JP6166534B2 - 新規調節タンパク質および阻害剤 - Google Patents
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Description
本分野は、γ−セクレターゼを活性化し、β−アミロイドタンパク質(Aβ)を生産する、以前に特徴付けられていないタンパク質に関する。Aβの沈着は、アルツハイマー病および他の病理と関連している。本発明は、例えば、該新規タンパク質のスクリーニング方法および新規研究手段、阻害剤、ならびにアルツハイマー病およびAβの沈着と関連する他の神経変性状態の処置およびコントロールの方法を提供する。
現在、世界中で1200万を越える人々がアルツハイマー病(AD)に罹患している。この数は、次の40年後に4倍になると予測されている。そのため、ADの処置は、満たされていない大きな医薬的要求の典型である。ADを処置するための現在承認されている医薬は、症状の改善を助け得るが、疾患の進行を停止するために有効ではない。
本発明者らは、γ−セクレターゼおよびその基質であるアミロイド前駆体タンパク質のC−末端フラグメント(APP−CTF)の両方との相互作用に関与するメカニズムを介してAβ生産を選択的に調節する、新規のγ−セクレターゼを活性化するタンパク質(gSAP)を見出した。gSAPはNotchと相互作用せず、γ−セクレターゼによる開裂に影響しない。組換えgSAPは、インビトロおよび無傷の細胞でAβ生産を刺激する。細胞系におけるgSAPの減少はAβレベルを減少させる。アルツハイマー病のマウスモデルにおけるgSAPのノックダウンは、Aβのレベルおよびプラーク発生を減少させる。gSAPは、gSAPの阻害がAβ形成における有意な減少をもたらすため、アルツハイマー病および他のAβ介在状態の処置のための新規治療標的を示す。
詳細な説明において提供される実施例および図面は単に説明であり、あらゆる特許請求の範囲の解釈または説明において特許請求の範囲を限定するために使用すべきでない。
a.BLASTアルゴリズム(例えば、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi参照)を使用して、図1に記載されている配列から選択される配列と少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、例えば、少なくとも80%、例えば、少なくとも90%類似しているペプチド
b.図1において太字の保存された残基に対応する残基を有するペプチド、または
c.配列番号7(LWDHPMSSNIISR)および/または配列番号8(NHVTRLLQNYKK)の配列を含むペプチド、または
d.図1に記載されている配列番号1−6のいずれかのペプチド、とりわけヒトgSAP、または
e.ガンマセクレターゼとの複合体を形成することができるgSAPのフラグメント、例えば、図1に記載されている配列番号1−6のいずれかのC−末端由来の約16kDaのフラグメント、とりわけヒトgSAP−16K。
a.例えば、ガンマ−セクレターゼとの相互作用を阻害し、それによりAβ生産および蓄積を阻害または減少することができる、gSAPに対するモノクローナル抗体;
b.gSAPの免疫原性フラグメントを適当なアジュバントおよび/または担体と共に含むワクチン;および
c.免疫原性担体に連結したgSAPの免疫原性フラグメントを含む免疫原性複合体
を提供する。
a.i.例えば、競合的結合アッセイにおいて、
ii.例えば、イマチニブ
iii.例えば、メチルピペラジニル部分にて標識基による置換または標識基での修飾により標識化されている、
iv.例えば、
1.光標識された誘導体、例えば、4−アジド−2−ヒドロキシ−N−(4−メチル−3−(4−(ピリジン−3−イル)ピリミジン−2−イルアミノ)フェニル)ベンズアミド、
2.放射性標識された誘導体、例えば、4−アジド−2−ヒドロキシ−5−125ヨード−N−(4−メチル−3−(4−(ピリジン−3−イル)ピリミジン−2−イルアミノ)フェニル)ベンズアミドまたは3H−イマチニブ、および
3.例えば、IC339239およびIC2000001(不活性な対照化合物)
から選択される、
例えば上記定義の、gSAPペプチドへの試験化合物の結合を測定すること。
