CN116390731A - 五氮杂大环状环配合物与激素治疗剂的组合癌症疗法 - Google Patents

五氮杂大环状环配合物与激素治疗剂的组合癌症疗法 Download PDF

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Abstract

治疗哺乳动物个体的癌症的方法，其中癌症具有多重疗法抗性，该方法包括向哺乳动物个体施用治疗有效量的相应于下式(I)的五氮杂大环状环配合物、任选与施用另外的抗癌疗法一起。
Figure DDA0004113464770000011

Description

五氮杂大环状环配合物与激素治疗剂的组合癌症疗法
本发明是在国立卫生研究院(NIH)/国立癌症研究所(NCI)授予的基金号为1R01CA214025-01、R01CA 152601-06A1和R01CA 168292的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
本公开通常涉及癌症治疗的组合疗法，包括施用五氮杂大环状环配合物与抗癌疗法的组合，包括化疗、放疗、细胞周期抑制剂和激素受体途径抑制剂，并且特别是用于治疗表现出以对多种抗癌疗法具有抗性为特征的多种疗法抗性表型的癌症。本发明还通常涉及用于治疗癌症的疗法，所述癌症的特征在于赖氨酸脱乙酰酶沉默调节蛋白3(Sirt 3)的减少、锰超氧化物歧化酶(MnSOD)的乙酰化增加、特别是Mn SOD的赖氨酸68(AcK68、MnSOD-K68-Ac)或其下游标志物的乙酰化增加。
已显示含有过渡金属的具有相应于式A的大环环系的五氮杂大环状环配合物在许多人类疾病的动物和细胞模型中是有效的，以及在治疗人患者患有的病症中是有效的。
Figure BDA0004113464730000011
例如，在结肠炎的啮齿动物模型中，已报道一种此类化合物GC4403非常显著地降低进行结肠炎试验模型的大鼠结肠的损伤(参见Cuzzocrea等人,Europ.J.Pharmacol.,432,79-89(2001))。
Figure BDA0004113464730000012
还已经报道GC4403减弱在急性、放射诱导的口腔粘膜炎的临床相关的仓鼠模型中产生的(Murphy等人,Clin.Can.Res.,14(13),4292(2008))和成年小鼠的总致死身体放射中产生的(Thompson等人,Free Radical Res.,44(5),529-40(2010))放射损伤。类似地，另外的此类化合物GC4419已显示在大鼠模型中减轻VEGFr抑制剂诱导的肺疾病(Tuder等人,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,29,88-97(2003))。另外，已经显示另外的此类化合物GC4401在脓毒性休克(S.Cuzzocrea等人,Crit.Care Med.,32(1),157(2004)和胰腺炎(S.Cuzzocrea等人,Shock,22(3),254-61(2004))的动物模型中提供保护作用。
Figure BDA0004113464730000021
还已显示这些化合物中的某些在体内具有有效的抗炎活性并且预防氧化损伤。例如，已报道在炎症大鼠模型中，GC4403抑制炎症(Salvemini等人,Science,286,304(1999))，并且在胶原诱导的关节炎大鼠模型中预防关节疾病(Salvemini等人,Arthritis&Rheumatism,44(12),2009-2021(2001))。另外的这些化合物MdPAM和MnBAM已经在体内显示出抑制结肠组织损伤和嗜中性粒细胞累积至结肠组织的活性(Weiss等人,The Journal ofBiological Chemistry,271(42),26149-26156(1996))。此外，已经报道这些化合物在大鼠爪角叉菜胶痛觉过敏模型中具有镇痛活性并且减轻炎症和水肿，参见例如美国专利6,180,620。
还已显示这类化合物在预防和治疗人个体疾病中是安全和有效的。例如，已显示在经历放化疗疗法的头颈癌症患者中，GC4419减轻口腔粘膜炎(Anderson,C.,Phase1Trial of Superoxide Dismutase(SOD)Mimetic GC4419 to Reduce Chemoradiotherapy(CRT)-Induced Mucositis(OM)in Patients(pts)with Mouth or OropharyngealCarcinoma(OCC),Oral Mucositis Research Workshop,MASCC/ISOO Annual Meeting onSupportive Care in Cancer,Copenhagen,Denmark(2015年6月25日))。
此外，相应于此类含有过渡金属的五氮杂大环状环配合物已经显示出在治疗多种癌症中的功效。例如，已经提供相应于此类的某些化合物与活性剂例如紫杉醇和吉西他滨组合，以增强癌症治疗，例如用于治疗结肠癌和肺癌(非小细胞肺癌)(参见例如美国专利9,198,893)。上述4403化合物也已用于治疗Meth A纺锤形鳞状细胞癌和RENCA肾癌的体内模型(Samlowski等人,Nature Medicine,9(6),750-755(2003)，并且已经用于治疗纺锤形鳞状细胞癌转移的体内模型(Samlowski等人,Madame Curie Bioscience Database(Internet),230-249(2006))。
已经证明内分泌治疗剂(激素治疗剂)例如他莫昔芬在治疗多种类型的癌症中是有效的，包括雌激素受体阳性乳腺癌，并且目前也可用作具有乳腺癌高风险的女性的化学预防剂(Minsun Chang,Biomolecules and Therapeutics,20(3):256-267(2012))。然而，某些内分泌治疗剂(例如他莫昔芬)的问题是某些肿瘤可能固有地具有抗性(即甚至在此类治疗开始之前对治疗具有抗性)，和/或初始响应性肿瘤可以随时间推移对内分泌治疗剂产生抗性(Zhu等人,Nature Communications,9(1595):1-11(2018)；Wu等人,CancerResearch,78(3):671-684(2017))。对其它类型的抗癌疗法的抗性，例如对化疗剂和放疗的抗性，对于不同类型的肿瘤也是固有的或可能发展的。因此，癌细胞对治疗的发展或固有抗性可导致先前治疗的个体的癌症的复发，或无法对抗目前接受治疗的个体的癌症。
因此，仍然需要增强的癌症治疗方法，其在杀伤癌细胞方面提供改善的功效，同时还降低癌细胞对癌症治疗的抗性。
因此，简言之，本公开的方面涉及治疗哺乳动物个体的癌症的方法，所述癌症的特征在于具有多重疗法抗性，该方法包括：
向哺乳动物个体施用治疗有效量的相应于下式(I)的五氮杂大环状环配合物：
Figure BDA0004113464730000031
其中
M为Mn2+或Mn3+；
R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10独立地为氢、烃基、取代的烃基、杂环基、氨基酸侧链部分或选自以下的部分：-OR11、-NR11R12、-COR11、-CO2R11、-CONR11R12、-SR11、-SOR11、-SO2R11、-SO2NR11R12、-N(OR11)(R12)、-P(O)(OR11)(OR12)、-P(O)(OR11)(R12)和-OP(O)(OR11)(OR12)，其中R11和R12独立地为氢或烷基；
U与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
V与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
W与大环的氮和其所连接的大环的碳原子一起形成具有2-20个环碳原子的芳族或脂环族，取代或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的含氮稠合杂环，条件是当W为稠合的芳族杂环时，连接至为杂环和大环的组成部分的氮的氢和连接至为杂环和大环的组成部分的碳原子的R1和R10不存在；
X和Y表示衍生自任何单齿或多齿配位配体或配体体系或其相应阴离子的适合配体；
Z为抗衡离子；
n为0-3的整数；并且
虚线表示大环的氮原子与过渡金属锰之间的配位键。
根据另一个方面，提供了在具有肿瘤特征的哺乳动物个体中治疗癌症的方法，所述肿瘤特征的特征在于以下任何一项或多项：(i)沉默调节蛋白(SIRT3)蛋白的水平低于第一预定阈值水平，(ii)在赖氨酸68残基处乙酰化的锰超氧化物歧化酶(AcK68)的水平超过第二预定阈值水平，(iii)缺氧诱导因子2α(HIF2α)的表达水平超过指示干细胞谱系可塑性的第三预定阈值水平，(iv)Ki-67蛋白的水平超过第四预定阈值水平，(v)OCT4水平超过第五预定阈值水平，(vi)SOX2水平超过第六预定阈值水平，和(vii)单体与四聚体MnSOD的比率超过第七预定阈值水平，该方法包括：
向哺乳动物个体施用治疗有效量的相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物。
根据另一个方面，治疗哺乳动物个体的癌症的方法包括通过以下步骤选择作为用相应于下式(I)的五氮杂大环状环配合物治疗的适合个体的个体：从个体获得测试组织样品，测试组织样品包含肿瘤细胞，评估测试组织样品以确定包括以下任何一项或多项的标准：(i)在组织样品的肿瘤细胞中，沉默调节蛋白(SIRT3)蛋白的水平是否低于第一预定阈值水平，(ii)在赖氨酸68残基处乙酰化的锰超氧化物歧化酶(AcK68)的水平是否超过第二预定阈值水平，(iii)缺氧诱导因子2α(HIF2α)的表达水平是否超过指示干细胞谱系可塑性的第三预定阈值水平，(iv)Ki-67蛋白的水平是否超过第四预定阈值水平，(v)OCT4蛋白的水平是否超过第五预定阈值水平，(vi)SOX2蛋白的水平是否超过第六预定阈值水平，和(vii)单体与四聚体MnSOD的比率是否超过第七预定阈值水平，并且如果满足标准(i)-(vii)中的一个或多个，则确定个体适合于治疗，并且在选择个体适合于治疗的情况下，施用治疗有效量的相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物。
根据另一个方面，提供了用于治疗哺乳动物个体的癌症的试剂盒，所述试剂盒包含用于分析获自个体并且包含肿瘤细胞的组织样品的测定法，所述测定法能够确定包括以下任何一种或多种的标准：(i)在组织样品的肿瘤细胞中，沉默调节蛋白(SIRT3)蛋白的水平是否低于第一预定阈值水平，(ii)在赖氨酸68残基处乙酰化的锰超氧化物歧化酶(AcK68)的水平是否超过第二预定阈值水平，以及(iii)缺氧诱导因子2α(HIF2α)的表达水平是否超过指示干细胞谱系可塑性的第三预定阈值水平，(iv)Ki-67蛋白的水平是否超过第四预定阈值水平，(v)OCT4蛋白的水平是否超过第五预定阈值水平，(vi)SOX2蛋白的水平是否超过第六预定阈值水平，和(vii)单体与四聚体MnSOD的比率是否超过第七预定阈值水平，和治疗有效量的相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物。
根据另一个方面，提供了在患有该病的哺乳动物个体中治疗对抗癌剂具有抗性的肿瘤的方法，该方法包括通过向个体施用治疗有效量的相应于下式(I)的五氮杂大环状环配合物来治疗个体。
根据另一个方面，提供了在患有该病的哺乳动物个体中治疗对电离放疗具有抗性的肿瘤的方法，该方法包括通过向个体施用治疗有效量的相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物来治疗个体。
根据又一个方面，提供了在患有癌症的哺乳动物个体中治疗癌症的方法，其中所述个体对抗癌疗法具有抗性，和/或具有指示MnSOD-AC-K68/ROS/HIF2α轴失调的肿瘤特征，该方法包括：向个体施用抗癌疗法，所述抗癌疗法选自治疗有效量的化疗剂、治疗有效量的抑制与癌症的生长或进展相关的激素受体途径的治疗剂、治疗有效量的细胞周期抑制剂和治疗有效剂量的电离辐射；和在施用抗癌疗法之前、与之同时或之后，向个体施用治疗有效量的相应于下式(I)的五氮杂大环状环配合物。
根据另一个方面，在有风险的哺乳动物个体中治疗癌症和/或降低癌症复发可能性的方法，该方法包括向个体施用治疗有效量的相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物，任选与其它抗癌疗法组合。
根据另一个方面，在哺乳动物个体中治疗对抗癌疗法具有抗性的肿瘤的方法，所述抗癌疗法选自化疗剂、抑制与癌症生长或进展相关的激素受体途径的治疗剂、细胞周期抑制剂和放疗，该方法包括向个体施用治疗有效量的相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物。
根据另一个方面，提供了在患有癌症的哺乳动物个体中治疗癌症的方法，该方法包括向个体施用治疗有效量的选自化疗剂、抑制与癌症生长或进展相关的激素受体途径的治疗剂和细胞周期抑制剂的抗癌剂，并且在施用抗癌剂之前、与之同时或之后向个体施用治疗有效量的相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物。
根据又一个实施方案，在有风险的哺乳动物个体中预防癌症和/或降低癌症发生和/或复发的可能性的方法，该方法包括向个体施用选自化疗剂、抑制与癌症生长或进展相关的激素受体途径的治疗剂和细胞周期抑制剂的抗癌剂，在施用抗癌剂之前、与之同时或之后向个体施用治疗有效量的相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物。根据另一个实施方案，在患有癌症的哺乳动物个体中降低癌症侵袭或转移的方法，该方法包括向个体施用治疗有效量的相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物。在另一个实施方案中，在患有癌症的哺乳动物个体中抑制癌症中干性表型的发展和/或进展的方法，该方法包括向个体施用治疗有效量的相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物。
根据另一个实施方案，提供了在患有癌症的哺乳动物个体中治疗癌症，或在有风险的哺乳动物个体中预防癌症和/或降低癌症发生和/或复发的可能性的方法，该方法包括：确定哺乳动物个体是否表现出指示锰超氧化物歧化酶(MnSOD)的K68-乙酰化形式的表达超过预定水平的生物标志物；和在确定哺乳动物个体表现出指示MnSOD的K68-乙酰化形式的表达超过预定水平的生物标志物的情况下，向个体施用治疗有效量的相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物。
根据另一个实施方案，在对抗癌疗法表现出抗性的哺乳动物个体中降低对抗癌疗法的抗性的方法，所述抗癌疗法选自用化疗剂的治疗性治疗、用抑制与癌症生长或进展相关的激素受体途径的治疗剂的治疗、用细胞周期抑制剂的治疗和放疗，该方法包括向个体施用治疗有效量的抗癌疗法，并且在施用抗癌疗法之前、与之同时或之后，向个体施用治疗有效量的相应于下式(I)的五氮杂大环状环配合物。
附图简述
图1a-1d为示例用MnSODK68Q表达模拟乙酰化赖氨酸68促进体外转化许可表型的示意图和示意图像，其中：图1a显示了用lenti-MnSODWT、lenti-MnSODK68R和lenti-MnSODK68Q以及lenti-Myc或lenti-Ras感染的pMEF的无限增殖化，即生长超过15代；图1b显示了针对软琼脂生长(上图)和集落形成(下图)测试的上述细胞系；图1c显示了测试用RasG12V感染的pMEF的无限增殖化、倍增时间和软琼脂生长；图1d显示测试表达MnSODWT、MnSODK68R和MnSODK68Q的NIH 3T3细胞的软琼脂中的生长(上图)和集落形成(下图)。试验一式三份进行。比例尺：20μm。
图2a-2f为示例用MnSODK68Q表达模拟乙酰化赖氨酸68增加异种移植物肿瘤生长和体外增殖、同时用MnSODK68R模拟永久脱乙酰赖氨酸具有相反作用的示意图和绘图，其中图2a和2b显示了将表达MnSODWT、MnSODK68R和MnSODK68Q的MCF7细胞植入裸鼠的后肢(n＝10/组)并且测试异种移植物肿瘤生长；图2c和2d显示了表达MnSODWT、MnSODK68R和MnSODK68Q的MCF7细胞，其中2c显示Ki-67和DAPI的免疫荧光(IF)染色，并且2d对Ki-67强度定量，如ImageJ分析测定的；图2e和2f显示了表达MnSODWT、MnSODK68R和MnSODK68Q的T47D细胞，其中2e显示了Ki-67和DAPI的IF染色，并且2f为对Ki-67强度定量的染色。全部试验一式三份进行。误差条表示±1SEM。使用具有Tukey事后分析的单向ANOVA分析。**p<0.01和***p<0.001。
图3a-3e为示例用MnSOD-K68Q模拟乙酰化赖氨酸68或通过敲低SIRT3脱乙酰酶诱导赖氨酸68乙酰化通过减少完整四聚体形式和增加单体形式改变MnSOD构象，并且产生过氧化物酶活性，而用MnSODK68R模拟永久脱乙酰化赖氨酸具有相反的作用的图像和示意图，其中图3a示例了通过半天然交联和用抗-MnSOD抗体印迹分析的表达MnSODWT、MnSODK68R或MnSODK68Q的MCF7细胞(左图)和T47D细胞(右图)；图3b示例了通过交联分析的表达shSIRT3以敲低SIRT3水平的MCF7细胞(左图)和T47D细胞(右图)；图3c示例了测量过氧化物酶活性的在MCF7细胞中表达的Flag-MnSODWT、Flag-MnSODK68R和Flag-MnSODK68Q。误差条表示±1SEM。**p<0.01；图3d示例了通过半天然交联分析并且用抗-MnSOD抗体免疫印迹以确定四聚体和单体形式的水平的表达MnSODWT、MnSODK68R或MnSODK68Q的无限增殖化MnSOD-/-pMEF；并且图3e显示了使用或不使用Ad-Mito-Cat或Ad-Empty的表达MnSODWT、MnSODK68R或MnSODK68Q的MnSOD-/-pMEF，测量其转化。所有试验一式三份进行。使用具有Tukey事后分析的单向ANOVA统计分析。
图4a-4i为示例MnSOD-K68的生化乙酰化将MnSOD的大小从四聚体转变为更小形式、包括单体的图像和示意图，并且四聚体形式表现出歧化酶活性，而更小的形式表现出过氧化物酶活性，其中：图4a-4d显示了表达Flag-MnSODWT的永生化MnSOD-/-MEF将其在NAM+TSA或NAD+中培养，使用50kDa分子截留膜分离，其中图4a显示了测定MnSOD-K68-Ac、MnSOD和肌动蛋白免疫反应性蛋白水平，图4b显示了过氧化物酶活性，图4c显示了在<50kDa级分中的MnSOD活性，并且图4d显示了在>50kDa级分中的MnSOD活性；图4e显示了通过尺寸排阻柱色谱法表征细菌产生和纯化的重组MnSOD-WT和MnSOD-K68-Ac蛋白。显示了标准品；图4f和4g显示了对应于图4e的峰1(4f)的洗脱体积13和14mL以及对应于图4e的峰2(4g)的洗脱体积16和17mL，其被分析用于MnSOD和MnSOD-K68-Ac免疫印迹(上图)或考马斯亮蓝染色(下图)；图4h和4i显示，分析峰1(洗脱体积13和14mL)和峰2(洗脱体积16和17mL)的如图4h所示的超氧化物歧化酶活性和如图4i中所示的过氧化物酶活性。所有试验一式三份进行。误差代表±1SEM。***p<0.01。使用t-检验比较两组的平均值。
图5a-5h为示例用MnSODK68Q表达模拟乙酰化赖氨酸68导致人乳腺癌细胞中氧化性应激、而用MnSODK68R模拟永久脱乙酰化赖氨酸具有相反的作用的示意图，其中图5a和5b显示了MnSOD活性，图5a显示了MCF7-MnSODWT、MCF7-MnSODK68R和MCF7-MnSODK68Q，并且图5b显示了在全细胞匀化物中的T47D-MnSODWT、T47D-MnSODK68R和T47D-MnSODK68Q；图5c和5d显示了如图5c中所示的在MCF7-MnSODWT、MCF7-MnSODK68R和MCF7-MnSODK68Q中和如图5d中所示的在T47D-MnSODWT、T47D-MnSODK68R和T47D-MnSODK68Q细胞中测量的超氧化物的稳态水平；图5e和5f显示了通过流式细胞术经CDCFH2氧化在这些细胞中测量的H2O2水平；图5g和5h显示了在这些细胞的全细胞匀化物中测量的氧化型谷胱甘肽(GSSG)与还原型谷胱甘肽(GSH)水平的比率。所有试验一式三份进行。误差条表示±1SEM。*p<0.05，**p<0.01，和***p<0.001。使用具有Tukey事后分析的单向ANOVA统计分析。
图6a-6h为示例乳腺癌细胞中MnSOD-K68的乙酰化或模拟乙酰化使它们成为羟基-Tam-抗性、而模拟MnSOD-K68的脱乙酰化或药理学模拟脱乙酰化赖氨酸68MnSOD的活性具有相反的作用的示意图和示意图像，其中图6a-c为通过细胞毒性测量的在暴露和不暴露于1μM羟基-Tam 120小时(HT)的情况下，关于图6a的MCF7-MnSODWT、MCF7-MnSODK68R和MCF7-MnSODK68Q细胞，关于图6b的MCF7-shCtrl和MCF7-shSIRT3细胞，以及关于图6c的MCF7和MCF7-HTR(他莫昔芬抗性)细胞的克隆形成细胞存活试验；图6d显示了MCF7和MCF7-HTR，以及T47D和T47D-HTR细胞裂解物，针对MnSOD-K68-Ac、MnSOD、SIRT3和肌动蛋白进行免疫印迹；图6e显示了MCF7和MCF7-HTR以及T47D和T47D-HTR细胞裂解物的免疫反应性MnSOD-K68-Ac蛋白水平的定量；图6f-6h显示了MCF7-HTR细胞的克隆形成细胞存活试验，其中图6f显示了用1μM羟基-Tam处理120小时的经转染以表达MnSODWT、MnSODK68Q或MnSODK68R的此类细胞；图6g显示了用1μM羟基-Tam处理的经转染以表达SIRT3WT或SIRT3DN(S3DN，脱乙酰化裸SIRT3基因)的此类细胞；图6h显示了用5μM小分子MnSOD模拟物GC4419处理5天的此类细胞。所有试验一式三份进行。误差条表示±1SEM。**P<0.01并且***P<0.001。通过具有Tukey事后分析的单向ANOVA统计分析来分析三臂组，并且通过t-检验分析两臂组。
图7a-7k为示例羟基-TAM暴露诱导的对羟基-Tam(HTR)的抗性与四聚体MnSOD和活性的丧失、增加的单体形式、增加的氧化性应激和增加的增殖相关，而在HTR癌细胞中用MnSODK68R模拟永久脱乙酰化的赖氨酸逆转了这些作用的图像和示意图，其中：图7a显示了MCF7和MCF7-HTR全细胞裂解物的总MnSOD活性；图7b和7c显示了MCF7和MCF7-HTR，以及T47D和T47D-HTR全细胞匀化物，相对于图7b，通过Mitosox氧化测定O2●-的稳态水平；并且关于图7c，通过CDCFH2氧化测定H2O2；图7d显示了MCF7和MCF7-HTR全细胞匀化物中的谷胱甘肽水平；图7e显示了MCF7和MCF7-HTR以及T47D和T47D-HTR细胞裂解物的MnSOD形式的半天然凝胶分析；图7f-7h显示了表达MnSODWT、MnSODK68Q或MnSODK68R的MCF7-HTR细胞的全细胞匀化物，关于图7f，测定O2●-的稳态水平，关于图7g，测定H2O，并且关于图7g，测定谷胱甘肽水平；图7i显示了针对Ki-67和DAPI染色的MCF7和MCF7-HTR细胞；图7j和7k显示了表达AdMitoCat或空载体的MCF7-MnSODK68Q细胞的克隆形成存活试验。在图7j和图7k的底行中，用1μM羟基-Tam处理细胞120小时。所有试验一式三份进行。误差条表示±1SEM。*p<0.05并且***p<0.001。通过具有Tukey事后分析的单向ANOVA统计分析来分析三臂组，并且通过t-检验来分析双臂组。
图8a和8b为显示MCF7和MCF7-HTR细胞(5.0×106)植入裸鼠两个后肢的结果和测量6周的肿瘤体积的示意图和示意图像，其中在图8a中误差条代表±1SEM，并且在图8b中显示了在6周时来自MCF7-HTR(左图)和MCF7细胞(右图)的肿瘤的代表性图像。
图8c为显示将MCF7-HTR多西环素诱导型MnSODK68R细胞植入裸鼠后肢并且监测肿瘤体积4周的结果的示意图，误差条代表±1SEM。
图8d显示了用抗-MnSOD-K68-Ac或抗-SIRT3抗体染色的管腔乳腺癌样品TMA；图8e和8f显示了由管腔A(n＝37)和管腔B(n＝38)样品组成的定量TMA，所述样品相对于图8e针对MnSOD-K68-Ac进行免疫染色，并且相对于图8f针对SIRT3进行免疫染色。阴影框表示四分位距；虚线代表第10-90个百分位范围。试验一式三份进行。*P<0.05。使用t-检验来比较两组之间的数据。
图8g为正常细胞中MnSOD(即保护作用)对肿瘤促进剂和/或Tam抗性的二分作用关系的示意图。
图9a-9b为示例用MnSODK68Q的表达模拟MnSOD-K68的乙酰化减少倍增时间，允许异种移植物生长，并且引起雌激素非依赖性，而用MnSODK68R模拟MnSOD-K68的脱乙酰化具有相反作用的图和示意图。关于图9a，用lenti-Myc(对照)和lenti-MnSODK68R或lenti-MnSODK68Q感染pMEF，在嘌呤霉素中选择细胞14天；然后每2天更换培养基，持续28天，并且评估细胞生长速率。pMEF-对照、pMEF-Myc-MnSODK68R和pMEF-Myc-MnSODK68Q细胞(中间列)的倍增时间通过Td＝(t241)*log(2)/log(q2/q1)测定。用lenti-Myc(对照)感染MCF7细胞，并且lenti-MnSODK68R或lenti-MnSODK68Q也用于异种移植生长试验，其中将100万个细胞植入裸鼠的两个后肢。每3天测量肿瘤体积。对照和Myc-MnSODK68R细胞不形成肿瘤，而Myc-MnSODK68Q细胞形成异种移植肿瘤(三个向上的箭头表示所有10只裸鼠后腿感染生长异种移植物)。关于图9b，随后将用lenti-MnSODK68Q感染的并且在嘌呤霉素中选择14天的MCF7细胞在没有雌激素补充(黑色方块)或有雌激素补充(空心圆)的情况下植入裸鼠的两个后肢中。每7天测量肿瘤体积(1.0×106个细胞)。所有试验一式三份进行。误差条表示±1SEM。
图10a-10f，对于图10a-10b，为示例MCF7细胞和针对Ki-67水平对MCF7-MnSODWT细胞进行染色的图像。对于图10a，MCF7和MCF7-MnSOD’AFT细胞，以及对于图10b，通过用lenti-MnSODWT或空对照慢病毒感染构建的MCF7和MCF7-MnSOD’AFT细胞的异步生长培养物。在玻璃盖玻片上生长24小时后，将细胞固定并且用抗-Ki-67和抗-DAPI抗体染色。关于图10c-10d，显示了示例MCF7-MnSODK68Q细胞暴露于雌激素或Tam并且针对Ki-67染色的图像，如图10c所示，将MCF7-MnSODWK68QT细胞暴露于雌激素(E2)5天，或如图10d所示，将MCF7-MnSODWK68QT细胞暴露于1μM 4-羟基-Tam(HT)5天。将细胞在具有相同浓度的E2或HT的玻璃盖玻片上重新铺板24小时。然后将细胞固定，随后用抗-Ki-67和抗-DAPI抗体染色。关于图10e-10f，显示了示例图10c和10d中所示的图中平均Ki-67强度的定量的示意图，并且在条形图中示出。所有试验一式三份进行。误差条表示±1SEM。显示了代表性的IHC图像。
图11a-11d为显示用MnSODK68Q表达模拟MnSOD-K68乙酰化在促进体外转化许可表型，而用MnSODK68R模拟MnSOD-K68的脱乙酰化具有相反作用的示意图和图像，其中图11a显示了用lenti-MnSODWT、lenti-MnSODK68R和lenti-MnSODK68Q感染的MnSOD-/-MEF并且在嘌呤霉素中培养和选择细胞14天。表达MnSODK68Q的MnSOD-/-MEF与表达MnSODK68R或MnSODWT的任一细胞以及未感染的细胞(MnSOD-/-)相比，表现出更多转化的表型。图11b显示了来自所有四种这些细胞系的100或250个细胞的结果，其每60mm培养皿铺板，并且14天后，用结晶紫染色细胞以确定低密度下的生长。图11c显示了来自所有四种这些细胞系的10,000个细胞的结果，其在0.6％基础琼脂上的0.3％琼脂上铺板21天，并且对集落进行计数。图11d显示了来自所有四种这些细胞系的20,000个细胞的结果，其每60mm培养皿铺板并且每天测量，并且通过Td＝(t2-t1)*log(2)/log(q2/q1)确定倍增时间。所有试验一式三份进行。误差条表示±1SEM。***p<0.001。显示了代表性图像。
图12a-12c为示例MnSOD-K68的生化乙酰化使MnSOD的大小从四聚体转变为包含单体在内的更小形式并且产生过氧化物酶活性的图像和示意图。关于图12a，用表达Flag-MnSODWT的质粒转染293T细胞并且用10mM NAM和1μM TSA，或者10mM NAD+处理，在40小时时收获，并且用抗-FLAG抗体IPed。使用50kDa离心过滤器分离IPed样品，并且分离高于和低于50kDa的蛋白质提取物，然后用抗-MnSOD、MnSOD-K68-Ac和肌动蛋白抗体进行免疫印迹。关于图12b，表达Flag-MnSODWT的样品并且用10mM NAM和1μMTSA，或者10mM NAD+处理，使用50kDa离心过滤器分离。随后将样品在半天然凝胶上运行，并且用抗-MnSOD抗体进行免疫印迹。关于图12c，用表达Flag-MnSODWT的质粒转染MnSOD-/-无限增殖化MEF，并且用10mM NAM和111M TSA，或10mM NAD+处理，并且在40小时时收获细胞，并且用抗-FLAG抗体IPed。使用50kDa离心过滤器分离IPed样品，并且分离高于50kDa的蛋白质提取物，然后将纯化的蛋白质用于过氧化物酶活性的生化分析。所有试验一式三份进行。误差条表示±1SEM。显示了代表性图像。
图13a-13f为示例MnSOD-K68乙酰化将MnSOD的大小从四聚体转变为包含单体在内的更小形式的图像和示意图。用pET21a-MnSODWT或pEVOL-AcKRS与pET21a-MnSODK68TAG一起转化BL21(DE3)细菌。收获并且裂解细胞，并且将洗脱的蛋白质在Superdex 20Increase10/300GL柱上运行，并且随后将级分1’2’3和这些样品用于进一步分析。关于图13a，显示了来自携带pET21a-MnSODwT的细菌的纯化蛋白质的尺寸排阻柱的色谱图(上图)，保留体积级分11至20通过考马斯染色(中图)或用抗-MnSOD抗体免疫印迹(下图)进一步分析以确定MnSOD水平。关于图13b，显示了来自携带pEVOL-AcKRS和pET21a-MnSODK68TAG的细菌的纯化蛋白质的色谱图，所有级分通过考马斯染色(中图)或用抗-MnSOD-K68-Ac抗体免疫印迹(下图)进一步分析。原始数据以y轴表示为mAU(280nm)，以显示峰2小于峰1，这可能是由于在Superdex 200Increase 10/300GL柱上运行的蛋白质略少(5.5mg对4.8mg)所致。关于图13c，通过质谱和32种独有的独特肽、164个光谱和999个总光谱、100％覆盖率(其是每次运行的平均值)分析了三个单独的MnSOD-K68-WT样品。关于图13d，三个单独的MnSOD-K68-Ac样品显示24种独有的独特肽，99个独特光谱，鉴定了531个总光谱，95％覆盖率，其是每次运行的平均值。关于图13e，表格显示了独特的K68乙酰化肽的总数的平均百分比，作为独特肽的总数的比率。还显示了来自表达pET21a-MnSODWT或表达pET21a-MnSODK68TAG的细菌的独特肽的总数、独特光谱和总光谱的数据。关于图13f，通过SDS-PAGE分离峰1(体积13，14mL)和峰2(体积16，17mL)，并且用抗-MnSOD-K68-Ac抗体进行免疫印迹。所有试验一式三份进行。显示了代表性图像。
图14a-14g为示例SIRT3诱导的MnSOD-K68脱乙酰化的丧失导致羟基-Tam抗性，并且此类抗性与人乳腺癌细胞中赖氨酸乙酰化的增加有关，而用锰五氮杂大环歧化酶模拟物模拟MnSOD-K68的脱乙酰化或药理学模拟脱乙酰化赖氨酸68MnSOD的活性具有相反作用的图像和示意图。关于图14a，选择T47D-MnSODWT、T47D-MnSODK68R和T47D-MnSODK68D永久性细胞系用于1μM羟基-Tam抗性3个月，并且完成克隆形成细胞存活试验。关于图14b，将T47D-shCtrl和SIRT3敲低的T47D-shSIRT3永久性细胞系暴露于1μM 4-羟基-Tam 24小时(HT)，并且进行克隆形成细胞存活试验。关于图14c，通过克隆形成存活试验测量的T47D和T47D细胞暴露于和不暴露于1μM 4-羟基-Tam 24小时(HT)的羟基-Tam响应。关于图14d，将MCF7细胞(左)和T47D细胞(右)在包含1μM羟基-Tam的常规DMEM中培养3个月(HT)。通过用抗-MnSOD-K122-Ac(在Tao等人，2010，Cancer Cell中验证为SIRT3脱乙酰化靶标)、抗-MnSOD、抗-OSCP-K139-Ac(在Tao等人，2010，Cancer Cell中验证为SIRT3脱乙酰化靶标)、抗-OSCP、抗-IDH2K413-Ac(在Someya等人，2010，Cancer Cell中验证为SIRT3脱乙酰化靶标)、抗-IDH2和抗-肌动蛋白进行免疫印迹来分析细胞裂解物。关于图14e，用lenti-MnSODWT、lenti-MnSODK68D或lenti-MnSODK68R感染T47D-HTR细胞并且用1μM 4-HT处理24小时，随后进行克隆形成细胞存活测定。关于图14f，用lenti-SIRTWT(S3)或lenti-SIRTDN(S3DN；显性负效应脱乙酰化无效基因)感染T47D-HTR细胞，并且用1μM羟基-Tam处理24小时，随后进行克隆形成细胞存活测定。关于图14g，将T47D-HTR细胞与5μM GC4419一起温育5天，然后进行克隆形成细胞存活测定。所有试验一式三份进行。误差条表示±1SEM。*p<0.05，**p<0.01，和***p<0.001。
图15a-15e为示例在羟基-Tam抗性人乳腺癌细胞中降低的MnSOD活性和增加的氧化性应激可以通过MnSODK68R的表达逆转的示意图。关于图15a和15b，收获在1μM羟基-Tam中选择3个月的T47D细胞，并且将全细胞匀化物用于：图15a中，总MnSOD活性的生化分析，和图15b中，谷胱甘肽水平的生化分析。关于图15c-15e，用lenti-MnSODWT、lenti-MnSODK68R或lenti-MnSODK68Q感染T47D-HTR细胞，并且收获。全细胞匀化物用于：图15c中，MitoSox氧化的生化分析，图15d中，H2O2的生化分析，如通过CDCFH2氧化检测的，以及图15e中，谷胱甘肽水平的生化分析。所有试验一式三份进行。误差条表示±1SEM。*p<0.05，**p<0.01，和***p<0.001。
图16a-16g为示例Ki-67水平在羟基-Tam抗性(HTR)乳腺癌细胞中增加，和用锰五氮杂大环歧化酶模拟物药理学模拟脱乙酰化赖氨酸68MnSOD活性降低HTR中Ki-67水平并且使它们对羟基-Tam细胞毒性敏感的图像和示意图。关于图16a，来自图7i的数据(其中MCF7-HTR细胞针对Ki-67以及DAPI染色)用ImageJ计数并且定量平均Ki-67强度，如条形图所示。关于图16b和16c，将T47D和T47D-HTR细胞针对Ki-67以及DAPI染色，并且用ImageJ计数细胞核中的颗粒并且定量平均Ki-67强度，如条形图所示。在图16d和16e中，MCF7-HTR细胞，以及图16f和16g中，T47D-HTR细胞用5μM GC4419和/或1μM 4-羟基-Tam处理5天，然后针对Ki-67以及DAPI染色。平均Ki-67强度的定量显示在条形图中。所有试验一式三份进行。误差条表示±1SEM。***p<0.001。显示了代表性图像。
图17a-17e为示例在表达MnSODK68Q的MCF7和T47D细胞中，用锰五氮杂大环歧化酶模拟物药理学模拟脱乙酰化赖氨酸68MnSOD的活性降低Ki-67水平的图像和示意图。将MCF7-MnSODK68Q细胞(在图17a和17b中)和T47D-MnSODK68Q细胞(在图17c和17d中)用5μMGC4419和/或1μM 4-羟基-Tam处理5天，然后针对Ki-67以及DAPI染色。平均Ki-67强度的定量显示在条形图中。在图17e中，将MCF7和MCF7-HTR细胞植入裸鼠的两个后肢中，并且每3天测量肿瘤体积持续6周，并且显示了成功植入的肿瘤的数量相对于感染MCF7和MCF7-HTR的小鼠的总数以及平均肿瘤重量和肿瘤大小。显示了代表性图像。所有试验一式三份进行。误差条表示±1SEM。***p<0.001。
图18a-18b为示例用Tet-ON诱导的MnSODK68R表达模拟MnSOD-K68的脱乙酰化抑制MCF7-HTR细胞中异种移植物生长的图像和示意图。图18a显示了用pTet-Dualon(Clontech)感染并且用嘌呤霉素选择，然后用pTre-Dual2-Flag-MnSODK68R感染并且用潮霉素选择的MCF7-HTR细胞。通过免疫荧光成像测试未暴露于四环素和暴露于四环素的这些细胞(MCF7-HTR-Tet-On-MnSODK68Q细胞)中pTet-DualOn的存在和pTre-Dual2-Flag-MnSODK68R的存在。图18b显示了上述MCF7-HTR-Tet-ON-MnSODK68Q细胞，其也通过SDS-PAGE分离，并且用抗-MnSOD、Flag和微管蛋白抗体免疫印迹。人管腔B肿瘤的亚组表现出高水平的MnSOD-K68-Ac。
图18c-18d为显示人乳腺癌TMA的图像，所述TMA由脱蜡并且用抗-MnSOD-K68-Ac(在图18c中)或抗-SIRT3抗体(在图18d中)免疫染色的管腔A(n＝37)和管腔B(n＝38)样品组成。MnSOD-K68-Ac和SIRT3染色被分组为低、中和高水平，并且落入这些组中的每一个的样品数量在每个TMA下的表中呈现。圈出的肿瘤样品包含高MnSOD-K68-AC染色。所有试验一式三份进行。显示了代表性图像。
图19a-19c为显示恩杂鲁胺-抗性前列腺癌细胞(LNCaP-ENZR)显示MnSOD上赖氨酸68的乙酰化增加和MnSOD四聚体形式和活性水平降低的图像和示意图。在图19a中，通过在ENZ(10μM)中连续生长数月(超过3个月)来选择LNCaP-ENZR细胞。用抗-MnSOD-K68-Ac和MnSOD抗体对来自这些细胞的提取物进行免疫印迹。在图19b中，将对照和LNCaP-ENZR细胞戊二醛交联，收获，并且在SDS-PAGE上分离提取物，并且用抗-MnSOD抗体进行免疫印迹。在图19c中，测定提取物的MnSOD活性。误差条为±1SEM。试验一式三份。**P<0.01。
图20a-20b为显示用MnSODK68R表达模拟MnSOD-K68的脱乙酰化逆转了LNCaP-ENZR细胞中的ENZR，而用MnSODK68Q模拟MnSOD-K68的乙酰化诱导LNCaP细胞中的恩杂鲁胺抗性的示意图。在图20a中，在ENZ(10μM)存在下在用lenti-MnSODK68R或lenti-MnSODK68Q感染的LNCaP-ENZR细胞中进行克隆形成细胞存活试验。在图20b中，在用lenti-MnSODWT、lenti-MnSODK68R和lenti-MnSODK68Q感染的LNCaP细胞中进行克隆形成存活测定并且用新霉素选择，并且置于10μL ENZ中72小时。误差条±1SEM。试验一式三份进行。**P<0.01。
图21a-21b为显示用锰五氮杂大环歧化酶模拟物药理学模拟脱乙酰化赖氨酸68MnSOD的活性，它们都抑制LNCaP-ENZR肿瘤生长并且逆转LNCaP-ENZR/LNCaP-MnSODK68Q细胞和肿瘤中的恩杂鲁胺抗性的图表和示意图表。在图21(a)中，在LNCaP-ENZR(左侧两个条形图)和LNCaP-MnSODK68Q(右侧两个条形图)中进行克隆形成细胞存活试验，使用有或不使用GC4419(20μM)的ENZ处理5天。在图21b中，将表现出ENZR的LNCaP-MnSODK68Q细胞植入雄性裸鼠的后肢，并且用GC4419(10mg/kg，每周一次)、ENZ(25mg/kg/天)或GC4419+ENZ处理。每周测量肿瘤体积三次，持续46天。对于每组，n＝10。误差条±1SEM。所有试验一式三份进行。**P<0.01。
图22a-22b为显示MnSOD-K68-Ac染色与人前列腺癌组织样品中增加的Gleason等级相关的示意图和示意图像。在图22a中，将样品针对MnSOD-K68-Ac染色并且通过相对IHC染色强度定量。阴影框是四分位距；虚线是第10-90个百分点。在图22b中，提供了显示PIN、G3和G4人前列腺肿瘤组织样品中的MnSOD-K68-Ac染色的图像。
图23a-23b为显示LNCaP-MnSODK68Q细胞不表现出雄激素受体(AR)的表达或活性的变化的图像和示意图。在图23a中，LNCaP-MnSODK68Q细胞用ENZ处理3个月，并且用抗-AR和肌动蛋白抗体进行免疫印迹。在图23b中，用lenti-MnSODK68Q感染在mCherry上游包含AR启动子的LNCaP细胞并且测量mCherry水平。误差条为±1SEM。
图24a-24b为显示MnSOD-Ac-K68-ROS-HIF2α轴的失调指导前列腺癌细胞中的干性表型的图像和示意图，其也与对雄激素途径疗法的抗性相关。在图24a中，收获LNCaP和LNCaP-MnSODK68Q细胞，并且用作为干性标志物的HIF2α、SOX2和Oct4以及肌动蛋白的抗体进行免疫印迹。在图24b中，LNCaP(条纹线)和LNCaP-MnSODK68Q细胞(黑点)通过有和没有ENZ的克隆形成细胞存活测定，并且用乱序(con)或HIF2αshRNA感染来测量。试验一式三份。误差条为±1SEM。*P<0.05。
图25a-25c为显示在乳腺癌细胞中用MnSODK68Q表达模拟MnSOD-K68的乙酰化诱导氟维司群抗性(Fulv-R)和哌柏西利抗性(Palb-R)，并且用锰五氮杂大环歧化酶模拟物药理学模拟去乙酰化赖氨酸68MnSOD的活性均抑制MnSODK68Q乳腺癌细胞的生长并且恢复其对哌柏西利的响应的示意图。图25a-25b显示暴露于以下任一者的MCF7-MnSODK68Q中的克隆形成细胞存活研究：100nM的Fulv(在图25a中)；或0.5μM的Palb(在图25b中)，使用标准方法。图25c显示暴露于GC4419(10μM)或Palb(0.5μM)的MCF7-MnSODK68Q细胞，单独或组合。误差条为±1SEM。试验一式三份进行。***p<0.001。
