JP4819321B2

JP4819321B2 - Ａｋｔ活性特異的抑制ポリペプチド

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Publication number: JP4819321B2
Application number: JP2004134583A
Authority: JP
Inventors: 昌幸野口; 太岡田; 信廣村
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Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2003-12-15
Filing date: 2004-04-28
Publication date: 2011-11-24
Anticipated expiration: 2024-04-28
Also published as: US20130137758A1; CN1894278A; EP1717244B1; JP2005198643A; WO2005056594A1; US20120034651A1; CN1894278B; US8440630B2; EP1717244A1; US9212210B2; EP1717244A4

Description

本発明は、セリンスレオニンキナーゼＡｋｔ（Protein Kinase B）の活性を特異的に抑制するポリペプチド、該ペプチドをコードするＤＮＡ及び該ポリペプチドを有効成分とするＡｋｔ活性の特異的阻害剤或いは該ポリペプチドを有効成分とする抗腫瘍剤等に関する。

Ａｋｔキナーゼ（Protein Kinase B：以下、Ａｋｔと表示する。）は１９９０年代の初めに相次いでウイルスｖ−Ａｋｔとの相同性を手がかりに見つけられたセリンスレオニンリン酸化酵素である。現在までに３つのサブタイプがあることが確認されている。これらの分子は８０％程度の相同性があり、当初から癌化との関連性が注目されていた。特に、サイトカインの細胞内シグナル伝達の中で細胞死を抑制する中心的な役割を担っていることがわかり注目されている（Genes & Dev., 13:2905-2927, 1999; Annu. Rev. Biochem., 67:481-507, 1998; Biochem.J., 335: 1-13, 1998）。

このＡｋｔは、分子量約５７ｋＤで、プレクストリン相同ドメイン（pleckstrin homology domain:ＰＨドメイン）にイノシトールリン酸が選択的に結合し、主に細胞膜への局在を規定する役割を果たす機能をＮ末端に持つ。また、Ｃ末端側には、リン酸化キナーゼドメインを持つ。ホスファチディルイノシトール−３−キナーゼ（Phosphatidylinositol 3-kinase：Ｐ１３Ｋ）からのシグナルによりＰＨドメインにＰＩＰ３などが結合し、Ａｋｔ分子が細胞膜に移行すること、並びにＡｋｔの三次構造を変化させることがその活性化に関与していると推測されている。

Ａｋｔの活性化にはスレオニン３０８基（Ｔｈｒ３０８）、セリン４７３基（Ｓｅｒ４７３）の２つのアミノ酸のリン酸化が必須であると考えられている。Ｔｈｒ３０８はＰＤＫ（phosphoinositide dependent kinase）によりリン酸化されることが知られているが、Ｓｅｒ４７３のリン酸化のプロセスは十分に解明されておらず、ＩＬＫ（integrin linked kinase）やＰＤＫ２などのいくつかの不確定な分子がそのリン酸化のプロセスに関与している可能性が推測されているに過ぎない。また、最近Ｓｅｒ４７３のリン酸化に自己リン酸化が可能性も報告されている。

活性化されたＡｋｔは細胞死抑制に関与する分子のリン酸化を促進することが知られている。このＡｋｔによりリン酸化されるセリン／スレオニン近傍のアミノ酸配列はＲＸＲＸＸＳ／Ｔとして知られている（J. Biol. Chem.in press,2000）。ＢＡＤ．Caspace ９．ＦＫＨＲＩ（forkhead transcription factor）などの分子はこれらのアミノ酸配列を持ち、Ａｋｔの生理的条件下での基質として知られている。不活性型ＢＡＤがＡｋｔによりリン酸化され、リン酸化依存的に１４−３−３タンパク質と結合し、活性型Ｂｃｌ−２やＢｃｌ−ＸＬなどの細胞死抑制作用のあるタンパク質を遊離する。これらの既知の機能並びに未解明の種々のターゲットを介してＡｋｔはアポトーシス抑制制御の中心的な役割を担っていると考えられている（Cell,96:857-868,1999）。

このようにセリン／スレオニンキナーゼＡｋｔは、細胞内タンパク質のセリン又はスレオニン残基を特異的にリン酸化する機能を有しており、該リン酸化機能によって多細胞器官へのシグナル伝達を媒介する役割を担っている。そして、該Ａｋｔのリン酸化機能によって細胞内の種々の機構が調節されている。例えば、有糸分裂、細胞増殖、細胞分化、脂質代謝の制御、免疫応答、炎症性応答、グリコーゲンの代謝の制御等、細胞内の種々の機構の調節に関与している。同時に、このことは、癌、肥満症、自己免疫障害、炎症、及び糖尿病（II型）のような広範囲な種々の疾患や障害に関与していることを意味する。

近年、Ａｋｔの活性化が、乳がん、肺がん、前立腺がん、卵巣がん、或いは、白血病及びリンパ系腫瘍のような血液系がん等に関与することが報告されている（Annu. Rev.Biochem. 68,965,1999）。これらの悪性腫瘍においてはＡｋｔの活性が上昇することから、Ａｋｔの活性化がこれらの悪性腫瘍の原因となっていると考えられている。最近、これらのセリン／スレオニンキナーゼの活性を、セリン／スレオニンキナーゼのＨＪループの誘導体であるショートペプチドを用いて調節し、上記のような疾患や障害の治療を行う試みもなされている（特表２００２−５００６４９号公報）。

一方で、プロトオンコジーンとしてＴＣＬ１が知られている。ＴＣＬ１は、ヒトＴ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）でその活性が上がることで注目され、これまでに３つの類似するサブタイプ（ＴＣＬ１、ＭＴＣＰ１、ＴＣＬ１ｂ）があることが知られている（Oncogene,8:2475-2483,1993;Proc. Natl. Acad. Sci. USA,91:12530-12534,1994）。これらの遺伝子座、１４ｑ、３２、χ２８がＴ細胞受容体遺伝子座に転座することによりその発現が活性化され、ヒト白血病（Ｔ−ＰＬＬ）を起こすことが知られている。しかし、１３〜１６ｋＤの小さなタンパク質で、これまでに知られている特有な機能構造を持たないことから、その機能は全くわからなかった。

生理的条件下でのこれらの分子の発現は、比較的限定されている。ＴＬＣ１発現は、分化早期（ＣＤ３^-／ＣＤ４^-／ＣＤ８^-）Ｔ細胞、並びに形質細胞分化前までの各種Ｂ細胞のリンパ系細胞に限られている。また、ＭＴＣＰ１の生理的条件下での発現の詳細は不明であるが、最近の遺伝子発現の解析結果から活性化Ｔ細胞で発現が誘導されていることが確認された。ＴＣＬ１ｂは、ごく最近クローニングされた分子で、ＴＣＬ遺伝子座の極めて近くに存在する。マウスでは５種のサブタイプが存在し、ヒトでは１種のみが存在すると考えられている。この遺伝子の発現は分化初期の胚芽細胞で非常に高い発現があることが報告されている。

