KR102234112B1 - 뇌 특이적 핵산 전달 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 렙틴 또는 렙틴-유래 뇌 타겟팅 펩타이드 및 양이온성 펩타이드(cationic peptide)로 구성된 폴리펩타이드를 포함하는 핵산분자의 뇌 운반용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 조성물을 사용함으로써 핵산분자를 뇌로 효율적으로 운반할 수 있다.
본 발명의 조성물을 사용함으로써 핵산분자를 뇌로 효율적으로 운반할 수 있다.
Description
본 발명은 핵산분자의 뇌 운반용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
알츠하이머 병(Alzheimer's disease, AD)는 치매의 가장 일반적인 유형 중 하나이다. 행동의 변화 및 말하거나 걷기의 어려움은 늦은 발병 증상인 반면에, 초기 증상은 무관심, 우울증, 손상된 판단력, 방향감각 상실, 정신착란 등을 포함한다[1-5]. 노화, 유전적 돌연변이 또는 가족 병력과 같은 AD의 원인이 되는 많은 위험 요소들이 있다. 통계적으로 65세 이상의 사람들 중 11%가 AD를 앓고 있으며, 이 수치는 85세 이상의 인구에서 32%까지 증가한다[6]. 이 질병은 행동에 심각한 영향을 끼치기 때문에 치매는 환자 뿐만 아니라 환자의 가족, 친구, 공동체를 포함하는 주변 사람들에서 영향을 끼친다. 경제적으로도 이 질병은 환자를 돌보는 비용을 사회의 부담 및 추가적인 책임으로 전가한다. 또한 AD는 미국내에서 6번째 사망원인이며, 그 비율은 2000년과 2010년 사이에 68%까지 사망률이 증가하였다[6-1].
AD의 주요한 특징은 주름진 뇌, 부피의 감소, 뇌의 신경 세포 내에서의 아밀로이드-β(Aβ) 플라크 축적 및 얽힌 타우(Tangled Tau)의 축적이다[8]. Aβ 플라크 및 얽힌 타우 모두는 신경 독성이고 그들의 집합체의 형성을 촉진한다[9-11]. Aβ 플라크는 Aβ 펩타이드들로 구성되고, 주요 구성요소는 β-시트 풍부 구조에서 기인한 집합체 형성에 대한 높은 잠재력을 갖는 Aβ42 펩타이드이다[23, 24]. Aβ 펩타이드는 아밀로이드 전구 펩타이드(APP)로부터 형성되고, 세포외부 도메인 및 막통과 도메인 상의 β-시크리테이즈 및 γ-시크리테이즈 각각에 의해 절단된다. β-시크리테이즈(BACE-1)는 처음으로 아밀로이드-β의 N-말단에서 절단되고, C-말단에서 γ-시크리테이즈에 의해 연속적으로 절단된다. Aβ 펩타이드의 최종 길이는 아밀로이드-β의 40 또는 42 아미노산에서 가장 높은 빈도를 보이는 γ-시크리테이즈의 절단 위치에 의해 결정된다[21, 22]. γ-시크리테이즈는 프레세닐린 1, 2, Pen-2, 니카스트린 및 Aph-1을 포함하는 몇몇의 서브유닛으로 구성되고, 그것이 활성화되는 때에 N-말단 단편 및 C-말단 단편으로 나뉘어진다(separated)[25-29].
독성 Aβ42 생성을 위한 γ-시크리테이즈에 의한 APP의 절단은 Aβ 합성의 최종 단계이고, Aβ 생산을 억제하기 위한 상기 효소를 표적으로하는 많은 연구들이 있었다[33-35]. 그러나 γ-시크리테이즈의 직접적인 억제는 시도들의 실패를 야기하는 심각한 부작용을 낳는데 이는 노치(notch)가 γ-시크리테이즈의 또 다른 기질이며, 노치 신호전달의 방해를 야기하기 때문이다[36, 37]. Aβ 또는 타우 그 자체, β-시크리테이즈, γ-시크리테이즈 또는 연관 단백질들 또는 유전자과 같은 다양한 분자들에 의해 AD의 진행을 치료 또는 억제하기 위해 수 많은 전략들이 개발되었다[35, 38-43]. 최근의 연구들은 γ-시크리테이즈 활성 단백질(GSAP)이 γ-시크리테이즈의 프레세닐린-1 서브유닛에 결합하고 효소를 활성화시킨다는 것을 보여준다[53, 54]. GSAP는 γ-시크리테이즈의 활성도를 조절하는데 중요하다는 것 또한 밝혀졌고, 그 억제는 체내의 정상적인 생리적 기능을 조절하는 노치 신호 전달에 영향을 주지 않는다. GSAP 억제자 및 GSAP 타겟팅 shRNA를 이용한 녹-인(knock-in) 형질 전환 마우스 연구는 in vitro 및 in vivo 모두에서 Aβ 로드(load)에서 주요한 감소를 보였다(53). 그러므로 AD의 진행 상에 GSAP를 타겟팅하는 약물의 치료적 적용을 시험하는 것은 흥미롭다.