图26a-26b为显示MnSOD-Ac-K68/ROS/HIF2α轴的失调指导乳腺癌细胞中的干性表型的图像和示意图，其也与对雌激素途径疗法的抗性相关。在图26a中，收获MCF7和MCF7-MnSODK68Q细胞，并且用作为干性标志物的HIF2α、SOX2和OCT4以及肌动蛋白的抗体进行免疫印迹。在图26b中，通过克隆形成细胞存活试验在没有和有Tam暴露的情况下测量MCF7和MCF7-MnSODK68Q细胞，并且用乱序(con)或HIF2αshRNA感染。所有试验一式三份进行。误差条为±1SEM。*P<0.05。
图27a-27c为显示MnSOD-AC-K68/ROS/HIF2α失调指导PanR(对癌症治疗剂的多重疗法抗性)的图像和示意图。图27a显示了与对照(C)MCF7细胞相比，使用抗-MnSOD-K68-Ac、MnSOD、HIF2α或肌动蛋白抗体对MCF7-Cispl-R细胞(顺铂抗性细胞)的免疫印迹。在图27b中，使用Amplex Red测定法，与MCF7细胞相比，在MCF7-Cispl-R细胞中测量ROS。在图27c中，通过克隆形成细胞存活测定在没有和有顺铂暴露的情况下测量MCF7和MCF7-MnSODK68Q细胞，并且用乱序(C)或HIF2αshRNA感染。所有试验一式三份进行。误差条为±1SEM。*P<0.05。
图28a-28f为图像和示意图，其显示作为多重疗法抗性实例的顺铂和多柔比星抗性乳腺癌细胞表现出MnSOD-K68-Ac的增加，并且在非抗性乳腺癌细胞中用MnSODK68Q表达模拟MnSOD-K68的乙酰化增加了它们对化疗的抗性，与PanR表型一致。在图28a-28b中，收集250nM、500nM、1μM顺铂抗性MCF7细胞和500pM、1nM和2nM多柔比星抗性MCF7细胞(在含药物培养基中培养3个月)的细胞裂解物，并且对MnSOD-K68-Ac、MnSOD、肌动蛋白和微管蛋白进行免疫印迹。在图28d-28e中，收集2.5μM、5μM、10μM顺铂抗性T47D细胞和5nM、10nM和20nM多柔比星抗性T47D细胞(在含药物的培养基中培养3个月)的细胞裂解物，并且对MnSOD-K68-Ac、MnSOD、肌动蛋白和微管蛋白进行免疫印迹。在图28c和28f中，将用空载体、MnSODWT、MnSODK68R或MnSODK68Q过表达的10,000个MCF7或T47D细胞铺板在96孔板中，并且在第二天用顺铂(对于MCF7为1μM，对于T47D为10μM)或多柔比星(对于MCF7为2nM，对于T47D为20nM)处理。48小时后，进行MTT测定以确定化疗药物处理后的细胞活力。
图29a-29b为显示在不表达脱乙酰化活性SIRT3的细胞中，通过更多地暴露于MnSOD模拟物GC4419抑制鼠乳腺同种异体移植肿瘤的生长的示意图。图29a显示Sirt3-/--MT-SIRT3DN(脱乙酰化活性无效)，并且图29b显示Sirt3-/--MT-SIRT3WT肿瘤细胞(1.0×106个细胞)双侧注射到裸鼠(n＝10)的后肢中，并且在第4天开始IP注射2mg/kg GC4401和不注射GC4401进行处理。随后将小鼠每周注射荧光素钾(120mg/kg)并且定量信号强度。误差条代表距平均值的一个SD。
图30a-30b为显示用MnSODK68Q表达模拟MnSOD-K68乙酰化诱导乳腺癌细胞中的电离辐射抗性(IRR)，以及用锰五氮杂大环歧化酶模拟物药理学模拟脱乙酰化赖氨酸68MnSOD的活性逆转这种IRR的示意图。图30a显示了将MCF7-MnSODWT和MCF7-MnSODK68Q细胞铺板并且暴露于5Gy电离辐射并且测定克隆形成细胞存活，并且图30b显示将MCF7-MnSODK68Q细胞用或不用5μM GC 4419处理5天并且暴露于5Gy电离辐射，并且测定克隆形成细胞存活。所有试验一式三份进行。误差条表示±1SEM。***p<0.001。通过t-检验分析数据。
图31a-31b为显示LNCaP-IRR(电离辐射抗性)细胞表现出增加的MnSOD-K68-Ac的图像和示意图。图31a显示了连续5天用5Gy IR处理的LNCaP细胞的结果。裂解随后的IRR细胞(LNCaP-IRR细胞)和LNCaP对照，并且通过SDS-PAGE分离提取物，并且用抗-MnSOD-K68-Ac抗体进行免疫印迹。图31b显示了测定提取物的MnSOD活性的结果。所有试验一式三份进行。误差条为±1SEM。**P<0.01。
缩写和定义
提供下述定义和方法，以更好地定义本发明和指导本领域普通技术人员实践本发明。除非另外指出，否则术语应根据相关领域普通技术人员的常规用法理解。
如本文所用，术语“AcK68”是指在MnSOD蛋白的K68残基上具有乙酰化的锰超氧化物歧化酶(MnSOD)的乙酰化形式，并且在本文中还可以称作MnSOD-K68-Ac。
“酰基”意指-COR部分，其中R是如本文定义的烷基、卤代烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基，例如乙酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基等。
“酰基氧基”意指-OCOR部分，其中R是如本文定义的烷基、卤代烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基，例如乙酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基等。
“烷氧基”意指-OR部分，其中R是如本文定义的烷基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基或2-丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基等。
“烷基”意指例如1-6个碳原子的直链饱和单价烃部分或者例如3-6个碳原子的支链饱和单价烃部分，例如C1-C6烷基例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、丁基(包括所有异构体形式)、戊基(包括所有异构体形式)等。
此外，除非另外说明，否则本文所用的术语“烷基”旨在包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”，后者指具有代替烃骨架的一个或多个碳原子上的氢的取代基的烷基部分。事实上，除非另外说明，否则本文提到的所有基团旨在包括取代和未取代的选择。
当与化学部分例如烷基和芳烷基联用时，术语“Cx-y”意指包括链中含有x-y个碳的基团。例如术语Cx-y烷基指取代或未取代的饱和烃基，包括链中含有x-y个碳原子的直链烷基和支链烷基。
除非另外说明，否则“亚烷基”意指例如1-6个碳原子的直链饱和二价烃部分或者例如3-6个碳原子的支链饱和二价烃部分，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、1-甲基亚丙基、2-甲基亚丙基、亚丁基、亚戊基等。
“链烯基”意指例如2-6个碳原子的直链不饱和一价烃部分或者例如3-6个碳原子的支链饱和一价烃部分，例如乙烯基(ethenyl)(乙烯基(vinyl))、丙烯基、2-丙烯基、丁烯基(包括所有异构体形式)、戊烯基(包括所有异构体形式)等。
“烷芳基”意指通过用烷基代替一个或多个氢原子而由芳基部分衍生的一价部分。
“链烯基环烯基”意指通过用环烯基代替一个或多个氢原子而由链烯基部分衍生的一价部分。
“链烯基环烷基”意指通过用链烯基代替一个或多个氢原子而由环烷基部分衍生的一价部分。
“烷基环烯基”意指通过用烷基代替一个或多个氢原子而由环烯基部分衍生的一价部分。
“烷基环烷基”意指通过用烷基代替一个或多个氢原子而由环烷基部分衍生的一价部分。
“炔基”意指例如2-6个碳原子的直链不饱和一价烃部分或者例如3-6个碳原子的支链饱和一价烃部分，例如乙炔基、丙炔基、丁炔基、异丁炔基、己炔基等。
“烷氧基”意指通过用羟基代替一个或多个氢原子而由烷基部分衍生的一价部分。
“氨基”意指-NRaRb基团，其中Ra和Rb独立地是氢、烷基或芳基。
如本文所用，“抗体”包括IgG、IgM、IgA、IgD或IgE类抗体，或其片段或衍生物，包括Fab、F(ab’)2、Fd和单链抗体、双体、双特异性抗体和双功能抗体。抗体可以为单克隆抗体、多克隆抗体、亲和纯化的抗体或其混合物，其对期望表位或由其衍生的序列表现出足够的结合特异性。抗体也可以为嵌合抗体。可以通过连接本领域已知的一种或多种化学、肽或多肽部分来衍生抗体。抗体可以与化学部分缀合。抗体可以为人或人源化抗体。
“芳烷基”意指通过用芳基代替一个或多个氢原子而由烷基部分衍生的一价部分。
“芳基”意指6-10个环原子的一价单环或双环芳族烃部分，例如苯基或萘基。
“环”意指3-10个碳原子的碳环饱和一价烃部分。
“环烷基”意指3-10个碳原子的环状饱和一价烃部分，例如环丙基、环丁基、环戊基或环己基等。
“环烷基烷基”意指通过用环烷基代替一个或多个氢原子而由烷基部分衍生的一价部分，例如环丙基甲基、环丁基甲基、环戊基乙基或环己基乙基等。
“环烷基环烷基”意指通过用环烷基代替一个或多个氢原子而由环烷基部分衍生的一价部分。
“环烯基”意指3-10个碳原子的环状单不饱和一价烃部分，例如环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基或环己烯基等。
“环烯基烷基”意指通过用环烯基代替一个或多个氢原子而由烷基部分衍生的一价部分，例如环丙烯基甲基、环丁烯基甲基、环戊烯基乙基或环己烯基乙基等。
“醚”意指通过用烷氧基代替一个或多个氢原子而由烷基部分衍生的一价部分。
“卤代”意指氟代、氯代、溴代或碘代，优选氟代或氯代。
“杂环”或“杂环基”意指4-8个环原子的饱和或不饱和单价单环基团，其中一个或两个环原子是选自N、O或S(O)n的杂原子(其中n是0-2的整数)，剩余环原子是C。杂环基环任选与本文定义的(一个)芳基或杂芳基环稠合，条件是芳基和杂芳基环是单环的。与单环芳基或杂芳基环稠合的杂环基环在本申请中还称作“双环杂环基”环。此外，杂环基环的一个或两个环碳原子可任选被-CO-基团替代。更特别是，术语杂环基包括但不限于吡咯烷子基、哌啶子基、高哌啶子基(homopiperidino)、2-氧代吡咯烷基、2-氧代哌啶基、吗啉代、哌嗪子基、四氢吡喃基、硫代吗啉代等。当杂环基环是不饱和的时，其可含有一个或两个环双键，条件是环不是芳族的。当杂环基是饱和环并且不与上述芳基或杂芳基环稠合时，其在本文中还称作饱和单环杂环基。
“杂芳基”意指5-10个环原子的单价单环或双环芳族部分，其中一个或多个、优选1个、2个或3个环原子是选自N、O或S的杂原子，剩余环原子是碳。代表性实例包括但不限于吡咯基、吡唑基、噻吩基、噻唑基、咪唑基、呋喃基、吲哚基、异吲哚基、
Figure BDA0004113464730000161
唑基、异
Figure BDA0004113464730000162
唑基、苯并噻唑基、苯并
Figure BDA0004113464730000163
唑基、苯并咪唑基、喹啉基、异喹啉基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三唑基、四唑基等。
“硝基”意指-NO2。
本文所用的“多重疗法抗性”是指表现出此类抗性的癌症，其特征在于对两种或多种抗癌疗法的抗性，使得癌症对用其治疗没有反应。此类抗癌疗法的实例可以包括化疗、放疗、用抑制激素受体途径的活性剂例如内分泌剂的疗法和用细胞周期抑制剂例如CDK4/6抑制剂的疗法。此类响应失败或响应停止可以通过本领域普通技术人员理解的任何数量的成像模式来确定，包括但不限于x-射线成像、计算机断层扫描、磁共振成像、超声、正电子发射断层摄影术、放射性核素成像或视觉观察；或通过指示癌症活性水平的血浆或组织生物标志物，包括但不限于PSA、PSMA、CA19-9、CA-125；或通过任何数量的方法(包括但不限于基因组测试、基因组筛选和离体分析)离体测试癌细胞对疗法的响应来进行预处理。
“有机硫”意指单价部分-SR基团，其中R是氢、烷基或芳基。
“取代的烷基”、“取代的环”、“取代的苯基”、“取代的芳基”、“取代的杂环”和“取代的氮杂环”分别意指烷基、环、芳基、苯基、杂环或含氮杂环，其任选被1个、2个或3个取代基例如独立地选自烷基、烷氧基、烷氧基烷基、卤代、羟基、羟基烷基或有机硫的取代基取代。通常，术语“取代的”包括被C1-4烷基、C2-4链烯基、卤素、醇和/或胺中的任何一个或多个取代的基团。
“硫醚”意指通过用-SR基团替代1个或多个氢原子而由烷基部分衍生的一价部分，其中R为烷基。
如本文所用，(i)本文和附图中作为化合物401、4401或GC4401提到的化合物是指相同的化合物，(ii)本文和附图中作为化合物403、4403或GC4403提到的化合物是指相同的化合物，(iii)本文和附图中作为化合物419、4419或GC4419提到的化合物是指相同的化合物，和(iv)本文和附图中作为化合物444、4444或GC4444提到的化合物是指相同的化合物。
此外，在涉及治疗方法时，术语“基本上由……组成”的使用意指该方法基本上不涉及提供足以提供治疗的量和/或条件的另外的疗法和/或另外的活性剂，并且所述的另外的疗法和/或另外的活性剂不是权利要求中所述的疗法和/或活性剂。类似地，在涉及用于治疗的试剂盒时，术语“基本上由……组成”的使用意指该试剂盒基本上不包括以足以提供治疗的量和/或条件提供的另外的疗法和/或另外的活性剂，并且所述的另外的疗法和/或另外的活性剂不是权利要求中所述的疗法和/或活性剂。
详述
在一个实施方案中，本公开的方面涉及使用五氮杂大环状环配合物治疗具有多重疗法抗性的癌症。具有多重疗法抗性的癌症表现出对两种或多种抗癌疗法的抗性，使得癌症不能对用其治疗作出响应。例如，癌症可以表现出对抗癌疗法的抗性，所述抗癌疗法可以包含化疗、放疗、用抑制激素受体途径的活性剂例如内分泌剂的疗法和用细胞周期抑制剂例如CDK4/6抑制剂的疗法。具有此类多重疗法抗性的癌症可能难以治疗，因为它们可能对通常为癌症开出的标准治疗方案无响应。本公开的方面还涉及使用五氮杂大环状环配合物、任选与另外的治疗剂组合治疗具有某些肿瘤特征的癌症。
具体地，已经预料不到地发现某些五氮杂大环状环配合物能够治疗具有多重疗法抗性的癌症患者。根据本文的某些实施方案，多重疗法抗性癌症的特征可在于具有在MnSOD蛋白的K68残基处具有乙酰化的锰超氧化物歧化酶(MnSOD)的乙酰化形式的水平增加，和/或SIRT3蛋白的水平降低(参见，Zhu等人,Lysine 68Acetylation Directs MnSOD as aTetrameric Detoxification Complex Versus a Monomeric Tumor Promoter,NatureCommunications,10:2399(2019))。根据某些其它方面，已经预料不到地发现，某些五氮杂大环状环配合物可能能够治疗患有癌症的患者，所述癌症的特征在于具有指示干性谱系可塑性的缺氧诱导因子2α(HIF2α)的表达水平增加。例如，在某些实施方案中，五氮杂大环状环配合物可能能够治疗对某些治疗剂具有固有抗性的癌症，和/或可能能够减少和甚至停止对某些治疗剂例如内分泌治疗剂例如他莫昔芬和/或恩杂鲁胺和其它药剂的抗性的发展，并且因此增加其有效性。也就是说，在某些方面，五氮杂大环状环配合物可以在治疗开始之前向对用治疗剂(例如他莫昔芬)治疗具有抗性的肿瘤提供治疗，和/或向在用此类治疗剂治疗过程中已经产生抗性的肿瘤提供治疗。
根据其它实施方案，就肿瘤对化疗剂的固有和/或获得性抗性而言，就降低对用于治疗癌症的其它治疗剂例如化疗剂包括顺铂和多柔比星的抗性并且因此增加其有效性而言，获得了类似的效果。根据某些其它实施方案，本文所述的某些五氮杂大环状环配合物能够为具有特征在于相对高水平的例如AcK68和/或HIF2α和/或相对低水平的SIRT3和/或本文所述的其它生物标志物的肿瘤特征的癌症提供作为唯一疗法的治疗(即不需要施用其它治疗剂，例如内分泌剂或化疗剂)。
根据某些实施方案，锰超氧化物歧化酶(MnSOD)起肿瘤抑制剂的作用；然而，一旦发生肿瘤发生，临床数据启示MnSOD水平与更具侵袭性的人肿瘤相关，这意味着MnSOD在代谢调节中的潜在双重功能。已经预料不到地发现MnSOD-K68乙酰化(Ac)模拟突变体(MnSODK68Q)作为肿瘤促进剂起作用。有意义地，在多种乳腺癌和原代细胞类型中，MnSODK68Q的表达伴随着MnSOD的化学计量从已知的同源四聚体复合物变为单体形式。使用MnSOD-K68Q Ac-模拟物或物理上K68-Ac(MnSOD-K68-Ac)的生化试验启示，这些单体起过氧化物酶的作用，不同于已建立的MnSOD超氧化物歧化酶活性。表达MnSODK68Q的细胞表现出对他莫昔芬(Tam)的抗性，并且针对Tam抗性选择的细胞表现出增加的K68-AC和单体MnSOD。这些结果启示用于Tam抗性、癌发生和肿瘤进展的MnSOD-K68-Ac代谢途径(参见，Zhu等人,Lysine 68Acetylation Directs MnSOD as a Tetrameric Detoxification ComplexVersus a Monomeric Tumor Promoter,Nature Communications,10:2399(2019))。
根据进一步的实施方案，已经预料不到地发现，具有增加的AcK68水平的肿瘤也表现出破坏的细胞代谢、增加的活性氧物质(ROS)水平和稳定的HIF2α水平，这可以导致谱系可塑性表型，从而产生对治疗剂治疗具有抗性的肿瘤细胞，例如对内分泌剂例如恩杂鲁胺具有抗性的前列腺癌细胞。在又一个实施方案中，已经预料不到地发现生理性MnSOD-K68-AC轴的失调和/或破坏可以导致某些癌症(例如ER+乳腺癌)中的化疗抗性表型，因为AcK68表达指导线粒体形态和超微结构的失调，并且破坏线粒体代谢。在另一个实施方案中，已经预料不到地发现，生理学MnSOD-K68-AC轴的失调和/或破坏可以促进干性谱系可塑性，这可以导致癌症的侵袭性甚至转移增加，并且还可以导致癌症对一种或多种抗癌治疗剂的抗性。
根据某些实施方案，治疗哺乳动物个体的癌症的方法，所述癌症表征为具有多重疗法抗性，该方法包括：向哺乳动物个体施用治疗有效量的相应于下式(I)的五氮杂大环状环配合物：
Figure BDA0004113464730000181
其中
M为Mn2+或Mn3+；
R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10独立地为氢、烃基、取代的烃基、杂环基、氨基酸侧链部分或选自以下的部分：-OR11、-NR11R12、-COR11、-CO2R11、-CONR11R12、-SR11、-SOR11、-SO2R11、-SO2NR11R12、-N(OR11)(R12)、-P(O)(OR11)(OR12)、-P(O)(OR11)(R12)和-OP(O)(OR11)(OR12)，其中R11和R12独立地为氢或烷基；
U与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
V与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
W与大环的氮和其所连接的大环的碳原子一起形成具有2-20个环碳原子的芳族或脂环族，取代或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的含氮稠合杂环，条件是当W为稠合的芳族杂环时，连接至为杂环和大环的组成部分的氮的氢和连接至为杂环和大环的组成部分的碳原子的R1和R10不存在；
X和Y表示衍生自任何单齿或多齿配位配体或配体体系或其相应阴离子的适合配体；
Z为抗衡离子；
n为0-3的整数；并且
虚线表示大环的氮原子与过渡金属锰之间的配位键。
根据某些实施方案，多重疗法抗性癌症对选自以下的至少两种疗法具有抗性：用化疗剂治疗、用抑制激素受体途径的治疗剂治疗、用细胞周期抑制剂治疗和用放疗治疗。根据一个实施方案，多重疗法抗性癌症对选自如下的一种或多种疗法具有抗性：用含铂活性剂治疗、用蒽环治疗、用激素受体途径抑制剂治疗、用细胞周期抑制剂治疗和用放疗治疗。根据另一个实施方案，多重疗法抗性癌症对用以下至少一种治疗具有抗性：含铂化疗剂，选自顺铂、奥沙利铂、卡铂、奈达铂、洛铂、庚铂、双环铂、脂铂(lipoplatin)、LA-12、磷铂、菲铂、prolindac、四硝酸三铂、吡铂、沙铂和/或其药学上可接受的盐，和/或蒽环化疗剂，选自多柔比星、柔红霉素、表柔比星和伊达比星和/或其药学上可接受的盐。
根据又一个实施方案，多重疗法抗性癌症对抑制与癌症生长或进展相关的激素受体途径的治疗剂具有抗性。在一个实施方案中，多重疗法抗性癌症对抑制与癌症的生长或进展相关的激素受体途径的治疗剂具有抗性，所述治疗剂靶向雌激素受体途径、孕酮受体途径和雄激素受体途径中的任何一种或多种。在另一个实施方案，多重疗法抗性癌症对靶向雌激素受体途径、孕酮受体途径和雄激素受体途径中的任何一种或多种的治疗剂具有抗性，所述治疗剂选自雌激素受体抑制剂、雌激素受体降解剂/下调剂、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、芳香酶抑制剂、GnRH激动剂、雄激素合成抑制剂、雄激素受体抑制剂和选择性孕酮受体调节剂(SPRM)。在又另一个实施方案中，多重疗法抗性癌症对靶向雌激素受体途径的治疗剂具有抗性，所述治疗剂包括选自如下的至少一种：他莫昔芬、来曲唑、氯米芬、4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、萘福昔定、拉索昔芬、巴多昔芬、奥培米芬、氟维司群、布林司群(brilanestrant)、依拉司群(elacestrant)及其衍生物、盐和/或前药。
在另一个实施方案中，多重疗法抗性癌症对靶向雄激素受体途径的治疗剂具有抗性，所述治疗剂包括选自雄激素受体拮抗剂、雄激素合成抑制剂和抗促性腺激素的任何。在又一个实施方案中，多重疗法抗性癌症对靶向雄激素受体途径的治疗剂具有抗性，所述治疗剂包括选自如下的至少一种：醋酸环丙孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、螺内酯、奥生多龙、醋酸奥沙特隆、氟他胺、比卡鲁胺、尼鲁米特、托匹鲁胺、恩杂鲁胺、阿帕鲁胺、地诺孕素、屈螺酮、美多孕酮(medogestone)、醋酸诺美孕酮、普美孕酮、曲美孕酮、酮康唑、醋酸阿比特龙、赛维罗奈、氨鲁米特、非那雄胺、度他雄胺、依立雄胺(episteride)、α-雌二醇(alfatradial)、醋酸环丙孕酮、美罗孕酮、氟他胺、尼鲁米特、戊双氟酚、亮丙瑞林、西曲瑞克、烯丙雌醇、醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、己酸孕诺酮、己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸奥沙特隆、奥生多龙、雌二醇、雌二醇酯、炔雌二醇、共轭雌激素、己烯雌酚及其衍生物、盐和/或前药。在又另一个实施方案中，多重疗法抗性癌症对靶向孕酮受体途径的治疗剂具有抗性，所述治疗剂包括I型、II型或III型孕酮选择性调节剂(SPRM)，其为选自奥那司酮、米非司酮、洛那立生、阿来司酮、Org31710、Org31806、CDB-2914和CDB-4124及其衍生物、盐和/或前药中的至少一种。
在另一个实施方案中，多重疗法抗性癌症对使用细胞周期抑制剂的疗法具有抗性，所述细胞周期抑制剂包括CDK4/6抑制剂，所述CDK4/6抑制剂包括选自以下的至少一种：哌柏西利、阿贝西利、瑞博西利及其衍生物、盐和/或前药。
根据某些实施方案，提供了在哺乳动物个体中治疗癌症的方法，其中所述癌症包括特征在于以下任一项或多项的肿瘤特征：(i)沉默调节蛋白(SIRT3)蛋白的水平低于第一预定阈值水平，(ii)在赖氨酸68残基处乙酰化的锰超氧化物歧化酶(AcK68)的水平超过第二预定阈值水平，(iii)缺氧诱导因子2α(HIF2α)的表达水平超过指示干性谱系可塑性的第三预定阈值水平，(iv)Ki-67蛋白的水平超过第四预定阈值水平，(v)OCT4水平超过第五预定阈值水平，(vi)SOX2水平超过第六预定阈值水平，和(vii)单体与四聚体MnSOD的比率超过第七预定阈值水平，并且其中该方法包括向哺乳动物个体施用治疗有效量的相应于本文所述的式(I)的五氮杂大环状环配合物。具有满足标准(i)-(vii)中任一项的肿瘤特征的癌症可以例如对治疗具有抗性，所述治疗包括用化疗剂治疗、用抑制激素受体途径的治疗剂(例如内分泌剂)治疗、用细胞周期抑制剂(例如CDK4/6抑制剂)治疗和用电离辐射治疗的任何一种或多种。根据某些实施方案，五氮杂大环状环配合物的施用可以降低癌症对治疗的抗性，以改善其功效。
根据又一个实施方案，提供了治疗哺乳动物个体的癌症的方法，其中该方法包括选择适合用相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物治疗的个体。例如，可以基于表现出指示对此类治疗的响应性的可能性的生物标志物(例如肿瘤特征)来选择个体。在另一个实例中，个体可以是对治疗具有固有抗性和/或对治疗具有发展抗性的个体，所述治疗包括用化疗剂治疗、用抑制激素受体途径的治疗剂(例如内分泌剂)治疗、用细胞周期抑制剂(例如CDK4/6抑制剂)治疗和用电离辐射治疗中的任何一种或多种。根据一个实施方案，该方法可以包括通过从个体获得包含肿瘤细胞的测试组织样品并且测试组织样品中某些生物标志物的存在来选择个体。可以例如通过活组织检查或其它常规方法获得测试组织样品。根据某些方面，组织样品选自患有一种类型的癌症的个体，其中牵涉AcK68、SIRT3和/或HIF2α的任意一种或多种的失调，如本文进一步描述的，例如乳腺癌和前列腺癌中的任意一种或多种。SIRT3可以是例如线粒体SIRT3的水平。SIRT3是人中由SIRT3基因[沉默调节蛋白(沉默交配型信息调节2同源物)3(啤酒糖酵母(S.cerevisiae))]编码的蛋白质，并且SIRT3也可称为NAD依赖性脱乙酰酶沉默调节蛋白-3。组织样品还可以选自患有引起Ki-67蛋白(也称为抗原Ki-67或MKI67，由MKI67基因编码)、OCT4蛋白(八聚体结合转录因子4，也称为POU5F1(POU结构域，5类，转录因子1)，由POU5F1基因编码)和/或SOX2蛋白((性别决定区Y)-盒2，也称为SRY)中任何的失调的癌症类型的个体。根据又一个实施方案，组织样品可以选自患有引起单体与四聚体MnSOD(锰超氧化物歧化酶)的比率失调的癌症类型的个体。
根据一个实施方案，可以通过评估组织样品以确定包含以下任何一种或多种的标准来测试组织样品：(i)在组织样品的肿瘤细胞中沉默调节蛋白(SIRT3)蛋白的水平是否低于第一预定阈值水平，(ii)在赖氨酸68残基处乙酰化的锰超氧化物歧化酶(AcK68)的水平是否超过第二预定阈值水平，和(iii)低氧诱导因子2α(HIF2α)的表达水平是否超过指示干性谱系可塑性的第三预定阈值水平。(iv)Ki-67蛋白的水平是否超过第四预定阈值水平，(v)OCT4蛋白的水平是否超过第五预定阈值水平，(vi)SOX2蛋白的水平是否超过第六预定阈值水平，和(vii)单体与四聚体MnSOD的比率是否超过第七预定阈值水平。在另一个实施方案中，诊断方法可以与用五氮杂大环状环配合物治疗分开提供，诊断方法包括分析组织样品以确定本文所述的任何标准(i)-(vii)。
例如，在一个实施方案中，可以测试组织样品以确定是否满足表现出相对低水平的SIRT3的标准(i)，如低于预定阈值水平所示，因为该低水平可指示肿瘤对用式(I)五氮杂大环状环配合物治疗的可能响应性。作为另一个实例，可以测试组织样品以确定肿瘤细胞表现出相对高水平的AcK68是否满足标准(ii)，如通过超过预定阈值水平所指示的，因为该高水平可以指示肿瘤对用式(I)的五氮杂大环状环配合物治疗的可能响应性。作为又一个实例，可以测试组织样品以确定肿瘤细胞表现出相对高水平的HIF2α是否满足标准(iii)，如通过超过预定阈值水平所指示的，因为该高水平可以指示肿瘤对用式(I)的五氮杂大环状环配合物治疗的可能响应性。作为又一个实例，可以测试组织样品以确定肿瘤细胞表现出相对高水平的Ki-67蛋白是否满足标准(iv)，如通过超过预定阈值水平所指示的，因为该高水平可以指示肿瘤对用式(I)的五氮杂大环状环配合物治疗的可能响应性。在又一个实例中，可以测试组织样品以确定肿瘤细胞表现出相对高水平的OCT4蛋白是否满足标准(v)，如通过超过预定阈值水平所示，因为该高水平可以表明肿瘤对用式(I)的五氮杂大环状环配合物治疗的可能响应性。又一个实例，可以测试组织样品以确定肿瘤细胞表现出相对高水平的SOX2蛋白是否满足标准(vi)，如通过超过预定阈值水平所指示的，因为该高水平可以指示肿瘤对用式(I)的五氮杂大环状环配合物治疗的可能响应性。在又一个实施方案中，可以测试组织样品以确定肿瘤细胞表现出单体与四聚体MnSOD的相对高比率是否满足标准(vii)，如通过超过预定阈值水平所指示的，因为该高水平可以指示肿瘤对用式(I)的五氮杂大环状环配合物治疗的可能响应性。
因此，在某些实施方案中，治疗方法可以包括如果满足标准(i)-(vii)中的任何一个或多个，则确定个体适合于治疗。在选择作为适合治疗的个体的情况下，治疗方法可以包括施用治疗有效量的相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物，任选与其它治疗性治疗组合，例如内分泌治疗剂和/或化疗剂，和/或其它适合的活性剂或疗法，例如本文所述的那些。
根据某些实施方案，生物标志物例如AcK68、SIRT3和/或HIF2α中的任何一种或多种的水平可以通过适合的方法测定，例如通过免疫染色或其它类似的方法。在免疫染色方法中，使用针对感兴趣的蛋白质和/或部分(例如蛋白质的特定区域)的抗体来检测样品中的特定靶标(例如蛋白质)。例如，在一个实施方案中，用于免疫染色的抗体可以包括抗-AcK68单克隆抗体，其特异性结合AcK68的包含乙酰化赖氨酸残基的区域(表位)。与样品(例如组织或细胞)中的蛋白质结合的抗体的存在可以通过多种方法确定，包括通过用可以检测的部分(例如可通过荧光检测器检测的荧光染料，和/或可以显色以产生可通过例如光学显微镜的方法以及其它方法检测的有色产物的过氧化物酶)标签或标记抗体。根据另外的方面，可以使用用可检测部分(例如过氧化物酶或荧光染料)标记和/或加标签并且结合靶向样品中感兴趣的蛋白质的一抗的一种或多种二抗。根据更进一步的方面，一抗可以用小分子标记，所述小分子与连接至酶或荧光部分的高亲和力结合配偶体相互作用，例如通过使用生物素-链霉亲和素相互作用。免疫染色方法的实例可以包括用于染色组织样品的免疫组织化学(IHC)方法，或用于染色细胞的免疫细胞化学染色方法。可以用于实施和/或补充免疫染色技术的其它技术可以包括流式细胞术技术、蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫电子显微镜。根据某些实施方案，还可以使用免疫沉淀法，其使用抗体从样品中分离出靶蛋白用于进一步分析(例如通过偶联到珠粒)。根据进一步的实施方案，确定感兴趣的靶蛋白的水平的其它间接方法，例如通过确定蛋白质的活性水平，或通过确定指示表达、蛋白质活化和/或失活的其它因子。
根据一个实施方案，选择个体进行治疗包括通过免疫染色方法测定AcK68的水平，包括将组织与抗-AcK68单克隆抗体接触，并且测定与组织样品中的AcK68结合的抗-AcK68单克隆抗体的水平。根据另一个实施方案，选择个体进行治疗包括通过免疫染色方法测定SIRT3蛋白的水平，包括使组织与抗-SIRT3单克隆抗体接触，并且测定组织样品中结合SIRT3的抗-SIRT3单克隆抗体的水平。在另一个实施方案中，选择个体进行治疗包括通过免疫染色方法测定HIF2α蛋白的水平，包括使组织与抗-HIF2α单克隆抗体接触，并且测定与组织样品中的HIF2α结合的抗-HIF2α单克隆抗体的水平。在另一个实施方案中，选择个体进行治疗包括通过免疫染色方法测定Ki-67蛋白的水平，包括使组织与抗-Ki-67单克隆抗体接触，并且测定组织样品中与Ki-67结合的抗-Ki-67单克隆抗体的水平。在又另一个实施方案中，选择个体进行治疗包括通过免疫染色方法测定OCT4蛋白的水平，包括使组织与抗-OCT4单克隆抗体接触，并且测定所述组织样品中与OCT4结合的抗-OCT4单克隆抗体的水平。在另一个实施方案中，选择个体进行治疗包括通过免疫染色方法测定SOX2蛋白的水平，包括使组织与抗-SOX2单克隆抗体接触，并且测定与组织样品中的SOX2结合的抗-SOX2单克隆抗体的水平。在另一个实施方案中，选择个体进行治疗包括通过免疫染色方法测定四聚体和单体SOD蛋白的水平，包括使组织与抗-四聚体SOD单克隆抗体接触，并且测定组织样品中与四聚体SOD结合的抗-四聚体SOD单克隆抗体的水平，使组织与抗-单体SOD单克隆抗体接触，并且测定组织样品中与单体SOD结合的抗-单体SOD单克隆抗体的水平，并且测定单体与四聚体MnSOD的比率。
根据一个实施方案，提供了用于治疗哺乳动物个体的癌症的试剂盒。根据某些方面，试剂盒包含用于分析从个体获得并且包含肿瘤细胞的组织样品的测定法，其中该测定法能够确定包含以下任何一种或多种的标准：(i)在组织样品的肿瘤细胞中沉默调节蛋白(SIRT3)蛋白的水平是否低于第一预定阈值水平，(ii)在赖氨酸68残基处乙酰化的锰超氧化物歧化酶(AcK68)的水平是否超过第二预定阈值水平，(iii)缺氧诱导因子2α(HIF2α)的表达水平是否超过指示干性谱系可塑性的第三预定阈值水平，(iv)Ki-67蛋白的水平是否超过第四预定阈值水平，(v)OCT4蛋白的水平是否超过第五预定阈值水平，(vi)SOX2蛋白的水平是否超过第六预定阈值水平，和(vii)单体与四聚体MnSOD的比率是否超过第七预定阈值水平。根据其它方面，试剂盒可以进一步包含治疗有效量的相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物，用于在通过测定确定满足标准(i)-(vii)中的任一项的情况下治疗癌症。
在一个实施方案中，测定法包括免疫染色测定法，例如免疫组织化学测定法或相应于任何本文所述的免疫染色技术，用于测定组织样品中靶蛋白的水平。在另外的实施方案中，测定法可以包括能够选择性结合至AcK68以测定其水平的抗-AcK68抗体。在另一个实施方案中，测定法可以包括能够选择性结合SIRT3以测定其在组织样品中的水平的抗-SIRT3抗体。在另一个实施方案中，测定法可以包括能够选择性结合HIF2α以测定其在组织样品中的水平的抗-HIF2α抗体。在另一个实施方案中，测定法可以包括能够选择性结合Ki-67以确定组织样品中其水平的抗-Ki-67抗体。在另一个实施方案中，测定法可以包括能够选择性结合OCT4以确定其在组织样品中的水平的抗-OCT4抗体。在另一个实施方案中，测定法可以包括能够选择性结合SOX2以确定其在组织样品中的水平的抗-SOX2抗体。在另一个实施方案中，测定法可以包括能够选择性结合单体MnSOD以测定其在组织样品中的水平的抗-单体MnSOD抗体，和能够选择性结合四聚体MnSOD以测定其在组织样品中的水平的抗-四聚体MnSOD抗体。
可选地或另外地，测定可以包括利用免疫染色以外的技术直接或间接评估靶蛋白水平的测试。在更进一步的实施方案中，试剂盒还可以包含使用测定法测定靶蛋白水平中的任何一种或多种的说明书，基于测定结果评估是否满足标准(i)-(vii)中的任何一种的说明书，和/或施用五氮杂大环状环配合物的说明书。在另外的实施方案中，试剂盒可以包含用于从个体获得组织样品的仪器和/或试剂。试剂盒还可以包含用于制备用于分析的组织样品的一种或多种工具和/或试剂，例如用于形成福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片的工具和/或试剂。试剂盒还可以包含用于进行组织分析的一种或多种工具和/或试剂，例如一抗、二抗、标记物、封闭试剂、缓冲液、染料、过氧化物酶、显色试剂等的一种或多种。在另一个实施方案中，可以五氮杂大环状环配合物分开提供诊断试剂盒，诊断试剂盒包含用于分析组织样品的测定法以确定如本文所述的标准(i)-(vii)中的任一个，例如在诊断与治疗分开进行的情况下。
根据一个实施方案，将生物标志物(i)-(vii)中的一种或多种的水平，例如AcK68、SIRT3和/或HIF2α的水平与阈值水平进行比较，以确定个体是否患有将受益于式(I)五氮杂大环状环配合物(单独或与其它治疗剂组合)治疗的肿瘤类型。也就是说，可以将从个体获得的肿瘤细胞中测定的靶蛋白(例如AcK68、SIRT3和/或HIF2α)的水平与预定的阈值水平进行比较，以确定是否满足标准(i)-(vii)中的任何一个。在一个实施方案中，与阈值水平的比较可以涉及评估肿瘤细胞中任何一种或多种靶蛋白的检测水平与相同组织类型的“正常”或非癌组织中的水平的比率。例如，当检测值与“正常”值的比率处于或超过预定值时，可以满足阈值。在另一个实施方案中，与阈值水平的比较可以涉及将肿瘤细胞中任何一种或多种靶蛋白的检测水平的值与相同组织类型的“正常”或非癌组织中的水平的值进行比较，例如与超过“正常”或非癌组织的水平的标准偏差的预定水平进行比较。还可以提供检测到的水平与阈值水平的其它比较。例如，可以基于观察到肿瘤对治疗的抗性的水平来提供阈值水平的其它度量。在一个实施方案中，阈值水平是偏离从多个不同个体获得的相同组织类型的非癌组织中相应靶蛋白的平均水平的水平。例如，平均水平可以是在从至少6个不同个体获得的非癌(正常)组织中测量的相应蛋白质靶标的平均值，所述个体的组织类型与癌组织的组织类型相同(例如，将癌性乳腺组织与非癌性乳腺组织进行比较等)。每种相应靶蛋白的平均水平可以包括所测试的相应组织类型中该靶蛋白的正常分数。
根据某些实施方案，用于与肿瘤细胞中靶蛋白的检测水平比较的阈值水平可以设定在指示用五氮杂大环状环配合物治疗将获得益处的水平的水平。在一个实施方案中，可以根据肿瘤细胞中靶蛋白的检测水平与非癌组织中该蛋白的正常评分的标准偏差的关系来设定相应靶蛋白的阈值水平。也就是说，阈值水平可以被设置为与正常分数的一个标准偏差的至少一半、与正常分数的至少一个标准偏差、与正常分数的至少一个半标准偏差、与正常分数的至少两个标准偏差、与正常分数的至少两个半标准偏差、与正常分数的至少三个标准偏差、与正常分数的至少四个标准偏差和/或与正常分数的至少五个标准偏差的水平。因此，在预定阈值之外的一种或多种靶蛋白的检测水平将指示肿瘤组织可能对五氮杂大环状环配合物治疗有响应。根据又一个实施方案，正常分数可以包括在大群体中获得的平均值，例如大群体成员的值，用于特定类型的免疫染色测定，以提供可以在后续测定中参考的参考值。根据进一步的实施方案，任何一种或多种靶蛋白(例如AcK68、SIRT3和/或HIF2α)的阈值水平可以根据提供靶水平和治疗适用性之间的相关性的替代诊断方法和/或诊断相关性来设定。例如，阈值水平可以根据提供与本文所述的免疫染色方法基本上等同的结果的方法来设定，所述方法可以是等同的，因为它们提供靶蛋白水平的评估以允许确定肿瘤细胞是否对抗癌治疗剂具有抗性(例如，基于SIRT3、AcK68和/或HIF2α水平，或其它诊断结果)。
根据某些实施方案，通过免疫染色技术测定肿瘤细胞中任何一种或多种靶蛋白(例如AcK68、SIRT3和/或HIF2α)的水平。根据某些方面，可以将靶蛋白的水平与根据相同的免疫染色技术确定的相应阈值水平进行比较，例如通过获得来自至少6个不同个体的与肿瘤细胞(例如，乳腺癌细胞、前列腺癌细胞)相同组织类型的非癌组织的水平，以确定正常评分。根据一个实施方案，肿瘤组织中沉默调节蛋白(SIRT3)蛋白的活性的第一预定阈值水平是低于与肿瘤组织相同类型的非癌组织的正常评分的一个标准偏差的水平，其中正常评分通过取来自至少6个不同个体的相同组织类型的至少6个非癌组织样品的平均值来确定，如通过免疫染色所确定的。根据另一个实施方案，在赖氨酸68残基处乙酰化的锰超氧化物歧化酶(AcK68)的第二预定阈值水平是高于与肿瘤组织相同类型的非癌组织的正常评分的一个标准偏差的水平，其中正常评分通过取来自至少6个不同个体的相同类型的至少6个非癌组织样品的平均值来确定，如通过免疫染色所确定的。根据又一个实施方案，低氧诱导因子2α(HIF2α)的表达水平的第三预定阈值水平是高于与肿瘤组织相同类型的非癌组织的正常评分的一个标准偏差的水平，其中正常评分通过取来自至少6个不同个体的相同类型的至少6个非癌组织样品的平均值来确定，如通过免疫染色所确定的。根据另一个实施方案，Ki-67蛋白的表达水平的第四预定阈值水平是高于与肿瘤组织相同类型的非癌组织的正常评分的一个标准偏差的水平，其中正常评分通过取来自至少6个不同个体的相同类型的至少6个非癌组织样品的平均值来确定，如通过免疫染色所测定的。根据另一个实施方案，OCT4蛋白的表达水平的第五预定阈值水平是高于与肿瘤组织相同类型的非癌组织的正常评分的一个标准偏差的水平，其中正常评分通过取来自至少6个不同个体的相同类型的至少6个非癌组织样品的平均值来确定，如通过免疫染色所确定的。根据另一个实施方案，SOX2蛋白的表达水平的第六预定阈值水平是高于与肿瘤组织相同类型的非癌组织的正常评分的一个标准偏差的水平，其中所述正常评分通过取来自至少6个不同个体的相同类型的至少6个非癌组织样品的平均值来确定，如通过免疫染色所确定的。根据另一个实施方案，单体MnSOD蛋白的表达水平与四聚体MnSOD蛋白的表达水平比率的第七预定阈值水平是高于与肿瘤组织相同类型的非癌组织的正常评分的一个标准偏差的水平，其中正常评分通过取来自至少6个不同个体的相同类型的至少6个非癌组织样品的平均值来确定，如通过免疫染色所确定的。在其它实施方案中，可以将相应的阈值水平设置为与正常分数的标准偏差的不同倍数和/或分数，或者根据其它相关性，如上所述。
根据一个实施方案，本文的治疗方法可以包含在施用式(I)五氮杂大环状环配合物之前、与之同时或之后施用抗癌疗法例如电离放疗和/或治疗性抗癌剂，所述治疗性抗癌剂包括化疗剂、抑制与癌症生长或进展相关的激素受体途径的治疗剂(例如激素治疗剂例如内分泌剂)和用细胞周期抑制剂(例如CDK4/6抑制剂)治疗的任何一种或多种。此类其它治疗剂也可作为本文所述的任何试剂盒的一部分包含在内，例如以提供与式(I)五氮杂大环状环配合物的共同疗法，和/或试剂盒可以包含施用疗法的说明书。
