ES2946052T3 - Compuesto de epiditiodioxopiperazina o sus derivados, y el uso del mismo - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un derivado de epiditiodioxopiperazina representado por la fórmula química 1 o su derivado reducido; un método para preparar un compuesto representado por la fórmula química 1 que tiene una permeabilidad intracelular mejorada y que imita la actividad de 2-Cys-Prx en su forma reducida en las células; una composición farmacéutica para prevenir o tratar enfermedades vasculares que comprende un compuesto de epiditiodioxopiperazina o sus derivados o sus sales farmacéuticamente aceptables como ingrediente activo; un dispositivo de administración de fármacos para administración local que incluye la composición farmacéutica; y una composición farmacéutica para inhibir la metástasis de melanoma que comprende el compuesto de epiditiodioxopiperazina o sus derivados o sus sales farmacéuticamente aceptables como ingrediente activo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Compuesto de epiditiodioxopiperazina o sus derivados, y el uso del mismo

[Campo técnico]

La presente invención se refiere a un derivado de epiditiodioxopiperazina representado por la siguiente Fórmula química 1; a u n método para preparar un compuesto representado por la Fórmula química 1 que tiene una permeabilidad intracelular mejorada y que imita la actividad de 2-Cys-Prx en su forma reducida en las células; a una composición farmacéutica para prevenir o tratar vasculopatías que comprende un compuesto de epiditiodioxopiperazina o sus derivados o sales farmacéuticamente aceptables del mismo como ingrediente activo; y a una composición farmacéutica para inhibir la metástasis del melanoma que comprende el compuesto de epiditiodioxopiperazina o sales farmacéuticamente aceptables del mismo como ingrediente activo.

[Técnica anterior]

La arteroesclerosis se refiere a un estado en el que se desarrollan inflamaciones por la acumulación de placas de grasa que contienen colesterol, fosfolípidos, calcio y similares en la íntima vascular, y el riego sanguíneo se inhibe por la pérdida de resiliencia de las arterias y su estrechamiento, o la ruptura o la disección de los vasos sanguíneos debido al aumento de la presión. En particular, la arterioestenosis que se desarrolla a partir de la misma reduce el riego sanguíneo provocando una carencia de nutrientes y oxígeno, y esto se convierte en la causa principal de vasculopatías. Las vasculopatías generalmente incluyen la arterioesclerosis, las cardiopatías tales como insuficiencia cardíaca, cardiopatía hipertensiva, arritmia, infarto de miocardio y angina de pecho, y las vasculopatías tales como ictus y vasculopatía periférica.

Como métodos para superar esta angioestenosis, existe la cirugía de injerto arterial que es un método quirúrgico y la angioplastia percutánea que es un método vasodilatador que no acompaña a la cirugía. La angioplastia percutánea incluye la dilatación con globo vascular percutáneo, el injerto con stent vascular percutáneo y similares. La dilatación con globo vascular percutáneo es un método para insertar un conducto guía a través de las arterias femoral o braquial y ubicar el conducto en el punto de entrada vascular con una lesión, ubicando un conducto al que se une un globo al final en el área de estenosis vascular a través del interior de este conducto guía, ensanchando después el vaso sanguíneo estrechado inflando el globo y presionando la placa y similares, mejorando de este modo el flujo sanguíneo del vaso sanguíneo. Además, el injerto con stent es un método para ubicar el globo cubierto con una malla de alambre en el área de la estenosis y después cubrir la pared interna del vaso sanguíneo inflando el globo, y el stent como este se usa para tratar las complicaciones provocadas por el inflado del globo, puesto que la incidencia de reestenosis es baja en comparación con un procedimiento independiente de dilatación con globo, y el stent actúa como soporte con respecto a la pared interna vascular. Este procedimiento intervencionista que usa angioplastia es más simple que un método que implica una operación quirúrgica, reduce el riesgo debido a la anestesia general y tiene altas tasas de éxito, lo que hace que sea ampliamente utilizado a nivel mundial.

La reestenosis vascular es un diagnóstico realizado por angiografía y se refiere a un caso en el que la estenosis del diámetro del vaso es del 50 % o más en una angiografía de seguimiento después de la angioplastia. Dado que la cantidad de procedimientos que usan stents ha aumentado en aproximadamente un 70 %, la incidencia de reestenosis ha disminuido; sin embargo, la reestenosis vascular todavía se desarrolla a una tasa de aproximadamente el 30 % en pacientes que se han sometido a angioplastia (dilatación con globo e injerto con stent). Aunque aún no se ha establecido con exactitud el mecanismo de la reestenosis, se sabe que se secretan localmente un factor de crecimiento y una citocina debido a la lesión de las células endoteliales durante un procedimiento, y el factor de crecimiento y la citocina inducen la proliferación y la migración del músculo liso vascular, estrechando de este modo el lumen aórtico y dando como resultado la reestenosis. En consecuencia, la proliferación de células de músculo liso se ha reconocido recientemente como un problema clínico importante que limita la eficacia de la angioplastia. Como resultado, se han desarrollado y utilizado en ensayos clínicos stents mejorados que liberan fármacos o materiales que inhiben la proliferación de células de músculo liso vascular. Sin embargo, los fármacos que se usan actualmente para este fin tienen una limitación en su uso en ensayos clínicos puesto que los fármacos son altamente tóxicos y, por lo tanto, previenen la hiperplasia de la íntima a través del mecanismo de destrucción de las células del músculo liso vascular, y la toxicidad destruye las células endoteliales así como las células del músculo liso. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar fármacos capaces de facilitar la recuperación de las capas de células endoteliales lesionadas suprimiendo selectivamente al mismo tiempo el crecimiento de las células del músculo liso vascular.

Mientras tanto, se ha demostrado que la gliotoxina (GT), un material representativo que tiene una estructura de epiditiodioxopiperazina (ETP), ejerce diversas actividades farmacológicas, tales como actividades de supresión inmunitaria, antineoplásicas y antivíricas. Además, también se ha demostrado que la quetocina y la quetomina, que son derivados de la epiditiodioxopiperazina, tienen actividades antineoplásicas.

Como se ha descrito anteriormente, se han realizado numerosos esfuerzos para buscar dianas moleculares para utiizar compuestos de epiditiodioxopiperazina como agentes terapéuticos. Como resultado, se ha demostrado que la gliotoxina inhibe varias enzimas tales como NF-kB, farnesiltransferasa y NOx2 fagocítica, mientras que la quetocina inhibe la tiorredoxina reductasa o la histona metiltransferasa. Además, se ha demostrado que la quetomina inhibe la interacción entre el factor 1 inducible por hipoxia (HIF-1) y p300. A pesar del hecho de que se han identificado actividades celulares parciales de los compuestos de ETP, ha sido difícil deducir una correlación lógica entre sus estructuras químicas y sus actividades celulares debido a la diversidad de sus estructuras. Más específicamente, no se ha descubierto la actividad fisiológica ni la función celular de la estructura del anillo de ditiocetopiperazina, que se conoce como una estructura común del compuesto de ETP y sus derivados.

Hui Jiang y col. (Australian Journal of Chemistry, vol. 46, 1993, páginas 1743-1754) describen compuestos de Fórmula química I, véase a continuación, que comprenden grupos alquilo como grupos R2 y R4. Alanna M. Hume y col. (Biorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 7, N.° 20, 1997, páginas 2645-2650) describen compuestos de Fórmula química I, véase a continuación, que comprenden grupos etilo como grupos R2 y R4.

Hilton S. y col. (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol.15, n.° 9, 2 de mayo de 2005, páginas 2239-2242) describen compuestos de la familia de las 3,3-epiditiopiperazina-2,5-dionas. Los compuestos difieren de los compuestos de Fórmula química I, véase a continuación, en que R4 es un grupo bencilo sin sustituir o un grupo metilo.

[Descripción]

[Problema técnico]

En vista de lo anterior, los inventores de la presente invención han realizado diversos esfuerzos para buscar materiales capaces de prevenir o tratar vasculopatías mediante la imitación de la actividad de 2-Cys-Prx, que se sabe que suprime la hiperplasia de la íntima y, basándose en la idea de que los compuestos de ETP presentan la actividad de la peroxirredoxina II (PrxII), un tipo de 2-Cys-Prx, en las células, sintetizaron una serie de derivados de ETP novedosos que tienen un enlace de puente disulfuro intramolecular y demostraron que los derivados inhiben la proliferación y la migración inducibles por PDGF en células de músculo liso vascular y promueven la proliferación y la migración inducibles por VEGF en células endoteliales mediante la imitación de la actividad intracelular de PrxII y, por lo tanto, impiden la hiperplasia de la íntima debido al exceso de proliferación de células de músculo liso vascular y potencian la recuperación de capas de endotelio vascular, es decir, reendotelización, y, en última instancia, son útiles para prevenir o tratar vasculopatías. Además, basándose en la idea de que los compuestos de ETP pueden imitar la actividad intracelular de 2-Cys-Prx, en particular, PrxII, los inventores han demostrado que los compuestos de ETP pueden inhibir la metástasis del melanoma maligno inducida por la deficiencia o inactivación de PrxII, completando de este modo la presente invención.

[Solución técnica]

Es un objeto de la presente invención proporcionar un derivado de epiditiodioxopiperazina representado por la siguiente Fórmula química 1 o su sal farmacéuticamente aceptable como se cita en la reivindicación 1

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición que comprenda el derivado.

Otro objeto más de la presente invención es proporcionar un método para preparar el compuesto representado por la Fórmula química 1 que tenga una permeabilidad intracelular mejorada y que imite la actividad de 2-Cys-Prx en su forma reducida en las células, incluyendo el método la etapa de formar un enlace de puente disulfuro intramolecular a partir de un derivado de dimercaptopiperazinadiona representado por la siguiente Fórmula química 2 usando una reacción de oxidación:

Otro objeto más de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de vasculopatías que comprende el compuesto de epiditiodioxopiperazina representado por la Fórmula química 1 o sales farmacéuticamente aceptables del mismo como se cita en la reivindicación 8 como ingrediente activo.

Otro objeto más de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica para su uso para inhibir la metástasis del melanoma que incluye el compuesto de epiditiodioxopiperazina representado por la Fórmula química 1 o sales farmacéuticamente aceptables del mismo como se cita en la reivindicación 11 como ingrediente activo.

La presente invención se refiere a una serie de derivados de epiditiodioxopiperazina novedosos, y el derivado incluye un enlace de puente disulfuro intramolecular que, por lo tanto, tiene una permeabilidad intracelular mejorada y se reduce rápidamente a un compuesto que tiene 2 grupos tiol en las células, suprimiendo de este modo la hiperplasia de la íntima mediante la imitación de la función de la isoforma de PrxII particularmente entre 2-Cys-Prx e inhibiendo la migración y la proliferación de células del músculo liso vascular inducidas por PDGF, mejorando al mismo tiempo la reendotelización mediante la promoción de la migración y la proliferación de células endoteliales inducidas por VEGF. En consecuencia, los derivados de epiditiodioxopiperazina según la presente invención son útiles como composiciones farmacéuticas para prevenir o tratar vasculopatías. Además, los derivados son para su uso en el tratamiento del melanoma, puesto que los derivados pueden inhibir la metástasis del melanoma imitando una actividad de PrxII intracelular.

[Descripción de los dibujos]

La FIG. 1 es un diagrama que muestra las actividades catalíticas del Compuesto A1 para la reducción de peróxido de hidrógeno. Vo en los gráficos de las FIG. 1-4 indica la velocidad de reacción de reducción, que se representa por la cantidad de peróxidos de hidrógeno reducidos por minuto (nmol/min).

La FIG. 2 es un diagrama que muestra la actividad catalítica del Compuesto A2, teniendo el Compuesto A2R un grupo ditiol mediante la reducción del enlace de puente disulfuro intramolecular de A2 como ejemplo comparativo, y el Compuesto A3 para la reducción con peróxido de hidrógeno.

La FIG. 3 es un diagrama que muestra la actividad catalítica del Compuesto A4, teniendo el Compuesto A4R un grupo ditiol mediante la reducción del enlace de puente disulfuro intramolecular de A4 como ejemplo comparativo, y el Compuesto A5, teniendo el Compuesto A5R un grupo ditiol mediante la reducción del enlace de puente disulfuro intramolecular de A5 para la reducción de peróxido de hidrógeno.

La FIG. 4 es un diagrama que muestra las actividades catalíticas de los Compuestos A6, A7, A8 y A9 para la reducción de peróxido de hidrógeno.

La FIG. 5 es un diagrama que muestra actividades catalíticas de los compuestos de ETP para la reducción de peróxido de hidrógeno. (a) a (c) muestran el poder reductor de peróxido de hidrógeno de la gliotoxina, la quetocina y la quetomina, respectivamente. Se realiza una reacción de peroxidasa in vitro mediante la adición de un compuesto de ETP 25 μM cada uno bajo el sistema de oxidación-reducción de acoplamiento especificado en el gráfico. (d) a (f) son diagramas que muestran las actividades peroxidasa dependientes de Trx típicas de los compuestos de ETP. La reacción se realiza sumando los factores del sistema de acoplamiento Trx/TR especificados en el gráfico. Se muestran las curvas de reacción representativas de tres experimentos. (g) es un diagrama que muestra las actividades peroxidasa dependientes de la concentración de los compuestos de ETP. La velocidad inicial se presenta como media ± error estándar de 3 experimentos independientes. Se usa bis(metiltio)gliotoxina en la que el enlace de puente disulfuro está reducido y metilado como grupo de control negativo.

La FIG. 6 es un diagrama que muestra los resultados experimentales de citotoxicidad para (A) células de músculo liso aórtico humanas (CMLAH) y (B) células endoteliales aórticas humanas (CEAH) del Compuesto A1 como porcentaje de células vivas.

La FIG. 7 es un diagrama que muestra los resultados experimentales de citotoxicidad para (A) células de músculo liso aórtico humanas (CMLAH) y (B) células endoteliales aórticas humanas (CEAH) del Compuesto A2, el Compuesto A2R como ejemplo comparativo, y el Compuesto A3 como porcentaje de células vivas.

La FIG. 8 es un diagrama que muestra los resultados experimentales de citotoxicidad para (A) células de músculo liso aórtico humanas (CMLAH) y (B) células endoteliales aórticas humanas (CEAH) del compuesto A4, el Compuesto A4R como ejemplo comparativo, el Compuesto A5 y su ejemplo comparativo A5R como porcentaje de células vivas. La FIG. 9 es un diagrama que muestra los resultados experimentales de citotoxicidad para (A) células de músculo liso aórtico humanas (CMLAH) y (B) células endoteliales aórticas humanas (CEAH) de los Compuestos A6 a A9 como porcentaje de células vivas.

La FIG. 10 es un diagrama que muestra los resultados experimentales de citotoxicidad in vitro e in vivo de GT y quetocina. (a) y (d) son fotomicrografías de células de músculo liso aórtico humanas (CMLAH) y células epiteliales aórticas humanas (CEAH) tratadas con GT en las concentraciones indicadas en los gráficos. (b) y (c) son diagramas que muestran la viabilidad dependiente de la concentración de las CMLAH cuando se tratan con GT o quetocina, respectivamente, y (e) y (f) son diagramas que muestran la viabilidad de las CEAH cuando se tratan con GT o quetocina, respectivamente. En la presente memoria, después de que cada compuesto de ETP se pretrata con las células privadas de suero en un medio basal que contiene FBS al 0,5 % durante 2 horas a las concentraciones indicadas, las células se recogen y se tiñen con azul de tripano para comprobar la viabilidad. La viabilidad se presenta como el porcentaje de células vivas sin teñir respecto al número total de células. (g) es un diagrama que muestra la citotoxicidad in vivo de GT en arterias carótidas de rata. Se inyecta GT en el lumen de vasos arteriales carotídeos lesionados por globo a las concentraciones indicadas y se incuban durante 30 minutos. DMSO se usa como grupo de control. Se muestran imágenes de tinción con HE representativas, y la relación entre la íntima y la media medida a partir de muestras de arteria carótida teñidas con HE se presenta como media ± error estándar (n = 7 por grupo). La muerte celular se evalúa mediante la tinción TUNEL de secciones de parafina de vasos arteriales carotídeos lesionados por globo (izquierda), calculada como el porcentaje de células positivas para TUNEL por células positivas para DAPI (derecha).

La FIG. 11 muestra la capacidad de regulación recíproca del peróxido de hidrógeno dependiente de PDGF y VEGF por gliotoxina en CMLAH y CEAH inyectadas con ARNip de PrxII y pretratadas durante 2 horas con DMSO (grupo de control) o GT. (a) y (b) cada uno muestra el nivel de peróxido de hidrógeno intracelular en CMLAH y CEAH como imágenes de fluorescencia de DCF e intensidades relativas. El gráfico muestra la intensidad de fluorescencia de DCF relativa promediando la fluorescencia de 50 a 80 células como media ± error estándar (n = 3, *p < 0,01, **p < 0,001).

La FIG. 12 (a) es un diagrama que muestra los efectos de la GT sobre la fosforilación de tirosina inducida por PDGF en CMLAH con PrxII atenuada como análisis por inmunotransferencia, y la FIG. 12 (b) es un diagrama que muestra los efectos de la GT sobre la fosforilación de tirosina inducida por VEGF en CEAH con PrxII atenuada como análisis por inmunotransferencia. Se muestran transferencias representativas de la fosforilación de tirosina total (pTyr) de 3 experimentos repetidos mediante un anticuerpo antifosfotirosina (4G10). Además, la activación de PDGFR-p y PLCy1 en CMLAH y la activación de VEGFR y Erk en CEAH se muestran como transferencias representativas. La FIG. 13 es un diagrama que muestra los efectos de la GT sobre la proliferación y la migración inducidas por factor de crecimiento de células vasculares con PrxII atenuada. (a) y (b) son diagramas que muestran los efectos de la GT sobre la proliferación y la migración de CMLAH, respectivamente, en respuesta a PDGF, y (c) y (d) son diagramas que muestran los efectos de la GT sobre la proliferación y la migración de CEAH, respectivamente, en respuesta a VEGF. El factor de aumento de cada célula se presenta como media ± error estándar (n = 3, *p < 0,05, **p < 0,001). La FIG. 14 es un diagrama que muestra los efectos del Compuesto A1 sobre la proliferación y la migración inducidas por factor de crecimiento de células vasculares con PrxII atenuada. A representa los efectos sobre la proliferación y la migración de CMLAH en respuesta a PDGF y B representa los efectos sobre la proliferación y la migración de CEAH en respuesta a VEGF.

La FIG. 15 es un diagrama que muestra los efectos del Compuesto A2 sobre la proliferación y la migración inducidas por factor de crecimiento de células vasculares con PrxII atenuada. A representa los efectos sobre la proliferación y la migración de CMLAH en respuesta a PDGF y B representa los efectos sobre la proliferación y la migración de CEAH en respuesta a VEGF.

La FIG. 16 es un diagrama que muestra los efectos del Compuesto A2R, un ejemplo comparativo del Compuesto A2, sobre la proliferación y la migración inducidas por factor de crecimiento de células vasculares con PrxII atenuada. A representa los efectos sobre la proliferación y la migración de CMLAH en respuesta a PDGF y B representa los efectos sobre la proliferación y la migración de CEAH en respuesta a VEGF. Estos resultados muestran que la forma reducida de los derivados de la presente invención en los que se ha reducido el enlace de puente disulfuro no se puede introducir en una célula.

La FIG. 17 es un diagrama que muestra los efectos del Compuesto A3 sobre la proliferación y la migración inducidas por factor de crecimiento de células vasculares con PrxII atenuada. A representa los efectos sobre la proliferación y la migración de CMLAH en respuesta a PDGF y B representa los efectos sobre la proliferación y la migración de CEAH en respuesta a VEGF.

La FIG. 18 es un diagrama que muestra los efectos de los Compuestos A4 y A5 y los Compuestos A4R y A5R que son ejemplos comparativos de los mismos sobre la proliferación inducida por factor de crecimiento de células vasculares con PrxII atenuada. A representa los efectos sobre la proliferación de CMLAH en respuesta a PDGF y B representa los efectos sobre la proliferación de CEAH en respuesta a VEGF.

La FIG. 19 es un diagrama que muestra los efectos del Compuesto A5 sobre la migración inducida por factor de crecimiento de células vasculares con PrxII atenuada. A representa los efectos sobre la migración de CMLAH en respuesta a PDGF y B representa los efectos sobre la migración de CEAH en respuesta a VEGF.

La FIG. 20 es un diagrama que muestra los efectos de los Compuestos A6 a A9 sobre la proliferación inducida por factor de crecimiento de células vasculares con PrxII atenuada. A representa los efectos sobre la proliferación de CMLAH en respuesta a PDGF y B representa los efectos sobre la proliferación de CEAH en respuesta a VEGF. La FIG. 21 es un diagrama que muestra los efectos del Compuesto A8 sobre la migración inducida por factor de crecimiento de células vasculares con PrxII atenuada. A representa los efectos sobre la migración de CMLAH en respuesta a PDGF y B representa los efectos sobre la migración de CEAH en respuesta a VEGF.

La FIG. 22 es un diagrama que muestra los efectos de la GT y la quetocina sobre la actividad de NOx en CMLAH y CEAH. CMLAH (a) y CEAH (b) se privan de suero en un medio basal que contiene FBS al 0,5 %, después se pretratan durante 2 horas con las concentraciones indicadas de GT o quetocina y se tratan durante 10 minutos con PDGF o VEGF. Como Datos, la presentación de la cantidad de superóxido en células estimuladas frente a células sin estimular se presenta como media ± error estándar (n = 3,*p< 0,05,**p <0,001).

La FIG. 23 es un diagrama que muestra los efectos de la GT sobre la supresión de la hiperplasia de la íntima vascular y la promoción de la reendotelización en arterias carótidas lesionadas por globo. (a) son imágenes de tinción con HE representativas que muestran hiperplasia de la íntima según el tiempo durante un período de recuperación en arterias carótidas lesionadas por globo. La relación entre la íntima y la media medida a partir de secciones de arteria carótida teñidas con HE se presenta como media ± error estándar (n = 4 por grupo). (b) indica sobreoxidación de 2-Cys-Prx en vasos arteriales carotídeos inducida por lesión por globo y la inmunohistoquímica se realiza usando un anticuerpo anti-2-Cys-Prx (Prx-SO2/3) sobreoxidado. Para un control positivo, se tiñen vasos arteriales carotídeos normales tratados con una solución de peróxido de hidrógeno durante 10 minutos. El péptido antigénico bloqueante elimina la señal inmunopositiva. Las imágenes de tinción con DAB representativas se muestran a partir de 4 muestras independientes. (c) muestra el resultado del análisis por inmunotransferencia para la sobreoxidación de 2-Cys-Prx intracelular usando extractos arteriales de carótida lesionada. A modo de comparación, se cargan juntos extractos de vasos arteriales carotídeos normales tratados con peróxido de hidrógeno.

La FIG. 24 es un diagrama que muestra los efectos de la inyección in vivo de ARNip de PrxII sobre la promoción de la hiperplasia de la íntima en arterias carótidas lesionadas por globo. (a) muestra los efectos de la atenuación de PrxII para la hiperplasia de la íntima inducida por la lesión por globo como imágenes de tinción con HE representativas. La relación entre la íntima y la media medida a partir de secciones de arteria carótida teñidas con HE se presenta como media ± error estándar (n = 7 por grupo, *p < 0,01). (b) es el resultado de la transferencia Western de extractos de arteria carótida lesionada para PrxII de rata. (c) es el resultado de la tinción por inmunofluorescencia de PrxII de rata en secciones de tejido de arteria carótida lesionada. Esto representa la atenuación de PrxII intrínseca por inyección de ARNip en arterias carótidas lesionadas por globo.