ＴＣＬ１の遺伝子はクローニングされ、１３２４の塩基配列と１１３のＴＣＬ１のアミノ酸配列が明らかにされている（米国特許第５，９８５，５９８号明細書）。

しかし今まで、ＴＣＬ１の機能については全く分かっていなかった。本発明者らは、Ａｋｔ活性化のプロセスを解明する目的でＡｋｔに結合するタンパク質分子を酵母を用いたｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法によりヒトＢ細胞由来のライブラリーを用いて検索した結果、プロトオンコジーンＴＣＬ１がＡｋｔと結合することを見い出した。すなわち、ＴＣＬ１がＡｋｔと結合し、多量体を形成し、その多量体のＡｋｔが活性化されることを示し、ＴＣＬ１がＡｋｔの活性化を促すＡｋｔの活性補助因子であることを見い出した（Mol. Cell,6:395-407,2000）。更に、本発明者らは、ＴＣＬ１がＡｋｔを介した細胞分裂、細胞死（アポトーシス）の抑制などを亢進し、白血病やヒトリンパ系の腫瘍の病因となっていることを明らかにし、その後の研究により、細胞内及び細胞外でのリコンビナントタンパクを使った免疫共沈法により、ＴＣＬ１が異種のＡｋｔ分子間での重合形成を促進し、ＴＣＬ１が異種のＡｋｔ分子の間でＡｋｔセリン４７２／４７３残基のリン酸化を促進することを示し、ＴＣＬ１がＡｋｔを活性化する分子学的な機序を明らかにした（J. Biological Chemistry,277[5],3743-3751,2002）。

更に、本発明者らはＰＣＲ法を応用したＴＣＬ１オンコジーンのアミノ酸ランダムライブラリーを作成し、ＴＣＬ１とＡｋｔの結合並びにＴＣＬ１の重合形成に必要なアミノ酸部位を同定し、また、ＴＣＬ１のダイマー形成或いはＡｋｔとの結合能を欠く変異型ＴＣＬ１を同定した。そして、この変異型ＴＣＬ１はＡｋｔを活性化（in vitoro或いはin vivoとも）する能力を欠き、ミトコンドリア外膜の安定化、細胞死抑制、Ａｋｔの核内への移行などＴＣＬ１の各種機能を失うことを確認した（Molecular and Cellular Biology,22[5],1513-1525,2002）。すなわち、本発明者らはこれまで機能の分からなかったプロトオンコジーンＴＣＬ１が、Ａｋｔの活性補助因子であり、その活性化にＡｋｔとの結合、ＴＬＣ１同士の重合形成が必須であることを見い出した。
特表２００２−５００６４９号公報。米国特許第５，９８５，５９８号明細書。 Genes & Dev.,13:2905-2927,1999。 Annu.Rev.Biochem.,67:481-507,1998。 Biochem.J.,335:1-13,1998。 J. Biol. Chem.in press,2000。 Cell,96:857-868,1999。 Oncogene,8:2475-2483,1993。 Proc. Natl. Acad. Sci. USA,91:12530-12534,1994。 Mol. Cell,6:395-407,2000。 J. Biological Chemistry,277[5],3743-3751,2002。 Molecular and Cellular Biology,22[5],1513-1525,2002。

本発明の課題は、セリンスレオニンキナーゼＡｋｔ（Protein Kinase B）の活性を特異的に抑制するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体、及び該ポリペプチドを有効成分とするＡｋｔ活性の特異的阻害剤或いは該ポリペプチドを有効成分とする抗腫瘍剤等を提供することにある。

本発明者らは、機能の全く分かっていなかったプロトオンコジーンＴＣＬ１が、ヒト悪性腫瘍等に関与するＡｋｔに直接結合し、Ａｋｔの活性化を促す、すなわち、Ａｋｔの活性補助因子であることを明らかにし、更に、白血病やヒトリンパ系の腫瘍等の原因になっていることを明らかにしてきた。また、Ａｋｔと結合しない変異型ＴＣＬ１はＡｋｔを活性化する能力を欠き、ミトコンドリア外膜の安定化、細胞死抑制、Ａｋｔの核内への移行などＴＣＬ１の各種機能を失うことを示してきた。これらの一連の研究から、ＴＣＬ１（ヒト）のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基１０〜２４番目の部位がＡｋｔと結合する部位であり、該アミノ酸残基のポリペプチド配列を用いることにより、Ａｋｔの活性化に伴う細胞の増殖等を特異的に抑制することを見い出し、本発明を完成するに至った。

更に、ＴＣＬ１と同様の機能を有するＴＣＬ１Ｂ及びＭＴＣＰ１（ヒト）においても同様の機能があることを確認し、ＴＣＬ１Ｂ（ヒト）のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基８〜２２番目の部位、及びＭＴＣＰ１（ヒト）のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基５〜１９番目の部位が、Ａｋｔの活性化に伴う細胞の増殖を抑制することを見い出し、本発明をなした。更に、本発明においては、マウスＴＣＬ１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基９〜２４番目の部位、及び、ラットＴＣＬ１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基９〜２４番目の部位がＡｋｔの活性化に伴う細胞の増殖を抑制することを確認した。本発明のポリペプチドは、ホスホイノシチド（phsphoinositide：ホスファチジルイノシトール）のＡｋｔへの結合を競合的に阻害する。

すなわち、本発明はＴＣＬ１（ヒト）のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基１０〜２４番目の部位に相当するアミノ酸配列（配列表の配列番号１）、ＴＣＬ１Ｂ（ヒト）のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基８〜２２番目の部位に相当するアミノ酸配列（配列表の配列番号３）、ＭＴＣＰ１（ヒト）のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基５〜１９番目の部位に相当するアミノ酸配列（配列表の配列番号５）、ＴＣＬ１（マウス）のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基９〜２４番目の部位（配列表の配列番号７）、及び、ＴＣＬ１（ラット）のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基９〜２４番目の部位（配列表の配列番号９）からなりＡｋｔの活性を特異的に抑制するポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡ（配列表の配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号１０）からなる。

また、本発明は該ポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡｋｔの活性を特異的に抑制するポリペプチド誘導体、及び、それらの配列をコードするＤＮＡ、或いは、該配列のＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡｋｔの活性を特異的に抑制するポリペプチドをコードするＤＮＡを包含する。更に、本発明は、該ＤＮＡを発現ベクターに組込んで、組換え発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞に導入して発現することにより、本発明のポリペプチドを製造する方法を包含する。

また、本発明は本発明のＡｋｔ活性を特異的に抑制するポリペプチドに特異的に結合する抗体を包含し、更には、本発明のポリペプチドを有効成分とするＡｋｔ活性の特異的阻害剤、及び、該ポリペプチドを有効成分とする悪性腫瘍等の予防、治療のための抗腫瘍剤としての利用を包含する。また、本発明においては、本発明のポリぺプチドをコードするＤＮＡを生体細胞に導入し、該ポリペプチドを発現することにより、Ａｋｔの活性を特異的に抑制する方法を包含する。

すなわち具体的には本発明は、（１）配列表の配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるＡｋｔのキナーゼ活性を特異的に抑制するポリペプチドや、（２）配列表の配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１〜２個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡｋｔのキナーゼ活性を特異的に抑制するポリペプチドからなる。

また、本発明は、（３）以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
(ａ)配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(ｂ)配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１〜２個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡｋｔのキナーゼ活性を特異的に抑制するポリペプチドや、（４）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、又は配列番号１０に示される塩基配列を含み、かつＡｋｔのキナーゼ活性を特異的に抑制するポリペプチドをコードするＤＮＡや、（５）上記（３）又は（４）記載のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡｋｔのキナーゼ活性を特異的に抑制するポリペプチドをコードするＤＮＡからなる。

更に本発明は、（６）上記（３）〜（５）のいずれか記載のＡｋｔのキナーゼ活性を特異的に抑制するポリペプチドをコードするＤＮＡを、遺伝子発現ベクターに組込んで構築したことを特徴とする組換え発現ベクターや、（７）上記（６）記載の組換え発現ベクターを宿主細胞に導入し、発現することを特徴とするＡｋｔのキナーゼ活性を特異的に抑制するポリペプチドを製造する方法からなる。