在一个实施方案中，抗癌治疗剂包括化疗剂，所述化疗剂包括任何含铂化疗剂和蒽环化疗剂，和/或其组合。在另一个实施方案中，治疗剂包括至少一种选自顺铂、奥沙利铂、卡铂、奈达铂、洛铂、庚铂、双环铂、脂铂、LA-12、磷铂、菲铂、prolindac、四硝酸三铂、吡铂、沙铂和/或其药学上可接受的盐的含铂化疗剂，和/或选自多柔比星、柔红霉素、表柔比星和伊达比星和/或其药学上可接受的盐的蒽环化疗剂。
根据又一个实施方案，治疗性抗癌剂可以包括抑制与癌症生长或进展相关的激素受体途径的治疗剂(例如内分泌治疗剂)。根据一个实施方案，抑制与癌症生长或进展相关的激素受体途径的治疗剂靶向雌激素受体途径、孕酮受体途径和雄激素受体途径中的任何一种或多种(例如，激素治疗剂和/或内分泌剂)。例如，靶向雌激素受体途径、孕酮受体途径和雄激素受体途径中的任何一种或多种的治疗剂可以包括选自雌激素受体抑制剂、雌激素受体降解剂/下调剂、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、芳香酶抑制剂和GnRH激动剂的任何，并且还可提供其组合。根据一个实施方式，靶向雌激素受体途径的治疗剂包括选自他莫昔芬、来曲唑、氯米芬、4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、萘福昔定、拉索昔芬、巴多昔芬、奥培米芬、氟维司群、布来诺司群、依拉司群及其衍生物、盐和/或前药中的至少一种。根据另一个实施方案，靶向雄激素受体途径的治疗剂包括选自雄激素受体拮抗剂、雄激素合成抑制剂和抗促性腺激素的任何。例如，靶向雄激素受体途径的治疗剂可以包括选自以下的至少一种：醋酸环丙孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、螺内酯、奥生多龙、醋酸奥沙特隆、氟他胺、比卡鲁胺、尼鲁米特、托匹芦胺、恩杂鲁胺、阿帕鲁胺、地诺孕素、屈螺酮、美多孕酮、醋酸诺美孕酮、普美孕酮、曲美孕酮、酮康唑、醋酸阿比特龙、赛维罗奈、氨鲁米特、非那雄胺、度他雄胺、episteride、alfatradial、醋酸环丙孕酮、美罗孕酮、氟他胺、尼鲁米特、戊双氟酚、亮丙瑞林、西曲瑞克、烯丙雌醇、醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、己酸孕诺酮、己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸奥沙特隆、奥生多龙、雌二醇、雌二醇酯、炔雌醇、共轭雌激素、己烯雌酚及其衍生物、盐和/或前药。根据另一个实施方案，靶向孕酮受体途径的治疗剂可以包括I型、II型或III型孕酮选择性调节剂(SPRM)，其为选自奥那司酮、米非司酮、洛那立生、阿来司酮、Org31710、Org31806、CDB-2914和CDB-4124及其衍生物、盐和/或前药中的至少一种(也参见Antiprogestins in Breast Cancer Treatment:Are We Ready？Lanari等人,Endocrine-Related Cancer(2012)19R35-R500。根据又一个实施方案，抗癌治疗剂包括细胞周期抑制剂，例如CDK4/6抑制剂，例如选自哌柏西利、abemaciclib、瑞博西利及其衍生物、盐和/或前药中的至少一种。
在一个实施方案中，提供了治疗肿瘤的方法，所述肿瘤在患有该病的哺乳动物个体中对治疗性抗癌剂例如化疗剂、抑制激素受体途径的治疗剂和细胞周期抑制剂中的任何一种或多种具有抗性。例如，对抗癌剂具有抗性的肿瘤可以是具有肿瘤特征的肿瘤，其特征在于以下中的任何一种或多种：(i)沉默调节蛋白(SIRT3)蛋白的水平低于第一预定阈值水平，(ii)K68-乙酰化锰超氧化物歧化酶(MnSODK68)的水平超过第二预定阈值水平，(iii)缺氧诱导因子2α(HIF2α)的表达水平超过指示干性谱系可塑性的第三预定阈值水平，(iv)Ki-67蛋白的水平超过第四预定阈值水平，(v)OCT4蛋白的水平超过第五预定阈值水平，(vi)SOX2蛋白的水平超过第六预定阈值水平，和(vii)单体与四聚体MnSOD的比率超过第七预定阈值水平。也就是说，由(i)-(vii)中的任一个表征的肿瘤特征可以指示肿瘤细胞对抗癌剂治疗的抗性。
根据某些方面，该方法可以包括通过从患者获得测试组织样品来选择作为治疗的适合个体的个体，测试组织样品包括肿瘤细胞，并且评估组织样品以确定包含以下任何一项或多项的标准：(i)在组织样品的肿瘤细胞中沉默调节蛋白(SIRT3)蛋白质活性的水平是否低于第一预定阈值水平，(ii)在赖氨酸68残基处乙酰化的锰超氧化物歧化酶(AcK68)的水平是否超过第二预定阈值水平，和(iii)低氧诱导因子2α(HIF2α)的表达水平是否超过指示干性谱系可塑性的第三预定阈值水平，(iv)Ki-67蛋白的水平是否超过第四预定阈值水平，(v)OCT4蛋白的水平是否超过第五预定阈值水平，(vi)SOX2蛋白的水平是否超过第六预定阈值水平，和(vii)单体与四聚体MnSOD的比率是否超过第七预定阈值水平。该方法还包括如果满足标准(i)-(vii)中的一个或多个，则确定个体适合于该治疗。根据某些方面，在选择个体适合于治疗的情况下，该方法可以包括通过向个体施用治疗有效量的相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物，任选与其它治疗剂，例如本文所述的任何治疗剂治疗个体。可选择或另外的，可以进行诊断方法以确定肿瘤是否对抗癌剂例如化疗剂、抑制激素受体途径的治疗剂和细胞周期抑制剂中的任何一种或多种具有抗性，通过评估组织以确定是否满足标准(i)-(vii)中的任何一种，而不需要施用根据式(I)的五氮杂大环状环配合物。治疗和/或诊断还可以通过包括评估标准(i)-(vii)中的任一个的测定的试剂盒，例如本文所述的任何试剂盒来实施。在一个实施方案中，该方法还可以包括在施用式(I)的五氮杂大环状环配合物之前、与之同时或之后施用抗癌剂，其中化疗剂可以是本文所述的任何化疗剂。抗癌剂也可以作为用于进行治疗方法的试剂盒的一部分提供，和/或试剂盒可以包含用于施用化疗剂作为治疗的一部分的说明书。
根据另一个方面，提供了在患有该病的哺乳动物个体中治疗对电离放疗有抗性的肿瘤的方法。例如，对放疗有抗性的肿瘤可以是具有肿瘤特征的肿瘤，其特征在于以下中的任何一种或多种：(i)沉默调节蛋白(SIRT3)蛋白的水平低于第一预定阈值水平，(ii)K68-乙酰化锰超氧化物歧化酶(MnSODK68)的水平超过第二预定阈值水平，(iii)缺氧诱导因子2α(HIF2α)的表达水平超过指示干性谱系可塑性的第三预定阈值水平，(iv)Ki-67蛋白的水平超过第四预定阈值水平，(v)OCT4蛋白的水平超过第五预定阈值水平，(vi)SOX2蛋白的水平超过第六预定阈值水平，和(vii)单体与四聚体MnSOD的比率超过第七预定阈值水平。也就是说，由(i)-(vii)中的任一个表征的肿瘤特征可以指示肿瘤细胞对电离辐射治疗的抗性。根据一些实施方案，治疗方法可以包括通过从个体获得测试组织样品来选择作为治疗的适合个体的个体，测试组织样品包括肿瘤细胞，并且评估组织样品以确定包含以下任何一种或多种的标准：(i)在组织样品的肿瘤细胞中沉默调节蛋白(SIRT3)蛋白活性的水平是否低于第一预定阈值水平，(ii)在赖氨酸68残基处乙酰化的锰超氧化物歧化酶(AcK68)的水平是否超过第二预定阈值水平，(iii)缺氧诱导因子2α(HIF2α)的表达水平是否超过指示干性谱系可塑性的第三预定阈值水平，(iv)Ki-67蛋白的水平是否超过第四预定阈值水平，(v)OCT4蛋白的水平是否超过第五预定阈值水平，(vi)SOX2蛋白的水平是否超过第六预定阈值水平，和(vii)单体与四聚体MnSOD的比率是否超过第七预定阈值水平。根据某些方面，如果满足标准(i)-(vii)中的一个或多个，则确定个体适合于治疗。根据其它方面，在选择个体适合治疗的情况下，该方法可以包括通过向个体施用治疗有效量的相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物来治疗个体。也就是说，根据某些方面，可以施用相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物以降低癌症/肿瘤对涉及电离辐射的放疗的抗性。因此，在某些实施方案中，该方法还可以包括例如在施用五氮杂大环状环配合物之前、与之同时或之后，例如根据本文进一步描述的任何放射施用/放疗方法和/或与本文进一步描述的任何放射施用/放疗方法组合，向个体施用电离辐射，例如在放疗过程中。在某些进一步的实施方案中，还可以提供另外的抗癌治疗剂，例如化疗剂、抑制激素受体途径的治疗剂(例如内分泌剂)和细胞周期抑制剂中的任何一种或多种，包括本文所述的任何那些。
根据一个实施方案，在患有癌症的哺乳动物个体中治疗癌症的方法包括向个体施用抗癌疗法，所述抗癌疗法选自治疗有效量的化疗剂、治疗有效量的抑制与癌症生长或进展相关的激素受体途径的治疗剂(例如内分泌剂)、治疗有效量的细胞周期抑制剂和治疗有效剂量的电离辐射，并且在施用治疗剂之前、与之同时或之后向个体施用治疗有效量的相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物。例如，根据某些方面，五氮杂大环状环配合物可以降低肿瘤细胞对抗癌治疗剂的抗性或以其它方式增强抗癌治疗剂的有效性。根据又一实施方案，在有风险的哺乳动物个体中治疗癌症和/或降低癌症复发可能性的方法包括向个体施用治疗有效量的相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物，任选与其它抗癌疗法，例如抗癌治疗剂(例如化疗剂或内分泌剂)组合。例如，根据某些方面，五氮杂大环状环配合物的施用可以有效治疗个体中癌症的复发，例如对其它疗法具有抗性的肿瘤的复发，和/或可以通过降低对疗法产生抗性的可能性来降低肿瘤复发发生的可能性。
根据另一个实施方案，在哺乳动物个体中治疗对抗癌疗法具有抗性的肿瘤的方法，所述抗癌疗法选自化疗剂、抑制与癌症生长或进展相关的激素受体途径的治疗剂、细胞周期抑制剂和放疗，该方法包括向个体施用治疗有效量的相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物，任选与抗癌疗法例如抗癌治疗剂组合。在又一个实施方案中，肿瘤对治疗剂的抗性可以根据本文所述的方法确定，例如通过确定是否满足本文的标准(i)-(vii)。此外，本文所述的方法还可以包括在施用五氮杂大环状环配合物之前、与之同时或之后施用本文的抗癌治疗剂。包含测定法的试剂盒，例如本文所述的用于确定标准(i)-(vii)的那些，有或没有五氮杂大环状环配合物和/或其它治疗剂，也可以作为诊断和/或治疗试剂盒提供，以实施本文所述方法整体的任何部分。
因此，在某些实施方案中，本文所述的五氮杂大环状环配合物可以有利地治疗某些癌症和/或降低某些癌症的复发的可能性或复发，与作为抗癌疗法例如抗癌治疗剂组合提供和/或降低癌细胞对抗癌疗法和/或抗癌治疗剂治疗的抗性。
根据一个实施方案，在患有癌症的哺乳动物个体中治疗癌症的方法包括向个体施用治疗有效量的内分泌治疗剂，和在施用内分泌治疗剂之前、与之同时或之后，向个体施用治疗有效量的相应于下式(I)的五氮杂大环状环配合物。例如，内分泌治疗剂和五氮杂大环状环配合物可以包括为在治疗患病个体中的癌症而施用的组合疗法。
根据又一个实施方案，降低有风险的哺乳动物个体中癌症复发可能性的方法包括向个体施用治疗有效量的内分泌治疗剂，和在施用内分泌治疗剂之前、同时或之后向个体施用治疗有效量的相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物。例如，降低复发可能性的方法可以包括向处于癌症复发风险和/或经历癌症复发的个体施用内分泌治疗剂和五氮杂大环状环配合物的组合疗法。根据另一个实施方案，个体可以是癌症缓解的个体，其中施用组合疗法以降低癌症复发的可能性。
根据又一个实施方案，用于确定标准(i)-(vii)的预定阈值可以相对于一般群体中靶蛋白的平均或中值水平来设定，使得预定阈值与靶蛋白(例如SIRT3、AcK68和/或HIF2α)的治疗显著量相关，例如治疗显著程度的K68-乙酰化。在一个实施方案中，AcK68的预定阈值是发生显著过氧化物酶活性的水平，其指示K68-乙酰化和/或单体MnSOD形式的存在。在另一个实施方式中，靶蛋白的预定阈值水平可以与指示个体中对抗癌疗法(例如内分泌疗法和/或化疗)的抗性增加和/或癌症复发和/或癌症生长或增殖的风险增加的水平相关。
根据又一个实施方案，在对抗癌治疗剂具有抗性的哺乳动物个体中降低对抗癌疗法例如内分泌疗法和/或化疗的抗性的方法包括向个体施用治疗有效量的抗癌治疗剂，并且在施用抗癌治疗剂之前、与之同时或之后，向个体施用治疗有效量的相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物。例如，五氮杂大环状环配合物可能能够降低和/或逆转癌细胞中固有的和/或已经在癌细胞中发展的对特定抗癌疗法(例如特定内分泌治疗剂和/或化疗剂)的抗性，使得内分泌治疗剂和/或化疗剂的治疗功效增加和/或恢复。根据一个实施方案，可以在哺乳动物个体例如由于接受内分泌疗法治疗方案以治疗哺乳动物个体所患的癌症而对内分泌疗法具有固有抗性和/或对内分泌疗法具有发展抗性的情况下提供组合疗法。根据另一个实施方案，可以在哺乳动物个体由于接受内分泌疗法治疗方案而对内分泌疗法产生抗性的情况下提供组合疗法，以降低哺乳动物个体有风险的癌症复发的可能性。根据另一个实施方案，可以在哺乳动物个体由于接受化疗治疗方案以治疗哺乳动物个体所患的癌症而产生对化疗的抗性的情况下提供组合疗法。根据某些方面，五氮杂大环状环配合物能够预料不到地并且有利地恢复癌细胞对抗癌治疗剂(例如内分泌治疗剂和/或化疗剂)的敏感性，从而可以实现用抗癌治疗剂的治疗。
根据一个实施方案，根据本文任何方法可以治疗的癌症和/或肿瘤和/或复发可能性降低的癌症和/或肿瘤可以是选自乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、头颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肝细胞癌、硬纤维瘤、胰腺癌、黑素瘤和肾细胞癌的一种(也参见文章SIRT3 is a Mitochondrial-Localized Tumor Suppressor Required forMaintenance of Mitochondrial Integrity and Metabolism during Stress,Kim等人,Cancer Cell,第16卷,41-52(2010))。根据某些实施方案，癌症可以是已知用一种或多种内分泌治疗剂和/或化疗剂可治疗和/或接受治疗的癌症，尽管在其它实施方案中，也可以治疗和/或预防其它癌症。根据一个实施方案，根据本文的任何方法治疗和/或预防的癌症是激素受体阳性(HR+)乳腺癌。根据又另一个实施方案，癌症是管腔A型乳腺癌和/或管腔B型乳腺癌中的任何。例如，在一个实施方案中，癌症是管腔B型乳腺癌。根据又一个实施方案，癌症包括表现出在MnSOD蛋白的K68残基处具有乙酰化的锰超氧化物歧化酶(MnSOD)的乙酰化形式的水平升高，和/或SIRT3蛋白的水平降低，和/或HIF2α的水平升高的癌细胞，这是与对内分泌疗法和/或化疗的抗性相关的歧化酶功能破坏的标志。根据又一个实施方案，可以治疗和/或复发可能性可以降低的癌症和/或肿瘤可以是激素受体阳性(HR+)癌症，例如雌激素受体阳性(ER+)癌症、孕酮受体阳性(PR+)癌症和/或雄激素受体阳性(AR+)癌症。
根据又一个实施方案，本文所述的方法还可以包括对哺乳动物个体进行评估的步骤，以鉴定它们是否受益于作为组合疗法的一部分的五氮杂大环状环配合物的治疗，并且响应评估结果施用作为组合疗法的一部分的五氮杂大环状环配合物。例如，评估可以包括确定哺乳动物个体是否患有具有其中所述任何特征的癌症和/或处于发展具有其中所述任何特征的癌症的复发的风险中，所述癌症例如可通过抗癌剂例如内分泌治疗剂和/或化疗剂治疗的癌症、对用抗癌剂例如内分泌治疗剂和/或化疗剂治疗具有固有和/或获得性抗性的癌症、和/或表现出歧化酶功能被破坏的标志(例如本文所述的任何标准(i)-(vii))的癌症，以及可以指示施用五氮杂大环状环配合物是有利的其它特征。一旦将个体鉴定为将受益于治疗的个体，作为属于将接受治疗的群体，可以施用五氮杂大环状环配合物以改善抗癌治疗(内分泌疗法治疗和/或化疗治疗)的功效。根据某些实施方案，五氮杂大环状环配合物可以以治疗有效量施用，所述治疗有效量导致癌症响应增加，所述癌症响应增加对应于选自以下的任何：肿瘤体积减小，肿瘤生长速率降低，哺乳动物个体的存活增加，转移的发生和/或程度降低，和癌细胞增殖减少，和/或癌症并发症减少。此外，本文的方法可以包括与本文所述的任何治疗组合的另外的癌症治疗，例如放疗、免疫疗法和/或施用另外的化疗剂或其它抗癌剂中的任何。
过渡金属五氮杂大环状环配合物
在一个实施方案中，五氮杂大环状环配合物相应于式(I)的配合物：
Figure BDA0004113464730000301
其中
M为Mn2+或Mn3+；
R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10独立地为氢、烃基、取代的烃基、杂环基、氨基酸侧链部分或选自以下的部分：-OR11、-NR11R12、-COR11、-CO2R11、-CONR11R12、-SR11、-SOR11、-SO2R11、-SO2NR11R12、-N(OR11)(R12)、-P(O)(OR11)(OR12)、-P(O)(OR11)(R12)和-OP(O)(OR11)(OR12)，其中R11和R12独立地为氢或烷基；
U与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
V与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
W与大环的氮和其所连接的大环的碳原子一起形成具有2-20个环碳原子的芳族或脂环族，取代或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和含氮稠合杂环，条件是当W为稠合芳族杂环时，连接至既为杂环又为大环的组成部分的氮的氢和连接至既为杂环又为大环的组成部分的碳原子的R1和R10不存在；
X和Y表示适合的配体，其衍生自任意单齿或多齿配位配体或配体系统或其相应的阴离子；
Z为抗衡离子；
n为0-3的整数；并且
虚线表示大环的氮原子与过渡金属锰之间的配位键。
如上述对式(I)的五氮杂大环状环配合物所述，M为Mn2+或Mn3+。在一个特别的实施方案中，其中五氮杂大环状环配合物相应于式(I)，M为Mn2+。在另一个特别的实施方案中，其中五氮杂大环状环配合物相应于式(I)，M为Mn3+。
在其中R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10的一个或多个为烃基的实施方案中，例如，适合的烃基部分包括但不限于链烯基、链烯基环烯基、链烯基环烷基、烷基、烷基环烯基、烷基环烷基、炔基、芳烷基、芳基、环烯基、环烷基、环烷基烷基、环烷基环烷基、环烯基烷基和芳烷基。在一个实施方案中，R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10独立地为氢、烃基、取代的烃基或杂环基。更优选地，在该实施方案中，R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10独立地为氢或低级烷基(例如C1-C6烷基，更通常为C1-C4烷基)。因此，例如R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10可以独立地为氢、甲基、乙基、丙基或丁基(直链、支链或环状)。在一个优选的实施方案中，R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10独立地为氢或甲基。
在一个优选的实施方案中，其中五氮杂大环配合物相应于式(I)，R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R7、R8、R9、R’9和R10各自为氢并且R6和R’6之一为氢，并且R6和R’6的另一个为甲基。在该实施方案中，例如R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R7、R8、R9、R’9和R10各自可以为氢，而R’6为甲基。可选择的是，例如R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10各自可以为氢，而R6为甲基。在另一个优选的实施方案中，其中五氮杂大环状环配合物相应于式(I)，R1、R3、R4、R5、R’5、R’6、R7、R8和R10各自为氢，R2和R’2之一为氢，并且R2和R’2的另一个为甲基，并且R9和R’9之一为氢，并且R9和R’9的另一个为甲基。在该实施方案中，例如R1、R’2、R3、R4、R5、R’5、R7、R8、R9和R10各自可以为氢，而R2和R’9为甲基。可选择的是，例如R1、R2、R3、R4、R5、R’5、R7、R8、R’9和R10各自可以为氢，而R’2和R9为甲基。在另一个实施方案中，其中五氮杂大环状环配合物相应于式(I)，R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10各自为氢。
在某些实施方案中，U和V部分独立地为取代或未取代的稠合环烷基部分，其具有3-20个环碳原子，更优选4-10个环碳原子。在特别的实施方案中，U和V部分各自为反式-环己基稠合环。
在某些实施方案中，W部分为取代或未取代的稠合杂芳族部分。在特别的实施方案中，W部分为取代或未取代的稠合吡啶并(pyridino)部分。当W为取代的稠合吡啶并部分时，例如，W部分通常在杂环氮原子对位上的环碳原子上被烃基或取代的烃基(例如烷基、取代的烷基)取代。在一个优选的实施方案中，W部分为未取代的稠合吡啶并部分。.
如上所述，X和Y表示适合的配体，其衍生自任意单齿或多齿配位配体或配体系统或其相应的阴离子(例如苯甲酸或苯甲酸阴离子、酚或酚氧阴离子、醇或醇氧阴离子)。例如，X和Y可以选自卤代、氧代、水合离子(aquo)、羟离子(hydroxo)、醇、酚、双氧、过氧、氢过氧(hydroperoxo)、烷基过氧、芳基过氧、氨、烷基氨基、芳基氨基、杂环烷基氨基、杂环芳基氨基、氧化胺、肼、烷基肼、芳基肼、一氧化氮、氰化物、氰酸根、硫氰酸根、异氰酸根、异硫氰酸根、烷基腈、芳基腈、烷基异腈、芳基异腈、硝酸根、亚硝酸根、叠氮基、烷基磺酸、芳基磺酸、烷基亚砜、芳基亚砜、烷基芳基亚砜、烷基次磺酸、芳基次磺酸、烷基亚磺酸、芳基亚磺酸、烷基硫羟羧酸、芳基硫羟羧酸、烷基硫羟硫代羧酸、芳基硫羟硫代羧酸、烷基羧酸、芳基羧酸、脲、烷基脲、芳基脲、烷基芳基脲、硫脲、烷基硫脲、芳基硫脲、烷基芳基硫脲、硫酸根、亚硫酸根、硫酸氢根、酸式亚硫酸根(bisulfite)、硫代硫酸根、硫代亚硫酸根、亚硫酸氢根(hydrosulfite)、烷基膦、芳基膦、烷基膦氧化物、芳基膦氧化物、烷基芳基膦氧化物、烷基膦硫化物、芳基膦硫化物、烷基芳基膦硫化物、烷基膦酸、芳基膦酸、烷基次膦酸、芳基次膦酸、烷基三价膦酸、芳基三价膦酸、磷酸根、硫代磷酸根、亚磷酸根、焦亚磷酸根、三磷酸根、磷酸氢根、磷酸二氢根、烷基胍基、芳基胍基、烷基芳基胍基、烷基氨基甲酸根、芳基氨基甲酸根、烷基芳基氨基甲酸根、烷基硫代氨基甲酸根、芳基硫代氨基甲酸根、烷基芳基硫代氨基甲酸根、烷基二硫代氨基甲酸根、芳基二硫代氨基甲酸根、烷基芳基二硫代氨基甲酸根、碳酸氢根、碳酸根、高氯酸根、氯酸根、亚氯酸根、次氯酸根、过溴酸根、溴酸根、亚溴酸根、次溴酸根、四卤代锰酸根、四氟硼酸根、六氟锑酸根、次磷酸根、碘酸根、高碘酸根、偏硼酸根、四芳基硼酸根、四烷基硼酸根、酒石酸根、水杨酸根、琥珀酸根、柠檬酸根、抗坏血酸根、糖精酸根(saccharinate)、氨基酸、异羟肟酸、硫代甲苯磺酸根和离子交换树脂阴离子，或它们相应的阴离子等可能性。在一个实施方案中，X和Y如果存在的话独立地选自卤代、硝酸根和碳酸氢根配体。例如，在该实施方案中，X和Y如果存在的话是卤代配体、例如氯代配体。
此外，在一个实施方案中，X和Y相应于-O-C(O)-X1，其中X1各自为-C(X2)(X3)(X4)，并且X1各自独立地为取代或未取代的苯基或-C(-X2)(-X3)(-X4)；
X2各自独立地为取代或未取代的苯基、甲基、乙基或丙基；
X3各自独立地为氢、羟基、甲基、乙基、丙基、氨基、-X5C(＝O)R13，其中X5为NH或O，并且R13为C1-C18烷基、取代或未取代的芳基或C1-C18芳烷基，或-OR14，其中R14为C1-C18烷基、取代或未取代的芳基或C1-C18芳烷基，或与X4一起为(＝O)；并且
X4各自独立地为氢或与X3一起为(＝O)。
在另一个实施方案中，X和Y独立地选自中和电荷的阴离子，其衍生自任意单齿或多齿配位配体和配体系统及其相应的阴离子；或者X和Y独立地连接至R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10的一个或多个。
在相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物中，Z为抗衡离子(例如中和电荷的阴离子)，其中n为0-3的整数。通常，Z可以相应于上述涉及X和Y的部分的抗衡离子。
在组合中，某些优选的实施方案为相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物，其中
M为Mn2+或Mn3+；
R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10独立地为氢或低级烷基；
U和V各自为反式-环己基稠合环；
W为取代或未取代的稠合吡啶并部分；
X和Y为配体；并且
Z如果存在的话为中和电荷的阴离子。
更优选地，在这些实施方案中，M为Mn2+；R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10独立地为氢或甲基；U和V各自为反式-环己基稠合环；W为未取代的稠合吡啶并部分；并且X和Y独立地为卤代配体(例如氟代、氯代、溴代、碘代)。Z如果存在的话可以为卤化物阴离子(例如氟化物、氯化物、溴化物、碘化物)。
在另一个实施方案中，五氮杂大环状环配合物由下式(II)表示：
Figure BDA0004113464730000331
其中
X和Y表示适合的配体，其衍生自任意单齿或多齿配位配体或配体系统或其相应的阴离子；并且
RA、RB、RC和RD独立地为氢、烃基、取代的烃基、杂环基、氨基酸侧链部分或选自以下的部分：-OR11、-NR11R12、-COR11、-CO2R11、-CONR11R12、-SR11、-SOR11、-SO2R11、-SO2NR11R12、-N(OR11)(R12)、-P(O)(OR11)(OR12)、-P(O)(OR11)(R12)和-OP(O)(OR11)(OR12)，其中R11和R12独立地为氢或烷基。
此外，在一个实施方案中，五氮杂大环状环配合物由式(III)或式(IV)表示：
Figure BDA0004113464730000332
其中
X和Y表示适合的配体，其衍生自任意单齿或多齿配位配体或配体系统或其相应的阴离子；并且
RA、RB、RC和RD独立地为氢、烃基、取代的烃基、杂环基、氨基酸侧链部分或选自以下的部分：-OR11、-NR11R12、-COR11、-CO2R11、-CONR11R12、-SR11、-SOR11、-SO2R11、-SO2NR11R12、-N(OR11)(R12)、-P(O)(OR11)(OR12)、-P(O)(OR11)(R12)和-OP(O)(OR11)(OR12)，其中R11和R12独立地为氢或烷基。
在另一个实施方案中，五氮杂大环状环配合物为由选自式(V)-(XVI)的式表示的化合物：
Figure BDA0004113464730000341
Figure BDA0004113464730000351
Figure BDA0004113464730000361
在一个实施方案中，本文任意式中的X和Y独立地选自氟代、氯代、溴代和碘代阴离子。在另一个实施方案中，本文任意式中的X和Y独立地选自烷基羧酸根、芳基羧酸根和芳基烷基羧酸根。在另一个实施方案中，本文任意式中的X和Y独立地为氨基酸。
在一个实施方案中，五氮杂大环状环配合物具有下式(IA)：
Figure BDA0004113464730000371
其中
M为Mn2+或Mn3+；
R1A、R1B、R2、R3、R4A、R4B、R5、R6、R7A、R7B、R8、R9、R10A和R10B独立地为氢、烃基、取代的烃基、杂环基、氨基酸侧链部分或独立地选自如下的部分：-OR11、-NR11R12、-COR11、-CO2R11、-C(＝O)NR11R12、-SR11、-SOR11、-SO2R11、-SO2NR11R12、-N(OR11)(R12)、-P(＝O)(OR11)(OR12)、-P(＝O)(OR11)(R12)和-OP(＝O)(OR11)(OR12)，其中R11和R12独立地为氢或烷基；
U与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
V与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
W与大环的氮和其所连接的大环的碳原子一起形成具有2-20个环碳原子的芳族或脂环族，取代或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和含氮稠合杂环，条件是当W为稠合芳族杂环时，连接至既为杂环又为大环的组成部分的氮的氢和连接至既为杂环又为大环的组成部分的碳原子的R5和R6不存在；其中
X1各自独立地为取代或未取代的苯基或-C(-X2)(-X3)(-X4)；
X2各自独立地为取代或未取代的苯基或烷基；
X3各自独立地为氢、羟基、烷基、氨基、-X5C(＝O)R13，其中X5为NH或O，并且R13为C1-C18烷基、取代或未取代的芳基或C1-C18芳烷基，或-OR14，其中R14为C1-C18烷基、取代或未取代的芳基或C1-C18芳烷基，或与X4一起为(＝O)；
X4各自独立地为氢或与X3一起为(＝O)；并且
过渡金属M与大环氮原子之间的键和过渡金属M与轴配体-OC(＝O)X1的氧原子之间的键为配位共价键。
在一个实施方案中，在式(IA)和其中包含的基团中，在一组化合物中，X1为-C(-X2)(-X3)(-X4)，并且X2、X3和X4各自以组合形式相应于下表中定义的任意组合：
Figure BDA0004113464730000381
此外，在实施方案(IA)和其中包含的基团中，在一组化合物中，X1为-C(-X2)(-X3)(-X4)，并且X3为-X5C(＝O)R13，使得X2、X3和X4的组合包括下表中定义的任意组合：
组合 X2 X3 X4
1 Ph NHC(＝O)R13 H
2 Ph OC(＝O)R13 H
3 CH3 NHC(＝O)R13 H
4 CH3 OC(＝O)R13 H
其中R13为C1-C18烷基、取代或未取代的芳基或C1-C18芳烷基，或-OR14，其中R14为C1-C18烷基、取代或未取代的芳基或C1-C18芳烷基。
在一个实施方案中，相应于式(IA)的五氮杂大环状环配合物为式(IE)的配合物之一，例如(IER1)、(IES1)、(IER2)、(IES2)、(IER3)或(IES3)：
Figure BDA0004113464730000382
Figure BDA0004113464730000391
其中
M为Mn+2或Mn+3；
X1各自独立地为取代或未取代的苯基或-C(X2)(X3)(X4)；
X2各自独立地为取代或未取代的苯基、甲基、乙基或丙基；
X3各自独立地为氢、羟基、甲基、乙基、丙基、氨基，或与X4一起为＝O；
X4各自独立地为氢或与X3一起为＝O；并且
锰与大环氮原子之间的键和锰与轴配体-OC(＝O)X1的氧原子之间的键为配位共价键。
在一个实施方案中，X1各自为-C(X2)(X3)(X4)，并且-C(X2)(X3)(X4)各自相应于出现在上述式(IA)的表中的任意组合1-9。
在另一个实施方案中，式(I)的五氮杂大环状环配合物中的X和Y相应于式(IA)或(IE)中的配体。例如，式(I)的配合物中的X和Y可相应于-O-C(O)-X1，其中X1如上述对式(IA)和(IE)的配合物所定义。
在一个实施方案中，相应于式(I)(例如式(I)或相应于式(II)-(XIV)、(IA)和(IE)的式(I)的任意子集)的五氮杂大环状环配合物可以包括任意如下结构：
Figure BDA0004113464730000401
Figure BDA0004113464730000411
Figure BDA0004113464730000421
在一个实施方案中，用于本文所述方法和组合物的五氮杂大环状环配合物包括相应于式(2)、(3)、(4)、(5)、(6)和(7)的那些：
Figure BDA0004113464730000431
其中式(2)、(3)、(4)、(5)、(6)和(7)各自中的X和Y独立地为配体。例如，根据一个实施方案，用于本文所述方法和组合物的五氮杂大环状环配合物包括相应于式(2)、(3)、(4)、(5)、(6)和(7)的那些，其中这些通式各自中的X和Y为卤代，例如氯代。可选择的是，X和Y可以为非氯代的配体，例如任意上述配体。
在另一个实施方案中，五氮杂大环状环配合物相应于式(6)或式(7)：
Figure BDA0004113464730000441
本文的6(例如在Riley,D.P.,Schall,O.F.,2007,Advances in InorganicChemistry,59:233-263中所述的二氯代配合物)和7(例如7的二氯代配合物形式)的化学结构相同，除它们具有镜像手性外；即对映异构体结构为不可重叠的。
例如，五氮杂大环状环配合物可以相应于如下配合物的至少一种：
Figure BDA0004113464730000442
在另一个实施方案中，五氮杂大环状环配合物可以相应于如下配合物的至少一种和/或其对映异构体：
Figure BDA0004113464730000443
Figure BDA0004113464730000451
在一个实施方案中，五氮杂大环状环配合物的对映异构体纯度大于95％，更优选大于98％，更优选大于99％，并且最优选大于99.5％。如本文所用，术语“对映异构体纯度”是指具有所示绝对立体化学的化合物的量，表示为占所示化合物及其对映异构体总量的百分比。在一个实施方案中，五氮杂大环状环配合物的非对映异构体纯度大于98％，更优选大于99％，并且最优选大于99.5％。如本文所用，术语“非对映异构体纯度”是指具有所示绝对立体化学的化合物的量，表示为占所示化合物及其非对映异构体总量的百分比。用于测定非对映异构体和对映异构体纯度的方法是本领域众所周知的。可以通过能够在化合物与其非对映异构体之间定量区分的任意分析方法测定非对映异构体纯度，例如高效液相色谱法(HPLC)。类似地，可以通过能够在化合物与其对映异构体之间定量区分的任意分析方法测定对映异构体纯度。用于测定对映异构体纯度的适合的分析方法的实例包括但不限于使用偏光计的平面偏振光的旋光度和使用手性柱填充材料的HPLC。
在一个实施方案中，五氮杂大环状环配合物的治疗有效量可以为当施用于患者时足以提供至少0.1μM的峰值血浆浓度的量。例如，在一个实施方案中，可以以当施用于患者时足以提供至少1μM的峰值血浆浓度的量施用五氮杂大环状环配合物。在另一个实施方案中，可以以当施用于患者时足以提供至少10μM的峰值血浆浓度的量施用五氮杂大环状环配合物。通常，将不以当施用于患者时提供大于40μM的峰值血浆浓度的量施用五氮杂大环状环配合物。例如，可以以足以在患者中提供0.1μM-40μM范围的峰值血浆浓度的量施用五氮杂大环状环配合物。作为另一个实例，可以以足以在患者中提供0.5μM-20μM范围的峰值血浆浓度的量施用五氮杂大环状环配合物。作为另一个实例，可以以足以在患者中提供1μM-10μM范围的峰值血浆浓度的量施用五氮杂大环状环配合物。
在另一个实施方案中，每kg患者体重施用的五氮杂大环状环配合物的剂量可以为至少0.1mg/kg，例如至少0.2mg/kg。例如，每kg患者体重施用的五氮杂大环状环配合物的剂量可以为至少0.5mg/kg。作为另一个实例，每kg患者体重施用的五氮杂大环状环配合物的剂量可以为至少1mg/kg。在另一个实例中，每kg患者体重施用的五氮杂大环配合物的剂量可以为至少2mg/kg，例如至少3mg/kg和甚至至少约15mg/kg。例如至少24mg/kg和甚至至少40mg/kg。通常，每kg患者体重施用的五氮杂大环状环配合物的剂量不超过1000mg/kg。例如，每kg患者体重施用的五氮杂大环状环配合物的剂量范围可以为0.1-1000mg/kg，例如0.2mg/kg-40mg/kg，例如0.2mg/kg-24mg/kg和甚至0.2mg/kg-10mg/kg。作为另一个实例，每kg体重施用的五氮杂大环状环配合物的剂量范围可以为1mg/kg-1000mg/kg，例如3mg/kg-1000mg/kg和甚至5mg/kg-1000mg/kg，例如10mg/kg-1000mg/kg。作为另一个实例，每kg体重施用的五氮杂大环状环配合物的剂量范围可以为2mg/kg-15mg/kg。作为另一个实例，每kg体重施用的五氮杂大环状环配合物的剂量范围可以为3mg/kg-10mg/kg。作为另一个实例，每kg患者体重施用的五氮杂大环状环配合物的剂量范围可以为0.5-5mg/kg。作为另一个实例，每kg患者体重施用的五氮杂大环状环配合物的剂量范围可以为1-5mg/kg。
在一个实施方案中，上述剂量和/或血浆浓度可以特别适合于相应于GC4419的五氮杂大环状环配合物，不过，它们还可以适合于另外的五氮杂大环状环配合物。此外，本领域技术人员可以认识到如何基于例如所用具体化合物的分子量和/或活性这样的因素调整剂量和/或血浆浓度。例如，对于具有2倍于GC4419的活性的五氮杂大环状环配合物，剂量和/或血浆浓度可以减半，或对于具有高于GC4419分子量的五氮杂大环状环配合物，可以使用相应更高的剂量。
类似地，可以根据预期的治疗选择五氮杂大环状环配合物的给药方案。例如，在一个实施方案中，在治疗过程中，适合的给药方案可以包括对患者给药至少每周1次，例如至少每周2、3、4、5、6或7天(例如每天)。作为另一个实例，在一个实施方案中，给药可以至少每天1次(qd)或者甚至至少每天2次(bid)。在一个实施方案中，使用五氮杂大环状环配合物的治疗过程可以持续至少与使用抗癌治疗剂例如内分泌剂(例如他莫昔芬或4-羟基他莫昔芬)和/或化疗剂的治疗过程一样长，甚至可以超过提供的抗癌治疗剂的持续时间。五氮杂大环状环配合物的治疗过程也可以与内分泌治疗剂的治疗开始于同一天，或者可以在抗癌治疗剂首次给药后的某个时间开始，如下面更详细地讨论。例如，在一个实施方案中，对于在治疗过程中持续至少一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月施用的抗癌治疗剂，可以在治疗过程中施用五氮杂大环状环配合物持续至少一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月。
抗癌治疗剂
根据一个实施方案，抗癌治疗剂作为本文治疗方法的一部分与五氮杂大环化合物组合提供。抗癌治疗剂可以是抑制与癌症生长或进展相关的激素受体途径的治疗剂(例如内分泌剂，其可以称作激素治疗剂)和/或化疗剂中的任何一种或多种。内分泌剂是能够阻断或干扰激素对癌细胞的作用的化合物(Lumachi等人,Curr Med Chem,18(4)513-522(2011)；Awan等人,Curr Oncol,25(4):285-291(2018))。包含激素受体和/或依赖激素生长的癌症和/或肿瘤细胞可以特别响应于内分泌疗法，例如使用雌激素生长的雌激素受体阳性(ER阳性)细胞。根据一个实施方案，抑制与癌症生长或进展相关的激素受体途径的治疗剂靶向雌激素受体途径、孕酮受体途径和雄激素受体途径中的任何一种或多种。例如，靶向雌激素受体途径、孕酮受体途径和雄激素受体途径中的任何一种或多种的治疗剂可以包括雌激素受体抑制剂、雌激素受体降解剂/下调剂、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、芳香酶抑制剂、GnRH激动剂、雄激素合成抑制剂、雄激素受体抑制剂和选择性孕酮受体调节剂(SPRM)的任何一种或多种。根据另一个实施方案，内分泌治疗剂包括选自以下的SERM化合物：他莫昔芬、来曲唑、氯米芬、4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、萘福昔定、拉索昔芬、巴多昔芬、奥培米芬、氟维司群、布林司群、依拉司群及其衍生物、盐和/或前药。根据又一个实施方案，内分泌治疗剂包括SERM化合物，其具有三苯乙烯结构和/或苯并噻吩结构。根据另一个实施方案，内分泌治疗剂包括SERM，其为选自他莫昔芬、4-羟基他莫昔芬及其衍生物、前药和/或盐的任意一种。
根据又一个实施方案，抗癌治疗剂靶向雄激素受体途径，并且包括雄激素受体拮抗剂、雄激素合成抑制剂和抗促性腺激素的任何一种或多种。例如，靶向雄激素受体途径的治疗剂可以包括选自以下的至少一种：醋酸环丙孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、螺内酯、奥生多龙、醋酸奥沙特隆、氟他胺、比卡鲁胺、尼鲁米特、托匹芦胺、恩杂鲁胺、阿帕鲁胺、地诺孕素、屈螺酮、美多孕酮、醋酸诺美孕酮、普美孕酮、曲美孕酮、酮康唑、醋酸阿比特龙、塞维特罗、氨鲁米特、非那雄胺、度他雄胺、episteride、alfatradial、醋酸环丙孕酮、美罗孕酮、氟他胺、尼鲁米特、戊双氟酚、亮丙瑞林、西曲瑞克、烯丙雌醇、醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、己酸孕诺酮、己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸奥沙特隆、奥生多龙、雌二醇、雌二醇酯、炔雌醇、共轭雌激素、己烯雌酚及其衍生物、盐和/或前药。
根据又一个实施方案，抗癌治疗剂靶向孕酮受体途径，并且包括任何一种或多种I型、II型或III型选择性孕酮调节剂(SPRM)，其为选自奥那司酮、米非司酮、洛那立生、阿来司酮、Org31710、Org31806、CDB-2914和CDB-4124及其衍生物、盐和/或前药中的至少一种。