La FIG. 25 es un diagrama que muestra los efectos de la GT sobre la hiperplasia de la íntima y la regeneración de la capa endotelial en arterias carótidas de rata lesionadas por globo, (a) es un diagrama que muestra la íntima vascular de arterias carótidas de rata lesionadas por globo después de tratarlas con un grupo de control y GT. Se muestran imágenes de tinción con HE representativas que se obtienen tratando con DMSO y GT cada una y después incubando durante 30 minutos. La flecha indica la capa de íntima vascular engrosada. La relación entre la íntima y la media medida a partir de muestras de arteria carótida teñidas con HE se presenta como media ± error estándar (n = 9 por grupo, *p < 0,01). (b) es un diagrama que muestra el resultado de la tinción por inmunofluorescencia de aactina de músculo liso (SMA) y CD31 (n = 3). Los vasos arteriales carotídeos normales muestran una monocapa endotelial típica (flecha). La tinción por DAPI muestra núcleos.

La FIG. 26 es un diagrama que muestra imágenes de tinción con HE según el tratamiento con bis-(metiltio)GT sola o inhibidor de GT+TR (DNCB, auranofina) para la hiperplasia de la íntima inducida por lesión por globo.

La FIG. 27 es un diagrama que muestra el resultado de la tinción por inmunohistoquímica que verifica los efectos de la GT sobre la sobreoxidación de 2-Cys-Prx.

La FIG. 28 es un diagrama que muestra que A1 a A3, A5, A6 y A8, que son derivados de ETP, inhiben la proliferación de células de músculo liso de la neαntima. Se muestran imágenes de tinción con HyE representativas, y los datos que se muestran en el gráfico son la relación entre la íntima y la media medida a partir de secciones de arteria carótida teñidas con HE y se presentan como media ± error estándar (*p < 0,01). N.S. significa no significativo.

La FIG. 29 es un diagrama que muestra que la reendotelización se induce cuando un modelo de arteria carótida lesionada por globo se trata con A1 a A3, A5, A6 y A8 que son derivados de ETP. Se realiza una cotinción de CD31 y a-actina de músculo liso (SMA) en arterias carótidas lesionadas tratadas con DMSO o los derivados de ETP, y se indican las partes correspondientes. La flecha indica el área de la neαntima engrosada y la punta de flecha indica una monocapa endotelial típica de arterias carótidas tratadas con los derivados de ETP. Los núcleos se tiñen con DAPI. Se muestran imágenes representativas de 2 experimentos independientes.

La FIG. 30 es un diagrama que muestra los efectos de la GT sobre la permeabilidad vascular y el estado de la superficie luminal en arterias carótidas de rata lesionadas por globo. (a) muestra la extensión del flujo de entrada de azul de Evans dentro de vasos arteriales carotídeos de rata lesionados con globo tratados con un grupo de control y GT. En el lado izquierdo, se muestran imágenes representativas, y en el gráfico del lado derecho, el azul de Evans que fluyó en el vaso sanguíneo se extrae y la absorbancia a 620 nm se presenta como media ± error estándar (n = 7 por grupo, * p < 0,01). (b) es un resultado de examen con microscopio electrónico de barrido de la superficie luminal de vasos arteriales carotídeos de rata lesionados con globo tratados con un grupo de control y GT. Se realizan 3 experimentos independientes y se muestran imágenes ampliadas representativas.

La FIG. 31 es un diagrama que muestra los efectos del tratamiento con quetocina sobre la proliferación y la migración celulares. Las CMLAH ((a) y (b)) y las CEAH ((c) y (d)) con PrxII atenuada se pretratan con quetocina durante 2 horas y se estimulan con PDFG o VEGF durante 24 horas. El factor de aumento se presenta como media ± error estándar en el gráfico (n = 3, *p < 0.01, **p < 0,005, #p < 0,001).

La FIG. 32 es un diagrama que muestra los efectos de la quetocina y la quetomina sobre la hiperplasia de la íntima inducida por lesión por globo. Las arterias carótidas de rata lesionadas por globo se incuban con quetocina o quetomina durante 30 minutos. Se usa DMSO como grupo de control y se muestran imágenes de tinción con HE representativas ((a) y (b)). La punta de flecha indica la capa de íntima vascular engrosada. La relación entre la íntima y la media medida a partir de muestras de arteria carótida teñidas con HE se presenta como media ± error estándar (n = 9 por grupo, *p < 0,01). (c) y (d) muestran los resultados de la tinción por inmunofluorescencia de a-actina de músculo liso (SMA) y CD31. La flecha indica una monocapa endotelial.

La FIG. 33 es un diagrama que muestra los efectos de diversos compuestos antioxidantes sobre la señalización de VEGF en CEAH. Se inyecta ARNip de PrxII a CEV y el resultado se pretrata con concentraciones crecientes de los compuestos indicados (N-acetilcisteína; NAC, hidroxianisol butilado; BHA) durante 2 horas. Las células se tratan con VEGF durante 10 minutos y después se analizan mediante inmunotransferencia.

La FIG. 34 es un diagrama que muestra los resultados de transferencia Western que verifican los efectos de la GT sobre la fosforilación de tirosina dependiente de PDGF y VEGF en células vasculares deficientes en PrxII y ((a), (b)), y los resultados de la tinción con HE que verifican los efectos de la GT sobre la hiperplasia de la íntima vascular inducida por ligadura en ratones deficientes en PrxII.

La FIG. 35 es un diagrama que muestra un espectro de RMN 1H del Compuesto A1 (Fórmula química 15)

La FIG. 36 es un diagrama que muestra un espectro de RMN 1H del Compuesto A2 (Fórmula química 7).

La FIG. 37 es un diagrama que muestra un espectro de RMN 1H del Compuesto A2R.

La FIG. 38 es un diagrama que muestra un espectro de RMN 1H del Compuesto A3 (Fórmula química 8).

La FIG. 39 es un diagrama que muestra un espectro de RMN 1H del Compuesto A4 (Fórmula química 9).

La FIG. 40 es un diagrama que muestra un espectro de RMN 1H del Compuesto A4R.

La FIG. 41 es un diagrama que muestra un espectro de RMN 1H del Compuesto A5 (Fórmula química 10)

La FIG. 42 es un diagrama que muestra un espectro de RMN 1H del Compuesto A5R.

La FIG. 43 es un diagrama que muestra un espectro de RMN 1H del Compuesto A6 (Fórmula química 11)

La FIG. 44 es un diagrama que muestra un espectro de RMN 1H del Compuesto A7 (Fórmula química 12)

La FIG. 45 es un diagrama que muestra un espectro de RMN 1H del Compuesto A8 (Fórmula química 13)

La FIG. 46 es un diagrama que muestra un espectro de RMN 1H del Compuesto A9 (Fórmula química 14)

La FIG. 47 es un diagrama que muestra los efectos de PrxII (Prx2) sobre la proliferación y la migración de estirpes celulares de melanoma. A muestra el nivel de expresión de PrxII en 4 tipos diferentes de estirpes celulares de melanoma (SK5, SK₂8, A375 y G361). B muestra el nivel de peróxido de hidrógeno intracelular de las estirpes celulares de melanoma. El nivel de peróxido de hidrógeno intracelular se detecta usando DCFH-DA, un colorante sensible a la oxidación, y se cuantifica. Se muestran imágenes representativas y las barras en el gráfico son la media ± desviación estándar de los valores de fluorescencia relativos promediados de 60 a 80 células. C es un diagrama que muestra las comparaciones de actividad proliferativa entre las estirpes celulares de melanoma. D y E son diagramas que muestran las comparaciones de actividad migratoria entre las estirpes celulares de melanoma, y las actividades se miden mediante el ensayo de transmigración quimiotáctica (D) y el ensayo de cicatrización de heridas (E). El experimento se repite 3 veces (*P < 0,01,**P < 0,005).

La FIG. 48 es un diagrama que muestra los efectos de la inhibición de la proliferación y la migración por la expresión de PrxII en estirpes celulares SK-MEL deficientes en PrxII. A es un diagrama que muestra la expresión retrovírica de PrxII en estirpes celulares SK-MEL. B a D son diagramas que muestran cada uno la proliferación (B) y la migración (C y D) de estirpes celulares SK-MEL de grupo de control (vec) y que expresan PrxII. Las células se infectan con retrovirus de control y que codifican PrxII durante 24 horas. El experimento se repite 3 veces (*P < 0,01, **P < 0,005).

La FIG. 49 es un diagrama que muestra los efectos de la atenuación de PrxII sobre la proliferación y la migración de estirpes celulares de melanoma que expresan PrxII. A es un diagrama que muestra la atenuación selectiva de PrxII humana en estirpes celulares G361 y A375 usando dos ARNip específicos diferentes. B y C son diagramas que muestran la proliferación (B) y la migración (C) de las estirpes celulares G361 y A375 atenuadas con un grupo de control (con) y PrxII. D es un diagrama que muestra la proliferación y la migración de células A375 con PrxI atenuada para la estimulación con suero usando ARNip específico. Las células se infectan con un ARNip de control o específico de isoforma durante 24 horas como se indica. El experimento se repite 3 veces (*P < 0,01; **P < 0,005; N.S. significa no significativo).

La FIG. 50 es un diagrama que muestra los efectos de la inhibición de PrxII sobre la activación de Src y ERK inducida con suero a través de la conservación de las actividades de PTP. A y B son diagramas que muestran la fosforilación de tirosina inducida con suero en células SK₂8 de grupo de control (vec) y que expresan PrxII. La fosforilación de tirosina se detecta mediante inmunotransferencia (A) e inmunotinción (B) usando un anticuerpo antipTyr (4G10). Se muestran transferencias e imágenes representativas (n = 3). C es un diagrama que muestra las actividades de PTP en células SK₂8 de grupo de control y que expresan PrxII. Las actividades de PTP totales se miden usando un poli-péptido (Glu4-pTyr). D y E son diagramas que muestran las actividades de las moléculas de señalización intracelular en células SK₂8 que expresan PrxIl (D) y células G361 deficientes en PrxI/II (E). Las células G361 se estimulan con suero durante 30 minutos. La banda fosfoespecífica se cuantifica y la intensidad de la banda no fosfoproteica correspondiente se normaliza. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de las intensidades de banda relativas de 3 experimentos independientes. F y G son diagramas que muestran la proliferación y la migración de células de melanoma SK₂8 cuando hay presentes inhibidores de MEK (F) y Src (G) específicos. Las células SK₂8 se privan de suero durante 24 horas y se pretratan con PD98059 (5 μM) o PP2/PP3 (1 μM cada uno) durante 1 hora antes de la estimulación con suero. PP3 es un análogo inactivo de PP2. Se usa DMSO como vehículo de control para muestras sin tratar. El experimento se repite 3 veces (*P<0,01; **P<0,005; #P<0,001; N.S. significa no significativo).

La FIG. 51 es un diagrama que muestra un aumento de complejo E-cadherina/p-catenina en la unión adherente de células de melanoma por expresión de PrxII. A muestra la expresión de proteína de unión adherente en las células SK₂8 de grupo de control (vec) y que expresan PrxII. Las intensidades de las bandas de p-catenina y E-cadherina se cuantifican y normalizan con respecto a la intensidad de la banda de tubulina correspondiente. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de las intensidades de banda relativas de 3 experimentos independientes (*P<0,005; N.S., no significativo). B es un diagrama que muestra la expresión de p-catenina y E-cadherina en células SK5 que expresan PrxII y G361 deficientes en PrxII. C y D son diagramas que muestran la inmunotinción de p-catenina y E-cadherina en células SK5 (C) que expresan PrxII y G361 (D) deficientes en PrxII. La imagen solapada representa la coexistencia de dos proteínas en la membrana plasmática de las células que expresan PrxII (Amarillo). Las intensidades de fluorescencia se cuantifican siguiendo la flecha de color blanco (Arriba a la derecha) y se presentan como el porcentaje de la intensidad de la fracción indicada con respecto a la intensidad total (Abajo a la derecha, n = 33 células por grupo, *P<0,001). M1 y M2 representan la membrana plasmática y Cito representa el citoplasma. E es un diagrama que muestra la disminución de la fosforilación de p-catenina Y654 debido a la expresión de PrxII en las células SK₂8. La banda fosfoespecífica se cuantifica y se normaliza con respecto a la intensidad de la banda no fosfoproteica correspondiente. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de las intensidades de banda relativas de 3 experimentos independientes. F es un diagrama que muestra la fosforilación de p-catenina Y654 aumentada por la atenuación de PrxII en células G361. Se muestra una inmunotransferencia representativa de 3 experimentos independientes que proporcionaron los mismos resultados.

La FIG. 52 es un diagrama que muestra los efectos de PrxII en la inhibición de la actividad metastásica de células de melanoma in vivo. A es un diagrama que muestra la activación de Src/ERK y la fosforilación de p-catenina mejoradas, y la expresión de E-cadherina reducida por la atenuación de PrxII en células de melanoma de ratón B16F10. B es un diagrama que muestra la proliferación y la migración con estimulación con suero en células de melanoma de ratón B16F10 del grupo de control y deficientes en PrxII (n = 3, **P< 0,001). C es un diagrama que muestra un nivel de expresión de PrxII según el período de tiempo de atenuación de PrxII en células B16F10. Las células se transfectan con ARNip de mPrx2-1 y se realiza un análisis por inmunotransferencia. La intensidad de la banda de PrxII se cuantifica y se normaliza con respecto a la intensidad de la banda de tubulina correspondiente. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de intensidades de banda relativas de 3 experimentos independientes. D y E son diagramas que muestran la metástasis al pulmón de células de melanoma B16F10 de grupo de control y con PrxII atenuada. Las células transfectadas se inyectan a un ratón por inyección intravenosa. Después de 10 días, el pulmón se extrae y los nódulos tumorales de melanoma se cuentan en la superficie (D) y en las secciones de tejido teñidas con HE (E). Los datos se presentan como media ± error estándar (E.E.M.) (*P < 0. 005,**P < 0,001).

La FIG. 53 es un diagrama que muestra los efectos de la gliotoxina (GT), un derivado de ETP, en la inhibición de la actividad metastásica de células de melanoma. A es un diagrama que muestra el nivel de peróxido de hidrógeno intracelular en una estirpe celular de melanoma SK₂8 tratada con vehículo de control (DMSO) o GT. Se muestran imágenes representativas y las barras en el gráfico son la media ± desviación estándar (**P < 0,005) de los valores de fluorescencia de DCF relativos promediados de 60 a 80 células. B es un diagrama que muestra la expresión de la fosforilación de proteínas inducida con suero y E-cadherina en células SK₂8 tratadas con vehículo de control (DMSO) y GT. C y D son diagramas que muestran la proliferación (C) y la migración (D) de estirpes celulares SK5 y SK₂8 tratadas con vehículo de control (DMSO) y GT. Las células privadas de suero se pretratan con GT (100 nM) durante 1 hora y después se estimulan con suero. El experimento se repite 3 veces (*P< 0,01, **P< 0,005). E y F son diagramas que muestran la metástasis de células de melanoma B16F10 al pulmón en ratones inyectados con vehículo de control y GT. Se inyectan por vía intravenosa células de melanoma B16F10 progenitoras (E) o transfectadas con ARNip de mPrx2-1 (F) a ratones (7 por cada grupo) y después se inyecta DMSO o GT (300 μg/kg, 1. p.) 5 veces durante 10 días. Después de eso, el pulmón se extirpa y los nódulos tumorales de melanoma se cuentan en la superficie. Los datos se presentan como media ± error estándar (E.E.M.) (*P < 0,01). G es un diagrama esquemático que muestra la función antimetastásica de PrxII en células de melanoma. Cuando PrxII no está presente, el nivel de peróxido de hidrógeno intracelular aumenta. El nivel de peróxido de hidrógeno celular aumentado mejora las actividades de Src y ERK con respecto a la estimulación. La Src cinasa activada fosforila la pcatenina (p-cat) y desencadena la liberación de p-cat desde la unión adherente con respecto al citoplasma, mientras que la ERK cinasa activada inhibe la expresión de E-cadherina (E-cad). Por consiguiente, los complejos E-cadherina/p-catenina se destruyen en la unión adherente y, como resultado, las células de melanoma tienen una capacidad metastásica superior. Por el contrario, la expresión de PrxII retira el peróxido de hidrógeno intracelular, inhibiendo de este modo la activación de Src y ERK. En consecuencia, la proteína p-catenina se mantiene y el nivel de E-cadherina aumenta y, por lo tanto, los complejos E-cadherina/p-catenina aumentan en la unión adherente. Como resultado, la expresión de PrxII fortalece la adhesividad entre las células de melanoma para que no se produzca metástasis.

La FIG. 54 es un diagrama que muestra la inhibición de la proliferación y la migración de células de melanoma por la quetocina y la quetomina. Un vehículo (DMSO) o 100 nM del compuesto de ETP indicado se trata con células de melanoma SK-MEL28 y los resultados de las mediciones de citotoxicidad (A), proliferación (B) y migración (C) celulares se muestran en los gráficos. El compuesto de ETP se usó a una concentración de 100 nM sin presentar citotoxicidad.

El suero (FBS) promueve la proliferación y la migración de las células. El valor de p en cada gráfico significa un valor estadísticamente significativo.

La FIG. 55 es un gráfico que muestra si la metástasis de células de melanoma B 16F10 al pulmón se produce en un ratón inyectado con vehículo de control o compuesto de ETP. Se inyectan por vía intravenosa células de melanoma B16F10 a ratones (5 por grupo) y después se inyecta DMSO (DMSO) o un compuesto de ETP (300 mg/kg, i.p.) 5 veces durante 10 días. Se cuentan los nódulos tumorales de melanoma ubicados en la superficie del pulmón separado y esto se muestra en el gráfico. El valor de p en el gráfico significa un valor estadísticamente significativo.

[Mejor modo]

Como un aspecto para lograr los objetos de la presente invención, la presente invención proporciona un derivado de epiditiodioxopiperazina representado por la siguiente Fórmula química 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

en donde, en la Fórmula química 1,

R1 y R3 son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo C1 a C6 lineal o ramificado;

R2 y R4 son cada uno independientemente hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo hidroxilo, alquenilo o alquinilo lineal o ramificado, alcoxi C1 a C6 lineal o ramificado, hidroxialquilo C1 a C6 lineal o ramificado, alquilarilo C1 a C6 lineal o ramificado, un grupo perfluoroalquilo C1 a C6 lineal o ramificado, un grupo arilo sustituido o sin sustituir, un grupo perfluoroarilo sustituido o sin sustituir, un grupo heteroarilo sustituido o sin sustituir que comprende un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre en un anillo como heteroátomo, o un grupo epiditiodioxopiperazina sustituido o sin sustituir,

y el grupo alquilo y arilo pueden incluir opcionalmente un heteroátomo de oxígeno, nitrógeno o azufre en el medio de la cadena, y cada uno de los grupos epiditiodioxopiperazina sustituidos puede incluir opcionalmente e independientemente los sustituyentes definidos anteriormente.

El derivado de epiditiodioxopiperazina representado por la Fórmula química 1 puede separarse de fuentes naturales, obtenerse de fuentes naturales y después prepararse mediante reformado químico, o puede prepararse a partir de síntesis química por los expertos en la técnica haciendo referencia a métodos de preparación conocidos. Preferiblemente, el derivado de epiditiodioxopiperazina puede usarse separándolo de bacterias, un medio de cultivo de las mismas o metabolitos según métodos conocidos en la técnica, o preparándolo a partir de síntesis usando métodos descritos en los ejemplos de la presente invención. El derivado reducido del derivado de epiditiodioxopiperazina puede usarse como precursor para la síntesis del derivado de epiditiodioxopiperazina que tiene los mismos sustituyentes. Más adelante se describirán métodos específicos para sintetizar el derivado de epiditiodioxopiperazina a partir del derivado reducido.

Preferiblemente, Ri a R4 del derivado pueden ser cada uno independientemente hidrógeno, alquenilo o alcoxialquilo C1 a C6 lineal o ramificado y, específicamente, R1 a R4 puede ser cada uno independientemente hidrógeno, alilo o 3-metoxipropilo.

Más preferiblemente, R1 y R3 son hidrógeno, R2 y R4 son iguales entre sí y pueden ser alquenilo C1 a C6 lineal o ramificado; o alcoxialquilo y, específicamente, puede ser alilo o 3-metoxipropilo;

R1 y R3 pueden ser cada uno independientemente hidrógeno; o alquilo C1 a C6 lineal o ramificado tal como metilo, propilo o n-butilo;

R1 y R3 son hidrógeno, y R2 y R4 pueden ser cada uno independientemente hidrógeno.

Con la máxima preferencia, el derivado puede ser un derivado que es uno cualquiera de los compuestos representados por las siguientes Fórmulas químicas 10 y 14.

Además, cuando el compuesto representado por la Fórmula química 1 tiene estereoisómeros, la presente invención incluye todos los estereoisómeros.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar un compuesto representado por la Fórmula química 1, teniendo dicho derivado una permeabilidad intracelular mejorada y que imita la actividad de 2-Cys-Prx en su forma reducida en las células, incluyendo el método formar un enlace de puente disulfuro intramolecular a partir de un derivado de dimercaptopiperazinadiona representado por la siguiente Fórmula química 2 usando una reacción de oxidación.

En la Fórmula química 2, R1 a R4 son los mismos que los definidos anteriormente.

Una característica del derivado de epiditiodioxopiperazina de la presente invención es imitar la actividad de 2-Cys-Prx en las células. La “2-Cys-Prx” es una proteína antioxidante específica de tiol que desempeña la función de proteger las células a través de una actividad peroxidasa que reduce peróxido de hidrógeno, peroxinitrito y otros hidroperóxidos en las células. La unidad funcional de 2-Cys-Prx es un homodímero, y la unidad tiene un centro de disulfuro activo de oxidación-reducción intramolecular intrínseco que desempeña una función importante en la actividad de la enzima. Cada cisteína del dímero está presente como un grupo tiol en estado reducido. Mientras tanto, cuando se hace reaccionar con peróxido, la cisteína peroxidativa de 2-Cys-Prx se oxida a un intermedio de ácido sulfénico, y se diferencia de otras cisteínas de unidades pequeñas del dímero que mantienen un grupo tiol, y el grupo ácido sulfénico y el grupo tiol del intermedio forman un enlace de puente disulfuro intramolecular mediante condensación por deshidratación. Por ejemplo, en las células, la 2-Cys-Trx se oxida de un tipo reducido que incluye dos grupos tiol a un tipo oxidado en el que los dos grupos tiol forman un enlace de puente disulfuro intramolecular entre sí y reduce el peróxido intracelular. En la presente memoria, la 2-Cys-Prx oxidada que incluye un enlace de puente disulfuro intramolecular puede convertirse en un tipo reducido que tiene dos grupos tiol, que es un tipo activo, mediante un sistema de oxidación-reducción que incluye tiorredoxina (Trx) y tiorredoxina reductasa (TR); alquil hidroperóxido reductasa (AhpF); tripanotiona reductasa, tripanotiona y triparredoxina o lipoamida deshidrogenasa, dihidrolipoiltranssuccinilasa (SucB), AhpD y similares.