RNAi 간섭은 임상에서 이용하기 위한 대단한 잠재력을 갖는 강력한 사일런싱 메카니즘이다. 그러나 프라이머리 세포에 siRNA를 전달하는 것은 임상에 도달하기 전에 극복해야 할 주요한 장벽이다. 몇가지 성공적인 결과들이 임상 시험으로부터 보고되었다(Fitzgerald, K., et al., Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial. Lancet, 2014. 383(9911): p. 60-8. 및 Semple, S.C., et al., Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nat Biotechnol, 2010. 28(2): p. 172-6).
모든 성공적인 접근들은 siRNA(GalNAc-siRNA)에 직접적으로 컨쥬게이션된 N-아세틸갈락토사민과 같은, 아시알로글라이코프로틴 리셉터 또는 안정한 핵산 지질 입자(SNALP)에 의한 흡수를 통한 헤파토사이트에 대한 간단한 전달 시스템에 의해 쉽게 접근 가능한 조직에 대하여 제한된다. 그러므로 간단하고 비용효율적인 siRNA의 표적화 전달 시스템을 개발하는 것은 중요하고 임상 시험에 대하여 요구된다. 종래 리간드 또는 단일사슬 단편 항체(scFv)와 같은 표적 부(moiety)를 갖는, siRNA 운반 카고(cargo)로서 폴리-9 아르기닌(9R)을 siRNA와 결합시키기 위해 사용하였다(Kumar, P., et al., Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature, 2007. 448(7149): p. 39-43. 및 Kumar, P., et al., T cell-specific siRNA delivery suppresses HIV-1 infection in humanized mice. Cell, 2008. 134(4): p. 577-86).
siRNA의 표적화 전달을 동물 모델에서 뿐만아니라 임상 시험에서도 집중적으로 연구해왔다(O'Mahony, A.M., et al., Non-viral nanosystems for gene and small interfering RNA delivery to the central nervous system: formulating the solution. J Pharm Sci, 2013. 102(10): p. 3469-84. 및 Ramsey, J.M., et al., 'Smart' non-viral delivery systems for targeted delivery of RNAi to the lungs. Ther Deliv, 2013. 4(1): p. 59-76).
첫째 인간의 siRNA의 표적화 전달은, 암 세포 상에서 전형적으로 상승 조절되는 트랜스페린 리셉터(TfR)에 결합하기 위한 타겟팅 리간드에 부착된 자가-조립, 시클로덱스트린 폴리머-기반의 나노파티클을 이용한 고형암의 전신적 타겟팅을 통하여 고형암을 효과적으로 제어하였다(Davis, M.E., et al., Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature, 2010. 464(7291): p. 1067-70). 많은 연구들은 표적화 전달이 뇌를 포함하는 조직 내에서 달성될 수 있을을 보였다(1. Kumar, P., et al., Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature, 2007. 448(7149): p. 39-43. 및 Davis, M.E., et al., Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature, 2010. 464(7291): p. 1067-70). 본 발명자들 또한 암, T 세포 또는 뇌로의 리간드 또는 항체를 이용한 siRNA의 전신적 전달을 보였다(Kumar, P., et al., Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature, 2007. 448(7149): p. 39-43. 및 Kumar; P., et al., T cell-specific siRNA delivery suppresses HIV-1 infection in humanized mice. Cell, 2008. 134(4): p. 577-86; 및 Beloor, J., et al., Arginine-engrafted biodegradable polymer for the systemic delivery of therapeutic siRNA. Biomaterials, 2012. 33(5): p. 1640-50).
그러나 표적화 전달에 대한 가장 중요한 인자들은 특이적 전달, 효율적인 유전자 녹다운 및 면역 반응의 비촉발이다. 그러므로 리간드 펩타이드의 반복적인 주입이 면역 반응을 유발할 수 있기 때문에(Kumar, P., et al., Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature, 2007. 448(7149): p. 39-43), 가능한 면역원성을 최소화하기 위하여, 외인성 리간드보다는 내인성 리간드로부터의 리간드를 개발하는 것이 중요하다.
