CN105229013B - 桥二硫双氧代哌嗪化合物或它的衍生物，及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由以下化学式1表示的桥二硫双氧代哌嗪衍生物或其还原衍生物；制备由化学式1表示的化合物的方法，所述化合物具有改善的细胞内渗透性并在细胞中以其还原形式模拟2‑Cys‑Prx的活性；防止或治疗血管病的药物组合物，其包含桥二硫双氧代哌嗪化合物或它的衍生物或其可药用盐作为活性成分；用于局部给药的药物投送装置，其包含所述药物组合物；和用于抑制黑素瘤转移的药物组合物，其包含所述桥二硫双氧代哌嗪化合物或它的衍生物或其可药用盐作为活性成分。

Description

桥二硫双氧代哌嗪化合物或它的衍生物，及其用途
技术领域
本发明涉及由以下化学式1表示的桥二硫双氧代哌嗪(epidithiodioxopiperazine)衍生物或其还原衍生物；制备由化学式1表示的化合物的方法，所述化合物具有改善的细胞内渗透性并在细胞中以其还原形式模拟2-Cys-Prx的活性；防止或治疗血管病的药物组合物，其包含桥二硫双氧代哌嗪化合物或它的衍生物或其可药用盐作为活性成分；用于局部给药的药物投送装置，其包含所述药物组合物；和用于抑制黑素瘤转移的药物组合物，其包含所述桥二硫双氧代哌嗪化合物或它的衍生物或其可药用盐作为活性成分。
[化学式1]
背景技术
动脉粥样硬化是指下述的状态，其中因含有胆固醇、磷脂、钙等的脂肪斑块在血管内膜蓄积而发展炎症，并因动脉失去弹性和变得狭窄或者由于压力增加引起血管破裂或夹层而抑制供血。特别是，因此发展的动脉狭窄减少了供血，引起养分和氧气缺乏，并且这成为血管病的主要原因。血管病通常包括动脉粥样硬化，心脏病例如心功能不全、高血压性心脏病、心律失常、心肌梗塞和心绞痛，以及血管病例如中风和外周血管病。
作为克服这种血管狭窄的方法，有作为外科方法的动脉移植手术，和作为不伴手术的扩血管方法的经皮血管成形术。经皮血管成形术包括经皮血管球囊扩张、经皮血管支架移植等等。经皮血管球囊扩张方法是:将导向管经股或肱动脉插入并将所述管定位在有病变的血管进入点，将末端连接有球囊的管子通过该导向管的内部定位在血管狭窄区域，然后通过膨胀球囊和压迫斑块等拓宽缩窄的血管，从而改善所述血管的血流。另外，支架移植是将覆盖着线网的球囊定位在狭窄区域、然后通过膨胀球囊而覆盖所述血管内壁的方法，像这样的支架的再狭窄发生率比独立球囊扩张术低，所以用于治疗因球囊扩张引起的并发症，并且该支架作为所述血管内壁的支撑。利用血管成形术的这种介入术比包括外科手术的方法更简单，降低了由于全身麻醉所致的风险，并且具有高成功率，从而使其在全世界广泛使用。
血管再狭窄是通过血管造影做出的诊断，并且是指在血管成形术之后的后续血管造影中血管直径狭窄了50％或以上的情况。因为使用支架的手术量已经增加了大约70％，再狭窄的发生率已经降低，然而，对于经历过血管成形术(球囊扩张和支架移植)的患者来说，血管再狭窄仍然以大约30％的速率发展。虽然所述再狭窄的机制还没有准确建立，但已经知道由于手术期间内皮细胞的损伤导致生长因子和细胞因子局部分泌，并且所述生长因子和细胞因子引起血管平滑肌的增殖和迁移，从而使主动脉腔变窄，引起再狭窄。因此，最近已经认识到平滑肌细胞的增殖是限制血管成形术疗效的主要临床问题。因此，已经开发了释放抑制血管平滑肌细胞增殖的药物或材料的改良支架并用于临床试验。然而，当前用于这种目的的药物在临床试验中它们的用途有限，因为所述药物是高毒性的并因而通过杀死血管平滑肌细胞的机制来防止内膜增殖，并且所述毒性在平滑肌细胞之外也杀死内皮细胞。因此，迫切需要开发能够在选择性抑制血管平滑肌细胞生长的同时促进损伤的内皮细胞层恢复的药物。
同时，具有桥二硫双氧代哌嗪(ETP)结构的代表性物质，胶霉毒素(GT)，已经显示出发挥各种药理活性例如免疫抑制、抗癌和抗病毒活性。另外，桥二硫双氧代哌嗪的衍生物，毛壳素和毛壳菌素，也已经显示出具有抗癌活性。
如上所述，为了利用桥二硫双氧代哌嗪化合物作为治疗剂，已经做出了许多努力来寻找分子靶。结果，胶霉毒素已经显示出抑制若干酶例如NF-κB、法呢基转移酶和吞噬细胞的NOX2，而毛壳素抑制硫氧还蛋白还原酶或组蛋白甲基转移酶。另外，毛壳菌素已经显示出抑制缺氧诱导因子-1(HIF-1)和p300之间的相互作用。尽管事实上已经鉴定了所述ETP化合物的部分细胞活性，但由于它们结构的多样性，尚难以推断它们的化学结构与细胞活性之间的逻辑关系。更具体地说，二硫酮哌嗪(dithioketopiperazine)环结构已知是所述ETP化合物及其衍生物的共同结构，其生理活性和细胞功能尚未揭开。
发明内容
技术问题
鉴于上述，本发明的发明人做出多种努力来寻找能够通过模拟已知抑制内膜增殖的2-Cys-Prx的活性来预防或治疗血管病的物质，并且基于ETP化合物在细胞中表现出过氧化物氧还蛋白(peroxiredoxin)II(PrxII)—一种2-Cys-Prx的活性的理念，合成了一系列具有分子内二硫桥键的新ETP衍生物，并且证明了所述衍生物通过模拟PrxII的细胞内活性，抑制血管平滑肌细胞中PDGF诱导的增殖和迁移并促进内皮细胞中VEGF诱导的增殖和迁移，并从而阻止由于血管平滑肌细胞的过度增殖所致的内膜增殖，和增强血管内皮细胞层的修复，亦即，再内皮细胞化(reendothelization)，并最终可用于预防或治疗血管病。此外，基于所述ETP化合物可模拟2-Cys-Prx、特别是PrxII的细胞内活性的理念，本发明人已经证明了所述ETP化合物可通过抑制因PrxII缺陷或失活诱导的恶性黑色素瘤的转移，并从而完成本发明。
技术手段
本发明的目的是提供以下化学式1表示的桥二硫双氧代哌嗪衍生物或它的还原衍生物，或其可药用盐：
[化学式1]
本发明的另一个目的是提供包含所述衍生物的组合物。
本发明的再一个目的是提供制备由化学式1表示的化合物的方法，所述化合物具有改善的细胞内渗透性并以其还原形式在细胞中模拟2-Cys-Prx的活性，所述方法包括利用氧化反应从以下化学式2表示的二巯基哌嗪二酮衍生物形成分子内二硫桥键的步骤：
[化学式2]
本发明的再一个目的是提供用于预防或治疗血管病的药物组合物，其包含由化学式1表示的桥二硫双氧代哌嗪化合物、它的衍生物、或其可药用盐作为活性成分，和治疗血管病的方法，所述方法包括将所述药物组合物施用于疑似患有血管病的对象。
本发明的再一个目的是提供由化学式1表示的桥二硫双氧代哌嗪化合物、它的衍生物、或其可药用盐在制备预防或治疗血管病的药物中的用途。
本发明的再一个目的是提供用于局部给药的药物投送装置，其包含所述药物组合物。
本发明的再一个目的是提供抑制黑素瘤转移的药物组合物，其包括由化学式1表示的桥二硫双氧代哌嗪或它的衍生物、或其可药用盐作为活性成分，和抑制黑素瘤的方法，所述方法包括将所述药物组合物施用于疑似黑素瘤转移的对象。
本发明的再一个目的是提供由化学式1表示的桥二硫双氧代哌嗪、它的衍生物、或其可药用盐在制备抑制黑素瘤转移的药物中的用途。
本发明的再一个目的是提供血管再狭窄的预防或治疗剂的筛选方法，所述方法包括鉴定包含一个或多个由化学式47表示的桥二硫双氧代哌嗪环的化合物是否表现出2-Cys-过氧化物氧还蛋白(2-Cys-Prx)活性；和当NADPH氧化反应或H2O2还原反应发生时，确定所述化合物作为血管再狭窄的预防或治疗剂。
[化学式47]
有益效果
本发明涉及一系列新的桥二硫双氧代哌嗪衍生物，所述衍生物包括分子内二硫桥键借此改善细胞内渗透性，并在细胞中迅速还原成具有2硫醇基的化合物，从而通过模拟特别是在2-Cys-Prx当中PrxII同工型的功能来抑制内膜增殖，并抑制PDGF诱导的血管平滑肌细胞增殖，同时通过促进VEGF诱导的内皮细胞迁移和增殖来改善再内皮细胞化。因此，本发明的桥二硫双氧代哌嗪衍生物可用作预防或治疗血管病的药物组合物。另外，因为所述衍生物可以通过模拟细胞内PrxII活性而抑制黑素瘤转移，所述衍生物可用于治疗黑素瘤。
附图说明
图1是显示根据本发明的化合物A1对过氧化氢还原的催化活性的图。图1-4的图中的Vo指示还原反应速率，其由每分钟还原的过氧化氢的量(nmol/min)表示。
图2是显示根据本发明的化合物A2、通过还原A2的分子内二硫桥键而具有二巯基的化合物A2R作为比较例、和化合物A3对过氧化氢还原的催化活性的图。
图3是显示根据本发明的化合物A4、通过还原A4的分子内二硫桥键而具有二巯基的化合物A4R作为比较例、和化合物A5、通过还原A5的分子内二硫桥键而具有二巯基的化合物A5R对过氧化氢还原的催化活性的图。
图4是显示根据本发明的化合物A6、A7、A8和A9对过氧化氢还原的催化活性的图。
图5是显示ETP化合物对过氧化氢还原的催化活性的图。(a)至(c)分别显示了胶霉毒素、毛壳素和毛壳菌素的过氧化氢还原能力。体外过氧化物酶反应通过在该图中规定的耦合氧化-还原系统下各自添加25μM ETP化合物进行。(d)至(f)是显示ETP化合物典型的Trx依赖性过氧化物酶活性的图。所述反应是在添加所述图中规定的Trx/TR耦合系统的因子时进行的。显示了来自三次试验的代表性反应曲线。(g)是显示ETP化合物的浓度依赖性过氧化物酶活性的图。初始速率以3次独立实验的均值±标准误差提供。二硫桥键被还原和甲基化的双(甲硫基)胶霉毒素用作阴性对照组。
图6是按照活细胞百分比显示根据本发明的化合物A1对(A)人类主动脉平滑肌细胞(HASMC)和(B)人类主动脉内皮细胞(HAEC)的细胞毒性试验结果的图。
图7是按照活细胞百分比显示本发明的化合物A2、作为比较例的化合物A2R、和化合物A3对(A)人类主动脉平滑肌细胞(HASMC)和(B)人类主动脉内皮细胞(HAEC)的细胞毒性试验结果的图。
图8是按照活细胞百分比显示本发明的化合物A4、作为比较例的化合物A4R、化合物A5及其比较例A5R对(A)人类主动脉平滑肌细胞(HASMC)和(B)人类主动脉内皮细胞(HAEC)的细胞毒性试验结果的图。
图9是按照活细胞百分比显示本发明的化合物A6至A9对(A)人类主动脉平滑肌细胞(HASMC)和(B)人类主动脉内皮细胞(HAEC)的细胞毒性试验结果的图。
图10是显示GT和毛壳素的体外和体内细胞毒性试验结果的图。(a)和(d)是用GT以图中指示的浓度处理的人类主动脉平滑肌细胞(HASMCs)和人类主动脉上皮细胞(HAECs)的显微照片。(b)和(c)是显示当分别用GT或毛壳素处理时HASMCs的浓度依赖性存活力的图，(e)和(f)是显示当分别用GT或毛壳素处理时HAECs的存活力的图。在此，每种ETP化合物在指示的浓度下用在含有0.5％FBS的基础培养基中的血清饥饿细胞预处理2小时之后，收集所述细胞并通过台盼蓝染色以检查存活力。存活力表示为未染色的活细胞相对于细胞总数的百分比。(g)是显示GT在大鼠颈动脉中的体内细胞毒性的图。GT以指示的浓度注入球囊损伤的颈动脉血管腔并温育30分钟。DMSO用作对照组。显示的是代表性的HE染色图像，从HE染色的颈动脉样品测量的内膜对比中膜的比率表示为均值±标准误差(每组n＝7)。细胞死亡通过球囊损伤的颈动脉血管石蜡切片的TUNEL染色评价(左)，计算为DAPI阳性细胞，TUNEL阳性细胞的百分比(右)。
图11显示了在注入PrxIIsiRNA并用DMSO(对照组)或GT预处理2小时的HASMCs和HAECs中，通过胶霉毒素得到的PDGF-和VEGF-依赖性过氧化氢的相互调节能力。(a)和(b)各自以DCF荧光图像和相对强度显示了HASMCs和HAECs中细胞内过氧化氢的水平。该图以均值±标准误差显示了50至80个细胞的荧光相平均的相对DCF荧光强度(n＝3，*p＜0.01，**p＜0.001)。
图12(a)是显示了根据免疫印迹分析，在PrxII击倒的HASMC中GT对PDGF诱导的酪氨酸磷酸化的效应的图，图12(b)是显示了根据免疫印迹分析，在PrxII击倒的HAEC中GT对VEGF诱导的酪氨酸磷酸化的效应的图。显示的总酪氨酸磷酸化(pTyr)的代表性印迹来自用抗磷酸酪氨酸抗体(4G10)的3次重复试验。另外，PDGFR-β和PLCγ1在HASMC中的激活，以及VEGFR和Erk在HAECs中的激活，以代表性印迹显示。
图13是GT对PrxII击倒的血管细胞的生长因子诱导增殖和迁移的效应图。(a)和(b)是分别显示GT对HASMCs响应PDGF的增殖和迁移的效应的图，(c)和(d)是分别显示GT对HAECs响应VEGF的增殖和迁移的效应的图。各细胞的倍数增加显示为均值±标准误差(n＝3，*p＜0.05，**p＜0.001)。
图14是显示根据本发明的化合物A1对PrxII击倒的血管细胞的生长因子诱导增殖和迁移的效应的图。A表示对HASMC响应PDGF的增殖和迁移的效应，和B表示对HAEC响应VEGF的增殖和迁移的效应。
图15是显示根据本发明的化合物A2对PrxII击倒的血管细胞的生长因子诱导增殖和迁移的效应的图。A表示对HASMC响应PDGF的增殖和迁移的效应，和B表示对HAEC响应VEGF的增殖和迁移的效应。
图16是显示化合物A2R，本发明的化合物A2的比较例，对PrxII击倒的血管细胞的生长因子诱导增殖和迁移的效应的图。A表示对HASMC响应PDGF的增殖和迁移的效应，和B表示对HAEC响应VEGF的增殖和迁移的效应。这些结果显示，二硫桥键已经被还原的本发明衍生物还原形式不能被引入细胞。
图17是显示根据本发明的化合物A3对PrxII击倒的血管细胞的生长因子诱导增殖和迁移的效应的图。A表示对HASMC响应PDGF的增殖和迁移的效应，和B表示对HAEC响应VEGF的增殖和迁移的效应。
图18是显示根据本发明化合物A4和A5以及其比较例的化合物A4R和A5R对PrxII击倒的血管细胞的生长因子诱导增殖的效应的图。A表示对HASMC响应PDGF的增殖的效应，和B表示对HAEC响应VEGF的增殖的效应。
图19是显示根据本发明的化合物A5对PrxII击倒的血管细胞的生长因子诱导迁移的效应的图。A表示对HASMC响应PDGF的迁移的效应，和B表示对HAEC响应VEGF的迁移的效应。
图20是显示根据本发明化合物A6至A9对PrxII击倒的血管细胞的生长因子诱导增殖的效应的图。A表示对HASMC响应PDGF的增殖的效应，和B表示对HAEC响应VEGF的增殖的效应。
图21是显示根据本发明的化合物A8对PrxII击倒的血管细胞的生长因子诱导迁移的效应的图。A表示对HASMC响应PDGF的迁移的效应，和B表示对HAEC响应VEGF的迁移的效应。
图22是显示GT和毛壳素对HASMCs和HAECs中NOX活性的效应的图。HASMCs(a)和HAECs(b)在含有0.5％FBS的基础培养基中血清饥饿，然后用指示浓度的GT或毛壳素预处理2小时，并用PDGF或VEGF处理10分钟。作为数据，受刺激细胞相比未刺激细胞的过氧化物量的百分比表示为均值±标准误差(n＝3，*p＜0.05，**p＜0.001)。
图23是显示GT在球囊损伤的颈动脉中抑制血管内膜增殖和促进再内皮细胞化的效应的图。(a)是代表性的HE染色图像，显示了在球囊损伤的颈动脉修复期中，根据时间的内膜增殖。从HE染色的颈动脉段测量的内膜对比中膜的比率表示为均值±标准误差(n＝4/组)。(b)指示在颈动脉血管中通过球囊损伤引起的2-Cys-Prx的过氧化，免疫组织化学利用抗过氧化2-Cys-Prx(Prx-SO2/3)抗体实行。为了阳性对照，将用过氧化氢溶液处理10分钟的正常颈动脉血管染色。所述阻断性抗原肽消除了免疫阳性信号。显示的代表性DAB染色图像来自4个独立样品。(c)显示了利用损伤的颈动脉的提取物进行细胞内2-Cys-Prx过氧化的免疫印迹分析结果。为了比较，用过氧化氢处理的正常颈动脉血管的提取物一起加样。
图24是显示体内注入PrxII siRNA对促进球囊损伤的颈动脉中内膜增殖的效应的图。(a)以代表性的HE染色图像显示了PrxII击倒对于球囊损伤引起的内膜增殖的效应。从HE染色的颈动脉段测量的内膜对比中膜的比率表示为均值±标准误差(n＝7/组，*p＜0.01)。(b)是损伤的颈动脉提取物针对大鼠PrxII的Western印迹结果。(c)是在损伤颈动脉组织切片中大鼠PrxII的免疫荧光染色结果。这表现了在球囊损伤的颈动脉中通过注入siRNA的内在PrxII击倒。