Otra característica del derivado de epiditiodioxopiperazina de la presente invención es la presencia de un puente disulfuro intramolecular. Esta estructura química característica implica la captación intracelular, por lo tanto, una vez que los compuestos se introducen en las células, los compuestos se unen en las células mediante su acumulación a una concentración intracelular mucho más alta de lo esperado (P. H. Bernardo y col., 2003, J. Biol. Chem., 278: 46549). Por esta razón, el derivado de epiditiodioxopiperazina según la presente invención puede prevenir o tratar eficazmente vasculopatías incluso cuando se administra en concentraciones muy bajas capaces de evitar la citotoxicidad intrínseca.

Como se ha descrito anteriormente, el derivado de epiditiodioxopiperazina de la presente invención se diseña para incluir un enlace de puente disulfuro intramolecular y, por lo tanto, se introduce fácilmente en las células y puede reducir el peróxido convirtiéndolo rápidamente en una molécula que tiene dos grupos tiol mediante un sistema de oxidación-reducción intracelular y, como resultado, puede imitar eficazmente la actividad de 2-Cys-Prx en las células. Aunque no se limita a ello, el sistema de oxidación-reducción intracelular es preferiblemente un sistema de oxidación-reducción que incluye tiorredoxina y tiorredoxina reductasa.

El derivado de dimercaptopiperazinadiona representado por la Fórmula química 2 puede prepararse mediante las etapas de preparar un intermedio que incluye una estructura de anillo que incluye 4 átomos de azufre representados por la siguiente Fórmula química 4 haciendo reaccionar un derivado de piperazinadiona representado por la siguiente Fórmula química 3 con azufre (S) y bis(trimetilsilil)amiduro de litio (LiHMDS) o NaHMDS, y reducir el intermedio para formar 2 grupos tiol a partir de la estructura de anillo, que incluye 4 átomos de azufre.

En las Fórmulas químicas 3 y 4, Ri a R4 son los mismos que los definidos anteriormente.

En la presente memoria, la reacción de reducción se puede realizar usando reacciones conocidas en la técnica sin límite, y se puede realizar preferiblemente usando un agente reductor de la serie de hidruros tal como borohidruro de sodio o hidruro de litio y aluminio. Más preferiblemente, la reacción se puede realizar usando borohidruro de sodio; sin embargo, la reacción no se limita a ello.

Además, el derivado de dimercaptopiperazinadiona representado por la Fórmula química 2 puede prepararse para que incluya dos grupos tiol mediante la preparación de un intermedio representado por la siguiente Fórmula química 6 que incluye un grupo tioacetato mediante la reacción de un derivado de piperazinadiona sustituido con un átomo de halógeno representado por la siguiente Fórmula química 5 con una sal de metal alcalino de ácido tioacético (MSAc), y después hacer reaccionar el intermedio con una solución de ácido para sustituir el grupo acetilo unido al átomo de azufre con un átomo de hidrógeno.

La sal de metal alcalino es una sal de sodio o potasio, X es un átomo de halógeno tal como F, Cl, Br o I, y R1 a R4 son los mismos que los definidos anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de vasculopatías que comprende un derivado de epiditiodioxopiperazina representado por la siguiente Fórmula química 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo como ingrediente activo; y un método para tratar vasculopatías que comprende administrar la composición a un sujeto del que se sospecha que padece vasculopatías. Además, la presente invención proporciona el uso del compuesto de epiditiodioxopiperazina representado por la Fórmula química 1, sus derivados o sales farmacéuticamente aceptables del mismo para la preparación de un medicamento para prevenir o tratar vasculopatías.

en donde, Ri y R3 son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo C1 a C6 lineal o ramificado, y R2 y R4 son cada uno independientemente hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo hidroxilo, alquilo, alquenilo o alquinilo C1 a C6 lineal o ramificado, alcoxi C1 a C6 lineal o ramificado, hidroxialquilo C1 a C6 lineal o ramificado, bencilo sustituido o sin sustituir, alquilarilo C1 a C6 lineal o ramificado, un grupo perfluoroalquilo C1 a C6 lineal o ramificado, un grupo arilo sustituido o sin sustituir, un grupo perfluoroarilo sustituido o sin sustituir, un grupo heteroarilo sustituido o sin sustituir que comprende un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre en un anillo como heteroátomo, o un grupo epiditiodioxopiperazina sustituido o sin sustituir,y el grupo alquilo y arilo pueden incluir opcionalmente un heteroátomo de oxígeno, nitrógeno o azufre en el medio de la cadena, y cada uno de los grupos epiditiodioxopiperazina sustituidos puede incluir opcionalmente e independientemente los sustituyentes definidos anteriormente.

Los derivados de la presente invención tienen un enlace de puente disulfuro intramolecular en común. El enlace de puente disulfuro facilita la introducción del derivado en las células, y el compuesto introducido en las células presenta una actividad intracelular al reducirse rápidamente a dos grupos tiol. Por lo tanto, es necesario diseñar la molécula para que excluya el enmascaramiento por sustituyentes para facilitar el acercamiento de un sustrato al sitio activo. Como resultado, los sustituyentes unidos al anillo de piperazina del derivado son preferiblemente sustituyentes de tamaño pequeño de manera que el sustituyente no bloquee estereoscópicamente un enlace de puente disulfuro por el volumen del propio sustituyente o por ocupar el espacio debido a la rotación, o están preferiblemente unidos entre sí para formar un anillo para no rotar.

En consecuencia, en el derivado representado por la Fórmula química 1, R1 y R3 pueden ser átomos de hidrógeno, R2 y R4 pueden ser cada uno independientemente hidrógeno, alquilo C1 a C6, alquenilo, un grupo alquilo que incluye un heteroátomo de oxígeno, nitrógeno o azufre en el medio de la cadena, alcoxibencilo o benzhidrilo y, más preferiblemente, R1 y R3 son átomos de hidrógeno, R2 y R4 pueden ser cada uno independientemente hidrógeno, o alquilo o alquenilo C1 a C6; o R1 a R3 son átomos de hidrógeno, R4 puede ser alquilo C1 a C6, alquenilo, un grupo alquilo que incluye un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre en el medio de la cadena, o un grupo bencilo sustituido tal como 4-metoxibencilo o un grupo bencilo sin sustituir; y R1, R2 y R4 pueden ser un grupo alquilo C1 a C6 y R3 puede ser hidrógeno.

Alternativamente, uno o más pares de R1 y R2, o R3 y R4 pueden formar un grupo cicloalquilo sustituido o sin sustituir o un anillo heterocíclico.

El compuesto representado por la Fórmula química 1 incluido en la composición puede ser uno cualquiera de los compuestos representados por las siguientes Fórmulas químicas 7 a 15.

Los compuestos de las Fórmulas químicas 16 a 31 no son según la invención.

En la presente memoria, A y B son cada uno independientemente hidrógeno; metoxi; o un grupo hidroxilo.

El compuesto de Fórmula química 16 es un compuesto de ETP representativo denominado gliotoxina (GT) y puede separarse de bacterias tales como Aspergillus fumigatus, Trichoderma virens, Penicillium spp. o Candida albicans, un medio de cultivo de las mismas, un metabolito o un metabolito secundario [Kirby y Robins, 1980, The Biosynthesis of Mycotoxins, Nueva York: Academic Press; Shah y Larsen, 1991, Mycopathologia, 116: 203-208].

El compuesto de Fórmula química 17 es un compuesto de ETP denominado sirodesmina y puede separarse de bacterias tales como Leptosphaeria maculans o Sirodesmium diversum, un medio de cultivo de las mismas, un metabolito o un metabolito secundario [Curtis y col., 1977, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 180-189; Ferezou y col., 1977, Nouv. J. Chim., 1: 327-334].

El compuesto de Fórmula química 18 es un compuesto de ETP denominado hialodendrina y puede separarse de bacterias tales como Hyalodendron sp., un medio de cultivo de la misma, un metabolito o un metabolito secundario [Stillwell y col., 1974, Can. J. Microbiol., 20: 759-764].

El compuesto de Fórmula química 19 es un compuesto de ETP denominado esporidesmina A y puede separarse de bacterias tales como Pithomyces chartarum, un medio de cultivo del mismo, un metabolito o un metabolito secundario [Kirby y Robins, 1980, The Biosynthesis of Mycotoxins, Nueva York: Academic Press].

El compuesto de Fórmula química 20 es un compuesto de ETP denominado quetomina y puede separarse de Chaetomium globosum [Sekita y col., 1981, Can. J. Microbiol., 27: 766-772].

El compuesto de Fórmula química 21 es un compuesto de ETP denominado quetocina y puede separarse de Chaetomium spp. [Sekita y col., 1981, Can. J. Microbiol., 27: 766-772].

El compuesto de Fórmula química 22 es un compuesto de ETP denominado verticilinas y puede separarse de Verticillium spp. o Penicillium sp. [Byeng y col., 1999, Nat. Prod. Lett., 13: 213-222; Joshi y col., 1999, J. Nat. Prod., 62: 730-733; Kirby y Robins, 1980, The Biosynthesis of Mycotoxins, Nueva York: Sekita y col., 1981, Can. J. Microbiol., 27: 766-772]. Las verticilinas incluyen todas las verticilinas A, verticilinas 13, verticilinas D, verticilinas E y verticilinas F.

El compuesto de Fórmula química 23 es un compuesto de ETP denominado leptosina y puede separarse de Leptosphaetia sp. [Takahashi y col., 1994, J. Antibiot., 47: 1242-1249].

El compuesto de Fórmula química 24 es un compuesto de ETP denominado emestrina y puede separarse de Aspergillus spp. [Seya y col., 1986, Chem. Pharm. Bull., 34: 2411 -2416].

El compuesto de Fórmula química 25 es un compuesto de ETP denominado escabrosina y puede separarse de Xanthoparmelia scabrosa [Ernst-Russell y col., 1999, Aust. J. Chem., 52: 279-283; Moerman y col., 2003, Toxicol. Appl. Pharmacol., 190: 232-240].

El compuesto de Fórmula química 26 es un compuesto de ETP denominado ditiosilvatina y puede separarse de Aspergillus silvaticus [Kawahara y col., 1987, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1,2099-2101].

El compuesto de Fórmula química 27 es un compuesto de ETP denominado epicorazina y puede separarse de Stereum hirsutum, Epicoccum purpurascens o Epicoccum nigrum [Deffieux y col., 1977, Acta Christallogr., B33: 1474-1478; Kleinwachter y col., 2001, J. Antibiot., 54: 521-525].

El compuesto de Fórmula química 28 es un compuesto de ETP denominado Aranotina y puede separarse de Arachniotus aureus o Aspergillus terreus [Neuss y col., 1968, Antimicrob. Agents Chemother., 8: 213-219].

El compuesto de Fórmula química 29 es un compuesto de ETP denominado emetalicina y puede separarse de Aspergillus heterothallicus [Kawahara y col., 1989, Chem. Pharm. Bull., 37: 2592-2595].

El compuesto de Fórmula química 30 es un compuesto de ETP denominado verticilinas y puede separarse de Verticillium spp. [Byeng y col., 1999, Nat. Prod. Lett., 13: 213-222; Joshi y col., 1999, J. Nat. Prod., 62: 730­ 733; Kirby y Robins, 1980, The Biosynthesis of Mycotoxins, Nueva York: Sekita y col., 1981, Can. J. Microbiol., 27: 766-772].

El compuesto de Fórmula química 31 puede separarse de Gliocladium catenulatum [Byeng y col., 1999, Nat. Prod. Lett., 13: 213-222; Joshi y col., 1999, J. Nat. Prod., 62: 730-733; Kirby y Robins, 1980, The Biosynthesis of Mycotoxins, Nueva York: Sekita y col., 1981, Can. J. Microbiol., 27: 766-772].

El compuesto de epiditiodioxopiperazina o los derivados del mismo pueden separarse de fuentes naturales, obtenerse de fuentes naturales y después prepararse mediante reformado químico, prepararse a partir de síntesis química por los expertos en la técnica haciendo referencia a métodos de preparación conocidos u obtenerse en el mercado. Preferiblemente, el compuesto de epiditiodioxopiperazina o los derivados del mismo pueden usarse separándolos de bacterias, un medio de cultivo de las mismas o metabolitos según métodos conocidos en la técnica, o preparándolos a partir de síntesis usando métodos descritos en los ejemplos de la presente invención.

En los ejemplos específicos de la presente invención, A1 en el que todos los sustituyentes son átomos de hidrógeno; A2 y A3 en los que 2 y 3 grupos metilo están sustituidos, respectivamente; A5 en el que 2 átomos de nitrógeno del anillo de piperazina están sustituidos con un grupo 2-propenilo, y A8 en el que se une un grupo butilo, muestran actividades excelentes de mejora de la proliferación y la migración de células endoteliales inducidas por VEGF inhibiendo al mismo tiempo la proliferación y la migración de células de músculo liso vascular inducidas por PDGF. Mientras tanto, A6 en el que un grupo metoxibencilo está sustituido, y A9 en el que dos grupos metoxipropilo formados con 5 elementos, incluyendo heteroátomos, están sustituidos, muestran actividades moderadas, y A4 en el que dos grupos metoxibencilo están sustituidos, y A7 en el que dos grupos benzhidrilo están sustituidos, muestran actividades bajas. Basándose en los resultados anteriores, se puede inferir que el derivado sustituido con sustituyentes relativamente pequeños, tales como un grupo alquilo o alquenilo C1 a C4, muestra actividades excelentes independientemente del número de sustituyentes, y el derivado que tiene sustituyentes relativamente grandes tiene actividades algo disminuidas, sin embargo, la eficacia de las actividades puede ajustarse mediante el ajuste del tipo y/o el número de sustituyentes.

El derivado de epiditiodioxopiperazina de la presente invención puede usarse en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Además, los compuestos de la presente invención pueden usarse solos o unidos a otros compuestos farmacéuticamente activos, o en forma de una agregación.

La expresión “sal farmacéuticamente aceptable” utilizada en la presente invención significa todas las sales que tienen actividades biológicas y/o fisiológicas diana de los compuestos y que presentan mínimamente efectos toxicológicos no deseados. En la presente invención, el tipo de sal no está limitado siempre que la sal mantenga un anillo de dicetopiperazina que incluya un puente disulfuro intramolecular. Como sal, es útil una sal de adición de ácido formada por un ácido libre farmacéuticamente aceptable. La sal de adición de ácido puede prepararse usando métodos comunes tales como disolver un compuesto en una solución acuosa en exceso y precipitar esta sal usando un disolvente orgánico miscible en agua tal como metanol, etanol, acetona o acetonitrilo. Se calienta un compuesto equimolar y un ácido o alcohol en agua (por ejemplo, glicol monometil éter) y después la mezcla puede secarse por evaporación, o la sal precipitada se puede filtrar por succión. En la presente memoria, puede usarse un ácido inorgánico o un ácido orgánico como ácido libre, y puede usarse ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido nítrico, ácido sulfúrico, ácido estánnico y similares como ácido inorgánico y puede usarse ácido metanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido maleico, ácido succínico, ácido oxálico, ácido benzoico, ácido tartárico, ácido fumárico, ácido mandélico, ácido propiónico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido glicólico, ácido glucónico, ácido galacturónico, ácido glutámico, ácido glutárico, ácido glucurónico, ácido aspártico, ácido ascórbico, ácido carbónico, ácido vanílico, ácido yodhídrico y similares como ácido orgánico, sin embargo, el ácido inorgánico y el ácido orgánico no se limitan a ellos.

Además, puede prepararse una sal de metal farmacéuticamente aceptable usando una base. Una sal de metal alcalino o de metal alcalinotérreo se obtiene, por ejemplo, disolviendo un compuesto en un exceso de solución de hidróxido de metal alcalino o de hidróxido de metal alcalinotérreo, filtrando la sal del compuesto no soluble, secando el filtrado y secando el resultado. En la presente memoria, la preparación de una sal de sodio, potasio o calcio como sal de metal es farmacéuticamente adecuada, pero la sal de metal no se limita a ello. Además, puede obtenerse una sal de plata correspondiente a ésta haciendo reaccionar la sal de metal alcalino o alcalinotérreo con una sal de plata adecuada (por ejemplo, nitrato de plata).

La sal farmacéuticamente aceptable de los derivados de epiditiodioxopiperazina incluye, a menos que se especifique otra cosa, todas las sales de grupos ácidos o básicos que puedan existir. Por ejemplo, la sal farmacéuticamente aceptable puede incluir una sal de sodio, calcio y potasio de un grupo hidroxilo, y como otras sales farmacéuticamente aceptables de un grupo amino, puede incluirse bromhidrato, sulfato, hidrógeno sulfato, fosfato, hidrógeno fosfato, dihidrógeno fosfato, acetato, succinato, citrato, tartrato, lactato, mandelato, metanosulfonato (mesilato), sal de p-toluenosulfonato (tosilato) y similares, y éstas pueden prepararse usando métodos de preparación de sales conocidos en la técnica.

La composición farmacéutica según la presente invención puede usarse para prevenir o tratar vasculopatías derivadas de la hipertensión, una arteriopatía coronaria isquémica tal como la angina de pecho inestable, la angina de pecho y el infarto de miocardio, la oclusión de la arteria cerebral tal como el ictus, la arteroesclerosis, una arteriopatía oclusiva periférica tal como la enfermedad de Berger, la tromboembolia, la lesión del pie diabético, la úlcera venosa, la trombosis venosa profunda, la arteriesclerosis carotídea, el vasoespasmo, la hiperplasia del músculo liso vascular y/o la pérdida de endotelio tal como la arteritis y la reestenosis vascular sin límite. La composición farmacéutica puede usarse para prevenir o tratar la reestenosis vascular que surge de un injerto vascular, un corte vascular, la arteriesclerosis, la acumulación de lípidos intravasculares, la hipertensión, la arteritis, la angioplastia y similares. La razón del desarrollo de la reestenosis vascular no está clara, sin embargo, se sabe que la hiperplasia de la íntima está provocada por la migración y la proliferación anómalas de las células del músculo liso vascular debido a un factor de crecimiento y/o una citocina secretados por las células circundantes como mecanismo para recuperarse de las lesiones vasculares por diversas razones o las lesiones endoteliales debidas a dispositivos insertados al realizar la angioplastia. El vaso sanguíneo incluye arterias carótidas, arterias coronarias, arterias periféricas, arterias renales y similares, pero no se limita a ellas.

La composición farmacéutica que incluye el derivado de epiditiodioxopiperazina representado por la Fórmula química 1 o sales farmacéuticamente aceptables del mismo promueve la proliferación o la migración de células endoteliales inhibiendo al mismo tiempo la proliferación o la migración de células de músculo liso vascular.

El derivado de epiditiodioxopiperazina preferiblemente tiene una característica que imita la actividad de 2-Cys-Prx.

“ PrxII (escrita como peroxirredoxina II o Prx2)” es una peroxidasa 2-Cys-Prx que reduce peróxido de hidrógeno intracelular y desempeña una función en la supresión de la amplificación de la señalización celular a través de la supresión de la fosforilación que se produce de manera específica de sitio en PDGFR-PCL^y1 mediante la reducción del peróxido de hidrógeno producido por PDGF en células de músculo liso vascular. A través de un mecanismo tal como este, la PrxII tiene actividad para inhibir la migración y la proliferación de células de músculo liso en vasos sanguíneos lesionados y suprimir la hiperplasia de la íntima (M. H. Choi y col., 2005, Nature, 435: 347). Mientras tanto, se ha publicado que PrxII activa la señalización inducida por VEGF mediante la protección de VEGFR2 de la desactivación oxidativa en células endoteliales (D. H. Kang y col., 2011, Mol. Cell., 44: 656). Los inventores de la presente invención han demostrado que el compuesto de epiditiodioxopiperazina o sus derivados según la presente invención pueden reemplazar la PrxII en la función celular usando un modelo animal con lesiones celulares y vasculares en el que se inactiva la PrxII mediante la inyección de ARNip de PrxII.

Según un aspecto de la presente invención, se demuestra que la gliotoxina, la quetocina, la quetomina y los compuestos representados por las Fórmulas químicas 7 a 15, que son compuestos representativos pertenecientes al compuesto representado por la Fórmula química 1, es decir, compuestos que tienen una estructura de epiditiodioxopiperazina, pueden imitar la actividad de 2-Cys-Prx intracelular y tienen una capacidad mejorada para introducirse en las células, y adicionalmente, se demuestra que estos compuestos pueden promover la migración y la proliferación de células endoteliales inducidas por VEGF inhibiendo al mismo tiempo la migración y la proliferación de células de músculo liso vascular inducidas por PDGF. En consecuencia, otros compuestos representados por la Fórmula química 1 también son eficaces en el tratamiento de vasculopatías, en particular, la reestenosis vascular mediante la promoción de la migración y la proliferación de células endoteliales, y la inhibición de la migración y la proliferación de células de músculo liso vascular, puesto que los compuestos comparten la estructura de epiditiodioxopiperazina.

La composición según la presente invención puede incluir además portadores, agentes diluyentes y diluyentes apropiados comúnmente utilizados para la preparación de composiciones farmacéuticas. La composición está esterilizada o es aséptica, puede ser agua, un tampón, un agente isotónico y similares, y la solución está esterilizada o es aséptica, o puede incluir otros ingredientes conocidos por los expertos en la técnica, que no provoquen alergias u otras reacciones perniciosas cuando se apliquen a animales o seres humanos.

La expresión “portador farmacéuticamente aceptable” utilizado en la presente invención incluye todos los disolventes aleatorios, medios de dispersión, materiales de recubrimiento, agentes antimicrobianos, agentes antifúngicos y agentes isotónicos y similares. El uso de los medios y las formulaciones como materiales farmacéuticamente activos es bien conocido en la técnica relacionada. Además de los medios comunes o las formulaciones no miscibles con los ingredientes activos, se considera el uso de los medios y las formulaciones descritos anteriormente en las composiciones terapéuticas. Además, los ingredientes activos complementarios se pueden mezclar con la composición descrita anteriormente.

La composición puede prepararse como formulaciones tales como líquidos, emulsiones, suspensiones o cremas, o puede usarse para la administración no oral. La cantidad de la composición utilizada puede ser cantidades utilizadas comúnmente para prevenir o tratar vasculopatías, y es preferiblemente diferente dependiendo de la edad, el género y el estado de los pacientes, la absorbancia in vivo de las sustancias activas, la velocidad de inactivación y los fármacos utilizados en combinación.

En la presente invención, el término “prevención” significa todas las acciones que suprimen las vasculopatías o retrasan el brote de las enfermedades mediante la administración de la composición farmacéutica, y el término “tratamiento” significa todas las acciones que permiten mejorar o cambiar a mejor los síntomas de las vasculopatías mediante la administración de la composición farmacéutica.

En la presente invención, el término “sujeto” significa todos los animales, incluyendo los seres humanos, que han desarrollado o que tienen la posibilidad de desarrollar vasculopatías, y la vasculopatía puede prevenirse o tratarse eficazmente mediante la administración de la composición farmacéutica de la presente invención a una entidad. Además, la composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar en combinación con agentes terapéuticos conocidos para vasculopatías.

La composición farmacéutica de la presente invención se administra con una dosis terapéuticamente eficaz. La expresión “dosis terapéuticamente eficaz” significa una cantidad suficiente para tratar enfermedades en una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a los tratamientos médicos y que no provoque efectos secundarios, y el nivel de la dosis eficaz puede determinarse fácilmente por los expertos en la técnica dependiendo de los factores que incluyen el sexo, la edad, el peso y el estado de salud de los pacientes, la gravedad de la enfermedad, la actividad de los fármacos, la sensibilidad a los fármacos, los métodos de administración, el tiempo de administración, las vías de administración y las velocidades de excreción, el período de tratamiento y los fármacos combinados o simultáneos utilizados, y otros factores bien conocidos en el campo de la medicina.