また本発明は、（８）上記（１）又は（２）記載のポリペプチドを有効成分とするＡｋｔのキナーゼ活性の特異的阻害剤や、（９）ポリペプチドがＴＣＬ１のタンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜２４の配列であることを特徴とする上記（８）記載のＡｋｔのキナーゼ活性の特異的阻害剤や、（１０）ポリペプチドがＴＣＬ１Ｂのタンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸残基８〜２２の配列であることを特徴とする上記（８）記載のＡｋｔのキナーゼ活性の特異的阻害剤や、（１１）ポリペプチドがＭＴＰ１のタンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸残基５〜１９の配列であることを特徴とする上記（８）記載のＡｋｔのキナーゼ活性の特異的阻害剤や、（１２）ポリペプチドがマウスＴＣＬ１のタンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸残基９〜２４の配列であることを特徴とする上記（８）記載のＡｋｔのキナーゼ活性の特異的阻害剤や、（１３）ポリペプチドがラットＭＴＰ１のタンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸残基９〜２４の配列であることを特徴とする上記（８）記載のＡｋｔのキナーゼ活性の特異的阻害剤や、（１４）上記（１）又は（２）記載のポリペプチドを有効成分とする、ホスホイノシチドのＡｋｔへの結合の阻害剤からなる。

更に本発明は、（１５）上記（１）又は（２）記載のポリペプチドを有効成分とする抗腫瘍剤や、（１６）抗腫瘍剤が、悪性腫瘍の予防、治療のための薬剤であることを特徴とする上記（１５）記載の抗腫瘍剤や、（１７）悪性腫瘍の治療が、乳がん、肺がん、白血病、又はリンパ系腫瘍の予防、治療であることを特徴とする上記（１６）記載の抗腫瘍剤や、（１８）上記（３）〜（５）のいずれか記載のＡｋｔのキナーゼ活性を特異的に抑制するポリペプチドをコードするＤＮＡを生体細胞（ヒト生体細胞を除く）に導入し、該ポリペプチドを発現することにより、Ａｋｔのキナーゼ活性を特異的に抑制する方法からなる。

オンコジーンＴＣＬ１は、Ａｋｔ（セリンスレオニンリン酸化酵素；Protein Kinase B）の活性補助因子であり、ＴＣＬ１がＡｋｔに直接結合し、Ａｋｔの活性化を促す。本発明において、このＴＣＬ１のアミノ酸配列の中で、Ａｋｔに結合する部位を特定し、該ＴＣＬ１、ＴＣＬ１Ｂ、及びＭＴＣＰ１のＡｋｔに結合する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドがＡｋｔの活性を特異的に抑えることを見い出すことにより、本発明のポリペプチドのＡｋｔ活性の特異的阻害剤としての利用を可能とした。これまでＡｋｔの特異的ペプチド阻害剤は知られていないことから、本発明のポリペプチドは、全く新しいタイプのＡｋｔの活性阻害剤としての利用が期待できるものである。

更に、Ａｋｔは細胞死を抑制する中心的な役割を担う細胞内シグナル分子であり、多くの癌細胞では、Ａｋｔが活性化され、アポトーシスが障害される。この結果、細胞死が減少し、細胞が異常に増殖し、癌の発症の原因となる。Ａｋｔはアポトーシスを制御する中心的な分子として知られており、重要な研究テーマとなっているが、この細胞死抑制機構の中心的分子Ａｋｔを特異的に阻害する薬剤は未だに開発されていない。本発明のＡｋｔ活性の特異的阻害剤は、アポトーシス制御など癌の発症の原因となる機構に関与するものであり、ＴＣＬ１遺伝子の過剰発現や癌抑制遺伝子ＰＴＥＮの異常によるＡＫＴの活性化が背景となる悪性腫瘍の予防又は治療薬の開発につながるものである。Ａｋｔの活性は、乳がん、肺がん、前立腺がん、卵巣がん、及び白血病或いはリンパ系腫瘍のような血液系腫瘍等の悪性腫瘍に関与することから、本発明のＡｋｔ活性の特異的阻害剤は、抗腫瘍剤（抗癌剤）として、これらのＡｋｔキナーゼの活性化が原因となる様々なヒト悪性腫瘍の予防、治療に用いることができる。

本発明は、Ａｋｔの活性を特異的に抑制するポリペプチド、すなわちヒトＴＣＬ１オンコジーンのアミノ酸残基１０〜２４のアミノ酸配列、ヒトＴＣＬ１Ｂのアミノ酸残基８〜２２のアミノ酸配列、ヒトＭＴＣＰ１のアミノ酸残基５〜１９のアミノ酸配列、マウスＴＣＬ１のアミノ酸残基９〜２４のアミノ酸配列、及びラットＴＣＬ１のアミノ酸残基９〜２４のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなり、該アミノ酸配列は配列表の配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、及び配列番号９に示される。また、本発明は、該ポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡｋｔの活性を特異的に抑制するポリペプチド誘導体からなる。ヒトＴＣＬ１オンコジーンのアミノ酸残基配列１０〜２４のアミノ酸配列、ヒトＴＣＬ１Ｂのアミノ酸残基８〜２２のアミノ酸配列、及びヒトＭＴＣＰ１のアミノ酸残基５〜１９のアミノ酸配列、マウスＴＣＬ１のアミノ酸残基９〜２４のアミノ酸配列、及びラットＴＣＬ１のアミノ酸残基９〜２４のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、配列表の配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、及び配列番号１０に示される。本発明は、該配列のＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡｋｔの活性を特異的に抑制するポリペプチドをコードするＤＮＡを包含する。

本発明のポリペプチドは、配列表の配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７及び配列番号９のアミノ酸配列からなるポリペプチドの構造を基本にして、周知のポリペプチドの合成法によって合成することができる。また、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を用いて遺伝子工学操作によって、製造することができる。ヒトＴＣＬ１オンコジーン全体の遺伝子のＤＮＡ配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、米国特許第５、９８５、５９８号明細書に開示されており、また、その遺伝子及びタンパク質の配列は、ＧｅｎＢａｎｋのデーターベースでアクセッションナンバー、Ｘ８２２４０及びＣＡＡ５７７０８によってアクセスすることができる。また、ＴＣＬ１の遺伝子の全長（ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ）を組込んだベクターは、米国の微生物の寄託機関であるＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）に特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づく微生物の寄託として、受託番号７５９２３及び７５９２４でそれぞれ寄託されている。更に、マウスＴＣＬ１の遺伝子のＤＮＡ配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＩＢのデーターベースでアクセッションナンバーＮＰ_０３３３６３によって、ラットＴＣＬ１の遺伝子のＤＮＡ配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、アクセッションナンバーＸＰ_３４５７２０によってアクセスすることができる。

ＴＣＬ１Ｂ全体の遺伝子のＤＮＡ配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は文献（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ,96(6),2949-2951,1999）に示されており、ＮＣＢＩのデーターベースにおいて、アクセッションナンバー：ＡＦ_１１０４６５によってアプローチすることができる。また、ＭＴＣＰ１全体の遺伝子のＤＮＡ配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は文献（Oncogene 8(9),2475-2483,1993）に示されており、ＮＣＢＩのデーターベースにおいて、アクセッションナンバー：ＢＣ_００２６００によってアプローチすることができる。