根据另一个实施方案，抗癌治疗剂包括化疗剂，例如任何含铂化疗剂和蒽环化疗剂。例如，化疗剂可以包括选自顺铂、奥沙利铂、卡铂、奈达铂、洛铂、庚铂、双环铂、脂铂、LA-12、磷铂、菲铂、prolindac、四硝酸三铂、吡铂、沙铂和/或其药学上可接受的盐的任何含铂化疗剂，和/或选自多柔比星、柔红霉素、表柔比星和伊达比星和/或其药学上可接受的盐的蒽环化疗剂。本文其它部分描述的其它化疗剂也可以是适合的。
根据又一个实施方案，抗癌治疗剂包括细胞周期抑制剂，例如CDK4/6抑制剂，例如选自哌柏西利、abemaciclib、瑞博西利及其衍生物、盐和/或前药的任何。
抗癌治疗剂的剂量可以根据所提供的治疗和所使用的特定抗癌治疗剂来选择。抗癌治疗剂的给药方案可以根据期望的治疗和提供的抗癌治疗剂类似地选择。例如，在一个实施方案中，适合的给药方案可以包括以每天、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周、每两周、每三周或每月一次或两次的频率给药患者。
施用时间表
在一个实施方案中，根据提供的治疗，用五氮杂大环状环配合物，任选用抗癌治疗剂的治疗过程可以包括一个或多个剂量的活性剂和/或配合物。在一个实施方案中，包括一个或多个剂量的治疗过程可以包括在施用抗癌治疗剂之前的预定时间期限施用一定剂量的五氮杂大环状环配合物。例如，治疗过程可以包括施用初始剂量和任选的一个或多个后续剂量的抗癌治疗剂，五氮杂大环状环配合物的给药开始在初始抗癌治疗剂之前的预定时间期限进行。在另一个实施方案中，包括一个或多个剂量的治疗过程可以包括在自施用一定剂量的抗癌治疗剂起经过预定时间期限后施用一定剂量的五氮杂大环状环配合物。也就是说，治疗过程可以包括施用初始剂量和任选的一个或多个后续剂量的抗癌治疗剂，五氮杂大环状环配合物的给药开始在初始抗癌治疗剂后延迟预定的时间期限。
在一个实施方案中，在治疗过程中，五氮杂大环状环配合物的至少一个剂量在施用抗癌治疗剂之前至少一周、至少5天、至少3天、至少2天、至少1天、至少12小时、至少8小时、至少4小时、至少2小时、至少1小时和/或至少30分钟施用。在另一个实施方案中，在施用抗癌治疗剂后至少一周、至少5天、至少3天、至少2天、至少1天、至少12小时、至少8小时、至少4小时、至少2小时、至少1小时和/或至少30分钟，在治疗过程中施用五氮杂大环状环配合物的至少一个剂量。此外，五氮杂大环状环配合物的至少一个剂量的时间表也可以适用于在治疗过程中提供的多个剂量，例如在治疗过程中提供的至少25％、至少50％、至少75％、至少90％和甚至基本上所有剂量。
其它癌症疗法
在一个实施方案中，本文提供的治疗还可以包括用除上文具体描述的那些之外的另外的疗法治疗，例如放疗、免疫疗法和/或另外的化疗治疗的一种或多种。例如，在一个实施方案中，可以在施用一种或多种五氮杂大环状环配合物(任选与抗癌治疗剂一起)之前、与之同时或之后向个体施用放疗。下文提供了适用于治疗癌症的放疗和其它化疗的进一步详细描述。
在一个实施方案中，放疗可以与施用一种或多种五氮杂大环状环配合物和任选的抗癌治疗剂同时施用。例如，抗癌治疗剂和五氮杂大环状环配合物中的一种或多种可以在放疗过程中施用，例如在放射给药之间、之前或之后或同一天施用，使得个体与抗癌治疗剂和五氮杂大环状环配合物中的一种或多种同时接受放疗。
在另一个实施方案中，五氮杂大环状环配合物和任选的抗癌治疗剂可以在没有任何其它癌症治疗的情况下施用。如在以下实施例中进一步证明的，已经预料不到地发现五氮杂大环状环配合物能够增强对抗癌疗法例如内分泌疗法和化疗的响应和/或功效，即使在没有放疗的情况下施用时也是如此。因此，在一个实施方案中，提供给个体的癌症治疗可以基本上由五氮杂大环状环配合物和任选的抗癌治疗剂组成，没有辐射暴露(即没有施用辐射剂量或剂量分数)。例如，五氮杂大环状环配合物和任选的抗癌治疗剂的组合可以施用于未接受放疗的个体，和/或未接受任何放疗至少一天，例如至少一周和/或至少一个月的个体。
施用方法
根据一个实施方案，抗癌治疗剂作为与五氮杂大环状环配合物的共同疗法或组合疗法施用。根据本文描述方法的共同疗法或组合疗法旨在包括在将提供药物组合的有益作用的方案中以依次方式施用各个化合物，并且还旨在包括以基本上同时的方式共同施用这些活性剂，例如在具有固定比例的这些活性剂的单一胶囊中或在多个每种活性剂的分开的胶囊中，或单次或多次非肠道施用，或其它施用途径和剂型。因此，当组合施用时，可以将治疗剂(即五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂)配制成同时施用或依次在不同时间施用的单独的组合物，或可以将治疗剂作为单一组合物施用。药物组合物和制剂在本文其它地方讨论。
不一定同时或基本上同时施用五氮杂大环状环配合物和抗癌治疗剂；这些活性剂和化合物可以依次施用。同时或基本上同时施用或依次施用的优点完全在熟练的临床医生的确定范围之内。例如，尽管包含抗癌治疗剂的药物组合物或制剂对于一种特定的治疗可能有利于首先在组合中施用、然后施用五氮杂大环状环配合物，在另一种治疗中先施用五氮杂大环状环配合物可能是有利的。还应理解，五氮杂大环状环配合物和抗癌治疗剂的即时组合可以与其它治疗癌症(通常为癌性肿瘤)的方法结合使用，包括但不限于放疗和外科手术或其它化疗。应进一步理解，另外的活性剂例如细胞抑制剂或静止剂(quiescentagent)或止吐剂(如果有的话)可以与任何一种或所有其它协同疗法依次或同时施用。
因此，该治疗方法的实施方案包括其中同时或依次施用五氮杂大环状环配合物和抗癌治疗剂及其组合。例如，本公开的某些方面包括用于治疗癌症的方法，其中同时或依次施用五氮杂大环状环配合物和抗癌治疗剂。其它活性剂也可以与五氮杂大环状环配合物和抗癌治疗剂同时或依次施用。
如上所述，如果五氮杂大环状环配合物和抗癌治疗剂未同时或基本上同时施用，则可以改变组分的初始施用次序。因此，例如可以首先施用抗癌治疗剂，然后施用五氮杂大环状环配合物；或可以首先施用五氮杂大环状环配合物，然后施用抗癌治疗剂。可以在单个治疗方案中重复进行这种交替施用。考虑了其它施用顺序以利用本文描述的作用，并且也可以提供其它活性剂的其它施用顺序。
在一个实施方案中，用抗癌治疗剂预先治疗个体，然后再施用五氮杂大环状环配合物，或反之亦然。根据此类实施方案，可以在施用抗癌治疗剂后至少1小时和甚至至少3天施用五氮杂大环状环配合物，或反之亦然。例如，在一个实施方案中，在施用抗癌治疗剂后1小时至3天之间施用五氮杂大环状环配合物，或反之亦然。在另一个实施方案中，例如，在施用抗癌治疗剂后1小时至1天之间施用五氮杂大环状环配合物，或反之亦然。例如，五氮杂大环状环配合物可以在施用抗癌治疗剂后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、1周、2周、3周、4周、6周、8周、9周、10周或12周内施用，或反之亦然。在这些和其它实施方案中，抗癌治疗剂可以以多剂量施用，然后施用五氮杂大环状环配合物，或反之亦然。
可选择的是，可以用五氮杂大环状环配合物对个体进行预治疗，然后施用抗癌治疗剂，或反之亦然。根据此类实施方案，可以在抗癌治疗剂的至少1个血浆半衰期内施用五氮杂大环状环配合物，例如在抗癌治疗剂的4个血浆半衰期内，或反之亦然。例如，五氮杂大环状环配合物可以在其它抗癌治疗剂的1、2或3个血浆半衰期内施用，或反之亦然。
在其它可选择的实施方案中，可以用抗癌治疗剂对个体进行预治疗，然后施用五氮杂大环状环配合物，其进一步继之以抗癌治疗剂的一次或多次另外的施用，或反之亦然。例如，可以用一定剂量的抗癌治疗剂对个体进行预治疗，然后施用一定剂量的五氮杂大环状环配合物，然后再施用其它(或部分)剂量的相同或不同的抗癌治疗剂，然后可以再施用另外剂量的五氮杂大环状环配合物。此外，可以用部分或全部剂量的五氮杂大环状环配合物对个体进行预治疗，然后施用抗癌治疗剂，其然后继之以施用另外(或部分)剂量的五氮杂大环配合物。
如以下进一步详细描述的，本公开的组合也可以与其它众所周知的治疗剂共同施用，所述治疗剂是针对所治疗病症的特殊用途而选择的。当多种组合制剂不适合时，可以依次与已知药学上可接受的一种或多种活性剂交替地使用组合。
在一个实施方案中，通常可以根据这些活性剂的本领域已知的治疗方案施用五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂。例如，可以根据待治疗的疾病和五氮杂大环状环配合物和抗癌治疗剂针对该疾病的效果改变多种组分的施用。此外，根据临床普通技术人员的知识，可以根据观察到的所施用的治疗剂(即五氮杂大环状环配合物、抗癌治疗剂)对患者的效果并且根据观察到的疾病对施用的治疗剂的响应来改变治疗方案(例如剂量和施用次数)。
此外，通常，五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂不必须在相同的药物组合物中施用，并且由于物理和化学特性的不同，可能必须通过不同的途径施用。例如，可以口服施用五氮杂大环状环配合物以产生并且维持其良好的血液水平，而可以静脉内施用或通过输注施用抗癌治疗剂，或反之亦然。施用模式可以包括如果可能在相同药物组合物中或在分开的药物组合物中(例如两种或三种分开的组合物)。此外，一旦完成初始施用，则基于观察到的效果，可以修改剂量、施用方式和施用时间。
五氮杂大环状环配合物和抗癌治疗剂以及其它相关疗法(例如放射、免疫疗法或其它化疗)的具体选择将取决于主治医生的诊断及其对患者病症的判断以及适当的治疗方案。
因此，根据经验和知识，执业医师可以随治疗的进行，根据个体患者的需要修改用于施用治疗组分(五氮杂大环状环配合物和抗癌治疗剂)的每种方案。
主治临床医生在判断治疗是否在所施用的剂量下有效时，将考虑患者的总体健康状况以及更明确的体征，例如疾病相关症状的减轻、肿瘤生长的抑制、肿瘤的实际缩小或转移的抑制。肿瘤的大小可以通过标准方法来测量，例如放射学研究，例如CAT或MRI扫描，并且成功的测量可以用来判断肿瘤的生长是否已经被延迟或甚至逆转。疾病相关症状例如疼痛的缓解和总体状况的改善也可以用来帮助判断治疗的有效性。
组成组合的产品可以同时、分开或间隔一定时间期限施用，以获得组合的最大功效；每次施用的持续时间可能从快速施用变化至任一组分的相对连续灌注(在单独的制剂中或在单一制剂中)。作为结果，出于本公开的目的，组合不限于通过成分的物理结合而获得的那些，还包括允许分开施用的那些，其可以同时或间隔开一段时间期限进行。
因此，本文描述的组分的施用可以作为单个事件发生或在治疗的整个时间过程中发生。例如，五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂的施用(同时或依次)可以以小时计(例如每小时、每两小时、每三小时、每四小时、每五小时、每六小时等)、以天计、以每周计、以每两周计或以每月计进行。对于急性病症的治疗，治疗的时间过程可能至少为几小时或几天。某些病症可能会将治疗从数天扩展到数周。例如，治疗可能会持续一周、两周或三周。对于更慢性的病症，治疗可以从数周延长至数月、一年或更长时间或需要此类治疗的患者的终生。可选择的是，作为预防性措施，可以以小时计、以天计、以每周计、以每两周计或以月计，施用化合物和活性剂数周、数月、数年或患者终生的时间。
施用于患者的包含五氮杂大环状环配合物和抗癌治疗剂的药物组合物的剂量或量应该是用于预期目的的有效量，即治疗或预防本文中讨论的一种或多种疾病、病理学障碍和医学病症，特别是癌症的量。一般而言，施用的组合物的有效量可以根据多种因素而不同，例如年龄、体重、性别、饮食、施用途径和需要治疗的患者的医疗状况。特别优选的剂量在本文中更充分地讨论。然而，应理解，本文所述组合物的每天总用量将由主治医师或兽医在合理的医学判断范围内决定。
如上所述，可以共同施用组合(通过共同配制的剂型或单独剂型在约同时施用)。组合也可以在不同的时间分开施用，每种活性剂在分开的单位剂型中。用于施用抗癌治疗剂和五氮杂大环状环配合物的多种方法可以容易地适用于本公开。药物组合物可以口服递送，例如以片剂或胶囊剂单位剂型，或非肠道，例如以可注射单位剂型，或通过一些其它途径递送。对于全身施用，例如，可以通过例如静脉内输注(连续或推注)来施用药物。组合物可用于任何其中患者可从该组合治疗中受益的治疗或预防性治疗。
对任何特定患者而言的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的障碍和障碍的严重程度；所用特定化合物的活性；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；施用时间；施用途径；所用特定化合物的排泄率；治疗期限；组合所用的或与所用特定化合物同时使用的药物和在医学和/或兽医学领域众所周知的因素。如果需要，可以将有效日剂量分为多个剂量以进行施用。因此，单剂量组合物可以包含这样的量或多个子剂量以构成每日剂量。
在一个实施方案中，每种组分的适合的或优选的剂量用于本文所述的方法或包括在本文所述的组合物中。例如，五氮杂大环状环配合物的优选剂量可以在每位患者每天10-500mg的范围内。但是，剂量可以取决于给药方案而不同，可以根据需要调整剂量以获得所需的治疗效果。应当注意，本文提供的有效剂量范围不旨在限制本公开并且代表示例性剂量范围。最优选的剂量将针对单个个体量身定制，尤其考虑所使用的特定组合和患者的年龄、性别、体重、身体状况、饮食等，正如本领域普通技术人员无需过度试验可以理解并确定的。
本文所述的癌症的治疗或癌症疗法包括获得治疗益处，但是该治疗也可以施用以获得预防益处。治疗益处通常是指至少部分根除或改善所治疗的潜在障碍。例如，在癌症患者中，治疗益处包括(部分或完全)根除或改善潜在的癌症。此外，通过至少部分或完全根除或改善与潜在障碍有关的生理症状的一种或多种而获得治疗益处，使得在患者中观察到改善，尽管患者仍可能患有潜在的障碍。对于预防益处，可以对处于发生癌症风险中的患者或对报告此类病症的一种或多种生理学症状但病症诊断还没有做出的患者实施本公开的方法或对其施用本发明的组合物。
癌症治疗方法
通常，可以使用本公开的组合物和方法来治疗患有或怀疑患有癌症或其它增殖性障碍的任何个体。接受根据本文描述的方法治疗的个体是哺乳动物个体，并且通常为人患者。可以根据本公开治疗的其它哺乳动物包括伴侣动物例如狗和猫，农场动物例如牛、马和猪，以及鸟和其它外来动物(例如在动物园或自然保护区中发现的那些)。在本公开的一个实施方案中，提供了用于治疗癌性肿瘤、特别是实体瘤的方法。有利地，本文描述的方法可以减少哺乳动物宿主中肿瘤的发展、减少肿瘤负担或产生肿瘤消退。癌症患者和希望预防癌症的个体可以用本文所述的组合治疗。
癌症和肿瘤通常是指或描述通常特征在于细胞生长失调的哺乳动物的生理状况。借助于本公开的药物组合、共制剂和组合疗法，可以治疗多种肿瘤，例如乳房、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头颈、卵巢、前列腺、脑、胰、皮肤、骨、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、宫颈和肝的肿瘤。
在一个实施方案中，肿瘤或癌选自腺瘤、血管肉瘤、星形细胞瘤、上皮癌、生殖细胞瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、错构瘤、血管内皮瘤、血管肉瘤、血肿、肝母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤和畸胎瘤。肿瘤可以选自肢端色斑样黑素瘤、光化性角化病、腺癌、囊腺癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鳞癌、星形细胞肿瘤、前庭大腺癌(bartholin gland carcinoma)、基底细胞癌、支气管腺癌、毛细血管癌、类癌、癌、癌肉瘤、海绵状(cavernous)、胆管癌(cholangio-carcinoma)、软骨肉瘤、脉络丛乳头状瘤/癌、透明细胞癌(clear cell carcinoma)、囊腺瘤、内胚窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜样腺癌、室管膜(ependymal)、类上皮(epitheloid)、尤文氏肉瘤、纤维层、局限性结节状增生、胃泌素瘤、生殖细胞肿瘤、胶质母细胞瘤、胰升糖素瘤、血管母细胞瘤、血管内皮瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝腺瘤病、肝细胞癌、胰岛素瘤、上皮内瘤形成(intaepithelial neoplasia)、上皮间鳞状细胞瘤形成、浸润性鳞状细胞癌、大细胞癌、平滑肌肉瘤、恶性着色斑型黑素瘤、恶性黑素瘤、恶性间皮瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、黑素瘤、脑膜癌、间皮瘤、转移癌、粘液上皮癌、神经母细胞瘤、神经上皮腺癌、结节性黑素瘤、燕麦细胞癌、少突胶质癌、骨肉瘤、胰腺癌、乳突浆液性腺癌(papillary serous adeno-carcinoma)、松果体细胞癌、垂体瘤、浆细胞瘤、假性肉瘤、肺母细胞瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液性癌、小细胞癌、软组织癌、抑生长素分泌性肿瘤、鳞状癌、鳞状细胞癌、间皮下、浅表扩散性黑素瘤、未分化癌(undifferentiated carcinoma)、眼色素层黑素瘤、疣状癌、血管活性肠多肽瘤、分化良好癌和Wilm瘤。
因此，例如，本公开提供了用于治疗多种癌症的方法，包括但不限于以下：癌、包括膀胱(包括加速和转移性膀胱癌)、乳房、结肠(包括结肠直肠癌)、肾、肝、肺(包括小和非小细胞肺癌和肺腺癌)、卵巢、前列腺、睾丸、泌尿生殖道、淋巴系统、直肠、喉、胰(包括外分泌胰腺癌)、食道、胃、胆囊、宫颈、甲状腺和皮肤(包括鳞状细胞癌)的癌症；淋巴谱系的造血系统肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、B-细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多毛细胞淋巴瘤、组织细胞性淋巴瘤和伯基特淋巴瘤；骨髓谱系的造血系统肿瘤，包括急性和慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、髓性白血病和前髓细胞性白血病；中枢和周围神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；以及其它肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病(xenoderma pigmentosum)、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡状癌和畸胎癌。
例如，可以用本文所述的组合和方法治疗的特定白血病包括但不限于急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性前髓细胞白血病、成年T细胞白血病、白细胞不增多性白血病、白细胞性白血病(leukocythemicleukemia)、嗜碱粒细胞白血病、母细胞白血病、牛白血病、慢性髓细胞白血病、皮肤白血病(leukemia cutis)、胚性白血病(embryonal leukemia)、嗜酸粒细胞白血病、格罗斯白血病、多毛细胞白血病、成血细胞性白血病(hemoblastic leukemia)、成血细胞性白血病(hemocytoblastic leukemia)、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病(lymphatic leukemia)、成淋巴细胞白血病、淋巴细胞白血病、淋巴原白血病(lymphogenous leukemia)、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、小原始粒型白血病、单核细胞白血病、成髓细胞白血病(myeloblastic leukemia)、髓细胞白血病、髓性粒细胞白血病、髓单核细胞白血病、内格利白血病、浆细胞白血病(plasma cell leukemia)、浆细胞白血病(plasmacytic leukemia)、前髓细胞性白血病、里德尔细胞白血病、希林白血病、干细胞白血病、亚白血病性白血病和未分化细胞性白血病。
淋巴瘤也可以用本文所述的组合和方法治疗。淋巴瘤通常是主要位于淋巴样组织中的细胞的肿瘤转化。淋巴瘤是免疫系统的肿瘤，并且通常以T-细胞和B-细胞相关疾病的形式存在。在淋巴瘤中，存在两个主要的不同组：非霍奇金淋巴瘤(NHL)和霍奇金病。可能涉及骨髓、淋巴结、脾和循环细胞等。治疗方案包括从患者体内取出骨髓并且清除肿瘤细胞，通常使用针对存在于肿瘤细胞类型上的抗原的抗体，然后进行保存。然后为患者提供毒性剂量的放疗或化疗，然后重新输注清除后的骨髓，以重新注入患者的造血系统。
可以用本文所述的组合和方法治疗的其它血液系统恶性肿瘤包括骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增殖综合征(MPS)和骨髓瘤，例如孤立性骨髓瘤和多发性骨髓瘤。多发性骨髓瘤(也称为浆细胞性骨髓瘤)涉及骨骼系统，并且其特征在于散布在整个系统中的多个肿瘤性浆细胞瘤块。它也可能扩散到淋巴结和其它部位例如皮肤。孤立性骨髓瘤涉及倾向于在与多发性骨髓瘤相同的位置发生的孤立病变。
在一个实施方案中，本文所述的方法和药物组合物用于治疗以下任何一种癌症：乳腺癌、黑素瘤、口腔鳞状细胞癌、肺癌包括非小细胞肺癌、肾细胞癌、结肠直肠癌、前列腺癌、脑癌、梭形细胞癌、尿道上皮癌(urothelial cancer)、膀胱癌、结肠直肠癌、头颈癌例如鳞状细胞癌和胰腺癌。根据又一个实施方案，所治疗的癌症可以为选自乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、头颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肝细胞癌、硬纤维肿瘤、胰腺癌、黑素瘤和肾细胞癌的任意一种。
根据一个实施方案，癌症治疗涉及以治疗有效量施用抗癌治疗剂和五氮杂大环状环配合物中的一种或两种，所述治疗有效量导致癌症响应增加，所述癌症响应增加对应于选自以下的任何：肿瘤体积减小、肿瘤生长速率降低、哺乳动物个体的存活率增加、转移的发生和/或程度降低和癌细胞增殖降低，和/或可以减少癌症并发症。
药物制剂
本公开的另一方面涉及包含与药学上可接受的赋形剂一起的本文所述的组合的药物组合物。药物组合物包含如上所述的五氮杂大环状环配合物(例如相应于式(I)的那些)和任选的至少一种抗癌治疗剂及其组合，通常将其任选与药学上可接受的载体、添加剂或赋形剂配制成药物剂型。在一个实施方案中，例如药物组合物包含五氮杂大环状环配合物、抗癌治疗剂和药学上可接受的赋形剂。本公开的药物组合物可以用于治疗癌症。
本文所述的药物组合物是由一种以上活性成分的混合或组合产生的产物，并且包括活性成分的固定和非固定组合。固定组合是这样的组合，其中将活性成分例如五氮杂大环状环配合物和抗癌治疗剂以单一实体或剂量的形式同时施用于患者。其它活性剂也可以作为单一实体或剂量的一部分施用，或可以分开施用。非固定组合是这样的组合，其中将活性成分例如五氮杂大环状环配合物和抗癌治疗剂作为单独的实体同时、伴随或依次施用于患者，没有具体的干预时间限制，其中此类施用在患者体内提供有效水平的化合物。后者也适用于鸡尾酒疗法，例如三种或以上活性成分的施用。
上述的五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂可以在施用于哺乳动物前分散在药学上可接受的载体中；即优选共配制本文所述的组分。载体在本领域中也称为赋形剂、媒介物、助剂、佐剂或稀释剂，通常为对药物惰性的物质，赋予组合物适合的稠度或形式，并且不会降低化合物的功效。如果将载体施用于哺乳动物、特别是人时不会产生不可接受的不利、过敏或其它不良反应，则通常将该载体视为“药学或药理学可接受的”。
药学上可接受的载体的选择也将部分地取决于施用途径。通常，本文所述的组合物可以配制用于任何施用途径，只要通过该途径并且根据常规施用途径血液循环系统可获得即可。例如，适合的施用途径包括但不限于口服、非肠道(例如静脉内、动脉内、皮下、直肠、皮下、肌内、眶内、囊内、脊柱内、腹膜内或胸骨内)、局部(鼻、透皮、眼内)、膀胱内、鞘内、肠内、肺、淋巴管内、腔内、阴道、经尿道、皮内、耳内、乳内、口含、原位(orthotopic)、气管内、病变内、经皮、内镜、经粘膜、舌下和肠施用。
与本公开的组合物组合使用的药学上可接受的载体是本领域普通技术人员众所周知的，并且是基于许多因素选择的：所用的特定化合物和活性剂及其浓度、稳定性和预期的生物利用度；个体、其年龄、大小和总体状况；以及施用途径。适合的非水、药学上可接受的极性溶剂包括但不限于醇(例如α-甘油缩甲醛、6-甘油缩甲醛、1,3-丁二醇、具有2至30个碳原子的脂族或芳族醇例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、叔丁醇、己醇、辛醇、水合戊烯(amylene hydrate)、苄醇、甘油(甘油)、乙二醇、己二醇、四氢糠醇、月桂醇、鲸蜡醇或硬脂醇；脂肪醇的脂肪酸酯例如聚亚烷基二醇(例如聚丙二醇、聚乙二醇)、脱水山梨醇、蔗糖和胆固醇)；酰胺(例如二甲基乙酰胺(DMA)、苯甲酸苄酯、DMA、二甲基甲酰胺、N-(6-羟基乙基)-乳酰胺，N,N-二甲基乙酰胺、2-吡咯烷酮、1-甲基-2-吡咯烷酮或聚乙烯基吡咯烷酮)；酯(例如1-甲基-2-吡咯烷酮、2-吡咯烷酮、乙酸酯例如一醋精、双醋精和三醋精；脂族或芳族酯，例如辛酸乙酯(ethyl caprylate or octanoate)、油酸烷基酯、苯甲酸苄酯、乙酸苄酯、二甲亚砜(DMSO)；甘油酯例如单、二或三甘油柠檬酸酯或酒石酸酯；苯甲酸乙酯、乙酸乙酯、碳酸乙酯、乳酸乙酯、油酸乙酯、脱水山梨醇的脂肪酸酯、脂肪酸衍生的PEG酯、单硬脂酸甘油酯、甘油酯例如单、二或三甘油酯、脂肪酸酯例如肉豆蔻酸异丙酯、脂肪酸衍生的PEG酯例如PEG-羟基油酸酯和PEG-羟基硬脂酸酯、N-甲基吡咯烷酮、普朗尼克60(pluronic 60)、聚氧乙烯山梨醇油酸聚酯、聚氧乙烯脱水山梨醇酯例如聚氧乙烯-脱水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯-脱水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯-脱水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯-脱水山梨醇单硬脂酸酯，和得自ICI Americas,Wilmington,DE的
Figure BDA0004113464730000551
20、40、60或80；聚乙烯吡咯烷酮、亚烷基氧基修饰的脂肪酸酯例如聚氧乙烯40氢化蓖麻油和聚氧乙基化蓖麻油(例如
Figure BDA0004113464730000552
EL溶液或
Figure BDA0004113464730000553
RH 40溶液)；糖脂肪酸酯(即单糖(例如戊糖例如核糖、核酮糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖和木酮糖、己糖例如葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖和山梨糖、三糖、四糖、庚糖和辛糖)、二糖(例如蔗糖、麦芽糖、乳糖和海藻糖)或寡糖或它们的混合物与C4-C22脂肪酸(例如饱和脂肪酸例如辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸和不饱和脂肪酸例如棕榈油酸、油酸、反油酸、芥酸和亚油酸))的缩合产物)，或甾体酯)；具有2-30个碳原子的烷基醚、芳基醚或环醚(例如乙醚、四氢呋喃、二甲基异山梨醇(dimethyl isosorbibe)、二乙二醇单乙醚)；糖原质(glycofurol)(四氢糠醇聚乙二醇醚)；具有3至30个碳原子的酮(例如丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮)；具有4-30个碳原子的脂族、脂环族或芳族烃(例如苯、环己烷、二氯甲烷、二氧戊环、己烷、正癸烷、正十二烷、正己烷、环丁砜、四亚甲基砜、四亚甲基亚砜、甲苯、二甲亚砜(DMSO)或四甲亚砜(tetramethylenesulfoxide))；矿物油、植物油、动物油、精油或合成来源的油(例如矿物油例如基于脂族或蜡的烃、芳族烃、基于混合脂族和芳族的烃和精炼石蜡油、植物油例如亚麻籽油、桐油、红花油、大豆油、蓖麻油、棉籽油、花生油、菜籽油、椰子油、棕榈油、橄榄油、玉米油、玉米胚油、芝麻油、桃仁油和花生油和甘油酯例如单、二或三甘油酯、动物油例如鱼油、海产油、鲸油、鳕鱼肝油、鲆鱼肝油、角鲨烯、角鲨烷和鲨鱼肝油、油酸油和聚氧乙基化蓖麻油)；具有1-30个碳原子并且任选一个以上卤素取代基的烷基或芳基卤化物；二氯甲烷；单乙醇胺；石油醚；三乙醇胺；ω-3多不饱和脂肪酸(例如α-亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸)；12-羟基硬脂酸和聚乙二醇的聚乙二醇酯(
Figure BDA0004113464730000554
HS-15，得自BASF,Ludwigshafen,德国)；聚氧乙烯甘油；月桂酸钠；油酸钠；或脱水山梨醇单油酸酯。
在一些实施方案中，由于例如大亲脂性部分的存在，可以在制剂中使用油或非水溶剂以将化合物的一种或多种引入溶液中。可选择的是，可以使用乳剂、混悬剂或其它制剂例如脂质体制剂。关于脂质体制剂，例如，可以使用任何已知的制备脂质体的方法。参见例如Bangham等人,J.Mol.Biol,23:238-252(1965)和Szoka等人,Proc.Natl Acad.Sci 75:4194-4198(1978)，其通过引用并入本文。因此，在一个实施方案中，将一种或多种化合物以脂质体递送系统的形式施用，例如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡。脂质体可以由多种磷脂例如胆固醇、硬脂酰胺或磷脂酰胆碱形成。配体也可以连接至脂质体，例如以将这些组合物引导至特定的作用部位。
用于本文所述药物组合物的另外的药学上可接受的溶剂是本领域技术人员众所周知的，并且在如下文献中确定：The Chemotherapy Source Book(Williams&WilkensPublishing)、The Handbook of Pharmaceutical Excipients(American PharmaceuticalAssociation,Washington,D.C.和The Pharmaceutical Society of Great Britain,London,England,1968)、Modern Pharmaceutics(G.Banker等人编辑,第3版)(MarcelDekker,Inc.,New York,New York,1995)、The Pharmacological Basis of Therapeutics(Goodman&Gilman,McGraw Hill Publishing)、Pharmaceutical Dosage Forms(H.Lieberman等人编辑)(Marcel Dekker,Inc.,New York,New York,1980)、Remington’sPharmaceutical Sciences(A.Gennaro编辑,第19版)(Mack Publishing,Easton,PA,1995)、The United States Pharmacopeia 24,The National Formulary 19(NationalPublishing,Philadelphia,PA,2000)和A.J.Spiegel等人,Use of Nonaqueous Solventsin Parenteral Products,Journal of Pharmaceutical Sciences,第52卷,第10期,第917-927页(1963)。
包含五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂的制剂可以采取固体、半固体、冻干粉末或液体剂型的形式，例如气雾剂、胶囊剂、乳膏剂、乳剂、泡沫剂、凝胶剂/胶冻剂、洗剂、软膏剂、糊剂、散剂、肥皂、溶液剂、喷雾剂、栓剂、混悬剂、缓释制剂、片剂、酊剂，透皮贴剂等，优选为适合简单施用精确剂量的单位剂型。如果配制成固定剂量，则此类药物组合物或制剂产品将在可接受的剂量范围内使用五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂。
在一个实施方案中，提供包含作为液体剂型一部分的抗癌治疗剂的制剂，例如适合注射用的无菌液体剂型。例如，含有抗癌治疗剂和一种或多种其它成分例如乙二胺四乙酸二钠(EDTA)组合的液体形式。在一个实施方案中，液体形式可以包含适合作为防腐剂和/或金属螯合剂的量的EDTA，例如约0.025％的量。液体形式还可以包含水，并且还可以包含pH调节剂例如碳酸氢钠，用于将pH调节在5.5至7.0的范围。在一个实施方案中，也可以提供五氮杂大环状环配合物作为适合注射用的无菌液体剂型的一部分，可以与抗癌治疗剂在同一液体剂型中，也可以作为单独的剂型。
某些五氮杂大环状环配合物的制剂还描述在如下中，例如美国专利5,610,293、5,637,578、5,874,421、5,976,498、6,084,093、6,180,620、6,204,259、6,214,817、6,245,758、6,395,725和6,525,041(其通过引用各自完整地并入本文)。
关注五氮杂大环状环配合物和抗癌治疗剂的共同制剂可以单独地对这些组分采用常规制剂技术或替代配制路线，视组合的多种组分的相容性和有效性而定。
包含五氮杂大环化合物和/或抗癌治疗剂的上述药物组合物可以另外包含一种或多种其它药物活性组分。可以包含在根据本发明的方面的组合物中的适合的药物活性剂包括例如止吐剂、麻醉剂、抗高血压剂、抗焦虑剂、抗凝血剂、抗惊厥剂、降血糖剂、减充血剂、抗组胺剂、镇咳剂、抗肿瘤剂、β阻滞剂、抗炎剂、抗精神病剂、认知增强剂、降胆固醇剂、减肥剂、自身免疫性障碍剂、抗勃起功能障碍剂、抗细菌剂和抗真菌剂、安眠剂、抗帕金森病剂、抗阿尔茨海默病剂、抗生素、抗抑郁剂和抗病毒剂。此类组合的各个组分可以以分开的或组合的药物制剂形式依次或同时施用。
在另一个实施方案中，可以提供包含五氮杂大环状环配合物和任选的抗癌治疗剂的试剂盒，其用于治疗病症例如癌症和/或降低癌症复发的可能性。例如，该试剂盒可以包含第一容器，其中具有包含五氮杂大环状环配合物的制剂，例如五氮杂大环状环配合物的口服或注射制剂；和第二容器，其中具有包含抗癌治疗剂的制剂，例如抗癌治疗剂的注射制剂。该试剂盒还可以包含标签或或其它说明书，用于活性剂施用、推荐剂量、持续时间和施用方案、警告、可能的药物相互作用列表以及其它相关说明，例如指示与本文所述的任何治疗方案相对应的治疗方案(例如给药，给药频率等)的标签。
与癌症疗法的组合治疗
在一个实施方案中，五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂可以与另外的癌症疗法组合施用，以提供治疗性治疗。例如，五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂可以作为放射疗法治疗方案的组成部分施用。
通常，施用五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂的时间方面可以取决于例如所选的特定放疗或射线暴露的类型、性质和/或持续时间。其它考虑因素可以包括所治疗的疾病或障碍以及疾病或障碍的严重程度；所用特定化合物的活性；所用特定组合物；个体的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和所用特定化合物的排泄率；治疗持续时间；用于与特定化合物组合或伴随使用的药物等因素。例如，可以在多种实施方案中在施用放疗之前、期间和/或之后施用化合物(例如在暴露于包含多次暴露和/或剂量的放疗过程之前、期间或之后，和/或在包含多次暴露和/或剂量的放疗过程之前、期间或之后)。作为另外的实例，可以在多种实施方案中在暴露于放射之前、期间和/或之后施用化合物。在一个实施方案中，放疗可以包含选自γ辐射、质子疗法、重离子疗法、近距离放疗、放射性核素疗法、适形放疗、强度调节的放疗、立体定向体部放疗、立体消融放疗和伽玛刀疗法的任何，无论是作为标准分割、低分割、加速分割还是减速分割及其变型递送。
如果期望，可以将有效剂量分成多个剂量用于施用目的；因此，单剂量组合物可以包含此类量或其多个子剂量以组成该剂量。
在一个实施方案中，例如将五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂在放射暴露之前或同时施用于患者。在另一个实施方案中，例如，将组分在放射暴露之前但不是之后施用于患者。在另一个实施方案中，将五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂的一种或多种在放射暴露例如在放疗过程的初始放射暴露之前或在作为治疗过程中的放射剂量或剂量分数之一的另外的剂量或剂量分数之前至少15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、180分钟、0.5天、1天、3天、5天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周或更长时间施用于患者。在另外的实施方案中，例如，将五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂在放射暴露之后施用于患者；因此，例如，可将化合物在放射暴露之后至多15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟或180分钟、0.5天、1天、3天、5天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周或更长时间施用，其可以为在放疗的多剂量过程中的放射剂量或剂量分数，或可以为放疗中放射的单次或最终剂量或剂量分数。
在一个实施方案中，将五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂作为包括放疗的治疗过程的组成部分施用。在放疗中，患者接受一定剂量或剂量分数的电离放射，以杀死或控制癌细胞的生长。放射的剂量或剂量分数可以定向于身体的特定部位，并且射线束也可以根据预定的治疗方案来成形，以减少对未患癌症的身体部分的有害影响。典型的放疗过程可以包括一个或多个剂量或剂量分数的放射，其可历经数天、数周和甚至数个月的疗程中施用。在放疗过程中施用的总放射“剂量”通常是指患者在整个放疗过程中所接受的放射量，在总剂量历经若干次施用的情况下，该剂量可以作为对应于多次放射暴露的剂量施“分数”用，所施用的分数之和相应于总剂量。
在一个实施方案中，将五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂的至少一种在放射暴露之前或之后的预定时间期限内施用，例如在放射剂量或剂量分数之前或之后。例如，五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂可以在患者接受放射暴露例如剂量或剂量分数的1周、48小时、24小时、12小时、6小时、2小时、1小时或乃至30分钟内施用(相应于放射剂量或剂量分数的放射暴露之前或之后)。导致增强杀灭癌细胞的、放射暴露与施用化合物之间的其它时间间隔也可能适合。在一个实施方案中，五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂的一种或多种可以在放射暴露之前施用，并且其余的五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂的一种或多种可以在放射暴露之后施用。五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂的一种或多种也可以在放射暴露之前和之后均施用。
在一个实施方案中，放疗过程包括历经预定时间期限施用的多个放射剂量或剂量分数，例如历经数小时、数周、数天和甚至数月的过程中，其中多个剂量或剂量分数具有相同的幅度或各自不同。也就是说，放疗的过程可以包括施用一系列放射的多次剂量或剂量分数。在一个实施方案中，五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂可以在该系列的一个或多个放射剂量或剂量分数之前，例如在每个放射剂量或剂量分数之前，或在一定数量的放射剂量或剂量分数之前施用。此外，可以选择在放疗过程中施用五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂，以增强放疗的癌症治疗效果，例如通过使癌细胞对放疗敏感。在一个实施方案中，将五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂在每个剂量或剂量分数之前或之后的预定期限内例如上述预定时间期限内施用。在另一个实施方案中，将五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂仅在选择剂量或剂量分数之前或之后的预定时间期限内施用。在另一个实施方案中，将五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂的至少一种在剂量之前的预定时间期限内施用，而将五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂的另一种在剂量或剂量分数之后的预定时间期限内施用。在另一个实施方案中，将五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂的至少一种仅在所选剂量或剂量分数之前或之后的预定时间期限内施用，而将五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂的另一种仅在非选择剂量或剂量分数的剂量或剂量分数之前或之后的预定时间期限内施用。