Los ejemplos de agentes terapéuticos conocidos que pueden usarse en combinación con la composición farmacéutica de la presente invención incluyen paclitaxel, silorimus o similares. Las dosis terapéuticamente eficaces de agentes terapéuticos conocidos se conocen en la técnica relacionada y un médico especialista puede ajustar la cantidad teniendo en cuenta diversas condiciones tales como el nivel de síntomas y la coadministración con la composición de la presente invención. Mediante la coadministración de agentes terapéuticos conocidos descritos anteriormente, los efectos secundarios de los agentes terapéuticos conocidos pueden reducirse mediante la composición de la presente invención y también pueden esperarse efectos curativos sinérgicos. Estos agentes terapéuticos conocidos pueden administrarse simultáneamente como un fármaco combinado o consecutivamente a intervalos de tiempo con la composición de la presente invención.

El término “administración” en la presente invención significa introducir un material prescrito a un paciente usando métodos apropiados y la composición puede administrarse por cualquier vía general siempre que la composición alcance un tejido diana. Aunque no se limita a ello, el método de administración es preferiblemente la administración no oral y, más preferiblemente, la administración local a las lesiones. Para la administración local de fármacos, pueden usarse catéteres de doble globo, distribuidores o balones microporosos y similares, y en particular, pueden usarse stents o micropartículas sostenidas para un suministro de fármacos a largo plazo. Con la máxima preferencia, la composición de la presente invención se puede administrar directamente al área de estenosis aplicando la composición dentro de un stent.

Además, en la presente memoria se describe un dispositivo de suministro de fármacos para la administración local que incluye la composición farmacéutica para prevenir o tratar vasculopatías. El dispositivo de suministro de fármacos para la administración local puede incluir catéteres de doble globo, distribuidores, globos microporosos, stents y similares, pero no se limita a ellos, y es preferiblemente un stent.

El término “stent” significa un dispositivo general para la aplicación endoluminal como se ha descrito anteriormente, tal como la aplicación intravascular, y significa un material médico cilíndrico que normaliza el flujo sanguíneo al insertarlo en un área vascular estrechada u obstruida con fluoroscopia sin laparotomía quirúrgica cuando el flujo sanguíneo está imposibilitado debido al desarrollo de enfermedades en una ubicación para tener un flujo sanguíneo suave. Por ejemplo, se describe un stent vascular en el libro de texto de Interventional Cardiology (Saunders Company, 1994) escrito por Eric J. Topol. Preferiblemente, el stent es un stent de liberación sostenida de fármacos. Como método para recubrir el stent con la composición farmacéutica de la presente invención, pueden aplicarsemétodos de recubrimiento comunes conocidos por los expertos en la técnica, y los ejemplos de los mismos incluyen un método de recubrimiento por inmersión y un método de recubrimiento con polímero, el método de recubrimiento por inmersión es el método de recubrimiento más simple, y los efectos biológicos del propio fármaco se observan fácilmente puesto que solo se recubre la composición farmacéutica; sin embargo, el método no se limita a ello. Preferiblemente, el stent puede prepararse aplicando como recubrimiento la composición sobre un stent de liberación de fármacos después de mezclarla con un material polimérico de manera que la composición según la presente invención se libere lentamente. El material polimérico que puede usarse como stent de liberación de fármacos es ampliamente conocido en la técnica, y los ejemplos del mismo incluyen poliuretano, tereftalato de polietileno, copolímero de PLLA-ácido poliglicólico (PLGA), policaprolactona, copolímero de poli(hidroxibutirato/hidroxivalerato), polivinilpirrolidona, politetrafluoroetileno, poli(2-hidroxietilmetacrilato), poli(éteruretano urea), silicona, acrílico, epóxido, poliéster, uretano, pireno, un polímero de polifosfazina, un polímero fluorado, poliamida, poliolefina y una mezcla de los mismos, pero no se limitan a ellos.

El stent puede formarse con uno o más materiales seleccionados del grupo que consiste en polisacárido, heparina, gelatina, colágeno, alginato, ácido hialurónico, ácido algínico, carragenano, condroitina, pectina, quitosano y derivados y copolímeros de los mismos, o puede recubrirse adicionalmente con una capa antitrombótica que los incluya. Estos materiales pueden combinarse correctamente con una capa superior biocompatible, como se describe en la Publicación abierta a inspección pública de la solicitud de patente de los EE.UU. N.° US-2006/0083772. El método para formar un stent a partir de la mezcla de un polímero y un compuesto farmacológico se describe en Blindt y col., 1999, Int. J. Artif. Organs, 22: 843.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para inhibir la metástasis del melanoma que comprende el derivado de epiditiodioxopiperazina representado por la Fórmula química 1 o sales farmacéuticamente aceptables del mismo como ingrediente activo.

Además, la presente invención proporciona un método para inhibir la metástasis del melanoma que comprende administrar la composición farmacéutica a un sujeto que la necesite.

Además, en la presente memoria se describe el uso del compuesto de epiditiodioxopiperazina representado por la Fórmula química 1, sus derivados o sales farmacéuticamente aceptables del mismo para la preparación de un medicamento para inhibir la metástasis del melanoma.

El compuesto representado por la Fórmula química 1 incluido en la composición puede ser uno cualquiera de los compuestos representados por las Fórmulas químicas 7 a 15.

El “ melanoma” significa tumores malignos de melanocitos que producen melanina, un pigmento oscuro, y también se denomina melanoma maligno. El melanocito determina el color de la piel y usualmente aparece en la piel, pero también puede aparecer en otras partes del cuerpo, incluyendo el intestino y los ojos. Por lo tanto, el melanoma puede ocurrir en cualquier parte del cuerpo en la que se distribuyen los melanocitos. El melanoma no es una enfermedad general en comparación con otros cánceres de piel, pero es una enfermedad mucho más peligrosa puesto que la detección temprana es difícil y la mayor parte (75 %) de la causa de muerte relacionada con el cáncer de piel se debe al melanoma. El melanoma metastásico puede provocar síntomas inespecíficos tales como pérdida de apetito, náuseas y fatiga. Aunque es relativamente raro, el melanoma en ocasiones hace metástasis en una etapa temprana. La metástasis cerebral es la observada más universalmente en pacientes con melanoma metastásico. Además, el melanoma puede hacer metástasis en el hígado, los huesos, el abdomen o incluso en los ganglios linfáticos a larga distancia.

Los inventores de la presente invención han demostrado que la PrxIl está implicada en la metástasis del melanoma a través de ejemplos específicos. Específicamente, se identifica que el nivel de peróxido de hidrógeno intracelular es alto en estirpes celulares en las que el nivel de expresión de PrxII en la estirpe celular de melanoma es bajo (SK5 y SK₂8). Además, se identifica que estas estirpes celulares tienen actividades migratorias y proliferativas altas en comparación con las estirpes celulares de melanoma que expresan PrxII (A375 y G361). Mientras tanto, cuando la expresión de PrxII aumenta en la estirpe celular de melanoma que hipoexpresa la PrxII, se identifica que la proliferación y la migración se reducen. Además, cuando la PrxII se inactiva selectivamente en la estirpe celular de melanoma que expresa la PrxII usando ARNip, se identifica que la proliferación y la migración se potencian. Además, al usar un modelo en ratón de atenuación de PrxII, se identifica que la PrxII está implicada en la metástasis del melanoma in vivo (Ejemplo experimental 9 (1)). Como se ha descrito anteriormente, PrxII es un tipo de 2-Cys-Prx, y basándose en la idea de que el derivado de epiditiodioxopiperazina según la presente invención puede imitar la actividad de 2-Cys-Prx tal como PrxII en las células, se identifica que el potencial metastásico del melanoma se puede inhibir mediante el tratamiento con gliotoxina (GT), quetocina y quetomina, que es un tipo de derivados de epiditiodioxopiperazina separados de los metabolitos fúngicos, que incluyen una estructura de enlace de puente disulfuro intramolecular identificada para presentar la actividad en los derivados de la presente invención (Ejemplo experimental 9 (2) y (3)). Como resultado, el derivado de epiditiodioxopiperazina según la presente invención puede inhibir eficazmente la metástasis del melanoma provocada por la deficiencia o inactivación de PrxII imitando la actividad de PrxII en las células.

Además, en la presente memoria se describe un método para preparar un agente preventivo o terapéutico para la reestenosis vascular, incluyendo el método identificar si el compuesto de epiditiodioxopiperazina (ETP) que incluye uno o más anillos de epiditiodioxopiperazina representados por la Fórmula química 47 presenta una actividad 2-Cysperoxirredoxina (2-Cys-Prx); y producir el compuesto identificado como que presenta actividad 2-Cys-peroxirredoxina (2-Cys-Prx) en la etapa anterior.

Además, en la presente memoria se describe un método para detectar un agente preventivo o terapéutico para la reestenosis vascular, incluyendo el método las etapas de (a) identificar si el compuesto que incluye uno o más anillos de epiditiodioxopiperazina representados por la Fórmula química 47 presenta una actividad 2-Cysperoxirredoxina (2-Cys-Prx); y (b) determinar el compuesto como un agente preventivo o terapéutico para la reestenosis vascular cuando se produce una reacción de oxidación de NADPH o una reacción de reducción de H₂O2.

En la Etapa (a), la identificación de si el compuesto presenta una actividad 2-Cys-peroxirredoxina (2-Cys-Prx) puede realizarse identificando si la reacción de oxidación de NADPH o la reacción de reducción de H₂O2 se produce cuando el compuesto que incluye uno o más anillos de epiditiodioxopiperazina representados por la Fórmula química 47 se mezcla y reacciona con tiorredoxina (Trx), tiorredoxina reductasa (TR), NADPH, una solución tampón y H₂O2; y determinando que el compuesto presenta una actividad 2-Cys-peroxirredoxina (2-Cys-Prx) cuando se produce la reacción de oxidación de NADPH o la reacción de reducción de H₂O2.

El compuesto anterior que incluye uno o más anillos de epiditiodioxopiperazina representados por la Fórmula química 47 puede tener más de 1, 2, 3 o 4 anillos de epiditiodioxopiperazina, pero no se limita a ellos.

Específicamente, un grupo experimental se prepara haciendo reaccionar en primer lugar el compuesto candidato que incluye anillos de epiditiodioxopiperazina, con Trx, TR, NADPH y EDTA en una solución tampón, después mezclando con H₂O2 para realizar una reacción de oxidación, y se prepara un grupo de control realizando la misma reacción sin la muestra, y después se puede comparar cada grupo monitorizando la disminución de absorbancia a 340 nm. En la presente memoria, el grupo de control presenta una absorbancia constante mientras que se observa una disminución de la absorbancia con el tiempo cuando se incluye el compuesto candidato que presenta la actividad 2-Cys-Prx, y la actividad es proporcional al grado de disminución de la absorbancia. En consecuencia, realizando la etapas anteriores, puede determinarse que el compuesto candidato que incluye anillos de epiditiodioxopiperazina para los que se observa la disminución de la absorbancia es un material que tiene actividades para prevenir o tratar la reestenosis vascular. La Trx y la TR pueden derivar de levadura, seres humanos o ratas, y preferiblemente pueden derivar de levadura. La identificación de si el compuesto presenta una actividad 2-Cys-peroxirredoxina (2-Cys-Prx) puede realizarse según un método descrito en la Publicación abierta a inspección pública de la solicitud de patente coreana n.° 10-2006-0020140.

[Modo para la invención]

A continuación en la memoria, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a los ejemplos. <Síntesis de un derivado de epiditiodioxopiperazina que incluye un enlace de puente disulfuro intramolecular> Ejemplo de preparación 1: Preparación de 2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]octano-6,8-diona (A1, Fórmula química 15)

A. 1,4-dibenzhidrilpiperazina-2,5-diona (2)

Después de que se dispersase NaH (disperso al 60 % en aceite mineral, 385 mg, 9,64 mmol) en 10 ml de DMF, se añadió glicina anhidra (500 mg, 4,38 mmol) en un baño de agua con hielo. Después de que la mezcla se agitase durante 10 minutos, se añadió lentamente bromodifenilmetano (2,27 g, 2,1 eq.). El resultado se hizo reaccionar durante la noche a temperatura ambiente. Se añadió agua a la solución de reacción y el resultado se agitó. Los precipitados se filtraron, se lavaron con agua y después se secaron a presión reducida para obtener 1,4-dibenzhidrilpiperazina-2,5-diona (2) (1,4 g, rendimiento del 71 %).

RMN 1H (400 MHz, CDCL): 5 ppm 7,39-7,31 (m, 12H), 7,21-7,19 (d, 8H), 7,09 (s, 2H), 3,83 (s, 4H).

B. 7,9-dibenzhidril-2,3,4,5-tetratia-7,9-diazabiciclo[4.2.2]decano-8,10-diona (3)

Después de que se dispersase azufre (402 mg, 12,54 mmol) en 5 ml de THF seco, se añadió LiHMDS (1,0 M en THF, 4,7 ml, 3,0 eq.) gota a gota durante 2 minutos en atmósfera de argón. Después de que la mezcla se agitase durante aproximadamente 1 minuto, una solución en la que el compuesto (2; 700 mg, 1,567 mmol) obtenido en la Etapa A se disolvió en 20 ml de THF se añadió gota a gota. Después de que el resultado se agitase durante aproximadamente 1 minuto, se añadió LiHMDS (1,0 M en THF, 3,13 ml, 2,0 eq.) gota a gota y después el resultado se agitó durante 30 minutos. Después de que la reacción se completase, el resultado se extrajo dos veces mediante la adición de una solución saturada de NH4Cl y acetato de etilo (EA) (x3). Las capas orgánicas se combinaron, se trataron con sulfato de magnesio, se filtraron y después el disolvente se retiró. El residuo se purificó usando cromatografía en columna de gel de sílice (Hex:EA = 2:1) para obtener 7,9-dibenzhidril-2,3,4,5-tetratia-7,9-diazabiciclo[4.2.2]decano-8,10-diona (3; 230 mg, rendimiento: 26 %).

RMN 1H (400 MHz, CDCL): 5 ppm 7,39-7,32 (m, 12H), 7,21 (m, 4H), 7,07 (m, 4H), 6,95 (s, 2H), 5,14 (s, 2H).

C. 3,6-dimercapto-1,4-dibenzhidrilpiperazina-2,5-diona (4)

Después de que se disolviese 7,9-dibenzhidril-2,3,4,5-tetratia-7,9-diazabiciclo[4.2.2]decano-8,10-diona (3; 230 mg, 0,401 mmol) en metanol, se añadió NaBH4 (45 mg, 3,0 eq.) lentamente en un baño de agua con hielo. Después de que la mezcla se agitase durante 30 minutos y la reacción se completase, el disolvente se retiró. Se añadieron EA y DCM (x3) al compuesto en bruto y el resultado se extrajo. Las capas orgánicas se combinaron, se trataron con sulfato de magnesio, se filtraron y después el disolvente se retiró. El residuo se secó a presión reducida para obtener 3,6-dimercapto-1,4-dibenzhidrilpiperazina-2,5-diona (4). El compuesto se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.

D. 5,7-dibenzhidril-2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]octano-6,8-diona (5)

Después de que el compuesto de ditiol (4) en bruto se disolviese en 30 ml de cloroformo, se añadieron 20 ml de una solución en la que se disolvió yodo (101 mg, 0,401 mmol) en cloroformo. Después de que la mezcla se hiciese reaccionar durante 30 minutos a temperatura ambiente, el disolvente se retiró y el residuo se purificó usando cromatografía en columna de gel de sílice (EA:Hex = 1:2) para obtener 5,7-dibenzhidril-2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]octano-6,8-diona (5) (130 mg, rendimiento del 63 % en 2 etapas).

RMN 1H (400 MHz, CDCh): 5 ppm 7,37-7,28 (m, 12H), 7,27 (m, 4H), 7,14 (m, 4H), 6,77 (s, 2H), 5,31 (s, 2H).

IEN-EM (M+Na): 531 calculado para C30H24N₂O₂S2508.

E. 2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]octano-6,8-diona (6; A1)

Después de que el compuesto en bruto (5; 50 mg) obtenido en la Etapa D se disolviese en ácido trifluoroacético (TFA, 1 ml), se añadió ácido tríflico (CF3SO3H, 0,1 ml) y se hizo reaccionar en un baño de agua con hielo. Después de que la mezcla se hiciese reaccionar durante 30 minutos, la reacción se terminó añadiendo agua helada a la solución de reacción y el resultado se agitó. Los sólidos producidos se filtraron y se secaron. Después de eso, los sólidos se agitaron en éter, se filtraron y se secaron a presión reducida para obtener 2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]octano-6,8-diona (6; 8 mg, 47 %). Los datos de RMN del producto final obtenido se mostraron en la FIG. 35.

RMN 1H (400 MHz, CDCh): 5 ppm 9,69 (s a 2H), 5,65 (d, 2H).

IEN-EM (M-1): 175 calculado para C4H4N₂O₂S2176.

Ejemplo de preparación 2: Preparación de 5,7-dimetil-2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]-octano-6,8-diona (A2, Fórmula química 7)

A. 3,6-dibromo-1,4-dimetilpiperazina-2,5-diona (2)

Después de que se dispersase un anhídrido de sarcosina (1) (500 mg, 3,52 mmol), N-bromosuccimida (1,87 g, 3,0 eq.) y peróxido de benzoílo (85 mg, 0,1 eq.) en tetracloruro de carbono (50 ml), la mezcla se calentó a reflujo durante 2 horas. Después de que la reacción se completase y el material de reacción se enfriase a temperatura ambiente, la succimida obtenida se filtró y se lavó con tetracloruro de carbono. Los filtrados se combinaron, se secaron con sulfato de magnesio y después se filtraron una vez más. El disolvente se retiró y el residuo se secó a presión reducida para obtener 3,6-dibromo-1,4-dimetilpiperazina-2,5-diona (2). El compuesto obtenido se usó tal cual para la siguiente reacción sin purificación adicional.

RMN 1H (400 MHz, CDCh): 5 ppm 6,04 (s, 2H), 3,15 (s, 6H).

B. 1,4-dimetil-3,6-dioxopiperazina-2,5-diil-dietanotioato (3)

Después de que se disolviese 3,6-dibromo-1,4-dimetilpiperazina-2,5-diona (2) (1,05 mg en bruto, 3,52 mmol) en diclorometano (DCM; 100 ml), se añadió tioacetato de potasio (1,2 g, 3,0 eq.) en un baño de agua con hielo. La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente y los precipitados obtenidos se filtraron y se lavaron con DCM. Los filtrados se combinaron y el disolvente se evaporó al vacío. El residuo se purificó usando cromatografía en columna de gel de sílice (DCM:acetato de etilo (EA) = 5:1) para obtener 1,4-dimetil-3,6-dioxopiperazina-2,5-diildietanotioato (3) (sólidos de color blanco; 200 mg, rendimiento del 20 % en 2 etapas).

RMN 1H (400 MHz, CDCh): 5 ppm 5,77 (s, 2H), 2,94 (s, 6H), 2,48 (s, 6H).

C. 3,6-dimercapto-1,4-dimetilpiperazina-2,5-diona (4)

Después de que se disolviese ditioacetato (195 mg, 0,67 mmol) en etanol (20 ml), se añadió una solución etanólica de ácido clorhídrico (preparada añadiendo 1,5 ml de cloruro de acetilo a 7 ml de etanol). La solución de mezcla se calentó a reflujo durante 2 horas. Después de que la reacción se completase, el disolvente se retiró y el residuo se secó a presión reducida para obtener 3,6-dimercapto-1,4-dimetilpiperazina-2,5-diona (4) en sólidos de color amarillo brillante (90 mg, 65 %). El compuesto obtenido se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.

RMN 1H (400 MHz, CDCta): 5 ppm 5,00 (s, 2H), 3,09 (s, 6H).

IEN-EM (M-1): 205 calculado para C6H10N₂O₂S2206.

D. 5,7-dimetil-2,3-ditio-5,7-diazabiciclo[2,2,2]octano-6,8-diona (5; A2

Una solución en la que se disolvió yodo (63 mg, 1,0 eq.) en 10 ml de DCM se añadió a una solución en la que se disolvió 3,6-dimercapto-1,4-dimetilpiperazina-2,5-diona (50 mg, 0,242 mmol) en 10 ml de cloroformo. La mezcla se hizo reaccionar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de que la reacción se completase, se vertió una solución saturada de NaHCO3 que contenía tiosulfato de sodio en el material de reacción y el resultado se agitó hasta que desapareció el color debido al yodo. Después de que la capa orgánica se separase y la capa acuosa se extrajese adicionalmente dos veces con DCM, las capas orgánicas se combinaron y después se secaron con sulfato de magnesio. Después de eso, la capa orgánica se filtró y se concentró al vacío para proporcionar un residuo, y el residuo se recristalizó usando etanol, se filtró, después se lavó con hexano (Hex) y se secó a presión reducida para obtener 5,7-dimetil-2,3-ditio-5,7-diazabiciclo[2,2,2]octano-6,8-diona (5) en sólidos de color amarillo brillante (18 mg, 36 %). Los datos de RMN del producto final obtenido se mostraron en la FIG. 36.

RMN 1H (400 MHz, CDCls): 5 ppm 5,21 (s, 2H), 3,12 (s, 6H).

IEN-EM (M+Na): 227 calculado para C6H8N₂O₂S2204.

Ejemplo de preparación 3: Preparación de 1,5,7-trimetil-2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]octano-6,8-diona (A3, Fórmula química 8)

A. 2-(2-cloroacetamido)propanoato de metilo (2)

Después de que se disolviese clorhidrato de éster metílico de alanina (2 g, 14,3 mmol) en 6 ml de agua, se añadió bicarbonato de sodio (NaHCOs; 2,8 g, 33,6 mmol) lentamente en un baño de agua con hielo. Al material de reacción se le añadió gota a gota una solución de cloruro de cloroacetilo (1,67 ml, 20,9 mmol) disuelta en 5 ml de tolueno para que se mezclaran, y el resultado se agitó vigorosamente durante 3 horas a temperatura ambiente. Después de que la reacción se completase, la capa orgánica se separó y la capa acuosa se lavó adicionalmente con tolueno. Las capas orgánicas se combinaron, se trataron con sulfato de magnesio, se filtraron y después el disolvente se retiró. El residuo se secó a presión reducida para obtener 2-(2-cloroacetamido)propanoato de metilo en bruto (2) (2,6 g). RMN 1H (400 MHz, CDCls): 5 ppm 7,23 (s a, 1H), 4,65 (m, 1H), 4,11 (s, 2H), 3,79 (s, 3H), 1,42 (d, 3H).

B. 3-metilpiperazina-2,5-diona (3)

Después de se disolviese 2-(2-cloroacetamido)propanoato de metilo (2; 2,6 g, 14,3 mmol) en 12 ml de etanol, se añadieron 6,1 ml (43,4 mmol) de una solución acuosa de amoníaco al 30 %. La mezcla se hizo reaccionar durante 5 horas a 70 °C. Después de que la reacción se completase y el material de reacción se enfriase a temperatura ambiente, el etanol se retiró. Cuando se formaron sólidos en la cantidad pequeña restante de agua, los sólidos se filtraron y después se lavaron con agua y hexano. Los sólidos lavados se secaron a presión reducida para obtener 3-metilpiperazina-2,5-diona (3) en sólidos de color blanco (420 mg, rendimiento del 23 % en 2 etapas).