图25是显示了在球囊损伤的大鼠颈动脉中GT对内膜增殖和内皮细胞层再生的效应的图。(a)是显示了在用对照组和GT处理之后，球囊损伤的大鼠颈动脉的血管内膜的图。显示的代表性HE染色图像通过用DMSO和GT各自处理并然后温育30分钟而获得。箭号指示了增厚的血管内膜层。从HE染色的颈动脉样品测量的内膜对比中膜的比率表示为均值±标准误差(n＝9/组，*p＜0.01)。(b)是显示平滑肌α-肌动蛋白(SMA)和CD31的免疫荧光染色结果(n＝3)的图。正常颈动脉血管显示了典型的内皮细胞单层(箭号)。DAPI染色显示细胞核。
图26是显示了根据用双-(甲硫基)GT单独或GT+TR抑制剂(DNCB，金诺芬)处理对于球囊损伤引起的内膜增殖的HE染色图像的图。
图27是显示免疫组织化学染色结果的图，证实了GT对2-Cys-Prx过氧化的效应。
图28是显示了根据本发明的ETP衍生物，A1至A3、A5、A6和A8，抑制新生内膜平滑肌细胞增殖的图。显示了代表性的H&E染色图像，并且图中显示的数据是从HE染色颈动脉段测量的内膜对比中膜的比率并表示为均值±标准误差(*p＜0.01)。N.S.是指没有显著性。
图29是显示了当球囊损伤的颈动脉模型用根据本发明的ETP衍生物——A1至A3、A5、A6和A8处理时，引起再内皮细胞化的图。在用DMSO或所述ETP衍生物处理的损伤颈动脉中，进行CD31和平滑肌α-肌动蛋白(SMA)的共染色，并指出对应的部分。箭号指示增厚的新生内膜区域，而箭头指示用所述ETP衍生物处理的颈动脉的典型内皮细胞单层。细胞核用DAPI染色。显示了来自2次独立试验的代表性图像。
图30是显示在球囊损伤的大鼠颈动脉中，GT对血管渗透性和管腔表面状态的效应的图。(a)显示了在用对照组和GT处理的球囊损伤的大鼠颈动脉血管内，伊文思蓝(Evansblue)流入的程度。在左侧，显示了代表性的图像，而在右侧图中，流入所述血管的伊文思蓝被提取并且在620nm处的吸光度表示为均值±标准误差(n＝7/组，*p＜0.01)。(b)是用对照组和GT处理的球囊损伤的大鼠颈动脉血管的管腔表面扫描电子显微镜检查结果。进行3次独立试验，显示了代表性的放大图像。
图31是显示了毛壳素处理对细胞增殖和迁移的效应的图。PrxII击倒的HASMCs((a)和(b))和HAECs((c)和(d))用毛壳素预处理2小时，并用PDFG或VEGF刺激24小时。倍数增加在图中表示为均值±标准误差(n＝3，*p＜0.01，**p＜0.005，#p＜0.001)。
图32是显示毛壳素和毛壳菌素对球囊损伤引起的内膜增殖的效应的图。球囊损伤的大鼠颈动脉与毛壳素或毛壳菌素一起温育30分钟。DMSO用作对照组，并显示代表性的HE染色图像((a)和(b))。箭头指示了增厚的血管内膜层。从HE染色的颈动脉样品测量的内膜对比中膜的比率表示为均值±标准误差(n＝9/组，*p＜0.01)。(c)和(d)显示平滑肌α-肌动蛋白(SMA)和CD31的免疫荧光染色结果。箭号指示内皮细胞单层。
图33是显示各种抗氧化化合物对HAECs中VEGF信号传导的效应的图。将PrxIIsiRNA注入VEC，结果是用浓度渐增的所指示化合物(N-乙酰基半胱氨酸；NAC，丁基化羟基茴香醚；BHA)预处理2小时的。细胞用VEGF处理10分钟，然后通过免疫印迹法分析。
图34是显示Western印迹结果的图，证实了在PrxII缺陷的血管细胞中GT对PDGF-和VEGF-依赖性酪氨酸磷酸化的效应((a)，(b))，并且HE染色结果证实了在PrxII缺陷的小鼠中GT对结扎引起的血管内膜增殖的效应。
图35是显示了根据本发明的化合物A1(化学式15)的1HNMR光谱的图。
图36是显示了根据本发明的化合物A2(化学式7)的1H NMR光谱的图。
图37是显示了根据本发明的化合物A2R的1H NMR光谱的图。
图38是显示了根据本发明的化合物A3(化学式8)的1H NMR光谱的图。
图39是显示了根据本发明的化合物A4(化学式9)的1H NMR光谱的图。
图40是显示了根据本发明的化合物A4R的1H NMR光谱的图。
图41是显示了根据本发明的化合物A5(化学式10)的1H NMR光谱的图。
图42是显示了根据本发明的化合物A5R的1H NMR光谱的图。
图43是显示了根据本发明的化合物A6(化学式11)的1H NMR光谱的图。
图44是显示了根据本发明的化合物A7(化学式12)的1H NMR光谱的图。
图45是显示了根据本发明的化合物A8(化学式13)的1H NMR光谱的图。
图46是显示了根据本发明的化合物A9(化学式14)的1H NMR光谱的图。
图47是PrxII(Prx2)对黑素瘤细胞系增殖和迁移的效应的图。A显示了在4个不同类型的黑素瘤细胞系(SK5，SK28，A375和G361)中PrxII的表达水平。B显示了所述黑素瘤细胞系的细胞内过氧化氢水平。所述细胞内过氧化氢水平利用氧化敏感型染料DCFH-DA检测，和定量。显示了代表性的图像，图中的条是60至80个细胞平均的相对荧光值的均值±标准误差。C是显示所述黑素瘤细胞系之间增殖活性比较的图。D和E是显示所述黑素瘤细胞系之间迁移活性比较的图，并且所述活性通过趋化迁移实验(D)和创伤愈合实验(E)测量。所述试验重复3次(*P＜0.01，**P＜0.005)。
图48是显示通过在PrxII缺陷的SK-MEL细胞系中表达PrxII来抑制增殖和迁移的效应的图。A是显示在SK-MEL细胞系中PrxII的逆转录病毒表达的图。B至D是各自显示了对照组(vec)-和PrxII-表达的SK-MEL细胞系的增殖(B)和迁移(C和D)的图。所述细胞用对照-和PrxII-编码型逆转录病毒感染24小时。所述试验重复3次(*P＜0.01，**P＜0.005)。
图49是显示PrxII击倒对PrxII表达的黑素瘤细胞系的增殖和迁移的效应的图。A是显示在G361和A375细胞系中利用两种不同的特异性siRNA的选择性人类PrxII击倒的图。B和C是显示用对照组(con)和PrxII击倒的G361和A375细胞系的增殖(B)和迁移(C)的图。D是显示对于利用特异性siRNA的血清刺激，PrxI击倒的A375细胞的增殖和迁移的图。所述细胞按照指示用对照或同工型-特异性siRNA感染24小时。所述试验重复3次(*P＜0.01；**P＜0.005；N.S.是指没有显著性)。
图50是显示PrxII通过保存PTP活性对血清诱导的Src和ERK活化的抑制效应的图。A和B是显示在对照组(vec)-和PrxII-表达的SK28细胞中血清诱导的酪氨酸磷酸化的图。酪氨酸磷酸化是利用抗pTyr抗体(4G10)通过免疫印迹(A)和免疫染色(B)来检测。显示了代表性的印迹和图像(n＝3)。C是显示在对照组-和PrxII-表达的SK28细胞中PTP活性的图。总PTP活性利用聚-(谷氨酸4-p酪氨酸)(Glu4-pTyr)肽测量。D和E是显示在PrxII-表达的SK28细胞(D)和PrxI/II-缺陷的G361细胞(E)中细胞内信号传导分子的活性的图。G361细胞用血清刺激30分钟。定量磷酸特异性条带，并将相应的非磷酸蛋白条带的强度归一化。数据表示为来自3次独立试验的相对条带强度的均值±标准误差。F和G是显示当存在特异性MEK(F)和Src(G)抑制剂时，SK28黑素瘤细胞的增殖和迁移的图。所述SK28细胞血清饥饿24小时，并在血清刺激之前用PD98059(5μM)或PP2/PP3(各1μM)预处理1小时。PP3是PP2的无活性类似物。DMSO用作未处理样品的对照介质。所述试验重复3次(*P<0.01；**P<0.005；#P<0.001；N.S.是指没有显著性)。
图51是显示E-钙粘着蛋白/β-联蛋白复合体因PrxII表达在黑素瘤细胞的粘着连接处增加。A显示了在对照组(vec)和PrxII-表达的SK28细胞中粘着连接蛋白的表达。定量β-联蛋白和E-钙粘着蛋白条带的强度，并相对于相应的微管蛋白条带的强度归一化。数据表示为来自3次独立试验的相对条带强度的均值±标准误差(*P<0.005；N.S.，没有显著性)。B是显示在PrxII-表达的SK5和PrxII-缺陷的的G361细胞中β-联蛋白和E-钙粘着蛋白的表达的图。C和D是显示PrxII-表达的SK5(C)和PrxII-缺陷的G361(D)细胞中β-联蛋白和E-钙粘着蛋白的免疫染色的图。重叠的图像表现了在PrxII-表达的细胞的质膜中两种蛋白的共存(黄色)。跟随白色箭号(右上方)定量荧光强度并表示为所指示的级分相对于总强度的强度百分比(右下，n＝33个细胞/组，*P<0.001)。M1和M2表示质膜，Cyto表示细胞质。E是显示在SK28细胞中由于PrxII表达致使β-联蛋白Y654磷酸化降低的图。定量磷酸特异性条带，并相对于相应的非磷酸蛋白条带的强度归一化。数据表示为来自3次独立试验的相对条带强度的均值±标准误差。F是显示在G361细胞中通过PrxII击倒引起β-联蛋白Y654磷酸化增加的图。显示的代表性的免疫印迹来自3次独立试验，所述试验得到相同的结果。
图52是显示PrxII体内抑制黑素瘤细胞的转移活性的效应的图。A是显示在B16F10小鼠黑素瘤细胞中通过PrxII击倒改善Src/ERK活化和β-联蛋白磷酸化和降低E-钙粘着蛋白表达的图。B是显示在对照组-和PrxII-缺陷的B16F10小鼠黑素瘤细胞中用血清刺激的增殖和迁移的图(n＝3，**P＜0.001)。C是显示在B16F10细胞中根据PrxII击倒的时段，PrxII表达水平的图。所述细胞用mPrx2-1siRNA转染，并进行免疫印迹分析。定量PrxII条带的强度，并相对于相应的微管蛋白条带的强度归一化。数据表示为来自3次独立试验的相对条带强度的均值±标准误差。D和E是显示对照组-和PrxII击倒的B16F10黑素瘤细胞向肺转移的图。所述转染的细胞通过静脉注射注入小鼠。10天之后，取出肺，在(D)表面和(E)HE染色的组织切片中计算黑素瘤肿瘤结节。数据表示为均值±标准误差(S.E.M.)(*P＜0.005，**P＜0.001)。
图53是显示ETP衍生物，胶霉毒素(GT)，抑制黑素瘤细胞转移活性的效应的图。A是显示在对照介质(DMSO)-或GT-处理的SK28黑素瘤细胞系中细胞内过氧化氢水平的图。显示了代表性的图像，图中的条是60至80个细胞平均的相对DCF荧光值的均值±标准误差(**P＜0.005)。B是显示在对照介质(DMSO)-和GT-处理的SK28细胞中血清诱导蛋白磷酸化和E-钙粘着蛋白的表达的图。C和D是显示对照介质(DMSO)-和GT-处理的SK5和SK28细胞系的增殖(C)和迁移(D)的图。所述血清饥饿细胞用GT(100nM)预处理1小时，然后用血清刺激。所述试验重复3次(*P＜0.01，**P＜0.005)。E和F是显示在对照介质-和GT-注入的小鼠中B16F10黑素瘤细胞向肺转移的图。向小鼠(每组7只)静脉注射亲本(E)或mPrx2-1siRNA-转染的(F)B16F10黑素瘤细胞，然后在10天中注射5次DMSO或GT(300μg/kg，i.p.)。然后，取出肺，计算表面上的黑素瘤肿瘤结节。数据表示为均值±标准误差(S.E.M.)(*P＜0.01)。G是显示黑素瘤细胞中PrxII的抗转移功能的示意图。当PrxII不存在时，细胞内过氧化氢水平增加。增加的细胞过氧化氢水平相对于刺激而言，改善了Src和ERK的活性。活化的Src激酶使β-联蛋白(β-cat)磷酸化并触发β-cat相对于细胞质而言从粘着连接释放，同时活化的ERK激酶抑制了E-钙粘着蛋白(E-cad)的表达。因此，粘着连接处的E-钙粘着蛋白/β-联蛋白复合体被破坏，于是，黑素瘤细胞具有更高的转移能力。相反，PrxII表达除去了细胞内过氧化氢，从而抑制Src和ERK活化。因此，保留了β-联蛋白，并增加E-钙粘着蛋白水平，并因此增加了粘着连接处的E-钙粘着蛋白/β-联蛋白复合体。于是，PrxII表达增强了黑素瘤细胞之间的粘着性，从而免得转移。
图54是显示毛壳素和毛壳菌素抑制黑素瘤细胞增殖和迁移的图。介质(DMSO)或100nM所指示的ETP化合物用SK-MEL28黑素瘤细胞处理，细胞的细胞毒性(A)、增殖(B)和迁移(C)测量的结果在所述图中显示。所述ETP化合物以100nM浓度使用，没有表现出细胞毒性。
血清(FBS)促进了细胞的增殖和迁移。各图中的p值是指统计学显著性值。
图55是显示了在对照介质-或ETP化合物-注射的小鼠中是否发生B16F10黑素瘤细胞向肺转移的图。向小鼠(5只/组)静脉注射B16F10黑素瘤细胞，然后在10天中注射5次DMSO(DMSO)或ETP化合物(300mg/kg，i.p.)。计数位于分离的肺表面上的黑素瘤肿瘤结节，其显示在图中。图中的p值是指统计学显著性值。
具体实施方式
作为实现本发明目的的一个方面，本发明提供了以下化学式1表示的桥二硫双氧代哌嗪衍生物或它的还原衍生物，或其可药用盐。
[化学式1]
在化学式1中，R1至R4各自独立地是氢，卤素原子，羟基，直链或支链C1至C6烷基、烯基或炔基，直链或支链C1至C6烷氧基，直链或支链C1至C6羟烷基，取代或未取代的苄基，直链或支链C1至C6烷基芳基，直链或支链C1至C6全氟代烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的全氟代芳基，在环中包含氧、氮或硫原子作为杂原子的取代或未取代的杂芳基，或者取代或未取代的桥二硫双氧代哌嗪基，
并且所述烷基和芳基可以任选在链的中间包含氧、氮或硫杂原子，并且每个所述取代的桥二硫双氧代哌嗪基可以独立地任选包含上述限定的取代基并可以具有与母核桥二硫双氧代哌嗪相同或不同的结构；
或者R1和R2、以及R3和R4同与它们相连的碳原子一起各自独立地形成取代或未取代的C3至C6环烷基；或同与它们相连的碳原子、和另外的碳或杂原子一起形成具有5至8个环原子的取代或未取代杂环，在此，所述杂环的1或2个环原子选自氮(N)、氧(O)或硫(S)，然而，下列化学式15至46表示的化合物可能不包括在内。
[化学式15]
[化学式16]
[化学式17]
[化学式18]
[化学式19]
[化学式20]
[化学式21]
[化学式22]
在此，A和B各自独立地是氢；甲氧基；或羟基。[化学式23]
[化学式24]
[化学式25]
[化学式26]
[化学式27]
[化学式28]
[化学式29]
[化学式30]
[化学式31]
[化学式32]
[化学式33]
[化学式34]
[化学式35]
[化学式36]
[化学式37]
[化学式38]
[化学式39]
[化学式40]
[化学式41]
[化学式42]
[化学式43]
[化学式44]
[化学式45]
[化学式46]
由化学式1表示的桥二硫双氧代哌嗪衍生物或它的还原衍生物可以从天然源分离、从天然源取得并然后通过化学重整制备、或由本领域技术人员参考已知的制备方法从化学合成制备。优选地，所述桥二硫双氧代哌嗪衍生物可以通过根据本领域已知的方法从细菌、其培养基、或代谢物分离、或利用本发明的实施例中描述的方法从合成中制备加以利用。本发明的桥二硫双氧代哌嗪衍生物的还原衍生物可以用作合成具有相同取代基的桥二硫双氧代哌嗪衍生物的前体。从所述还原衍生物合成所述桥二硫双氧代哌嗪衍生物的具体方法将在后面描述。
优选地，所述衍生物的R1至R4可以各自独立地是氢、直链或支链C1至C6烷基或烯基、烷氧基苄基、烷氧基烷基或二苯甲基，并且特别地，R1至R4可以各自独立地是氢、甲基、正丁基、烯丙基、4-甲氧基苄基、3-甲氧基丙基或二苯甲基。
更优选地，R1和R3是氢，R2和R4彼此相同，并且可以是直链或支链C1至C6烷基或烯基；烷氧基苄基；烷氧基烷基或二苯甲基，并且特别地，可以是甲基、正丁基、烯丙基、4-甲氧基苄基、3-甲氧基丙基或二苯甲基；
R2和R4可以是直链或支链C1至C6烷基例如甲基、丙基或正丁基，R1和R3可以各自独立地是氢；或者直链或支链C1至C6烷基例如甲基、丙基或正丁基；
R1和R3是氢，R2和R4可以各自独立地是氢；或烷氧基苄基例如4-甲氧基苄基，但是不限于此。
最优选地，所述衍生物可以是由下列化学式7至14表示的任何一种化合物，或它的还原衍生物。
[化学式7]
[化学式8]
[化学式9]
[化学式10]
[化学式11]
[化学式12]
[化学式13]
[化学式14]
另外，当由化学式1表示的化合物具有立体异构体时，本发明包括所有立体异构体在内。
在另一个方面，本发明提供了制备由化学式1表示的化合物的方法，所述衍生物具有改善的细胞内渗透性并在细胞中以其还原形式模拟2-Cys-Prx的活性，所述方法包含利用氧化反应从以下化学式2表示的二巯基哌嗪二酮衍生物形成分子内二硫桥键。
[化学式2]
在化学式2中，R1至R4与上述限定的那些相同。