비록 대부분의 프라이머리 조직들이 siRNA를 포함하는 약물을 전달하는 것이 어렵긴 하지만, 뇌로의 전달이 가능하다. 많은 종류의 나이-연관 및 신경변성 질환이 뇌에서 발생하기 때문에, 이러한 특별한 장소는 BBB(Blood brain barrier)의 존재로 인한[44, 45, 46, 47] 효율적인 전달 및 부작용의 위험을 포함하는[64, 65] 유전자 치료를 포함하는 치료 수단을 제한한다. 폐색 접합(occluding junction)으로 조직된 상기 BBB는 제한된 종류의 분자들만이 이 장벽을 통과하도록 허용하고, 이런 이유로 치료적 약물에 대한 효율적인 전달을 요한다[48-50]. 몇몇의 연구들은 표적화 펩타이드 또는 그 동족 수용체가 뇌에서 발현되는 항체를 이용한 뇌로의 카고의 전달을 보여준다[51, 52]. 그러나 내인성 분자를 억제하기 위한 치료적 약물의 효율적인 전달은 보고되지 않았다. 그러므로 안전하고 효율적인 뇌로의 약물 전달을 가능케하는 새로운 시스템의 개발이 필요하다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 핵산 분자를 뇌로 효율적으로 운반하기 위한 전달체를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 (a) 렙틴 또는 렙틴-유래 뇌 타겟팅 펩타이드와 (b) 양이온성 펩타이드로 구성된 폴리펩타이드 간의 컨쥬게이트의 다량체를 이용하는 경우 핵산을 객체(subject)의 뇌로 핵산을 매우 높은 효율로 전달할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 핵산분자의 뇌 운반용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 알츠하이머 질환에 대한 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 객체(subject)의 뇌로의 핵산 전달 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 핵산의 뇌 전달용 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 일반식 1로 표시되는 컨쥬게이트의 다량체(multimer)를 포함하는 핵산 분자의 뇌 운반용 조성물을 제공한다:
일반식 1
Lep-CP 또는 CP-Lep
상기 일반식에서, Lep은 렙틴 또는 렙틴-유래 뇌 타겟팅 펩타이드이고, CP는 양이온성 펩타이드(cationic peptide)로 구성된 폴리펩타이드임.
본 발명자들은 핵산 분자를 뇌로 효율적으로 운반하기 위한 전달체를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 (a) 렙틴 또는 렙틴-유래 뇌 타겟팅 펩타이드와 (b) 양이온성 펩타이드로 구성된 폴리펩타이드 간의 컨쥬게이트의 다량체를 이용하는 경우 핵산을 객체(subject)의 뇌로 핵산을 매우 높은 효율로 전달할 수 있음을 규명하였다.
본 발명은 일반식 1로 표시되는 컨쥬게이트의 다량체를 포함하는 핵산분자의 뇌 운반용 조성물에 관한 것이다. 일반식 1에 있어서, 'Lep-CP', 또는 'CP-Lep'는 Lep와 CP간에 공유결합이 형성되어 있는 것을 의미한다. 본 명세서 상에서의 용어 "Lep"는 렙틴 또는 렙틴-유래 뇌 타겟팅 펩타이드를 의미하고, "CP"는 양이온성 펩타이드(cationic peptide)로 구성된 폴리펩타이드를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 렙틴-유래 뇌 타겟팅 펩타이드는 서열목록 제 1 서열로 표시되는 렙틴의 1-33, 12-32, 15-32 또는 61-90 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 1-33 또는 61-90 아미노산 서열을 포함하며, 더 바람직하게는 61-90 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 양이온성 펩타이드는 아르기닌, 히스티딘 및 리신으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이며, 바람직하게는 아르기닌이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 폴리펩타이드는 8-18 아미노산으로 이루어지며, 바람직하게는 8-12 아미노산으로 이루어진다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 컨쥬게이트의 Lep와 CP 간의 결합은 링커를 통하여 형성된다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 링커는 글리신, 아스파라긴, 세린, 트레오닌 및 알라닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 1-50 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩타이드이고, 바람직하게는 2-30, 더 바람직하게는 3-20, 더욱 더 바람직하게는 5-15, 가장 바람직하게는 6-12 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩타이드이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 컨쥬게이트는 컨쥬게이트 다량체의 형성을 위한 상호 결합부위를 포함하며, 상기 상호 결합부위는 단량체 간의 아미드 결합을 위한 일 말단 아미노산 그 자체일 수 있고, 이황화결합, 이민결합, 또는 에스테르 결합을 위한 특정의 아미노산 일 수 있다. 