1RMN H (400 MHz, DMSO-d6): 5 ppm 8,13 (s a, 1H), 7,95 (s a, 1H), 3,84 (c, 1H), 3,72 (s, 2H), 1,26 (d, 3H).

C. 1,3,4-trimetilpiperazina-2,5-diona (4)

Después de que se dispersase 3-metilpiperazina-2,5-diona (3; 420 mg, 3,28 mmol) en 25 ml de dimetilformamida (DMF), se añadió NaH (400 mg, 9,83 mmol) en un baño de agua con hielo. Se añadió yoduro de metilo (2 ml, 10 eq.) y la mezcla se agitó durante 4 horas a temperatura ambiente. Después de que la reacción se completase, la DMF se retiró y el residuo se purificó usando cromatografía en columna de gel de sílice (DCM:metanol = de 20:1 a 9:1) para obtener 1,3,4-trimetilpiperazina-2,5-diona (4) (sólidos incoloros; 440 mg, rendimiento del 86 %).

RMN 1H (400 MHz, CDCls): 5 ppm 4,08 (d, 1H), 3,92 (c, 1H), 3,85 (d, 1H), 2,98 (s, 6H), 1,47 (d, 3H).

D. 6,7,9-trimetil-2,3,4,5-tetratia-7,9-diazabiciclo[4.2.2]decano-8,10-diona (5)

Después de que se dispersase azufre (1,64 g, 51,2 mmol) en 20 ml de THF seco, se añadió NaHMDS (1,0 M en THF, 19,2 ml) gota a gota durante 2 minutos en atmósfera de argón. Después de que la mezcla se agitase durante aproximadamente 1 minuto, una solución en la que el compuesto (4; 1 g, 6,4 mmol) obtenido en la Etapa C se disolvió en 20 ml de THF se añadió gota a gota. Después de que el resultado se agitase durante aproximadamente 1 minuto, se añadió NaHMDS (1,0 M en THF, 12,8 ml, 2,0 eq.) gota a gota y después el resultado se agitó durante 30 minutos. Después de que la reacción se completase, el resultado se extrajo mediante la adición de una solución saturada de NH4Cl y DCM (x3). Las capas orgánicas se combinaron, se trataron con sulfato de magnesio, se filtraron y después el disolvente se retiró. El residuo se purificó usando cromatografía en columna de gel de sílice (EA:hexano = 1:1) para obtener 6,7,9-trimetil-2,3,4,5-tetratia-7,9-diazabiciclo[4.2.2]decano-8,10-diona (5; 250 mg, rendimiento: 14 %).

RMN 1H (400 MHz, CDCls): 5 ppm 5,13 (s, 1H), 3,06 (d, 6H), 2,00 (s, 3H).

E. 3,6-dimercapto-1,3,4-trimetilpiperazina-2,5-diona (6)

Después de que se disolviese 6,7,9-trimetil-2,3,4,5-tetratia-7,9-diazabiciclo[4.2.2]decano-8,10-diona (5) (250 mg, 0,885 mmol) en 20 ml de metanol, el resultado se añadió lentamente a NaBH4 (167 mg, 4,43 mmol) en un baño de agua con hielo. Después de que la mezcla se agitase durante 30 minutos y la reacción se completase, el disolvente se retiró. Se añadieron agua y DCM (x3) al compuesto en bruto y el resultado se extrajo. Las capas orgánicas se combinaron, se trataron con sulfato de magnesio, se filtraron y después el disolvente se retiró. El residuo se secó a presión reducida para obtener 3,6-dimercapto-1,3,4-trimetilpiperazina-2,5-diona (6). El compuesto se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.

F. 1,5,7-trimetil-2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]octano-6,8-diona (7; A3)

Después de que el compuesto de ditiol (35 mg) obtenido anteriormente se disolviese en 30 ml de cloroformo, se añadieron 25 ml de una solución en la que se disolvió yodo (249 mg, 1,0 eq.) en cloroformo. Después de que la mezcla se hiciese reaccionar durante 30 minutos a temperatura ambiente, el disolvente se retiró y el residuo se purificó usando cromatografía en columna de gel de sílice (EA:Hex = 1:1) para obtener 1,5,7-trimetil-2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]octano-6,8-diona (7) en sólidos de color amarillo brillante (24 mg, rendimiento del 12 % en 2 etapas). Los datos de RMN del producto final obtenido se mostraron en la FIG. 38.

RMN 1H (400 MHz, CDCta): 5 ppm 5,29 (s, 1H), 3,14 (s, 3H), 3,03 (s, 1H), 1,98 (s, 3H).

IEN-EM (M+Na): 241 calculado para C7H10N₂O₂S2218.

Ejemplo de preparación 4: Preparación de 1,4-bis(4-metoxibencil)-2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]octano-6,8-diona (A4, Fórmula química 9)

A. 1,4-bis(4-metoxibencil)piperazina-2,5-diona (2)

Después de que se dispersase NaH (1,54 g, 38,5 mmol) en 20 ml de DMF, se añadió glicina anhidra (2 g, 17.5 mmol) en un baño de agua con hielo. Después de que la mezcla se agitase durante 10 minutos, se añadió cloruro de bencilo (5,94 ml, 2,5 eq.) lentamente durante 30 minutos. Después de que el resultado se hiciese reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente, se añadió agua y el resultado se agitó. Los precipitados se filtraron y después se lavaron con agua. El compuesto sólido obtenido se agitó en un disolvente mixto de EA y hexano (EA:Hex = 9:1), se filtró y después se secó a presión reducida para obtener 1,4-bis(4-metoxibencil)piperazina-2,5-diona (2; 5,1 g, 82 %).

RMN 1H (400 MHz, CDCls): 5 ppm 7,21 (d, 4H), 6,87 (d, 4H), 4,51 (s, 4H), 3,89 (s, 4H), 3,80 (s, 6H).

B. 7,9-bis(4-metoxibencil)-2,3,4,5-tetratia-7,9-diazabiciclo[4.2.2]decano-8,10-diona (3)

Después de que se dispersase azufre (72 mg, 2,257 mmol) en 2 ml de THF seco, se añadió NaHMDS (1,0 M en THF, 0,85 ml, 3,0 eq.) gota a gota durante 2 minutos en atmósfera de argón. Después de que la mezcla se agitase durante aproximadamente 1 minuto, una solución en la que el compuesto (2; 100 mg, 0,282 mmol) obtenido en la Etapa A se disolvió en 20 ml de THF se añadió gota a gota. Después de que el resultado se agitase durante aproximadamente 1 minuto, se añadió NaHMDS (1,0 M en THF, 0,56 ml, 2,0 eq.) gota a gota y el resultado se agitó durante 30 minutos. Después de que la reacción se completase, el resultado se extrajo mediante la adición de una solución saturada de NH4Cl y EA (x2). Las capas orgánicas se combinaron, se trataron con sulfato de magnesio, se filtraron y después el disolvente se retiró. El residuo se purificó usando cromatografía en columna de gel de sílice (Hex:EA = de 4:1 a 2:1) para obtener 7,9-bis(4-metoxibencil)-2,3,4,5-tetratia-7,9-diazabiciclo[4.2.2]decano-8,10-diona (3; 35 mg, rendimiento: 26 %).

RMN 1H (400 MHz, CDCls): 5 ppm 7,21 (d, 4H), 6,87 (d, 4H), 5,37 (d, 2H), 4,99 (s, 2H), 3,84 (d, 2H), 3,81 (s, 6H). C. 3,6-dimercapto-1,4-bis(4-metoxibencil)piperazina-2,5-diona (4)

Después de que se disolviese 7,9-bis(4-metoxibencil)-2,3,4,5-tetratia-7,9-diazabiciclo[4.2.2]decano-8,10-diona (3) (420 mg, 0,873 mmol) en 20 ml de metanol, el resultado se añadió lentamente a NaBH4 (99 mg, 3,0 eq.) en un baño de agua con hielo. Después de que la mezcla se agitase durante 30 minutos y la reacción se completase, el disolvente se retiró. Se añadieron EA y DCM (x3) al compuesto en bruto y el resultado se extrajo. Las capas orgánicas se combinaron, se trataron con sulfato de magnesio, se filtraron y después el disolvente se retiró. El residuo se secó a presión reducida para obtener 3,6-dimercapto-1,4-bis(4-metoxibencil)piperazina-2,5-diona (4). El compuesto se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.

RMN 1H (400 MHz, CDCls): 5 ppm 7,20 (d, 4H), 6,89 (d, 4H), 5,21 (d, 2H), 4,93 (s, 2H), 4,12 (d, 2H), 3,85 (s, 6H), 3.05 (s a, 2H).

IEN-EM (M+Na): 441 calculado para C20H22N₂O4S2418.

D. 5,7-bis(4-metoxibencil)-2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]octano-6,8-diona (5; A4)

Después de que el compuesto de ditiol (4; 380 mg) obtenido anteriormente se disolviese en 50 ml de cloroformo, se añadieron 100 ml de una solución en la que se disolvió yodo (221 mg, 0,873 mmol) en cloroformo. Después de que la mezcla se hiciese reaccionar durante 30 minutos a temperatura ambiente, el disolvente se retiró y el residuo se purificó usando cromatografía en columna de gel de sílice (EA:Hex = 1:1) para obtener 5,7-bis(4-metoxibencil)-2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]octano-6,8-diona (5) (120 mg, rendimiento del 33 % en 2 etapas). Los datos de RMN del producto final obtenido se mostraron en la FIG. 39.

RMN 1H (400 MHz, CDCls): 5 ppm 7,22 (d, 4H), 6,91 (d, 4H), 5,21 (s, 2H), 4,77 (d, 2H), 4,45 (d, 2H), 3,81 (s, 6H). IEN-EM (M+Na): 439 calculado para C20H20N₂O4S2416.

Ejemplo de preparación 5: Preparación de 5,7-dialil-2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]octano-6,8-diona (A5, Fórmula química 10)

A. 1,4-dialilpiperazina-2,5-diona (2)

Después de que se dispersase NaH (1,3 g, 32,8 mmol) en 25 ml de DMF, se añadió glicina anhidra (1,5 g, 13,1 mmol) en un baño de agua con hielo. Después de que la mezcla se agitase durante 10 minutos, se le añadió cloruro de alilo (3,2 ml, 3,0 eq.) lentamente durante 30 minutos. El resultado se hizo reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente y después la solución de reacción se extrajo añadiendo EA (x2) y una solución saturada de NH4Cl. Las capas orgánicas se combinaron, se trataron con sulfato de magnesio, se filtraron y después el disolvente se retiró. El residuo se purificó usando cromatografía en columna de gel de sílice (DCM:EA = 1:1) para obtener 1,4-dialilpiperazina-2,5-diona (2) (1,4 g, rendimiento del 56 %).

RMN 1H (400 MHz, CDCta): 5 ppm 5,79-5,69 (m, 2H), 5,30-5,22 (m, 4H), 4,04 (d, 4H), 3,96 (s, 4H).

B. 7,9-dialil-2,3,4,5-tetratia-7,9-diazabiciclo[4.2.2]decano-8,10-diona (3)

Después de que se dispersase azufre (1,32 g, 41,2 mmol) en 10 ml de THF seco, se añadió NaHMDS (1,0 M en THF, 15,4 ml, 3,0 eq.) gota a gota durante 2 minutos en atmósfera de argón. Después de que la mezcla se agitase durante aproximadamente 1 minuto, una solución en la que el compuesto (2; 1 g, 5,15 mmol) obtenido en la Etapa A se disolvió en 20 ml de THF se añadió gota a gota. Después de que el resultado se agitase durante aproximadamente 1 minuto, se añadió NaHMDS (1,0 M en THF, 10,3 ml, 2,0 eq.) gota a gota y el resultado se agitó durante 30 minutos. Después de que la reacción se completase, el resultado se extrajo mediante la adición de una solución saturada de NH4Cl y EA (x3). Las capas orgánicas se combinaron, se trataron con sulfato de magnesio, se filtraron y después el disolvente se retiró. El residuo se purificó usando cromatografía en columna de gel de sílice (Hex:EA = de 9:1 a 4:1) para obtener 7,9-dialil-2,3,4,5-tetratia-7,9-diazabiciclo[4.2.2]decano-8,10-diona (3; 530 mg, rendimiento: 32 %).

RMN 1H (400 MHz, CDCls): 5 ppm 5,83-5,73 (m, 2H), 5,40-5,33 (m, 4H), 5,21 (s, 2H), 4,81 (d, 2H), 3,51-3,45 (m, 2H).

C. 3,6-dimercapto-1,4-dialilpiperazina-2,5-diona (4)

Después de que se disolviese 7,9-dialil-2,3,4,5-tetratia-7,9-diazabiciclo[4.2.2]decano-8,10-diona (3) (530 mg, 1,65 mmol) en un disolvente mixto de metanol/THF, se añadió NaBH4 (187 mg, 3,0 eq.) lentamente en un baño de agua con hielo. Después de que la mezcla se agitase durante 30 minutos y la reacción se completase, el disolvente se retiró. Se añadieron EA y DCM (x3) al compuesto en bruto y el resultado se extrajo. Las capas orgánicas se combinaron, se trataron con sulfato de magnesio, se filtraron y después el disolvente se retiró. El residuo se secó a presión reducida para obtener 3,6-dimercapto-1,4-dialilpiperazina-2,5-diona (4). El compuesto se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.

RMN 1H (400 MHz, CDCls): 5 ppm 5,80-5,70 (m, 2H), 5,39-5,31 (m, 4H), 5,07 (s, 2H), 4,68 (d, 2H), 3,70-3,64 (m, 2H), 3,09 (s a, 2H).

D. 5,7-dialil-2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]octano-6,8-diona (5; A5)

Después de que el compuesto de ditiol (4; 430 mg) obtenido anteriormente se disolviese en 30 ml de cloroformo, se añadieron 60 ml de una solución en la que se disolvió yodo (419 mg, 1,0 eq.) en cloroformo. Después de que la mezcla se hiciese reaccionar durante 30 minutos a temperatura ambiente, el disolvente se retiró y el residuo se purificó usando cromatografía en columna de gel de sílice (EA:Hex = de 1:9 a 1:4) para obtener 5,7-dialil-2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]octano-6,8-diona (5) (110 mg, rendimiento del 26 % en 2 etapas). Los datos de RMN del producto final obtenido se mostraron en la FIG. 41.

RMN 1H (400 MHz, CDCla): 5 ppm 5,86-5,81 (m, 2H), 5,38-5,34 (m, 4H), 5,30 (s, 2H), 4,32-4,27 (m, 2H), 4,00-3,95 (m, 2H).

IEN-EM (M+K): 295 calculado para C10H12N₂O₂S2256.

Ejemplo de preparación 6: Preparación de 5-(4-metoxibencil)-2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]octano-6,8-diona (A6, Fórmula química 11)

A. 1,4-bis(4-metoxibencil)piperazina-2,5-diona (2)

Se obtuvo 1,4-bis(4-metoxibencil)piperazina-2,5-diona (2) de la misma manera que en la Etapa A del Ejemplo de preparación 3.

B. 3,6-dibromo-1,4-bis(4-metoxibencil)piperazina-2,5-diona (3)

Después de que se dispersasen 1,4-bis(4-metoxibencil)piperazina-2,5-diona (2; 1 g, 2,82 mmol), N-bromosuccimida (1,05 g, 2,1 eq.) y peróxido de benzαlo (6,8 mg, 0,01 eq.) en tetracloruro de carbono (250 ml), la mezcla se hizo reaccionar durante 2 horas mientras se calentaba a reflujo. Después de que la reacción se completase y el material de reacción se enfriase a temperatura ambiente, los sólidos producidos se filtraron. El disolvente se retiró y el resultado se secó a presión reducida para obtener 3,6-dibromo-1,4-bis(4-metoxibencil)piperazina-2,5-diona (3). El compuesto obtenido se usó tal cual para la siguiente reacción sin purificación adicional.

RMN 1H (400 MHz, CDCta): 5 ppm 7,22 (d, 4H), 6,89 (d, 4H), 5,89 (s, 2H), 5,30 (d, 2H), 3,93 (d, 2H), 3,82 (s, 6H). C. 1,4-bis(4-metoxibencil)-3,6-dioxopiperazina-2,5-diil-dietanotioato (4)

Después de que se disolviese 3,6-dibromo-1,4-bis(4-metoxibencil)piperazina-2,5-diona (3; 1,44 g, 2,82 mmol) en diclorometano (DCM; 100 ml), se añadió tioacetato de sodio (966 mg, 3,0 eq.) en un baño de agua con hielo. La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente y los precipitados obtenidos se filtraron, y el disolvente se retiró. El resultado se purificó usando cromatografía en columna de gel de sílice (Hex:EA = de 2:1 a 1,5:1) para obtener 1,4-bis(4-metoxibencil)-3,6-dioxopiperazina-2,5-diil-dietanotioato (4) (600 mg, rendimiento del 43 % en 2 etapas).

RMN 1H (400 MHz, CDCls): 5 ppm 7,22 (d, 4H), 6,86 (d, 4H), 5,83 (s, 2H), 4,98 (d, 2H), 3,89 (d, 2H), 3,81 (s, 6H), 2,45 (s, 6H).

D. 1 -(4-metoxibencil)-3,6-dioxopiperazina-2,5-diil-dietanotioato (5)

Después de que se disolviese 1,4-bis(4-metoxibencil)-3,6-dioxopiperazina-2,5-diil-dietanotioato (4; 1,37 g, 2,73 mmol) en un disolvente mixto de ACN/H₂O (90 ml/20 ml), se añadió nitrato de amonio cérico ((NH4^Ce(NO3)6; CAN, 4,5 g, 3,0 eq), y la mezcla se agitó durante 2 horas. Después de que el disolvente orgánico se retirase, el resultado se extrajo añadiendo DCM (x2) y agua. El disolvente orgánico se trató con sulfato de magnesio, se filtró y después el disolvente se retiró. El residuo se purificó usando cromatografía en columna de gel de sílice (Hex:EA = de 2:1 a 1,5:1) para obtener 1-(4-metoxibencil)-3,6-dioxopiperazina-2,5-diil-dietanotioato (5; 380 mg, 36 %).

RMN 1H (400 MHz, CDCls): 5 ppm 7,27 (d, 2H), 6,88 (d, 2H), 6,73 (s a, 1H), 5,78-5,74 (m, 2H), 5,12 (d, 1H), 3,81 (s, 3H), 3,78 (d, 1H), 2,46 (s, 6H)

E. 3,6-dimercapto-1-(4-metoxibencil)piperazina-2,5-diona (6)

Después de que el ditioacetato (5; 150 mg, 0,392 mmol) se dispersase en etanol (20 ml), se añadió una solución etanólica de ácido clorhídrico (preparada añadiendo 1,5 ml de cloruro de acetilo a 7 ml de etanol). La solución de mezcla se hizo reaccionar durante 2 horas mientras se calentaba a reflujo. Después de que la reacción se completase, el disolvente se retiró y el residuo se secó a presión reducida para obtener 3,6-dimercapto-1-(4-metoxibencil)piperazina-2,5-diona (6). El compuesto obtenido se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.

F. 5-(4-metoxibencil)-2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]octano-6,8-diona (7; A6)

Una solución en la que se disolvió yodo (99,5 mg, 1,0 eq.) en 15 ml de DCM se añadió a una solución en la que se disolvió 3,6-dimercapto-1-(4-metoxibencil)piperazina-2,5-diona (6; 117 mg, 0,392 mmol) en 20 ml de DCM. La mezcla se hizo reaccionar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de que la reacción se completase, el disolvente se retiró y el residuo se purificó dos veces usando cromatografía en columna de gel de sílice (Hex:EA = 1:1) para obtener 5-(4-metoxibencil)-2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]octano-6,8-diona (7) (4 mg). Los datos de RMN del producto final obtenido se mostraron en la FIG. 43.

RMN 1H (400 MHz, CDCl3): 5 ppm 7,23 (d, 2H), 7,15 (s a, 1H), 6,89 (d, 2H), 5,39 (d, 1H), 5,14 (s, 1H), 4,84 (d, 1H), 4,45 (d, 1H), 3,81 (s, 3H).

IEN-EM (M+Na): 319 calculado para C12H12N₂O3S2296.

Ejemplo de preparación 7: Preparación de 5,7-dibenzhidril-2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]octano-6,8-diona (A7, Fórmula química 12)

Se obtuvo 5,7-dibenzhidril-2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]octano-6,8-diona de la misma manera que en las Etapas A a D del Ejemplo de preparación 1. Los datos de RMN del producto final obtenido se mostraron en la FIG. 44.

RMN 1H (400 MHz, CDCls): 5 ppm 7,37-7,28 (m, 12H), 7,27 (m, 4H), 7,14 (m, 4H), 6,77 (s, 2H), 5,31 (s, 2H).

IEN-EM (M+Na): 531 calculado para C₃0H24N₂O₂S2508.

Ejemplo de preparación 8: Preparación de 5,7-dibutil-2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]octano-6,8-diona (A8, Fórmula química 13)

A. 1,4-dibutilpiperazina-2,5-diona (2)

Después de que se dispersase NaH (430 mg, 10,95 mmol) en 10 ml de DMF, se añadió glicina anhidra (500 mg, 4,38 mmol) en un baño de agua con hielo. Después de que la mezcla se agitase durante 10 minutos, se añadió 1-bromobutano (1,8 g, 13,14 mmol, 3 eq.) lentamente durante 30 minutos. El resultado se hizo reaccionar durante la noche a temperatura ambiente y la solución de reacción se inactivó con una solución saturada de NH4O y después se extrajo con EA (x2). Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con agua, se secaron con sulfato de magnesio y después se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida y el residuo se purificó usando cromatografía en columna de gel de sílice (DCM:EA = 1:1) para obtener 1,4-dibutilpiperazina-2,5-diona (2) (410 mg, rendimiento del 41 %, aceite de color amarillo).

RMN 1H (400 MHz, CDCl₃): 5 ppm 3,95 (s, 4H), 3,39 (t, 4H), 1,54 (m, 4H), 1,34 (m, 4H), 0,94 (t, 6H).

B. 7,9-dibutil-2,3,4,5-tetratia-7,9-diazabiciclo[4.2.2]decano-8,10-diona (3)

Después de que se dispersase azufre (450 mg, 14,16 mmol) en 5 ml de THF seco, se añadió LiHMDS (1,0 M en THF, 5,31 ml, 3,0 eq.) gota a gota durante 2 minutos en atmósfera de argón. Después de que la mezcla se agitase durante aproximadamente 1 minuto, una solución en la que el compuesto (2; 400 mg, 1,567 mmol) obtenido en la Etapa A se disolvió en 20 ml de THF se añadió gota a gota. Después de que el resultado se agitase durante aproximadamente 1 minuto, se añadió LiHMDS (1,0 M en THF, 3,54 ml, 2,0 eq.) gota a gota y el resultado se agitó durante 30 minutos. Después de que la reacción se completase, el resultado se extrajo mediante la adición de una solución saturada de NH4Cl y EA (x3). Las capas orgánicas se combinaron, se trataron con sulfato de magnesio, se filtraron y después se concentraron a presión reducida. El resultado se purificó usando cromatografía en columna de gel de sílice (Hex:EA = 3:1) para obtener 7,9-dibutil-2,3,4,5-tetratia-7,9-diazabiciclo[4.2.2]decano-8,10-diona (3; 100 mg, rendimiento: 16 %).