本发明的桥二硫双氧代哌嗪衍生物的一个特征是在细胞中模拟2-Cys-Prx的活性。“2-Cys-Prx”是硫醇特异性抗氧化蛋白，通过还原过氧化氢、过氧亚硝酸盐和细胞中的其他氢过氧化物的过氧化酶活性，发挥保护细胞的作用。2-Cys-Prx的功能单元是同型二聚体，并且所述单元具有内在的分子内氧化-还原活性二硫化物中心，其在所述酶的活性中发挥重要的作用。所述二聚体的每个半胱氨酸作为硫醇基以还原状态存在。同时，当与过氧化物反应时，2-Cys-Prx的过氧化半胱氨酸被氧化成次磺酸中间体，并有别于保持硫醇基的所述二聚体的其他小单元半胱氨酸，并且所述次磺酸基与所述中间体的硫醇基通过脱水缩合形成分子内二硫桥键。例如，在细胞中，2-Cys-Trx从包括两个硫醇基的还原型氧化成氧化型，其中所述两个硫醇基彼此形成分子内二硫桥键，并还原细胞内过氧化物。在此，包含分子内二硫桥键的氧化2-Cys-Prx可以被氧化-还原系统转化为具有两个硫醇基的还原型，其是活性类型，所述氧化-还原系统包括硫氧还蛋白(Trx)和硫氧还蛋白还原酶(TR)；烷基过氧化氢还原酶(AhpF)；锥虫胱甘肽还原酶，锥虫胱甘肽和锥虫氧还蛋白或硫辛酰胺脱氢酶，二氢硫辛酸琥珀酰基转移酶(SucB)，AhpD等。
本发明的桥二硫双氧代哌嗪衍生物的另一个特征是存在分子内二硫桥键。这种特征性的化学结构参与细胞内摄入，因此，一旦所述化合物被引入细胞，所述化合物就通过以比预期高得多的细胞内浓度聚积而在细胞中结合(P.H.Bernardo等，2003，J.Biol.Chem.，278：46549)。为了这个原因，本发明的桥二硫双氧代哌嗪衍生物可以有效防止或治疗血管病，即使当以能够避免内在细胞毒性的很低浓度给药时。
如上所述，本发明的桥二硫双氧代哌嗪衍生物被设计成包含分子内二硫桥键并从而容易被引入细胞，并可以通过细胞内氧化-还原系统被迅速转化为具有两个硫醇基的分子来还原过氧化物，于是，可以在细胞中有效模拟2-Cys-Prx的活性。虽然不限于此，但所述细胞内氧化-还原系统优选是包括硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶的氧化-还原系统。
由化学式2表示的二巯基哌嗪二酮衍生物可以通过以下步骤制备：通过由以下化学式3表示的哌嗪二酮衍生物与硫(S)和双(三甲基甲硅烷基)酰胺锂(LiHMDS)或NaHMDS反应制备中间体，所述中间体包括由以下化学式4表示的包含4个硫原子的环结构，并还原所述中间体以从包含4个硫原子的所述环结构形成2个硫醇基。
[化学式3]
[化学式4]
在化学式3和4中，R1至R4与上述限定的那些相同。
在此，所述还原反应可以利用本领域已知的反应进行而没有限制，并且可以优选利用氢化物系列还原剂例如硼氢化钠或氢化锂铝进行。更优选地，所述反应可以利用硼氢化钠进行；然而，所述反应不限于此。
另外，由化学式2表示的包含两个硫醇基的二巯基哌嗪二酮衍生物可以通过以下制备：由以下化学式5表示的卤素原子取代的哌嗪二酮衍生物与硫代乙酸的碱金属盐(MSAc)反应，制备由以下化学式6表示的包含硫代乙酸盐基团的中间体，然后所述中间体与酸溶液反应以用氢原子取代与硫原子结合的乙酰基。
[化学式5]
[化学式6]
所述碱金属盐是钠或钾盐，X是卤素原子例如F、Cl、Br或I，并且R1至R4与上述限定的那些相同。
在另一个方面，本发明提供了预防或治疗血管病的药物组合物，其包含由以下化学式1表示的桥二硫双氧代哌嗪衍生物或其可药用盐作为活性成分；以及治疗血管病的方法，所述方法包括将所述组合物施用于疑似有血管病的对象。此外，本发明提供了由化学式1表示的桥二硫双氧代哌嗪化合物、它的衍生物或可药用盐在制备预防或治疗血管病的药物中的用途。
[化学式1]
在化学式I中，R1至R4与上述限定的那些相同。
具体而言，在化学式1中，R1至R4各自独立地是氢，卤素原子例如F、Cl、Br或I，羟基，直链或支链C1至C6烷基，直链或支链C1至C6烷氧基，直链或支链C1至C6羟烷基，直链或支链C1至C6全氟代烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的全氟代芳基，在环中包含氧、氮或硫原子作为杂原子的取代或未取代的杂芳基；或
R1和R2、以及R3和R4同与它们相连的碳原子一起各自独立地形成取代或未取代的C3至C6环烷基；或同与它们相连的碳原子和另外的碳或杂原子一起形成具有5至8个环原子的取代或未取代杂环，在此，所述杂环的1或2个环原子可以选自N、O和S。
本发明的衍生物具有共同的分子内二硫桥键。所述二硫桥键促进所述衍生物引入细胞中，并且被引入细胞的所述化合物通过迅速还原成两个硫醇基而表现出细胞内活性。因此，所述分子需要被设计成排除被取代基遮掩，从而便于底物接近活性位点。因此，与所述衍生物的哌嗪环结合的取代基优选是小尺寸的取代基，以便所述取代基不会因所述取代基本身的体积或因旋转引起空间占据而立体阻挡二硫桥键，或优选彼此相连形成环以免旋转。
因此，在化学式1表示的衍生物中，R1和R3可以是氢原子，R2和R4可以各自独立地是氢，C1至C6烷基、烯基，在链的中间包含氧、氮或硫杂原子的烷基，烷氧基苄基或二苯甲基，并且更优选地，R1和R3是氢原子，R2和R4可以各自独立地是氢，或者C1至C6烷基或烯基；或者R1至R3是氢原子，R4可以是C1至C6烷基、烯基，在链的中间包含氧、氮或硫原子的烷基，或者取代苄基例如4-甲氧基苄基或未取代的苄基；并且R1、R2和R4可以是C1至C6烷基并且R3可以是氢，然而，R1至R4不限于此。
或者，一或多对的R1和R2、或R3和R4可以形成取代或未取代的环烷基或杂环。
所述组合物中包含的由化学式1表示的化合物可以是由下列化学式7至31表示的任何一种化合物。
[化学式7]
[化学式8]
[化学式9]
[化学式10]
[化学式11]
[化学式12]
[化学式13]
[化学式14]
[化学式15]
[化学式16]
[化学式17]
[化学式18]
[化学式19]
[化学式20]
[化学式21]
[化学式22]
在此，A和B各自独立地是氢；甲氧基；或羟基。[化学式23]
[化学式24]
[化学式25]
[化学式26]
[化学式27]
[化学式28]
[化学式29]
[化学式30]
[化学式31]
化学式16的化合物是代表性的ETP化合物，称为胶霉毒素(GT)，并可以从细菌例如烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、绿木霉(Trichoderma virens)、青霉属菌种(Penicillium spp.)或白色念珠菌(Candida albicans)、其培养基、代谢物或次级代谢物分离[Kirby和Robins，1980，霉菌毒素的生物合成(The Biosynthesis of Mycotoxins)，纽约：Academic Press；Shah和Larsen，1991，Mycopathologia，116：203-208]。
化学式17的化合物是称为刺串孢素(sirodesmin)的ETP化合物，并可以从细菌例如十字花科小球腔菌(Leptosphaeria maculans)或差异链格孢菌属(Sirodesmiumdiversum)、其培养基、代谢物或次级代谢物分离[Curtis等，1977，J.Chem.Soc.PerkinTrans.1，180-189；Ferezou等，1977，Nouv.J.Chim.，1：327-334]。
化学式18的化合物是称为透明菌素(hyalodendrin)的ETP化合物，并可以从细菌例如明枝霉属菌种(Hyalodendronsp.)、其培养基、代谢物或次级代谢物分离[Stillwell等，1974，Can.J.Microbiol.，20：759-764]。
化学式19的化合物是称为葚孢菌素(sporidesmin)A的ETP化合物，并可以从细菌例如纸皮司霉(Pithomyces chartarum)、其培养基、代谢物或次级代谢物分离[Kirby和Robins，1980，霉菌毒素的生物合成(The Biosynthesis of Mycotoxins)，New York：Academic Press]。
化学式20的化合物是称为毛壳菌素的ETP化合物，并可以从球毛壳霉(Chaetomiumglobosum)分离[Sekita等，1981，Can.J.微生物学(Microbiol.)，27：766-772]。
化学式21的化合物是称为毛壳素的ETP化合物，并可以从毛壳属菌种(Chaetomiumspp.)分离[Sekita等，1981，Can.J.微生物学(Microbiol.)，27：766-772]。
化学式22的化合物是称为轮枝孢菌素(verticillins)的ETP化合物，并可以从轮枝孢菌属菌种(Verticillium spp.)或青霉属菌种分离[Byeng等，1999，Nat.Prod.Lett.，13：213-222；Joshi等，1999，J.Nat.Prod.，62：730-733；Kirby和Robins，1980，霉菌毒素的生物合成(The Biosynthesis of Mycotoxins)，纽约：Sekita等，1981，Can.J.Microbiol.，27：766-772]。所述轮枝孢菌素包括轮枝孢菌素A、轮枝孢菌素13、轮枝孢菌素D、轮枝孢菌素E与轮枝孢菌素F的全部。
化学式23的化合物是称为小球腔菌素(leptosin)的ETP化合物，并可以从小球腔菌属菌种(Leptosphaetiasp.)分离[Takahashi等，1994，J.Antibiot.，47：1242-1249]。
化学式24的化合物是称为emestrin的ETP化合物，并可以从曲霉属菌种分离[Seya等，1986，Chem.Pharm.Bull.，34：2411-2416]。
化学式25的化合物是称为scabrosin的ETP化合物，并可以从黄梅地衣(Xanthoparmelia scabrosa)分离[Ernst-Russell等，1999，Aust.J.Chem.，52：279-283；Moerman等，2003，Toxicol.Appl.Pharmacol.，190：232-240]。
化学式26的化合物是称为dithiosilvatin的ETP化合物，并可以从森林曲霉(Aspergillus silvaticus)分离[Kawahara等，1987，J.Chem.Soc.Perkin Trans.1，2099-2101]。
化学式27的化合物是称为黑附球菌素(epicorazine)的ETP化合物，并可以从毛韧革菌(Stereum hirsutum)、紫附球菌(Epicoccum purpurascens)或黑附球菌(Epicoccumnigrum)分离[Deffieux等，1977，Acta Christallogr.，B33：1474-1478；Kleinwachter等，2001，J.Antibiot.，54：521-525]。
化学式28的化合物是称为阿拉诺丁(Aranotin)的ETP化合物，并可以从Arachniotus aureus或土曲霉(Aspergillus terreus)分离[Neuss等，1968，Antimicrob.Agents Chemother.，8：213-219]。
化学式29的化合物是称为emethallicin的ETP化合物，并可以从Aspergillusheterothallicus分离[Kawahara等，1989，Chem.Pharm.Bull.，37：2592-2595]。
化学式30的化合物是称为轮枝孢菌素的ETP化合物，并可以从轮枝孢属菌种分离[Byeng等，1999，Nat.Prod.Lett.，13：213-222；Joshi等，1999，J.Nat.Prod.，62：730-733；Kirby和Robins，1980，霉菌毒素的生物合成(The Biosynthesis of Mycotoxins)，纽约：Sekita等，1981，Can.J.Microbiol.，27：766-772]。
化学式31的化合物可以从链孢粘帚霉(Gliocladium catenulatum)分离[Byeng等，1999，Nat.Prod.Lett.，13：213-222；Joshi等，1999，J.Nat.Prod.，62：730-733；Kirby和Robins，1980，霉菌毒素的生物合成(The Biosynthesis of Mycotoxins)，纽约：Sekita等，1981，Can.J.Microbiol.，27：766-772]。
所述桥二硫双氧代哌嗪化合物或其衍生物可以从天然源分离，从天然源取得并然后通过化学重整制备，由本领域技术人员参考已知的制备方法从化学合成制备，或商业购买。优选地，所述桥二硫双氧代哌嗪化合物或其衍生物可以通过根据本领域已知的方法从细菌、其培养基、或代谢物分离、或利用本发明的实施例中描述的方法从合成中制备加以利用。
在本发明的具体例子中，A1中所有取代基是氢原子；A2和A3中分别被2和3个甲基取代；A5中哌嗪环的2个氮原子被2-丙烯基取代，和A8中结合丁基，各自显示了改善由VEGF诱导的的内皮细胞增殖和迁移的优异活性，同时抑制由PDGF诱导的血管平滑肌的增殖和迁移。同时，A6中被一个甲氧基苄基取代、和A9中被包括杂原子的5种元素形成的两个甲氧基丙基取代显示出中等活性，而A4中被两个甲氧基苄基取代和A7中被两个二苯甲基取代显示出低活性。基于上述结果，可推断用比较小的取代基例如C1至C4烷基或烯基取代的衍生物不管取代基数量多少都显示出优异的活性，具有比较大的取代基的衍生物具有有所降低的活性，然而，所述活性的效力可以通过调节取代基的类型和/或数量进行调节。
本发明的桥二硫双氧代哌嗪衍生物可以以可药用盐的形式使用。另外，本发明的化合物可以单独或与其他可药用活性化合物结合、或作为集合体使用。
本发明中使用的术语“可药用盐”是指具有所述化合物的目标生物和/或生理活性、并极少表现出不希望的毒理学效应的所有盐。在本发明中，所述盐的类型没有限制，只要所述盐保留包含分子内二硫桥键的二酮哌嗪环即可。作为所述盐，通过可药用的游离酸形成的酸加成盐是有用的。所述酸加成盐可以利用普通的方法例如在过量的水溶液中溶解化合物、并利用水溶性有机溶剂例如甲醇、乙醇、丙酮或乙腈沉淀这种盐来制备。等摩尔的化合物、和酸或醇的水溶液(例如，乙二醇单甲醚)加热，然后可以通过蒸发干燥所述混合物，或者沉淀的盐可以被抽吸过滤。在此，无机酸或有机酸可以用作游离酸，且盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、锡酸等可以用作无机酸，甲磺酸、对甲苯磺酸、乙酸、三氟乙酸、马来酸、琥珀酸、草酸、苯甲酸、酒石酸、富马酸、扁桃酸、丙酸、柠檬酸、乳酸、乙醇酸、葡糖酸、半乳糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、葡糖醛酸、天冬氨酸、抗坏血酸、碳酸、香草酸、氢碘酸等可以用作有机酸，然而，所述无机酸和有机酸不限于此。
另外，可药用金属盐可以用碱制备。通过，例如，将化合物溶解在过量的碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物溶液中，过滤不可溶的化合物盐，干燥滤液并干燥产物，得到碱金属或碱土金属盐。在此，制备钠、钾或钙盐作为所述金属盐是药用合适的，但是所述金属盐不限于此。此外，通过所述碱金属或碱土金属盐与合适的银盐(例如硝酸银)反应，可以得到与此相应的银盐。
除非另作说明，本发明的桥二硫双氧代哌嗪衍生物的可药用盐包括能存在的酸性或碱性基团的所有盐。例如，所述可药用盐可以包括羟基的钠、钙和钾盐，并且作为其他可药用盐，可以包括氨基、氢溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、乙酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乳酸盐、扁桃酸盐、甲基磺酸盐(甲磺酸盐)、对甲苯磺酸盐(甲苯磺酸盐)等，并且这些可以利用本领域已知的盐制备方法制备。