a.国際特許公報WO03/057165および米国特許第5,521,184号(これらの内容を出典明示により本明細書に包含させる)において記載されているイマチニブおよび他の化合物、
b.WO05/072826;J. Zimmermannら Bioorganic & Medicinal Chem. Lett., 7(2): 187−192;EP 1 533 304;WO04/005281;WO05/039586;米国特許第5,521,184号;およびWO04/110452(これらの内容を出典明示により本明細書に包含させる)に記載されている化合物、および
c.WO/2008/153974、WO/2008/153959およびWO/2008/057599(これらの内容を出典明示により本明細書に包含させる)において記載されている化合物
を含む。
a.例えば、gSAPに対するmRNAの一部に対応し、gSAPの転写または翻訳を阻害することができる二本鎖、ヘアピン、センスまたはアンチセンスRNAから選択される阻害性RNA分子;例えば、
i.センス配列、例えば、AUGCAGAGCUGGACGACAUUUおよびアンチセンス配列、例えば、5’−P.AUGUCGUCCAGCUCUGCAUUUを含むsiRNA;または
ii.gSAP shRNAコード配列、例えば、TCCCGGAACTCCATGATTGACAAATTTCAAGAGAATTTGTCAATCATGGAGTTCC TTTTTAまたは
TGCTGTTGACAGTGAGCGCGGAAATAGAGTGGTGATTAAATAGTGAAGCCACAGATGTATTTAATCACCACTCTATTTCCATGCCTACTGCCTCGGAにより生産されるヘアピン転写産物;
b.阻害性RNA分子を生産するベクターおよび細胞、例えば、gSAP shRNAを有する組換えアデノ随伴ウイルス2(AAV2);
c.gSAPに対する抗体、とりわけモノクローナル抗体、例えば、C−末端領域からのフラグメント、例えば、16K−gSAPに対する抗体、例えば、より完全に以下に記載されているペプチドCFEGHDNVDAEFVEEAALKHT(複合体化のために結合されたN−末端システインを有するヒトgSAPのaa829−848に対応する)に対する抗体;
d.gSAPのフラグメントを免疫原性アジュバントおよび/または担体と共に、例えば、免疫原性担体、例えば、細菌トキソイド、例えば、ジフテリアまたは破傷風菌トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ブルー(blue)担体タンパク質、オボアルブミンまたはウシ血清アルブミンと複合体化されて、および/またはアジュバント、例えば、フロイントアジュバントまたはアラムアジュバントと一緒に送達されることを含むgSAPに対するワクチン
を含む。
1.例えば、発現が高いことがgSAP標的療法での処置のための候補において見られる、gSAPに対する抗体またはgSAP発現に対する定量PCRを使用して、gSAP発現を測定すること;または
2.gSAPまたはgSAP発現に影響する変異を有する、例えば、以下の群のSNP
a)rs6976567|rs1468682|rs1819814、
b)rs1468682|rs1819814|rs4729535、
c)rs1819814|rs4729535|rs4729540、
d)rs7781642|rs6955503|rs7776973
のいずれかを含むハプロタイプを有する患者を同定することであって、
このような変異体またはハプロタイプを有する患者がgSAP標的療法での処置のための候補であると同定すること;
3.gSAP活性に影響する変異、例えば、APP−CTFの膜近傍領域をコードする配列での変異を有する患者を同定することであって、このような変異体またはハプロタイプを有する患者がgSAP標的療法での処置のための候補であると同定すること
から選択される方法を提供する。