RMN 1H (400 MHz, CDCls): 5 ppm 5,15 (s, 2H), 3,90 (m, 2H), 3,05 (m, 2H), 1,61 (m, 4H), 1,35 (m, 4H), 0,95 (t, 6H). C. 3,6-dimercapto-1,4-dibutilpiperazina-2,5-diona (4)

Después de que se disolviese 7,9-dibutil-2,3,4,5-tetratia-7,9-diazabiciclo[4.2.2]decano-8,10-diona (3; 100 mg, 0,28 mmol) en un disolvente mixto de metanol/THF (1:1), se añadió NaBH4(32 mg, 0,84 mmol, 3,0 eq.) lentamente en un baño de agua con hielo. Después de que la mezcla se agitase durante 30 minutos y la reacción se completase, el disolvente se retiró. Una solución saturada de NH4Cl y EA (x3) se añadieron al compuesto en bruto y el resultado se extrajo. Las capas orgánicas se combinaron, se secaron con sulfato de magnesio, se filtraron y después se concentraron a presión reducida para obtener 3,6-dimercapto-1,4-dibutilpiperazina-2,5-diona (4). El compuesto se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.

RMN 1H (400 MHz, CDCls): 5 ppm 5,03 (d, 2H), 3,80 (m, 2H), 3,21 (m, 2H), 1,63 (m, 4H), 1,37 (m, 4H), 0,96 (t, 6H). D. 5,7-dibutil-2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]octano-6,8-diona (5; A8)

Después de que el compuesto de ditiol (4) en bruto obtenido anteriormente se disolviese en 30 ml de cloroformo, se añadieron 20 ml de una solución en la que se disolvió yodo (86 mg, 0,34 mmol) en cloroformo. La mezcla se hizo reaccionar durante 30 minutos a temperatura ambiente y el disolvente se retiró por concentración a presión reducida, y el residuo se purificó usando cromatografía en columna de gel de sílice (EA:Hex = 1:3) para obtener 5,7-dibutil-2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]octano-6,8-diona (5) (26 mg, rendimiento del 32 % en 2 etapas). Los datos de RMN del producto final obtenido se mostraron en la FIG. 45.

RMN 1H (400 MHz, CDCta): 5 ppm 5,27 (s, 2H), 3,50 (m, 4H), 1,66 (m, 4H), 1,35 (m, 4H), 0,95 (t, 6H).

IEN-EM (M+Na): 311 calculado para C12H20N₂O₂S2288.

Ejemplo de preparación 9: Preparación de 5,7-bis(3-metoxipropil)-2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]octano-6,8-diona (A9, Fórmula química 14)

A. 1,4-bis(3-metoxipropil)piperazina-2,5-diona (2)

Después de que se dispersasen glicina anhidra (0,5 g, 4,38 mmol) y K₂CO3 (2,12 g, 15,33 mmol) en 10 ml de DMSO, la temperatura se elevó a 80 °C y la mezcla se agitó durante 15 minutos a esa temperatura. Se añadió 1-cloro-3 metoxipropano (1,43 ml, 13,14 mmol) lentamente gota a gota. Después de que el resultado se hiciese reaccionar durante 24 horas a 80 0C, la reacción se terminó y los sólidos se filtraron. Los sólidos filtrados se purificaron usando cromatografía en columna de gel de sílice (DCM:MeOH = 9:1) para obtener 1,4-bis(3-metoxipropil)piperazina-2,5-diona (2) (350 mg, rendimiento del 31 %). El DMSO residual se lavó adicionalmente con agua.

RMN 1H (400 MHz, CDCls): 5 ppm 3,98 (s, 4H), 3,48 (t, 4H), 3,41 (t, 4H), 3,32 (s, 6H), 1,84 (m, 4H).

B. 3,6-dibromo-1,4-bis(3-metoxipropil)piperazina-2,5-diona (3)

Después de que se dispersasen 1,4-bis(4-metoxipropil)piperazina-2,5-diona (2; 200 mg, 0,77 mmol), N-bromosuccimida (276 mg, 1,55 mmol, 2,01 eq.) y azo-bis-isobutironitrilo (AIBN; 6,3 mg, 0,04 mmol, 0,05 eq.) en tetracloruro de carbono (50 ml), la mezcla se hizo reaccionar durante 2 horas mientras se calentaba a reflujo. Después de que la reacción se completase y el material de reacción se enfriase a temperatura ambiente, los sólidos producidos se filtraron. El disolvente se retiró y el resultado se secó a presión reducida para obtener 3,6-dibromo-1,4-bis(3-metoxipropil)piperazina-2,5-diona (3). El compuesto obtenido se usó tal cual para la siguiente reacción sin purificación adicional.

RMN 1H (400 MHz, CDCls): 5 ppm 6,21 (s, 2H), 3,92 (m, 2H), 3,41 (m, 4H), 3,32 (s, 6H), 3,25 (m, 2H), 1,87 (m, 4H). C. 1,4-bis(3-metoxipropil)-3,6-dioxopiperazina-2,5-diil-dietanotioato (4)

Después de que se disolviese 3,6-dibromo-1,4-bis(4-metoxipropil)piperazina-2,5-diona (3; 400 mg, 0,96 mmol) en 30 ml de DCM, se añadió tioacetato de sodio (329 mg, 2,888 mmol, 3,0 eq.) en un baño de agua con hielo. Después de que la mezcla se agitase durante la noche a temperatura ambiente, los sólidos producidos se filtraron y después el disolvente se retiró de la solución. El resultado se purificó usando cromatografía en columna de gel de sílice (EA:Hex = de 1:1 a 3:1) para obtener 1,4-bis(4-metoxipropil)-3,6-dioxopiperazina-2,5-diil-dietanotioato (4) (65 mg, rendimiento del 6,4 % en 2 etapas).

RMN 1H (400 MHz, CDCl3): 5 ppm 5,88 (s, 2H), 3,95 (m, 2H), 3,43 (m, 4H), 3,37 (s, 6H), 2,98 (m, 2H), 2,43 (s, 6H), 1,90 (m, 4H).

D. 3,6-dimercapto-1,4-bis(3-metoxipropil)piperazina-2,5-diona (5)

Después de que el ditioacetato (4; 40 mg, 0,1 mmol) se dispersase en etanol, una solución etanólica de ácido clorhídrico (preparada añadiendo 0,75 ml de cloruro de acetilo a 3,5 ml de etanol) se añadió gota a gota y la solución de mezcla se hizo reaccionar durante 2 horas mientras se calentaba a reflujo. Después de que la reacción se completase y el material de reacción se enfriase a temperatura ambiente, el disolvente orgánico se retiró y el residuo se secó para obtener 3,6-dimercapto-1,4-bis(metoxipropil)piperazina-2,5-diona (5). El compuesto obtenido se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.

RMN 1H (400 MHz, CDCls): 5 ppm 5,08 (d, 2H), 3,89 (m, 2H), 3,41 (m, 4H), 3,35 (s, 6H), 3,23 (m, 2H), 3,18 (d, 2H), 1,93 (m, 4H).

E. 5,7-bis(3-metoxipropil)-2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]octano-6,8-diona (6; A9)

Una solución en la que se disolvió yodo (20,3 mg, 0,08 mmol, 1,0 eq.) en 15 ml de DCM se añadió a una solución en la que se disolvió 3,6-dimercapto-1,4-bis(metoxipropil)piperazina-2,5- diona (5; 25 mg, 0,08 mmol) en 10 ml de cloroformo y la mezcla se hizo reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de que la reacción se completase, el disolvente se retiró y el residuo se purificó usando cromatografía en columna de gel de sílice (Hex:EA = 1:1 a 1:2) para obtener 5,7-bis(metoxipropil)-2,3-ditia-5,7-diazabiciclo[2.2.2]octano-6,8-diona (6) (9 mg, rendimiento del 36 %). Los datos de RMN del producto final obtenido se mostraron en la FIG. 46.

RMN 1H (400 MHz, CDCls): 5 ppm 5,35 (s, 2H), 3,69 (m, 2H), 3,57-39 (m, 6H), 3,36 (s, 6H), 1,93 (m, 4H).

IEN-EM (M+Na): 343 calculado para C12H20N₂O4S2320.

<Síntesis del derivado de piperazinadiona que incluye el grupo ditiol reducido>

Ejemplo de preparación 10: 3,6-dimercapto-1,4-dimetilpiperazina-2,5-diona (A2R)

Se obtuvo 3,6-dimercapto-1,4-dimetilpiperazina-2,5-diona de la misma manera que en las Etapas A a C del Ejemplo de preparación 2. Los datos de RMN del producto final obtenido se mostraron en la FIG. 37.

RMN 1H (400 MHz, CDCta): 5 ppm 5,00 (s, 2H), 3,09 (s, 6H).

IEN-EM (M-1): 205 calculado para C6H10N₂₀2S2206.

Ejemplo de preparación 11: 3,6-dimercapto-1,4-bis(4-metoxibencil)piperazina-2,5-diona (A4R)

Se obtuvo 3,6-dimercapto-1,4-bis(4-metoxibencil)piperazina-2,5-diona de la misma manera que en las Etapas A a C del Ejemplo de preparación 4. Los datos de RMN del producto final obtenido se mostraron en la FIG. 40.

RMN 1H (400 MHz, CDCta): 5 ppm 7,20 (d, 4H), 6,89 (d, 4H), 5,21 (d, 2H), 4,93 (s, 2H), 4,12 (d, 2H), 3,85 (s, 6H), 3,05 (s a, 2H).

IEN-EM (M+Na): 441 calculado para C20H22N₂O4S2418.

Ejemplo de preparación 12: 3,6-dimercapto-1,4-dialilpiperazina-2,5-diona (A5R)

Se obtuvo 3,6-dimercapto-1,4-dialilpiperazina-2,5-diona de la misma manera que en las Etapas A a C del Ejemplo de preparación 5. Los datos de RMN del producto final obtenido se mostraron en la FIG. 42.

RMN 1H (400 MHz, CDCls): 5 ppm 5,80-5,70 (m, 2H), 5,39-5,31 (m, 4H), 5,07 (s, 2H), 4,68 (d, 2H), 3,70-3,64 (m, 2H), 3,09 (s a, 2H).

Ejemplo 1: Materiales

Los anticuerpos anti-PrxI y PrxII se adquirieron en AbFrontier (Seúl, Corea). La secuencia del ARNip específico de PrxII utilizado en la presente invención fue la siguiente: 5'-CGCUUGUCUGAGGAUUACGUU-3' (ARNip-1 de PrxII humana, Prx2-1; número de secuencia 1), 5'-AGGAAUAUUUCCCAACAUU-3' (ARNip-2 de PrxII humana, Prx2-2; número de secuencia 2), 5'-ACTCAACTGCCAAGTGATTUU-3' (ARNip de PrxI humana, Prx1; número de secuencia 3) y 5'-AAAUCAAGCUUUCGGACUAUU-3' (ARNip-1 de PrxII de ratón, mPrx2-1; número de secuencia 4). El dúplex de oligonucleótidos de ARNip se sintetizó a partir de Dharmacon. El ARNip de luciferasa de luciérnaga se sintetizó y se usó como ARNip de control. El dúplex de ARNip se transfectó según el protocolo del fabricante usando ARNi de Lipofectamine MAX™(Invitrogen).

Un grupo SMART de cuatro dúplex de ARNip para PrxII de rata (5'-GCAACGCGCACAUCGGAAAUU-3' (número de secuencia 5), 5'-GAUCACAGUCAACGACCUAUU-3' (número de secuencia 6), 5'-AGAAUUACGGCGUGUUGAAUU-3' (número de secuencia 7) and 5'-ACGCUGAGGACUUCCGAAAUU-3' (número de secuencia 8); N.° de cat. de Dharmacon D-089973) se usó para experimentos de lesiones carotídeas por globo en ratas. El ARNip de luciferasa de luciérnaga se sintetizó y se usó como ARNip de control.

La gliotoxina, la quetocina y la quetomina se adquirieron en Sigma-Aldrich. La bis(metiltio)gliotoxina se adquirió en Santa Cruz Biotechnology. SU-5416 se adquirió en Calbiochem. Los anticuerpos fosfo-PLCY1 (pY783), P^lC^y1 y fosfo-VEGFR2 (pY1175) se adquirieron en Cell Signaling Technology. Los anticuerpos anti-PDGFR-p (M-20) y KDR/Flk-1 (VeGfR2) se adquirieron en Santa Cruz Biotechnology. La antifosfotirosina (4G10) y el p Dg F-BB se adquirieron en Upstate. Los VEGF-A (VEGF165 humano) se adquirieron en R&D Systems. El anticuerpo de ratón anti-CD31 de rata se adquirió en BD Bioscience. Los anticuerpos secundarios de burro anti-conejo conjugados con Alexa Fluor 488 y de burro anti-ratón conjugados con Alexa Fluor 568 se adquirieron en Invitrogen. Los sustratosde cabra antiIgG de conejo biotinilado, Avidina-HRP y DAB se adquirieron en Vector Laboratories. Los anticuerpos policlonales de conejo contra PrxI, PrxII, Prx-SO2/3 y fosfo-PDGFRp(pY857) se prepararon como se describió anteriormente [MH Choi y col., 2005, Nature, 435: 347].

Ejemplo 2: Cultivo celular

Se adquirieron células endoteliales aórticas humanas (CEAH) y células de músculo liso aórtico humanas (CMLAH) en Clonetics-Bio Whittaker (Venders, Bélgica). Las células se sembraron en una placa recubierta con gelatina al 0,1 % y se cultivaron a 37 0C en una incubadora humidificada que incluía dióxido de carbono al 5 % en medio basal endotelial (EBM™-2) y medio basal de células de músculo liso (SmBM™) SingleQuotes® que incluía suero bovino fetal (FBS) al 10 % y suplementos completos (N.° de cat. cc-4176 para CEAH y N.° de cat. cc-4149 para CMLAH; Clonetics-BioWhittaker), respectivamente. En la presente invención se usaron células de los pases 5 a 7.

Se cultivaron estirpes celulares de melanoma SK-MEL-5, A375 y B16F10 a 37 0C en una incubadora de CO2 usando medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que incluía suero bovino fetal (FBS) al 10 %. Se cultivaron células SK-MEL-28 y G361 en un medio RPMI 1640 que incluía FBS al 10 %.

Se cultivaron melanocitos epidérmicos humanos en Medio 254 (Cascade Biologies™ que incluía suplementos de crecimiento de melanocitos humanos. Las estirpes celulares de melanoma y los melanocitos utilizados en la presente invención se adquirieron en la American Type Culture Collection.

Ejemplo 3: Ensayo de actividad peroxidasa

El ensayo de actividad peroxidasa para los derivados de epiditiodioxopiperazina según la presente invención (a continuación en la memoria, denominados compuestos de ETP) se realizó según métodos conocidos [Patente coreana N.° 10-0953326]. Se realizó una reacción de peroxidasa estándar para el ensayo espectrofotométrico usando una mezcla de reacción de 200 μl de solución tampón Hepes-NaOH 50 mM que contenía EDTA 1 mM (pH 7,0) que incluía NADPH 250 μM, tiorredoxina de levadura (Trx) 3 μM, tiorredoxina reductasa de levadura 1,5 μM (TR), compuesto de ETP 25 μM y 1,2 ml de peróxido de hidrógeno. Para la comparación con una reacción de peroxidasa dependiente de glutatión (GSH), se añadieron GSH (1 mM) y glutatión reductasa de levadura (GSH reductasa; GR) (1 Unidad) en lugar de levadura Trx y TR. Cada reacción se inició mediante la adición de peróxido de hidrógeno y la oxidación de NADPH se monitorizó durante 12 minutos a 30 °C según la disminución de la absorbancia a 340 nm usando un espectrofotómetro Agilent UV8453 (Hewlett Packard, EE.UU.). La velocidad de reacción inicial se calculó usando la porción lineal de la curva y se expresó como la cantidad de NADPH oxidada por minuto.

Ejemplo 4: Ensayo de función de células vasculares in vitro

Para el ensayo de proliferación celular, se dividieron CEAH a una concentración de 4000 células/pocillo en un volumen final de 100 μl en una placa de 96 pocillos que incluía una mezcla de reactivos de transfección de ARNip. Después de la transfección con ARNip durante 24 horas, las células se privaron de suero durante 18 horas y después se colocaron en un medio basal EBM-2 suplementado con VEGF-A165 (25 ng/ml, N.° de cat. 293-VE, R&D systems) durante 24 horas adicionales. El grado de proliferación celular se midió usando un kit de ensayo de proliferación celular WST-1 (Roche Diagnostics, EE.^u U.), y el número de células se expresó como absorbancia a 450 nm, que se promedió a partir de 3 pocillos después de restar la turbidez a 600 nm.

El ensayo de migración celular se realizó en una cámara de cultivo Transwell de 24 pocillos (Costar; tamaño de poro de 8 μm). El fondo del filtro se recubrió con gelatina B (1 mg/ml) y se secó al aire durante 1 hora. Se añadieron CEAH (6 x 103) a las cámaras superiores, incluyendo complejos de transfección de ARNip. Después de 24 horas, las CEAH transfectadas con ARNip se privaron de suero durante la noche. Se preparó una solución de VEGF-A (25 ng/ml) en un medio basal que incluía albúmina de suero bovino (BSA) al 0,5 % y se añadió a las cámaras inferiores. Cada uno de los pocillos de la cámara superior se llenó con un medio basal que incluía BSA al 0,5 %. La cámara Transwell se incubó durante 8 horas en condiciones de 37 0C/dióxido de carbono al 5 %. Después de la incubación, las células que no migraron en la parte superior del filtro se retiraron y las células que migraron al fondo del filtro se fijaron y se tiñeron con hematoxilina al 0,6 % y eosina al 0,5 %. Las células teñidas se fotografiaron y se contaron. El número de células que migran se promedió a partir de 3 pocillos.

Ejemplo 5: Análisis por inmunotransferencia

Las células se aclararon con una solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada y después se lisaron en una solución tampón de extracción que contenía Hepes 20 mM (pH 7,0), Triton X-100 al 1 %, NaCl 150 mM, glicerol al 10 %, EDTA 1 mM, EGTA 2 mM, DTT 1 mM, Na3VO4 5 mM, NaF 5 mM, AEBSF 1 mM, aprotinina (5 μg/ml) y leupeptina (5 μg/ml). Después de centrifugar a 12.000 xg, los extractos celulares purificados se usaron para la inmunotransferencia. Para ajustar la carga, las membranas se desprendieron agitándolas durante 30 minutos a 60 0C en Tris 67 mM (pH 6,7), SDS al 2 % y solución de 2-mercaptoetanol 100 mM, y se reprobaron con un anticuerpo pan apropiado.

Ejemplo 6: Inmunocitoquímica

Las células se cultivaron en un portaobjetos de vidrio y se fijaron con una solución de paraformaldehído al 4 % precalentada durante 15 minutos. Las células fijadas se lavaron dos veces con PBS y se trataron con Triton X-100 al 0,2 % durante 30 minutos a temperatura ambiente para que tuvieran permeabilidad celular. Después de eso, las células se bloquearon durante 1 hora usando una solución de PBS que incluía BSA al 2 % y se incubaron durante la noche a 40C con anticuerpos primarios diluidos en una solución tampón de bloqueo: anti-fosfotirosina (clon 4G10, 1:100), anti-Prx1 (1:300), anti-Prx2 (1:300), anti-p-catenina (1:200) y anti-E cadherina (1:200). Las células se aclararon 3 veces con una solución tampón de bloqueo y se incubaron durante 30 minutos con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 568 o Alexa Fluor 488. El cubreobjetos teñido se lavó tres veces con una solución tampón de bloqueo y se montó. Las imágenes de fluorescencia se registraron usando un microscopio de barrido láser confocal LSM510 META (Zeiss).

Ejemplo 7: Medición del peróxido de hidrógeno intracelular

El nivel de H₂O2 intracelular se midió usando diacetato de 5,6-clorometil-2',7'-diclorodihidrofluoresceína (CM-DCFH-DA, Invitrogen), un colorante fluorescente sensible a la oxidación. Se cultivaron melanocitos epidérmicos humanos, células SK-^m E^l-5, SK-MEL-28, A375 y G361 (3 x 105) en una placa de cultivo de 35 mm y se infectaron con retrovirus durante 24 horas. Después de eso, las células se privaron de suero durante 18 horas y se estimularon con FBS al 20 % durante 10 minutos en un medio sin rojo de fenol. Después de estimularlas como se ha descrito anteriormente, las células se aclararon rápidamente con una solución de Krebs-Ringer y se incubaron con CM-DCFH-DA 5 μM durante 5 minutos. La fluorescencia de 2',7'-diclorodihidrofluoresceína (DCF) se recogió durante 10 segundos usando un microscopio de fluorescencia invertido Axiovert 200 (Zeiss). La fluorescencia de DCF relativa se calculó promediando las intensidades de fluorescencia de 60 a 80 células después de restar la fluorescencia de fondo de cada imagen usando un software ImageQuantTM (GE Healthcare). Las células esfenoidales desorbidas se excluyeron de la cuantificación.

Ejemplo 8: Producción de retrovirus

Se produjeron retrovirus que codificaban PrxlI humana usando un vector μLXIN bicitrónico y un sistema de vector Retro-X Q (Clontech). En primer lugar, se insertaron secuencias codificantes de tipo silvestre (TS) de PrxII humana en μLXIN mediante clonación por PCR. Los virus se produjeron transfectando de manera estable el vector resultante a una estirpe celular de empaquetamiento dualtrópica basada en NIH3T3 estable RetroPack™ PT67. Los virus se usaron principalmente para la sobreexpresión de PrxII en las células SK-MEL. Se determinó la concentración de los virus (títulos víricos) (1 x 106 partícula vírica/ml) y los virus se dividieron y almacenaron a -70 0C. Para la infección por retrovirus, los virus divididos se descongelaron en un baño de agua caliente y se mezclaron con 10 μg/ml de polibreno.

Ejemplo 9: Ensayo de proliferación y migración

El grado de proliferación celular se midió usando un kit de ensayo de proliferación celular WST-1 (Roche Diagnostics, EE.UU.) según el protocolo del fabricante. El número de células se expresó como un valor de absorbancia a 450 nm promediado a partir de 3 pocillos después de restar la turbidez a 600 nm. El ensayo de transmigración quimiotáctica se realizó en una cámara de cultivo Transwell de 24 pocillos (Costar; inserto de membrana de policarbonato con un tamaño de poro de 8 μm). El fondo del inserto se recubrió con gelatina B (1 mg/ml) y se secó al aire durante 1 hora. Los retrovirus o los complejos de transfección se aplicaron como tratamiento a células de melanoma (6 x 103). Después de 24 horas, las células de melanoma infectadas o transfectadas se privaron de suero durante 18 horas. Se añadió una solución de FBS al 20 % a las cámaras inferiores, incluyendo un medio basal que contenía BSA al 0,5 %. Cada uno de los pocillos de la cámara superior se llenó con un medio basal que incluía BSA al 0,5 %. La cámara Transwell se incubó durante 12 horas en una incubadora de 37 °C/CÜ2 al 5 %. Después de la incubación, las células que no migraron en la parte superior del filtro se eliminaron. Las células que migraron al fondo del filtro se fijaron y se tiñeron con hematoxilina al 0,6 % y eosina al 0,5 %. Las células teñidas se fotografiaron y se contaron. El número de células que migran se promedió a partir de 3 pocillos.