本发明的药物组合物可以用于预防或治疗血管病，所述血管病起因于高血压、缺血性冠状动脉病例如不稳定型心绞痛、心绞痛和心肌梗塞、脑动脉阻塞例如中风、动脉粥样硬化、外周动脉阻塞性疾病例如贝格尔(bergers)病、血栓栓塞、糖尿病足病变、静脉曲张性溃疡、深静脉血栓、颈动脉动脉粥样硬化、血管痉挛、血管平滑肌增生和/或内皮损失例如动脉炎和血管再狭窄，但没有限制。所述药物组合物可以用于预防或治疗起因于血管移植、血管切割、动脉粥样硬化、血管内脂质堆积、高血压、动脉炎、血管成形术等的血管再狭窄。血管再狭窄发展的原因不明，然而，已知内膜增生是由于周围细胞分泌生长因子和/或细胞因子引起血管平滑肌细胞的异常迁移和增殖所导致的，而周围细胞分泌生长因子和/或细胞因子是由于各种原因所致的血管损伤或当进行血管成形术时因插入装置所致的内皮损伤的恢复机制。所述血管包括颈动脉、冠状动脉、外周动脉、肾动脉等，但不限于此。
所述包含由化学式1表示的桥二硫双氧代哌嗪衍生物或其可药用盐的药物组合物促进内皮细胞的增殖或迁移，同时抑制血管平滑肌细胞的增殖或迁移。
本发明的桥二硫双氧代哌嗪衍生物优选具有模拟2-Cys-Prx活性的特征。“PrxII(写为过氧化物氧还蛋白II或Prx2)”是还原细胞内过氧化氢的过氧化物酶2-Cys-Prx之一，并通过还原在血管平滑肌细胞中由PDGF产生的过氧化氢来抑制在PDGFR-PCLγ1中位置特异性发生的磷酸化，发挥抑制细胞信号传导放大的作用。通过例如这种的机制，PrxII具有抑制损伤的血管中平滑肌细胞迁移和增殖以及遏制内膜增生的活性(M.H.Choi等，2005，Nature，435：347)。同时，已经报告，PrxII通过在内皮细胞中保护VEGFR2免于氧化失活来激活VEGF诱导的信号传导(D.H.Kang等，2011，Mol.Cell.，44：656)。利用通过注入PrxIIsiRNA击倒PrxII的细胞和血管损伤动物模型，本发明的发明人已经证明了本发明的桥二硫双氧代哌嗪化合物或它的衍生物可以在细胞功能上代替PrxII。
根据本发明的一个方面，证明了胶霉毒素、毛壳素、毛壳菌素和由化学式7至15表示的化合物，其是属于化学式1表示的化合物的代表性化合物，亦即具有桥二硫双氧代哌嗪结构的化合物，它们可以模拟细胞内2-Cys-Prx活性并具有改善的引入细胞的能力，另外，证明了这些化合物可促进VEGF诱导的内皮细胞的迁移和增殖，同时抑制PDGF诱导的血管平滑肌细胞的迁移和增殖。因此，由化学式1表示的其他化合物在治疗血管病、特别是因促进内皮细胞的迁移和增殖引起的血管再狭窄、和抑制血管平滑肌细胞的迁移和增殖中也是有效的，因为所述化合物共有桥二硫双氧代哌嗪结构。
本发明的组合物还可以包含普遍用于制备药物组合物中的适当载体、稀释剂和冲淡剂。所述组合物是灭菌或消毒的，可以是水、缓冲液、等渗剂等，并且所述溶液是灭菌或消毒的，或可以包含本领域技术人员已知的其他成分，所述成分当应用于动物或人类时不引起过敏或其他有害反应。
本发明中使用的术语“可药用载体”包括所有随机溶剂、分散介质、涂料、抗微生物剂、抗真菌剂和等渗剂等等。利用所述介质和制剂作为药用活性物质是相关领域中公知的。除了与活性成分不可混溶的常用介质或制剂之外，在治疗组合物中还考虑使用如上所述的介质和制剂。另外，辅助的活性成分可以与如上所述的组合物混合。
所述组合物可以制成制剂例如液体、乳液、悬液或霜剂，或可以用于非口服给药。所述组合物的使用量可以是通常用于预防或治疗血管病的量，并优选根据患者的年龄、性别和状况、活性物质的体内吸收率、失活速率和联合用药而不同。
在本发明中，术语“预防”是指通过施用所述药物组合物来抑制血管病或延迟所述疾病发作的所有作用，术语“治疗”是指通过施用所述药物组合物使血管病症状能够改善或变好的所有作用。
在本发明中，术语“对象”是指感染了血管病或具有感染血管病可能性的包括人类在内的所有动物，并且所述血管病可以通过向实体中施用本发明的药物组合物而有效预防或治疗。另外，本发明的药物组合物可以与已知的血管病治疗剂联合施用。
本发明的药物组合物以治疗有效剂量施用。术语“治疗有效剂量”是指足以以适用于医疗并且不引起副作用的合理效益/风险比治疗疾病的量，并且所述有效剂量的水平可以由本领域技术人员根据下述因素容易地确定，所述因素包括患者的性别、年龄、重量和健康状况、疾病严重度、药物活性、对药物的敏感性、给药方法、给药时间、给药途径和排泄速率、治疗期和混合或同时使用的药物、以及医学领域中公知的其他因素。
可与本发明的药物组合物联合使用的已知治疗剂的例子包括紫杉醇、西罗莫司等等。已知治疗剂的治疗有效剂量是相关领域中已知的，并且主治医师可以考虑各种情况例如症状的程度和与本发明组合物的共同给药来调节所述量。通过共同施用如上所述的已知治疗剂，所述已知治疗剂的副作用可以通过本发明的组合物降低，并且协同疗效也是可预期的。这些已知的治疗剂可以与本发明的组合物作为复方药同时施用，或以时间间隔顺序施用。
本发明中的术语“给药(administration)”是指利用适当的方法向患者引入处方物质，并且所述组合物可以通过任何通常的途径施用，只要所述组合物到达靶组织即可。虽然不限于此，但给药方法优选非口服给药，并且更优选向病灶局部给药。为了药物的局部给药，可以使用双气囊导管、派送器(dispatches)或微孔气囊等等，并且特别是支架或缓释微粒可以用于长期药物投送。最优选地，本发明的组合物可以通过在支架内部施加所述组合物而直接施用于狭窄区域。
另外，本发明提供了用于局部给药的药物投送装置，其包含预防或治疗血管病的药物组合物。用于局部给药的药物投送装置可以包括但不限于双气囊导管、派送器、微孔气囊、支架等，并优选是支架。
本发明中的术语“支架”是指如上所述用于管腔内应用、例如血管内应用的一般装置，并且是指圆柱形的医学材料，其当某个位置由于疾病发展而失去血流时，通过在无需外科剖腹术的荧光透视下插入到缩窄或堵塞的血管区使血流正常化而具有顺畅血流。例如，在Eric J.Topol撰写的介入心脏病学教程(textbook of Interventional Cardiology)(Saunders Company，1994)中描述了血管支架。优选所述支架是缓释药型支架。
作为将本发明的药物组合物涂布于支架的方法，可以采用本领域技术人员已知的常用涂层方法，其例子包括浸渍涂层法和聚合物涂层法，浸渍涂层法是最简单的涂层方法，并且因为只涂布了所述药物组合物，容易观察药物本身的生物效应，然而，方法并不限于此。优选地，本发明的支架可以通过将所述组合物涂布在与聚合物材料混合之后的释药支架上来制备，以便缓释本发明的组合物。可用作释药支架的聚合物材料是本领域公知的，其例子包括聚氨酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乳酸(PLLA)-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯、聚-(羟基丁酸酯/羟基戊酸酯)共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、聚四氟乙烯、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、聚(醚氨基甲酸酯脲)、有机硅、丙烯酰材料、环氧化物、聚酯、氨基甲酸酯、芘、聚膦嗪聚合物、氟代聚合物、聚酰胺、聚烯烃及其混合物，但不限于此。
支架可以用选自由多糖、肝素、明胶、胶原蛋白、藻酸盐、透明质酸、藻酸、角叉菜胶、软骨素、果胶、壳聚糖及其衍生物和共聚物组成的组中的一种或多种材料形成，或可以进一步涂有包含这些的抗血栓形成的抗血栓形成层。这些材料可以如美国专利申请公布No.US 2006/0083772中所述，适当地合并成生物相容的顶涂层。从聚合物和药物化合物的混合物形成支架的方法公开在Blindt等，1999，Int.J.Artif.Organs，22：843中。
在另一个方面，本发明提供了抑制黑素瘤转移的药物组合物，其包含由化学式1表示的桥二硫双氧代哌嗪衍生物或其可药用盐作为活性成分。
另外，本发明提供了抑制黑素瘤转移的方法，所述方法包括将所述药物组合物施用于需要所述组合物的对象中。
另外，本发明提供了由化学式1表示的桥二硫双氧代哌嗪化合物、它的衍生物、或其可药用盐在制备用于抑制黑素瘤转移的药物中的用途。
所述组合物中包含的由化学式1表示的化合物可以是由化学式7至31表示的任何一种化合物。
“黑素瘤”是指产生深色色素—黑色素的黑色素细胞的恶性肿瘤，也称为恶性黑色素瘤。黑色素细胞决定肤色，并通常出现在皮肤上，但是也可以出现在包括肠和眼睛的其他身体部分。因此，黑素瘤可以出现在分布有黑色素细胞的任何身体部分。与其他皮肤癌相比，黑素瘤不是全身疾病，但是因难于早期检测而是危险高得多的疾病，，并且皮肤癌相关死亡的大部分原因(75％)是由于黑素瘤。转移的黑素瘤可以引起非特异性症状，例如胃口不佳、恶心和疲劳。虽然比较罕见，黑素瘤有时在早期转移。脑转移是在转移黑素瘤患者中最普遍观察到的。另外，黑素瘤可以远距离转移到肝、骨、腹或甚至淋巴结。
本发明的发明人通过特定的例子，证明了PrxII参与黑素瘤转移。具体而言，鉴定出在黑素瘤细胞系中PrxII的表达程度低的细胞系中，细胞内过氧化氢的水平高(SK5和SK28)。此外，鉴定出与表达PrxII的黑素瘤细胞系相比，这些细胞系具有高增殖和迁移活性(A375和G361)。同时，当低表达PrxII的黑素瘤细胞系中PrxII表达增加时，鉴定出增殖和迁移降低。此外，当在表达PrxII的黑素瘤细胞系中利用siRNA选择性击倒PrxII时，鉴定出增殖和迁移提高。另外，利用PrxII击倒的小鼠模型，鉴定出PrxII参与体内黑素瘤转移(试验例9(1))。如上所述，PrxII是2-Cys-Prx的一种类型，并且基于本发明的桥二硫双氧代哌嗪衍生物可以在细胞中模拟2-Cys-Prx例如PrxII的活性的想法，鉴定可以通过用胶霉毒素(GT)、毛壳素和毛壳菌素处理来抑制黑素瘤的转移潜力，胶霉毒素、毛壳素和毛壳菌素是桥二硫双氧代哌嗪衍生物的一种类型、从真菌代谢物分离、包含分子内二硫桥键结构、并在本发明的衍生物中被鉴定表现出所述活性(试验例9(2)和(3))。因此，本发明的桥二硫双氧代哌嗪衍生物可以通过在细胞中模拟PrxII活性，有效抑制由PrxII缺陷或失活引起的黑素瘤转移。
另外，本发明提供了制备血管再狭窄的预防或治疗剂的方法，所述方法包括鉴定包含一个或多个由化学式47表示的桥二硫双氧代哌嗪环的桥二硫双氧代哌嗪(ETP)化合物是否表现出2-Cys-过氧化物氧还蛋白(2-Cys-Prx)活性；和生产在上述步骤中被鉴定表现出2-Cys-过氧化物氧还蛋白(2-Cys-Prx)活性的化合物。
[化学式47]
另外，本发明提供了筛选血管再狭窄的预防或治疗剂的方法，所述方法包括以下步骤：(a)鉴定所述包含一个或多个由化学式47表示的桥二硫双氧代哌嗪环的化合物是否表现出2-Cys-过氧化物氧还蛋白(2-Cys-Prx)活性；和(b)当NADPH氧化反应或H2O2还原反应发生时，确定所述化合物为血管再狭窄的预防或治疗剂。
在步骤(a)中，鉴定所述化合物是否表现出2-Cys-过氧化物氧还蛋白(2-Cys-Prx)活性可以通过鉴定当所述包含一个或多个由化学式47表示的桥二硫双氧代哌嗪环的化合物与硫氧还蛋白(Trx)、硫氧还蛋白还原酶(TR)、NADPH、缓冲液和H2O2混合和反应时是否发生NADPH氧化反应或H2O2还原反应来实行；并且当发生NADPH氧化反应或H2O2还原反应时，确定所述化合物表现出2-Cys-过氧化物氧还蛋白(2-Cys-Prx)活性。
包含一个或多个由化学式47表示的桥二硫双氧代哌嗪环的上述化合物可以具有多于1、2、3或4个桥二硫双氧代哌嗪环，但不限于此。
具体而言，试验组是通过所述包含桥二硫双氧代哌嗪环的候选化合物首先在缓冲液中与Trx、TR、NADPH和EDTA反应，然后与H2O2混合以进行氧化反应而制备的，而对照组是通过在没有所述样品下进行相同的反应而制备的，然后每个组通过监测在340nm处的吸光度降低进行比较。在此，对照组表现出不变的吸光度，而当包含表现出2-Cys-Prx活性的候选化合物时，观察到吸光度随时间降低，并且活性与吸光度降低成正比。因此，通过执行上述步骤，观察到所述吸光度降低的包含桥二硫双氧代哌嗪环的候选化合物可以确定为具有预防或治疗血管再狭窄活性的材料。Trx和TR可以来源于酵母、人类或大鼠，并优选来源于酵母。鉴定所述化合物是否表现出2-Cys-过氧化物氧还蛋白(2-Cys-Prx)活性可以按照韩国专利申请公布No.10-2006-0020140中描述的方法进行，所述专利的内容包括在本说明书中作为参考。
实施例
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例只出于说明性目的，并且本发明的范围不限于这些实施例。
<包含分子内二硫桥键的桥二硫双氧代哌嗪衍生物的合成>
制备例1：2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮(A1，化学式15)的制备
A.1,4-二二苯甲基哌嗪-2,5-二酮(2)
NaH(60％分散在矿物油中，385mg，9.64mmol)分散在10mlDMF中之后，在冰水浴中向其添加无水甘氨酸(500mg，4.38mmol)。所述混合物搅拌10分钟后，向其缓慢添加溴代二苯甲烷(2.27g，2.1eq.)。所得物(result)在室温下反应过夜。向所述反应溶液添加水并搅拌所得物。过滤出沉淀，用水洗涤，然后在减压下干燥，获得1,4-二二苯甲基哌嗪-2,5-二酮(2)(1.4g，收率71％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 7.39-7.31(m，12H)，7.21-7.19(d，8H)，7.09(s，2H)，3.83(s，4H)。
B.7,9-二二苯甲基-2,3,4,5-四硫杂-7,9-二氮杂双环[4.2.2]癸烷-8,10-二酮(3)
硫(402mg，12.54mmol)分散在5ml无水THF中之后，在氩气氛下用2分钟向其逐滴添加LiHMDS(1.0M于THF中，4.7ml，3.0eq.)。所述混合物搅拌大约1分钟后，向其逐滴添加步骤A中得到的化合物(2；700mg，1.567mmol)溶解在20ml THF中的溶液。所得物搅拌大约1分钟后，向其逐滴添加LiHMDS(1.0M于THF中，3.13ml，2.0eq.)，然后搅拌所得物30分钟。反应完成后，所得物通过添加饱和NH4Cl溶液和乙酸乙酯(EA)(x3)提取两次。合并有机层，用硫酸镁处理，过滤，然后除去所述溶剂。剩余物利用硅胶柱层析(Hex:EA＝2:1)提纯，得到7,9-二二苯甲基-2,3,4,5-四硫杂-7,9-二氮杂双环[4.2.2]癸烷-8,10-二酮(3；230mg，收率：26％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 7.39-7.32(m，12H)，7.21(m，4H)，7.07(m，4H)，6.95(s，2H)，5.14(s，2H)。
C.3,6-二巯基-1,4-二二苯甲基哌嗪-2,5-二酮(4)
7,9-二二苯甲基-2,3,4,5-四硫杂-7,9-二氮杂双环[4.2.2]癸烷-8,10-二酮(3；230mg，0.401mmol)溶解在甲醇中后，在冰水浴中向其缓慢添加NaBH4(45mg，3.0eq.)。所述混合物搅拌30分钟并且反应完成后，除去溶剂。向所述粗化合物添加水和EA(x3)并提取所得物。合并有机层，用硫酸镁处理，过滤，然后除去所述溶剂。剩余物在减压下干燥，得到3,6-二巯基-1,4-二二苯甲基哌嗪-2,5-二酮(4)。所述化合物没有进一步提纯就用于接下来的反应。
D.5,7-二二苯甲基-2,3-二硫杂-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮(5)
所述二硫醇粗化合物(4)溶解在30ml氯仿中后，向其添加碘(101mg，0.401mmol)溶解在氯仿中的20ml溶液。所述混合物在室温下反应30分钟后，除去溶剂，剩余物利用硅胶柱层析(EA:Hex＝1:2)提纯，得到5,7-二二苯甲基-2,3-二硫杂-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮(5)(130mg，2步收率-63％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 7.37-7.28(m，12H)，7.27(m，4H)，7.14(m，4H)，6.77(s，2H)，5.31(s，2H)。
ESI-MS(M+Na)：531，C30H24N2O2S2计算值为508.