2,5−ジオキソピロリジン−1−イル 4−アジド−2−ヒドロキシベンゾエート(NHS−ASA)を、ProChem. Inc (Rockford, IL)から購入する。6−メチル−N1−(4−(ピリジン−3−イル)ピリミジン−2−イル)ベンゼン−1,3−ジアミンおよびN−(4−メチル−3−(4−(ピリジン−3−イル)ピリミジン−2−イルアミノ)フェニル)−4−(ピペラジン−1−イルメチル)ベンズアミド(N−デスメチルイマチニブ)を、ChemPacific Inc (Baltimore, MD)から購入する。2,5−ジオキソピロリジン−1−イル 5−((3aS,4S,6aR)−2−オキソ−ヘキサヒドロ−1H−チエノ[3,4−d]イミダゾール−4−イル)ペンタノエート(ビオチン−OSu)、N−(クロロ(ジメチルアミノ)メチレン)−N−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスフェート(TCFH)、トリフルオロ酢酸(TFA)、1H−ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール−1−オール(HOBt)およびN,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)を、Sigma−Aldrich (St. Louis, MO)から購入する。Tert−ブチル2−(ピペラジン−1−イル)エチルカルバメートを、Astatech Inc (Bristol, PA)から購入する。
ヒトAPP695を安定に過剰発現する神経芽腫2a細胞を、10μMのG01で3時間処理する。DMSOまたはDMSO プラス イマチニブで処理された細胞を対照として使用する。3時間後、馴化培地を回収し、Aβ免疫沈降を4G8抗体を使用して行う。免疫沈降されたAβを10−20%のトリス−トリシンゲルで分離し、PVDF膜に移し、6E10抗体により検出する。イマチニブほど強力ではないが、G01は、10μMのレベルでDMSOビヒクルと比較して、Aβを有意に減少させる。
アフィニティー精製のために、HEK293細胞をプロテアーゼ阻害剤の存在下で10mMのHepes、250mMのスクロース、pH7.4とホモジェナイズする。細胞残屑を1,000gで5分間の遠心分離により取り除いた後、上清を100,000gで1時間超遠心分離に付す。次に、膜ペレットをプロテアーゼ阻害剤(Roche Inc. cat#04 693 132 001)を含む50mMのHepes、150mMのNaCl、5mMのMgCl2、5mMのCaCl2および1%のCHAPSO中で氷上で1時間可溶化し、100,000gで1時間、超遠心分離に付す。可溶性膜抽出物を、結合した活性なビオチン−イマチニブを含むMyoneTMストレプトアビジンT1ビーズ(cat#656−01, Invitrogen)と4℃で3時間インキュベートする。次に、ビーズを溶解物バッファーで3回洗浄する。結合したタンパク質をトリシンSDS−PAGEサンプルバッファーで溶離し、10−20%のトリス−トリシンゲルで分離する。免疫ブロット法のために、ゲルを次にPVDF膜に移し、γ−セクレターゼ抗体で調べる:PS1抗体(cat#529592)およびPen−2抗体(cat#NE1008)はEMD Biosciencesからであり、ニカストリン抗体はBD Transduction Laboratories(cat # 612290)からである。銀染色を使用して、SDS−PAGEゲルにおけるタンパク質バンドを同定する。〜16kDaのバンドを切り取り、トリプシン処理し、タンデムMS/MS質量分析により配列決定する。
インビトロでの標識化のために、膜ペレットを上記のとおりに調製し、50mMのHepes、pH7.4、150mMのNaCl、5mMのMgCl2、5mMのCaCl2に再懸濁する。再懸濁された膜を20nMの125I−G01と4℃で3時間インキュベートし、254nMで2分間、緻密化UVランプ(4ワット、モデル UVGL−25、UVP Inc.)を使用して光分解する。標識化特異性を試験するために、50μMのイマチニブを平行アッセイに加える。光分解後、膜を100,000gで1時間の超遠心分離によりペレット化し、50mMのHepes、150mMのNaCl、1% CHAPSO、5mMのMgCl2、5mMのCaCl2で可溶化する。上清をタンパク質G プラス/タンパク質Aビーズ(EMD Biosciences, cat#IP05)で30分間で前除去し、タンパク質をタンパク質G プラス/タンパク質Aビーズと結合しているPS1抗体(EMD Biosciences, cat#529592)を使用して2時間で沈澱させ、溶解バッファーで4回洗浄する。