在治疗过程中要提供的适合的总剂量可以根据要提供的治疗类型、患者的身体特征和其它因素来确定，并且可以类似地确定要提供的剂量分数。在一个实施方案中，施用于患者的放射剂量分数可以为至少1.8Gy，例如至少2Gy和甚至至少3Gy，例如至少5Gy和甚至至少6Gy。在另一个实施方案中，施用于患者的放射剂量分数可以为至少10Gy，例如至少12Gy和甚至至少15Gy，例如至少18Gy和甚至至少20Gy，例如至少24Gy。通常，施用于患者的放射剂量分数不会超过54Gy。此外，应注意，在一个实施方案中，递送至个体的剂量分数可以指递送至个体的特定靶区域例如肿瘤靶区域的量，而可以使其它肿瘤区域或周围组织暴露于比标称剂量分数量所指定的更多或更少的放射。
在另一个实施方案中，将五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂作为包括施用另外的化疗剂的治疗过程的组成部分施用。在化疗中，将化疗剂施用于患者以杀死或控制癌细胞的生长。典型的化疗过程可以包括一个或多个剂量的一种或多种化疗剂，其可以历经数天、数周和甚至数月的过程中施用。化疗剂可以包括以下至少一种：烷化抗肿瘤剂例如氮芥(例如环磷酰胺、苯丁酸氮芥)、亚硝基脲(例如正-亚硝基-正-甲基脲、卡莫司汀、司莫司汀)、四嗪(例如达卡巴嗪、米托唑胺)、氮丙啶(例如噻替派、丝裂霉素C)；抗代谢剂例如抗叶酸剂(例如甲氨蝶呤和培美曲塞)、氟嘧啶(例如氟尿嘧啶、卡培他滨)、蒽环(例如阿霉素、柔红霉素、表柔比星)、脱氧核苷类似物(例如阿糖胞苷、吉西他滨、地西他滨)和硫嘌呤(例如硫鸟嘌呤、巯嘌呤)；抗微管剂例如紫杉烷(例如紫杉醇、多西他赛)；拓扑异构酶抑制剂(例如依托泊苷、阿霉素、米托蒽醌、替尼泊苷)；以及抗肿瘤抗生素(例如博来霉素、丝裂霉素)。例如，化疗剂可以选自全反式维甲酸、三氧化二砷、氮杂胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、多西氟尿啶、阿霉素、表柔比星、埃坡霉素(epothilone)、依托泊苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊马替尼、氮芥、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、替尼泊苷、tiguanine、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。多种化疗剂的施用描述在“Physicians’Desk Reference”(PDR)，例如1996版(Medical Economics Company,Montvale,N.J.07645-1742,USA)中。
在一个实施方案中，将五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂作为治疗过程的组成部分施用，所述治疗过程包括选自顺铂、多柔比星、博来霉素和紫杉醇的另外的化疗剂。此外，在一个实施方案中，另外的化疗剂可以选自紫杉烷、抗癌抗生素和蒽环。另外的化疗剂可以包括三氧化二砷和5-FU，这些活性剂也可以用于本文所述的方法和组合物中。(Alexandre等人,Cancer Res.67:(8),3512-3517(2007)；Yen等人,J.Clin.Invest.98(5),1253-1260(1996)；Masuda等人,Cancer Chemother.Pharmacol.47(2),155-160(2001))。
根据另一个实施方案，另外的化疗剂可以包括抗代谢物抗癌剂和抗有丝分裂抗癌剂的至少一种及其组合，其可包括上述一些活性剂和本文进一步描述的其它活性剂。多种抗代谢剂和抗有丝分裂剂可以用于本文所述的方法和组合物中。
抗代谢剂通常在结构上类似于天然代谢物，其参与癌细胞的正常代谢过程，例如核酸和蛋白质的合成。然而，抗代谢剂与天然代谢物的差异足够大，以至于它们干扰癌细胞的代谢过程。在细胞中，抗代谢剂被误认为是它们相似的代谢物，并且被细胞以类似于正常化合物的方式处理。“诱饵”代谢物的存在阻止细胞执行重要功能，并且细胞无法生长和存活。例如，抗代谢剂可以通过将这些欺诈性核苷酸取代入细胞DNA中来发挥细胞毒活性，从而破坏细胞分裂，或通过抑制关键的细胞酶来阻止DNA复制。
因此，在一个实施方案中，抗代谢剂为核苷酸或核苷酸类似物。在某些实施方案中，例如，抗代谢剂可以包括嘌呤(例如鸟嘌呤或腺苷)或其类似物或嘧啶(胞苷或胸苷)或其类似物，其带有或不带有连接的糖部分。
适用于本公开的抗代谢剂通常可以根据它们影响的代谢过程进行分类，并且包括但不限于叶酸、嘧啶、嘌呤和胞苷的类似物和衍生物。因此，在一个实施方案中，抗代谢剂选自胞苷类似物、叶酸类似物、嘌呤类似物、嘧啶类似物及其组合。
在一个特别的实施方案中，例如，抗代谢剂为胞苷类似物。根据该实施方案，例如，胞苷类似物可以选自阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinodside))、氮杂胞苷(5-氮杂胞苷)及其盐、类似物和衍生物。
例如，在另一个特别的实施方案中，抗代谢剂为叶酸类似物。叶酸类似物或抗叶酸剂通常通过抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)来起作用，DHFR是一种参与核苷酸形成的酶；当该酶被阻断时，不会形成核苷酸，从而破坏了DNA复制和细胞分裂。根据某些实施方案，例如，叶酸类似物可以选自二甲叶酸、甲氨蝶呤(氨甲蝶呤)、培美曲塞、蝶酰三谷氨酸、雷替曲塞、三甲曲沙(trimetrexate)及其盐、类似物和衍生物。
在另一个特别的实施方案中，例如，抗代谢剂为嘌呤类似物。基于嘌呤的抗代谢剂通过抑制DNA合成来发挥作用，例如通过干扰含有嘌呤的核苷酸、腺嘌呤和鸟嘌呤的产生来阻止DNA合成，从而阻止细胞分裂。嘌呤类似物也可以在DNA合成过程中掺入DNA分子本身，这可能会干扰细胞分裂。例如，根据某些实施方案，嘌呤类似物可以选自阿昔洛韦、别嘌呤醇、2-氨基腺苷、阿糖腺苷(ara-A)、氮杂胞苷、硫唑嘌呤、8-氮杂-腺苷、8-氟-腺苷、8-甲氧基-腺苷、8-氧代-腺苷、克拉屈滨、喷司他丁(deoxycoformycin)、氟达拉滨、gancylovir、8-氮杂-鸟苷、8-氟-鸟苷、8-甲氧基-鸟苷、8-氧代-鸟苷、鸟苷二磷酸、鸟苷二磷酸-β-L-2-氨基岩藻糖、鸟苷二磷酸-D-阿拉伯糖、鸟苷二磷酸-2-氟岩藻糖、鸟苷二磷酸岩藻糖、巯嘌呤(6-MP)、喷司他丁(pentostatin)、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤(6-TG)及其盐、类似物和衍生物。
在另一个特别的实施方案中，例如，抗代谢剂为嘧啶类似物。与上述嘌呤类似物相似，基于嘧啶的抗代谢剂阻断含嘧啶核苷酸(DNA中的胞嘧啶和胸腺嘧啶；RNA中的胞嘧啶和尿嘧啶)的合成。通过充当“诱饵”，基于嘧啶的化合物可以防止核苷酸的产生，和/或可以掺入正在生长的DNA链中并且导致其终止。例如，根据某些实施方案，嘧啶类似物可以选自：环胞苷、氮杂胞苷、6-氮杂尿苷(azauridine)、溴尿嘧啶(例如5-溴尿嘧啶)、卡培他滨、卡莫氟、氯尿嘧啶(例如5-氯尿嘧啶)、阿糖胞苷(胞嘧啶阿糖核苷)、胞嘧啶、双脱氧尿苷、3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷、3’-双脱氧胞苷-2’-烯、3’-脱氧-3’-脱氧胸苷-2’-烯、二氢尿嘧啶、多西氟尿啶、依诺他滨、氟尿苷、5-氟胞嘧啶、2-氟脱氧胞苷、3-氟-3’-脱氧胸苷、氟尿嘧啶(例如5-氟尿嘧啶(也称为5-FU)、吉西他滨、5-甲基胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-丙炔基胸腺嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、尿苷及其盐、类似物和衍生物。在一个实施方案中，嘧啶类似物不为5-氟尿嘧啶。在另一个实施方案中，嘧啶类似物为吉西他滨或其盐。
在某些实施方案中，抗代谢剂选自5-氟尿嘧啶、卡培他滨、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、吉西他滨、阿糖胞苷、氟达拉滨、培美曲塞及其盐、类似物、衍生物及其组合。在另外的实施方案中，抗代谢剂选自卡培他滨、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、吉西他滨、阿糖胞苷、氟达拉滨、培美曲塞及其盐、类似物、衍生物及其组合。在一个特别的实施方案中，抗代谢剂不为5-氟尿嘧啶。在特别优选的实施方案中，抗代谢剂为吉西他滨或其盐(例如吉西他滨HCl
Figure BDA0004113464730000601
)。
其它抗代谢剂可以选自但不限于：acanthifolic acid、氨基噻二唑、白瑞夸尔钠(brequinar sodium)、Ciba-Geigy CGP-30694、环戊基胞嘧啶、磷酸硬脂酸阿糖胞苷(cytarabine phosphate stearate)、阿糖胞苷缀合物、Lilly DATHF、Merrel Dow DDFC、地扎胍宁(dezaguanine)、二脱氧胞苷、双脱氧鸟苷、didox、Yoshitomi DMDC、Wellcome EHNA、Merck&Co.EX-015、法扎拉滨(fazarabine)、磷酸氟达拉滨、N-(2’-呋喃烷基(furanidyl))-5-氟尿嘧啶、Daiichi Seiyaku FO-152、5-FU-纤维蛋白原、isopropyl pyrrolizine、LillyLY-188011；Lilly LY-264618、methobenzaprim、Wellcome MZPES、去甲精胺(norspermidine)、NCI NSC-127716、NCI NSC-264880、NCI NSC-39661、NCI NSC-612567、Warner-Lambert PALA、喷司他丁、吡曲克辛、普卡霉素、Asahi Chemical PL-AC、TakedaTAC-788、噻唑呋林、Erbamont TIF、酪氨酸激酶抑制剂、Taiho UFT和uricytin等。
在一个实施方案中，化疗剂包括抗有丝分裂剂，其为微管抑制剂或微管稳定剂。通常，微管稳定剂例如紫杉烷(以上已描述了其中一些)和埃坡霉素与β-微管链的内表面结合并且通过促进聚合反应的成核和延伸相以及降低微管组装所需的关键微管蛋白亚单位浓度来增强微管组装。与阻止微管组装的微管抑制剂例如长春花生物碱不同，微管稳定剂例如紫杉烷减少滞后时间，并且使微管蛋白二聚体和微管聚合物之间的动态平衡急剧地向聚合反应移动。因此，在一个实施方案中，微管稳定剂为紫杉烷或埃坡霉素。在另一个实施方案中，微管抑制剂为长春花生物碱。
本文描述的疗法的一个要素可以包括使用紫杉烷或其衍生物或类似物，其中一些也在上文中讨论。在一个实施方案中，紫杉烷可以是天然衍生的化合物或相关形式或可以是具有抗肿瘤性质的化学合成的化合物或其衍生物。紫杉烷是萜烯家族，包括但不限于紫杉醇
Figure BDA0004113464730000611
和多西他赛
Figure BDA0004113464730000612
其主要来源于太平洋紫杉树、短叶紫杉(Taxusbrevifolia)并且它们对某些肿瘤、特别是乳腺肿瘤和卵巢肿瘤具有活性。在一个实施方案中，紫杉烷为多西他赛或紫杉醇。紫杉醇为优选的紫杉烷并且被视为一种抗有丝分裂剂，其促进微管蛋白二聚体组装微管，并且通过防止解聚作用稳定微管。这种稳定性导致微管网状结构正常动态重组受到抑制，而微管网状结构对于重要的相间和有丝分裂细胞功能至关重要。
还包括多种已知的紫杉烷衍生物，包括亲水性衍生物和疏水性衍生物。紫杉烷衍生物包括但不限于国际专利申请WO 99/18113中描述的半乳糖和甘露糖衍生物；WO 99/14209中描述的哌嗪子基和其它衍生物；WO 99/09021、WO 98/22451和美国专利5,869,680中描述的紫杉烷衍生物；WO 98/28288中描述的6-硫代衍生物；美国专利5,821,263中描述的亚磺酰胺衍生物；脱氧紫杉醇化合物，例如美国专利5,440,056中描述的那些；以及美国专利5,415,869中描述的泰素衍生物。如上所述，还包括紫杉醇的前药，包括但不限于WO98/58927；WO 98/13059；以及美国专利5,824,701中描述的那些。紫杉烷也可以是紫杉烷缀合物例如紫杉醇-PEG、紫杉醇-葡聚糖、紫杉醇-木糖、多西他赛-PEG、多西他赛-葡聚糖、多西他赛-木糖等。另外的衍生物在如下中提及：“Synthesis and Anticancer Activity ofTaxol Derivatives”，D.G.I.Kingston等人,Studies in Organic Chemistry,第26版,标题为“New Trends in Natural Products Chemistry”(1986),Atta-ur-Rabman,P.W.leQuesne编辑(Elsevier,Amsterdam 1986)等参考文献。这些参考文献各自通过引用整体并入本文。.
易于使用本领域技术人员公知的技术制备多种紫杉烷(另外参见WO 94/07882、WO94/07881、WO94/07880、WO 94/07876、WO 93/23555、WO 93/10076；美国专利5,294,637；5,283,253；5,279,949；5,274,137；5,202,448；5,200,534；5,229,529；和EP 590,267)(它们各自通过引用整体并入本文)或得自多种商品来源，包括例如Sigma-Aldrich Co.,St.Louis,MO。
可选择的是，抗有丝分裂剂可以是微管抑制剂；在一个优选的实施方案中，微管抑制剂为长春花生物碱。通常，长春花生物碱是有丝分裂纺锤体毒物。长春花生物碱活性剂在有丝分裂期间起作用，此时染色体分裂并且开始在细胞分离之前沿着有丝分裂纺锤体的小管向其极点之一迁移。在这些纺锤体毒物的作用下，纺锤体在有丝分裂过程中由于染色体的分散而变得混乱，从而影响细胞繁殖。根据某些实施方案，例如，长春花生物碱选自长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨及其盐、类似物和衍生物。
抗有丝分裂剂也可以是埃坡霉素。通常，埃坡霉素类化合物的成员根据与紫杉烷相似的机理稳定微管功能。埃坡霉素还可以导致细胞周期停滞在G2-M过渡期，从而导致细胞毒性并且最终导致细胞凋亡。适合的埃坡霉素包括埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、埃坡霉素D、埃坡霉素E和埃坡霉素F及其盐、类似物和衍生物。一种特别的埃坡霉素类似物为埃坡霉素B类似物伊沙匹隆(IxempraTM)。
在某些实施方案中，抗有丝分裂抗癌剂选自紫杉烷、埃博霉素、长春花生物碱及其盐和组合。因此，例如，在一个实施方案中，抗有丝分裂剂为紫杉烷。更优选地，在该实施方案中，抗有丝分裂剂为紫杉醇或多西他赛，仍然更优选紫杉醇。在另一个实施方案中，抗有丝分裂剂为埃坡霉素(例如埃坡霉素B类似物)。在另一个实施方案中，抗有丝分裂剂为长春花生物碱。
在一个实施方案中，在施用一定剂量的另外的化疗剂之前或之后的预定时间期限内施用至少一种五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂。例如，五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂可以在患者接受另外的化疗剂剂量的1周、48小时、24小时、12小时、6小时、2小时、1小时或乃至30分钟之内(在化疗剂剂量之前或之后)施用。在另外的化疗剂剂量与施用导致杀死癌细胞增强的组分之间的其它持续时间也可能是适合的。在一个实施方案中，五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂的一种或多种可以在另外的化疗剂剂量之前施用，而其余的五氮杂大环状环配合物和基于铂的抗癌剂的一种或多种可以在另外的化疗剂剂量之后施用。五氮杂大环状环配合物和和/或抗癌治疗剂的一种或多种也可以在施用另外的化疗剂剂量之前和之后均施用。
在一个实施方案中，化疗过程包括单次剂量的另外的化疗剂。在另一个实施方案中，化疗过程包括历经预定时间期限例如在数小时、数周、数天和甚至数个月施用的多个剂量的另外的化疗剂。多个剂量可以是相同大小或不同的并且可以包括相同或不同的化疗剂和/或化疗剂组合的剂量。可以选择在化疗过程中施用五氮杂大环状环配合物和和/或抗癌治疗剂，以增强化学治疗的癌症治疗效果，例如通过增加胞内过氧化氢水平来促进癌细胞中的氧化应激。在一个实施方案中，五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂在各剂量之前或之后的预定持续时间内进行施用，例如上述的预定持续时间。在另一个实施方案中，五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂在仅选择的剂量之前或之后的预定时间期限内施用。在另一个实施方案中，在剂量前的预定时间期限内施用五氮杂大环状环配合物和抗癌治疗剂的至少一种，而五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂的另一种在剂量后的预定持续时间内施用。在另一个实施方案中，五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂的至少一种仅在选择剂量之前或之后的预定持续时间期限内施用，而五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂的另一种仅在非选择剂量的剂量之前或之后的预定时间期限内施用。
在另一个实施方案中，将五氮杂大环状环配合物和/或抗癌治疗剂的至少一种与放疗和涉及施用另外的化疗剂的化疗组合施用。
实施例
提供以下非限制性实施例以进一步示例本发明的各方面。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表本发明人已经发现在本发明的实施中很好地起作用的方法，因此可以认为构成其实施方式的实例。然而，根据本公开，本领域技术人员应当理解，可以在所公开的具体实施方案中进行许多改变，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下仍然获得相同或相似的结果。
线粒体沉默调节蛋白，SIRT3，作为肿瘤抑制(TS)蛋白，其靶向几种代谢蛋白进行脱乙酰化，包括锰超氧化物歧化酶(MnSOD)1,2,3,4，以防止代谢损伤5。研究1,6已经表明MnSOD的乙酰化破坏正常细胞和线粒体代谢，导致肿瘤许可表型，启示MnSOD是响应于细胞氧化性应激的适应性酶7,8,9。已经提出MnSOD的乙酰化是衰老、能量状态和代谢应激物(例如活性氧物质(ROS)、致癌作用和对抗癌剂的抗性)的细胞和生物体生理学之间的机制联系2,3,4,8；然而，MnSOD乙酰化指导这些过程的机制仍然不清楚。
哺乳动物MnSOD是线粒体基质定位的同源四聚体抗氧化酶，具有四个相同的亚单位，每个含有Mn2+原子10；MnSOD的主要功能是清除由不同代谢过程产生的超氧化物。尽管已经鉴定了多个MnSOD乙酰化位点，但近期的出版物显然启示MnSOD亚单位(K68)中赖氨酸68的乙酰化状态是MnSOD超氧化物歧化酶活性调节的中心1,6,8,9,11,12,13。然而，MnSOD乙酰化的特定细胞生物学、生化和/或生理学意义，以及调节MnSOD解毒活性和线粒体代谢的潜在分子机制尚待完全确定。因此，已经提出MnSOD是除了指导线粒体代谢之外还调节细胞如何适应ROS诱导的代谢应激的线粒体信号传导中枢14，这可能在迟发性疾病中起重要作用2,5。
缺乏Sirt3并且因此包含乙酰化MnSOD(MnSOD-Ac)的小鼠发生肿瘤7，这意味着SIRT3可能起肿瘤抑制剂(TS)的作用。缺乏Sirt3的雌性小鼠自发地发生雌激素阳性(ER+)、低分化、高Ki-67乳腺肿瘤，其显然类似于通常在老年女性中诊断的人管腔B乳腺恶性肿瘤2,5,7,15。与管腔A ER+乳腺癌相比，管腔B亚型倾向于具有增加的增殖标志物，并且最重要的是，可以表现出内分泌抗性表型5。具有MnSOD的单等位基因敲除(MnSOD+/-)的小鼠表现出降低的MnSOD活性、增加的氧化性应激和缩短的寿命，以及衰老相关的表型，特别是致癌作用16。这种体外和体内证据支持如下可能性：如由SIRT3指导的线粒体乙酰基组与ROS解毒、线粒体代谢和癌发生之间存在联系。此外，本文的实施例启示，在特定的生理条件下，当K68被乙酰化时，MnSOD可以作为肿瘤促进剂起作用，这与暗示MnSOD水平与侵袭性肿瘤表型正相关的数据一致。在这方面，过去几年中的几篇出版物已经显示了MnSOD-Ac轴的破坏与人类疾病之间的联系4，包括衰老34、神经变性35、心血管疾病36和胰岛素抵抗37。
本文的实施例提供的数据显示MnSOD(特别是K68)的乙酰化状态指导ROS解毒活性，以及连接代谢应激和维持代谢平衡的线粒体修复途径。结果显示MnSOD以同源四聚体和单体形式存在，其分别起超氧化物歧化酶和过氧化物酶的作用。结果进一步显示，同源四聚体是TS，而如通过增强的MnSODK68Q表达建模的单体起肿瘤促进剂的作用。结果显示乙酰化状态可能与肿瘤分期相关，并且乙酰化K68(AcK68)在多种人肿瘤类型中升高。结果进一步显示，AcK68位点处的乙酰化状态与特异性和多种癌症疗法相关并诱导对其的抗性，并且与癌细胞的干性表型相关，所述癌细胞干性表型同样与疗法抗性和癌症转移相关。最后，结果支持模拟K68的脱乙酰化，无论是通过表达乙酰化抗性MnSOD还是药理学上用锰五氮杂大环模拟物。MnSOD(歧化酶模拟物)可以抑制AcK68阳性肿瘤的生长，降低癌细胞和肿瘤对疗法的抗性，并且降低癌细胞的干性。
实施例1
MnSODK68Q表达促进转化表型。
MnSOD为体外和体内17,18以及在人肿瘤样品中19的TS。然而，在人肿瘤样品中的相关发现启示，虽然MnSOD可以在肿瘤起始的早期阶段起TS的作用，但一旦肿瘤发生进展，MnSOD水平与更具侵袭性的人肿瘤正相关20，这启示MnSOD的特定同种型，潜在地包括MnSOD的乙酰化赖氨酸68形式(MnSOD-K68-Ac，AcK68)，可以起肿瘤促进剂的作用。此外，还显然在特定条件下，失调的MnSOD、异常的细胞ROS水平21,22,23和对他莫昔芬(Tam)诱导的细胞毒性的抗性之间存在相关性。这些和其它发现24启示线粒体氧化还原/ROS平衡与ER+乳腺癌生物学之间的机制联系。
为了检验这一假设，制备MnSOD K68乙酰化模拟物(MnSODK68Q)和脱乙酰化模拟物(MnSODK68R)突变体，其中用谷氨酰胺(Q)取代赖氨酸68稳定模拟乙酰化氨基酸状态，而用精氨酸(R)取代稳定模拟脱乙酰化氨基酸状态8。为了确定遗传模拟AcK68的定点突变体MnSODK68Q是否可作为肿瘤促进剂发挥作用，将lenti-MnSODK68R或lenti-MnSODK68Q载体共感染到具有c-Myc或Ras的慢病毒表达的野生型(WT)原代小鼠胚胎成纤维细胞(pMEF)中。在这些试验中，需要至少两种致癌基因，即c-Myc和Ras(WT Ras基因)25使原代细胞无限增殖化和/或转化。用lenti-MnSODK68Q和任一c-Myc或Ras感染的pMEF无限增殖化(即，分裂超过15次细胞传代)，以及被两种基因感染的细胞(图1a，底行)。相反，用lenti-MnSODK68R感染不会使感染c-Myc或Ras的WT pMEF无限增殖化，并且令人感兴趣的是，MnSODK68R防止感染两种基因的细胞无限增殖化(图1a，中间行)。作为对照，用c-Myc和Ras共同使pMEF无限增殖化，但不使用单独的c-Myc或Ras(图1a，顶行)。此外，感染lenti-MnSODK68Q的pMEF表现出在体外更具转化的表型，正如根据软琼脂上生长所确定的(图1b，顶图)，即锚定-不依赖性生长的量度；当以低密度铺板时(底行)，集落形成增加，即增殖能力的量度；倍增时间减少，即增殖率的量度(图9a，中间列)；和异种移植物肿瘤形成，即体内肿瘤发生许可表型的量度(图9a，右列)。
为了进一步表征MnSOD与其功能、TS与肿瘤促进剂之间的相关性，用致癌lenti-KrasG12V(即致癌Kras基因)和lenti-MnSODWT、lenti-MnSODK68R或lenti-MnSODK68Q共感染pMEF。使表达MnSODK68Q的pMEF无限增殖化(图1c，底行，第二列)，以及表现出更多转化的体外表型，如通过培养物中的倍增时间(22相对于35小时，第三列)和在软琼脂中的生长(底行，右列)所测量的。令人感兴趣的是，当与lenti-KrasG12V(中间行，第二列)共感染时，用脱乙酰化模拟物MnSOD突变体lenti-MnSODK68R感染防止无限增殖化。最终，在无限增殖化的NIH 3T3细胞(建立的体外模型)中重复这些试验以确定体外转化，并且表达MnSODK68Q的NIH 3T3细胞在软琼脂中表现出增加的生长(图1d，上图)和以低密度铺板时的集落形成(下图)。因此，显示用MnSODK68Q表达模拟乙酰化赖氨酸68促进体外转化许可表型，减少倍增时间并且允许异种移植物生长，而用MnSODK68R模拟MnSOD-K68的脱乙酰化具有相反作用。
MnSODK68Q增加体外和异种移植物增殖。
为了确定MnSODK68Q表达对肿瘤生长特性的作用，将lenti-MnSODWT、lenti-MnSODK68R或lenti-MnSODK68Q感染的人乳腺ER+MCF7肿瘤细胞移植到裸鼠体内。通常，MCF7细胞在没有雌激素补充的裸鼠中不会生长；然而，lenti-MnSODK68Q感染的MCF7细胞(MCF7-MnSODK68Q)在没有雌激素补充的裸鼠中生长肿瘤(图2a、b)。相反，用lenti-MnSODWT(MCF7-MnSODWT)或lenti-MnSODK68R(MCF7-MnSODK68R)感染的MCF7细胞不形成肿瘤(图2a、b)。这些结果启示表达MnSODK68Q的异种移植肿瘤的生长特征增加；然而，这也可以反映雌激素非依赖性生长特性。为了解决这个问题，将MCF7-MnSODK68Q细胞注入小鼠的后肢中，并且这些异种移植试验显示雌激素补充不改变肿瘤生长曲线(图9b)。
如通过Ki-67染色测定的，管腔B ER+乳腺癌细胞与管腔A癌细胞相比更具侵袭性并且显示增加的增殖5。缺乏Sirt3的包含MnSOD-Ac的小鼠中的肿瘤显示管腔B样肿瘤特征，包括增加的Ki-675。与这些观察结果一致，MCF7-MnSODK68Q细胞与MCF7-MnSODK68R或MCF7-MnSODWT细胞相比，用抗-Ki-67抗体染色的MCF7-MnSODK68Q细胞显示Ki-67免疫荧光(IF)染色的显著增加(图2c)并且使用ImageJ分析定量(图2d)。MCF7-MnSODWT细胞表现出与对照未感染的MCF7细胞相同的Ki-67染色(图10a)。此外，使用第二ER+人乳腺癌细胞系T47D的试验也显示T47D-MnSODK68Q与T47D-MnSODK68R和T47D-MnSODWT细胞相比Ki-67染色增加(图2e、f)。T47D-MnSODWT细胞表现出与对照未感染的T47D细胞相同的Ki-67染色(图10b)。最终，MCF7-MnSODK68Q细胞当暴露于雌激素(图10c、e)或Tam(图10d、f)时表现出类似的Ki-67染色。因此，显示用MnSODK68Q表达模拟乙酰化赖氨酸68增加异种移植肿瘤生长和体外增殖并且引起雌激素不依赖性，而用MnSODK68R模拟永久脱乙酰化赖氨酸具有相反作用。
MnSODK68Q为表现出过氧化物酶活性的单体。
MnSOD由形成同型四聚体的四个亚单位组成，每个亚单位结合锰离子(～88kDa)3,10。为了确定赖氨酸68(K68)的乙酰化状态是否改变MnSOD的构象及其活性，收获MCF7-MnSODWT、MCF7-MnSODK68R和MCF7-MnSODK68Q细胞并且将细胞裂解物与戊二醛交联，然后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和用抗-MnSOD抗体进行免疫印迹。这些试验表明表达MnSODK68Q的细胞显示MnSOD的四聚体形式显著降低(图3a，左图)，二聚体和单体形式均略微增加。在T47D-MnSODK68Q细胞中也观察到类似的结果(右图)。此外，在用抑制K68的SIRT3脱乙酰化的lenti-shSIRT3感染的MCF7和T47D细胞中重复这些试验，并且这些细胞还显示MnSOD的四聚体形式的显著降低(图3b)，与对照细胞中MnSOD的寡聚化状态几乎没有或无变化相反。
先前已经显示MnSOD在特定条件下并且当显著过表达时可以表现出过氧化物酶活性26；然而，解释该观察结果的机制是未知的。在这方面，过氧化物酶测定显示从MCF7细胞免疫沉淀的MnSODK68Q突变体(IPed)起过氧化物酶的作用(图3c)。相反，IPed MnSODK68R显示出显著更低的过氧化物酶活性(即，约50倍差异)，这启示该过氧化物酶活性可能需要K68的乙酰化(图3c)。最终，试验证实了表达MnSODK68Q的MnSOD-/-MEF与表达MnSODWT或MnSODK68R的细胞相比显示四聚体MnSOD的显著降低(图3d)。
在上述试验中，显示作为AcK68的模拟物起作用的遗传突变体MnSODK68Q导致肿瘤促进表型(图1a、b)。为了更严格地解决该理念，用上述MnSOD定点突变体感染无限增殖化但未转化的MnSOD-/-MEF。这些试验显示仅用lenti-MnSODK68Q(即单基因)感染的MnSOD-/-MEF与用lenti-空载体、lenti-MnSODWT或lenti-MnSODK68R感染的细胞相比表现出更多转化的表型(图3e，中间列)(图11a)，如通过在软琼脂中的生长、接触抑制和倍增时间测量的(图11b-d)。由于这些结果是在缺乏MnSOD的细胞中进行的，因此MnSODK68Q作为体外肿瘤促进剂起作用显然是合理的。
最终，如果MnSODK68Q作为过氧化物酶起作用，则除去作为过氧化物酶活性必需和所需的底物的细胞过氧化氢可能阻止其作为过氧化物酶以及肿瘤促进剂起作用的能力。在这方面，与表达过氧化氢酶并且减少细胞过氧化氢的lenti-MnSODK68R和AdMitoCat共感染阻止转化(图3e，右栏)。由于显示无限增殖化的MnSOD-/-MEF可以通过用MnSODK68Q感染转化，所以这些结果启示富集单体MnSOD的MnSODK68Q可能是需要过氧化氢的体外肿瘤促进剂。因此，显示用MnSODK68Q模拟AcK68或通过敲低SIRT3脱乙酰酶诱导AcK68通过减少完整四聚体形式和增加单体形式改变MnSOD构象，并且产生过氧化物酶活性，而用MnSODK68R模拟永久脱乙酰化的赖氨酸68具有相反作用。还显示用MnSODK68Q表达模拟MnSOD-K68的乙酰化在体外促进转化许可表型，而用MnSODK68R模拟MnSOD-K68的脱乙酰化具有相反作用。
MnSOD-K68-Ac表现出过氧化物酶活性。
上述数据显示了在MnSODK68Q表达模拟K68-Ac时单体MnSOD的富集(图3a)和过氧化物酶活性(图3c)。然而，还必须显示K68的物理乙酰化如何影响酶活性。为了最初解决这一问题，使用建立的组织培养系统，其在一种模式中富集乙酰化K68，而在另一种模式中富集脱乙酰化K68。在该系统中，用FLAG-MnSODWT转染的MnSOD-/-MEF随后暴露于(i)10mM烟酰胺(NAM)和1μM曲古抑菌素A(TSA)，以抑制SIRT3脱乙酰酶活性并且富集AcK68，或(ii)10mMNAD+，以激活SIRT3活性并且富集脱乙酰化的K68。如所预期的，在转染后40小时收获并且用抗-FLAG抗体IPed的全细胞提取物显示NAM/TSA暴露增加了MnSOD-K68-Ac(图4a，顶行，左侧两个泳道)，而NAD+暴露使MnSOD-K68-Ac(右侧两个泳道)减少到最低限度。在293T细胞中观察到类似的结果(图12a)。通过两种不同的方法验证MnSOD-K68-Ac抗体特异性(Abcam,Inc,ab137037)12。
随后使用旋转柱将这些样品分离成高于或低于50kDa的级分。用抗-MnSOD抗体进行免疫印迹，来自在NAM/TSA中生长的细胞的样品显示在<50kDa级分中MnSOD的富集，这启示大部分MnSOD为二聚体或单体形式，其中在>50kDa级分中，MnSOD最少(图4a，第2行和第3行，左侧两个泳道)。单体MnSOD的富集在以下情况下得到证实：当<50kDa的级分在半天然凝胶上运行时，随后用在>50kDa级分中最少四聚体MnSOD对MnSOD进行免疫印迹(图12b，左侧两个泳道)。相反，来自在NAD+中生长的细胞的MnSOD在>50kDa级分中显示出增加的MnSOD水平(图4a，第2行和第3行，右侧两条泳道)，四聚体MnSOD在>50kDa级分中富集(图12b，右图，右侧两条泳道)。这些试验证实，富集AcK68的样品包含主要为单体的MnSOD，而具有脱乙酰化的MnSOD-K68的那些主要包含四聚体MnSOD。
与来自用NAD+处理的50kDa级分的细胞相比，来自暴露于NAM/TSA的细胞的<50kDa的级分(即富含MnSOD-K68-Ac和单体MnSOD)的生化分析显示了升高的过氧化物酶活性(图4b)。相反，来自<50kDa级分的MnSOD表现出最低的MnSOD解毒活性(图4c)。与暴露于NAM/TSA的细胞相比，来自用NAD+处理的细胞的>50kDa级分(即富含四聚体MnSOD)的分析表现出升高的MnSOD解毒活性(图4d)。在来自用NAD+或NAM/TSA处理的细胞的>50kDa级分中几乎没有MnSOD过氧化物酶活性(图12c)。因此，显示MnSOD-K68的生化乙酰化将MnSOD的大小从四聚体改变为包括单体的更小形式，并且产生过氧化物酶活性。
第二种方法也用于确定MnSOD-K68的生化乙酰化如何改变酶活性。在用表达来自M.barkeri的乙酰-赖氨酰-tRNA合成酶/tRNACUA对和允许将N-(∈)-乙酰基-L-赖氨酸位点特异性掺入K68中的MnSOD细菌表达载体pET21a-MnSODK68TAG的pEVOL-AcKRS转化的大肠杆菌(E.coli)中产生重组MnSOD-K68-Ac。通过镍亲和柱纯化来自对照(携带pET21a-MnSODWT)和乙酰化形式(携带pET21a-MnSODK68TAG)的细菌表达的蛋白质，然后进行尺寸排阻色谱(SEC)13,27,28。来自细菌的纯化的野生型MnSOD在SEC上以大致对应于92kDa的体积洗脱(图4e，峰1)，与其已知的同型四聚体复合物的大小一致(图13a，全色谱图)，如其它人所示(Knyphausen等人,2016)13。来自携带pEVOL-AcKRS和pET21a-MnSODK68TAG的细菌的纯化的MnSOD-K68-Ac以与单体形式的MnSOD一致的体积洗脱(图4e，峰2)，大致对应于25kDa(图13b，全色谱图)。
在进一步分析之前，分析对应于峰1(洗脱体积13和14mL)和峰2(洗脱体积16和17mL)的两个洗脱级分以确认MnSOD。纯化的野生型细菌表达的蛋白质的免疫印迹(图4f，上图)和考马斯染色(下图)证实了MnSOD的存在。类似的试验也证实了在携带pET21a-MnSODK68TAG的细菌中存在MnSOD(图4g，上图和下图)。还通过质谱法(图13c-e)和通过用抗-MnSOD-K68-Ac抗体染色(图13f)分析这些样品，证实峰2富含MnSOD-K68-Ac蛋白。因此，显示MnSOD-K68乙酰化将MnSOD的大小从四聚体转变为包括单体的更小形式。
来自表达pET21a-MnSODWT的细菌细胞的纯化蛋白样品(洗脱体积13和14mL)显示出显著的超氧化物歧化酶活性(图4h，左侧条形图)和最小的过氧化物酶活性(图4i，左侧条形图)。相反，来自表达pET21a-MnSODK68TAG的细菌细胞的重组MnSOD-K68-Ac蛋白(洗脱体积16和17mL)表现出最小的超氧化物活性(图4h，右侧条形图)和显著的过氧化物酶活性(图4i，右侧条形图)。这些生化结果显示了分离MnSOD的两种不同方法，其中K68被以物理方式乙酰化(细菌表达系统)或富集K68乙酰化(转染表达系统)，以证实转换为单体MnSOD并且表现出过氧化物酶酶功能。因此，显示MnSOD-K68的生化乙酰化将MnSOD的大小从四聚体改变为包括单体的更小形式，并且四聚体形式表现出歧化酶活性，而更小形式表现出过氧化物酶活性。
MnSOD-K68-Ac增加乳腺细胞中的氧化性应激。
组成型表达MnSODK68Q的MCF7-MnSODK68Q(图5a)和T47D-MnSODK68Q(图5b)细胞也表现出MnSOD超氧化物解毒活性的显著降低，与其它人所示的一致6,12。由于MnSOD的主要功能是解毒线粒体超氧化物(O2·-)，因此，在表达多种MnSOD乙酰化突变体的MCF7和T47D细胞中测量线粒体氧化/还原状态。在这些细胞系中，与MCF7-MnSODK68R、T47D-MnSODK68R和对照细胞系相比，MCF7-MnSODK68Q和T47D-MnSODK68Q细胞表现出以下的显著增加：(1)MitoSOX氧化，即线粒体O2-的量度(图5c、d)；(2)CDCFH2氧化，即细胞过氧化氢水平的量度(图5e、f)；和(3)GSSG/GSH比率，即细胞氧化性应激的量度(图5g、h)。因此，显示用MnSODK68Q表达模拟乙酰化赖氨酸68导致人乳腺癌细胞中的氧化性应激，而用MnSODK68R模拟永久脱乙酰赖氨酸具有相反作用。
表达MnSOD K68Q的肿瘤细胞表现出Tam抗性。
先前已经显示，失调的MnSOD29,30,31与异常的细胞ROS水平和/或氧化性应激之间存在联系，这归因于几种不同机制23,32和对内分泌疗法的抗性。基于这些先前的出版物和上述鉴定MnSODK68Q作为体外肿瘤促进剂的结果，显然合理的是，与其它癌基因类似，增强MnSODK68Q的表达也可能间接或直接导致对Tam的抗性。
为了测试该理念，使用1μM羟基-Tam处理MCF7、MCF7-MnSODK68R和MCF-MnSODK68Q细胞5天，并且进行克隆形成存活测定。这些试验的结果显示组成型表达MnSODK68Q的MCF7(图6a)和T47D(图14a)细胞与表达MnSODK68WT或MnSODK68R的细胞相比，对羟基-Tam的细胞毒性表现出显著的抗性。此外，表达导致细胞MnSOD-K68-Ac增加的shSIRT3的MCF7(图6b)和T47D(图14b)细胞也表现出对羟基-Tam细胞毒性的抗性。这些试验表明MnSODK68Q表达与羟基-Tam-抗性肿瘤细胞之间存在联系。这些结果也添加了涉及MnSOD途径的作用的文献29,30,31，以及在Tam抗性中的ROS水平23,32。
Tam-抗性乳腺细胞表现出MnSOD-K68-Ac特征。
由于表达MnSODK68Q的乳腺癌细胞在体外表现出对Tam诱导的细胞毒性的抗性，显然选择对羟基-Tam抗性的MCF7细胞也可以展示出MnSOD-K68-AC特征。为了解决这个理念，将MCF7(图6c)和T47D(图14c)细胞在1μM羟基-Tam存在下培养3个月以产生羟基-Tam抗性(HTR)细胞。MCF7-HTR和T47D-HTR细胞均显示MnSOD-K68-Ac的增加(图6d、e)。此外，用作为SIRT3活性的代表的几种其它SIRT3脱乙酰化靶标(MnSOD-K122-Ac、IDH2-K413-Ac和OSCP-K139-Ac)的抗体染色也显示乙酰化增加(图14d)，这启示SIRT3活性降低。这些试验的结果表明，选择对Tam的抗性的ER+乳腺癌细胞系表现出MnSOD-K68-Ac特征，其也可以用作潜在的分子生物标志物。
通过用MnSODK68R表达或MnPAM歧化酶模拟物模拟赖氨酸68脱乙酰化来逆转Tam抗性。
为了进一步显示MnSOD-K68-Ac是Tam抗性的潜在标志物，用lenti-MnSODWT、lenti-MnSODK68Q和lenti-MnSODK68R感染HTR细胞，并且通过克隆形成细胞存活测定来测量羟基-Tam抗性。结果显示用lenti-MnSODK68R感染、而不是用lenti-MnSODWT或lenti-MnSODK68Q感染，逆转了羟基-Tam抗性(图6f和图14e)。此外，当用导致MnSOD乙酰化的lenti-SIRT3WT(图6g和图14f)，或用5μM GC4419(图6h和图14g)(通过同四聚体MnSOD所用的相同催化机制将超氧化物催化转化为过氧化氢的锰五氮杂大环状环配合物(MnPAM))处理感染MCF7-HTR和T47D-HTR细胞时，它们变得对羟基-Tam敏感。这些结果启示MnSOD-K68-Ac是对TAM具有抗性的潜在分子生物标志物和/或肿瘤特征。这些结果还表明，通过药理学提供MnPAM，例如GC4419，可以处理具有羟基-Tam抗性的细胞和/或可以逆转羟基-Tam抗性。因此，显示乳腺癌细胞中MnSOD-K68的乙酰化或模拟乙酰化使其具有羟基-Tam抗性，而用五氮杂大环歧化酶模拟物模拟MnSOD-K68的脱乙酰化或药理学模拟脱乙酰化赖氨酸68MnSOD的活性具有相反作用。还显示SIRT3诱导的MnSOD-K68脱乙酰化的丧失导致羟基-Tam抗性，并且此类抗性与人乳腺癌细胞中赖氨酸乙酰化增加相关，而模拟MnSOD-K68的脱乙酰化或用锰五氮杂大环歧化酶模拟物在药理学上模拟脱乙酰化赖氨酸68MnSOD的活性具有相反作用。
Tam暴露增加氧化性应激和单体MnSOD。
MnSOD活性与线粒体代谢紧密相关，并且HTR细胞表现出MnSOD-K68-Ac(AcK68)特征(图6d、e)；因此，测定HTR ER+乳腺癌细胞中的线粒体代谢谱。在这方面，MCF7-HTR(图7a)和T47D-HTR(图15a)细胞表现出MnSOD活性降低、线粒体超氧化物水平增加(图7b)和细胞过氧化氢增加，如通过CDCFH2氧化测量的(图7c)，以及GSSG/GSH比率增加(图7d和图15b)。最后，单体MnSOD在MCF7-HTR和T47D-HTR细胞中富集(图7e)，与对照MCF7和T47D细胞比较，这与MnSOD活性的降低(图7a)和MnSOD-K68-Ac的增加(图6d)一致。
此外，为了确定HTR细胞中这种增加的氧化性应激是否归因于MnSOD-K68的乙酰化状态，用lenti-MnSODWT、lenti-MnSODK68R和lenti-MnSODK68Q感染MCF7-HTR和T47D-HTR细胞。这些试验显示MnSODK68R的增强表达与表达MnSODK68Q或MnSODWT的细胞相比，逆转了线粒体超氧化物(图7f和图15c)、胞内过氧化氢(图7g和图15d)和GSSG/GSH比率(图7h和图15e)的增加。这些数据显示HTR增加MnSOD-K68-Ac，表明可能存在Tam抗性肿瘤特征，其还包括细胞ROS谱的变化，这已经由其它人显示23,30。因此，显示在羟基-Tam抗性人乳腺癌细胞中降低的MnSOD活性和增加的氧化性应激可以被模拟MnSOD-K68的脱乙酰化逆转。