E.2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮(6；A1)
步骤D中得到的粗化合物(5；50mg)溶解在三氟乙酸(TFA，1mL)中后，向其添加三氟甲磺酸(CF3SO3H，0.1mL)并在冰水浴中反应。所述混合物反应30分钟后，通过向反应溶液添加冰冷的水来终止反应，并搅拌所得物。过滤并干燥产生的固体。然后，所述固体在醚中搅拌，过滤，并在减压下干燥得到2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮(6；8mg，47％)。得到的最终产物的NMR数据显示在图35中。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 9.69(brd，2H)，5.65(d，2H)。
ESI-MS(M-1)：175，C4H4N2O2S2的计算值为176。
制备例2：5,7-二甲基-2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]-辛烷-6,8-二酮(A2，化学式7)的制备
A.3,6-二溴-1,4-二甲基哌嗪-2,5-二酮(2)
在肌氨酸酐(1)(500mg，3.52mmol)、N-溴代琥珀酰亚胺(1.87g，3.0eq.)和过氧化苯甲酰(85mg，0.1eq.)分散在四氯化碳(50ml)中后，所述混合物在回流下加热2小时。所述反应完成和反应物质冷却到室温后，得到的琥珀酰亚胺过滤并用四氯化碳洗涤。合并滤液，用硫酸镁干燥，然后再一次过滤。除去溶剂，剩余物在减压下干燥得到3,6-二溴-1,4-二甲基哌嗪-2,5-二酮(2)。得到的化合物没有进一步提纯就原样用于接下来的反应。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 6.04(s，2H)，3.15(s，6H)。
B.1,4-二甲基-3,6-二氧代哌嗪-2,5-二基-二硫代乙酸酯(3)
在3,6-二溴-1,4-二甲基哌嗪-2,5-二酮(2)(粗制1.05mg，3.52mmol)溶解在二氯甲烷(DCM；100ml)中后，在冰水浴中向其添加硫代乙酸钾(1.2g，3.0eq.)。所述混合物在室温下搅拌过夜，得到的沉淀过滤并用DCM洗涤。合并滤液并在减压下蒸发溶剂。剩余物利用硅胶柱层析(DCM:乙酸乙酯(EA)＝5:1)提纯得到1,4-二甲基-3,6-二氧代哌嗪-2,5-二基-二硫代乙酸酯(3)(白色固体；200mg，2步收率-20％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 5.77(s，2H)，2.94(s，6H)，2.48(s，6H)。
C.3,6-二巯基-1,4-二甲基哌嗪-2,5-二酮(4)
在二硫代乙酸酯(195mg，0.67mmol)溶解在乙醇(20ml)中后，向其添加乙醇盐酸溶液(通过向7ml乙醇添加1.5ml乙酰氯来制备)。所述混合物溶液在回流下加热2小时。反应完成后，除去溶剂，剩余物在减压下干燥得到明黄色固体的3,6-二巯基-1,4-二甲基哌嗪-2,5-二酮(4)(90mg，65％)。得到的化合物没有进一步提纯就用于接下来的反应。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 5.00(s，2H)，3.09(s，6H)。
ESI-MS(M-1)：205，C6H10N2O2S2的计算值为206。
D.5,7-二甲基-2,3-二硫代-5,7-二氮杂双环[2,2,2]辛烷-6,8-二酮(5；A2)
碘(63mg，1.0eq.)溶解在10ml DCM中的溶液添加到3,6-二巯基-1,4-二甲基哌嗪-2,5-二酮(50mg，0.242mmol)溶解在10ml氯仿中的溶液。所述混合物在室温下反应30分钟。反应完成后，将含有硫代硫酸钠的饱和NaHCO3溶液倾入反应物质中，搅拌所得物直到碘引起的颜色消失。分离有机层并且水层用DCM进一步提取两次后，合并有机层并然后用硫酸镁干燥。然后，过滤有机层并减压浓缩以产生剩余物，所述剩余物利用乙醇再结晶，过滤，然后用己烷(Hex)洗涤，并在减压下干燥以得到明黄色固体的5,7-二甲基-2,3-二硫代-5,7-二氮杂双环[2,2,2]辛烷-6,8-二酮(5)(18mg，36％)。得到的最终产物的NMR数据显示在图36中。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 5.21(s，2H)，3.12(s，6H)。
ESI-MS(M+Na)：227，C6H8N2O2S2的计算值为204。
制备例3：1,5,7-三甲基-2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮(A3，化学式8)的制备
A.2-(2-氯代乙酰胺)丙酸甲酯(2)
在丙氨酸甲酯盐酸盐(2g，14.3mmol)溶解在6ml水中后，在冰水浴中向其缓慢添加碳酸氢钠(NaHCO3；2.8g，33.6mmol)。通过逐滴添加向所述反应物质混合溶解在5ml甲苯中的氯乙酰氯溶液(1.67ml，20.9mmol)，在室温下剧烈搅拌所得物3小时。反应完成后，分离有机层并用甲苯进一步洗涤水层。合并有机层，用硫酸镁处理，过滤，然后除去溶剂。剩余物在减压下干燥得到粗2-(2-氯代乙酰胺)丙酸甲酯(2)(2.6g)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 7.23(br s，1H)，4.65(m，1H)，4.11(s，2H)，3.79(s，3H)，1.42(d，3H)。
B.3-甲基哌嗪-2,5-二酮(3)
将2-(2-氯代乙酰胺)丙酸甲酯(2；2.6g，14.3mmol)溶解在12ml乙醇中后，向其添加6.1ml(43.4mmol)的30％氨水溶液。所述混合物在70℃下反应5小时。反应完成和反应物质冷却到室温后，除去乙醇。当在剩余的少量水中形成固体时，过滤出固体，然后用水和己烷洗涤。洗涤过的固体在减压下干燥，得到白色固体的3-甲基哌嗪-2,5-二酮(3)(420mg，2步收率-23％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δppm 8.13(br s，1H)，7.95(br s，1H)，3.84(q，1H)，3.72(s，2H)，1.26(d，3H)。
C.1,3,4-三甲基哌嗪-2,5-二酮(4)
在3-甲基哌嗪-2,5-二酮(3；420mg，3.28mmol)分散在25ml二甲基甲酰胺(DMF)中后，在冰水浴中向其添加NaH(400mg，9.83mmol)。向其添加碘甲烷(2ml，10eq.)，并将所述混合物在室温下搅拌4小时。反应完成后，除去DMF，剩余物利用硅胶柱层析(DCM:甲醇＝20:1至9:1)提纯，得到1,3,4-三甲基哌嗪-2,5-二酮(4)(无色固体；440mg，收率86％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 4.08(d，1H)，3.92(q，1H)，3.85(d，1H)，2.98(s，6H)，1.47(d，3H)。
D.6,7,9-三甲基-2,3,4,5-四硫杂-7,9-二氮杂双环[4.2.2]癸烷-8,10-二酮(5)
在硫(1.64g，51.2mmol)分散在20ml无水THF中后，在氩气气氛下用2分钟向其逐滴添加NaHMDS(1.0M于THF中，19.2ml)。所述混合物搅拌大约1分钟后，向其逐滴添加步骤C中得到的化合物(4；1g，6.4mmol)溶解在20ml THF中的溶液。所得物搅拌大约1分钟后，向其逐滴添加NaHMDS(1.0M于THF中，12.8ml，2.0eq.)，然后搅拌所得物30分钟。反应完成后，所得物通过添加饱和NH4Cl溶液和DCM(x3)提取。合并有机层，用硫酸镁处理，过滤，然后除去溶剂。剩余物利用硅胶柱层析(EA:己烷＝1:1)提纯，得到6,7,9-三甲基-2,3,4,5-四硫杂-7,9-二氮杂双环[4.2.2]癸烷-8,10-二酮(5；250mg，收率：14％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 5.13(s，1H)，3.06(d，6H)，2.00(s，3H)。
E.3,6-二巯基-1,3,4-三甲基哌嗪-2,5-二酮(6)
在6,7,9-三甲基-2,3,4,5-四硫杂-7,9-二氮杂双环[4.2.2]癸烷-8,10-二酮(5)(250mg，0.885mmol)溶解在20ml甲醇中后，所得物在冰水浴中缓慢添加到NaBH4(167mg，4.43mmol)。所述混合物搅拌30分钟并且反应完成后，除去溶剂。向所述粗化合物添加水和DCM(x3)并提取所得物。合并有机层，用硫酸镁处理，过滤，然后除去溶剂。剩余物在减压下干燥得到3,6-二巯基-1,3,4-三甲基哌嗪-2,5-二酮(6)。所述化合物没有进一步提纯就用于接下来的反应。
F.1,5,7-三甲基-2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮(7；A3)
在上面得到的二硫醇化合物(35mg)溶解在30ml氯仿中后，向其添加碘(249mg，1.0eq.)溶解在氯仿中的25ml溶液。所述混合物在室温下反应30分钟后，除去溶剂，剩余物利用硅胶柱层析(EA:Hex＝1:1)提纯,得到明黄色的固体1,5,7-三甲基-2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮(7)(24mg，2步收率-12％)。得到的最终产物的NMR数据显示在图38中。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 5.29(s，1H)，3.14(s，3H)，3.03(s，1H)，1.98(s，3H)。
ESI-MS(M+Na)：241，C7H10N2O2S2的计算值为218。
制备例4：1,4-双(4-甲氧基苄基)-2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮(A4，化学式9)的制备
A.1,4-双(4-甲氧基苄基)哌嗪-2,5-二酮(2)
在NaH(1.54g，38.5mmol)分散在20ml DMF中后，在冰水浴中向其添加无水甘氨酸(2g，17.5mmol)。所述混合物搅拌10分钟后，用30分钟向其缓慢添加苄基氯(5.94ml，2.5eq)。所得物在室温下反应1小时后，向其添加水并搅拌所得物。过滤出沉淀，然后用水洗涤。得到的固体化合物在EA和己烷的混合溶剂(EA:Hex＝9:1)中搅拌，过滤，然后在减压下干燥，得到1,4-双(4-甲氧基苄基)哌嗪-2,5-二酮(2；5.1g，82％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 7.21(d，4H)，6.87(d，4H)，4.51(s，4H)，3.89(s，4H)，3.80(s，6H)。
B.7,9-双(4-甲氧基苄基)-2,3,4,5-四硫杂-7,9-二氮杂双环[4.2.2]癸烷-8,10-二酮(3)
在硫(72mg，2.257mmol)分散在2ml无水THF中后，在氩气气氛下用2分钟向其逐滴添加NaHMDS(1.0M于THF中，0.85ml，3.0eq.)。所述混合物搅拌大约1分钟后，向其逐滴添加步骤A中得到的化合物(2；100mg，0.282mmol)溶解在20ml THF中的溶液。所得物搅拌大约1分钟后，向其逐滴添加NaHMDS(1.0M于THF中，0.56ml，2.0eq.)，然后搅拌所得物30分钟。反应完成后，所得物通过添加饱和NH4Cl溶液和EA(x2)提取。合并有机层，用硫酸镁处理，过滤，然后除去溶剂。剩余物利用硅胶柱层析(Hex:EA＝4:1至2:1)提纯，得到7,9-双(4-甲氧基苄基)-2,3,4,5-四硫杂-7,9-二氮杂双环[4.2.2]癸烷-8,10-二酮(3；35mg，收率：26％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 7.21(d，4H)，6.87(d，4H)，5.37(d，2H)，4.99(s，2H)，3.84(d，2H)，3.81(s，6H)。
C.3,6-二巯基-1,4-双(4-甲氧基苄基)哌嗪-2,5-二酮(4)
在7,9-双(4-甲氧基苄基)-2,3,4,5-四硫杂-7,9-二氮杂双环[4.2.2]癸烷-8,10-二酮(3)(420mg，0.873mmol)溶解在20ml甲醇中后，所得物在冰水浴中缓慢添加到NaBH4(99mg，3.0eq.)。所述混合物搅拌30分钟并且反应完成后，除去溶剂。向所述粗化合物添加水和EA(x3)并提取所得物。合并有机层，用硫酸镁处理，过滤，然后除去溶剂。剩余物在减压下干燥，得到3,6-二巯基-1,4-双(4-甲氧基苄基)哌嗪-2,5-二酮(4)。所述化合物没有进一步提纯就用于接下来的反应。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 7.20(d，4H)，6.89(d，4H)，5.21(d，2H)，4.93(s，2H)，4.12(d，2H)，3.85(s，6H)，3.05(br s，2H)。
ESI-MS(M+Na)：441，C20H22N2O4S2的计算值为418。
D.5,7-双(4-甲氧基苄基)-2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮(5；A4)
在上面得到的二硫醇化合物(4；380mg)溶解在50ml氯仿中后，向其添加碘(221mg，0.873mmol)溶解在氯仿中的100ml溶液。所述混合物在室温下反应30分钟后，除去溶剂，剩余物利用硅胶柱层析(EA:Hex＝1:1)提纯，得到5,7-双(4-甲氧基苄基)-2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮(5)(120mg，2步收率-33％)。得到的最终产物的NMR数据显示在图39中。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 7.22(d，4H)，6.91(d，4H)，5.21(s，2H)，4.77(d，2H)，4.45(d，2H)，3.81(s，6H)。
ESI-MS(M+Na)：439，C20H20N2O4S2的计算值为416.
制备例5：5,7-二烯丙基-2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮(A5，化学式10)的制备
A.1,4-二烯丙基哌嗪-2,5-二酮(2)
在NaH(1.3g，32.8mmol)分散在25ml DMF中后，在冰水浴中向其添加无水甘氨酸(1.5g，13.1mmol)。所述混合物搅拌10分钟后，用30分钟向其缓慢添加烯丙基氯(3.2ml，3.0eq.)。所得物在室温下反应1小时，然后通过添加EA(x2)和饱和NH4Cl溶液提取所述反应溶液。合并有机层，用硫酸镁处理，过滤，然后除去溶剂。剩余物利用硅胶柱层析(DCM:EA＝1:1)提纯，得到1,4-二烯丙基哌嗪-2,5-二酮(2)(1.4g，收率56％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 5.79-5.69(m，2H)，5.30-5.22(m，4H)，4.04(d，4H)，3.96(s，4H)。
B.7,9-二烯丙基-2,3,4,5-四硫杂-7,9-二氮杂双环[4.2.2]癸烷-8,10-二酮(3)
在硫(1.32g，41.2mmol)分散在10ml无水THF后，在氩气气氛下用2分钟向其逐滴添加NaHMDS(1.0M于THF中，15.4ml，3.0eq.)。所述混合物搅拌大约1分钟后，向其逐滴添加步骤A中得到的化合物(2；1g，5.15mmol)溶解在20ml THF中的溶液。所得物搅拌大约1分钟后，向其逐滴添加NaHMDS(1.0M于THF中，10.3ml，2.0eq.)，然后搅拌所得物30分钟。反应完成后，所得物通过添加饱和NH4Cl和EA(x3)提取。合并有机层，用硫酸镁处理，过滤，然后除去溶剂。剩余物利用硅胶柱层析(Hex:EA＝9:1至4:1)提纯，得到7,9-二烯丙基-2,3,4,5-四硫杂-7,9-二氮杂双环[4.2.2]癸烷-8,10-二酮(3；530mg，收率：32％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 5.83-5.73(m，2H)，5.40-5.33(m，4H)，5.21(s，2H)，4.81(d，2H)，3.51-3.45(m，2H)。
C.3,6-二巯基-1,4-二烯丙基哌嗪-2,5-二酮(4)
在7,9-二烯丙基-2,3,4,5-四硫杂-7,9-二氮杂双环[4.2.2]癸烷-8,10-二酮(3)(530mg，1.65mmol)溶解在甲醇/THF混合溶剂中后，在冰水浴中向其缓慢添加NaBH4(187mg，3.0eq.)。所述混合物搅拌30分钟并且反应完成后，除去溶剂。向所述粗化合物添加水和EA(x3)并提取所得物。合并有机层，用硫酸镁处理，过滤，然后除去溶剂。剩余物在减压下干燥，得到3,6-二巯基-1,4-二烯丙基哌嗪-2,5-二酮(4)。所述化合物没有进一步提纯就用于接下来的反应。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 5.80-5.70(m，2H)，5.39-5.31(m，4H)，5.07(s，2H)，4.68(d，2H)，3.70-3.64(m，2H)，3.09(br s，2H)。
D.5,7-二烯丙基-2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮(5；A5)
在上面得到的二硫醇化合物(4；430mg)溶解在30ml氯仿中后，向其添加碘(419mg，1.0eq.)溶解在氯仿中的60ml溶液。所述混合物在室温下反应30分钟后，除去溶剂，剩余物利用硅胶柱层析(EA:Hex＝1:9至1:4)提纯，得到5,7-二烯丙基-2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮(5)(110mg，2步收率-26％)。得到的最终产物的NMR数据显示在图41中。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 5.86-5.81(m，2H)，5.38-5.34(m，4H)，5.30(s，2H)，4.32-4.27(m，2H)，4.00-3.95(m，2H)。
ESI-MS(M+K)：295，C10H12N2O2S2的计算值为256。
制备例6：5-(4-甲氧基苄基)-2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮(A6，化学式11)
A.1,4-双(4-甲氧基苄基)哌嗪-2,5-二酮(2)
1,4-双(4-甲氧基苄基)哌嗪-2,5-二酮(2)以与制备例3的步骤A中相同的方式得到。
B.3,6-二溴-1,4-双(4-甲氧基苄基)哌嗪-2,5-二酮(3)
在1,4-双(4-甲氧基苄基)哌嗪-2,5-二酮(2；1g，2.82mmol)、N-溴代琥珀酰亚胺(1.05g，2.1eq.)和过氧化苯甲酰(6.8mg，0.01eq.)分散在四氯化碳(250ml)中后，所述混合物在回流的同时反应2小时。反应完成和反应物质冷却到室温后，过滤出产生的固体。除去溶剂，并且所得物在减压下干燥，得到3,6-二溴-1,4-双(4-甲氧基苄基)哌嗪-2,5-二酮(3)。得到的化合物没有进一步提纯就原样用于接下来的反应。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 7.22(d，4H)，6.89(d，4H)，5.89(s，2H)，5.30(d，2H)，3.93(d，2H)，3.82(s，6H)。
C.1,4-双(4-甲氧基苄基)-3,6-二氧代哌嗪-2,5-二基-二硫代乙酸酯(4)
在3,6-二溴-1,4-双(4-甲氧基苄基)哌嗪-2,5-二酮(3；1.44g，2.82mmol)溶解在二氯甲烷(DCM；100ml)中后，在冰水浴中向其添加硫代乙酸钠(966mg，3.0eq.)。所述混合物在室温下搅拌过夜，得到的沉淀过滤，并除去溶剂。所得物利用硅胶柱层析(Hex:EA＝2:1至1.5:1)提纯，得到1,4-双(4-甲氧基苄基)-3,6-二氧代哌嗪-2,5-二基-二硫代乙酸酯(4)(600mg，2步收率-43％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 7.22(d，4H)，6.86(d，4H)，5.83(s，2H)，4.98(d，2H)，3.89(d，2H)，3.81(s，6H)，2.45(s，6H)。