結合した物質をSDS−トリシンサンプルバッファーで溶離し、10−20%のトリス−トリシンゲルを使用して分離し、次にPVDF膜に移す。該膜を乾燥させ、オートラジオグラフィー用のKodak MSフィルムに暴露させる。無傷の細胞の標識化のために、〜80%の密集度(〜107細胞)にまで増殖させたヒト胚腎臓細胞(HEK293)を、Opti−MEM中の0.1μMの3H−G01でインキュベーター中で5%のCO2で37℃で2時間インキュベートし、1時間氷に移す。培地を取り出し、細胞を冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH7.4で2回洗浄する。光分解を254nMで緻密化UVランプ(4ワット、モデル UVGL−25、UVP Inc.)を使用して氷上で2分間行う。対照として、細胞を、UV架橋なし、または50μMの標識されていないイマチニブの存在下のいずれかでインキュベートする。光分解後、細胞(それぞれの処置に対して〜107細胞)を、氷上でプロテアーゼ阻害剤混合物(Roche)を有する1mlの50mMのHepes、pH7.4、150mMのNaCl、1%のCHAPSO、5mMのMgCl2、5mMのCaCl2中で即座にホモジェナイズする。タンパク質G プラス/タンパク質Aビーズでの前除去後、タンパク質を10μlのPS1−ループ抗体(cat#529592 EMD Biosciences)を使用して2時間、免疫沈降する。免疫沈降物を溶解バッファーで3回洗浄する。免疫精製された(IP)物質をSDSサンプルバッファーで溶離し、生成物を10−20%のトリス−トリシンSDS−PAGEゲルを使用して分離し、PVDF膜に移し、該膜を乾燥させ、オートラジオグラフィー用のKodak MSフィルムに暴露させる。
gSAPに対するウサギポリクローナル抗血清を、キーホールリンペットヘモシアニン(cat#PI−77563, Fisher Scientific)と結合しているペプチドCFEGHDNVDAEFVEEAALKHT(複合体化のために結合されたN−末端システインを有するヒトgSAPのaa829−848に対応する)をニュージーランド 白色ウサギに注射することにより産生する。ウサギ注射、出血および飼育は、Cocalico Biologicals(Reamstown, PA)により行う。抗体を、会社の指示にしたがって固定化され、溶離される抗原ペプチドを有するSulfolink樹脂(Thermo Scientific, cat#44999)に血清を通すことにより精製する。パルス・チェイス標識化のために、神経芽腫2a細胞を、メチオニンおよびシステインを欠くDME最小必須培地(Met−Cys−DMEM)で30分間インキュベートする。細胞タンパク質を、EXPRESS 35Sタンパク質標識化ミックス(cat#NEG772014MC, Perkin Elmer)を含むMet−Cys−DMEMで37℃で15分標識化する。追跡期間は、培地を完全培養培地50%のDMEM/50%のOpti−MEM、5%のウシ胎児血清(FBS)と置き換えることにより開始し、細胞を37℃で種々の時間インキュベートする。連続的な標識化のために、細胞を追跡なしで4時間、35Sタンパク質標識化ミックス(Perkin Elmer)で標識化し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で洗浄する。細胞単層を、プロテアーゼ阻害剤を含むRIPAバッファー(10mMのTris、1%のデオキシコール酸塩、1%のTriton X−100、0.1%のSDS、pH7.4)に溶解させる。該溶解物を13,000rpmで20分の遠心分離により浄化し、上清をタンパク質G プラス/タンパク質Aビーズで前除去し、gSAP抗体を使用して2時間免疫沈降する。ビーズをトリス−トリシンサンプルバッファーとインキュベートし、結合したタンパク質を溶離し、10−20%のトリス−トリシンゲルにより分離し、PVDF膜に移し、オートラジオグラフィー用のKodak MRフィルムに暴露させる。