Tam-抗性MCF7和T47D细胞表现出增加的Ki-67。
展示出MnSOD-K68-Ac特征(图6d)的MCF7-HTR(图7i和图16a)和T47D-HTR细胞(图16b、c)表现出增加的Ki-67水平，类似于管腔B乳腺恶性肿瘤，类似于MCF7-MnSODK68Q和T47D-MnSODK68Q细胞(图2c、d)。此外，用MnPAM歧化酶模拟物GC4419处理的MCF7-HTR(图16d、e)和T47D-HTR(图16f、g)细胞表现出降低的Ki-67 IHC染色，并且羟基-Tam+GC4419进一步降低Ki-67。GC4419或羟基-Tam和GC4419还逆转了MCF7-MnSODK68Q(图17a、b)和T47D-MnSODK68Q(图17c、d)细胞系中Ki-67 IHC染色的增加，这启示药理学模拟脱乙酰化赖氨酸68MnSOD的活性逆转了Ki-67的增加。因此，显示在羟基-Tam抗性(HTR)乳腺癌细胞中Ki-67水平增加，并且用锰五氮杂大环歧化酶模拟物模拟脱乙酰化赖氨酸68MnSOD的活性降低了HTR细胞中的Ki-67水平，并且使它们对羟基-Tam细胞毒性敏感。
为了确定过氧化氢对于在MCF7-MnSODK68Q细胞中观察到的HTR是否是必需的，我们用AdMitoCat感染这些细胞，其去除和/或显著降低线粒体过氧化氢水平，线粒体过氧化氢是过氧化物酶活性的关键和必需底物。克隆形成细胞存活试验的结果表明，降低的线粒体过氧化氢水平逆转了在组成型表达MnSODK68Q的MCF7细胞中观察到的HTR(图7j、k)。这些结果间接或直接启示，表达MnSOD乙酰化突变体的细胞需要过氧化氢来维持对Tam的抗性。因此，显示羟基-Tam暴露诱导的对羟基-Tam的抗性(HTR)与四聚体MnSOD和活性的丧失、增加的单体形式、增加的氧化性应激和增加的增殖相关，而在HTR癌细胞中用MnSODK68R模拟永久脱乙酰化的赖氨酸逆转了这些作用。
Tam-抗性异种移植物表现出更具侵袭性的表型。
为了测试表现出MnSOD-K68-Ac特征(图6d)的MCF7-HTR细胞是否在体内形成更具侵袭性的异种移植肿瘤，将MCF7和MCF7-HTR细胞注入免疫缺陷小鼠中，并且监测肿瘤生长。如预期的，没有雌激素补充，对照MCF7细胞不能在体内形成肿瘤。相反，在没有雌激素补充的情况下，MCF7-HTR细胞在6周内形成平均859mm3的肿瘤(图8a、b)，并且异种移植物植入为100％(图17e)，表明这些细胞表现出高度致瘤表型。最后，使用MCF7-HTR细胞构建用于脱乙酰化模拟突变体(MnSODK68R)的诱导型表达的Tet-On表达系统。因此，MCF7-HTR细胞最初用pTet-DualOn(Clontech)感染并且用嘌呤霉素选择，然后用pTre-Dual2-MnSODK68R感染和潮霉素选择，并且最后，验证这些细胞的MnSODK68R Tet-诱导(图18a、b)。使MCF7-HTR-Dual2-MnSODK68R异种移植物生长至100mm，并且将小鼠暴露于多西环素以诱导MnSODK68R表达。这些试验显示MnSODK68R的增强表达抑制了体内MCF7-HTR异种移植肿瘤细胞生长(图8c)。因此，显示用Tet-On诱导的MnSODK68R表达模拟MnSOD-K68的脱乙酰化抑制MCF7-HTR细胞中的异种移植物生长。
人管腔B肿瘤表现出高水平的MnSOD-K68-Ac。
缺乏Sirt3的小鼠发展为ER+、低分化并且显示高水平Ki-67的具有管腔B样表型的乳腺肿瘤5,7,33。为了确定是否存在展示出SIRT3/MnSOD-Ac特征丧失的人ER+肿瘤亚组，分析了包含所有四种乳腺恶性肿瘤亚型的乳腺癌患者组织微阵列(TMA)载玻片。使用抗-MnSOD-K68-Ac(参见图12a、b的抗体特异性)和抗-SIRT3抗体对TMA进行染色，并且显示了管腔A和B肿瘤样品的代表性IHC图像(图8d和示意图18c、d)。随后使用自动化HistoQuest软件定量染色强度，其揭示出与管腔A肿瘤样品相比，在管腔B样品中MnSOD-K68-Ac水平显著更高(图8e)，并且SIRT3蛋白水平显著更低(图8f)。此外，将来自管腔A与管腔B TMA的染色强度分层为低、中等和高染色启示可能存在表现出显著MnSOD-K68-Ac染色的管腔B肿瘤的亚组(图18c、d)。这些结果启示SIRT3/MnSOD-Ac特征是鉴定患有管腔B乳腺癌并且可能最受益于药理学干预以引起或模拟赖氨酸68脱乙酰化的女性的特定亚组的有用标志物。
方法
细胞系。将ER+MCF7和T47D人乳腺细胞在补充有10％胎牛血清(FBS，Sigma)和抗霉菌溶液(Sigma)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Gibco)中培养，所述ER+MCF7和T47D人乳腺细胞均获自ATCC，使用IDEXX BioResearch的CellCheck 9Plus的STR谱进行认证，并且在2016年4月使用支原体检测试剂盒InvivoGen,Inc测试支原体。将细胞维持在具有5％CO2的加湿37℃环境中。从E14.5同基因SIRT3+/+小鼠中分离pMEF(通过由InstitutionalAnimal Care and Use Committee(IACUC)批准并且符合相关动物研究伦理法规的方案)并且维持在具有5％CO2和6％氧气的37℃温育箱中，另有标注的除外。使MCF7和T47D细胞在1μM羟基-Tam中生长3个月以产生MCF7-HTR和T47D-HTR永久细胞系，并且冷冻几种不同的亚克隆。MCF7-HTR和T47D-HTR不用于>5代，并且使用新的细胞系。所有试验均使用50％汇合率的指数生长细胞培养物进行。
病毒质粒和短发夹RNA(shRNA)构建体和诱变。
为了包装慢病毒，用5μg DNA、5μg psPAX2包装质粒和500ng VSV.G包膜质粒转染293T细胞(得自ATCC)。72小时后收集病毒上清液，并且通过0.45μm过滤器(Corning)过滤。Lenti-SIRT3WT和脱乙酰化无效突变体(lenti-SIRT3DN)为来自Dr.Toren Finkel(NIDDK)的赠品。pLKO.1人SIRT3 shRNA购自OpenBiosystem。Lenti-MnSOD质粒(人)用作MnSODWT质粒并且用于定点诱变，即K68为精氨酸(R：脱乙酰基模拟物)或谷氨酰胺(Q：乙酰基模拟物)(Bioinnovatise)。使MCF7、T47D和NIH3T3细胞感染5MOI的慢病毒并且使用包含2μg/mL嘌呤霉素(Invitrogen)或100μg/mL硫酸G418(Invitrogen)的DMEM选择14天。2周选择期后，使细胞生长在包含10％FBS的DMEM中。
抗氧化酶的转导。不能复制的腺病毒载体AdCMV Bgl II(AdBgIII)和AdCMV线粒体-过氧化氢酶(AdMitoCat)由Dr.Douglas Spitz(University of Iowa)和Dr.MarceloBonini(Medical College of Wisconsin,WI)赠送。在病毒施用前一天将细胞铺板。加入期望数量的病毒颗粒24小时，然后将培养基更换为新鲜培养基并且在每次试验之前再放置48小时。
体外细胞转化测定。对于该研究，pMEF的自发无限增殖化是在第15代后继续分裂的能力。对于体外无限增殖化试验，将MnSOD或其定点突变体之一(K-R或K-Q)与c-Myc和/或Kras共感染到第三代pMEF中。每2天培养并且分裂细胞以防止汇合，并且以3.0×105个细胞铺板在新的100mm培养皿上。再经过15次传代(总计18次)后，细胞被视为无限增殖化的。
克隆形成细胞存活测定。对于克隆形成存活分析，使用适当的稀释度重新铺板指数生长的细胞，并且在常规生长培养基中14天后评估克隆形成存活。细胞用结晶紫染色，并且计数>50个细胞的集落并且用于计算克隆形成存活46。
软琼脂集落形成测定分析。将一万个细胞铺板在生长培养基中的0.6％基础琼脂基础层上的生长培养基中的0.3％琼脂上7,8。21天后，在×20显微镜(Zeiss)下使集落可视化，并且获取图像。
异种移植物体内肿瘤发生分析。将500万个表达MnSODK68WT、MnSODK68R或MnSODK68Q的MCF7、MCF7-HTR或MCF7细胞(从ATCC获得)注入6周龄的Foxn1nu无胸腺裸鼠(JacksonLaboratory)中(通过Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)批准并且符合相关动物研究伦理法规的方案)。每2-3天使用游标卡尺检查肿瘤大小，并且使用V＝1/2×W2×L计算体积。当肿瘤大小达到平均1000mm3时，处死小鼠，并且收集肿瘤用于重量和大小分析。
用于MCF-HTR MnSODK68R异种移植物的TetOn诱导系统。用pLenti-CMV-IE-Tet-OnAdvanced-IRES2-ZsGreen1-P2A-puro质粒(Clontech,Mountain View,CA,由ioinnovatise,Inc.改造,Baltimore,MD)感染MCF7-HTR细胞，并且在嘌呤霉素(1μg/mL)下选择并且选择绿色(MCF7-HTR TetON)。随后，将MCF7-HTR TetOn细胞用pLenti-SV40启动子-HygroR-SV40聚(A)/pTreDual2MnSODK68R-mCherry(MCF7-HTR TetOn MnSODK68R；Clontech,Inc.)感染，并且对mCherry和使用潮霉素(50μg/mL)选择。为了证实TetOn系统的活化，加入1μg/mL多西环素(Acros Organics，New Jersey)，并且24小时后，通过mCherry的存在验证表达，并且拍摄荧光图像。蛋白质印迹用于验证激活MnSODK68R的表达。在放置他莫昔芬丸粒(5mg丸粒，Innovative Research of America，Sarasota，FL)时，给8周龄裸鼠(Jackson Labs)右后胁腹注射5×106个MCF7-HTR TetOn MnSODK68R细胞。给予试验组包含多西环素(625ppm,Envigo Teklad Diets,Madison,WI)的饲料；对照组保持由Northwestern动物设施提供的标准饲料。在试验期间每三天更换一次饲料。每隔一天测量肿瘤，并且在试验结束时，通过由Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)批准并符合相关动物研究伦理法规的方案取出肿瘤用于分析。
免疫组织化学染色和分析。将乳腺癌组织阵列载玻片(BioMax)浸入100％二甲苯(Sigma)中5分钟和100％乙醇(Sigma)中5分钟两次。将载玻片依次用95％、80％和50％乙醇浸渍5分钟，然后浸入水中并且在95mL 95％乙醇和5mL 37％甲醛中固定2分钟。然后将载玻片用1×PBS(Corning)中的1％ Triton X-100处理20分钟，在1×PBS中洗涤三次5分钟，并且在1×PBS中的0.3％H2O2中猝灭20分钟。将载玻片用1×PBS中的10％驴血清(Sigma)、1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma)和0.3％ Triton X-100(Sigma)封闭2小时，然后在4℃用抗-MnSOD-K68-Ac抗体(1:250稀释，Abcam#ab137037)处理48小时。随后将这些载玻片在室温温育1小时，然后用1×PBS洗涤3次5分钟。将兔二抗(1:200稀释，A0545,Sigma)在抗体溶液中稀释并且施加于载玻片1小时，然后用1×PBS洗涤三次，每次5分钟。按照制造商的方案，用VECTASTAIN ABC试剂盒(Vector Laboratories)处理载玻片45分钟，以检测抗生物素蛋白/生物素化的酶复合物。根据制造商的方案，使用DAB过氧化物酶底物试剂盒(VectorLaboratories)处理载玻片，并且在苏木精(Sigma)中染色10分钟。然后将载玻片用100mL的70％乙醇和1mL的37％盐酸脱色，然后脱水。使用HistoQuest软件(Tissuegnostics)定量强度。
过氧化物酶活性测定。
将表达Flag-标记的MnSODWT、MnSODK68R和MnSODK68Q的100万个细胞在25mM Tris-HCl pH 7.4、150mM NaCl、1mM EDTA、0.1％NP-40、5％甘油、蛋白酶抑制剂(Biotool)和TSA(Trichostatin A，Sigma)中裂解30分钟。用Bradford测定法(BioRad)定量裂解物，并且使用抗-Flag抗体(Sigma)IPed。这些IPed蛋白的过氧化物酶活性通过使用邻苯三酚作为底物测定。在反应混合物中，终浓度为14mM磷酸钾(Sigma)、0.027％(v/v)过氧化氢(Sigma)和0.5％(w/v)邻苯三酚(Sigma)。轻敲板以混合样品和反应试剂，在室温温育10分钟，然后在OD 420nm读取。每3分钟记录A420的增加。对于所有测试样品和空白，使用最大线性速率或0.5分钟间隔获得ΔA420/20s。使用以下等式计算过氧化物酶活性：单位/mL＝[(ΔA420/20s测试样品-ΔA420/20s空白)(反应体积)(稀释因子)]/[(12)(0.1)]。
谷胱甘肽分析。
在1.34mM二亚乙基三胺五乙酸(DETAPAC，Sigma)中裂解70-80％汇合率的一百万个细胞，并且溶于143mM磷酸钠(Sigma)。然后向裂解物中加入6.3mM EDTA(Sigma)和5％5-磺基水杨酸(Sigma)。将50微升裂解物与溶于磷酸钠缓冲液中的700μL 0.298mM NADPH(Sigma)、100μL在磷酸钠缓冲液中的6mM 5,5’-二硫代-双-2-硝基苯甲酸(DTNB，Sigma)、100μL水和溶于水中的50μL 0.023U/μL谷胱甘肽还原酶(GR)(Sigma)混合。使用XMarkTM微孔板吸光度分光光度计(BioRad)每15秒在412nm处读取动力学吸光度，持续2.5分钟，并且将速率与标准曲线进行比较。在测定之前，将肿瘤在DETAPAC缓冲液中裂解，并且测量蛋白质浓度以标准化使用BCA方法校准的GSH水平。
MnSOD/SOD酶活性。
通过间接竞争性抑制试验测定总SOD和MnSOD活性47。通过黄嘌呤氧化酶从黄嘌呤产生超氧化物，并且通过记录氮蓝四唑(NBT)的还原速率来检测。SOD清除超氧化物，并且竞争性抑制NBT的还原。一个单位的SOD活性定义为抑制50％最大NBT减少所需的蛋白质量。为了获得MnSOD活性的量，加入5mM氰化钠以抑制CuZnSOD酶活性。使用BCA蛋白质测定法测量每个样品中的蛋白质水平48,49,50,51。
蛋白质印迹分析。
将细胞和组织用冷的1×PBS洗涤三次，收获，并且在具有蛋白酶抑制剂(Biotool)和TSA(Sigma)的25mM Tris-HCl pH 7.4、150mM NaCl、1mM EDTA、0.1％NP-40、5％甘油中裂解30分钟，然后通过Bradford测定定量，并且用以下物质进行免疫印迹：抗-MnSOD(1:1000稀释，Millipore,#06-984)、抗-MnSOD-K68-Ac(1:1000稀释，Abcam,#Ab137037)、抗-MnSOD-K122-Ac(1:500，Abcam,#Ab214675)、抗-SIRT3(1:1000稀释，Cell Signaling,#D22A3)、抗-IDH2(1:1000稀释，Cell Signaling,#56439)、抗-IDH2-K413-Ac(1:1000稀释，Epitomics,Inc,Burlingame,CA(该公司已由Abcam,Inc.收购))、抗-OSCP(1:1000稀释，Santa CruzBiotechnology,#sc-365162)、抗-OSCP-K139-Ac(1:1000稀释，Epitomics,Inc,Burlingame,CA)和抗-肌动蛋白(1:10,000稀释，Cell Signaling,#4970)。二抗包括抗-兔和抗-小鼠(1:10,000稀释，Cell Signaling，#7074，#7076)。对于MnSOD四聚体测定，将裂解的细胞在室温用0.1％戊二醛处理10分钟，然后用抗-MnSOD抗体免疫印迹样品。
使用MitoSox测定细胞超氧化物水平。
使用荧光染料二氢乙啶(DHE)(Life Technologies)的氧化来估计线粒体超氧化物的稳态水平。将细胞胰蛋白酶化，洗涤，然后在37℃在包含1×PBS与Mitosox Red(在0.1％ DMSO中2μM)的5mM丙酮酸盐中标记20分钟。标记后，将细胞保持在冰上。使用Fortessa流式细胞仪(Becton Dickinson Immunocytometry System,Inc.,MountainView,California；激发488nm，发射585，25nm带通滤波器)分析样品。在每个样品中分析10,000个细胞的平均荧光强度(MFI)，并且校正来自未标记细胞的自发荧光。将MFI数据相对于对照水平校准。
使用CDCFH2氧化估计细胞H2O2水平。
H2O2的稳态水平使用氧化敏感的5-(和6)-羧基-2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(CDCFH2)(Life Technologies)来估计。将细胞胰蛋白酶化并且用1×PBS洗涤一次，然后用CDCFH2或CDCF(10μg/mL,在0.1％DMSO中,15分钟)标记。标记后，将细胞保持在冰上。使用Fortessa流式细胞仪(Becton Dickinson Immunocytometry System,Inc.,MountainView,California；；激发488nm，发射530nm，25nm带通滤光器)分析样品。分析样品中10,000个细胞的MFI并且对来自未标记细胞的自体荧光校正。将MFI数据相对于对照水平校准。
使用MnSOD模拟物GC 4419处理的细胞存活试验。
为了测试指示氧化性应激的参数，用羟基-Tam和MnPAM歧化酶模拟物处理进行克隆形成测定。将细胞以每60-mm培养皿50,000个细胞的密度铺板，并且用1μM羟基-Tam(Sigma)和5μM GC4419(Galera Therapeutics)处理总计120小时。重复该方案，每24小时更换新鲜培养基，持续5天。在第6天，将细胞胰蛋白酶化，计数，并且使用适当的稀释度在对照培养基中重新铺板，并且评估克隆形成存活。
N-(ε)-乙酰基-赖氨酸掺入K68。
将由Andrzej Joachimiak,Argonne National Labs赠送的BL21(DE3)pMAGIC化学感受态大肠杆菌细胞用pEVOL-AcKRS和pET21a-MnSODK68TAG质粒或表达MnSOD-K68-Ac和MnSOD-WT蛋白的pET21a-wtMnSOD共转化。将携带pEVOL-AcKRS和pET21a-MnSODK68TAG质粒的细胞在具有300μg/mL氨苄西林、50μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素(37℃，220rpm)的100mLLB中在37℃温育3小时，并且向该培养物中加入50mM烟酰胺(Sigma)。当OD600达到1.1时，向培养物中加入2mM Nε-乙酰基-赖氨酸(Sigma)，并且通过加入0.4mM IPTG和0.2％阿拉伯糖(25℃，180rpm)再诱导细胞20小时。(用于制备物理乙酰化MnSOD-K68-Ac的细菌MnSOD表达和赖氨酸乙酰化tRNA突变质粒由Dr.Jiangyun Wang,Institute of Biophysics,ChineseAcademy of Sciences,Beijing,China赠送)。
将携带pET 21a-wtMnSOD质粒的BL 21(DE3)细胞在具有300μg/mL氨苄西林和50μg/mL卡那霉素的5mL LB培养基中培养，并且将1ml该培养物在具有300μg/mL氨苄西林和50μg/mL卡那霉素的100mL LB中培养过夜(37℃，200rpm)。第二天，将具有300μg/mL氨苄西林和50μg/mL卡那霉素的1L LB用10mL过夜培养物接种～2.5小时，直至OD600＝0.6，然后用0.4mM IPTG(25℃.180rpm)诱导细胞过夜。所有纯化步骤均在冰上进行。通过离心(6000rpm，10分钟，4℃)收获1L LB中的大肠杆菌细胞，并且用包含20mM咪唑、50mM Tris-HCl、200mM NaCl、5mM MgCl、50mM烟酰胺，pH＝8.0的50mL缓冲液I洗涤。然后将离心后的沉淀用补充有1mM PMSF和～1mg/mL溶菌酶的50mL缓冲液I悬浮，并且将裂解物在4℃温育10分钟。然后通过超声循环(5秒开，6秒关，25分钟)提取蛋白质。通过离心(13,000×g，30分钟，4℃)澄清提取物，并且弃去沉淀。总之，将0.2mL Ni2+-NTA珠粒加入到上清液中，并且在4℃搅拌温育1小时。
将珠粒转移到柱中并且用包含增加的咪唑梯度(50、75、100mM)的缓冲液I洗涤三次，并且在补充有200mM咪唑的1mL缓冲液I中洗脱蛋白质。通过SDS-PAGE分析蛋白质，然后使用Ultra-15离心过滤单元(10kDa,Millipore AmiconTM,USA UFC800324)浓缩。然后将洗脱的蛋白质再缓冲至缓冲液II(50mM Tris-HCl、200mM NaCl、5mM MgCl2、50 mM烟酰胺、pH8.0)，并且上样到具有GE HisTrap HP柱(产品#GE17524701)的平衡的Ni2+-NTA
Figure BDA0004113464730000751
FPLCPurifier系统上，并且通过Superdex 200Increase 10/300GL柱(GE Healthcare，产品#GE28-9909-44)在包含50mM磷酸钾(pH＝7.8)的缓冲液中进一步纯化。使用自动级分收集器收集峰级分。还记录了作为洗脱体积/时间的函数的A28013,27,28。测定峰值蛋白级分浓度，并且用抗-MnSOD和抗-MnSOD-K68-Ac进行免疫印迹。测量剩余的纯化蛋白质的过氧化物酶活性和MnSOD活性。然后对洗脱的级分进行进一步分析。根据制造商的说明书，使用凝胶过滤低分子量和高分子量试剂盒(GE Healthcare)产生校准曲线，并且如图4e中所示，其用于确定峰1和峰2的相对大小。
免疫荧光样品制备和图像获取。
将接种在玻璃盖玻片上的细胞在4％多聚甲醛中固定，然后用1％BSA和10％正常山羊血清在1×PBS中封闭。将细胞与1×PBS中的抗-Ki-67(c-bioscience)抗体一起温育，然后在具有5％山羊血清的1×PBS中与缀合了Alexa Fluor 647的山羊抗-兔IgG(Invitrogen)一起温育。将细胞在1×PBS中洗涤，固定，并且用荧光显微镜成像。使用激光扫描共聚焦显微镜(Nikon A1R)捕获荧光图像。在相同的增益和偏移设置下收集所有图中的配对图像。将收集后处理均匀地应用于所有配对的图像。图像在从各个场的z-系列堆叠扫描中采集之后呈现为单个光学层，或者显示为最大强度投影以表示共焦堆叠。
统计分析。
使用GraphPad Prism for Windows(GraphPad Software,San Diego,CA)进行统计分析。误差条表示平均值±SEM。使用具有Tukey事后分析的单向ANOVA分析来研究三组或更多组之间的差异。对于两个柱状图(即，为两组的平均值之间的显著性差异)，使用t-检验。将所有试验重复至少三次。在p<0.05推定统计学显著性。
实施例2
大部分诊断患有转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)的男性最初将表现出对雄激素剥夺疗法(ADT)和/或雄激素受体抑制(包括恩杂鲁胺(ENZ))的极佳响应，两者均靶向雄激素受体(AR)信号传导途径81。然而，随着时间的推移，几乎大部分男性将表现出其疾病的进展。因此，具有AR途径疗法抗性的男性的致死性至少在很大程度上是由于对这些活性剂的抗性的发生，并且重要的是缺乏有效的替代全身疗法82。因此，鉴定导致对AR途径抑制缺乏响应的特定过程(包括ADT(ADTR)和ENZ(ENZR)抗性)、潜在机制、新的治疗干预手段和预测特征具有重要性。在这方面，已经鉴定了多种机制有助于ADTR/ENZR，其主要集中于AR，包括AR扩增和超敏反应、导致混杂的AR突变、共激活因子/共阻遏物的突变和AR非依赖性肿瘤内雄激素产生81,83,84，它们用作提供替代增殖和存活刺激的逃逸途径。虽然大部分男性通过涉及改变AR信号传导的机制发生ADTR，但是新出现的抗性机制以谱系可塑性特性的发展为中心85-87。
在NCI白皮书(Beltran，2019)和生殖综述(Yuan，2019，Cancer Discovery)88中，提出了由于微环境线索、随机遗传和/或表观遗传改变或治疗施加的选择压力，细胞谱系可塑性(或干性)有助于肿瘤异质性和抗性肿瘤细胞表型的发展。谱系可塑性表型的发展最近已经成为前列腺癌中治疗抗性的重要机制81,84，这在大约20％的晚期前列腺癌患者中发生，代表了重要的临床和治疗意义86,87。在这方面，长时间暴露于ADT与肿瘤细胞亚群表现出AR信号传导依赖性和管腔前列腺标志物的丧失以及干细胞样发育程序的诱导相关85,86。线粒体代谢的破坏，包括ROS水平的异常是导致药物抗性表型的一种潜在机制，其根源于谱系可塑性样特性的发展87。因此，将谱系可塑性定义为与AR调节的谱系特征的丧失相关的CRPC，其中可塑性由细胞正常代谢生理学的破坏驱动，导致获得新的表型，包括AR非依赖性、持续的肿瘤细胞增殖和ENZR。
抗氧化酶的解毒活性在肿瘤中失调89,90并且随后代谢稳态的丧失对应于对抗癌剂(ADT/ENZ)表现出抗性的肿瘤89-91。MnSOD是线粒体解毒酶(即超氧化物歧化酶)，当缺失或失调时，其在代谢、肿瘤发生和治疗抗性表型中起作用。MnSOD-Ac可以作为代谢和生物能量平衡与肿瘤细胞生长和/或存活之间的联系，并且在特定的细胞条件下，它可以作为ENZR肿瘤表型的体内驱动物起作用。已经鉴定了以MnSOD-Ac为中心的线粒体信号传导轴，其在失调时破坏细胞代谢，导致异常的ROS(Zhu,2019,Nature Commun.)52以及异常稳定的HIF2α激活去分化程序(He,2019；Proc.Natl.Acad.Sci.)55。在某些情况下，当MnSOD-K68-Ac存在于其正常由MnSODK68Q建模的生理环境之外时，它破坏细胞代谢，增加ROS水平，其稳定HIF2α，产生谱系可塑性表型和ENZR肿瘤细胞89,90。因此，用适当的治疗剂(即，MnPAM歧化酶模拟物，例如GC4419)靶向MnSOD-K68-Ac轴可以降低谱系可塑性/干性并且提供有效的治疗选择。
ENZR前列腺肿瘤细胞表现出增加的MnSOD-K68-Ac和降低的MnSOD活性
为了解决MnSOD-K68-Ac和EnzR之间是否存在联系，使用了两种ENZ敏感的前列腺肿瘤细胞系LNCaP或22RV1，将其在5μM ENZ中培养3周，然后使用建立的方法91在10μM下连续生长，以选择ENZR细胞。LNCaP-EnzR(图19a)或22RV1-EnzR(数据未显示)细胞的免疫印迹显示MnSOD-K68-Ac增加，暗示改变的MnSOD生物学可能是驱动ENZR的一种潜在机制。由于赖氨酸68乙酰化改变了MnSOD四聚体界面处的表面电荷，因此，我们评估了LNCaP-ENZR细胞中MnSOD的寡聚化状态。交联试验显示四聚体复合物减少(图19b)。该凝胶还显示了三聚体和二聚体条带，其使用半天然分离方法未观察到，这意味着这些是可能由于严格的戊二醛交联分离方法引起的伪影条带。
LNCaP-ENZR(图19c)和22RV1-ENZR(数据未显示)细胞表现出MnSOD活性降低和细胞ROS水平增加(数据未显示)。这些结果暗示，当MnSOD-K68-Ac由于长期ENZ暴露或伴随MnSOD K68乙酰化模拟突变基因(MnSODK68Q)的强制表达而增加时，它破坏细胞代谢，包括异常的ROS水平，从而导致前列腺肿瘤组织培养细胞中的ENZR表型。最后，这些是合并的细胞，因此，显然细胞亚群可能具有不同的ENZR机制，然而，也显然失调的MnSOD生物学是至少一种机制。因此，显示恩杂鲁胺抗性前列腺癌细胞(LNCaP-ENZR)显示MnSOD上赖氨酸68的乙酰化增加，以及MnSOD四聚体形式和活性的水平降低。
MnSODK68R的表达逆转ENZR，而相反MnSODK68Q诱导PCa细胞中的ENZR
为了确定MnSOD-K68-Ac-ROS轴是否在ENZR表型中起作用，将ENZR组织培养模型细胞用MnSOD脱乙酰化模拟突变体(MnSODK68R)感染，其富集了四聚体MnSOD并且增加了MnSOD活性。在感染后72小时在培养于10μM ENZ中的细胞中进行的克隆形成细胞存活试验显示，感染了lenti-MnSODK68R的LNCaP-ENZR(图20a，柱图1与2)和22RV1-ENZR(数据未显示)细胞从ENZR转化为敏感表型。MnSODK68R水平通过用抗-Flag抗体进行免疫印迹得到证实。MnSODK68R表达还降低了细胞ROS水平(数据未显示)，这意味着当MnSOD-K68-Ac存在于其正常生理环境之外时，它破坏细胞代谢，导致ENZR表型。因此，也会破坏MnSOD生物学的乙酰化模拟物的表达也应当诱导ENZR表型。实际上，用预先显示模拟MnSOD-K68-Ac的表达乙酰化的模拟突变基因(MnSODK68Q)的慢病毒感染的LNCaP细胞(Zhu,2019,Nature Commun.)也表现出ENZR表型。因此，显示用MnSODK68R表达模拟MnSOD-K68脱乙酰化逆转了LNCaP-ENZR细胞中的ENZR，而用MnSODK68Q模拟MnSOD-K68的乙酰化诱导LNCaP细胞中的恩杂鲁胺抗性。
通过用MnPAM歧化酶模拟物模拟赖氨酸68脱乙酰化来逆转ENZR抗性。
图20a-20b中的数据启示，由于异常的MnSOD-K68-Ac和ROS水平导致的MnSOD生物学的破坏可能至少部分地在ENZR表型的发展中起作用。因此，推定使用锰五氮杂大环状环配合物(MnPAM)歧化酶模拟物GC4419(一种通过同型四聚体MnSOD所用的相同催化机制将超氧化物催化转化为过氧化氢的活性剂)恢复MnSOD活性可以使ENZR逆转/转化为敏感表型。实际上，通过克隆形成存活试验测量，用GC4419处理的LNCaP-ENZR细胞在ENZ存在下表现出肿瘤细胞存活的显著降低(图21a，左侧两个条形图)。此外，在LNCaP-MnSODK68Q细胞中观察到的ENZR(图21a，左侧两个条形图)也通过GC4419暴露转化为敏感表型(右侧两个条形图)。表现出ENZR的LNCaP-MnSODK68Q细胞(图20b，条形图3)也用于暴露于GC4419的体内鼠后肢异种移植物试验。GC4419的剂量和药代动力学基于鼠模型的数据92-93。在有或没有ENZ处理的小鼠中生长的LNCaP-MnSODK68Q细胞(图21b，图中框的顶部图)表现出类似的生长特征，与为ENZR的LNCaP-MnSODK68Q异种移植物一致。相反，用GC4419处理LNCaP-MnSODK68Q鼠异种移植物(图中框的底部图的第二个)，并且在更大程度上使用GC4419+ENZ处理鼠异种移植物(图中框的底部图)导致异种移植物生长的显著抑制。因此，显示用锰五氮杂大环歧化酶模拟物药理学模拟脱乙酰化赖氨酸68MnSOD的活性既抑制LNCaP-ENZR肿瘤的生长，又逆转LNCaP-ENZR/LNCaP-MnSODK68Q细胞和肿瘤中的恩杂鲁胺抗性。
该结果可以解释令人惊讶的临床数据，其显示在特定条件下MnSOD水平与更具侵袭性的乳腺癌正相关，这意味着MnSOD还可以充当肿瘤促进剂，而不是其更确定的作为肿瘤抑制剂(TS)的功能95-97。这些研究和以前的数据52,55启示MnSOD的二分作用，其中四聚体在理论上在肿瘤起始的早期增殖阶段期间充当TS。然而，一旦致癌进展，单体MnSOD-K68-Ac可以建立更具侵袭性的肿瘤表型。因此，在特定条件下，例如营养状态、遗传损伤或细胞应激下，MnSOD可以从四聚体SOD转变为单体过氧化物酶。在该模型中，我们推定来自能量产生的正常代谢需求的细胞和/或线粒体应激；然而，由于MnSOD-K68-Ac，连续的ENZ暴露破坏了MnSOD生物学，使平衡朝向更高水平的单体形式MnSOD移动。因此，该过程可能起到直接导致ENZR，更广泛地AR途径指导的治疗抗性，以及促进肿瘤生长的其它机制的作用。此外，实施例1中MnSOD-K68-Ac支持雌激素途径指导的治疗抗性(例如TamR)的类似观察结果启示，这是对抗癌激素途径指导的疗法的抗性的共有机制。最后，用MnPAM歧化酶模拟物例如GC4419恢复正常的脱乙酰化赖氨酸8MnSOD活性可以恢复细胞代谢，并且重要的是，逆转ENZR，并且更一般地逆转激素途径指导的疗法抗性、肿瘤细胞表型。
前列腺肿瘤分级与增加的MnSOD-K68-Ac水平相关
使用基因组学，已经显示MnSOD-Ac与前列腺癌之间的相关联系98，为了扩展该数据，将包含21个PIN、28个3级和25个4级前列腺肿瘤的组织微阵列(TMA)用我们的抗-MnSOD-K68-Ac抗体染色，并且通过染色强度对样品进行评分。通过Tissue-Gnostics软件的定量显示MnSOD-K68-Ac染色的显著增加，其与增加的肿瘤等级相关(图22a、b)。这些结果显示，存在表现出MnSOD-K68-Ac(AcK68)特征的人前列腺肿瘤，并且该AcK特征的强度与更具侵袭性和更具进展性的疾病相关。
MnSOD-K68-Ac/ROS/HIF2α轴的失调指导谱系可塑性ENZR肿瘤表型。
尽管ENZR的机制包括广泛的基因突变、AR剪接变体、AR失调和AR相关的信号传导途径，但存在通过干细胞样机制表现出ENZR的转移性前列腺肿瘤亚群，其不依赖于AR信号传导87。为了确定MnSODK68Q表达导致ENZR的机制是否通过AR信号传导失调进行，使用LNCaP-3xAR-LNCaP细胞，其包含与最小启动子相关的3xAR结合位点下游的mCherry报道基因，其是测定AR信号传导的代理。用lenti-MnSODK68Q感染这些细胞并且随后的细胞(LNCaP-3xAR-Cherry-MnSODK68Q)表现出类似于LNCaP-MnSODK68Q细胞的ENZR(参见图20b，条形图3)。令人惊讶的是，与对照细胞相比，这些细胞没有表现出AR蛋白水平(图23a)或通过mCherry表达测量的AR转录活性(图23b)的任何变化。相反，这些细胞表现出与谱系可塑性相关的三种下游生物标志物HIF2α、SOX2和OCT4水平的增加(图24a)。这具有重要性，因为HIF2α稳定化可以诱导谱系可塑性表型和ENZR。最后，HIF2α敲低降低了SOX2和Oct4水平(数据未显示)并且将ENZR肿瘤细胞逆转为敏感表型(图24b，条形图5对比条形图6)。因此，推定由于MnSODK68Q的表达，破坏的细胞代谢稳定HIF2α，导致谱系可塑性性质，这是前列腺肿瘤亚群中ENZR表型的潜在新机制。因此，这些结果启示MnSOD-K68-Ac/ROS/HIF2α轴可以为新干预手段的治疗靶标。因此，显示LNCaP-MnSODK68Q细胞在雄激素受体(AR)的表达或活性方面未表现出任何变化。还显示MnSOD-Ac-K68/ROS/HIF2α轴的失调指导前列腺癌细胞中的干性表型，其也与对雄激素途径疗法的抗性相关。
实施例3
雌激素受体阳性(ER+)侵入性导管癌(IDC)，即最常见类型的乳腺癌，通常用选择性雌激素受体调节剂(SERM)治疗，其在多项研究中已显示改善临床结果99,100。ER+IDC被分类为管腔A与管腔B癌(LuBCa)。占美国大多数乳腺癌死亡的LuBCa表现出侵袭性肿瘤特征，包括升高的增殖指数(高Ki-67)、低分化(高级别)和增加的复发和转移风险101,102。患有LuBCa的女性的致死率至少部分是由于对选择性雌激素受体调节剂(SERM)的抗性的发生和缺乏替代性全身疗法所致103。因此，鉴定SERM抗性机制具有巨大的临床重要性。
尽管ER途径在乳腺癌中起关键作用，并且阻断ER信号传导的内分泌疗法是高度有效的，但随着时间的推移，由于内分泌抗性的发展，ER+女性的一小部分复发99,100。内分泌抗性的多种机制已经得到鉴定，包括ER信号传导途径的多种组分的失调，改变的细胞周期和细胞存活过程，以及为肿瘤提供替代增殖和存活刺激的逃逸途径的激活99,104。尽管大多数对SERM的抗性涉及这些过程之一，但越来越被接受的机制涉及发育谱系可塑性。在这方面，最近发布了一份NCI白皮书(Beltran,2019)86和生殖综述(Yuan,2019,Cancer Discovery)88描述了由于微环境线索、随机遗传/表观遗传、代谢改变或其它疗法施加的选择压力，所述谱系可塑性有助于肿瘤异质性，并且重要的是，有助于抗性表型的发展。谱系可塑性应当理解为可逆的或不可逆的重编程，其中成熟体细胞可以通过细胞“身份”的变化，通过去分化为祖细胞样状态或通过转分化为替代的分化细胞类型而显示可塑性，导致新表型的出现105-109。线粒体生理学的破坏可能是一种新的机制，其导致谱系可塑性和肿瘤细胞如何建立对治疗干预的抗性表型110,111。因此，谱系可塑性也可能导致ER+LuBCa IDC亚组中的治疗抗性表型。
抗氧化酶在肿瘤中失调108,109，随后代谢动态平衡的丧失与肿瘤细胞表现出治疗抗性相对应108-110。锰超氧化物歧化酶(MnSOD)是一种关键的线粒体酶，当缺失或失调时，其在肿瘤发生中起作用，并且重要的是在治疗抗性中起作用。尽管长期以来已经启示线粒体ROS、MnSOD活性和肿瘤细胞抗性的失调之间的机制联系，但支持该理念的严格模型是有限的。MnSOD乙酰化(Ac)的水平可以至少在某种程度上关联代谢和生物能量平衡与肿瘤细胞生长和/或存活，并且在特定的细胞条件下，通过诱导谱系可塑性而作为肿瘤抗性的体内驱动物起作用。例如，存在以MnSOD-AC为中心的线粒体信号传导轴，其在失调时破坏细胞代谢，导致异常的ROS水平(Zhu,2019,Nature Commun.)52，并且异常稳定HIF2α，其激活去分化程序(He,2019；Proc.Natl.Acad.Sci.)55。因此，基于其赖氨酸68(K68)乙酰化状态，MnSOD显然表现出二分功能，其中脱乙酰化的同型四聚体形式充当针对持续/异常ROS的保护性解毒酶。相反，K68-Ac抑制同型四聚体形成并且使MnSOD平衡向主要单体形式的MnSOD移动，该单体形式的MnSOD起过氧化物酶和/或癌蛋白的作用。因此，当MnSOD-K68-Ac存在于其正常生理环境之外时，例如如由MnSODK68Q表达建模的，它破坏细胞代谢，增加ROS水平，稳定HIF2α并且促进谱系可塑性和PanR(多重疗法抗性)表型112,113。因此，用适合的MnPAM歧化酶模拟物(例如，GC4419)置换MnSOD-K68-Ac轴可以提供有效的新治疗选择以解决对多重疗法的抗性。
MCF7-MnSODK68Q细胞表现出对氟维司群(Fulv)和哌柏西利(Palb)的抗性
PALOMA-3114研究显示，与单独的Fulv相比，Fulv(雌激素受体破坏剂)和Palb(细胞周期抑制剂)的组合改善了无进展存活(PFS)，而在内分泌抗性女性中未观察到存活有益性。为了评估表达MnSODK68Q的细胞是否表现出对这些活性剂的抗性，进行了克隆形成肿瘤细胞存活研究，其显示与表达MnSODWT的MCF7细胞相比，MCF7-MnSODK68Q细胞表现出对Fulv(Fulv-R，图25a)和Palb(Palb-R，图25b)的抗性(条形图2对比条形图4)。还显示将MnPAM歧化酶模拟物GC4419和Palb组合导致MCF7-MnSODK68Q肿瘤细胞杀伤增加(图25C)。因此，显示在乳腺癌细胞中用MnSODK68Q表达模拟MnSOD-K68的乙酰化诱导氟维司群抗性(Fulv-R)和哌柏西利抗性(Palb-R)，并且用锰五氮杂大环歧化酶模拟物在药理学上模拟脱乙酰化赖氨酸68MnSOD的活性均抑制MnSODK68Q乳腺癌细胞的生长并且恢复其对哌柏西利的响应。
破坏MnSOD-Ac-K68/HIF2a轴导致乳腺癌细胞中的谱系可塑性
破坏线粒体代谢可以重新编程肿瘤，包括乳腺癌，以显示谱系可塑性115，即由于细胞环境的变化，例如遗传/表观遗传损伤或暴露于治疗剂，导致替代细胞“命运”和肿瘤抗性表型的细胞发育过程104,116 ENREF48。MCF7-MnSODK68Q和T47D-MnSODK68Q细胞没有表现出ER信号或ER相关途径的变化，这意味着TamR通过ER非依赖性机制出现54。然而，还显示MCF7-MnSODK68Q细胞表现出HIF2α水平增加(图26a)，已知促进谱系可塑性性质。此外，OCT4和SOX2(两种已建立的干性标志物)的水平也增加(图26a)。重要的是HIF2α敲低还降低了SOX2和OCT4水平(数据未显示)，以及将TamR细胞转化为敏感的肿瘤细胞表型(图26b，条形图5对比条形图6)。这些结果与公开的数据一致，其中HIF2α与远端复发和不良结果的风险增加相关。这表明谱系可塑性的诱导可能是在表达MnSODK68Q的乳腺肿瘤细胞中导致更具侵袭性的肿瘤和TamR表型的机制。因此，显示MnSOD-Ac-K68/ROS/HIF2α轴失调指导乳腺癌细胞中的干细胞表型，其也与对雌激素途径疗法的抗性相关。
异常HIF2α水平促进谱系可塑性，导致化学抗性和转移。
表达MnSODK68Q的乳腺肿瘤细胞可能表现出对通常用于治疗患有LuBCa的女性的多种活性剂具有抗性的PanR肿瘤细胞表型。因此，通过暴露于5μM Cispl 3个月，选择MCF7细胞的顺铂抗性(Cispl-R)。这些MCF7-Cispl-R细胞表现出MnSOD-K68-Ac和HIF2α水平增加(图27a)，并且还表现出增加的ROS水平(图27b)，这意味着异常的MnSOD-K68-Ac通过增加的ROS水平导致HIF2α稳定。为了测试这一理念，我们显示了用GC4419或HIF2α敲低在药理学上模拟脱乙酰化赖氨酸68MnSOD的活性降低了细胞ROS水平(数据未显示)。最后，用GC4419或shHIF2α处理的MCF7-Cispl-R显示SOX2和OCT4水平降低(数据未显示)，并且将Cispl-R细胞转化为敏感表型(图27c)。该数据暗示，HIF2α由于异常的MnSOD-K68-Ac和ROS水平而稳定化导致谱系可塑性和Cispl-R表型。因此，显示MnSOD-Ac-K68/ROS/HIF2α失调指导PanR(对癌症治疗剂的多重疗法抗性)。基于该数据，我们提出MnSOD-K68-Ac促进异常ROS和HIF2α水平，导致干性特性富集，其诱导乳腺肿瘤细胞PanR表型，该表型对用锰五氮杂大环歧化酶模拟物药理学模拟脱乙酰化赖氨酸68MnSOD的活性敏感并且可以被其逆转。