D.1-(4-甲氧基苄基)-3,6-二氧代哌嗪-2,5-二基-二硫代乙酸酯(5)
在1,4-双(4-甲氧基苄基)-3,6-二氧代哌嗪-2,5-二基-二硫代乙酸酯(4；1.37g，2.73mmol)溶解在ACN/H2O(90ml/20ml)混合溶剂中后，向其添加硝酸铈铵((NH4)2Ce(NO3)6；CAN，4.5g，3.0eq)，并且所述混合物搅拌2小时。除去有机溶剂后，所得物通过添加DCM(x2)和水提取。有机溶剂用硫酸镁处理，过滤，然后除去所述溶剂。剩余物利用硅胶柱层析(Hex:EA＝2:1至1.5:1)提纯，得到1-(4-甲氧基苄基)-3,6-二氧代哌嗪-2,5-二基-二硫代乙酸酯(5；380mg，36％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 7.27(d，2H)，6.88(d，2H)，6.73(br s，1H)，5.78-5.74(m，2H)，5.12(d，1H)，3.81(s，3H)，3.78(d，1H)，2.46(s，6H)
E.3,6-二巯基-1-(4-甲氧基苄基)哌嗪-2,5-二酮(6)
在二硫代乙酸酯(5；150mg，0.392mmol)分散在乙醇(20ml)中后，向其添加乙醇盐酸溶液(通过向7ml乙醇添加1.5ml乙酰氯来制备)。所述混合物溶液在回流的同时反应2小时。反应完成后，除去溶剂，剩余物在减压下干燥，得到3,6-二巯基-1-(4-甲氧基苄基)哌嗪-2,5-二酮(6)。得到的化合物没有进一步提纯就用于接下来的反应。
F.5-(4-甲氧基苄基)-2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮(7；A6)
碘(99.5mg，1.0eq.)溶解在15ml DCM中的溶液添加到3,6-二巯基-1-(4-甲氧基苄基)哌嗪-2,5-二酮(6；117mg，0.392mmol)溶解在20ml DCM中的溶液。所述混合物在室温下反应30分钟。反应完成后，除去溶剂，剩余物利用硅胶柱层析(Hex:EA＝1:1)提纯利用，得到5-(4-甲氧基苄基)-2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮(7)(4mg)。得到的最终产物的NMR数据显示在图43中。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 7.23(d，2H)，7.15(br s，1H)，6.89(d，2H)，5.39(d，1H)，5.14(s，1H)，4.84(d，1H)，4.45(d，1H)，3.81(s，3H)。
ESI-MS(M+Na)：319，C12H12N2O3S2的计算值为296。
制备例7：5,7-二二苯甲基-2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮(A7，化学式12)的制备
5,7-二二苯甲基-2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮以与制备例1的步骤A至D中相同的方式得到。得到的最终产物的NMR数据显示在图44中。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 7.37-7.28(m，12H)，7.27(m，4H)，7.14(m，4H)，6.77(s，2H)，5.31(s，2H)。
ESI-MS(M+Na)：531，C30H24N2O2S2的计算值为508。
制备例8：5,7-二丁基-2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮(A8，化学式13)的制备
A.1,4-二丁基哌嗪-2,5-二酮(2)
在NaH(430mg，10.95mmol)分散在10ml DMF中后，在冰水浴中向其添加无水甘氨酸(500mg，4.38mmol)。所述混合物搅拌10分钟后，用30分钟向其缓慢添加1-溴丁烷(1.8g，13.14mmol，3eq.)。所得物在室温下反应过夜，并且所述反应溶液用饱和NH4Cl溶液淬灭，然后用EA(x2)提取。合并有机层，用水洗涤，用硫酸镁干燥，然后过滤。所述滤液在减压下浓缩，并且所述剩余物利用硅胶柱层析(DCM:EA＝1:1)提纯，得到1,4-二丁基哌嗪-2,5-二酮(2)(410mg，收率41％，黄色油)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm3.95(s，4H)，3.39(t，4H)，1.54(m，4H)，1.34(m，4H)，0.94(t，6H)。
B.7,9-二丁基-2,3,4,5-四硫杂-7,9-二氮杂双环[4.2.2]癸烷-8,10-二酮(3)
在硫(450mg，14.16mmol)分散在5ml无水THF后，在氩气气氛下用2分钟向其逐滴添加LiHMDS(1.0M于THF中，5.31ml，3.0eq.)。所述混合物搅拌大约1分钟后，向其逐滴添加步骤A中得到的化合物(2；400mg，1.567mmol)溶解在20ml THF中的溶液。所得物搅拌大约1分钟后，向其逐滴添加LiHMDS(1.0M于THF中，3.54ml，2.0eq.)，然后搅拌所得物30分钟。反应完成后，所得物通过添加饱和NH4Cl溶液和EA(x3)提取。合并有机层，用硫酸镁处理，过滤，然后在减压下浓缩。所得物利用硅胶柱层析(Hex:EA＝3:1)提纯，得到7,9-二丁基2,3,4,5-四硫杂-7,9-二氮杂双环[4.2.2]癸烷-8,10-二酮(3；100mg，收率：16％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 5.15(s，2H)，3.90(m，2H)，3.05(m，2H)，1.61(m，4H)，1.35(m，4H)，0.95(t，6H)。
C.3,6-二巯基-1,4-二丁基哌嗪-2,5-二酮(4)
在7,9-二丁基-2,3,4,5-四硫杂-7,9-二氮杂双环[4.2.2]癸烷-8,10-二酮(3；100mg，0.28mmol)溶解在甲醇/THF混合溶剂(1:1)中后，在冰水浴中向其缓慢添加NaBH4(32mg，0.84mmol，3.0eq.)。所述混合物搅拌30分钟并且反应完成后，除去溶剂。向所述粗化合物添加饱和NH4Cl溶液和EA(x3)并提取所得物。合并有机层，用硫酸镁干燥，过滤，然后在减压下浓缩，得到3,6-二巯基-1,4-二丁基哌嗪-2,5-二酮(4)。所述化合物没有进一步提纯就用于接下来的反应。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 5.03(d，2H)，3.80(m，2H)，3.21(m，2H)，1.63(m，4H)，1.37(m，4H)，0.96(t，6H)。
D.5,7-二丁基2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮(5；A8)
在上面得到的二硫醇粗化合物(4)溶解在30ml氯仿中后，向其添加碘(86mg，0.34mmol)溶解在氯仿中的20ml溶液。所述混合物在室温下反应30分钟，并通过在减压下浓缩除去溶剂，剩余物利用硅胶柱层析(EA:Hex＝1:3)提纯，得到5,7-二丁基2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮(5)(26mg，2步收率-32％)。得到的最终产物的NMR数据显示在图45中。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 5.27(s，2H)，3.50(m，4H)，1.66(m，4H)，1.35(m，4H)，0.95(t，6H)。
ESI-MS(M+Na)：311，C12H20N2O2S2的计算值为288。
制备例9：5,7-双(3-甲氧基丙基)-2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮(A9，化学式14)的制备
A.1,4-双(3-甲氧基丙基)哌嗪-2,5-二酮(2)
无水甘氨酸(0.5g，4.38mmol)和K2CO3(2.12g，15.33mmol)分散在10ml DMSO中后，将温度提高到80℃，并且所述混合物在所述温度下搅拌15分钟。向其逐滴缓慢添加1-氯-3-甲氧基丙烷(1.43ml，13.14mmol)。所得物在80℃反应24小时后，终止反应，并过滤固体。过滤的固体利用硅胶柱层析(DCM:MeOH＝9:1)提纯，得到1,4-双(3-甲氧基丙基)哌嗪-2,5-二酮(2)(350mg，收率31％)。残留的DMSO用水进一步洗涤。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 3.98(s，4H)，3.48(t，4H)，3.41(t，4H)，3.32(s，6H)，1.84(m，4H)。
B.3,6-二溴-1,4-双(3-甲氧基丙基)哌嗪-2,5-二酮(3)
在1,4-双(4-甲氧基丙基)哌嗪-2,5-二酮(2；200mg，0.77mmol)、N-溴代琥珀酰亚胺(276mg，1.55mmol，2.01eq.)和偶氮-双异丁腈(AI BN；6.3mg，0.04mmol，0.05eq.)分散在四氯化碳(50ml)中后，所述混合物在回流的同时反应2小时。反应完成和反应物质冷却到室温后，过滤出产生的固体。除去溶剂，并且所得物在减压下干燥，得到3,6-二溴-1,4-双(3-甲氧基丙基)哌嗪-2,5-二酮(3)。得到的化合物没有进一步提纯就原样用于接下来的反应。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 6.21(s，2H)，3.92(m，2H)，3.41(m，4H)，3.32(s，6H)，3.25(m，2H)，1.87(m，4H)。
C.1,4-双(3-甲氧基丙基)-3,6-二氧代哌嗪-2,5-二基-二硫代乙酸酯(4)
在3,6-二溴-1,4-双(4-甲氧基丙基)哌嗪-2,5-二酮(3；400mg，0.96mmol)溶解在30ml DCM中后，在冰水浴中向其添加硫代乙酸钠(329mg，2.888mmol，3.0eq.)。所述混合物在室温下搅拌过夜后，过滤所产生的固体，然后从溶液除去溶剂。所得物利用硅胶柱层析(EA:Hex＝1:1至3:1)提纯，得到1,4-双(4-甲氧基丙基)-3,6-二氧代哌嗪-2,5-二基-二硫代乙酸酯(4)(65mg，2步收率-6.4％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 5.88(s，2H)，3.95(m，2H)，3.43(m，4H)，3.37(s，6H)，2.98(m，2H)，2.43(s，6H)，1.90(m，4H)。
D.3,6-二巯基-1,4-双(3-甲氧基丙基)哌嗪-2,5-二酮(5)
在二硫代乙酸酯(4；40mg，0.1mmol)分散在乙醇中后，向其逐滴添加乙醇盐酸溶液(通过向3.5ml乙醇添加0.75ml乙酰氯来制备)，所述混合物溶液在回流的同时反应2小时。反应完成和反应物质冷却到室温后，除去有机溶剂并且干燥剩余物，得到3,6-二巯基-1,4-双(甲氧基丙基)哌嗪-2,5-二酮(5)。得到的化合物没有进一步提纯就用于接下来的反应。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 5.08(d，2H)，3.89(m，2H)，3.41(m，4H)，3.35(s，6H)，3.23(m，2H)，3.18(d，2H)，1.93(m，4H)。
E.5,7-双(3-甲氧基丙基)-2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮(6；A9)
碘(20.3mg，0.08mmol，1.0eq.)溶解在15ml DCM中的溶液添加到3,6-二巯基-1,4-双(甲氧基丙基)哌嗪-2,5-二酮(5；25mg，0.08mmol)溶解在10ml氯仿中的溶液，并且所述混合物在室温下反应1小时。反应完成后，除去溶剂，剩余物利用硅胶柱层析(Hex:EA＝1:1至1:2)提纯，得到5,7-双(甲氧基丙基)-2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮(6)(9mg，收率36％)。得到的最终产物的NMR数据显示在图46中。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 5.35(s，2H)，3.69(m，2H)，3.57-39(m，6H)，3.36(s，6H)，1.93(m，4H)。
ESI-MS(M+Na)：343，C12H20N2O4S2的计算值为320。
<包含还原的二硫醇基团的哌嗪二酮衍生物的合成>
制备例10：3,6-二巯基-1,4-二甲基哌嗪-2,5-二酮(A2R)
3,6-二巯基-1,4-二甲基哌嗪-2,5-二酮以与制备例2的步骤A至C中相同的方式得到。得到的最终产物的NMR数据显示在图37中。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 5.00(s，2H)，3.09(s，6H)。
ESI-MS(M-1)：205，C6H10N2O2S2的计算值为206。
制备例11：3,6-二巯基-1,4-双(4-甲氧基苄基)哌嗪-2,5-二酮(A4R)
3,6-二巯基-1,4-双(4-甲氧基苄基)哌嗪-2,5-二酮以与制备例4的步骤A至C中相同的方式得到。得到的最终产物的NMR数据显示在图40中。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 7.20(d，4H)，6.89(d，4H)，5.21(d，2H)，4.93(s，2H)，4.12(d，2H)，3.85(s，6H)，3.05(br s，2H)。
ESI-MS(M+Na)：441，C20H22N2O4S2的计算值为418。
制备例12：3,6-二巯基-1,4-二烯丙基哌嗪-2,5-二酮(A5R)
3,6-二巯基-1,4-二烯丙基哌嗪-2,5-二酮以与制备例5的步骤A至C中相同的方式得到。得到的最终产物的NMR数据显示在图42中。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δppm 5.80-5.70(m，2H)，5.39-5.31(m，4H)，5.07(s，2H)，4.68(d，2H)，3.70-3.64(m，2H)，3.09(br s，2H)。
实施例1：材料
抗-PrxI和PrxII抗体购自AbFrontier(首尔，韩国)。本发明中使用的PrxII-特异性siRNA的序列如下：5'-CGCUUGUCUGAGGAUUACGUU-3'(人PrxII siRNA-1，Prx2-1；序列号1)，5'-AGGAAUAUUUCUCCAAACAUU-3'(人PrxII siRNA-2，Prx2-2；序列号2)，5'-ACTCAACTGCCAAGTGATTUU-3'(人PrxI siRNA，Prx1；序列号3)和5'-AAAUCAAGCUUUCGGACUAUU-3'(小鼠PrxII siRNA-1，mPrx2-1；序列号4)。所述siRNA寡核苷酸双链体是从Dharmacon合成。合成萤火虫荧光素酶siRNA并用作对照siRNA。所述siRNA双链体按照制造商的协议利用脂质体(Li pofectamine)RNAi MAXTM(Invitrogen)转染。
大鼠PrxII的四种siRNA双链体的SMART库(5'-GCAACGCGCACAUCGGAAAUU-3'(序列号5)，5'-GAUCACAGUCAACGACCUAUU-3'(序列号6)，5'-AGAAUUACGGCGUGUUGAAUU-3'(序列号7)和5'-ACGCUGAGGACUUCCGAAAUU-3'(序列号8)；Dharmacon目录号D-089973)用于大鼠颈动脉球囊损伤试验。合成萤火虫荧光素酶siRNA并用作对照siRNA。
胶霉毒素、毛壳素和毛壳菌素购自Sigma-Aldrich。双(甲硫基)胶霉毒素购自Santa Cruz Biotechnology。SU-5416购自Calbiochem。磷酸-PLCγ1(pY783)、PLCγ1、和磷酸-VEGFR2(pY1175)抗体购自CellSignaling Technology。抗-PDGFR-β(M-20)和KDR/Flk-1(VEGFR2)抗体购自Santa Cruz Biotechnology。抗-磷酸酪氨酸(4G10)和PDGF-BB购自Upstate。VEGF-A(人VEGF165)购自R&D systems。小鼠抗大鼠CD31抗体购自BD Bioscience。Alexa Fluor 488-结合的驴抗兔和Alexa Fluor 568-结合的驴抗小鼠二次抗体购自Invitrogen。生物素化的山羊抗兔IgG、抗生物素蛋白-HRP和DAB底物购自VectorLaboratories。PrxI、PrxII、Prx-SO2/3和磷酸-PDGFRβ(pY857)兔多克隆抗体如前述制备[M.H.Choi等，2005，Nature，435：347]。
实施例2：细胞培养
人主动脉内皮细胞(HAEC)和人主动脉平滑肌细胞(HASMC)购自Clonetics-BioWhittaker(Venders，Belgium)。所述细胞接种在0.1％明胶涂覆板上并在包含5％二氧化碳的潮湿培养箱中在37℃下分别在包含10％胎牛血清(FBS)和完全补充成分的内皮基础培养基(EBMTM-2)和平滑肌细胞基础培养基(SmBMTM)(用于HAEC的目录号cc-4176和用于HASMC的目录号cc-4149；Cloneti cs-BioWhittaker)中生长。在本发明中使用传代5至7次的细胞。
黑素瘤细胞系SK-MEL-5、A375和B16F10细胞利用包含10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良伊格尔培养基(Eagle's Medium)(DMEM)在CO2培养箱中在37℃下生长。SK-MEL-28和G361细胞在包含10％FBS的RPMI 1640培养基中生长。
人表皮黑色素细胞在培养基254(Cascade BiologicsTM，包含人黑色素细胞生长补充成分)中生长。本发明中使用的黑素瘤细胞系和黑色素细胞购自美国模式菌种保藏中心(American Type Culture Collection)。
实施例3：过氧化物酶活性检测
对本发明的桥二硫双氧代哌嗪衍生物(以下称为ETP化合物)的过氧化物酶活性检测按照已知的方法[韩国专利No.10-0953326]实行。分光光度法检测的标准过氧化物酶反应使用200μl反应混合物进行，所述反应混合物包括含有1mM EDTA的包含250μM NADPH的50mM Hepes-NaOH缓冲液(pH 7.0)、3μM酵母硫氧还蛋白(Trx)、1.5μM酵母硫氧还蛋白还原酶(TR)、25μM ETP化合物和1.2ml过氧化氢。为了与谷胱甘肽(GSH)-依赖性过氧化物酶反应比较，添加GSH(1mM)和酵母谷胱甘肽还原酶(GSH还原酶；GR)(1单位)代替酵母Trx和TR。每个反应通过添加过氧化氢引发，并使用Agilent UV8453分光光度计(Hewlett Packard，美国)根据340nm处吸光度降低在30℃下监测NADPH氧化12分钟。利用该曲线的直线部分计算初始反应速率并以每分钟氧化的NADPH量表示。
实施例4：体外血管细胞功能检测
为了细胞增殖检测，将HAECs以4000细胞/孔的浓度在100μl的最终容积中分配在包含siRNA转染试剂混合物的96-孔板上。在siRNA转染24小时后，所述细胞血清饥饿18小时，然后放入补充有VEGF-A165(25ng/ml，目录号293-VE，R&D systems)的EBM-2基础培养基中再24小时。细胞增殖的程度利用WST-1细胞增殖检测试剂盒(Roche Diagnostics，美国)测量，并且细胞数量表示为在450nm处的吸光度，其是在减去600nm处的浊度后3个孔的平均值。
细胞迁移检测在24-孔Transwell培养室(Costar；8-μm孔度)中实行。所述滤器的底部涂有明胶B(1mg/ml)并风干1小时。HAECs(6x103)添加到包含siRNA-转染复合物的上部室。24小时后，将siRNA转染的HAECs血清饥饿过夜。在包含0.5％牛血清清蛋白(BSA)的基础培养基中制备VEGF-A的溶液(25ng/ml)，并将其添加到下部室。上部室孔每个填充了包含0.5％BSA的基础培养基。所述Transwell室在37℃/5％二氧化碳的条件下温育8小时。温育后，除去在所述滤器顶部的未迁移细胞，固定迁移到所述滤器底部上的细胞并用0.6％苏木精和0.5％伊红染色。染色的细胞拍照和计数。迁移细胞的数量从3个孔平均。
实施例5：免疫印迹分析
所述细胞用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液清洗，然后在提取缓冲液中溶解，所述提取缓冲液含有20mM Hepes(pH 7.0)、1％Triton X-100、150mM NaCl、10％甘油、1mMEDTA、2mM EGTA、1mM DTT、5mM Na3VO4、5mM NaF、1mM AEBSF、抑肽酶(5μg/ml)、和亮抑酶肽(5μg/ml)。以12,000xg离心后，提纯的细胞提取物用于免疫印迹。为了调节加样，所述膜通过将它们在67mM Tris(pH 6.7)、2％SDS和100mM 2-巯基乙醇溶液中60？C振荡30分钟显示条带，并用适当的pan抗体再探测。
实施例6：免疫细胞化学
所述细胞在玻璃盖玻片上生长，并用预先温热的4％多聚甲醛溶液固定15分钟。所述固定细胞用PBS清洗两次，并用0.2％Triton X-100在室温下处理30分钟以便具有细胞渗透性。然后，所述细胞利用包含2％BSA的PBS溶液封闭1小时，并与稀释在在封闭缓冲液中的一级抗体一起在4℃温育过夜：抗-磷酸酪氨酸(克隆4G10，1:100)，抗-Prx1(1:300)，抗-Prx2(1:300)，抗-β-联蛋白(1:200)和抗-E钙粘着蛋白(1:200)。所述细胞用封闭缓冲液清洗3次，并与结合了Alexa Fluor 568或Alexa Fluor488的二级抗体一起温育30分钟。染色的盖玻片用封闭缓冲液洗涤三次，并安装。使用LSM 510META共焦激光扫描显微镜(Zeiss)记录荧光图像。
实施例7：测量细胞内过氧化氢
细胞内H2O2水平利用氧化敏感型荧光染料5,6-氯甲基-2',7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(CM-DCFH-DA，Invitrogen)测量。人表皮黑色素细胞、SK-MEL-5、SK-MEL-28、A375和G361细胞(3x105)在35mm培养皿中生长并用逆转录病毒感染24小时。然后，所述细胞血清饥饿18小时，并在无酚红培养基中用20％FBS刺激10分钟。如上所述刺激后，所述细胞迅速用Krebs-Ringer溶液清洗，并与5μM CM-DCFH-DA一起温育5分钟。使用倒置Axiovert 200荧光显微镜(Zeiss)收集2',7'-二氯二氢荧光素(DCF)荧光10秒。利用ImageQuantTM软件(GEHealthcare)，通过在减去每个图像的本底荧光后将60到80个细胞的荧光强度平均，计算相对DCF荧光。在定量中排除脱附的楔形细胞。
实施例8：逆转录病毒制造
利用双顺反pLXIN载体和Retro-X Q载体系统(Clontech)来制造编码人PrxII的逆转录病毒。首先，将人PrxII野生型(WT)编码序列通过PCR克隆法插入到pLXIN。病毒通过将所生成的载体稳定转染到稳定的NI H3T3-基双嗜性包装细胞系RetroPackTM PT67而制造。所述病毒在SK-MEL细胞中大多用于PrxII过表达。测定病毒的浓度(病毒滴度)(1x 106病毒粒子/ml)，并将所述病毒分开并在-70℃储存。为了逆转录病毒感染，将分开的病毒在温水浴中解冻，并与10μg/ml聚凝胺混合。
实施例9：增殖和迁移检测
细胞增殖的程度按照制造商的协议，利用WST-1细胞增殖检测试剂盒(RocheDiagnostics，美国)测量。细胞数量表示为在450nm处的吸光度值，其是在减去600nm处的浊度后3个孔的平均值。趋化性迁移检测在24-孔Transwell培养室(Costar；有8-μm孔径的聚碳酸酯膜插入板)中实行。插入板的底部涂有明胶B(1mg/ml)并风干1小时。逆转录病毒或转染复合体处理到黑素瘤细胞(6x103)。24小时后，将感染或转染的黑素瘤细胞血清饥饿18小时。向包含含有0.5％BSA的基础培养基的底部室添加20％FBS溶液。上部室孔每个填充了包含0.5％BSA的基础培养基。所述Transwell室在37℃/5％CO2培养箱中温育12小时。温育后，除去在所述滤器顶部的未迁移细胞。固定迁移到滤器底部上的细胞并用0.6％苏木精和0.5％伊红染色。染色的细胞拍照和计数。迁移细胞的数量从3个孔平均。
实施例10：创伤愈合检测
通过用吸量管尖端划伤，在细胞单层上产生创伤。所述创伤用PBS洗涤以除去细胞碎片，并向其供应新鲜的培养基。之后12小时，让所述细胞增殖并向创伤迁移。在显微镜下观察到细胞向创伤区迁移。创伤的宽度利用Image J软件测量。
实施例11：在小鼠中B16F10黑素瘤细胞向肺的转移
在用PrxII siRNA临时转染B16F10细胞24小时和胰蛋白酶化后，所述细胞重悬浮在Hank平衡盐溶液(HBSS)中。所述细胞悬液通过静脉注射注入到C57/BL6小鼠(1x106细胞/小鼠)。10天后处死小鼠，在用包含3.7％甲醛的肝素化盐水溶液经心脏灌注-固定后取下肺脏。取下的肺被石蜡包埋并使用轮转切片机(Leica RM2255)切片。两个系列的组织切片(厚度4μm)用苏木精和伊红染色。计算从肺表面和HE-染色的组织切片转移的黑素瘤肿瘤结节。为了验证胶霉毒素(GT)、毛壳素和毛壳菌素的效应，将所述黑素瘤细胞静脉内注射到C57/BL6小鼠，然后将胶霉毒素(300mg/kg)在10天内腹膜内注射5次。
实施例12：NADPH氧化酶活性检测
利用增强发光系统(Diogenes，National Diagnostics)测量全细胞过氧化物产生。为了所述检测，将所述血清饥饿细胞用100μl Diogene试剂在37℃预温育5分钟。在由所指示的生长因子刺激后，用TD-20/20照度计(Turner Biosystems)检测每秒的化学发光，为时10分钟。
实施例13：大鼠颈动脉的球囊损伤模型
动物试验依从梨花女子大学(Ewha Womans Uni versity)机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)的准则实行。利用透入型2FFogarty球囊导管在左颈总动脉中如下产生球囊损伤：在十周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠通过异氟烷气体(N2O:O2/70％:30％)吸入麻醉后，暴露左颈外动脉，并将它的分支电凝固。通过所述颈外动脉的横向动脉切开术，将导管推进1cm，并沿着颈总动脉通过三次，达到内皮剥脱。取出导管后，密封受冲击区域并打开夹住的颈总动脉恢复血流。除非另有说明，将大鼠在笼中恢复10天，并进行组织和免疫分析。
实施例14：组织分析
麻醉大鼠，在用含有3.7％甲醛的肝素化盐水溶液经心脏灌注-固定后切除颈总动脉。所述血管被石蜡包埋并使用轮转切片机(Lei caRM2255)切片。从颈总动脉的中间区域得到两个系列的组织切片(厚度4μm)，并用苏木精和伊红(HE)染色。利用NIH Image v1.62测量管腔、内弹性膜和外弹性膜面积。所述内膜和中膜面积通过从内弹性面积减去管腔面积和从外弹性面积减去内弹性面积来确定。将来自每个大鼠的所述两个系列切片的值平均以供分析。
实施例15：在颈动脉中局部投送siRNA或ETP化合物或衍生物
为了体内注射siRNA，将针对大鼠PrxII特异性的siRNA混合物(200nM)按照制造商(Ambion)的说明书与siPORTTM NeoFXTM试剂预混合。在球囊损伤后即刻，所述siRNA注射混合物(200μL)通过用Opti-MEM短暂洗涤后的导管注射。温育15分钟后，恢复血流。Si GLO-红(Dharmacon)是荧光染料结合的对照siRNA，用于优化体内注射效率。类似地，所述ETP化合物(200nM，在DMSO中)通过导管注射并温育30分钟。
实施例16：免疫组织化学和免疫荧光染色
所述过氧化的2-Cys Prxs的免疫组织化学利用抗-Prx-SO2/3抗体(1:1000稀释)在所述石蜡切片上实行。简单而言，所述切片在二甲苯中脱蜡并在乙醇中再水化，随后通过在柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中沸腾，进行抗原修复。然后，所述切片在4℃下与一级抗体一起温育48小时。用磷酸盐缓冲盐水溶液洗涤三次后，所述切片与过氧化物酶结合的二级抗体一起温育并用3',3'-二氨基联苯胺(DAB)底物溶液染色。对于负染色，所述Prx-SO2/3抗体用相应的抗原性肽(DFTFVC(SO2/3)PTEI)封闭。对于间接免疫荧光染色，所述石蜡切片在PBST(0.3％Triton X-100的PBS溶液)中用5％正常兔血清(Vector Laboratories)在室温下封闭1小时。所述切片然后与针对大鼠平滑肌α-肌动蛋白的抗原(1:300稀释)和针对大鼠CD31的抗原(PECAM-1，1:200稀释)一起在4℃温育过夜。细胞核用DAPI标记。数次PBST洗涤后，所述样品与Alexa Fluor 568-结合的驴抗小鼠抗体和Alexa Fluor 488-结合的驴抗兔IgG抗体一起在室温下温育2小时。利用配备氩和氦-氖激光器的LSM 510Meta共焦显微镜，在100X的屏幕放大倍数下，每个组织切片记录三个随机视野的荧光图像。
实施例17：TUNEL检测
所述石蜡切片在含有0.1％Triton X-100的PBS中温育10分钟。然后，利用原位细胞死亡检测试剂盒和荧光素(Roche Diagnostics Corp.)，按照制造商的说明书在37℃下进行TUNEL反应60分钟。细胞核用DAPI复染色。
实施例18：血管渗透性试验
小鼠静脉内注射100μL 5％伊文思蓝30分钟，然后用PBS灌注5分钟。颈总动脉从未受伤害的对侧和损伤同侧的颈总动脉上取下。所得物解剖，纵向打开，并在放大倍数20X的相差显微镜上检查。为了定量，流入所述血管的伊文思蓝通过放置在55℃的甲酰胺中过夜并以12，000rpm离心10分钟进行提取。收集上清液并在620nm下测量吸光度。在740nm处测量所述伊文思蓝染料的背景值并从颈动脉的值中减去。为了VEGFR2抑制，在球囊损伤之前和之后腹膜内注射SU5416(20mg/kg)3次(-1、1和3天)。对照注射由包含介质(5％DMSO)的200μL PBS制成。
实施例19：扫描电子显微镜(SEM)
从动物取下颈动脉血管，纵向打开，用2.5％戊二醛固定24小时。所述组织用PBS清洗，用1％四氧化锇温育，然后通过一系列乙醇稀释度脱水。所述组织干燥到临界点并用胶态银膏安装在扫描电子显微镜托(stubs)上。溅射涂布金/钯后，用扫描电子显微镜(Hitachi，日本)检查所述样品。
试验例1：对过氧化氢还原的催化活性
本发明的桥二硫双氧代哌嗪化合物或它的衍生物的化学特征是存在于桥二硫双氧代哌嗪环部分中的分子内二硫桥键。细胞过氧化物酶利用来源于NADPH的电子借助两种电子传递途径、即Trx/TR或GSH/GR来还原过氧化氢，因此，对过氧化氢还原活性的分光光度法检测在各体系存在下实行，结果显示在图1至5中。
因此，如图1至5中所示，共有所述桥二硫双氧代哌嗪结构的A1至A9、胶霉毒素、毛壳素和毛壳菌素，在Trx/TR系统存在下全部表现出优异的过氧化氢还原活性。特别有趣的是，在Trx/TR系统存在下毛壳素和毛壳菌素的活性分别是8.18±0.24和8.62±0.51nmol/min，因此比GT的活性(3.72±0.53nmol/min)高大约两倍(图5)。虽然毛壳素和毛壳菌素在GSH/GR系统存在下分别表现出1.51±0.39和2.53±0.79nmol/min的活性，但与Trx/TR系统存在下的活性相比，所述程度是微不足道的。因此，如图5d至5f中所示，所述ETP化合物的过氧化氢还原活性需要Trx/TR/NADPH系统的全部三种组分，并且活性与浓度成正比。另外，具有甲基化硫醇基的双(甲硫基)胶霉毒素用作对照组。结果，对具有甲基化硫醇基的双(甲硫基)胶霉毒素没有观察到过氧化物酶活性(图5g)。另外看出，具有甲基化硫醇基的双(甲硫基)胶霉毒素因为不能在双(甲硫基)胶霉毒素中通过氧化还原反应形成二硫桥键，所以没有过氧化物酶活性。这表明在所述化合物内的环中二硫醇的氧化-还原循环是所述过氧化物酶活性必不可少的。此外，结果证明，本发明的桥二硫双氧代哌嗪化合物或它的衍生物的2-Cys-Prx类似的过氧化物酶活性是Trx/TR系统依赖性的。
另外，所述结果利用A2、A4和A5的还原类型(A2R，A4R和A5R)进行比较(图3和4)。这些还原的化合物对相应的氧化类型(分别是A2、A4和A5)表现出相似的过氧化氢还原活性。此外，比较组包括通过还原分子内二硫桥键而包含两个硫醇基的化合物，并且因为这些化合物与细胞内2-Cys-Prx的活性类型具有相似的形式，这些化合物可以直接用于过氧化氢还原，无需通过Trx/TR系统对还原类型的转化过程，因此证明了所述还原类型与相应的氧化类型相比，对过氧化氢还原具有较高的初始反应速率。
同时，A2R、A4R和A5R没有实际上显示出PDGF-和VEGF-依赖性细胞增殖和迁移调节活性，如后面描述的试验中所示，并且可以推断，这些化合物没有PDGF-和VEGF-依赖性的细胞增殖和迁移调节活性，因为在哌嗪环中具有二硫醇的还原形式衍生物不能被引入到细胞中。这表明在所述ETP衍生物内哌嗪环中的分子内二硫桥键和二硫醇之间的氧化-还原循环对过氧化物酶活性是必不可少的。另外，根据如上所述的结果，证明了本发明的桥二硫双氧代哌嗪化合物或它的衍生物的2-Cys-Prx类似的过氧化物酶活性是Trx/TR系统依赖性的。
试验例2：体外和体内细胞毒性试验
已知大多数ETP化合物对动物细胞是细胞毒性的。因此，本发明的发明人确定了所述桥二硫双氧代哌嗪化合物或它的衍生物在血管细胞中的安全浓度范围。为此，人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)和人主动脉内皮细胞(HAECs)用各种浓度的胶霉毒素或毛壳素、和作为本发明的ETP衍生物的A1至A9预处理2小时，并且在新鲜培养基中培养24小时，然后进行细胞存活力检测(图6至10)。
结果，HASMCs和HAECs在缺血清条件下相对于胶霉毒素和A1至A9的存活力分别在200nM和50nM或更低的浓度下得到保证。发现毛壳素是相对低毒性的。所述两种细胞在高浓度下的低存活力被认为是由于各种副作用，包括NF-κB抑制。因此，为了如下所述的试验，本发明的发明人使用在100nM和50nM浓度范围下的ETP化合物，这是用于HASMCs和HAECs体外试验的安全剂量，而对于趋势低的化合物，浓度增加直到200nM和100nM的范围。
试验例3：在生长因子诱导的信号传导和细胞增殖/迁移中由胶霉毒素和桥二硫双氧代哌嗪衍生物代替PrxII功能的效应
(1)胶霉毒素代替PrxII功能的效应
首先，测试了在PrxII击倒的HASMCs和HAECs中GT消除细胞内过氧化氢的能力。利用氧化敏感型荧光染料(2',7'-二氢氯代荧光素二乙酸酯，H2DCF-DA)监测细胞过氧化氢生产。在缺血清对照HASMCs中通过PDGF处理，细胞内过氧化氢的水平增加了大约两倍，然后通过结合PrxII击倒而显著增加(图11a)。然而，所述GT处理以浓度依赖性方式完全抵消了细胞内过氧化氢水平的增加(图11a)。另外，HAECs中通过PrxII击倒而显著提高的细胞内过氧化氢基础水平，也通过所述GT处理完全消除(图11b)。
另外，检查了GT对PDGFRβ-和VEGFR2-介导的信号传导途径的调节效应。在HASMCs中的GT处理完全不同于通过PrxII击倒而提高的PDGF诱导的酪氨酸磷酸化(图12a)。特别是，PDGFRβ和PLCγ1活化的水平减弱到被刺激的对照组细胞的水平。相反地，在HAECs中的GT处理恢复了已经通过PrxII击倒而减弱的VEGFR2和ERK的VEGF依赖性活化(图12b)。进一步验证了GT在血管细胞功能中的作用。浓度逐渐增加的GT处理逐渐降低了已经通过PrxII击倒而提高的HASMCs响应PDGF的增殖和趋化性迁移(图13a和13b)。相反，对HAECs的相同处理导致已经通过PrxII击倒而削弱的VEGF诱导型增殖和趋化性迁移的增强(图13c和13d)。
(2)A1至A9代替PrxII功能的效应
检查了ETP衍生物A1至A9对PDGFRβ-和VEGFR2-介导的信号传导途径的调节效应。证明了ETP衍生物对血管细胞、也就是人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)和人主动脉内皮细胞(HAECs)的功能的效应。如上所述，各EPT衍生物分别以100nM和50nM或更低的浓度范围使用，该浓度范围没有表现出对HASMCs和HAECs的细胞毒性，而对活性不明显的几种化合物(A4、A7和A9)，所述浓度增加直到最高200nM和100nM。
结果，浓度逐渐增加的ETP衍生物处理逐渐降低了已经通过PrxII击倒而提高的HASMCs响应PDGF的增殖和趋化性迁移(图14A至21A)。相反，对HAECs的相同处理导致已经通过PrxII击倒而削弱的VEGF诱导型增殖和趋化性迁移的增强(图14B和21B)。
此外，利用有暴露的硫醇基的A2R、A4R和A5R来比较所述结果。结果，在HASMCs和HAECs二者中没有观察到显著的变化(图16和18)。
值得注意的是，纳摩尔浓度的ETP衍生物A1至A9，不表现出细胞毒性，却足以调节HASMCs和HAECs中的RTK信号传导和细胞功能。特别是，证明了具有比较小的取代基或少数取代基的A1至A3、A5和A8表现出优异的活性，而A6和A9表现出中等活性。总的说来，上面描述的试验结果表明低浓度的所述ETP衍生物可以恢复由于PrxII缺陷所致的损伤的PDGF-和VEGF-诱导的信号传导。
试验例4：ETP化合物对NADPH氧化酶(NOX)活性的效应
当分别用PDGF-B和VEGF-A刺激HASMCs和HAECs时，NOX活性增加了大约两倍。然而，用GT和毛壳菌素处理不抑制NOX活性，直到所述化合物的浓度增加直到500nM，这超过了毒性限(图22)。因此看出，这些ETP化合物起到过氧化氢还原酶的作用，能够在这两种血管细胞中代替PrxII，但是所述机制不抑制过氧化氢制造者NOX。
试验例5：通过体内试验鉴定球囊损伤的颈动脉的2-Cys-Prx、特别是PrxII过氧化
利用能够监测VSMCs增生和血管再内皮细胞化的血管损伤(球囊引起的大鼠颈动脉损伤)试验动物模型，体内鉴定所述ETP化合物的效应。当通过插入球囊导管损伤所述动脉时，内皮剥脱。因此，血小板和巨噬细胞在损伤病变中聚积以修复损伤的血管。这些细胞产生包括过氧化氢的活性氧自由基，因此，推测邻近的血管细胞中的2-CysPrx酶因半胱氨酸残基活性位点过氧化为亚磺酸/磺酸(Cys-SO2/3)而失活。为了对付这种可能性，利用抗-Prx-SO2/3抗体检查所述球囊损伤的大鼠颈动脉中2-Cys Prxs的过氧化。所述球囊损伤随着时间引起颈动脉的内膜增生(图23a)，并且免疫组织化学分析显示，2-Cys Prxs的过氧化在损伤后第5和第7天在内层和血管内膜层二者中是严重的(图23b)。通过在过氧化氢处理的正常血管中用相应的抗原性肽封闭，来证明免疫反应性信号传导特异性。免疫印迹分析证实了主要2-Cys Prxs的过氧化由球囊损伤引起。当通过用抗-PrxI抗体进行免疫沉淀来分离PrxI和PrxII时，发现与PrxI和PrxIII的过氧化相比，主要是PrxII的过氧化随着内膜增生而提高(图23c)。这与过氧化氢处理的对照血管形成对照，其中PrxI过氧化是明显的。PrxII在PDGF依赖性VSMCs生长中的负调节作用证明了通过过氧化失活PrxII促成了在损伤血管壁中SMC增生。的确，在颈动脉壁中siRNA介导的PrxII表达击倒加重了球囊损伤引起的内膜增生(图24)。
接下来，本发明的发明人评价了GT是否协调了发生PrxII过氧化的损伤血管的适当修复。当在球囊损伤后将各种浓度的GT溶液通过导管局部施用于颈动脉血管腔时，在不引起细胞死亡的纳摩尔范围内以浓度依赖性方式显著抑制内膜增生，这通过TUNEL染色鉴定(图25a)。这种结果表明GT抑制SMC增生。