本発明のポリペプチドを遺伝子工学操作によって製造するには、上記のようなＤＮＡ配列の情報から合成によりＤＮＡを作製するか、或いは、上記のようなＴＬＣ１の遺伝子源から本発明のＤＮＡを制限酵素を用いて切り出して取得し、該遺伝子を適宜の発現ベクターに組込み、該組換えベクターを宿主細胞に導入し、発現することによって取得することができる。本発明において、種々のポリペプチド誘導体は、該ポリペプチドをコードする塩基配列のＤＮＡを作製し、該ＤＮＡを用いて、発現ベクターを構築し、該発現ベクターを公知の適宜の宿主に導入して、発現することにより製造することができる。種々のポリペプチド誘導体をコードするＤＮＡ配列の変異は、周知の遺伝子工学的遺伝子変異手段によって行うことができる。

本発明のポリペプチドを遺伝子工学操作によって製造するには、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに組込み、組換え発現ベクターを構築し、これを宿主細胞に導入して発現することにより行う。組換え発現ベクターの宿主細胞への導入は適宜公知の方法を用いることができる。例えば、原核生物の宿主としては、大腸菌、枯草菌、シュードモナス属の菌株を挙げることができ、該原核生物を宿主として使用する場合のベクターとしては、ｐＵＣ１９，ｐＢＲ３２２又はｐＢＲ３２７のような大腸菌株等のベクターを用いることができ、プロモーターとして、例えばトリプトフアン・プロモーター、Ｐ_Lプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、マーカー遺伝子として、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を用いることができる。

真核微生物の宿主としては、酵母が一般に広く用いられ、発現ベクターとしては、例えばＹＲｐ７等を用いることができる。高等動物の培養細胞を宿主とする場合には、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）等を用いることができる。プロモーターとしては、例えばアデノウイルス２主後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、サイトメガロウイルス、ラウスザルコーマーウイルスからのプロモーターを、マーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、メトトレキセート耐性ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＲ）遺伝子等を用いることができる。その他、ＢｍＮ４細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞等の昆虫細胞を宿主として用いることができる。

本発明においては、ヒトＴＣＬ１のアミノ酸残基１０〜２４のアミノ酸配列からなるポリペプチド等、本発明のポリペプチドを用いることにより、ホスホイノシド（ホスファチジルイノシトール）との結合を阻害する結果、Ａｋｔ（protein Kinase B）活性、細胞増殖、抗腫瘍効果を得ることができる。このペプチドは、リコンビナント蛋白としての投与、ウイルスベクターを用いた投与法、哺乳類発現ベクターを用いた投与法が考えられる。TATペプチド（HIVウイルスの蛋白の一部）との融合法によるペプチドの導入法も利用できる。その他、エレクトロポーレーション、薬理学的に考えられる細胞内導入法を用いることもできる。ペプチドの安定化を図る意味でのペプチドの修飾、ＰＥＧ（polyethylene Glycol）、ＦＣＲ（ＦＣ Receptor）、他のペプチドとの融合ペプチドの作製などを用いることができる。

本発明は、ヒトＴＣＬ１のアミノ酸残基１０〜２４のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列表の配列番号２に示される塩基配列）、ヒトＴＣＬ１Ｂのアミノ酸残基８〜２２のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列表の配列番号４に示される塩基配列）、ヒトＭＴＣＰ１のアミノ酸残基５〜１９のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列表の配列番号６に示される塩基配列）、マウスＴＣＬ１のアミノ酸残基９〜２４のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列表の配列番号８に示される塩基配列）、又は、ラットＴＣＬ１のアミノ酸残基９〜２４のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列表の配列番号１０に示される塩基配列）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡｋｔの活性を特異的に抑制するポリペプチドをコードするＤＮＡを包含する。

ここで、「塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。

本発明は本発明のＡｋｔ活性を特異的に抑制するポリペプチドに特異的に結合する抗体を包含する。該抗体としては、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を挙げることができる。該抗体の作製は、本発明のポリペプチドを抗原として、常法により作製することができる。本発明の抗体は、ＴＣＬ１、ＴＣＬ１Ｂ、又はＭＴＣＰ１のＡｋｔへの結合部位に特異的に結合することにより、ＴＣＬ１、ＴＣＬ１Ｂ、又はＭＴＣＰ１のＡｋｔへの結合を特異的に阻害することが考えられる。また、本発明の抗体はＴＣＬ１、ＴＣＬ１Ｂ、又はＭＴＣＰ１ポリペプチドとの抗原抗体反応により、組織細胞、血清などにおけるＴＣＬ１、ＴＣＬ１Ｂ、又はＭＴＣＰ１遺伝子に関わる疾患の検出に用いることができる。本発明の抗体を用いた免疫学的測定には、例えばＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法等公知の免疫学的測定法を用いることができる。

本発明においては、本発明のポリペプチドを有効成分として、Ａｋｔ活性の特異的阻害剤として、及び、該ポリペプチドを有効成分として、悪性腫瘍等の予防、治療のための抗腫瘍剤として用いる。本発明のポリペプチドを有効成分として、Ａｋｔ活性の特異的阻害剤として、及び、悪性腫瘍等の予防、治療のための抗腫瘍剤として用いるには、該ポリペプチドをそれ単独で、或いは、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することにより製剤化して用いることができる。これらのＡｋｔ活性の特異的阻害剤又は悪性腫瘍等の予防若しくは治療剤は、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。

本発明のＡｋｔの活性を特異的に抑制するポリペプチドを癌などの予防・治療に用いる場合は、タンパク質、ペプチド又は抗体などの巨大分子と非共有結合体を形成し、ポリペプチドの構造を変化させ、ポリペプチドの分子を細胞内にデリバリーすることができるChariot（Active Motif社製）等の細胞毒性のない試薬を用い、Ａｋｔの活性を特異的に抑制するポリペプチドを癌細胞に直接接種することができる。なお、投与量は、疾病の種類、患者の体重、投与形態等により適宜選定することができる。本発明のＡｋｔ活性の特異的阻害剤又は抗腫瘍剤の投与の対象としては、Ａｋｔの活性化が原因となる各種疾病の予防或いは治療を挙げることができ、特には、乳がん、肺がん、前立腺がん、卵巣がん、及び白血病或いはリンパ系腫瘍のような血液系腫瘍等の悪性腫瘍の予防、治療を挙げることができる。

本発明においては、本発明のＡｋｔ活性を特異的に抑制するポリペプチドをコードするＤＮＡを生体細胞に導入し、該ポリペプチドを発現することにより、Ａｋｔの活性を特異的に抑制することができる。該Ａｋｔ活性を特異的に抑制するポリペプチドをコードするＤＮＡを生体細胞に導入するための動物細胞用発現ベクターとしては、上記本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡが動物細胞用ベクターにインテグレイトされているものであればどのようなものでもよく、かかる動物細胞用ベクターとしては、上記本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを宿主細胞内で発現させることができる発現系であれば特に制限されない。例示すれば、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。

これら発現系は、発現を起こさせるだけでなく、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。また、本発明の動物細胞用発現ベクターには、リポソームも含まれる。これら動物細胞用ベクターの中でも、アデノウイルスベクターが、安全性や使用の便からして特に好ましい。癌などの予防・治療においては病変部位に直接（インサイチュウ）投与することが好ましく、例えば、アデノウイルス発現ベクターを利用する場合は、癌組織等の病変部位に該ベクターの懸濁液を直接接種することができる。また、本発明のＡｋｔ活性を特異的に抑制するポリペプチドをコードするＤＮＡを収納したリポソームを用いる場合も、癌組織等の病変部位に該リポソームの懸濁液を直接接種することができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

［Ａｋｔ及びＴＣＬ１結合配列の同定］
酵母ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄスクリーニング及びβ−Ｇａｌの半定量法を用いてアミノ酸部分変異ＴＣＬ１クローンとＡｋｔとの相互作用について検討した（MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY,Mar. 2002,P.1513-1525）。

［Ａｋｔ−ＴＣＬ１の結合部位同定のためのＴＣＬ１（ヒト）アミノ酸ランダムミュテーションラブラリースクリーニング］
（材料及び方法）
１．ＴＣＬ１ライブラリー
ｐＧＡＤ４２４（Clontech社）中のヒト全長ＴＣＬ１を、５´−ＣＣＡＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧ及び５´−ＡＴＴＣＡＴＡＧＡＴＣＴＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡからなるプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅し、ランダムＴＣＬ１アミノ酸ライブラリーを作製した。

２．ＴＣＬ１のアミノ酸変異体の作製
ＴＣＬ１のアミノ酸置換変異体（Ｄ１６Ｇ、Ｋ３０Ｍ、Ｑ４６Ｒ、１７４Ｖ、Ｍ１０６Ｖ、３６−３８Ａ、又は３６Ａ／３８Δ）を下記のプライマーを用いて、ＰＣＲによって調製し、天然型と変異型をｐＧＡＤ４２４（Clontech社）、ｐＭＥ１８ＳＨＡ（Mol. Cell 6:395-407）、又はｐＣＭＶ Flag（Kodak社）発現ベクターにサブクローンした。

用いたプライマーは次のとおり（変異したコドンは、小文字で示した）：Ｄ１６Ｇに対しては、５´−ＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＧＣＣＣＧＡＣＡＣＴＣＧＧＧＧＡＧＧＣＡＧＴＣＡＣＣＧＡＣＣＡＣＣＣＧｇｇｃＣＧＣＣＴＧＴＧＧＧＣＣ；Ｋ３０Ｍに対しては、５´−ＧＴＧＴＡＴＴＴＧＧＡＣＧＡＧａｔｇＣＡＧＣＡＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧ；Ｑ４６Ｒに対しては、５´−ＧＡＴＡＡＡＧＧＡＴＡＧＧＴＴＡｃｇｇＴＴＡＣＧＧＧＴＧＣＴＣＴＴＧ；１７４Ｖに対しては、５´−ＣＣＡＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴｇｔｃＡＴＧＴＧＧＣＡＧＣＴＣＴＡＣ；Ｍ１０６Ｖに対しては、５´−ＡＴＣＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＣＡＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＣＧＡＧＡＡＧｃａｃＧＴＣＣＴＣＣ；３６−３８Ａに対しては、５´−ＣＡＧＣＡＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧｇｃｃｇｃｇｇｃｃＡＴＣＧＡＧＡＴＡＡＡＧＧＡＴ及び逆相補配列；及び３６Ａ／３８Δに対しては、５´−ＧＣＣＴＧＧＣＴＧｇｃｃＴＴＡＡＴＣＧＡＧＡＴＡ及び逆相補配列。ＴＣＬ１のアミノ酸置換変異体（Ｄ１６Ｇ、Ｋ３０Ｍ、Ｑ４６Ｒ、１７４Ｖ、Ｍ１０６Ｖ、３６−３８Ａ、又は３６Ａ／３８Δ）の変異位置を図１に示す。

３．酵母ツーハイブリドスクリーニング
ＴＣＬ１及びＡｋｔタンパク質の相互作用を検出するために、酵母ツーハイブリドタンパク質相互作用検出システムによるスクリーニングを行った。

Ｙ１９０細胞（Clontech社）を、リチウムアセテート法を用いて、既報（Mol. Cell 6:395-407；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11534-11539）に準じて、ヒトＡｋｔ２（Ａｋｔ２／ＰＡＳ２−１）及びＴＣＬ１ランダムライブラリーを酵母に発現した。３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（SＩＧＭＡ社）の存在下に、ｃＤＮＡライブラリーからの約１０⁴個のクローンをスクリーニングした。
Ｈｉｓ⁺コロニーをフィルター−リフトアッセイ（filter-lift assay）を用いて、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）活性を測定した。酵母クローンはβ−Ｇａｌの強度により、３−ｈ−ポジティブ（＋＋）、８−ｈ−ポジティブ（＋）、及び２４−ｈ−ネガティブ（−）クローンのカテゴリーに分類した。ヌクレオチドのシークエンシングのために、それぞれのカテゴリーから１０クローンを選択した。

４．定量的β−Ｇａｌアッセイ
Ｙ１９０細胞（Clontech社）を、野生型、Ｄ１６Ｇ、Ｋ３０Ｍ、Ｑ４６Ｒ、１７４Ｖ、Ｍ１０６ＶのＴＣＬ１と共に、Ａｋｔ２／ＰＡＳ２−１を用いて、ｐＧＡＤ４２４（Clontech社）ベクターを用いて酵母に発現した。ＴＣＬ１変異体は、ＰＣＲベースの部位変異（PCR-based site-directed mutagenesis）及び／又はQuikchangeキット（Stratagene社）により生成した。液体β−Ｇａｌアッセイは、ＯＮＰＧ（O-nitrophenyl-β-D-galactoppyranoside；Sigma社）を用いて結合度の定量を行った（Mol. Cell 6:395-407）。示された値は、ウエスタンブロット分析（ＧＡＬ４活性化ドメイン抗体［Ａｂ］：Clontech社）によって定量し、各々の酵母のトランスフォーマントの発現によって標準化した。

［実験及び結果］
Ａｋｔ−ＴＣＬ１の結合に必要なアミノ酸残基を決定するために、ＰＣＲ−介在−ランダム変異によるランダムＴＣＬ１ライブラリーを作製した。置換されたＤＮＡヌクレオチドは各々ｄＡＴＰは１，４％、ｄＴＴＰは３．８％、ｄＧＴＰは４．０％、及びｄＣＴＰは１．４％の発生率であった。このライブラリーにおけるヌクレオチド置換の総頻度は、２．７％であり、挿入−削除率は０．０９％であった。ライブラリーのサイズは、約２．５×１０⁴であった。置換部位は、シークエンスされた２５サンプルクローンにおいて、全ＴＣＬ１分子の９０％以上に分散していた。

次に、各々のクローンとＡｋｔ２との相互作用を調べるために、酵母ツーハイブリドスクリーニングを行った。酵母クローンは、β−Ｇａｌリフティングアッセイにおけるブルーカラー反応の強度に基づいて３つのカテゴリーに分類した。（３ｈでβ−Ｇａｌポジティブ〔＋＋〕、８ｈでβ−Ｇａｌポジティブ〔＋〕、及びネガティブ〔−〕）。各々のカテゴリーの１０クローンのヌクレオチド配列を決定した。＋＋クローンは、野生型ＴＣＬ１又はＰ５、Ｐ１５、Ｄ４３、Ｌ４５、Ｐ６１、Ｍ７５、及びＤ８８部位の変異体を含んでおり、該クローンはβ−Ｇａｌ活性に影響を与えず、該残基はＡｋｔ相互作用に対して反応しなかった。観察された、Ａｋｔと低い相互作用（８ｈポジティブ〔＋〕）を示す１０クローンのアミノ酸置換体と、ＴＣＬ１のアミノ酸配列を並べて示した（図１）。

これらのクローンの中で、特定の残基において、明らかに置換体の堆積が見い出された。１０クローンのうちの９クローンにおいて、Ｄ１６、Ｋ３０、Ｑ４６、Ｉ７４、又はＭ１０６におけるアミノ酸の少なくとも1つにおいて置換体が見い出された。陰性のクローン（−）は、ヌクレオチドの挿入、大量の削除を伴う挿入、構造シフト、及び／又は大量の変異体を含まなかった。それ故に、それ以上の分析から除外した。本発明者は、低下したＡｋｔ相互作用を示したクローンは、Ａｋｔ−ＴＣＬ１相互作用に必要なアミノ酸残基を含むに違いないとの仮説をたてた。そこで、部位特異的突然変異誘発法を用いて、ＴＣＬ１に個々の変異体（Ｄ１６Ｇ、Ｋ３０Ｍ、Ｑ４６Ｒ、Ｉ７４Ｖ、又はＭ１０６Ｖ）を作製した。Ｄ１６Ｇ及びＩ７４Ｖ変異体は、β−Ｇａｌリフティングアッセイ（図２）及び、定量的液体β−Ｇａｌアッセイ（図３）に示されるように、Ｄ１６Ｇ、１７４Ｖにおいて変異体Ａｋｔとの結合が劇的に低下する結果となった。

（ＴＣＬ１−誘導Ａｋｔ活性化に必要な、Ａｋｔ及びＴＣＬ１ホモダイマーによる会合）
ｉｎ vitro キナーゼアッセイにおいて、野生型ＴＣＬ１は、Ａｋｔキナーゼ活性を増大した。このことは、ＡｋｔＳｅｒ−４７３リン酸化の程度と優位に相関した。しかしながら、Ｄ１６ＧＴＣＬ１は、薬量を増加しても試験において、Ａｋｔキナーゼ活性に影響がなかった（図４）。Ｄ１６ＧＴＣＬ１は、ＧＳＫ３αのリン酸化、ＡｋｔＳｅｒ−４７３リン酸化とも変化を与えなかった。Ｄ１６ＧＴＣＬ１は、Ａｋｔキナーゼ活性によって評価した。同様に、Ａｋｔに結合するが、ホモダイマーを形成しない３６−３８ＡＴＣＬ１は（ｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにおいて、リン酸化ＧＳＫ−３α及びＳｅｒ−４７３Ａｋｔでの判定による）Ａｋｔキナーゼ活性を高めることができない（図５）。これらのことから、Ａｋｔと結合しない変異型ＴＣＬ１は、Ａｋｔの活性化する能力（ｉｎｖｉｔｒｏ及びＩｎｖｉｖｏとも）を欠くことを示した。

（Ａｋｔ及びＴＣＬ１結合配列の作製）
これまでに行われていたＴＣＬ１の結晶構造の解析結果から（Molecular and Cellular Biology,Mar.2002,p.1513-1525）、Ｄ１６は第一βシートの最初の部位に存在し、この第一βシートと第４βシートで作られる平面上にＡｋｔキナーゼが結合することが考えられた。これらの一連の研究に基づき、ＴＣＬ１蛋白分子におけるＡｋｔとの結合アミノ酸、第１６残基（Asparadic Acid）近傍のＴＣＬ１オンコジンのアミノ酸残基配列１０−２４（表１）が、Ａｋｔと結合し、Ａｋｔの活性化を抑制する阻害剤となりうるのではないかと考えた。

上記仮定に基づき、このＴＣＬ１とＡＫＴの結合部近傍のペプチド、すなわち、ＴＣＬ１のアミノ酸残基１０〜２４（「１０／２４」と表示する。）近傍のペプチド並びにコントロールペプチドの二つのペプチドを作製した（表２）。ペプチドは、通常のペプチド合成機で作製してあり、ゲル濾過又はＨＰＬＣで精製してある。北海バイオシステム、米国企業で作製されたものを用いた。

［ＴＣＬ１の１０／２４ペプチドのアッセイ］
１．ＭＴＴアッセイを用いた細胞増殖試験
ＭＴＴアッセイを用いた細胞の増殖試験を行った。すなわち、ＷＳＴ−８試薬 [2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt] (347-07621, Dojin, Kumamoto, Japan)アッセイを用いた細胞の増殖実験において、このＴＬＣ１オンコジーンのアミノ酸酸残基配列１０／２４ペプチド（NH2- - AVTDHPDRLWAWEKF -COOH）がＡＫＴ活性化に伴う細胞の増殖を特異的に抑制することを確認した（図６）。

この方法では、T４細胞株を用いた無刺激下での細胞増殖試験で１０／２４ペプチドを０−５０μＭの濃度で前処置し、４８時間後にＷＳＴ−８試薬アッセイ法を用いてその増殖能を測定し、４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーを用いたＥＬＩＳＡ法により (Model 550; BioRad, Tokyo, Japan).測定した。

２．免疫共沈法による結合試験
１０／２４ペプチドの特異的な細胞増殖抑制の原因を検討するために、免疫共沈法を用いて、１０／２４ペプチドがＡｋｔキナーゼと特異的に結合することを確認した（図７）。この方法では、AKTキナーゼをヒト２９３細胞に過剰発現し、採取した細胞溶液を１０／２４ペプチド（NH2- - AVTDHPDRLWAWEKF -COOH）と約２時間インキュベーションする。更に、この処置を行った細胞溶液に、Ａｋｔに融合したエピトープに対する特異抗体の結合したアガロースビーズを加え、２−３時間共−インキュベーション（co-incubation）した。その後、この抗体の結合したアガロースビーズを用いて付着する細胞溶液中の分子を免疫沈降し、特異抗体を用いたウエスターンブロット法により、Ａｋｔキナーゼとの結合を検討した。

２．脂質−タンパクプルダウンアッセイ
ＴＣＬ１の１０／２４ペプチドについて、リン脂質−タンパクプルダウンアッセイ（Lipid-protein pull down assay）を行った。
方法：脂質−タンパクプルダウンアッセイは PIP Beads (PI (3,4,5) P3 Echelon Bioscience Incorporated) を使って行った。１０／２４NH2- AVTDHPDRLWAWEKF -COOH またはコントロールとしてβＣ NH2- EKQHAWLPLTIE-COOH) を用いた。５０ｎｇのAKT kinase (unactivated, Upstate Biotechnology, #14-279) を用いて２時間４℃で処置後に２５μｌのＰＩＰ Beads (PI (3,4,5) P3 Echelon Bioscience Incorporated)を加えて(１０ｍＭ Hepes,ｐＨ７．４、０．２５％ＮＰ−４０、１４０ｍＭＮａＣｌ)を含む溶液で洗浄後、Ａｋｔ抗体 (Cell Signaling) を使ってウエスタンブロットを行った（図８）。図左側の３つのレーンでは、１−４００μＭでＡＫＴとの結合をDose−Dependentに抑制しており、図右側のコントロールペプチドでは全く抑制していない。これらの結果から、このペプチド（NH2- - AVTDHPDRLWAWEKF -COOH）はＡｋｔキナ？ゼに対するホスホイノシチド（Phosphoinositide：（PI (3,4,5) P3）の結合を競合的に抑制することが確認された。したがって、これがＡｋｔ活性化抑制の機序と考えられた。

［免疫共沈法による１０／２４ペプチドとＡｋｔサブタイプ分子との結合試験］
免疫共沈法を用いて、１０／２４ペプチドとＡｋｔサブタイプ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３分子との結合試験を行った。
方法：Ａｋｔキナーゼを２９３細胞(ＡＴＣＣ)に過剰発現した細胞溶液、すなわち、ｐＣＭＶ６中のＡｋｔ１、Ａｋｔ２、又はＡｋｔ３を、２９３細胞(ＡＴＣＣ)にカルシウムフォスフェート法により発現させ、過剰発現した細胞を採取し、溶解し、そして、プロテインＧ／Ａアガロース混合物（５０％ｖ／ｖ、ＰｒｏＧ／Ａ、Pharmacia）で前処理した。Ａｋｔ、又はコントロールペプチド（βＣ）を４００μＭで細胞溶解液に添加し、４℃で３時間、ＰｒｏＧ／Ａでインキュベートし、抗Flag Ｍ２抗体（Sigma）を添加した。得られた免疫沈降物を洗浄後、ウエスターンブロット法（anti-HA antibody、3F10, Boehringer Mannheim）により、Ａｋｔキナーゼとの結合を確認した。結果を、図７に示す。図に示されるように、１０／２４ペプチドは、Ａｋｔの３種類のサブタイプ分子、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、及びＡｋｔ３のいずれとも結合した。

［ＧＳＫを基質として用いたＡｋｔキナーゼアッセイによるＡｋｔ活性化抑制効果試験］
Ａｋｔは、ＧＳＫ（Glycogen Synthesis Kinase ３）のリン酸化を促進することがわかっている。このＧＳＫを基質として用いて、Ａｋｔキナーゼアッセイを行い、１０／２４ペプチドによるＡｋｔの活性化抑制試験を行った。
方法：インビトロＡｋｔキナーゼアッセイは(Cell Signaling社製、＃９８４０、)のキットを用いて行った。哺乳細胞から抽出したリコンビナントＡｋｔ蛋白を２００μＭの濃度のペプチドと混合し２時間反応させた。リン酸化反応は４分間、３０度で行った。反応はＳＤＳゲルで解析の後、ウエスタンブロット法によりＧＳＫのリン酸化を定量した。結果を、図８に示す。図８に示されるように、１０／２４ペプチドは、ＡｋｔのＧＳＫペプチドに対するリン酸化能を効果的に抑制（図の左側の３つのレーンで黒いバンドが薄くなっているのがＧＳＫのリン酸化を抑制していることを示している）した。同様なＡｋｔキナーゼ活性抑制効果は1０-2４(AVTDHPDRLWAWEKF)のうちの１１−２３の繰り返し配列を持つペプチド（NH2- VTDHPDRLWAWEK -RRR- VTDHPDRLWAWEK -COOH）を用いても認められた。

［マウス線維芽細胞腫瘍細胞（ＱｒＳＰ−１１）におけるＡｋｔリン酸化の活性化抑制効果試験］
マウス線維芽細胞腫瘍ＱｒＳＰ−１１細胞における１０／２４ペプチドとコントロールペプチドのＡＫＴのリン酸化（セリン４７３残基、スレオニン３０８残基）の活性化抑制効果について検討した。
方法：ＱｒＳＰ−１１細胞を５０ｍＭの濃度のペプチドと１６時間混合する。その後ＰＤＧＦ（PDGF-AB ，Sigma, 3226）で刺激する。細胞を脱リン酸化酵素阻害剤の存在下で溶解し、ＳＤＳゲルで解析、各種抗体(Cell Signaling; anti-Akt #9272, anti-pThr308 #9275L, and anti-pSer473 #9271L)を用いてＥＣＬ (Amersham)によりウェスタンブロットを行う。結果を、図９に示す。図に示されるように、１０／２４ペプチド処理した細胞では図の右端に示す示されるように、セリン４７３とスレオニン３０８のリン酸化が共に抑制されている。すなわち、図の左から２列目及び４列目のような黒いバンドが右端のものでは薄くなっているのが１０／２４ペプチドによってリン酸化の抑制が起こっていることを示している。

［１０／２４ペプチドのＡｋｔの細胞膜移行及び活性化抑制効果試験］
２９３細胞（ＡＴＣＣ）を用い、１０／２４ペプチドのＡｋｔの細胞膜移行及び活性化抑制効果について試験した。
方法：２９３細胞（ＡＴＣＣ）に１ｍｇのＡＫＴをＦｕＧＥＮＥ６(Roche Diagnostics)を用いて過剰発現する。１６時間後血清を除去し、細胞をＰＤＧＦ−ＡＢ(Sigma社製, ＃3226)を用いて１０分間刺激する。細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＦＩＴＣ−conjugated anti-HA抗体(12CA5, MBL)又はphospho-Ser 473抗体（５８７−Ｆ１１，Cell Signaling）を用いて染色し、Nikon社製共焦点顕微鏡を用いて観察する。

結果を、図１０に示す。図に示されるように１０／２４処理をした細胞（ｇ−ｉ）では、コントロールペプチド（ａ−ｆ）と比べてＡｋｔの細胞膜移行や活性化が抑制されているのが確認された（ｄ又はｆに示されるように細胞の周囲が緑又は黄色に光るのであるが、１０／２４ペプチドでは、ｊやｉに示されるように、この効果が抑制されている：参考図面）。すなわち、実験の結果から、１０／２４ペプチドは、細胞内におけるＡＫＴの細胞膜への移行と同時に活性化を抑制することを確認した。本来ＡＫＴは細胞の表面に移行し活性化されるのであるが、１０／２４ペプチドで処理した細胞では、このＡＫＴの膜への移行、活性化が抑制されることを確認した。

［１０／２４ペプチドによるアポトーシスの誘導と抗腫瘍効果］
ヒトＴ白血病細胞株（Ｔ４：human T cell leukemia cells）を用いて１０／２４ペプチドの細胞死に対する効果を検討した。
方法：Ｔ４細胞株を用いた無刺激下で１０／２４ペプチド（１０／２４pepetide NH2――AVTDHPDRLWAWEKF −ＣＯＯＨ）を０−３０μＭの濃度で前処置し、４８時間後にPropidium Iodideで染色し、ＦＡＣＳ（Beckton Dickinson社製）により細胞死（アポトーシス）を判定した。また、この抗腫瘍効果のＡＫＴ依存性を確かめるため、ｍｙｒ−ＡＫＴ（恒常的に活性化されたＡＫＴ）を過剰発現した。
結果を、図１１に示す。図に示されるように、１０／２４ペプチドはコントロールペプチドと比べて、細胞死（アポトーシス）を増強することが判明した。同様な細胞死の増強傾向は、Dexame thasoneによる細胞死の誘導下でも確認された。ｍｙｒ−ＡＫＴを過剰発現した結果、細胞死は抑制され（図１１、△）、１０／２４ペプチドがＡＫＴ依存的に効果を発揮していることが、確認された。

［１０／２４ペプチドによるｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍効果］
移植腫瘍細胞を用いて、１０／２４ペプチドのｉｎｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果を検討した。
方法：マウスの線維芽細胞株ＱｒＳＰ−１１細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの腹壁に移植し、ペプチドによる腫瘍増殖抑制効果を検討した。腫瘍細胞に直接１０／２４ペプチド或いはコントロールペプチドを注入し（1匹について２μＭづつ週に３回投与した、図に矢印で示す。）腫瘍径を測定し、その体積を計算した。結果を、図１２に示す。図に示されるように、１０／２４ペプチドでは腫瘍増殖を効果的に抑制することが確認された。

［１０／２４ペプチド処理によるマウス腫瘍の組織学的な検討］
実施例８の実験的マウス腫瘍を９日目に採取し、肉眼所見、ヘマトキシリン−エオシン（Hematoxylin-Eosin：H&E）染色（細胞の核などの状態を観察する方法）、TUNEL (Tdt-mediated dUTP nick end labeling, #MK500, Takara)免疫染色（アポトーシスというがん細胞の特殊な死に方を組織学的に同定する方法）、phospho Akt (Ser473)モノクローナル抗体（５８７Ｆ１１，Cell Signaling、AKTキナーゼのリン酸化を判定し、活性化を見る方法）により組織学的に検討した。結果を、図１３に示す。

図の写真に示されるように、肉眼的所見においては、１０／２４ペプチド処理ではコントロールと比較して明らかに腫瘍が縮小しているのが観察され、Ｈ＆Ｅ染色においては、１０／２４ペプチド処理では、細胞死が増加しているのが観察され、ＴＵＮＥＬ染色においては、１０／２４ペプチド処理では、アポトーシスの細胞が増加しているのが観察され、また、Ａｋｔ活性化においては、１０／２４ペプチド処理ではＡｋｔの活性化が抑制されているのが観察された。すなわち、１０／２４ペプチド処理によるマウス腫瘍の組織学的な検討により、１０／２４ペプチドは腫瘍の増殖を抑え、アポトーシスを増加させ（Ｈ＆Ｅ，ＴＵＮＥＬ）、また、AKT活性を阻害すること（ｐ４７３染色）が確認された。

本発明の実施例の試験において、構築し、観察された、Ａｋｔと低い相互作用（８ｈポジティブ〔＋〕）を示す１０クローンのアミノ酸置換体について、ＴＣＬ１のアミノ酸配列と並べて示した図である。本発明の実施例の試験において、部位特異的突然変異誘発を用いて導入したＴＣＬ１の変異体（Ｄ１６Ｇ、Ｋ３０Ｍ、Ｑ４６Ｒ、Ｉ７４Ｖ、又はＭ１０６Ｖ）と野生型ＴＣＬ１を用いて、β−Ｇａｌリフティングアッセイを行った結果を示す図である。本発明の実施例の試験において、部位特異的突然変異誘発を用いて導入したＴＣＬ１の変異体（Ｄ１６Ｇ、Ｋ３０Ｍ、Ｑ４６Ｒ、Ｉ７４Ｖ、又はＭ１０６Ｖ）と野生型ＴＣＬ１を用いて、定量的液体β−Ｇａｌアッセイを行った結果を示すを示す図である。本発明の実施例の試験において、ＴＣＬ１−誘導Ａｋｔ活性化に必要な、Ａｋｔ及びＴＣＬ１ホモダイマーによる会合を調べるために、野生型ＴＣＬ１について、ｉｎ vitro キナーゼアッセイを行った結果を示す図である。本発明の実施例の試験において、ＴＣＬ１−誘導Ａｋｔ活性化に必要な、Ａｋｔ及びＴＣＬ１ホモダイマーによる会合を調べるために、変異ＴＣＬ１（３６−３８ＡＴＣＬ１）について、ｉｎ vitroキナーゼアッセイを行った結果を示す図である。本発明の実施例の試験において、ＡＫＴ活性化に伴う細胞の増殖を特異的に抑制することを確認するために、ＴＬＣ１オンコジーンのアミノ酸酸残基配列１０／２４ペプチドを用いてＭＴＴアッセイを行った結果を示す図である。本発明の実施例の試験において、免疫共沈法を用いて、１０／２４ペプチドとＡｋｔサブタイプ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３分子との結合試験を行った結果のウェスタンブロットの写真である。本発明の実施例の試験において、ＧＳＫ（Glycogen Synthesis Kinase ３）を基質として用いて、Ａｋｔキナーゼアッセイを行い、１０／２４ペプチドによるＡｋｔの活性化抑制試験を行った結果のウェスタンブロットの写真である。本発明の実施例の試験において、マウス線維芽細胞腫瘍ＱｒＳＰ−１１細胞における１０／２４ペプチドとコントロールペプチドのＡＫＴのリン酸化（セリン４７３残基、スレオニン３０８残基）の活性化抑制効果について、各種抗体を用いてウェスタンブロットを行った結果の写真である。本発明の実施例の試験において、２９３細胞（ＡＴＣＣ）を用い、１０／２４ペプチドのＡｋｔの細胞膜移行及び活性化抑制効果について試験した結果の顕微鏡を用いて観察した写真である。本発明の実施例の試験において、ヒトＴ白血病細胞株（Ｔ４：human T cell leukemia cells）を用いて１０／２４ペプチドの細胞死に対する効果を検討した結果を示す図である。本発明の実施例の試験において、移植腫瘍細胞を用いて、１０／２４ペプチドのｉｎｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果を検討した結果を示す図である。本発明の実施例の試験において、移植腫瘍細胞を用いて、１０／２４ペプチドのｉｎｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果を検討した実験的マウス腫瘍を９日目に採取し、肉眼所見、肉眼的所見における観察、Ｈ＆Ｅ染色における観察、ＴＵＮＥＬ染色における観察、Ａｋｔ活性化における観察の結果を示す写真である。

Claims

配列表の配列番号１、配列番号７、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるＡｋｔのキナーゼ活性を特異的に抑制するポリペプチド。
配列表の配列番号１、配列番号７、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端及びＣ末端のそれぞれ１個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなり、かつＡｋｔのキナーゼ活性を特異的に抑制するポリペプチド。
以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
(ａ)配列番号１、配列番号７、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(ｂ)配列番号１、配列番号７、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端及びＣ末端のそれぞれ１個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなり、かつＡｋｔのキナーゼ活性を特異的に抑制するポリペプチド。
配列番号２、配列番号８、又は配列番号１０に示される塩基配列を含み、かつＡｋｔのキナーゼ活性を特異的に抑制するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
請求項３又は４記載のＡｋｔのキナーゼ活性を特異的に抑制するポリペプチドをコードするＤＮＡを、遺伝子発現ベクターに組込んで構築したことを特徴とする組換え発現ベクター。
請求項５記載の組換え発現ベクターを宿主細胞に導入し、発現することを特徴とするＡｋｔのキナーゼ活性を特異的に抑制するポリペプチドを製造する方法。
請求項１又は２記載のポリペプチドを有効成分とするＡｋｔのキナーゼ活性の特異的阻害剤。
ポリペプチドがヒトＴＣＬ１のタンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸残基１０〜２４の配列であることを特徴とする請求項７記載のＡｋｔのキナーゼ活性の特異的阻害剤。
ポリペプチドがマウスＴＣＬ１のタンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸残基９〜２４の配列であることを特徴とする請求項７記載のＡｋｔのキナーゼ活性の特異的阻害剤。
ポリペプチドがラットＴＣＬ１のタンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸残基９〜２４の配列であることを特徴とする請求項７記載のＡｋｔのキナーゼ活性の特異的阻害剤。
請求項１又は２記載のポリペプチドを有効成分とする、ホスホイノシチドのＡｋｔへの結合の阻害剤。
請求項１又は２記載のポリペプチドを有効成分とする抗腫瘍剤。
抗腫瘍剤が、悪性腫瘍の予防、治療のための薬剤であることを特徴とする請求項１２記載の抗腫瘍剤。
悪性腫瘍の治療が、乳がん、肺がん、白血病、又はリンパ系腫瘍の予防、治療であることを特徴とする請求項１３記載の抗腫瘍剤。
請求項３又は４記載のＡｋｔのキナーゼ活性を特異的に抑制するポリペプチドをコードするＤＮＡを生体細胞（ヒト生体細胞を除く）に導入し、該ポリペプチドを発現することにより、Ａｋｔのキナーゼ活性を特異的に抑制する方法。