实施例4
锰超氧化物歧化酶(MnSOD)乙酰化(Ac)是关键的翻译后修饰，其在多种疾病模型中具有重要的调节剂解毒活性。MnSOD赖氨酸-68(K68)乙酰化(AcK68)导致功能从清除超氧化物的同型四聚体改变为过氧化物酶定向的单体。选择用于在顺铂(CDDP)和多柔比星(DXR)中连续生长的雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌细胞系(MCF7和T47D)表现出MnSOD-K68-Ac的浓度依赖性增加。此外，通过经验证的乙酰化模拟突变基因(MnSODK68Q)的表达建模的MnSOD-K68-Ac也导致对CDDP和DXR的治疗抗性、四聚体MnSOD的丧失、线粒体结构和形态改变以及异常的细胞代谢。MnSODK68Q在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中的表达诱导体外转化许可表型。
顺铂和多柔比星抗性乳腺癌细胞表现出MnSOD-K68-Ac的增加
MnSOD-K68-Ac在患有管腔B乳腺恶性肿瘤的女性中富集52，其通常在内分泌疗法中复发，并且是用于他莫昔芬抗性(TaMR)发生的基于线粒体的信号传导网状结构，如使用乳腺癌组织培养细胞所确定的。在本实施例中，探索了这种抗性表型是否可以在患有管腔B乳腺癌的女性的其它标准治疗(包括顺铂(CDDP)和多柔比星(DXR))中扩展到更广泛的应用。为了解决这一问题，使用标准方法在MCF7和T47D(两种已建立的ER+乳腺癌细胞系)中选择组织培养物对抗癌剂的抗性53。用三种不同剂量的CDDP(250nM、500nM、1μM)和DXR(500pM、1nM和2nM)选择MCF7细胞抗性3个月。用三种不同剂量的CDDP(2.5μM、5μM、10μM)和DXR(5nM、10nM和20nM)选择T47D细胞的抗性3个月。CDDP抗性和DXR抗性MCF7和T47D细胞均显示MnSOD-K68-Ac的剂量依赖性增加(图28a、28b和28d-28e)，而总MnSOD蛋白水平没有变化。为了具体地研究K68乙酰化对药物抗性的影响，制备K68乙酰化模拟物(MnSODK68Q)和脱乙酰模拟物(MnSODK68R)突变体，其中用谷氨酰胺(Q)取代赖氨酸(K)模拟组成型乙酰化氨基酸状态，而用精氨酸(R)取代模拟组成型脱乙酰化54,52,55。过表达MnSODK68Q的MCF7和T47D细胞对最高剂量的CDDP(MCF7为1μM，T47D为10μM)和DXR(MCF7为2nM，T47D为20nM)的短期处理(48小时)显示出更高的抗性(图28c和28f)。这些结果清楚地启示通过失调的MnSOD-Ac破坏MnSOD生物学在MCF7和T47D乳腺癌细胞的PanR肿瘤细胞表型中的作用。与此一致，在实施例1和3中，过表达MnSODK68Q的MCF7和/或T47D乳腺癌细胞表现出对用羟基-Tam、Fulv和Palb处理的抗性。因此，显示作为多重疗法抗性的实例的顺铂和多柔比星抗性乳腺癌细胞表现出MnSOD-K68-Ac的增加，并且用无抗性乳腺癌细胞中MnSODK68Q的表达模拟MnSOD-K68乙酰化增加了它们对化疗的抗性，与PanR表型一致。
细胞系
将野生型ER+MCF7人乳腺癌细胞和无限增殖化MnSOD-/-小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)在37℃与5％CO2在常规生长培养基中培养，所述培养基由具有10％胎牛血清(FBS；Sigma)和1％抗生素抗霉菌溶液(Sigma)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM,Gibco)组成。从同基因小鼠胚胎(E13.5)分离原代MEF，并且在37℃与5％CO2和6％氧气培养。使慢病毒感染的MCF7和MEF在具有1μg/mL嘌呤霉素的培养基中生长。将顺铂和多柔比星抗性MCF7细胞处理超过3个月以建立永久细胞系。所有试验均使用50％-70％汇合率的指数生长细胞进行。
慢病毒感染
将人lenti-MnSOD质粒用于定点诱变，其中68位的赖氨酸突变为精氨酸(脱乙酰化模拟物)或谷氨酰胺(乙酰化模拟物)(Bioinnovatise)。用5μg关注的DNA、5μg psPAX2包装质粒和300ng VSV.G包膜质粒转染293T细胞。过夜温育后加入新鲜培养基，再经过48小时后收集病毒上清液，并且使用0.45μm过滤器(Corning)过滤。使MCF7和MEF在40％汇合率时用10μg/mL聚凝胺实施慢病毒感染72小时。随后用常规培养基回收细胞24小时，然后用1μg/mL嘌呤霉素选择。
克隆形成细胞存活测定
为了通过测试低密度下的细胞生长来评价克隆形成细胞存活，使用系列稀释将500个指数生长的细胞一式三份铺板在6-孔板中，并且在常规生长培养基中14天全程检查细胞的生长。将细胞用70％乙醇固定5分钟，然后用0.5％结晶紫(在25％甲醇中)染色20分钟。拍摄染色板的照片，并且计数超过50个细胞的集落并且用于计算克隆形成存活。
软琼脂集落形成测定
将10,000个细胞一式三份铺板在生长培养基1X中的0.6％基础琼脂基础层上的生长培养基1X中的0.3％琼脂上(生长培养基2X由补充有20％FBS、2％青霉素-链霉素、1％2.5M葡萄糖和2％ Glutamax 100X的DMEM组成)。历经3周期限监测集落的大小，并且在3周结束时，通过显微镜观察集落生长并且获得图像。
MTT细胞增殖测定
使用MTT增殖测定试剂盒(ab211091)测量细胞增殖。将10,000个指数生长的细胞在常规生长培养基中每孔铺板到96-孔板中，一式三份。过夜后用特定药物处理细胞并且温育48小时。然后弃去处理培养基，并且向每个孔中加入50μL MTT试剂和50μL无血清培养基的混合物，并且在37℃温育3小时。然后加入150μL MTT溶剂，并且将板避光振荡15分钟。在OD＝590nm处读取吸光度并且用于评估细胞增殖。
将N-(ε)-乙酰基-赖氨酸掺入和分离到MnSOD-K68中
用来自M.Barkeri的表达乙酰基-赖氨酰基-tRNA合成酶/tRNACUA对和允许将N-(∈)-乙酰基-l-赖氨酸(AcK)掺入K68中的位点特异性突变的pET21a-MnSODK68TAG共转染BL21(DE3)pMAGIC细菌。用pEVOL-AcKRS转化BL21(DE3)pMAGIC细胞，并且将pET21a-MnSODK68TAG在具有300μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的3mL无菌LB培养基中培养，然后将1mL培养物在具有300μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的100mL LB培养基中培养过夜(200rpm，37℃)。将1mL过夜培养物接种在具有相同抗生素浓度的100mL LB培养基中，并且在220rpm，37℃振荡直至OD＝600nM达到0.6。用0.4mMIPTG、烟酰胺、阿拉伯糖和N-乙酰基赖氨酸诱导细菌培养物，并且在室温以180rpm振荡过夜。
用pEVOL-AcKRS转化BL21(DE3)pMAGIC细胞，并且将pET21a-MnSODK68TAG在具有300μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的3mL无菌LB培养基中培养，然后将1mL培养物在具有300μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的100mL LB培养基中培养过夜(200rpm，37℃)。将1mL过夜培养物接种在具有相同抗生素浓度的100mLLB培养基中，并且在220rpm，37℃振荡直至OD 600达到0.6。用0.4mM IPTG、烟酰胺、阿拉伯糖和N-乙酰基赖氨酸诱导细菌培养物，并且在室温以180rpm振荡过夜。
在具有1.5mg/mL PMSF和1mg/mL溶菌酶的缓冲液(20mM咪唑，50mM Tris-HCl，200mM NaCl，pH＝8)中裂解蛋白质。将裂解物在冰上温育10分钟，超声处理20分钟(10秒开，5秒关，50％振幅)，并且离心上清液(13,000g，30分钟)。0.2mL Ni2+NTA珠粒加入到收集的上清液中并且在4℃旋转1小时。通过使上清液通过ProBond纯化系统过滤柱过滤蛋白质。使用裂解缓冲液洗涤柱三次。然后用洗脱缓冲液(250mM咪唑，50mM Tris-HCl，200mM NaCl，pH＝8)洗脱蛋白质，并且定量用于进一步的试验。
过氧化物酶活性测定
表达Flag标记的MnSODWT、MnSODK68R和MnSODK68Q的100万个细胞在25mM Tris-HClpH 7.4、150mM NaCl、1mM EDTA、0.1％NP-40、5％甘油、蛋白酶抑制剂(BioTool)和TSA(Trichostatin A,Sigma)中裂解30分钟。用Bradford测定(BioRad)定量裂解物，并且使用抗-Flag抗体(company)进行IPed。通过使用邻苯三酚作为底物测定这些IPed蛋白的过氧化物酶酶活性。在反应混合物中，最终浓度为14mM磷酸钾(Sigma)、0.027％(v/v)过氧化氢(Sigma)和0.5％(w/v)邻苯三酚(Sigma)。轻敲板以混合样品和反应试剂，在室温温育10分钟，然后在OD＝420nm读取。每3分钟记录A420的增加。对于所有测试样品和空白，使用最大线性速率或0.5分钟间隔获得ΔA420/20秒。使用以下等式计算过氧化物酶活性：单位/mL＝[(ΔA420/20秒测试样品-ΔA420/20秒空白)(反应体积)(稀释因子)]/[(12)(0.1)]。
统计分析
使用GraphPad Prism for Windows(GraphPad Software,San Diego,CA)进行统计分析。除非另有说明，否则数据表示为平均SEM。使用具有Tukey事后分析的单向ANOVA分析来研究三个或更多个平均值之间的差异。在p<0.05并且95％置信区间确定显著性。
实施例5
从缺乏Sirt3的小鼠分离的同种异体移植乳腺肿瘤表现出对MnPAM歧化酶模拟物的显著细胞毒性敏感性
评价了药理学模拟脱乙酰化赖氨酸68MnSOD的活性剂是否可能是细胞毒性的和/或逆转显示SIRT3-MnSOD-Ac特征的肿瘤中的Tam抗性。在IR之前30分钟IP注射2mg/kgGC4419(MnPAM选择性歧化酶模拟物)减弱了缺乏Sirt3的小鼠的肝损伤(Coleman等人,2014,Antioxid.Redox Signal.)。为了解决Tam抗性是否可以在体内逆转，使用源自在Sirt3敲除小鼠中自发发生的乳腺肿瘤的肿瘤细胞系，称作Sirt3-/--乳腺肿瘤细胞((Sirt3-/--MT)。随后将这些细胞系用SIRT3野生型(Sirt3-/--MT-SIRT3WT)或脱乙酰化活性无效(Sirt3-/--MT-SIRT3DN)基因和lenti-荧光素酶感染并且选择表达它们，以通过生物发光评价肿瘤生长。将同种异体移植肿瘤小鼠分成四组：(1)对照，未处理的Sirt3-/--MT-SIRT3DN；(2)GC4419处理的Sirt3-/--MT-SIRT3DN；(3)对照，未处理的Sirt3-/--MT-SIRT3WT；和(4)GC4419处理的Sirt3-/--MT-SIRT3WT。这些试验证明了与对照小鼠相比，每隔一天通过IP注射GC4419持续五周的Sirt3-/--MT-SIRT3DN同种异体移植物表现出抗增殖作用，如通过肿瘤生长的显著减少所测量的(图29a，顶部线对照与使用GC4419的底部线)。相反，在暴露于GC4419的Sirt3-/--MT-SIRT3WT同种异体移植物中几乎没有观察到肿瘤生长的变化(图29b)，不过，这些肿瘤确实生长略慢(图29a-b，在图7b中4周后在y轴上终止最高的线是对照，6周后在y轴上终止较低的线是GC4419)。具有不同Tam抗性以及Sirt3肿瘤细胞系丧失的体外数据也显示GC4419逆转Tam抗性(数据未显示)。因此，显示通过用锰五氮杂大环歧化酶模拟物在没有脱乙酰化能力SIRT3的肿瘤中更多地药理学模拟脱乙酰化赖氨酸68MnSOD的活性来抑制鼠乳腺同种异体移植肿瘤的生长。此外，这支持展示出AcK68特征的肿瘤的选择可以增加对单独或与其它疗法组合的MnPAM歧化酶模拟物(或其它方法)治疗的响应。
实施例6
MnSODK68Q的表达(即K68-Ac模拟突变体)诱导MCF7细胞中的电离辐射抗性(IRR)
为了确定MnSOD-K68-Ac-ROS轴是否在IRR中起作用，假设MnSOD乙酰化可能在肿瘤细胞如何被重编程以产生IRR表型中起作用。为了解决这个理念，用lenti-MnSODK68Q感染已建立的肿瘤细胞系MCF-7以诱导MnSODK68Q表达，其被验证。不使用或使用5Gy IR处理MCF-7-MnSODWT和MCF-7-MnSODK68Q细胞。克隆形成细胞存活试验显示，MCF7细胞中加强的MnSODK68Q表达导致IR诱导的细胞杀伤减少(图30a，黑色条形图相对于检查条形图)。此外，推测用MnPAM歧化酶模拟物GC4419药理学模拟脱乙酰化赖氨酸68MnSOD可以逆转MCF-7-MnSODK68Q细胞中的IRR表型。实际上，克隆形成细胞存活研究显示暴露于GC4419逆转了IRR表型(图30b，检查条形图2对比条形图4)。这些试验启示在MCF-7-MnSODK68Q细胞中观察到的IRR由于暴露于GC4419而转化为敏感表型，表明SOD活性的替代是该过程中的机制。这些结果清楚地启示通过失调的MnSOD-Ac破坏MnSOD生物学在乳腺癌细胞中的PANR(多重治疗抗性)肿瘤细胞表型中的作用。与此一致，在实施例1、3和4中，过表达MnSODK68Q的乳腺癌细胞表现出对用羟基-Tam、Fulv、Palb、CDDP和DXR治疗的抗性，并且在实施例2中，过表达MnSODK68Q的前列腺癌细胞表现出对ENZ治疗的抗性。诱导对这些多重疗法的抗性也增加了MnSOD AcK68的天然表达，具有所有相关的下游效应，这可以通过药理学MnPAM歧化酶模拟物在几种中降低或逆转。因此，显示用MnSODK68Q表达模拟MnSOD-K68的乙酰化诱导乳腺癌细胞中的电离辐射抗性(IRR)和PanR，并且用锰五氮杂大环歧化酶模拟物在药理学上模拟脱乙酰化赖氨酸68MnSOD的活性逆转这种IRR和PanR。
IRR前列腺肿瘤细胞系表现出增加的MnSOD-K68-Ac和降低的MnSOD活性
为了进一步评估MnSOD-K68-Ac-ROS轴是否在IRR中起作用，我们使用了两种激素敏感性前列腺肿瘤细胞系LNCaP和22RV1，将它们用5Gy IR连续处理5天以选择IRR。LNCaP-IRR细胞显示MnSOD-K68-Ac增加(图31a)，同样培养的22RV1-IRR细胞(数据未显示)也是如此。LNCaP-IRR细胞还表现出MnSOD活性的降低(图31b)和ROS水平的增加(数据未显示)。因此，显示前列腺癌细胞中的IRR与AcK68特征的增加相关，正如实施例5中乳腺癌中的IRR。此外，这与其它实施例中在乳腺癌和前列腺癌细胞中针对放射抗性、细胞毒性化疗抗性和靶向疗法抗性(激素和非激素途径)证明的PanR表型一致。在所有这些中，抗性的发生可能与MnSOD的赖氨酸68的乙酰化增加和谱系可塑性/干性增加相关，并且改造、强制或模拟赖氨酸68的乙酰化赋予特异性和多重疗法抗性，而改造、强制或模拟赖氨酸68的脱乙酰化，包括通过药理学方法逆转该抗性。赖氨酸68(AcK68)的乙酰化在试验癌症模型和人肿瘤样品中也与疾病等级/侵袭性和进展相关。
实施例方案
以下实施例方案显示了测定包含肿瘤细胞的组织样品中靶蛋白(包括AcK 68、SIRT3和HIF2α)水平的方法。
乳腺组织方案
将乳腺癌组织载玻片和正常乳腺组织载玻片(n>＝6)浸渍两次，在100％二甲苯(Sigma)中5分钟，并且在100％乙醇(Sigma)中5分钟。将载玻片依次用95％、80％和50％乙醇浸渍5分钟，然后浸入水中并且在95mL 95％乙醇和5mL 37％甲醛中固定2分钟。然后将载玻片用1×PBS(Corning)中的1％Triton X-100处理20分钟，在1×PBS中洗涤三次5分钟，并且在1×PBS中的0.3％H2O2中猝灭20分钟。将载玻片用1×PBS中的10％驴血清(Sigma)、1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma)和0.3％ Triton X-100(Sigma)封闭2小时，然后在4℃用抗-MnSOD-K68-Ac抗体(1:250稀释)处理48小时。随后将这些载玻片在室温温育1小时，然后用1×PBS洗涤3次5分钟。将兔二抗-(1:200稀释，A0545，Sigma)在抗体溶液中稀释并且施加于载玻片1小时，然后用1×PBS洗涤三次，每次5分钟。按照制造商的方案，用VECTASTAIN ABC试剂盒(Vector Laboratories)处理载玻片45分钟，以检测抗生物素蛋白/生物素化的酶复合物。根据制造商的方案，使用DAB过氧化物酶底物试剂盒(Vector Laboratories)处理载玻片，并且在苏木精(Sigma)中染色10分钟。然后将载玻片用100mL的70％乙醇和1mL的37％盐酸脱色，然后脱水。使用HistoQuest软件(Tissuegnostics)定量强度。根据信号强度，每个组织接受0-250之间的分数。接受低于正常乳腺组织平均评分的1个标准偏差的评分的任何组织载玻片被认为是低的。接受高于正常乳腺组织平均评分的1个标准偏差的评分的任何组织载玻片被认为是高的。通过评估来自不同个体的至少6个非癌性乳腺组织样品来确定正常乳腺组织平均评分。
前列腺组织方案
将前列腺癌组织载玻片和正常前列腺组织载玻片(n>＝6)浸渍两次，在100％二甲苯(Sigma)中5分钟，并在100％乙醇(Sigma)中5分钟。将载玻片依次用95％、80％和50％乙醇浸渍5分钟，然后浸入水中并且在95mL 95％乙醇和5mL 37％甲醛中固定2分钟。然后将载玻片用1×PBS(Corning)中的1％Triton X-100处理20分钟，在1×PBS中洗涤三次5分钟，并且在1×PBS中的0.3％H2O2中猝灭20分钟。将载玻片用1×PBS中的10％驴血清(Sigma)、1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma)和0.3％ Triton X-100(Sigma)封闭2小时，然后在4℃用抗-MnSOD-K68-Ac抗体(1:250稀释)处理48小时。随后将这些载玻片在室温温育1小时，然后用1×PBS洗涤3次5分钟。将兔二抗(1:200稀释，A0545，Sigma)在抗体溶液中稀释并且施加到载玻片上1小时，然后用1×PBS洗涤三次，每次5分钟。按照制造商的方案，用VECTASTAIN ABC试剂盒(Vector Laboratories)处理载玻片45分钟，以检测抗生物素蛋白/生物素化的酶复合物。根据制造商的方案，使用DAB过氧化物酶底物试剂盒(Vector Laboratories)处理载玻片，并且在苏木精(Sigma)中染色10分钟。然后将载玻片用100mL的70％乙醇和1mL的37％盐酸脱色，然后脱水。使用HistoQuest软件(Tissuegnostics)定量强度。根据信号强度，每个组织接受0-250之间的分数。接受低于正常前列腺组织平均评分的1个标准偏差的评分的任何组织载玻片被认为是低的。接受高于正常前列腺组织平均评分的1个标准偏差的评分的任何组织载玻片被认为是高的。通过评估来自不同个体的至少6个非癌性前列腺组织样品来确定正常前列腺组织平均评分。
参考文献
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本文中的某些实施例改编自Zhu等人的文章“Lysine 68Acetylation DirectsMnSOD as aTetrameric Detoxification Complex Versus a Monomeric TumorPromoter”,Nature Communications(2019)10:2399,2019年6月3日在线公开。该文章在Creative Commons Attribution 4.0International License下公开,其副本可以在http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/看到。

Claims (138)

1.治疗哺乳动物个体的癌症的方法，所述癌症表征为具有多重疗法抗性，该方法包括：
向哺乳动物个体施用治疗有效量的相对于下式(I)的五氮杂大环状环配合物：
Figure FDA0004113464710000011
其中
M为Mn2+或Mn3+；
R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10独立地为氢、烃基、取代的烃基、杂环基、氨基酸侧链部分或选自以下的部分：-OR11、-NR11R12、-COR11、-CO2R11、-CONR11R12、-SR11、-SOR11、-SO2R11、-SO2NR11R12、-N(OR11)(R12)、-P(O)(OR11)(OR12)、-P(O)(OR11)(R12)和-OP(O)(OR11)(OR12)，其中R11和R12独立地为氢或烷基；
U与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
V与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
W与大环的氮及其所连接的大环的碳原子一起形成具有2-20个环碳原子的芳族或脂环族，取代或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的含氮稠合杂环，条件是当W为稠合的芳族杂环时，连接至为杂环和大环的组成部分的氮的氢和连接至为杂环和大环的组成部分的碳原子的R1和R10不存在；
X和Y表示衍生自任何单齿或多齿配位配体或配体体系或其相应阴离子的适合配体；
Z为抗衡离子；
n为0-3的整数；并且
虚线表示大环的氮原子与过渡金属锰之间的配位键。
2.权利要求1的方法，其中多重疗法抗性癌症对选自如下的至少两种疗法具有抗性：用化疗剂治疗、用抑制激素受体途径的治疗剂治疗、用细胞周期抑制剂治疗和用放疗治疗。
3.上述权利要求任一项的方法，其中癌症对选自如下的一种或多种疗法具有抗性：用含铂活性剂治疗、用蒽环治疗、用激素受体途径抑制剂治疗、用细胞周期抑制剂治疗和用放疗治疗。
4.上述权利要求任一项的方法，其中癌症对以下至少一种具有抗性：选自顺铂、奥沙利铂、卡铂、奈达铂、洛铂、庚铂、双环铂、脂铂、LA-12、磷铂、菲铂、prolindac、四硝酸三铂、吡铂、沙铂和/或其药学上可接受的盐的含铂化疗剂，和/或选自多柔比星、柔红霉素、表柔比星和伊达比星和/或其药学上可接受的盐的蒽环化疗剂。
5.上述权利要求任一项的方法，其中癌症对抑制与癌症的生长或进展相关的激素受体途径的治疗剂具有抗性。
6.权利要求5的方法，其中癌症对抑制与癌症的生长或进展相关的激素受体途径的治疗剂具有抗性，所述治疗剂靶向雌激素受体途径、孕酮受体途径和雄激素受体途径中的任何一种或多种。
7.权利要求6的方法，其中癌症对靶向雌激素受体途径、孕酮受体途径和雄激素受体途径中的任何一种或多种的治疗剂具有抗性，所述治疗剂选自雌激素受体抑制剂、雌激素受体降解剂/下调剂、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、芳香酶抑制剂、GnRH激动剂、雄激素合成抑制剂、雄激素受体抑制剂和选择性孕酮受体调节剂(SPRM)。
8.权利要求7的方法，其中多重疗法抗性癌症对靶向雌激素受体途径的治疗剂具有抗性，所述治疗剂包括选自以下的至少一种：他莫昔芬、来曲唑、氯米芬、4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、萘福昔定、拉索昔芬、巴多昔芬、奥培米芬、氟维司群、布林司群、依拉司群及其衍生物、盐和/或前药。
9.权利要求7的方法，其中多重疗法抗性癌症对靶向雄激素受体途径的治疗剂具有抗性，所述治疗剂包括选自以下的任何：雄激素受体拮抗剂、雄激素合成抑制剂和抗促性腺激素。
10.权利要求9的方法，其中多重疗法抗性癌症对靶向雄激素受体途径的治疗剂具有抗性，所述治疗剂包括选自以下的至少一种：醋酸环丙孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、螺内酯、奥生多龙、醋酸奥沙特隆、氟他胺、比卡鲁胺、尼鲁米特、托匹鲁胺、恩杂鲁胺、阿帕鲁胺、地诺孕素、屈螺酮、美多孕酮、醋酸诺美孕酮、普美孕酮、曲美孕酮、酮康唑、醋酸阿比特龙、赛维罗奈、氨鲁米特、非那雄胺、度他雄胺、依立雄胺、α-雌二醇、醋酸环丙孕酮、美罗孕酮、氟他胺、尼鲁米特、戊双氟酚、亮丙瑞林、西曲瑞克、烯丙雌醇、醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、己酸孕诺酮、己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸奥沙特隆、奥生多龙、雌二醇、雌二醇酯、炔雌醇、共轭雌激素、己烯雌酚及其衍生物、盐和/或前药。
11.权利要求6的方法，其中癌症对靶向孕酮受体途径的治疗剂具有抗性，所述治疗剂包括I型、II型或III型孕酮选择性调节剂(SPRM)，其为选自以下的至少一种：奥那司酮、米非司酮、洛那立生、阿来司酮、Org31710、Org31806、CDB-2914和CDB-4124及其衍生物、盐和/或前药。
12.权利要求3的方法，其中癌症对CDK4/6抑制剂具有抗性，所述CDK4/6抑制剂包括选自以下的至少一种：哌柏西利、阿贝西利、瑞博西利及其衍生物、盐和/或前药。
13.治疗具有肿瘤特征的哺乳动物个体的癌症的方法，所述肿瘤特征的特征在于以下中的任何一种或多种：(i)沉默调节蛋白(SIRT3)蛋白的水平低于第一预定阈值水平，(ii)在赖氨酸68残基处乙酰化的锰超氧化物歧化酶(AcK68)的水平超过第二预定阈值水平，(iii)缺氧诱导因子2α(HIF2α)的表达水平超过指示干性谱系可塑性的第三预定阈值水平，(iv)Ki-67蛋白的水平超过第四预定阈值水平，(v)OCT4的水平超过第五预定阈值水平，(vi)Sox2的水平超过第六预定阈值水平，和(vii)单体与四聚体MnSOD的比率超过第七预定阈值水平，该方法包括：
向哺乳动物个体施用治疗有效量的相对于下式(I)的五氮杂大环状环配合物：
Figure FDA0004113464710000031
其中
M为Mn2+或Mn3+；
R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10独立地为氢、烃基、取代的烃基、杂环基、氨基酸侧链部分或选自以下的部分：-OR11、-NR11R12、-COR11、-CO2R11、-CONR11R12、-SR11、-SOR11、-SO2R11、-SO2NR11R12、-N(OR11)(R12)、-P(O)(OR11)(OR12)、-P(O)(OR11)(R12)和-OP(O)(OR11)(OR12)，其中R11和R12独立地为氢或烷基；
U与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
V与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
W与大环的氮和其所连接的大环的碳原子一起形成具有2-20个环碳原子的芳族或脂环族，取代或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的含氮稠合杂环，条件是当W为稠合的芳族杂环时，连接至为杂环和大环的组成部分的氮的氢和连接至为杂环和大环的组成部分的碳原子的R1和R10不存在；
X和Y表示衍生自任何单齿或多齿配位配体或配体体系或其相应阴离子的适合配体；
Z为抗衡离子；
n为0-3的整数；并且
虚线表示大环的氮原子与过渡金属锰之间的配位键。
14.治疗哺乳动物个体的癌症的方法，该方法包括：
通过下列步骤选择为用相应于下式(I)的五氮杂大环状环配合物治疗的适合个体的个体：
(a)从个体获得测试组织样品，测试组织样品包含肿瘤细胞；
(b)评估测试组织样品以确定包含以下任何一项或多项的标准：(i)组织样品的肿瘤细胞中沉默调节蛋白(SIRT3)蛋白的水平是否低于第一预定阈值水平，(ii)在赖氨酸68残基处乙酰化的锰超氧化物歧化酶(AcK68)的水平是否超过第二预定阈值水平，(iii)缺氧诱导因子2α(HIF2α)的表达水平是否超过指示干性谱系可塑性的第三预定阈值水平，(iv)Ki-67蛋白的水平是否超过第四预定阈值水平，(v)Oct4蛋白的水平是否超过第五预定阈值水平，(vi)SOX2蛋白的水平是否超过第六预定阈值水平，和(vii)单体与四聚体MnSOD的比率是否超过第七预定阈值水平；和
(c)如果满足标准(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)和/或(vii)中的一项或多项，则确定个体适合于治疗；和
在选择个体适合治疗的情况下，施用治疗有效量的相应于下式(I)的五氮杂大环状环配合物：
Figure FDA0004113464710000041
其中
M为Mn2+或Mn3+；
R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10独立地为氢、烃基、取代的烃基、杂环基、氨基酸侧链部分或选自以下的部分：-OR11、-NR11R12、-COR11、-CO2R11、-CONR11R12、-SR11、-SOR11、-SO2R11、-SO2NR11R12、-N(OR11)(R12)、-P(O)(OR11)(OR12)、-P(O)(OR11)(R12)和-OP(O)(OR11)(OR12)，其中R11和R12独立地为氢或烷基；
U与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
V与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
W与大环的氮和其所连接的大环的碳原子一起形成具有2-20个环碳原子的芳族或脂环族，取代或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的含氮稠合杂环，条件是当W为稠合的芳族杂环时，连接至为杂环和大环的组成部分的氮的氢和连接至为杂环和大环的组成部分的碳原子的R1和R10不存在；
X和Y表示衍生自任何单齿或多齿配位配体或配体体系或其相应阴离子的适合配体；
Z为抗衡离子；
n为0-3的整数；并且
虚线表示大环的氮原子与过渡金属锰之间的配位键。
15.权利要求14的方法，其中选择个体包括通过免疫染色方法测定AcK68的水平，所述免疫染色方法包括使组织与抗-AcK68单克隆抗体接触，并且测定与组织样品中的AcK68结合的抗-AcK68单克隆抗体的水平。
16.权利要求15的方法，其中抗-AcK68单克隆抗体包含与MnSOD的包含乙酰化赖氨酸68残基的区域特异性结合的结合区。
17.权利要求14的方法，其中选择个体包括通过免疫染色方法测定SIRT3蛋白的水平，所述免疫染色方法包括使组织与抗-SIRT3单克隆抗体接触，并且测定与组织样品中的SIRT3结合的抗-SIRT3单克隆抗体的水平。
18.权利要求14的方法，其中选择个体包括通过免疫染色方法测定HIF2α蛋白的水平，所述免疫染色方法包括使组织与抗-HIF2α单克隆抗体接触，并且测定与组织样品中的HIF2α结合的抗-HIF2α单克隆抗体的水平。
19.权利要求14的方法，其中选择个体包括通过免疫染色方法测定Ki-67蛋白的水平，所述免疫染色方法包括使组织与抗-Ki-67单克隆抗体接触，并且测定与组织样品中的Ki-67结合的抗-Ki-67单克隆抗体的水平。
20.权利要求14的方法，其中选择个体包括通过免疫染色方法测定OCT4蛋白的水平，所述免疫染色方法包括使组织与抗-OCT4单克隆抗体接触，并且测定与组织样品中的OCT4结合的抗-OCT4单克隆抗体的水平。
21.权利要求14的方法，其中选择个体包括通过免疫染色方法测定SOX2蛋白的水平，所述免疫染色方法包括使组织与抗-SOX2单克隆抗体接触，并且测定与组织样品中的SOX2结合的抗-SOX2单克隆抗体的水平。
22.权利要求14的方法，其中选择个体包括通过免疫染色方法测定四聚体和单体SOD蛋白的水平，所述免疫染色方法包括使组织与抗-四聚体SOD单克隆抗体接触，并且测定与组织样品中的四聚体SOD结合的抗-四聚体SOD单克隆抗体的水平，使组织与抗-单体SOD单克隆抗体接触，并且测定与组织样品中的单体SOD结合的抗-单体SOD单克隆抗体的水平，并且测定单体与四聚体MnSOD的比率。
23.权利要求14的方法，该方法还包括施用另外的抗癌疗法。
24.用于治疗哺乳动物个体的癌症的试剂盒，该试剂盒包含：
(a)用于分析从个体获得并且包含肿瘤细胞的组织样品的测定，该测定能够确定包含如下任何一项或多项的标准：(i)在组织样品的肿瘤细胞中沉默调节蛋白(SIRT3)蛋白的水平是否低于第一预定阈值水平，(ii)在赖氨酸68残基处乙酰化的锰超氧化物歧化酶(AcK68)的水平是否超过第二预定阈值水平，和(iii)缺氧诱导因子2α(HIF2α)的表达水平是否超过指示干性谱系可塑性的第三预定阈值水平，(iv)Ki-67蛋白的水平是否超过第四预定阈值水平，(v)OCT4蛋白的水平是否超过第五预定阈值水平，(vi)SOX2蛋白的水平是否超过第六预定阈值水平，和(vii)单体与四聚体MnSOD的比率是否超过第七预定阈值水平；和
(b)治疗有效量的相应于下式(I)的五氮杂大环状环配合物：
Figure FDA0004113464710000061
其中
M为Mn2+或Mn3+；
R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10独立地为氢、烃基、取代的烃基、杂环基、氨基酸侧链部分或选自以下的部分：-OR11、-NR11R12、-COR11、-CO2R11、-CONR11R12、-SR11、-SOR11、-SO2R11、-SO2NR11R12、-N(OR11)(R12)、-P(O)(OR11)(OR12)、-P(O)(OR11)(R12)和-OP(O)(OR11)(OR12)，其中R11和R12独立地为氢或烷基；
U与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
V与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
W与大环的氮和其所连接的大环的碳原子一起形成具有2-20个环碳原子的芳族或脂环族，取代或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的含氮稠合杂环，条件是当W为稠合的芳族杂环时，连接至为杂环和大环的组成部分的氮的氢和连接至为杂环和大环的组成部分的碳原子的R1和R10不存在；
X和Y表示衍生自任何单齿或多齿配位配体或配体体系或其相应阴离子的适合配体；
Z为抗衡离子；
n为0-3的整数；并且
虚线表示大环的氮原子与过渡金属锰之间的配位键。
25.权利要求24的试剂盒，其中测定包括免疫组织化学测定，其包括能够选择性结合AcK68以测定其在组织样品中的水平的抗-AcK68抗体。
26.权利要求24的试剂盒，其中测定包括免疫组织化学测定，其包括能够选择性结合SIRT3以测定其在组织样品中的水平的抗-SIRT3抗体。
27.权利要求24的试剂盒，其中测定包括免疫组织化学测定，其包括能够选择性结合HIF2α以测定其在组织样品中的水平的抗-HIF2α抗体。
28.权利要求24的试剂盒，其中测定包括免疫组织化学测定，其包括能够选择性结合Ki-67以测定其在组织样品中的水平的抗-Ki-67抗体。
29.权利要求24的试剂盒，其中测定包括免疫组织化学测定，其包括能够选择性结合OCT4以测定其在组织样品中的水平的抗-OCT4抗体。
30.权利要求24的试剂盒，其中测定包括免疫组织化学测定，其包括能够选择性结合SOX2以测定其在组织样品中的水平的抗-SOX2抗体。
31.权利要求24的试剂盒，其中测定包括免疫组织化学测定，其包括能够选择性结合单体MnSOD以测定其在组织样品中的水平的抗-单体MnSOD抗体，和能够选择性结合四聚体MnSOD以测定其在组织样品中的水平的抗-四聚体MnSOD抗体。
32.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中肿瘤组织中沉默调节蛋白(SIRT3)蛋白活性的第一预定阈值水平为低于与肿瘤组织相同类型的非癌组织的正常评分的一个标准偏差的水平，其中正常评分通过取来自至少6个不同个体的相同组织类型的至少6个非癌组织样品的平均值来确定，如通过免疫染色所测定的。
33.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中在赖氨酸68残基处乙酰化的锰超氧化物歧化酶(AcK68)的第二预定阈值水平是高于与肿瘤组织相同类型的非癌组织的正常评分的一个标准偏差的水平，其中正常评分通过取来自至少6个不同个体的相同类型的至少6个非癌组织样品的平均值来确定，如通过免疫染色所测定的。
34.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中低氧诱导因子2α(HIF2α)的表达水平的第三预定阈值水平是高于与肿瘤组织相同类型的非癌组织的正常评分的一个标准偏差的水平，其中正常评分通过取来自至少6个不同个体的相同类型的至少6个非癌组织样品的平均值来确定，如通过免疫染色所测定的。
35.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中Ki-67蛋白表达水平的第四预定阈值水平是高于与肿瘤组织相同类型的非癌组织的正常评分的一个标准偏差的水平，其中正常评分通过取来自至少6个不同个体的相同类型的至少6个非癌组织样品的平均值来确定，如通过免疫染色所测定的。
36.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中OCT4蛋白的表达水平的第五预定阈值水平是高于与肿瘤组织相同类型的非癌组织的正常评分的一个标准偏差的水平，其中正常评分通过取来自至少6个不同个体的相同类型的至少6个非癌组织样品的平均值来确定，如通过免疫染色所测定的。
37.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中SOX2蛋白的表达水平的第六预定阈值水平是高于与肿瘤组织相同类型的非癌组织的正常评分的一个标准偏差的水平，其中正常评分通过取来自至少6个不同个体的相同类型的至少6个非癌组织样品的平均值来确定，如通过免疫染色所测定的。
38.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中单体MnSOD蛋白的表达水平与四聚体MnSOD蛋白的表达水平的比率的第七预定阈值水平是高于与肿瘤组织相同类型的非癌组织的正常评分的一个标准偏差的水平，其中正常评分通过取来自至少6个不同个体的相同类型的至少6个非癌组织样品的平均值来确定，如通过免疫染色所测定的。
39.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中该方法还包括在施用式(I)的五氮杂大环状环配合物之前、与之同时或之后，以一定的剂量水平和作为提供癌症治疗的放疗过程的一部分向个体施用包含电离辐射的抗癌疗法，和/或该试剂盒包含关于施用包含电离辐射的抗癌疗法的说明书。
40.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中该方法还包括在施用式(I)的五氮杂大环状环配合物之前、与之同时或之后施用抗癌剂，所述抗癌剂包括化疗剂、抑制与癌症生长或进展相关的激素受体途径的治疗剂和用细胞周期抑制剂治疗中的任何一种或多种，和/或该试剂盒还包含抗癌剂。
41.权利要求40的方法和/或试剂盒，其中化疗剂包括任何含铂化疗剂和蒽环化疗剂。
42.权利要求41的方法和/或试剂盒，其中化疗剂包括以下至少一种：选自顺铂、奥沙利铂、卡铂、奈达铂、洛铂、庚铂、双环铂、脂铂、LA-12、磷铂、菲铂、prolindac、四硝酸三铂、吡铂、沙铂和/或其药学上可接受的盐的含铂化疗剂，和/或选自多柔比星、柔红霉素、表柔比星和伊达比星和/或其药学上可接受的盐的蒽环化疗剂。
43.权利要求40的方法和/或试剂盒，其中治疗剂抑制与癌症的生长或进展相关的激素受体途径。
44.权利要求43的方法和/或试剂盒，其中抑制与癌症的生长或进展相关的激素受体途径的治疗剂靶向雌激素受体途径、孕酮受体途径和雄激素受体途径中的任何一种或多种。
45.权利要求44的方法和/或试剂盒，其中靶向雌激素受体途径、孕酮受体途径和雄激素受体途径中的任何一种或多种的治疗剂选自雌激素受体抑制剂、雌激素受体降解剂/下调剂、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、芳香酶抑制剂、GnRH激动剂、雄激素合成抑制剂、雄激素受体抑制剂和选择性孕酮受体调节剂(SPRM)。
46.权利要求45的方法和/或试剂盒，其中靶向雌激素受体途径的治疗剂包括选自以下的至少一种：他莫昔芬、来曲唑、氯米芬、4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、萘福昔定、拉索昔芬、巴多昔芬、奥培米芬、氟维司群、布林司群、依拉司群及其衍生物、盐和/或前药。
47.权利要求44的方法和/或试剂盒，其中靶向雄激素受体途径的治疗剂包括选自以下的任何：雄激素受体拮抗剂、雄激素合成抑制剂和抗促性腺激素。
48.权利要求47的方法和/或试剂盒，其中靶向雄激素受体途径的治疗剂包括选自以下的至少一种：醋酸环丙孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、螺内酯、奥生多龙、醋酸奥沙特隆、氟他胺、比卡鲁胺、尼鲁米特、托匹鲁胺、恩杂鲁胺、阿帕鲁胺、地诺孕素、屈螺酮、美多孕酮、醋酸诺美孕酮、普美孕酮、曲美孕酮、酮康唑、醋酸阿比特龙、赛维罗奈、氨鲁米特、非那雄胺、度他雄胺、依立雄胺、α-雌二醇、醋酸环丙孕酮、美罗孕酮、氟他胺、尼鲁米特、戊双氟酚、亮丙瑞林、西曲瑞克、烯丙雌醇、醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、己酸孕诺酮、己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸奥沙特隆、奥生多龙、雌二醇、雌二醇酯、炔雌醇、共轭雌激素、己烯雌酚及其衍生物、盐和/或前药。