Ejemplo 10: Ensayo de cicatrización de heridas

Se creó una herida en una monocapa de células rascando con una punta de pipeta. La herida se lavó con PBS para retirar los fragmentos celulares y se le suministró un medio fresco. Durante 12 horas después de eso, se hizo que las células proliferasen y migrasen a la herida. La migración de las células al área herida se observó bajo un microscopio. La anchura de la herida se midió usando un software Image J.

Ejemplo 11: Metástasis de células de melanoma B16F10 al pulmón en ratón

Después de que las células B16F10 se transfectaran temporalmente con ARNip de PrxIl durante 24 horas y se tripsinizaran, las células se resuspendieron en solución salina equilibrada de Hank (HBSS). La suspensión celular se inyectó por vía intravenosa a un ratón C57/BL6 (1 x 106 células por ratón). El ratón se sacrificó después de 10 días y el pulmón se extirpó después de la perfusión transcardíaca-fijación con una solución salina heparinizada que incluía formaldehído al 3,7 %. El pulmón extraído se incluyó en parafina y se seccionó usando un micrótomo giratorio (Leica RM2255). Se tiñeron dos secciones de tejido en serie (4 μm de espesor) con hematoxilina y eosina. Se contaron los nódulos tumorales de melanoma metastatizados desde la superficie del pulmón y las secciones de tejido teñidas con HE. Para verificar los efectos de la gliotoxina (GT), la quetocina y la quetomina, las células de melanoma se inyectaron por vía intravenosa al ratón C57/BL6 y después se inyectó gliotoxina (300 mg/kg) por vía intraperitoneal 5 veces durante 10 días.

Ejemplo 12: Ensayo de actividad de NADPH oxidasa

La producción de superóxido de células enteras se midió usando un sistema de luminiscencia potenciado (Diogenes, National Diagnostics). Para el ensayo, las células privadas de suero se preincubaron con 100 μl de reactivo Diogene a 370C durante 5 minutos. Después de ser estimuladas por el factor de crecimiento indicado, se detectó quimioluminiscencia cada segundo durante 10 minutos con un luminómetro TD-20/20 (Turner Biosystems).

Ejemplo 13: Modelo de lesión por globo de la arteria carótida de rata

Los experimentos con animales se realizaron según las directrices del Comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC, por sus siglas en inglés) de la Ewha Womans University. Se creó una lesión por globo usando un catéter de globo Fogarty 2F infiltrado en la arteria carótida común izquierda de la siguiente manera: después de que las ratas macho Sprague-Dawley de diez semanas de edad fueran anestesiadas por inhalación de gas isoflurano (N₂O:O2/70 %:30 %), la arteria carótida externa izquierda se expuso y se electrocoagularon sus ramas. Se introdujo un catéter 1 cm a través de la arteriotomía transversal de la arteria carótida externa y se logró la denudación endotelial mediante tres pases a lo largo de la arteria carótida común. Después de retirar el catéter, el área perforada se selló y la arteria carótida común taponada se abrió para reanudar el flujo sanguíneo. A menos que se indique otra cosa, las ratas se recuperaron en una jaula durante 10 días y se sometieron a análisis histológico e inmunitario.

Ejemplo 14: Análisis histológico

Las ratas se anestesiaron y la arteria carótida común se extirpó después de la fijación por perfusión transcardíaca con una solución salina heparinizada que contenía formaldehído al 3,7 %. Los vasos se incluyeron en parafina y se seccionaron usando un micrótomo giratorio (Leica RM2255). Se obtuvieron dos secciones de tejido en serie (4 μm de espesor) del área media de las arterias carótidas primitivas y se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE). Se midieron las áreas del lumen, de la lámina elástica interna y de la lámina elástica externa usando NIH Image v1.62. Las áreas intima y medial se determinaron restando el área luminal del área elástica interna y restando el área elástica interna del área elástica externa. Los valores de las dos secciones en serie para cada rata se promediaron para su análisis.

Ejemplo 15: Suministro local de ARNip o compuesto o derivado de ETP en la arteria carótida

Para la inyección in vivo de ARNip, una mezcla de ARNip específica de PrxII de rata (200 nM) se premezcló con un reactivo siPORT™ NeoFX™ según las instrucciones del fabricante (Ambion). Inmediatamente después de la lesión por globo, la mezcla inyectada con ARNip (200 μl) se inyectó a través de un catéter después de lavarse brevemente con Opti-MEM. Después de la incubación durante 15 minutos, el flujo sanguíneo se reanudó. Se usó un siGLO-Red (Dharmacon), que es un ARNip de control conjugado con tinte fluorescente, para optimizar la eficiencia de inyección in vivo. De manera similar, el compuesto de ETP (200 nM en DMSO) se inyectó a través de un catéter y se incubó durante 30 minutos.

Ejemplo 16: Inmunohistoquímica y tinción por inmunofluorescencia

Se realizó inmunohistoquímica para la 2-Cys Prxs sobreoxidada en las secciones de parafina usando un anticuerpo anti-Prx-SO2/3 (dilución 1:1000). Brevemente, las secciones se desparafinaron en xileno y se rehidrataron en etanol, y posteriormente se realizó la recuperación de antígeno hirviéndolas en una solución tampón cítrica (pH 6,0). Después de eso, las secciones se incubaron con un anticuerpo primario durante 48 horas a 40C. Después de lavar tres veces con una solución salina tamponada con fosfato, las secciones se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa y se tiñeron con una solución de sustrato de 3',3'-diaminobencidina (DAB). Para la tinción negativa, el anticuerpo frente a Prx-SO2/3 se bloqueó con el péptido antigénico correspondiente (DFTFVC(SO2/3)PTEI). Para la tinción por inmunofluorescencia indirecta, las secciones de parafina se bloquearon con suero de conejo normal al 5 % (Vector Laboratories) en PBST (una solución de PBS de Triton X-100 al 0,3 %) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después, las secciones se incubaron durante la noche a 4 0C con los antígenos contra la alfa-actina de músculo liso de rata (dilución 1:300) y CD31 de rata (PECAM-1, dilución 1:200). Los núcleos se marcaron con DAPI. Después de varios lavados con PBST, las muestras se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con anticuerpos de burro anti-ratón conjugados con Alexa Fluor 568 y anticuerpos de burro antilgG de conejo conjugados con Alexa Fluor 488. Las imágenes de fluorescencia se registraron en tres campos aleatorios por sección de tejido con un aumento de pantalla de 100X usando un microscopio confocal LSM 510 Meta equipado con láseres de argón y helio-neón.

Ejemplo 17: Ensayo TUNEL

Las secciones de parafina se incubaron durante 10 minutos en PBS que contenía Triton X-100 al 0,1 %. Después de eso, las reacciones TUNEL se realizaron durante 60 minutos a 37 0C usando un Kit de detección de muerte celular in situ y fluoresceína (Roche Diagnostics Corp.) según las instrucciones del fabricante. Los núcleos celulares se contratiñeron con DAPI.

Ejemplo 18: Ensayo de permeabilidad vascular

A los ratones se les inyectaron por vía intravenosa 100 μl de azul de Evans al 5 % durante 30 minutos y después se perfundieron con PBS durante 5 minutos. Las arterias carótidas comunes se extirparon tanto de las colaterales no lesionadas como de las ipsilaterales lesionadas. El resultado se diseccionó, se abrió longitudinalmente y se examinó en un microscopio de contraste de fases con un aumento de 20X. Para la cuantificación, el azul de Evans que fluyó hacia el vaso sanguíneo se extrajo colocándolo en formamida a 55 0C durante la noche y centrifugando durante 10 minutos a 12.000 rpm. Los sobrenadantes se recogieron y la absorbancia se midió a 620 nm. El valor de fondo del colorante azul de Evans se midió a 740 nm y se restó de los valores en las arterias carótidas. Para la inhibición de VEGFR2, se inyectó SU5416 (20 mg/kg) por vía intraperitoneal 3 veces (Días -1, 1 y 3) antes y después de la lesión por globo. La inyección de control se realizó con 200 μl de PBS que incluía un vehículo (DMSO al 5 %).

Ejemplo 19: Microscopía electrónica de barrido (MEB)

Los vasos carotídeos se extrajeron de animales, se abrieron longitudinalmente y se fijaron con glutaraldehído al 2,5 % durante 24 horas. Los tejidos se aclararon con PBS, se incubaron con tetraóxido de osmio al 1 % y después se deshidrataron a través de una serie de diluciones de etanol. Los tejidos se secaron hasta el punto crítico y se montaron en microscopía electrónica de barrido con pasta de plata coloidal. Después de recubrir por pulverización catódica con oro/paladio, las muestras de ensayo se examinaron con un microscopio electrónico de barrido (Hitachi, Japón).

Ejemplo experimental 1: Actividad catalítica para la reducción de peróxido de hidrógeno

La característica química del compuesto de epiditiodioxopiperazina de la presente invención o sus derivados es el puente disulfuro intramolecular presente en el resto anillo de epiditiodioxopiperazina. La peroxidasa celular reduce el peróxido de hidrógeno utilizando los electrones derivados de NADPH a través de dos vías de transferencia de electrones, es decir, Trx/TR o GSH/GR, por lo tanto, se realizó un ensayo espectrofotométrico para determinar la actividad reductora de peróxido de hidrógeno en presencia de cada sistema, y los resultados se muestran en las FIG. 1 a 5.

Como resultado, como se muestra en las FIG. 1 a 5, A1 a A9, gliotoxina, quetocina y quetomina, que compartían la estructura de epiditiodioxopiperazina, presentaron todas excelentes actividades reductoras de peróxido de hidrógeno en presencia de un sistema Trx/TR. De manera particularmente interesante, las actividades de la quetocina y la quetomina en presencia de un sistema Trx/TR fueron 8,18±0,24 y 8,62±0,51 nmol/min, respectivamente, por lo que fueron aproximadamente dos veces mayores que la actividad de GT (3,72±0,53 nmol/min) (FIG. 5). Aunque la quetocina y la quetomina presentaron las actividades de 1,51 ± 0,39 y 2,53 ± 0,79 nmol/min, respectivamente, en presencia de un sistema GSH/GR, el grado fue marginal en comparación con las actividades en presencia del sistema Trx/TR. En consecuencia, como se muestra en las FIG. 5d a 5f, las actividades reductoras de peróxido de hidrógeno de los compuestos de ETP requerían los tres componentes de un sistema Trx/TR/NADPH, y las actividades fueron proporcionales a la concentración. Además, se usó bis(metiltio)gliotoxina con grupos tiol metilados como grupo de control. Como resultado, no se observó actividad peroxidasa para bis(metiltio)gliotoxina con grupos tiol metilados (FIG. 5g). Además, se observó que la bis(metiltio)gliotoxina con grupos tiol metilados no tenía actividades peroxidasa puesto que el puente disulfuro no puede formarse mediante una reacción de oxidaciónreducción en la bis(metiltio)gliotoxina. Esto indicó que el ciclo de oxidación-reducción de los ditioles en el anillo dentro del compuesto es esencial para la actividad peroxidasa. Además, el resultado demostró que la actividad peroxidasa análoga a 2-Cys-Prx del compuesto de epiditiodioxopiperazina o sus derivados según la presente invención era dependiente del sistema Trx/TR.

Además, los resultados se compararon usando los tipos reducidos (A2R, A4R y A5R) de A2, A4 y A5 (FIG. 3 y 4). Estos compuestos reducidos presentaron actividades reductoras de peróxido de hidrógeno similares a los tipos oxidados correspondientes (A2, A4 y A5, respectivamente). Además, el grupo comparativo incluye compuestos que incluyen dos grupos tiol mediante la reducción del enlace de puente disulfuro intramolecular, y estos compuestos pueden usarse directamente para la reducción de peróxido de hidrógeno sin un proceso de conversión en tipos reducidos mediante un sistema Trx/TR puesto que estos compuestos tienen formas similares con los tipos activos de 2-Cys-Prx intracelular y, por lo tanto, se demostró que los tipos reducidos tenían velocidades de reacción iniciales más altas para la reducción de peróxido de hidrógeno en comparación con los tipos oxidados correspondientes. Mientras tanto, A2R, A4R y A5R en realidad no mostraron actividades reguladoras de la migración y la proliferación celulares dependientes de PDGF y VEGF como se muestra en los experimentos que se describirán más adelante, y puede inferirse que estos compuestos no tenían actividades reguladoras de la proliferación y la migración celulares dependientes de PDGF y VEGF puesto que la forma reducida de los derivados que tienen el ditiol en el anillo de piperazina no se puede introducir en las células. Esto indicó que el ciclo de oxidación-reducción entre el enlace de puente disulfuro intramolecular y el ditiol en el anillo de piperazina dentro del derivado de ETP era esencial para la actividad peroxidasa. Además, a partir de los resultados descritos anteriormente, se demostró que la actividad peroxidasa análoga a 2-Cys-Prx del compuesto de epiditiodioxopiperazina o sus derivados según la presente invención era dependiente del sistema Trx/TR.

Ejemplo experimental 2: Experimento de citotoxicidad in vitro e in vivo

Se sabe que la mayoría de los compuestos de ETP son citotóxicos para las células animales. En consecuencia, los inventores de la presente invención determinaron un intervalo de concentración seguro del compuesto de epiditiodioxopiperazina o sus derivados en células vasculares. Para ello, se pretrataron células de músculo liso aórtico humanas (CMLAH) y células endoteliales aórticas humanas (CEAH) durante 2 horas con diversas concentraciones de gliotoxina o quetocina, y A1 a A9 que son derivados de ETP según la presente invención, y se cultivaron en un medio fresco durante 24 horas seguido de un ensayo de viabilidad celular (FIG. 6 a 10).

Como resultado, se garantizó la viabilidad de CMLAH y CEAH con respecto a la gliotoxina y A1 a A9 en condiciones de deficiencia de suero a concentraciones de 200 nM y 50 nM o menos, respectivamente. Se descubrió que la quetocina era relativamente menos tóxica. Se consideró que la baja viabilidad de las dos células a concentraciones altas se debía a diversos efectos secundarios, incluyendo la inhibición de NF-kB. En consecuencia, para los experimentos que se describen a continuación, los inventores de la presente invención usaron los compuestos de ETP en un intervalo de concentración de 100 nM y 50 nM, una dosis segura para experimentos in vitro para CMLAH y CEAH, y para compuestos que tienen tendencia baja, la concentración se aumentó hasta un intervalo de 200 nM y 100 nM.

Ejemplo Experimental 3: Efectos del reemplazo de la función de PrxIl por gliotoxina y derivado de epiditiodicetopiperazina en la señalización y la proliferación/migración celular inducidas por factor de crecimiento (1) Efectos del reemplazo de la función de PrxII por gliotoxina

En primer lugar, se sometió a ensayo la capacidad de GT para eliminar peróxido de hidrógeno intracelular en CMLAH y CEAH con PrxII atenuada. La producción de peróxido de hidrógeno celular se monitorizó usando un colorante de fluorescencia sensible a oxidantes (diacetato de 2',7'-dihidro-clorofluoresceína, H₂DCF-DA). El nivel de peróxido de hidrógeno intracelular aumentó aproximadamente dos veces mediante el tratamiento con PDGF en CMLAH de control deficientes en suero, y después aumentó notablemente mediante la combinación con la atenuación de PrxII (FIG. 11a). Sin embargo, el tratamiento con GT anuló por completo el aumento del nivel de peróxido de hidrógeno intracelular de una manera dependiente de la concentración (FIG. 11a). Además, el nivel basal de peróxido de hidrógeno intracelular en las CEAH, que se potenció notablemente con la atenuación de PrxII, también se eliminó por completo con el tratamiento con GT (FIG. 11 b).

Además, se examinaron los efectos reguladores de GT sobre la vía de señalización mediada por PDGFRp y VEGFR2. El tratamiento con GT en CMLAH fue bastante diferente de la fosforilación de tirosina inducida por PDGF que se potenció por la atenuación de PrxII (FIG. 12a). En particular, el nivel de activación de PDGFRp y PLCy1 disminuyó al nivel de las células del grupo de control estimuladas. Por el contrario, el tratamiento con GT en CEAH restableció la activación dependiente de VEGF de VEGFR2 y ERK que había disminuido por la atenuación de PrxII (FIG. 12b). Los efectos de la GT en la función de las células vasculares se validaron adicionalmente. El tratamiento con GT con concentraciones crecientes redujo gradualmente la proliferación y la transmigración quimiotáctica de CMLAH en respuesta a PDGF, que se había potenciado por la atenuación de PrxII (FIG. 13a y 13b). Por el contrario, el mismo tratamiento para CEAH dio como resultado la potenciación de la proliferación inducida por VEGF y la transmigración quimiotáctica que se había visto alterada por la atenuación de PrxII (FIG. 13c y 13d).

(2) Efectos del reemplazo de la función de PrxII por A1 a A9

Se examinaron los efectos reguladores de los derivados de ETP A1 a A9 sobre la vía de señalización mediada por PDGFRp y VEGFR2. Se demostraron los efectos de los derivados de ETP sobre la función de las células vasculares, es decir, las células de músculo liso aórtico humanas (CMLAH) y las células endoteliales aórticas humanas (CEAH). Como se ha descrito anteriormente, cada derivado de EPT se usó en un intervalo de concentración de 100 nM y 50 nM o menos, un intervalo de concentración que no muestra citotoxicidad para CMLAH y CEAH, respectivamente, y para varios compuestos (A4, A7 y A9) que tienen actividades insignificantes, la concentración se aumentó hasta un máximo de 200 nM y 100 nM.

Como resultado, los tratamientos con derivados de ETP con concentraciones crecientes redujeron gradualmente la proliferación y la transmigración quimiotáctica de CMLAH en respuesta a PDGF, que se había potenciado por la atenuación de PrxII (FIG. 14A a 21A). Por el contrario, el mismo tratamiento para CEAH dio como resultado la potenciación de la proliferación inducida por VEGF y la transmigración quimiotáctica que se había visto alterada por la atenuación de PrxII (FIG. 14B a 21B).

Además, se usaron A2R, A4R y A5R con grupos tiol expuestos para comparar los resultados. Como resultado, no se observaron cambios significativos tanto en CMLAH como en CEAH (FIG. 16 y 18).

Ha de destacarse que las concentraciones nanomolares de los derivados de ETP A1 a A9, que no presentan citotoxicidad, son suficientes para regular la señalización de RTK y la función celular en CMLAH y CEAH. En particular, se demostró que A1 a A3, A5 y A8 que tenían sustituyentes relativamente pequeños o un número pequeño de sustituyentes presentaron actividades excelentes, y A6 y A9 presentaron actividades moderadas. En conjunto, los resultados experimentales descritos anteriormente indican que concentraciones bajas de los derivados de ETP pueden restablecer la señalización inducida por PDGF y VEGF dañada debido a la deficiencia de PrxII. Ejemplo experimental 4: Efectos del compuesto de ETP sobre la actividad de la NADPH oxidasa (NOX) Cuando se estimularon CMLAH y CEAH con PDGF-B y VEGF-A, respectivamente, la actividad de NOx aumentó aproximadamente dos veces. Sin embargo, los tratamientos con GT y quetocina no inhibieron la actividad de NOx hasta que las concentraciones de los compuestos aumentaron hasta 500 nM, lo que supera el límite tóxico (Fig. 22). Por lo tanto, se observó que estos compuestos de ETP actúan como peróxido de hidrógeno reductasa capaz de reemplazar a la PrxII en ambas células vasculares, pero el mecanismo no era la inhibición del productor de peróxido de hidrógeno NOx.

Ejemplo experimental 5: Identificación de 2-Cys-Prx, en particular, sobreoxidación de PrxII, para arterias carótidas lesionadas por globo a través de experimentos in vivo

Los efectos de los compuestos de ETP se identificaron in vivo usando un modelo animal experimental de lesión vascular (lesión inducida por globo de arteria carótida de rata) capaz de monitorizar la hiperplasia de las CMLV y la reendotelización vascular. Cuando las arterias se lesionan por la inserción de un catéter de globo, el endotelio queda denudado. Por lo tanto, las plaquetas y los macrófagos se acumulan en la lesión lesionada para reparar el vaso lesionado. Estas células producen radicales de oxígeno activo, incluyendo peróxido de hidrógeno, por lo tanto, se supone que las enzimas 2-Cys Prx en las células vasculares vecinas se inactivan por sobreoxidación del residuo de cisteína del sitio activo a ácidos sulfínicos/sulfónicos (Cys-SO2/3). Para abordar esta posibilidad, la sobreoxidación de 2-Cys Prxs en las arterias carótidas de rata lesionadas por globo se examinó usando un anticuerpo anti-Prx-SO2/3. La lesión por globo indujo la hiperplasia de la íntima de las arterias carótidas con el tiempo (FIG. 23a) y el análisis inmunohistoquímico mostró que la sobreoxidación de 2-Cys Prxs era profunda en las capas de la íntima tanto interna como vascular en los días 5o y 7o después de la lesión (FIG. 23b). La especificidad de señalización inmunorreactiva se demostró bloqueando con el péptido antigénico correspondiente en vasos normales tratados con peróxido de hidrógeno. El análisis por inmunotransferencia afirmó que la sobreoxidación de la 2-Cys Prxs principal fue inducida por la lesión por globo. Cuando se separaron PrxI y PrxIl mediante inmunoprecipitación con un anticuerpo anti-PrxI, se descubrió que la sobreoxidación de PrxI I estaba potenciada de forma dominante junto con la hiperplasia de la íntima en comparación con las de PrxI y PrxIII (FIG. 23c). Esto contrasta con el recipiente de control tratado con peróxido de hidrógeno donde la sobreoxidación de PrxI es evidente. El papel regulador negativo de PrxII en el crecimiento de CMLV dependiente de PDGF demuestra que la inactivación de PrxII por sobreoxidación contribuye a la hiperplasia de CML en las paredes de los vasos lesionados. De hecho, la caída mediada por ARNip de la expresión de PrxII en las paredes arteriales de la carótida exacerbó la hiperplasia de la íntima inducida por la lesión por globo (FIG. 24).

A continuación, los inventores de la presente invención evaluaron si GT orquestó la reparación adecuada del vaso lesionado donde se produjo la sobreoxidación de PrxII. Cuando la solución de GT se administró localmente a diversas concentraciones al lumen de los vasos arteriales carotídeos a través del catéter después de una lesión por globo, la hiperplasia de la íntima se suprimió notablemente de manera dependiente de la concentración dentro de un intervalo nanomolar que no indujo la muerte celular, como se identificó por tinción TUNEL (FIG. 25a). Este resultado indica que GT suprime la hiperplasia de CML.

Además, como experimento de control, se trataron bis(metiltio)gliotoxina que tenía grupos ditiol metilados e inhibidor de TR (DNCB 5 μM o Auronafina 0,5 μM) solos o en combinación con GT y se observaron las imágenes de tinción con HE para los tejidos.

El resultado mostró que la bis(metiltio)gliotoxina no suprimió la capa de la íntima vascular engrosada, y todos los inhibidores de TR cancelaron los efectos de supresión de la hiperplasia de la íntima de la GT (Figura 26). Por lo tanto, se observó que la bis(metiltio)gliotoxina con grupos tiol metilados no era eficaz para reparar la lesión vascular y la GT era eficaz para reparar la lesión vascular a través de la regulación de TR.