細胞gSAPノックダウン試験のために、gSAPの低分子干渉RNA(siRNA)をDharmacon Incから購入する。使用されるsiRNAの配列は以下のとおりである:センス配列:AUGCAGAGCUGGACGACAUUU;アンチセンス配列:5’−P.AUGUCGUCCAGCUCUGCAUUU。APP695を安定に過剰発現する神経芽腫2a細胞系に、製造業者により提供される指示にしたがって50nMの濃度でDharmaFect2試薬を使用してsiRNAをトランスフェクトする。非標的対照siRNA(cat# D−001810−01, Dharmacon Inc.)を対照として平行にトランスフェクトする。gSAPの小ヘアピンRNA(shRNA)をOpen Biosystemsから購入し、リポフェクタミン 2000を使用して細胞にトランスフェクトする。pGIPZ shRNAmir−GFPベクター中のマウスgSAP shRNAの配列は、以下のとおりである:TGCTGTTGACAGTGAGCGCGGGTATAGCCTTATTTGCATATAGTGAAGCCACAGATGTATATGCAAATAAGGCTATACCCATGCCTACTGCCTCGGA。pGIPZ shRNAmir−GFPベクター中のヒトgSAP shRNAの配列は、以下のとおりである:TGCTGTTGACAGTGAGCGCGGAAATAGAGTGGTGATTAAATAGTGAAGCCACAGATGTATTTAATCACCACTCTATTTCCATGCCTACTGCCTCGGA。ノックダウン有効性は、リアルタイムRT−PCRキット(cat#12183, Invitrogen)を使用して試験する。
共免疫沈降のために、〜107個の細胞を、氷上でプロテアーゼ阻害剤を有する1mlの50mMのHepes、150mMのNaCl、1%のCHAPSO、5mMのMgCl2、5mMのCaCl2で30分溶解させる。細胞残屑および核を13,000rpmで20分、遠心分離により除去する。タンパク質G プラス/タンパク質Aビーズで30分間前除去後、免疫沈降を、対応する抗体および30μlのビーズを使用して氷上で2時間行う。該ビーズを溶解バッファーで4回洗浄し、30μlのSDSサンプルバッファーで95℃で5分間溶離する。免疫沈降されたタンパク質をSDS−PAGEにより決定し、免疫ブロット法により分析する。プレセニリン1ループ抗体AB14(EMD Biosciences #529594)をPS1−NTFを検出するために使用し、Pen−2抗体はEMD Biosciences(#NE1008)から購入する。ニカストリン抗体はBD Biosciences(#612290)からである。HAモノクローナル抗体(#A0089)およびMycタグ ポリクローナル抗体(#A00172)は、Genscript Incからである。APP−CTFを369抗体(Xu et al. 1998)を使用して検出する。Covanceからの6E10(#SIG39320)および4G8(#SIG39220)抗体をAβを検出するために使用する。
N2a細胞を、上記のとおり、35Sタンパク質標識化ミックス(Perkin Elmer)で4時間で標識する。可溶化膜調製物(0.2ml、50mMのHepes、150mMのNaCl、1%のCHAPSO、5mMのMgCl2、5mMのCaCl2中で〜1mgの可溶化タンパク質)を、100,000gで1時間遠心し、可能性のある凝集物質を除去する。得られる上清を、AKTA高速液体クロマトグラフィー系(Amersham Biosciences)のSuperdex 200 10/300 GLカラム(Amersham Biosciences)に負荷する。分別を0.5ml/分の流速で溶解バッファー中で行い、1mlの画分を分析のために回収する。それぞれの画分を、γ−セクレターゼ抗体に対するウェスタンブロットにより分析する。内因性gSAPを検出するために、それぞれの画分をgSAP抗体と免疫沈降する。免疫沈降した物質をトリス−トリシン サンプルバッファーで溶離し、10−20%のトリス−トリシンゲルにより分離し、PVDF膜に移し、オートラジオグラフィー用のKodak MRフィルムに暴露する。
膜ペレットを、上記のとおり、APP−β−CTF(CT−100)でトランスフェクトされたHEK293細胞から調製し、該膜をアッセイバッファー(10mMのHepes、140mMのKOAc、2.5mMのMgOAc、0.1mMのCaCl2、1mMのATP、pH7.2)で洗浄し、4℃で100,000gで30分間ペレット化する。組換えgSAP−16K(ヒトgSAPのaa733−854)を、BL21 DE3大腸菌から発現させ、精製する。該膜を、2μgの組換えgSAP−16Kまたは対照として同量のBSAを含む200μlのアッセイバッファーに再懸濁する。1μMのL685,458(γ−セクレターゼ阻害剤)での平行系を、また、対照として使用する。膜懸濁液を4℃で1時間、前インキュベートし、次に37℃で2時間インキュベートし、インビトロでAβの産生を可能にする。該膜を、1/4の容量の200mMのTris、pH7.8、760mMのNaCl、24mMのEDTA、10%のTriton X−100において可溶化し、不溶性物質を10,000gで20分間の遠心分離により除去する。Aβを、4G8抗体を使用して溶解物から免疫沈降し、10−20%のトリス−トリシンゲルで分離し、PVDF膜に移し、Kodak MRフィルムを使用するオートラジオグラフィーに付す。
NotchΔE(C−末端mycタグを有する、Notch細胞外ドメインのほとんどを欠いている短縮されたNotch−1)をコードするプラスミドは、以前に記載されている(Netzer et al. 2003)。NotchΔEでトランスフェクトされた細胞を、gSAP−shRNAまたはgSAPプラスミドと共トランスフェクトする。トランスフェクションの2日後、Notch発現および開裂を、抗−myc抗体で検出する。開裂されたNotch細胞内ドメイン(NICD)を、開裂−特異的抗体(Notch1 Val−1744, Cell Signaling Inc.)で検出する。L−685,458で処理された細胞を対照として使用する。
RNAiマウスを、前記の処理にしたがって生産する(Seibler et al. 2007)。具体的には、gSAP shRNA コード配列TCCCGGAACTCCATGATTGACAAATTTCAAGAGAATTTGTCAAT CATGGAGTTCCTTTTTAを有する交換ベクターは、H1−Tetプロモーターのコントロール下である。リコンビナーゼ介在カセット交換(RMCE)技術を使用して、ベクターをマウスES細胞ゲノムに組み込む(B6/129S6 背景)。次に、トランスフェクトされたES細胞を4倍体胚盤胞に注射し、誘導RNAiマウスを産生する。次に、ヘテロ接合体RNAiマウスをAPPsweおよびPS1Δ9変異を有するADマウスモデル(AD 2×マウス)と交雑し、gSAP−RNAi ADマウスを産生する。shRNA誘導を、10%のスクロースを含む飲料水中の2mg/mlのドキシサイクリン(Sigma D−9891)を導入することにより行う。対照マウスを、10%のスクロースを含む飲料水で飼育する。飲料水を2日毎に交換し、暗所を維持する。マウスにおけるgSAPノックダウン効率を、定量リアルタイムRT−PCRを使用してアッセイする。全RNAを標準処理にしたがって単離し、cDNAを逆転写Core Kit(Eurogentec)を使用して合成する。リアルタイムPCR反応は、iCycler Thermal cycler instrument(Bio−Rad)を使用して行う。マウス脳のAβレベル測定のために、2月齢gSAP−RNAi ADマウスを1月間ドキシサイクリンで誘導し、脳組織をELISAアッセイのためにギ酸で抽出する。
マウスGIPZ shRNAmirの個々のクローン(V2LMM_88580:マウスgSAP遺伝子に関するヘアピン配列
TGCTGTTGACAGTGAGCGCGGGTATAGCCTTATTTGCATATAGTGAAGCCACAGATGTATATGCAAATAAGGCTATACCCATGCCTACTGCCTCGGAを含む)を、Openbiosystems/Thermo Scientificから購入する。ヘアピン領域を切り出し、BamHIおよびHindIIIサイトを介してAAV2−siln4.1−MCS−EGFPベクター(Vector biolabs)に挿入する。三重トランスジェニックADマウス(6月齢)をAβに対して分析する。二重トランスジェニックADマウス(13月齢)をプラークに関して分析する。それぞれのグレープにおいて、マウスを、ケタミン(100mg/kg)およびキシラジン(10mg/kg)の混合物で深く麻酔し、定位フレームに置く。AVV2−gSAP shRNA−GFPまたはAVV2−GFPを有するAAV2ウイルスを、右または左の海馬に左右相称に注射する。定位座標をマウスの脳のPaxinos Atlasにしたがって決定する:前後方向2.18mm、中外側1.97mmおよび背腹2mm。1μlのそれぞれのAAV2(gSAPまたはGFP対照に関してshRNA)(3.3×1013vg/ml)を、0.2μl/分の速度で5分間、電動注射ポンプを備えた10ulのHamiltonシリンジで注射する。注射針をさらに5分間、脳に維持し、液体溢出を防止する。マウスを注射4週間後に殺す。
N−(6−メチル−5−(4−フェニルピリミジン−2−イルアミノ)ピリジン−3−イル)−4−((1−メチルピペリジン−4−イル)メチル)ベンズアミド(WO/2008/153974、ex.7)を、40個のキナーゼに対して試験されるとき(データは示していない)、少しのキナーゼ阻害活性を有する典型的なイマチニブ類似体として選択する。約100nMのKi 対 Ablキナーゼ(承認された抗癌適応に対する主要標的)を有するイマチニブと比較して、N−(6−メチル−5−(4−フェニルピリミジン−2−イルアミノ)ピリジン−3−イル)−4−((1−メチルピペリジン−4−イル)メチル)ベンズアミドは、約12,000nMのKi 対 このキナーゼの100倍弱い活性を有する。この化合物は、それにもかかわらず、イマチニブと同様の様式においてAβを阻害する。これは、イマチニブのキナーゼ阻害活性がgSAPに対する活性の根拠ではなく、むしろ、それがgSAPおよびガンマセクレターゼ間の相互作用における特異的な効果を有することをさらにサポートする。
以下に記載されているN−(6−メチル−5−(4−フェニルピリミジン−2−イルアミノ)ピリジン−3−イル)−4−((1−メチルピペリジン−4−イル)メチル)ベンズアミドは、WO/2008/153974において記載されているが、合成を便宜上の目的で提供する:
乾燥トルエン(25mL)中の3−ブロモ−2−メチル−5−ニトロ−ピリジン(4.46g、2.10mmol)および4−フェニル−2−ピリミジンアミン(1.3g、1.75mmol)の混合物にCs2CO3(0.85g、2.62mmol)、Pd2(dba)3(32mg、0.035mmol)およびXantphos(60mg、0.105mmol)を加える。混合物をN2で空気を抜き、パージし、窒素下で90℃に24時間加熱する。反応混合物を室温に冷却し、EtOAcで希釈し、濾過する。濾液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、生成物を黄色固体として得る(320mg、収率59%)。1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ 2.75 (s, 3H), 7.19 (s, 1H), 7.37 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.57−7.54 (m, 3H), 8.17−8.12 (m, 2H), 8.59 ( d, J = 4.0 Hz, 1H), 9.02 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 9.87 (d, J = 2.0 Hz, 1H); MS ESI+) m/z 308 [M+H]+。
ヒドラジン水和物(12mL)およびメタノール(20mL)中の触媒塩化第二鉄(12mg)、(2−メチル−5−ニトロ−ピリジン−3−イル)−(4−フェニル−ピリミジン−2−イル)−アミン(320mg、1.04mmol)の混合物を15分還流する。反応混合物を室温に冷却し、減圧下濃縮し、粗残渣を水に溶解し、EtOAcで抽出する。合わせた抽出物を無水Na2SO4上で乾燥させ、減圧下濃縮する。残渣をEt2Oと5分間撹拌し、エーテル層をデカントし、残渣を真空乾燥させ、生成物を黄色固体として得る(270mg、収率93%)。Mp: 133.1−133.4 ℃; 1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ 2.51 (s, 3H), 3.62 (bs, 2H), 6.93 (s, 1H), 7.20 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.52−7.49 (m, 3H), 7.74 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.08−8.03 (m, 2H), 8.13 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.48 (d, J = 4.0 Hz, 1H); MS (ESI+) m/z 278 [M+H]+。