단량체 간의 아미드 결합을 위한 단량체 각각의 일 말단은 구체적으로 CP 펩타이드의 양 말단 중 Lep와 결합을 형성하지 않은 반대편 일 말단의 아미노산을 의미한다. 또한 단량체 간의 이황화결합을 위한 상호 결합부위는 이황화결합을 형성할 수 있는 아미노산인 시스테인일 수 있고, 상기 시스테인은 CP 펩타이드 서열 가운데 포함될 수 있고, 바람직하게는 CP 펩타이드 서열의 양 말단 중 하나 이상에 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 CP 펩타이드의 양 말단 중 Lep와 결합을 형성하지 않은 반대편 일 말단의 아미노산과 아미드 결합을 형성하여 Lep-CP-C 또는 C-CP-Lep를 형성할 수 있다. 본 발명의 컨쥬게이트 단량체는 상술한 상호 결합부위 간의 결합을 통해 다량체를 형성할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 상호 결합부위는 복수개의 상기 컨쥬게이트 단량체 간의 이황화결합 형성을 위한, 하나 이상의 시스테인이다. 상술한 바와 같이 상호 결합부위로서의 시스테인은 CP 펩타이드 서열 가운데 포함될 수 있고, 바람직하게는 CP 펩타이드 서열의 양 말단 중 하나 이상에 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 CP 펩타이드의 양 말단 중 Lep와 결합을 형성하지 않은 반대편 일 말단의 아미노산과 아미드 결합을 형성할 수 있다. 본 발명의 컨쥬게이트 단량체에 다수의 시스테인이 포함되는 경우 시스테인간의 이황화 결합을 통하여 다량체를 형성하는 것이 가능하다.
본 발명의 일 구체예에 있어서 본 발명인 컨쥬게이트 다량체는 이량체(dimer)이다. 컨쥬게이트 이량체의 경우, 컨쥬게이트 단량체에 비하여 핵산을 뇌로 전달하는 효율 면에서 월등히 뛰어난 효과를 발휘한다(참조: 도 2a의 하단).
본 명세서 상의 용어 핵산은 염기, 당, 인산의 세 가지 요소로 구성된 화학적 단량체인 뉴클레오티드가 다수의 인산에스테르 결합을 매개로 사슬 형태로 이어진 고분자 화합물을 의미하며, '유전자', 'DNA', 'RNA', '올리고뉴클레오티드', '폴리뉴클레오티드', '앱타머', '플라스미드' 등을 포함하는 의미이다. 또한, 상기 핵산은 핵산 구조 중의 인산부, 에스테르부 등에 포함되는 산소 원자 등이, 예컨대 황 원자 또는 불소 원자 등의 다른 원자나 메틸기 등의 알킬기로 치환된 유도체를 포함한다. 또한, 상기 핵산은 합성된 형태 및 혼성 중합체, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 모두 포함하며, 당업자에게 명백한 바와 같이, 화학적으로 또는 생화학적으로 개질되거나, 또는 비천연 또는 뉴클레오티드 염기의 유도체를 포함할 수 있다. 또한 핵산은 플라스미드 유형의 선형 또는 환형, 수퍼코일링되거나 풀어진 DNA일 수 있고, 다양한 유전 요소를 운반할 수 있다(코딩 상, 프로모터, 종결자, 결합 부위, 복제 기원 등). 핵산은 다양한 기원(인간, 동물, 하등 진핵세포, 원핵세포, 식물, 바이러스, 파지 등)으로부터 얻은 것일 수 있다. 또한 핵산은 합성 또는 반-합성 핵산일 수 있고, 핵산의 크기는 매우 다양할 수 있다(올리고뉴클레오티드로부터 완전한 게놈까지).
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 핵산은 siRNA, 안티센스 핵산, 또는 핵산 앱타머이다. 본 명세서 상의 용어 'siRNA'는 표적 mRNA의 번역을 막는 이중 가닥 RNA 분자를 의미한다. 상기 siRNA는 dsRNA 및 shRNA를 모두 포함한다. 상기 'dsRNA'는 한 개의 가닥과 이에 상보적인 서열을 가지는 다른 가닥으로 구성된 두 개의 RNA 분자 컨스트럭트를 지칭한다. 상기 shRNA는 서로 상보적인 첫 번째 및 두 번째 영역, 즉 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는 줄기-루프 구조(stem-loop structure)를 가지는 siRNA를 지칭한다. 본 명세서 상의 용어 핵산 앱타머는 단일가닥의 올리고 핵산 또는 펩타이드 분자로서 화학물질, 단백질 그리고 세포까지 다양한 물질에 특이적으로 결합하는 특징적 서열을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 핵산은 5 내지 200개의 염기쌍으로 구성된 siRNA, 안티센스 핵산 또는 핵산 앱타머이다.
본 발명인 핵산 전달용 조성물은 포유류, 예컨대 인간에게 투여될 수 있으며, 뇌로의 핵산 전달을 목적으로 하므로, 전신성 투여를 통해 체내로 투여될 수 있다. 본 발명의 전신성 투여란 혈류로 유의하게 유입되지 않는 국소 투여와 대비되는 의미를 갖는 것으로서, 정맥, 경구, 복막내 및 근육내 투여를 지칭한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 일반식 1로 표시되는 컨쥬게이트의 다량체(multimer)를 포함하는 핵산분자의 뇌 운반용 조성물; 및 (b) γ-시크리테이즈 활성 단백질(GSAP) 발현을 억제하는 siRNA를 포함하는 알츠하이머 질환에 대한 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 γ-시크리테이즈 활성 단백질(GSAP) 발현을 억제하는 siRNA는 siGSAP로도 표기하였다. 본 발명의 조성물을 전신성 투여를 통해 체내 주입하는 경우, siGSAP를 효과적으로 뇌로 전달하여, Aβ 생성을 감소시키고, AD 마우스 행동을 개선시킨다는 결과를 도출하였다.
본 발명인 알츠하이머 질환에 대한 예방 또는 치료용 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등 을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하투여, 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 적합한 1일 투여량은, 0.0001-100 mg/kg(체중)이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 객체(subject)의 뇌로의 핵산 전달 방법을 제공한다:
(a) 제 1 항 내지 제14항의 조성물과 뇌로의 전달을 위한 핵산을 혼합하는 단계;
(b) 상기 단계(a)에서 준비한 혼합물을 객체에 투여(injection)하는 단계.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명인 핵산 전달 방법의 단계(b)의 '투여'는 전신성 투여이다. 전신성 투여란 혈류로 유의하게 유입되지 않는 국소 투여와 대비되는 의미를 갖는 것으로서, 정맥, 경구, 복막내 및 근육내 투여를 지칭한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 전신성 투여는 정맥(intravenous) 투여이다.
본 발명인 객체의 뇌로의 핵산 전달 방법은 상술한 본 발명의 다른 양태인 핵산 전달용 조성물을 이용하는 방법에 해당하는 바, 중복되는 내용에 대하여는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략하도록 한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 핵산의 뇌 전달용 조성물의 제조방법을 제공한다:
(a) Lep 및 CP 간의 직접 공유 결합 또는 링커를 통한 공유결합을 통해, Lep-CP 또는 CP-Lep 컨쥬게이트를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 제조한 2개 이상의 컨쥬게이트 간의 결합을 통해, 컨쥬게이트 다량체를 포함하는 핵산의 뇌 전달용 조성물을 제조하는 단계.
Lep 및 CP 간의 직접 공유 결합은 구체적으로 예를 들어 아미드 결합일 수 있고, 본 발명의 링커는 본 발명의 다른 양태인 핵산 전달용 조성물에서 상술한 바와 같다. 본 발명의 단계 (b)에 있어서의 2개 이상의 컨쥬게이트 간의 결합에 대하여도, 본 발명의 다른 양태인 핵산 전달용 조성물에서 상술한 바와 같다.
본 발명인 핵산의 뇌 전달용 조성물의 제조방법은 본 발명의 다른 양태인 핵산 전달용 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이므로, 중복되는 내용에 대하여는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략하도록 한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 핵산분자의 뇌 운반용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 알츠하이머 질환에 대한 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
(c) 본 발명에 의하면, 핵산분자를 BBB(Blood Brain Barrier) 통과 상의 문제 없이 효율적으로 뇌로 전달할 수 있다.
(d) 본 발명에 의하면, γ-시크리테이즈 활성 단백질(GSAP) 발현을 억제하는 siRNA를 객체(subject)의 뇌로 효율적으로 전달하여 알츠하이머 질환을 효과적으로 예방 또는 치료하는 것이 가능하다.