Posteriormente, se realizaron experimentos para identificar si GT realmente promovía la reparación endotelial en las paredes de los vasos lesionados. La tinción por inmunofluorescencia del marcador endotelial CD31 reveló claramente que, como en los vasos carotídeos normales, se formó una monocapa de endotelio en contacto con el lumen en los vasos lesionados tratados con GT, mientras que la monocapa no se formó en las arterias carótidas lesionadas de control (FIG. 25b). Además, la coinmunostinción con a-actina de músculo liso (SMA) demostró además que la capa endotelial estaba cubierta por encima de la capa de CML de la íntima vascular.

Además, la tinción por inmunohistoquímica se realizó usando un anticuerpo contra 2-Cys-Prx sobreoxidada (Prx-SO2/3) para identificar los efectos de la GT sobre la sobreoxidación de 2-Cys-peroxirredoxina (2-Cys-Prx), y como imágenes de tinción con DAB, se mostraron imágenes representativas entre 5 muestras diferentes de arteria carótida. Como resultado, como se muestra en la FIG. 27, no hubo diferencias significativas en los datos de la muestra entre el grupo de control y el grupo tratado con GT. Este resultado afirma que la GT no inhibe la oxidación de 2-Cys-Prx, sino que reemplaza la función de 2-Cys-Prx en las células después de la sobreoxidación.

Además, se identificó si A1 a A3, A5, A6 y A8, los derivados de ETP según la presente invención, pueden inhibir la proliferación de células del músculo liso aórtico.

Específicamente, se identificó si el derivado organiza la reparación adecuada del vaso lesionado donde ocurre la sobreoxidación de PrxII. La solución que incluía el derivado se administró localmente a una concentración de 200 nM en el lumen de los vasos arteriales carotídeos a través de un catéter después de la lesión por globo y se observaron las imágenes de tinción con HE para los tejidos.

El resultado, como se muestra en la FIG. 28, mostró que todos los derivados de ETP según la presente invención inhibían eficazmente la proliferación de células de músculo liso.

Posteriormente, se realizaron los experimentos para identificar si los derivados A1 a A3, A5, A6 y A8 realmente promovían la reparación endotelial en las paredes de los vasos lesionados. La tinción por inmunofluorescencia del marcador endotelial CD31 verificó que, mientras que en los vasos lesionados tratados con A1 a A3, A5, A6 o A8 se formaba una monocapa de endotelio en contacto con el lumen, en las arterias carótidas lesionadas de control no se formaba monocapa (FIG. 29). Además, la coinmunostinción con a-actina de músculo liso (SMA) demostró además que la capa endotelial estaba cubierta por encima de la capa de CML de la íntima vascular.

Ejemplo experimental 6: Ensayo de permeabilidad vascular

La permeabilidad del endotelio reparado se examinó mediante flujo de entrada de azul de Evans. La denudación endotelial por la lesión por globo dio como resultado la pérdida completa de la actividad de control de la permeabilidad, mientras que las arterias carótidas colaterales no lesionadas mostraron la función de barrera intacta del endotelio normal (FIG 30a). El tratamiento con GT para arterias carótidas lesionadas por globo dio como resultado una reducción de aproximadamente dos tercios en el flujo de entrada de azul de Evans en comparación con las arterias carótidas lesionadas tratadas con el grupo de control (DMSO). Más evidentemente, la recuperación de la función endotelial inducida por GT fue bloqueada por un inhibidor específico de la VEGFR2 cinasa, lo que sugiere que los efectos de la GT protegieron la función de VEGFR2 de la inactivación oxidativa inducida por la sobreoxidación de PrxII.

La unión interendotelial en las superficies luminales de los vasos arteriales carotídeos lesionados se examinó mediante microscopía electrónica de barrido. Las células endoteliales en la arteria carótida de una rata tratada con GT se extendieron y formaron una capa uniforme con uniones estrechas, mientras que las de la arteria carótida de una rata tratada con control se encogieron y parchearon (FIG. 30b). Los resultados indican en conjunto que el endotelio reparado mediante el tratamiento con GT está funcional y estructuralmente intacto, por lo que es suficiente para controlar la permeabilidad vascular.

Ejemplo experimental 7: Efectos de la quetocina, la quetomina y otros compuestos antioxidantes

Los inventores de la presente invención sometieron a ensayo si otros compuestos de ETP tales como la quetocina y la quetomina también inducen la reparación apropiada de los vasos lesionados. En primer lugar se evaluó la eficacia de la quetocina en la función de las células vasculares. El tratamiento con quetocina con concentraciones crecientes redujo notablemente la proliferación y la transmigración quimiotáctica de CMLAH en respuesta a PDGF, que se había potenciado por la atenuación de PrxII (Fig. 31a y 31b). Por el contrario, el mismo tratamiento dio como resultado una potenciación notable en la proliferación inducida por VEGF y la transmigración quimiotáctica de CEAH, que se había visto alterada por la atenuación de PrxII (FIG. 31c y 31 d). Como se mencionó en el Ejemplo experimental 2, la quetocina fue menos citotóxica que la GT, por lo tanto, la eficacia de la quetocina en la regulación de la función de CMLV y CEV fue importante incluso a concentraciones nanomolares altas. En paralelo con dichas actividades in vitro, el tratamiento con quetocina bloqueó notablemente la hiperplasia de la íntima y, simultáneamente, promovió la reendotelización en una pared arterial lesionada (FIG. 32a y 32c), lo que indica que, además de la GT, la quetocina también actúa como regulador recíproco de CMLV y CEV. La quetomina también presentó efectos similares en la reparación de paredes arteriales lesionadas (FIG. 32b y 32d). En conjunto, se demostró que los compuestos de la serie de ETP actúan como agentes terapéuticos ideales para reparar lesiones vasculares.

Por último, los efectos de la GT, un compuesto de ETP representativo, sobre las células vasculares se compararon con los efectos de otros compuestos conocidos como compuestos antioxidantes tales como la N-acetilcisteína o el hidroxianisol butilado, y los resultados se muestran en la FIG. 33. La inmunotransferencia se realizó pretratando las CEAH en las que se atenuó la PrxII inyectando ARNip con cada compuesto a las concentraciones indicadas en los gráficos durante dos horas y después tratando con VEGF durante 10 minutos. El resultado mostró que la N-acetilcisteína o el hidroxianisol butilado no indujeron la activación de VEGFR2 y ERK aguas abajo, incluso cuando se usaron con concentraciones 103 a 104 veces superiores a la concentración de GT. Estos experimentos comparativos condujeron a los inventores de la presente invención a concluir que la función citotóxica distintiva de los compuestos de ETP se debe claramente a la actividad análoga a PrxII y, adicionalmente, a la propiedad química especial del anillo de ditiocetopiperazina.

Ejemplo experimental 8: Identificación de los efectos de la GT en células vasculares y ratones con deficiencia de PrxII

Se separaron músculo liso vascular aórtico (A) y células endoteliales (B) de un ratón normal y un ratón PrxII-/-, se cultivaron y después se trataron con PDGF-BB y VEGF-A durante 10 minutos cada uno después de tratar con GT o sin tratamiento. La activación de PDGFRp PLC^y1, VEGFR2 y ERK se analizó usando un anticuerpo de unión específico de fosforilación para cada proteína. El resultado verificó, como se muestra en A y B de la FIG. 34, los efectos reguladores opuestos de la GT sobre la señalización de PDGF y la señalización de VEGF en las células de músculo liso vascular (CMLV) y las células endoteliales vasculares (CEV), respectivamente, que se separaron del ratón Prx-/-.

Además, para identificar los efectos de la GT sobre el engrosamiento vascular en un ratón PrxII-/-, se dañó la arteria carótida izquierda de un ratón PrxII-/- usando un alambre flexible. Después de la lesión, se empapó una tira de papel de filtro Whatman N.° 1 en un vehículo de control o una solución de GT, y el papel se adhirió a la superficie del epitelio vascular durante 30 minutos para que la solución penetrara en el tejido. El ratón fue recuperado el 10o día después de la lesión. Como resultado, la relación entre la íntima y la media medida a partir de la muestra de arteria carótida teñida con HE se presentó como media - error estándar (n = 8 por grupo, *p < 0,01). El resultado indicó que, como se muestra en la FIG. 34C, GT redujo notablemente el engrosamiento vascular.

Ejemplo experimental 9: Efectos de inhibición de PrxII sobre la proliferación y migración de células de Melanoma, e identificación de la inhibición de la migración in vitro y la metástasis in vivo de células de Melanoma al pulmón mediante el tratamiento de las células de melanoma con compuesto de ETP o sus derivados

(1) Identificación de la relación entre la proliferación y la migración de células de melanoma y la supresión de PrxII

Las células de melanoma se sometieron a inmunocribado para determinar el nivel de proteína PrxIl usando un anticuerpo específico de PrxII. Mientras que las células de melanoma SK-MEL-5 (SK5) y SK-MEL-28 (SK₂8) apenas expresaban PrxII, otras dos estirpes celulares, A375 y G361, expresaban la proteína PrxII (FIG. 47A). El nivel de expresión de PrxII en A375 fue similar al nivel de melanocito humano. Por el contrario, los niveles de proteína de la isoforma Prx1 más similar fueron idénticos en las 4 estirpes celulares. Además, la región promotora de los genes Prdx2 en la estirpe celular SK-MEL estaba metilada, pero no en las células A375 y G361. Esto proporciona el mecanismo molecular implicado en el silenciamiento de la expresión de PrxII. El nivel de peróxido de hidrógeno celular se midió usando DCFH-DA, un colorante sensible a la oxidación, teniendo en cuenta que PrxII es una enzima antioxidante citoplasmática.

En consecuencia, el nivel de peróxido de hidrógeno básico parecía ser alto en las células SK-MEL deficientes en PrxII mientras que el nivel era bajo no sólo en el melanocito primario en el que estaba presente PrxII sino también en A375 y G361 (FIG. 47B). Esto sugiere que PrxII es una enzima antioxidante importante que regula el nivel de peróxido de hidrógeno intracelular en las células de melanoma.

Además, se compararon actividades celulares in vitro tales como la proliferación y la migración de 4 tipos de células de melanoma. La condición del suero está fisiológicamente relacionada con la metástasis tumoral que implica factores complejos, por lo tanto, las células estaban en una condición de provación de suero y después se estimularon con suero fetal al 20 % para maximizar la inducción de actividades celulares dependientes de suero. Como resultado, las células SK-MEL deficientes en PrxII presentaron una actividad de proliferación superior en comparación con otras 2 células de melanoma que expresaban PrxII (FIG. 47C). La actividad migratoria presentada en la transmigración quimiotáctica del suero y el cierre de la herida fueron superiores en las células SK-MEL que en otras células de melanoma que expresaban PrxII (FIG. 47D y E). Esto sugiere una relación inversa entre la función celular y el nivel de PrxII en tipos celulares de melanoma.

Además, se identificaron los efectos reguladores directos de PrxII sobre las células de melanoma con respecto a la expresión exógena y la atenuación específica de PrxII. La expresión exógena de PrxII en las células SK-MEL se logró mediante la transducción retrovírica de genes Prdx2 humanos (FIG. 48A). Cuando se identificó la actividad proliferativa de las células SK-MEL, la expresión retrovírica de PrxII redujo la proliferación de células inducida por estimulación con suero (FIG. 48B). La actividad migratoria de las células SK-MEL presentada en la transmigración quimiotáctica y el cierre de la herida se redujo mucho más por la expresión de PrxII (FIG. 48C y D). Posteriormente, la expresión de PrxII se atenuó específicamente en células G361 y A375 usando 2 ARNip diferentes (FIG. 49A). La atenuación de PrxII aumentó significativamente la proliferación y la migración celulares en respuesta a la estimulación por suero en ambas células (FIG. 49B y C). Por el contrario, la atenuación de PrxI, otra isoforma citoplásmica de Prx, no afectó a las actividades de las células de melanoma (FIG. 49D). En conjunto, esto indica que la enzima PrxII actúa como un inhibidor antioxidante selectivo para la proliferación y la migración de células de melanoma.

(2) Aumento de la metástasis de células de melanoma al pulmón debido a la ausencia de PrxII

En la proliferación y la migración de células de melanoma, se realizaron experimentos in vivo usando un modelo de metástasis al pulmón con B16F10, una célula de melanoma de ratón, basándose en la actividad reguladora de PrxII. Se sabe que las células B16F10 expresan BRAF de tipo silvestre, por lo tanto, se identificó que PrxII todavía regulaba las actividades de las células B 16F10 y la vía Src/ERK. En las células B16F10, la atenuación de PrxII usando ARNip específico de PrxII de ratón redujo el nivel de E-cadherina mientras aumentaba la activación de Src/ERK y la fosforilación de p-catenina (FIG. 52A). De forma coherente con esto, la atenuación de PrxII aumentó la proliferación y la migración de B16F10 en respuesta a la estimulación con suero (FIG. 52B). Esto indica que la función de PrxII en células de melanoma puede ser independiente de la mutación oncogénica BRAF.

Para experimentos in vivo, se garantizó la deficiencia estable de la expresión de PrxII durante el ensayo de metástasis al pulmón usando la atenuación de la expresión de PrxII mediada por ARNip (FIG. 52C). Después de eso, se inyectaron células B16F10 transfectadas con ARNip de mPrxII a un ratón a través de la vena de la cola. Después de 10 días, se extirpó el pulmón del ratón y se identificaron los nódulos tumorales metastásicos. Un examen microscópico tanto de la superficie pulmonar como de la sección problema teñida con HE reveló que las células B16F10 con PrxII atenuada se infiltraron más agresivamente en el pulmón e invadieron y colonizaron el pulmón en comparación con las células del grupo de control (FIG. 52D y E).

(3) Inhibición de la migración in vitro y la inhibición de la metástasis in vivo al pulmón de células de melanoma por tratamiento con derivado de ETP y gliotoxina

El metabolito secundario fúngico conocido como gliotoxina (GT) es un primer producto natural conocido por presentar una actividad peroxidasa dependiente de tiorredoxina representada como una actividad Prx típica, por lo tanto, se identificó la capacidad de tratamiento de la GT para la inhibición de la metástasis del melanoma. El tratamiento con GT al nivel no tóxico realmente redujo el nivel de peróxido de hidrógeno intracelular en las células SK₂8 deficientes en PrxII (FIG. 53A). Esto prueba la actividad peroxidasa de GT. Nuevamente, aunque el tratamiento con GT en las células SK₂8 redujo la activación de Src/ERK y la fosforilación de p-catenina, aumentó la expresión de E-cadherina (FIG. 53B). Además, la GT redujo la proliferación y la migración en respuesta a la estimulación con suero tanto en las células SK5 como en las SK₂8 (FIG. 53C y D). Esto indica que la GT actúa como una molécula pequeña sustituta de PrxII en células de melanoma. Para demostrar el tratamiento eficiente in vivo, se inyectó GT a un ratón por vía intraperitoneal después de inyectar células B16F10. El tratamiento con GT redujo significativamente la metástasis al pulmón en las células de melanoma (FIG. 53E). Además, la GT redujo más significativamente la metástasis de las B16F10 con PrxII atenuada al pulmón (FIG. 53F). Esto indica que la GT tiene potencial como agente terapéutico para inhibir la metástasis al pulmón, puesto que puede actuar como una molécula pequeña sustituta de PrxII como inhibidor de la metástasis del melanoma.

Además, se identificó si la quetocina y la quetomina inhibían las actividades de las células de melanoma.

Específicamente, después de tratar las células de melanoma SK-MEL28 con quetocina y quetomina a concentraciones diferentes (0, 100, 200, 500 y 1000 nM), se comprobó la viabilidad celular y el resultado se muestra en la FIG. 54A. Como se muestra en la FIG. 54A, no se mostró toxicidad a una concentración de 100 nM y, en consecuencia, se usó 100 nM en los siguientes experimentos de proliferación y migración.

En consecuencia, las células de melanoma SK-MEL28 se trataron con quetocina y quetomina a 100 nM durante 1 hora, y se comprobaron las actividades proliferativas y migratorias, y se promovieron la proliferación y la migración con suero (FBS).

Como se muestra en las FIG. 54 B y C, el resultado indicó que el tratamiento con quetocina y quetomina impidió eficazmente tanto la proliferación como la migración de células de melanoma.

Además, para demostrar el tratamiento eficiente in vivo, se inyectaron quetocina y quetomina a un ratón por vía intraperitoneal después de inyectar células B16F10. El tratamiento con quetocina y quetomina redujo significativamente la metástasis al pulmón en células de melanoma (FIG. 55).

En consecuencia, se puede inferir que los derivados de ETP según la presente invención que imitan la actividad de PrxII in vivo también pueden presentar actividades similares para la inhibición de la metástasis del melanoma a través de la activación de PrxII.

La malignidad metastásica es el problema más crucial en el melanoma en fase de crecimiento vertical. A pesar de que se han establecido los principales genes o redes de señalización con respecto a la metástasis del melanoma, no hay evidencias sobre qué enzimas antioxidantes están implicadas. Los inventores de la presente invención establecieron en primer lugar que el nivel de PrxII está inversamente relacionado con las actividades de metástasis de las células de melanoma. Se demostró que las células de melanoma SK-MEL que tenían la expresión de PrxII silenciada tenían actividades migratorias y proliferativas superiores en comparación con las células A375 y G361 que expresaban mucha PrxII. Aunque la reexpresión exógena de PrxII en las células SK-MEL redujo la proliferación y la migración de las células, la atenuación de PrxII en las células A375 y G361 aumentó la actividad de ambas células. A nivel molecular, se reguló PrxII en las direcciones para reducir las actividades de Src/REK, y el sustento de E-cadherina y p-catenina independiente de la fosforilación Y654 se ajustaron uno por uno en la membrana plasmática. Las células B16F10 de melanoma de ratón deficientes en PrxII mostraron una metástasis mejorada al pulmón in vivo. Curiosamente, la gliotoxina, un compuesto natural que presenta una actividad análoga a Prx, inhibió no sólo la metástasis de células de melanoma deficientes en PrxII a g, sino también la proliferación y la migración. En consecuencia, la presente invención demostró que la PrxII y su mimético de molécula pequeña tienen la posibilidad de ser utilizados como agentes terapéuticos potenciales como inhibidores de la metástasis del melanoma.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   Un compuesto de epiditiodioxopiperazina representado por la siguiente Fórmula química 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:

   

   en donde, en la Fórmula química 1,

   R1 y R3 son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo C1 a C6 lineal o ramificado;

   R2 y R4 son cada uno independientemente hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo hidroxilo, alquenilo o alquinilo lineal o ramificado, alcoxi C1 a C6 lineal o ramificado, hidroxialquilo C1 a C6 lineal o ramificado, alquilarilo C1 a C6 lineal o ramificado, un grupo perfluoroalquilo C1 a C6 lineal o ramificado, un grupo arilo sustituido o sin sustituir, un grupo perfluoroarilo sustituido o sin sustituir, un grupo heteroarilo sustituido o sin sustituir que comprende un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre en un anillo como heteroátomo, o un grupo epiditiodioxopiperazina sustituido o sin sustituir,

   y el grupo alquilo y arilo pueden incluir opcionalmente un heteroátomo de oxígeno, nitrógeno o azufre en el medio de la cadena, y cada uno de los grupos epiditiodioxopiperazina sustituidos puede incluir opcionalmente e independientemente los sustituyentes definidos anteriormente. El compuesto, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo de la reivindicación 1, en donde R1 y R3 son cada uno independientemente hidrógeno, o alquilo C1 a C6 lineal o ramificado, y R2 y R4 son cada uno independientemente hidrógeno, alquenilo lineal o ramificado, o alcoxialquilo, preferiblemente R2 y R4 son cada uno independientemente hidrógeno, alilo o 3-metoxipropilo.

   El compuesto, o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo de la reivindicación 1, en donde el compuesto es uno cualquiera de los compuestos representados por las siguientes Fórmulas químicas 10 y 14:

   

   Un método para preparar el compuesto de epiditiodioxopiperazina según la reivindicación 1, comprendiendo el método formar un enlace de puente disulfuro intramolecular a partir de un compuesto de dimercaptopiperazindiona representado por la siguiente Fórmula química 2 usando una reacción de oxidación:

   

   en donde, en la Fórmula química 2,

   Ri a R4 son los mismos que los definidos en la reivindicación 1.

   El método de la reivindicación 4, que comprende además:

   preparar un intermedio representado por la siguiente Fórmula química 4 haciendo reaccionar un compuesto de piperazindiona representado por la siguiente Fórmula química 3 con azufre (S) y bis(trimetilsilil)amiduro de litio (LiHMDS) o NaHMDS; y

   preparar el compuesto de dimercaptopiperazindiona representado por la Fórmula química 2 mediante la reducción del intermedio:

   

   en donde, R1 a R4 son los mismos que los definidos en la reivindicación 1.

   El método de la reivindicación 4, que comprende además:

   preparar un intermedio representado por la siguiente Fórmula química 6 que incluye un grupo tioacetato haciendo reaccionar un compuesto de piperazindiona sustituido con un átomo de halógeno representado por la siguiente Fórmula química 5 con una sal de metal alcalino de ácido tioacético (MSAc); y

   preparar el compuesto de dimercaptopiperazindiona representado por la Fórmula química 2 haciendo reaccionar el intermedio con una solución de ácido:

   

   

   en donde, la sal de metal alcalino es una sal de sodio o potasio, X es un átomo de halógeno y Ri a R4 son los mismos que los definidos en la reivindicación 1.

   7. Una composición que comprende:

   el compuesto de epiditiodioxopiperazina según la reivindicación 1 o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

   8. Una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de vasculopatías que comprende un compuesto de epiditiodioxopiperazina según la reivindicación 1.

   9. La composición para su uso según la reivindicación 8, en donde el compuesto de epiditiodioxopiperazina es uno cualquiera de los compuestos representados por las siguientes Fórmulas químicas 7 a 15:

   

   

   10. La composición para su uso según la reivindicación 8, en donde

   la vasculopatía se selecciona del grupo que consiste en hipertensión, arteriopatía coronaria isquémica, oclusión de la arteria cerebral, arterioesclerosis, una arteriopatía oclusiva periférica, tromboembolia, lesión del pie diabético, úlcera venosa, trombosis venosa profunda, arterioesclerosis carotídea, vasoespasmo, arteritis y reestenosis vascular.

   11. Una composición farmacéutica para su uso en la inhibición de la metástasis de melanoma que comprende un compuesto de epiditiodioxopiperazina representado por la siguiente Fórmula química 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo como ingrediente activo:

   

   en donde, R1 y R3 son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo C1 a C6 lineal o ramificado, y R2 y R4 son cada uno independientemente hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo hidroxilo, alquilo, alquenilo o alquinilo C1 a C6 lineal o ramificado, alcoxi C1 a C6 lineal o ramificado, hidroxialquilo C1 a C6 lineal o ramificado, bencilo sustituido o sin sustituir, alquilarilo C1 a C6 lineal o ramificado, un grupo perfluoroalquilo C1 a C6 lineal o ramificado, un grupo arilo sustituido o sin sustituir, un grupo perfluoroarilo sustituido o sin sustituir, un grupo heteroarilo sustituido o sin sustituir que comprende un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre en un anillo como heteroátomo, o un grupo epiditiodioxopiperazina sustituido o sin sustituir,

   y el grupo alquilo y arilo pueden incluir opcionalmente un heteroátomo de oxígeno, nitrógeno o azufre en el medio de la cadena, y cada uno de los grupos epiditiodioxopiperazina sustituidos puede incluir opcionalmente e independientemente los sustituyentes definidos anteriormente.

   12. La composición para su uso según la reivindicación 11, en donde el compuesto de epiditiodioxopiperazina es uno cualquiera de los compuestos representados por las siguientes Fórmulas químicas 7 a 15: