGSH化1-chloro-2, 4-dinitrobenzene（CDNB）の生成量を算出した（図９）。
その結果、302の濃度に依存してGST活性が阻害された（図9）。

低分子化合物302の滑膜細胞に対する細胞増殖抑制活性の測定
本実施例では、低分子化合物302のリウマチ滑膜細胞（RASC）に対する細胞増殖抑制活性を測定した。

RASCを1500 cells / wellずつ 96 well プレートに播種し、10% ウシ胎児血清含DMEM（KOHJIN BIO）により24時間培養を行った。低分子化合物302を終濃度が0.195, 0.391, 0.781, 1.563, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 μMになるように添加し、24時間、48時間、72時間後の細胞生存率をCell Counting Kit-8 (Dojindo)により測定した。低分子化合物302を添加していないRASCを生存率100%とし、それに対するそれぞれの生存率を求めた。

その結果、図１０に示すように、24時間（A)、48時間（B)、72時間（C)後のIC50はそれぞれ4.6 μM, 5.0 μM, 4.4 μMであった。従って、低分子化合物302は低濃度で滑膜細胞増殖を抑制する事が示された。

低分子化合物302 P4HA1のin vivoユビキチン化作用
COS7細胞に、sp-FLAG-P4HA1、HA-Ubおよび野生型シノビオリン又は3S変異体（シノビオリンのRINGドメインの３０７、３０９、３２９のヒスチジンをセリンに変異させた変異体）を発現するプラスミドをFuGene6でトランスフェクションした。４８時間後に、野生型シノビオリンをトランスフェクションした細胞に1、10、100 μMの低分子化合物302を処理した。コントロールとして最終濃度0.1%となるようにDMSOを加えた。12時間後に細胞を回収し、高塩濃度バッファー（high salt buffer） (7.5 mM Tris-HCl (pH7.5), 420 mM NaCl, 0.5 % NP-40, 1 mM PMSF, 0.5 mM DTT)を用いて細胞を溶解し、14,000rpmにて遠心して上清を回収した。回収した上清に水を加えて塩濃度を150 mM にした後に、抗FLAG抗体アガロースビーズ(M2, Sigma)を加え、4℃にて2時間撹拌した。ビーズを洗浄バッファー (150 mM Tris-HCl (pH7.5)、0.5 % NP-40、150 mM NaCl、1 mM PMSF、0.5 mM DTT)で5回洗浄し、30μLのSDS-PAGE バッファーを加えて5分間煮沸した。

ミニプロティアン３（BioRad）にて作製した10%ポリアクリルアミドゲルに各サンプルを5 μLずつアプライし、150Vの定電圧により約1時間泳動した。PVDF膜にミニトランスブロットモジュール（BioRad）を用いて転写し、5%スキムミルクで転写後の膜ををブロッキングした。ウサギ抗FLAG抗体（Sigma)またはウサギ抗HA抗体を用いたウエスタンブロットを行い、免疫沈降したFLAG-P4HA1およびFLAG-P4HA1のシノビオリンによるHA-Ub化を検出した。

その結果、野生型シノビオリンによるP4HA1のユビキチン化が再現性良く検出でき（図１１）、また、3S変異体存在下ではユビキチン化が減弱した（図１１、レーン6）。次に、低分子化合物302処理群では、1 μMではコントロール群と比較して差は認められなかったのに対し、10 μMで抑制作用が検出できた。一方、100 μMでは細胞がほとんど死滅したため、シグナルは検出できなかった（図１１、レーン5）。

これらの結果から、低分子化合物302は非常に低濃度でシノビオリンによるP4HA1のユビキチン化を抑制することが示された。

ケルセチンのP4HA1のin vivoユビキチン化作用
COS7細胞に、FLAG-P4HA1、シノビオリンおよびHA-Ubを発現するプラスミド（pcDNA3-)をFuGene6（Roche)を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション48時間後にケルセチンを最終濃度1, 10, 20, 50 μMとなるように加えた。コントロール群には最終濃度0.1%のDMSOを加えた。6時間後に細胞を回収し、high salt buffer (7.5 mM Tris-HCl (pH7.5), 420 mM NaCl, 0.5 % NP-40, 1 mM PMSF, 0.5 mM DTT)を用いて細胞を溶解し、14,000rpmで遠心して上清を回収した。回収した上清に水を加えて塩濃度を150 mM にした後に、抗FLAG抗体アガロースビーズ(M2, Sigma)を加え、4℃にて2時間撹拌した。ビーズを洗浄バッファー(150 mM Tris-HCl (pH7.5)、0.5 % NP-40、150 mM NaCl、1 mM PMSF、0.5 mM DTT)で5回洗浄し、30μLのSDS-PAGEバッファーを加えて5分間煮沸した。

ミニプロティアン３（BioRad）にて作製した10%ポリアクリルアミドゲルに各サンプル5 μLずつアプライし、150Vの定電圧により約1時間泳動した。PVDF膜にミニトランスブロットモジュール（BioRad）を用いて転写し、5%スキムミルクで転写後の膜をブロッキングした。ウサギ抗FLAG抗体（Sigma)またはウサギ抗HA抗体を用いたウエスタンブロットを行い、免疫沈降したFLAG-P4HA1およびFLAG-P4HA1のシノビオリンによるHA-Ub化を検出した。

結果を図１２に示す。図１２に示すとおり、ユビキチン化シグナルが減少していることから、ケルセチンはP4HA1のシノビオリンによるユビキチン化（レーン1)を濃度依存的に抑制した。免疫沈降したP4HA1の量はどのレーンもほぼ同じ量が検出できたため、ユビキチン化シグナルが減少したのは、単なる細胞毒性によるものではなく、ケルセチンがシノビオリンによるユビキチン化を特異的に抑制したと考えられる。

＜実施例の結果まとめ＞
(i) 低分子化合物302及びケルセチンはシノビオリンの自己ユビキチン化を強く抑制する効果を有する。
(ii) 低分子化合物302におけるシノビオリンの自己ユビキチン化阻害活性のIC50は20μMである。
(iii) 低分子化合物302は、シノビオリン同士の相互作用により生じるシノビオリンの自己ユビキチン化を抑制する。
(iv) 低分子化合物302は、RING型E3ユビキチンリガーゼの自己ユビキチン化反応を抑制する。
E2ユビキチン複合体形成には影響を与えない。
(v) 低分子化合物302は、非常に低いIC50値でリウマチ滑膜細胞に対する細胞増殖抑制効果を示した。

シノビオリンの自己ユビキチン化抑制活性能を有する化合物のスクリーニング結果を示す図。 MBP-Syno ΔTM-Hisを基質としたときの低分子化合物302の自己ユビキチン化抑制活性能を示す図。 MBP-Syno ΔTM-Hisを基質としたときの低分子化合物302によるシノビオリンの自己ユビキチン化抑制活性を示す図。 Aは、低分子化合物302の濃度依存的MBP-Syno ΔTM-His自己ユビキチン化抑制能を示す。 Bは、低分子化合物302のMBP-Syno ΔTM-His自己ユビキチン化に対するIC50値を示す。低分子化合物302によるシノビオリンの自己ユビキチン化抑制活性を示す図。 Aは、GST-SynoΔTM、GST-AMFRを基質としたときの低分子化合物302の自己ユビキチン化抑制活性能を示す。 Bは、低分子化合物302のE2-ユビキチン複合体形成反応を示す。低分子化合物302のboiled biotinylated BSAのユビキチン化に対する影響を試験した結果を示す図。低分子化合物302の種々のRING型E3ユビキチンリガーゼに対する自己ユビキチン化反応への影響を試験した結果を示す図。低分子化合物302によるGST-SynoΔTMとUBE2G2の相互作用への影響を試験した結果を示す図。 CBB染色によりGST-SynoΔTM沈降量を確認した結果を示す図。低分子化合物302によるGST-SynoΔTMとboiled biotinylated BSAの相互作用への影響を試験した結果を示す図。 CBB染色によるGST-SynoΔTM沈降量を確認した結果を示す図。低分子化合物302のGST活性に対する影響を試験した結果を示す図。低分子化合物302の細胞増殖抑制活性を示す図。 Aは、低分子化合物302を作用させて24時間後の細胞増殖抑制能を示す。 Bは、低分子化合物302を作用させて48時間後の細胞増殖抑制能を示す。 Cは、低分子化合物302を作用させて72時間後の細胞増殖抑制能を示す。低分子化合物302 P4HA1のin vivoユビキチン化作用を示す図。ケルセチンのP4HA1のin vitroユビキチン化抑制作用を示す図。

Claims

プルムバギン及びケルセチンからなる群から選ばれる少なくとも１つ、その製薬上許容可能な塩又はこれらの水和物を含む、タンパク質のユビキチン化抑制剤。
タンパク質のユビキチン化がシノビオリンの自己ユビキチン化である請求項１記載の抑制剤。
自己ユビキチン化は、シノビオリン同士の相互作用により生じるものである請求項２に記載の抑制剤。
タンパク質のユビキチン化は、該タンパク質にシノビオリンが結合することにより生じるものである請求項１に記載の抑制剤。
プルムバギン、その製薬上許容可能な塩又はこれらの水和物を含む、線維症治療剤。