4−(ピペリジン−4−イルメチル)安息香酸(114mg、0.342mmol)を2mLのメタノールに溶解し、次に37%のホルムアルデヒド水溶液(56μL、0.685mmol)を加える。反応混合物を室温で5分間撹拌し、次にNaBH3CN(26mg、0.41mmol)を加える。混合物を室温で2時間撹拌し、少量の水でクエンチし、次に高真空下で乾燥のために蒸発させ、白色の泡状固体を得、これをさらなる精製なしに次の反応のために使用する。MS (ESI+) m/z 234.1 [M+H]+。
DIEA(149μL、0.86mmol)を、DMF中の2−メチル−N3−(4−フェニルピリミジン−2−イル)ピリジン−3,5−ジアミン(47mg、0.17mmol)、4−((1−メチルピペリジン−4−イル)メチル)安息香酸(40mg、0.17mmol)、BOP(91mg、0.21mmol)の懸濁液に加える。反応混合物をアルゴン雰囲気下で室温で一晩撹拌する。混合物を0.45μmのマイクロフィルターを介して濾過し、濾液をWaters半分取HPLCにより精製し、16mgの最終産物を白色粉末として得る。MS (ESI+) m/z 493.1 [M+H]+。
1つの例において、アッセイは、gSAPタンパク質の阻害剤に対して試験するために使用され得る。gSAPタンパク質の選択される配列は、可能性のある阻害剤との結合を検出するために使用され得る。
a.診断アッセイをgSAPタンパク質のレベルを測定するために使用する。gSAPタンパク質のレベルの増加は、疾患と相関であり得る。
a)rs6976567|rs1468682|rs1819814、
b)rs1468682|rs1819814|rs4729535、
c)rs1819814|rs4729535|rs4729540、
d)rs7781642|rs6955503|rs7776973。
これらのハプロタイプにおける2つのSNP(rs4729540およびrs7776973)は、また、単一のマーカー分析における遅延型認識試験と有意に関連する。したがって、これらのハプロタイプを有すると同定された患者は、gSAP阻害剤での処置のための候補である。
提供される例の代替的組合せおよび変化が、本記載に基づいて明らかである。記載されている態様の全ての多数の可能性のある組合せおよび変化に関する特定の例を提供することは不可能であるが、このような組合せおよび変化は、記載されている特許請求の範囲の範囲内である。
Claims (6)
- Aβ沈着を阻害する化合物を同定するためのアッセイにおける、
a.図1に記載されている配列番号1−6のいずれかの配列から選択される配列と90%より高い配列同一性を有するペプチド、
b.図1に記載されている配列番号1−6のいずれかのペプチド、
から選択されるγ−セクレターゼを活性化するタンパク質(gSAP)ペプチドの使用。 - 請求項1に記載のgSAPの免疫原性フラグメントを適当なアジュバントおよび/または担体と共に含むワクチン。
- 請求項1に記載のgSAPペプチドへの試験化合物の結合を測定することを含む、Aβ沈着を阻害する化合物を同定する方法。
- 対照集団を使用して同定された正常値と比較して請求項1に記載のgSAPペプチドにおける発現レベルの増加を調べることを含む、アルツハイマー病を発症する危険性がある個体を同定する方法。
- 標識されている請求項1に記載のgSAPペプチドを含有する組成物であって、Aβ沈着を阻害する化合物を同定するためのアッセイに使用する組成物。
- gSAPに対する抗体またはgSAP発現のための定量PCRを使用して、gSAP発現を測定することを含む、gSAP標的療法での処置のための候補を同定する方法であって、発現の増加がgSAP標的療法での処置のための候補において見られ、gSAPが請求項1に記載のgSAPである方法。
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