另外，作为对照实验，具有甲基化二硫醇基团的双(甲硫基)胶霉毒素和TR抑制剂(DNCB 5μM，金诺芬0.5μM)单独或与GT联合处理，并观察组织的HE染色图像。
结果显示，双(甲硫基)胶霉毒素不抑制增厚的血管内膜层，而TR抑制剂全部消除了GT的内膜增生抑制效应(图26)。因此看出，具有甲基化硫醇基的双(甲硫基)胶霉毒素在修复血管损伤中无效，而GT通过TR调节在修复血管损伤中是有效的。
随后，进行了鉴定GT是否实际促进损伤的血管壁中内皮修复的试验。内皮标志物CD31的免疫荧光染色清楚揭示，如同在正常颈动脉中，在GT处理的损伤血管中形成与管腔接触的内皮单层，而在对照的损伤颈动脉中没有形成所述单层(图25b)。另外，与α-平滑肌肌动蛋白(SMA)的共同免疫染色进一步证明了在血管内膜SMC层上面覆盖了内皮细胞层。
另外，利用过氧化2-Cys-Prx(Prx-SO2/3)抗体进行免疫组织化学染色，以便鉴定GT对2-Cys-过氧化物氧还蛋白(2-Cys-Prx)过氧化的效应，并且显示5个不同颈动脉样品当中的代表性图像，作为DAB染色图像。结果，如图27中所示，对照组和GT处理组之间的样品数据没有显著差异。这种结果确认GT没有抑制2-Cys-Prx的氧化，而是代替过氧化后2-Cys-Prx在细胞中的功能。
另外鉴定了本发明的ETP衍生物A1至A3、A5、A6和A8是否可以抑制主动脉平滑肌细胞的增殖。
具体地说，鉴定了所述衍生物是否协调发生PrxII过氧化的损伤血管的适当修复。在球囊损伤后，包含所述衍生物的溶液以200nM的浓度通过导管局部施用于颈动脉血管腔，观察组织的HE染色图像。
结果，如图28中所示，显示了本发明的ETP衍生物全部有效抑制平滑肌细胞增殖。
随后，进行了鉴定衍生物A1至A3、A5、A6和A8是否真正促进损伤血管壁中内皮修复的试验。内皮标志物CD31的免疫荧光染色证实，用A1至A3、A5、A6或A8处理的损伤血管中形成了与管腔接触的内皮单层，在对照损伤颈动脉中没有形成所述单层(图29)。另外，与α-平滑肌肌动蛋白(SMA)的共同免疫染色进一步证明了在血管内膜SMC层上面覆盖了内皮细胞层。
试验例6:血管渗透性试验
通过伊文思蓝流入来检查修复的内皮的渗透性。因球囊损伤的内皮剥脱导致渗透性控制活性的完全损失，而未损伤的对侧颈动脉显示正常内皮的完好屏障功能(图30a)。与对照组(DMSO)处理的损伤颈动脉相比，GT处理球囊损伤的颈动脉导致伊文思蓝流入减少大约三分之二。更明显地，GT引起的内皮功能恢复被VEGFR2激酶特异性抑制剂阻断，表明了GT保护VEGFR2功能免于因PrxII过氧化引起的氧化失活的效应。
损伤颈动脉血管的管腔表面上内皮间连接通过扫描电子显微术检查。GT处理的大鼠的颈动脉中的内皮细胞伸展并以紧密连接形成均一的层，而对照处理的大鼠的颈动脉中的内皮细胞则收缩和斑块化(图30b)。所述结果集体表明通过所述GT处理修复的内皮在功能和结构上完好，因此足以控制血管渗透性。
试验例7：毛壳素、毛壳菌素和其他抗氧化化合物的效应
本发明的发明人测试了其他ETP化合物例如毛壳素和毛壳菌素是否也引起损伤血管的适当修复。首先评价毛壳素在血管细胞功能的功效。浓度渐增的毛壳素处理显著降低了HASMCs响应PDGF的增殖和趋化性迁移，所述增殖和迁移已经通过PrxII击倒被提高(图31a和31b)。相反，相同的处理导致VEGF诱导的HAECs增殖和趋化性迁移明显提高，所述增殖和迁移已经通过PrxII击倒被削弱(图31c和31d)。正如在试验例2中提到的，毛壳素的细胞毒性低于GT，因此，毛壳素调节VSMCs和VECs功能的功效即使在高纳摩尔浓度下也是重要的。与这种体外活性并行，所述毛壳素处理显著阻断了损伤动脉壁中的内膜增生并伴随促进再内皮细胞化(图32a和32c)，表明除了GT之外，毛壳素也起到VSMCs和VECs的相互调节剂的功能。毛壳菌素在修复损伤动脉壁中也表现出类似的效应(图32b和32d)。总之，证明了所述ETP系列化合物起到修复血管损伤的理想治疗剂的作用。
最后，代表性的ETP化合物——GT对血管细胞的效应与已知作为抗氧化化合物的其他化合物例如N-乙酰半胱氨酸或丁基羟基苯甲醚的效应相比较，结果显示在图33中。通过注入siRNA击倒PrxII的HAECs用各化合物以所述图中指示的浓度预处理两小时，然后用VEGF处理10分钟，实行免疫印迹。结果显示，即使当使用浓度比GT浓度高103至104-倍时，N-乙酰半胱氨酸或丁基羟基苯甲醚不引起VEGFR2和下游ERK的活化。这些比较试验引导本发明的发明人得出结论，所述ETP化合物独特的细胞毒功能显然应归于PrxII类似的活性，并且还应归于所述二硫酮哌嗪环的特殊化学性质。
试验例8：鉴定GT对PrxII缺陷的血管细胞和小鼠的效应
从正常小鼠和PrxII-/-小鼠分离主动脉血管平滑肌(A)和内皮细胞(B)，并培养，然后在用GT处理或没有处理后各自用PDGF-BB和VEGF-A处理10分钟。利用各蛋白的磷酸化特异性结合抗体分析PDGFRβPLCγ1、VEGFR2和ERK的活化。如图34的A和B中所示，结果证实了GT分别对从Prx-/-小鼠分离的血管平滑肌细胞(VSMC)和血管内皮细胞(VEC)中PDGF信号传导和VEGF信号传导的相反调节效应。
另外，为了鉴定GT对PrxII-/-小鼠中血管增厚的效应，利用软线损伤PrxII-/-小鼠的左颈动脉。损伤后，Whatman 1号滤纸条浸泡在对照介质或GT溶液中，并将所述滤纸贴到血管上皮的表面30分钟以便所述溶液渗透到组织中。所述小鼠在损伤后第十天恢复。结果，从HE染色颈动脉样品测量的内膜对中膜比以均值+-标准误差表示(n＝8/组，*p<0.01)。结果表明，如图34C中所示，GT显著降低血管增厚。
试验例9：PrxII对黑素瘤细胞增殖和迁移的抑制效应，并鉴定通过用ETP化合物或它的衍生物处理黑素瘤细胞来抑制黑素瘤细胞体外迁移和体内转移到肺脏
(1)鉴定黑素瘤细胞的增殖和迁移与PrxII遏制之间的关系
利用PrxII特异性抗体免疫筛查黑素瘤细胞的PrxII蛋白水平。虽然SK-MEL-5(SK5)和SK-MEL-28(SK28)黑素瘤细胞很少表达PrxII，但两种其他细胞系，A375和G361，表达PrxII蛋白(图47A)。A375中的PrxII表达水平与人黑色素细胞的水平相似。相反，最相似的同工型Prx1的蛋白水平在所述4个细胞系中是一致的。另外，在SK-MEL细胞系中Prdx2基因的启动子区被甲基化，但在A375和G361细胞中没有。这提供了参与PrxII表达沉默的分子机制。考虑到PrxII是细胞质的抗氧化酶，细胞过氧化氢水平利用氧化敏感性染料DCFH-DA测量。
结果，碱性过氧化氢水平在PrxII缺陷的SK-MEL细胞中看来高，而所述水平不仅在存在PrxII的原代黑色素细胞中低，而且在A375和G361中也低(图47B)。这提示PrxII是调节黑素瘤细胞中的细胞内过氧化氢水平的重要的抗氧化酶。
此外，比较了4种黑素瘤细胞类型的体外细胞活性，例如增殖和迁移。血清条件与肿瘤转移生理相关，涉及多个复杂因素，因此，所述细胞在血清饥饿条件下，然后用20％胎血清刺激以便最大化诱导血清依赖性的细胞活性。结果，与2种其他PrxII表达的黑素瘤细胞相比，PrxII缺陷的SK-MEL细胞表现出较高的增殖活性(图47C)。在血清的趋化性迁移和创伤闭合中表现出的迁移活性在SK-MEL细胞中高于其他表达PrxII的黑素瘤细胞(图47D和E)。这揭示了黑素瘤细胞类型中的细胞功能和PrxII水平之间的相反关系。
另外，鉴定了PrxII对黑素瘤细胞关于PrxII的外源表达和特异性击倒的直接调节效应。在SK-MEL细胞中PrxII的外源表达通过逆转录病毒转导人Prdx2基因来实现(图48A)。当鉴定所述SK-MEL细胞的增殖活性时，PrxII的逆转录病毒表达降低了由血清刺激引起的细胞增殖(图48B)。通过所述PrxII表达，大大降低了SK-MEL细胞在趋化性迁移和创伤闭合中表现出的迁移活性(图48C和D)。随后，在G361和A375细胞中利用2种不同的siRNA特异性击倒了PrxII表达(图49A)。PrxII击倒明显增加了在这两种细胞中响应血清刺激的细胞增殖和迁移(图49B和C)。相反，击倒另一种细胞质Prx同工型，PrxI，不影响黑素瘤细胞活性(图49D)。总之，这表明所述PrxII酶充当了黑素瘤细胞的增殖和迁移的选择性抗氧化抑制剂。
(2)由于PrxII缺失，黑素瘤细胞向肺的转移增加
在黑素瘤细胞的增殖和迁移中，利用采用小鼠黑素瘤细胞B16F10的肺转移模型，基于PrxII的调节活性进行体内试验。已知B16F10细胞表达野生型BRAF，因此，鉴定了PrxII仍然调节B16F10细胞活性和Src/ERK途径。在B16F10细胞中，利用小鼠PrxII特异性siRNA击倒PrxII降低了E-钙粘着蛋白的水平，同时增加了Src/ERK活化和β-联蛋白磷酸化(图52A)。与此一致，PrxII击倒增加了B16F10响应血清刺激的增殖和迁移(图52B)。这表明黑素瘤细胞中PrxII的功能可能与致癌BRAF突变无关。
对于体内试验，利用siRNA介导的PrxII表达击倒来保证在所述肺转移检测期间稳定的PrxII表达缺陷(图52C)。然后，经尾静脉向小鼠注射mPrxII siRNA转染的B16F10细胞。10天后，取出小鼠的肺并鉴定转移的肿瘤结节。对肺表面和HE染色的问题切片二者的显微镜检查揭示，PrxII击倒的B16F10细胞比对照组细胞更积极地浸润入肺，侵袭和定殖于肺(图52D和E)。
(3)黑素瘤细胞通过ETP衍生物和胶霉毒素处理的体外迁移抑制和体内肺转移抑制
被称为胶霉毒素(GT)的真菌次级代谢产物是已知表现出代表典型Prx活性的硫氧还蛋白依赖性过氧化物酶活性的第一种天然产物，因此，鉴定GT对黑素瘤转移抑制的治疗性。无毒水平的GT处理在PrxII缺陷的SK28细胞中确实降低了细胞内过氧化氢水平(图53A)。这证明了GT的过氧化物酶活性。此外，在所述SK28细胞中GT处理降低Src/ERK活化和β-联蛋白磷酸化的同时，它增加了E-钙粘着蛋白的表达(图53B)。此外，在SK5和SK28这两种细胞中，GT降低了响应血清刺激的增殖和迁移(图53C和D)。这表明GT在黑素瘤细胞中充当了PrxII的小分子取代物。为了证明所述体内处理有效，小鼠在注射B16F10细胞后腹膜内注射GT。所述GT处理在黑素瘤细胞中明显降低了肺转移(图53E)。另外，GT更明显降低了PrxII击倒的B16F10的肺转移(图53F)。这表明GT具有作为抑制肺转移的治疗剂的潜力，因为它可以充当作为黑素瘤转移抑制剂的PrxII的小分子取代物。
另外，鉴定了毛壳素和毛壳菌素是否抑制黑素瘤细胞的活性。
具体地说，在用不同浓度(0，100，200，500和1000nM)的毛壳素和毛壳菌素处理SK-MEL28黑素瘤细胞后，检查所述细胞的存活力，结果在图54A中显示。如图54A中所示，在100nM浓度下没有显示毒性，因此，在以下增殖和迁移试验中使用100nM。
因此，用100nM毛壳素和毛壳菌素处理SK-MEL28黑素瘤细胞1小时，并检查增殖和迁移活性，并且所述增殖和迁移用血清(FBS)促进。
如图54B和C中所示，结果表明用毛壳素和毛壳菌素处理有效阻碍了黑素瘤细胞的增殖和迁移二者。
为了证明所述体内处理有效，小鼠在注射B16F10细胞后腹膜内注射毛壳素和毛壳菌素。用毛壳素和毛壳菌素处理明显降低了黑素瘤细胞的肺转移(图55)。
因此可以推断，模拟体内PrxII活性的本发明ETP衍生物也可以通过PrxII活化表现出相似的黑素瘤转移抑制活性。
转移性的恶性肿瘤是垂直生长期黑素瘤的最关键问题。尽管已经建立了关于黑素瘤转移的主要基因或信号传导网络，却没有关于哪种抗氧化酶参与的证据。本发明的发明人首先确定了PrxII的水平与黑素瘤细胞的转移活性负相关。证明了具有沉默的PrxII表达的SK-MEL黑素瘤细胞与PrxII高表达的A375和G361细胞相比，具有更优越的增殖和迁移活性。在SK-MEL细胞中PrxII的外源重表达降低了细胞的增殖和迁移的同时，A375和G361细胞中的PrxII击倒则增加了这两种细胞的活性。在分子水平下，以降低Src/REK活性的方向调节PrxII，并在质膜中逐一固定E-钙粘着蛋白和Y654磷酸化-不依赖性β-联蛋白的支撑。PrxII缺陷的小鼠黑素瘤B16F10细胞显示了体内肺转移提高。有趣的是，表现出Prx类似活性的天然化合物，胶霉毒素，不仅抑制PrxII缺陷的黑素瘤细胞的肺转移，而且抑制增殖和迁移。因此，本发明证明了PrxII和它的小分子模拟物具有作为用作黑素瘤转移抑制剂的潜在治疗剂的可能性。
根据上面的描述，本领域技术人员将显而易见的是，本发明可以在不改变技术思想和基本特征下以其他具体的方式执行。对此，要理解上面描述的例子在所有方面都是出于说明性目的，不是限制性的。本发明的范围需要解释为包括从下述权利要求的含义、范围和等效概念推导出的所有修改或修改形式，而不是以上做出的详细说明。
<110> 梨花女子大学校产学协力团
<120> 桥二硫双氧代哌嗪化合物或它的衍生物，及其用途
<130> OPA14064
<150> KR 10-2013-0059351
<151> 2013-05-24
<160> 8
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人 PrxII siRNA-1
<400> 1
cgcuugucug aggauuacgu u 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人 PrxII siRNA-2
<400> 2
aggaauauuu cuccaaacau u 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人 PrxI siRNA
<400> 3
actcaactgc caagtgattu u 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠 PrxII siRNA-1
<400> 4
aggaauauuu cuccaaacau u 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠 PrxII的siRNA
<400> 5
gcaacgcgca caucggaaau u 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠 PrxII的siRNA
<400> 6
gaucacaguc aacgaccuau u 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠 PrxII的siRNA
<400> 7
agaauuacgg cguguugaau u 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠 PrxII的siRNA
<400> 8
acgcugagga cuuccgaaau u 21 21

Claims (19)

1.一种以下化学式1表示的桥二硫双氧代哌嗪衍生物或以下化学式2表示的它的还原衍生物，或其可药用盐：
[化学式1]
[化学式2]
其中，在化学式1和2中，
R1和R3各自独立地是氢，或者C1至C6烷基，
R2和R4各自独立地是氢，直链或支链C1至C6烷基、烯基或炔基，二苯甲基，烷氧基苄基，烷氧基烷基，直链或支链C1至C6烷基芳基，或者取代或未取代的芳基，
然而，
不包括下列化学式15和9表示的化合物
[化学式15]
[化学式9]
2.根据权利要求1所述的衍生物、或其可药用盐，其中R2和R4各自独立地是氢、直链或支链C1至C6烷基或烯基、烷氧基苄基、烷氧基烷基或二苯甲基。
3.根据权利要求1所述的衍生物、或其可药用盐，其中R2和R4各自独立地是氢、甲基、正丁基、烯丙基、4-甲氧基苄基、3-甲氧基丙基或二苯甲基。
4.根据权利要求1所述的衍生物、或其可药用盐，其中所述衍生物是由下列化学式7、8和10至14表示的任何一种化合物：
[化学式7]
[化学式8]
[化学式10]
[化学式11]
[化学式12]
[化学式13]
[化学式14]
5.制备由权利要求1的化学式1表示的桥二硫双氧代哌嗪衍生物的方法，所述衍生物具有改善的细胞内渗透性并在细胞中以其还原形式模拟2-Cys-Prx的活性，所述方法包括利用氧化反应从以下化学式2表示的二巯基哌嗪二酮衍生物形成分子内二硫桥键：
[化学式2]
其中，在化学式2中，
R1至R4与权利要求1中限定的那些相同。
6.制备根据权利要求1所述的由化学式1表示的桥二硫双氧代哌嗪衍生物的方法，所述衍生物具有改善的细胞内渗透性并在细胞中以其还原形式模拟2-Cys-Prx的活性，所述方法包括：
通过由以下化学式3表示的哌嗪二酮衍生物与硫和双(三甲基甲硅烷基)酰胺锂或NaHMDS反应制备由以下化学式4表示的中间体；
通过还原所述中间体制备由化学式2表示的二巯基哌嗪二酮衍生物；并且
利用氧化反应从以下化学式2表示的二巯基哌嗪二酮衍生物形成分子内二硫桥键：
[化学式2]
[化学式3]
[化学式4]
其中，R1至R4与权利要求1中定义的相同。
7.制备根据权利要求1所述的由化学式1表示的桥二硫双氧代哌嗪衍生物的方法，所述衍生物具有改善的细胞内渗透性并在细胞中以其还原形式模拟2-Cys-Prx的活性，所述方法包括
由以下化学式5表示的卤素原子取代的哌嗪二酮衍生物与硫代乙酸的碱金属盐反应，制备由以下化学式6表示的包含硫代乙酸盐基团的中间体；
通过所述中间体与酸溶液反应，制备由化学式2表示的二巯基哌嗪二酮衍生物；并且
利用氧化反应从以下化学式2表示的二巯基哌嗪二酮衍生物形成分子内二硫桥键：
[化学式2]
[化学式5]
[化学式6]
其中，所述碱金属盐是钠或钾盐，X是卤素原子，并且R1至R4与权利要求1中定义的相同。
8.一种组合物，其包含：权利要求1所述的桥二硫双氧代哌嗪衍生物或其可药用盐。
9.一种由以下化学式1、化学式20、化学式21表示的桥二硫双氧代哌嗪衍生物或其可药用盐的用途，所述用途为用于制备预防或治疗血管病的药物组合物，
其中所述血管病选自由缺血性冠状动脉病、脑动脉阻塞和血管再狭窄所组成的组：
[化学式1]
其中，R1和R3各自独立地是氢，或者C1至C6烷基，
R2和R4各自独立地是氢，直链或支链C1至C6烷基、烯基或炔基，二苯甲基，烷氧基苄基，烷氧基烷基，直链或支链C1至C6烷基芳基，取代或未取代的芳基，
然而，不包括下列化学式9表示的化合物；
[化学式9]
[化学式20]
[化学式21]
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述血管再狭窄由血管移植、血管切割、动脉粥样硬化、血管内脂质堆积、高血压、动脉炎或血管成形术引起。
11.根据权利要求9所述的用途，其中所述组合物促进内皮细胞的增殖或迁移，同时抑制血管平滑肌细胞的增殖或迁移。
12.根据权利要求9所述的用途，其中所述桥二硫双氧代哌嗪化合物是由下列化学式7、8、10至15、20和21表示的任何一种化合物：
[化学式7]
[化学式8]
[化学式10]
[化学式11]
[化学式12]
[化学式13]
[化学式14]
[化学式15]
[化学式20]
[化学式21]
13.根据权利要求9所述的用途，其中所述缺血性冠状动脉病选自不稳定型心绞痛、心绞痛、动脉粥样硬化和心肌梗塞。
14.根据权利要求9所述的用途，其中所述脑动脉阻塞为中风。
15.一种由下述化学式1、化学式20、化学式21表示的桥二硫双氧代哌嗪衍生物或其可药用盐作为活性成分的用途，所述用途为用于制备抑制黑素瘤转移的药物组合物：
[化学式1]
其中，R1和R3各自独立地是氢，或者C1至C6烷基，
R2和R4各自独立地是氢，直链或支链C1至C6烷基、烯基或炔基，二苯甲基，烷氧基苄基，烷氧基烷基，直链或支链C1至C6烷基芳基，取代或未取代的芳基，然而，不包括下列化学式9表示的化合物；
[化学式9]
[化学式20]
[化学式21]
16.根据权利要求15所述的用途，其中R1至R4各自独立地是氢，直链或支链C1至C6烷基或烯基，烷氧基苄基，烷氧基烷基或二苯甲基。
17.根据权利要求15所述的用途，其中R1至R4各自独立地是氢，直链或支链C1至C6烷基或烯基，或烷氧基苄基。
18.根据权利要求15所述的用途，其中所述桥二硫双氧代哌嗪化合物是由以下化学式7、8和10至14表示的任何一种化合物：
[化学式7]
[化学式8]
[化学式10]
[化学式11]
[化学式12]
[化学式13]
[化学式14]
19.根据权利要求15所述的用途，其中所述衍生物通过模拟细胞内PrxII活性来抑制黑素瘤的转移。
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