49.权利要求44的方法和/或试剂盒，其中靶向孕酮受体途径的治疗剂包括I型、II型或III型孕酮选择性调节剂(SPRM)，其为选自以下的至少一种：奥那司酮、米非司酮、洛那立生、阿来司酮、Org31710、Org31806、CDB-2914和CDB-4124及其衍生物、盐和/或前药。
50.权利要求40的方法和/或试剂盒，其中抗癌剂包括CDK4/6抑制剂，所述CDK4/6抑制剂包括选自以下的至少一种：哌柏西利、阿贝西利、瑞博西利及其衍生物、盐和/或前药。
51.治疗患有该病的哺乳动物个体中对抗癌剂具有抗性的肿瘤的方法，该方法通过向个体施用治疗有效量的相应于下式(I)的五氮杂大环状环配合物来进行：
Figure FDA0004113464710000091
其中
M为Mn2+或Mn3+；
R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10独立地为氢、烃基、取代的烃基、杂环基、氨基酸侧链部分或选自以下的部分：-OR11、-NR11R12、-COR11、-CO2R11、-CONR11R12、-SR11、-SOR11、-SO2R11、-SO2NR11R12、-N(OR11)(R12)、-P(O)(OR11)(OR12)、-P(O)(OR11)(R12)和-OP(O)(OR11)(OR12)，其中R11和R12独立地为氢或烷基；
U与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
V与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
W与大环的氮和其所连接的大环的碳原子一起形成具有2-20个环碳原子的芳族或脂环族，取代或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的含氮稠合杂环，条件是当W为稠合的芳族杂环时，连接至为杂环和大环的组成部分的氮的氢和连接至为杂环和大环的组成部分的碳原子的R1和R10不存在；
X和Y表示衍生自任何单齿或多齿配位配体或配体体系或其相应阴离子的适合配体；
Z为抗衡离子；
n为0-3的整数；并且
虚线表示大环的氮原子与过渡金属锰之间的配位键。
52.权利要求51的方法，其中肿瘤具有特征在于以下的任何一种或多种的肿瘤特征：(i)沉默调节蛋白(SIRT3)蛋白水平低于第一预定阈值水平，(ii)K68-乙酰化锰超氧化物歧化酶(AcK68)水平超过第二预定阈值水平，(iii)缺氧诱导因子2α(HIF2α)的表达水平超过指示干性谱系可塑性的第三预定阈值水平，(iv)Ki-67蛋白的水平超过第四预定阈值水平，(v)OCT4蛋白的水平超过第五预定阈值水平，(vi)SOX2蛋白的水平超过第六预定阈值水平，和(vii)单体与四聚体MnSOD的比率超过第七预定阈值水平；该方法包括：
通过下列步骤选择为治疗的适合个体的个体：
(a)从个体获得测试组织样品，测试组织样品包含肿瘤细胞；
(b)评估组织样品以确定包含以下任何一项或多项的标准：(i)在组织样品的肿瘤细胞中沉默调节蛋白(SIRT3)蛋白活性的水平是否低于第一预定阈值水平，(ii)在赖氨酸68残基处乙酰化的锰超氧化物歧化酶(AcK68)的水平是否超过第二预定阈值水平，(iii)缺氧-诱导因子2α(HIF2α)的表达水平是否超过指示干性谱系可塑性的第三预定阈值水平，(iv)Ki-67蛋白的水平是否超过第四预定阈值水平，(v)OCT蛋白的水平是否超过第五预定阈值水平，(vi)SOX2蛋白的水平是否超过第六预定阈值水平，和(vii)单体与四聚体MnSOD的比率是否超过第七预定阈值水平；和
(c)如果满足标准(i)-(vii)中的一个或多个，则确定个体适合于治疗；和
在选择适合治疗的个体的情况下，通过向个体施用治疗有效量的相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物来治疗个体。
53.权利要求51-52任一项的方法，其中抗癌剂包括化疗剂、抑制激素受体途径的治疗剂和细胞周期抑制剂中的任何一种或多种。
54.权利要求51-52任一项的方法，该方法还包括在施用式(I)的五氮杂大环状环配合物之前、与之同时或之后，向个体施用治疗有效量的肿瘤对其具有抗性的抗癌剂。
55.权利要求51-54任一项的方法，其中抗癌剂包括选自以下的任何：含铂活性剂、蒽环活性剂、抑制激素受体途径的活性剂和细胞周期抑制剂。
56.权利要求55的方法，其中抗癌剂包括以下至少一种：选自顺铂、奥沙利铂、卡铂、奈达铂、洛铂、庚铂、双环铂、脂铂、LA-12、磷铂、菲铂、prolindac、四硝酸三铂、吡铂、沙铂和/或其药学上可接受的盐的含铂化疗剂，和/或选自多柔比星、柔红霉素、表柔比星和伊达比星和/或其药学上可接受的盐的蒽环化疗剂。
57.权利要求55的方法，其中抗癌剂包括抑制与癌症的生长或进展相关的激素受体途径的治疗剂。
58.权利要求57的方法，其中抑制与癌症的生长或进展相关的激素受体途径的治疗剂靶向雌激素受体途径、孕酮受体途径和雄激素受体途径中的任何一种或多种。
59.权利要求58的方法，其中靶向雌激素受体途径、孕酮受体途径和雄激素受体途径中的任何一种或多种的治疗剂选自雌激素受体抑制剂、雌激素受体降解剂/下调剂、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、芳香酶抑制剂、GnRH激动剂、雄激素合成抑制剂、雄激素受体抑制剂和选择性孕酮受体调节剂(SPRM)。
60.权利要求59的方法，其中靶向雌激素受体途径的治疗剂包括选自以下的至少一种：他莫昔芬、来曲唑、氯米芬、4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、萘福昔定、拉索昔芬、巴多昔芬、奥培米芬、氟维司群、布林司群、依拉司群及其衍生物、盐和/或前药。
61.权利要求58的方法，其中靶向雄激素受体途径的治疗剂包括选自以下的任何：雄激素受体拮抗剂、雄激素合成抑制剂和抗促性腺激素。
62.权利要求61的方法，其中靶向雄激素受体途径的治疗剂包括选自以下的至少一种：醋酸环丙孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、螺内酯、奥生多龙、醋酸奥沙特隆、氟他胺、比卡鲁胺、尼鲁米特、托匹鲁胺、恩杂鲁胺、阿帕鲁胺、地诺孕素、屈螺酮、美多孕酮、醋酸诺美孕酮、普美孕酮、曲美孕酮、酮康唑、醋酸阿比特龙、赛维罗奈、氨鲁米特、非那雄胺、度他雄胺、依立雄胺、α-雌二醇、醋酸环丙孕酮、氟他胺、尼鲁米特、戊双氟酚、亮丙瑞林、西曲瑞克、烯丙雌醇、醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、己酸孕诺酮、己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸奥沙特隆、奥生多龙、雌二醇、雌二醇酯、炔雌醇、共轭雌激素、己烯雌酚及其衍生物、盐和/或前药。
63.权利要求58的方法，其中靶向孕酮受体途径的治疗剂包括I型、II型或III型孕酮选择性调节剂(SPRM)，其为选自以下的至少一种：奥那司酮、米非司酮、洛那立生、阿来司酮、Org31710、Org31806、CDB-2914和CDB-4124及其衍生物、盐和/或前药。
64.权利要求55的方法，其中多重疗法抗性癌症对细胞周期抑制剂，包括CDK4/6抑制剂具有抗性，所述CDK4/6抑制剂包括选自以下的至少一种：哌柏西利、阿贝西利、瑞博西利及其衍生物、盐和/或前药。
65.治疗患有该病的哺乳动物个体中对电离放疗具有抗性的肿瘤的方法，该方法通过下列步骤进行：
向个体施用治疗有效量的相应于下式(I)的五氮杂大环状环配合物：
Figure FDA0004113464710000111
其中
M为Mn2+或Mn3+；
R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10独立地为氢、烃基、取代的烃基、杂环基、氨基酸侧链部分或选自以下的部分：-OR11、-NR11R12、-COR11、-CO2R11、-CONR11R12、-SR11、-SOR11、-SO2R11、-SO2NR11R12、-N(OR11)(R12)、-P(O)(OR11)(OR12)、-P(O)(OR11)(R12)和-OP(O)(OR11)(OR12)，其中R11和R12独立地为氢或烷基；
U与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
V与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
W与大环的氮和其所连接的大环的碳原子一起形成具有2-20个环碳原子的芳族或脂环族，取代或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的含氮稠合杂环，条件是当W为稠合的芳族杂环时，连接至为杂环和大环的组成部分的氮的氢和连接至为杂环和大环的组成部分的碳原子的R1和R10不存在；
X和Y表示衍生自任何单齿或多齿配位配体或配体体系或其相应阴离子的适合配体；
Z为抗衡离子；
n为0-3的整数；并且
虚线表示大环的氮原子与过渡金属锰之间的配位键。
66.权利要求65的方法，其中肿瘤具有特征在于以下的任何一种或多种的肿瘤特征：(i)沉默调节蛋白(SIRT3)蛋白水平低于第一预定阈值水平，(ii)K68-乙酰化锰超氧化物歧化酶(AcK68)水平超过第二预定阈值水平，(iii)缺氧诱导因子2α(HIF2α)的表达水平超过指示干性谱系可塑性的第三预定阈值水平，(iv)Ki-67蛋白的水平超过第四预定阈值水平，(v)OCT4蛋白的水平超过第五预定阈值水平，(vi)SOX2蛋白的水平超过第六预定阈值水平，和(vii)单体与四聚体MnSOD的比率超过第七预定阈值水平；该方法包括：
通过下列步骤选择为治疗的适合个体的个体：
(a)从个体获得测试组织样品，测试组织样品包含肿瘤细胞；
(b)评估组织样品以确定包含以下任何一项或多项的标准：(i)在组织样品的肿瘤细胞中沉默调节蛋白(SIRT3)蛋白活性的水平是否低于第一预定阈值水平，(ii)在赖氨酸68残基处乙酰化的锰超氧化物歧化酶(AcK68)的水平是否超过第二预定阈值水平，(iii)缺氧-诱导因子2α(HIF2α)的表达水平是否超过指示干性谱系可塑性的第三预定阈值水平，(iv)Ki-67蛋白的水平是否超过第四预定阈值水平，(v)OCT蛋白的水平是否超过第五预定阈值水平，(vi)SOX2蛋白的水平是否超过第六预定阈值水平，和(vii)单体与四聚体MnSOD的比率是否超过第七预定阈值水平；和
(c)如果满足标准(i)-(vii)中的一个或多个，则确定个体适合于治疗；和
在选择适合治疗的个体的情况下，通过向个体施用治疗有效量的相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物来治疗个体。
67.权利要求65-66任一项的方法，其中该方法还包括以提供癌症治疗的剂量水平和作为放疗过程的一部分向个体施用电离辐射。
68.权利要求65-67任一项的方法，该方法还包括在施用式(I)的五氮杂大环状环配合物之前、与之同时或之后，向个体施用治疗有效量的抗癌剂。
69.权利要求68的方法，其中抗癌剂包括以下任何一种或多种：化疗剂、用抑制激素受体途径的治疗剂治疗、用细胞周期抑制剂治疗。
70.权利要求69的方法，其中抗癌剂包括化疗剂，所述化疗剂包括任何含铂化疗剂和蒽环化疗剂。
71.权利要求70的方法，其中化疗剂包括以下任何一种或多种：包括顺铂、奥沙利铂、卡铂、奈达铂、洛铂、庚铂、双环铂、脂铂、LA-12、磷铂、菲铂、prolindac、四硝酸三铂、吡铂、沙铂和/或其药学上可接受的盐的至少一种的含铂化疗剂，和/或包括多柔比星、柔红霉素、表柔比星和伊达比星和/或其药学上可接受的盐的至少一种的蒽环化疗剂。
72.权利要求69的方法，其中抗癌剂抑制与癌症的生长或进展相关的激素受体途径。
73.权利要求72的方法，其中抑制与癌症的生长或进展相关的激素受体途径的抗癌剂靶向雌激素受体途径、孕酮受体途径和雄激素受体途径的任何一种或多种。
74.权利要求73的方法，其中靶向雌激素受体途径、孕酮受体途径和雄激素受体途径中的任何一种或多种的治疗剂选自雌激素受体抑制剂、雌激素受体降解剂/下调剂、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、芳香酶抑制剂、GnRH激动剂、雄激素合成抑制剂、雄激素受体抑制剂和选择性孕酮受体调节剂(SPRM)。
75.权利要求73的方法，其中靶向雌激素受体途径的治疗剂包括选自以下的至少一种：他莫昔芬、来曲唑、氯米芬、4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、萘福昔定、拉索昔芬、巴多昔芬、奥培米芬、氟维司群、布林司群、依拉司群及其衍生物、盐和/或前药。
76.权利要求73的方法，其中靶向雄激素受体途径的治疗剂包括选自以下的任何：雄激素受体拮抗剂、雄激素合成抑制剂和抗促性腺激素。
77.权利要求76的方法，其中靶向雄激素受体途径的治疗剂包括选自以下的至少一种：醋酸环丙孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、螺内酯、奥生多龙、醋酸奥沙特隆、氟他胺、比卡鲁胺、尼鲁米特、托匹鲁胺、恩杂鲁胺、阿帕鲁胺、地诺孕素、屈螺酮、美多孕酮、醋酸诺美孕酮、普美孕酮、曲美孕酮、酮康唑、醋酸阿比特龙、赛维罗奈、氨鲁米特、非那雄胺、度他雄胺、依立雄胺、α-雌二醇、醋酸环丙孕酮、美罗孕酮、氟他胺、尼鲁米特、戊双氟酚、亮丙瑞林、西曲瑞克、烯丙雌醇、醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、己酸孕诺酮、己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸奥沙特隆、奥生多龙、雌二醇、雌二醇酯、炔雌醇、共轭雌激素、己烯雌酚及其衍生物、盐和/或前药。
78.权利要求73的方法，其中靶向孕酮受体途径的治疗剂包括I型、II型或III型孕酮选择性调节剂(SPRM)，其为选自以下的至少一种：奥那司酮、米非司酮、洛那立生、阿来司酮、Org31710、Org31806、CDB-2914和CDB-4124及其衍生物、盐和/或前药。
79.权利要求69的方法，其中抗癌剂包括细胞周期抑制剂，其为CDK4/6抑制剂，所述CDK4/6抑制剂包括选自以下的至少一种：哌柏西利、阿贝西利、瑞博西利及其衍生物、盐和/或前药。
80.权利要求51-79任一项的方法，其中肿瘤组织中沉默调节蛋白(SIRT3)蛋白活性的第一预定阈值水平为低于与肿瘤组织相同类型的非癌组织的正常评分的一个标准偏差的水平，其中正常评分通过取来自至少6个不同个体的相同组织类型的至少6个非癌组织样品的平均值来确定，如通过免疫染色所测定的。
81.权利要求51-79任一项的方法，其中在赖氨酸68残基处乙酰化的锰超氧化物歧化酶(AcK68)的第二预定阈值水平为高于与肿瘤组织相同类型的非癌组织的正常评分的一个标准偏差的水平，其中正常评分通过取来自至少6个不同个体的相同类型的至少6个非癌组织样品的平均值来确定，如通过免疫染色所测定的。
82.权利要求51-79任一项的方法，其中缺氧诱导因子2α(HIF2α)的表达水平的第三预定阈值水平为高于与肿瘤组织相同类型的非癌组织的正常评分的一个标准偏差的水平，其中正常评分通过取来自至少6个不同个体的相同类型的至少6个非癌组织样品的平均值来确定，如通过免疫染色所测定的。
83.权利要求51-79任一项的方法，其中Ki-67蛋白的表达水平的第四预定阈值水平为高于与肿瘤组织相同类型的非癌组织的正常评分的一个标准偏差的水平，其中正常评分通过取来自至少6个不同个体的相同类型的至少6个非癌组织样品的平均值来确定，如通过免疫染色所测定的。
84.权利要求51-79任一项的方法，其中OCT4蛋白的表达水平的第五预定阈值水平为高于与肿瘤组织相同类型的非癌组织的正常评分的一个标准偏差的水平，其中正常评分通过取来自至少6个不同个体的相同类型的至少6个非癌组织样品的平均值来确定，如通过免疫染色所测定的。
85.权利要求51-79任一项的方法，其中SOX2蛋白的表达水平的第六预定阈值水平为高于与肿瘤组织相同类型的非癌组织的正常评分的一个标准偏差的水平，其中正常评分通过取来自至少6个不同个体的相同类型的至少6个非癌组织样品的平均值来确定，如通过免疫染色所测定的。
86.权利要求51-79任一项的方法，其中单体MnSOD蛋白的表达水平与四聚体MnSOD蛋白的表达水平的比率的第七预定阈值水平是高于与肿瘤组织相同类型的非癌组织的正常评分的一个标准偏差的水平，其中正常评分通过取来自至少6个不同个体的相同类型的至少6个非癌组织样品的平均值来确定，如通过免疫染色所测定的。
87.治疗患有癌症并且对抗癌疗法具有抗性和/或具有指示MnSOD-Ac-K68/ROS/HIF2α轴失调的肿瘤特征的哺乳动物个体的癌症的方法，该方法包括：
向个体施用抗癌疗法，其中抗癌疗法选自治疗有效量的化疗剂、治疗有效量的抑制与癌症的生长或进展相关的激素受体途径的治疗剂、治疗有效量的细胞周期抑制剂和治疗有效剂量的电离辐射；和
在施用抗癌疗法之前、与之同时或之后，向个体施用治疗有效量的相应于下式(I)的五氮杂大环状环配合物：
Figure FDA0004113464710000151
其中
M为Mn2+或Mn3+；
R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10独立地为氢、烃基、取代的烃基、杂环基、氨基酸侧链部分或选自以下的部分：-OR11、-NR11R12、-COR11、-CO2R11、-CONR11R12、-SR11、-SOR11、-SO2R11、-SO2NR11R12、-N(OR11)(R12)、-P(O)(OR11)(OR12)、-P(O)(OR11)(R12)和-OP(O)(OR11)(OR12)，其中R11和R12独立地为氢或烷基；
U与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
V与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
W与大环的氮和其所连接的大环的碳原子一起形成具有2-20个环碳原子的芳族或脂环族，取代或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的含氮稠合杂环，条件是当W为稠合的芳族杂环时，连接至为杂环和大环的组成部分的氮的氢和连接至为杂环和大环的组成部分的碳原子的R1和R10不存在；
X和Y表示衍生自任何单齿或多齿配位配体或配体体系或其相应阴离子的适合配体；
Z为抗衡离子；
n为0-3的整数；并且
虚线表示大环的氮原子与过渡金属锰之间的配位键。
88.在处于风险的哺乳动物个体中治疗癌症和/或降低癌症复发可能性的方法，该方法包括：
向个体施用治疗有效量的相应于下式(I)的五氮杂大环状环配合物：
Figure FDA0004113464710000161
其中
M为Mn2+或Mn3+；
R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10独立地为氢、烃基、取代的烃基、杂环基、氨基酸侧链部分或选自以下的部分：-OR11、-NR11R12、-COR11、-CO2R11、-CONR11R12、-SR11、-SOR11、-SO2R11、-SO2NR11R12、-N(OR11)(R12)、-P(O)(OR11)(OR12)、-P(O)(OR11)(R12)和-OP(O)(OR11)(OR12)，其中R11和R12独立地为氢或烷基；
U与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
V与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
W与大环的氮和其所连接的大环的碳原子一起形成具有2-20个环碳原子的芳族或脂环族，取代或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的含氮稠合杂环，条件是当W为稠合的芳族杂环时，连接至为杂环和大环的组成部分的氮的氢和连接至为杂环和大环的组成部分的碳原子的R1和R10不存在；
X和Y表示衍生自任何单齿或多齿配位配体或配体体系或其相应阴离子的适合配体；
Z为抗衡离子；
n为0-3的整数；并且
虚线表示大环的氮原子与过渡金属锰之间的配位键。
89.降低患有癌症的哺乳动物个体中癌症的侵袭性或转移的方法，该方法包括：
向个体施用治疗有效量的相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物：
Figure FDA0004113464710000171
其中
M为Mn2+或Mn3+；
R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10独立地为氢、烃基、取代的烃基、杂环基、氨基酸侧链部分或选自以下的部分：-OR11、-NR11R12、-COR11、-CO2R11、-CONR11R12、-SR11、-SOR11、-SO2R11、-SO2NR11R12、-N(OR11)(R12)、-P(O)(OR11)(OR12)、-P(O)(OR11)(R12)和-OP(O)(OR11)(OR12)，其中R11和R12独立地为氢或烷基；
U与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
V与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
W与大环的氮和其所连接的大环的碳原子一起形成具有2-20个环碳原子的芳族或脂环族，取代或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的含氮稠合杂环，条件是当W为稠合的芳族杂环时，连接至为杂环和大环的组成部分的氮的氢和连接至为杂环和大环的组成部分的碳原子的R1和R10不存在；
X和Y表示衍生自任何单齿或多齿配位配体或配体体系或其相应阴离子的适合配体；
Z为抗衡离子；
n为0-3的整数；并且
虚线表示大环的氮原子与过渡金属锰之间的配位键。
90.抑制患有癌症的哺乳动物个体中癌症的干性表型的发展和/或进展的方法，该方法包括：
向个体施用治疗有效量的相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物：
Figure FDA0004113464710000181
其中
M为Mn2+或Mn3+；
R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10独立地为氢、烃基、取代的烃基、杂环基、氨基酸侧链部分或选自以下的部分：-OR11、-NR11R12、-COR11、-CO2R11、-CONR11R12、-SR11、-SOR11、-SO2R11、-SO2NR11R12、-N(OR11)(R12)、-P(O)(OR11)(OR12)、-P(O)(OR11)(R12)和-OP(O)(OR11)(OR12)，其中R11和R12独立地为氢或烷基；
U与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
V与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
W与大环的氮和其所连接的大环的碳原子一起形成具有2-20个环碳原子的芳族或脂环族，取代或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的含氮稠合杂环，条件是当W为稠合的芳族杂环时，连接至为杂环和大环的组成部分的氮的氢和连接至为杂环和大环的组成部分的碳原子的R1和R10不存在；
X和Y表示衍生自任何单齿或多齿配位配体或配体体系或其相应阴离子的适合配体；
Z为抗衡离子；
n为0-3的整数；并且
虚线表示大环的氮原子与过渡金属锰之间的配位键。
91.权利要求88-90任一项的方法，该方法还包括在施用相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物之前、与之同时或之后，向个体施用选自下列的抗癌疗法：治疗有效量的化疗剂、治疗有效量的抑制与癌症生长或进展相关的激素受体途径的治疗剂、治疗有效量的细胞周期抑制剂和治疗有效剂量的电离辐射。
92.治疗哺乳动物个体中对抗癌疗法具有抗性的肿瘤的方法，所述抗癌疗法选自化疗剂、抑制与癌症生长或进展相关的激素受体途径的治疗剂、细胞周期抑制剂和放疗，该方法包括：
向个体施用治疗有效量的相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物：
Figure FDA0004113464710000191
其中
M为Mn2+或Mn3+；
R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10独立地为氢、烃基、取代的烃基、杂环基、氨基酸侧链部分或选自以下的部分：-OR11、-NR11R12、-COR11、-CO2R11、-CONR11R12、-SR11、-SOR11、-SO2R11、-SO2NR11R12、-N(OR11)(R12)、-P(O)(OR11)(OR12)、-P(O)(OR11)(R12)和-OP(O)(OR11)(OR12)，其中R11和R12独立地为氢或烷基；
U与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
V与大环的相邻碳原子一起形成具有3-20个环碳原子的稠合的，取代的或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的环或杂环；
W与大环的氮和其所连接的大环的碳原子一起形成具有2-20个环碳原子的芳族或脂环族，取代或未取代的，饱和、部分饱和或不饱和的含氮稠合杂环，条件是当W为稠合的芳族杂环时，连接至为杂环和大环的组成部分的氮的氢和连接至为杂环和大环的组成部分的碳原子的R1和R10不存在；
X和Y表示衍生自任何单齿或多齿配位配体或配体体系或其相应阴离子的适合配体；
Z为抗衡离子；
n为0-3的整数；并且
虚线表示大环的氮原子与过渡金属锰之间的配位键。
93.权利要求92的方法，该方法还包括在施用式(I)的五氮杂大环状环配合物之前、与之同时或之后施用抗癌疗法。
94.权利要求87-93任一项的方法，其中肿瘤和/或癌症具有特征在于以下任何一种或多种的特征：(i)沉默调节蛋白(SIRT3)蛋白水平低于第一预定阈值水平，(ii)K68-乙酰化锰超氧化物歧化酶(AcK68)水平超过第二预定阈值水平，(iii)缺氧诱导因子2α(HIF2α)的表达水平超过指示干性谱系可塑性的第三预定阈值水平，(iv)Ki-67蛋白的水平超过第四预定阈值水平，(v)OCT4蛋白的水平超过第五预定阈值水平，(vi)SOX2蛋白的水平超过第六预定阈值水平，和(viii)单体与四聚体MnSOD的比率超过第七预定阈值水平。
95.权利要求87-94任一项的方法，其中肿瘤和/或癌症对抗癌疗法具有固有抗性，和/或由于接受具有抗癌疗法的治疗方案以(i)治疗哺乳动物个体患有的癌症，和/或(ii)降低哺乳动物个体处于风险的癌症复发的可能性而具有对抗癌疗法的发展抗性。
96.权利要求87-95任一项的方法，其中抑制与癌症的生长或进展相关的激素受体途径的治疗剂靶向雌激素受体途径、孕酮受体途径和雄激素受体途径的任何一种或多种。
97.权利要求96的方法，其中靶向雌激素受体途径、孕酮受体途径和雄激素受体途径中的任何一种或多种的治疗剂包括以下任何一种或多种：雌激素受体抑制剂、雌激素受体降解剂/下调剂、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、芳香酶抑制剂、GnRH激动剂、雄激素合成抑制剂、雄激素受体抑制剂和选择性孕酮受体调节剂(SPRM)。
98.权利要求96的方法，其中靶向雌激素受体途径的治疗剂包括以下任何一种或多种：他莫昔芬、来曲唑、氯米芬、4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、萘福昔定、拉索昔芬、巴多昔芬、奥培米芬、氟维司群、布林司群、依拉司群及其衍生物、盐和/或前药。
99.权利要求96的方法，其中靶向雄激素受体途径的治疗剂包括以下任何一种或多种：雄激素受体拮抗剂、雄激素合成抑制剂和抗促性腺激素。
100.权利要求96的方法，其中靶向雄激素受体途径的治疗剂包括选自以下的至少一种：醋酸环丙孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、螺内酯、奥生多龙、醋酸奥沙特隆、氟他胺、比卡鲁胺、尼鲁米特、托匹鲁胺、恩杂鲁胺、阿帕鲁胺、地诺孕素、屈螺酮、美多孕酮、醋酸诺美孕酮、普美孕酮、曲美孕酮、酮康唑、醋酸阿比特龙、赛维罗奈、氨鲁米特、非那雄胺、度他雄胺、依立雄胺、α-雌二醇、醋酸环丙孕酮、美罗孕酮、氟他胺、尼鲁米特、戊双氟酚、亮丙瑞林、西曲瑞克、烯丙雌醇、醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、己酸孕诺酮、己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸奥沙特隆、奥生多龙、雌二醇、雌二醇酯、炔雌醇、共轭雌激素、己烯雌酚及其衍生物、盐和/或前药。
101.权利要求96的方法，其中靶向孕酮受体途径的治疗剂包括I型、II型或III型孕酮选择性调节剂(SPRM)，其为选自以下的至少一种：奥那司酮、米非司酮、洛那立生、阿来司酮、Org31710、Org31806、CDB-2914和CDB-4124及其衍生物、盐和/或前药。
102.权利要求87-95任一项的方法，其中化疗剂包括以下至少一种：选自顺铂、奥沙利铂、卡铂、奈达铂、洛铂、庚铂、双环铂、脂铂、LA-12、磷铂、菲铂、prolindac、四硝酸三铂、吡铂、沙铂和/或其药学上可接受的盐的含铂化疗剂，和/或选自多柔比星、柔红霉素、表柔比星和伊达比星和/或其药学上可接受的盐的蒽环化疗剂。
103.权利要求87-95任一项的方法，其中细胞周期抑制剂包括CDK4/6抑制剂，所述CDK4/6抑制剂选自哌柏西利、阿贝西利、瑞博西利及其衍生物、盐和/或前药。
104.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中癌症和/或肿瘤为选自以下任何一种：乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、头颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肝细胞癌、硬纤维瘤、胰腺癌、黑素瘤和肾细胞癌。
105.权利要求104的方法和/或试剂盒，其中癌症和/或肿瘤包括乳腺癌。
106.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中癌症为激素受体阳性(HR+)癌症，包括选自以下的任何：雌激素受体阳性(ER+)癌症、孕酮受体阳性(PR+)癌症和雄激素受体阳性(AR+)癌症。
107.权利要求105-106任一项的方法和/或试剂盒，其中乳腺癌为管腔A型乳腺癌和/或管腔B型乳腺癌中的任何。
108.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中乳腺癌为管腔B型乳腺癌。
109.权利要求104的方法和/或试剂盒，其中癌症和/或肿瘤包括前列腺癌。
110.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中五氮杂大环状环配合物以有效降低癌细胞对靶向雌激素受体途径、孕酮受体途径和雄激素受体途径中的任一种或多种的活性剂和/或化疗剂的抗性的量施用。
111.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中哺乳动物个体为人个体。
112.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中五氮杂大环状环配合物以治疗有效量施用，所述治疗有效量导致癌症响应增加，所述癌症响应增加对应于选自以下的任何：肿瘤体积减小、肿瘤生长速率降低、哺乳动物个体的存活增加、转移的发生和/或程度降低和癌细胞增殖减少和/或癌症并发症减少。
113.上述权利要求任一项的方法，其中该方法还包括施用：(i)放疗，(ii)免疫疗法和/或另外的化疗剂。
114.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10各自为氢。
115.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中W为未取代的吡啶部分。
116.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中U和V为反式环己基稠合环。
117.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中五氮杂大环状环配合物由式(II)表示：
Figure FDA0004113464710000211
其中
X和Y表示衍生自任何单齿或多齿配位配体或配体体系或其相应阴离子的适合配体；并且
RA、RB、RC和RD独立地为氢、烃基、取代的烃基、杂环基、氨基酸侧链部分或选自以下的部分：-OR11、-NR11R12、-COR11、-CO2R11、-CONR11R12、-SR11、-SOR11、-SO2R11、-SO2NR11R12、-N(OR11)(R12)、-P(O)(OR11)(OR12)、-P(O)(OR11)(R12)和-OP(O)(OR11)(OR12)，其中R11和R12独立地为氢或烷基。
118.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中五氮杂大环状环配合物由式(III)或式(IV)表示：
Figure FDA0004113464710000221
其中
X和Y表示衍生自任何单齿或多齿配位配体或配体体系或其相应阴离子的适合配体；并且
RA、RB、RC和RD独立地为氢、烃基、取代的烃基、杂环基、氨基酸侧链部分或选自以下的部分：-OR11、-NR11R12、-COR11、-CO2R11、-CONR11R12、-SR11、-SOR11、-SO2R11、-SO2NR11R12、-N(OR11)(R12)、-P(O)(OR11)(OR12)、-P(O)(OR11)(R12)和-OP(O)(OR11)(OR12)，其中R11和R12独立地为氢或烷基。
119.上述权利要求任一项的方法，其中五氮杂大环状环配合物为选自式(V)-(XVI)的式表示的化合物：
Figure FDA0004113464710000231
Figure FDA0004113464710000241
Figure FDA0004113464710000251
120.上述权利要求任一项的方法，其中X和Y独立地选自以下的取代或未取代的部分：卤代、氧代、水合离子、羟离子、醇、酚、双氧、过氧、氢过氧、烷基过氧、芳基过氧、氨、烷基氨基、芳基氨基、杂环烷基氨基、杂环芳基氨基、氧化胺、肼、烷基肼、芳基肼、一氧化氮、氰化物、氰酸根、硫氰酸根、异氰酸根、异硫氰酸根、烷基腈、芳基腈、烷基异腈、芳基异腈、硝酸根、亚硝酸根、叠氮基、烷基磺酸、芳基磺酸、烷基亚砜、芳基亚砜、烷基芳基亚砜、烷基次磺酸、芳基次磺酸、烷基亚磺酸、芳基亚磺酸、烷基硫羟羧酸、芳基硫羟羧酸、烷基硫羟硫代羧酸、芳基硫羟硫代羧酸、烷基羧酸、芳基羧酸、脲、烷基脲、芳基脲、烷基芳基脲、硫脲、烷基硫脲、芳基硫脲、烷基芳基硫脲、硫酸根、亚硫酸根、硫酸氢根、酸式亚硫酸根、硫代硫酸根、硫代亚硫酸根、亚硫酸氢根、烷基膦、芳基膦、烷基膦氧化物、芳基膦氧化物、烷基芳基膦氧化物、烷基膦硫化物、芳基膦硫化物、烷基芳基膦硫化物、烷基膦酸、芳基膦酸、烷基次膦酸、芳基次膦酸、烷基三价膦酸、芳基三价膦酸、磷酸根、硫代磷酸根、亚磷酸根、焦亚磷酸根、三磷酸根、磷酸氢根、磷酸二氢根、烷基胍基、芳基胍基、烷基芳基胍基、烷基氨基甲酸根、芳基氨基甲酸根、烷基芳基氨基甲酸根、烷基硫代氨基甲酸根、芳基硫代氨基甲酸根、烷基芳基硫代氨基甲酸根、烷基二硫代氨基甲酸根、芳基二硫代氨基甲酸根、烷基芳基二硫代氨基甲酸根、碳酸氢根、碳酸根、高氯酸根、氯酸根、亚氯酸根、次氯酸根、过溴酸根、溴酸根、亚溴酸根、次溴酸根、四卤代锰酸根、四氟硼酸根、六氟锑酸根、次磷酸根、碘酸根、高碘酸根、偏硼酸根、四芳基硼酸根、四烷基硼酸根、酒石酸根、水杨酸根、琥珀酸根、柠檬酸根、抗坏血酸根、糖精酸根、氨基酸、异羟肟酸、硫代甲苯磺酸根和离子交换树脂阴离子，或它们相应的阴离子；
或X和Y对应于-O-C(O)-X1，其中X1各自为-C(X2)(X3)(X4)，并且
X1各自独立地为取代或未取代的苯基或-C(-X2)(-X3)(-X4)；
X2各自独立地为取代或未取代的苯基、甲基、乙基或丙基；
X3各自独立地为氢、羟基、甲基、乙基、丙基、氨基、-X5C(＝O)R13，其中X5为NH或O，并且R13为C1-C18烷基、取代或未取代的芳基或C1-C18芳烷基或-OR14，其中R14为C1-C18烷基、取代或未取代的芳基或C1-C18芳烷基，或与X4一起为(＝O)；并且
X4各自独立地为氢或与X3一起为(＝O)；
或X和Y独立地选自中和电荷的阴离子，其衍生自任何单齿或多齿配位配体和配体体系及其相应的阴离子；
或X和Y独立地连接至R1、R2、R’2、R3、R4、R5、R’5、R6、R’6、R7、R8、R9、R’9和R10的一个或多个。
121.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中X和Y独立地选自氟、氯、溴和碘阴离子。
122.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中X和Y独立地选自烷基羧酸根、芳基羧酸根和芳基烷基羧酸根。
123.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中X和Y独立地为氨基酸。
124.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中五氮杂大环状环配合物为下式表示的化合物：
Figure FDA0004113464710000261
125.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中五氮杂大环状环配合物为下式表示的化合物：
Figure FDA0004113464710000262
126.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中五氮杂大环状环配合物为下式表示的化合物：
Figure FDA0004113464710000271
127.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中五氮杂大环状环配合物由下式表示：
Figure FDA0004113464710000272
128.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中五氮杂大环状环配合物由下式表示：
Figure FDA0004113464710000273
129.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中五氮杂大环状环配合物由下式表示：
Figure FDA0004113464710000281
130.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中五氮杂大环状环配合物由下式表示：
Figure FDA0004113464710000282
131.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中以范围为0.2mg/kg-40mg/kg的剂量向个体施用五氮杂大环状环配合物。
132.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中以范围为0.2mg/kg-24mg/kg的剂量向个体施用五氮杂大环状环配合物。
133.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中以范围为0.2mg/kg-10mg/kg的剂量向个体施用五氮杂大环状环配合物。
134.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中通过非肠道途径和口服途径的至少一种施用五氮杂大环状环配合物。
135.上述权利要求任一项的方法，其中通过腹膜内或静脉内施用五氮杂大环状环配合物。
136.用于治疗癌症和/或降低癌症复发可能性的试剂盒，该试剂盒包含：
相应于式(I)的五氮杂大环状环配合物：
任选抗癌治疗剂；和
用于施用治疗有效量的五氮杂大环状环配合物以进行上述权利要求任一项的方法的说明书。
137.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，其中癌症对放疗具有抗性，所述放疗包括选自以下的任何：γ辐射、质子疗法、重离子疗法、近距离放疗、放射性核素疗法、适形放疗、强度调节的放疗、立体定向体部放疗、立体消融放疗和伽玛刀疗法，无论是作为标准分割、低分割、加速分割还是减速分割及其变型递送。
138.上述权利要求任一项的方法和/或试剂盒，包括施用放疗，所述放疗包括选自以下的任何：γ辐射、质子疗法、重离子疗法、近距离放疗、放射性核素疗法、适形放疗、强度调节的放疗、立体定向体部放疗、立体消融放疗和伽玛刀疗法，无论是作为标准分割、低分割、加速分割还是减速分割及其变型递送。
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