도 1은 Lep9R/siRNA, diLep9R/siRNA의 생리화학적 특성을 나타낸다. 도 1의 A는 Lep9R/siRNA 및 diLep9R/siRNA의 도식 구조도를 나타낸다. 네 개의 글리신(G)을 렙틴-유도 펩타이드 및 9R 펩타이드 사이의 스페이서로서 이용하였다. 각각의 펩타이드 말단의 시스테인 사이의 막대는 이황화결합을 나타낸다. 도 1의 B는 diLep9R을 형성하기 위한 Lep9R의 컨쥬게이션 효율을 나타낸다. 펩타이드의 C-말단에서의 시스테인으로부터의 프리 싸이올 그룹의 상대적인 퍼센트는 Ellman's kit를 이용하여 측정하였다. 컨쥬게이션 효율은 프리 시스테인 펩타이드와 비교하여 반응의 3일부터 80%로 유지되었다. 도 1의 C는 Lep9R/siRNA 및 diLep9R/siRNA의 전기영동 이동성 시프트 분석을 나타낸다. 1% 아가로오스 겔을 분석에 사용하였다. 도 1의 D는 표면 전하 및 (E) 20:1 중량비에서의 diLep9R/siRNA의 입자 크기을 동적 광 산란(DLS)를 이용하여 측정한 것을 나타낸다. 표는 3회의 독립 실험의 평균±SD를 나타낸다.
도 2a 내지 도 2e는 in vitro 및 in vivo에서 diLep9R이 기능성 siRNA를 전달하는 것을 나타낸다. 도 2a는 N2a 세포를 20:1의 중량비로 diLep9R/siFITC와 배양하였고, 감염 24 시간 후 유동 세포분석기로 형광을 분석한 것을 나타낸다. 히스토그램은 FITC에 대하여 양성인 세포의 % 및 평균 형광 강도(MFI)를 나타낸다. 리포펙타민 2000을 양성 대조구로 사용하였다. 채워진 히스토그램 및 열린 히스토그램은 감염되지 않은 세포 및 소정의 시약으로 감염된 세포와 연관된다. 도 2b는 diLep9R/siSOD1에 의한 SOD-1 사일런싱을 나타낸다. 소정의 시약들로 처리한 세포 및 타겟 mRNA 수준은 감염 24시간 후 qPCR에 의해 분석하였다. GAPDH mRNA 수준은 정규화를 위해 이용하였다. 데이터는 SOD1의 상대적인 발현에 대한 평균±SD를 나타낸다. 인간 CD4를 타겟팅하는 siCD4를 음성 대조구로서 이용하였다. Mock은 무처리 세포를 나타낸다. 도 2c는 diLep9R/siFITC의 생물 분포(Biodistribution)를 나타낸다. diLep9R/siRNA 또는 scrambled/siRNA 복합체들을 정맥 주사하고 18시간 후, 뇌 및 다른 조직들을 마우스로부터 절단하였고, 형광을 분석하였다. 도 2d는 2c에서의 뇌를 각 부분으로 분리하고, 형광으로 분석한 것을 나타낸다. 도 2e는 뇌의 다른 부분에서의 유전자 사일런싱의 분석을 나타낸다. 소정의 시약으로 정맥 주사한지 24 시간 후 뇌의 각 부분을 분리하였다. GAPDH mRNA 수준을 정규화를 위해 사용하였다. 결과들은 3회의 독립실험의 평균이다. 표시한 바와 같이 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001이다.
도 3은 AD 마우스 모델에서의 상승된 GSAP 발현을 나타낸다. 도 3의 A는 AD 마우스 내에서의 피질 및 해마로부터의 상대적인 GSAP mRNA 발현을 나타낸다. 피질 및 해마를 마우스로부터 표시된 개월 수에서 절단하고 GSAP 발현을 qPCR로 분석하였다. GAPDH mRNA 수준은 정규화를 위해 사용하였다. 결과들은 3회의 독립 실험의 평균이다. 데이터는 GSAP의 상대적인 발현에 대한 평균±SD를 나타낸다. 도3의 B는 다른 개월 수에서의 AD 마우스로부터의 해마 및 피질 사이의 GSAP mRNA 발현 비율을 나타낸다.
도 4a 내지 도 4d는 세포 내에서 Aβ 생성의 일부를 siLep9R/siGSAP가 감소시키는 것을 나타낸다. 도 4a는 siLep9R/siGSAP가 GSAP를 억제하는 것을 나타낸다. RT-PCR(좌측 패널) 및 qPCR(우측 패널)을 diLep9R/siGSAP 또는 diLep9R/siCD4로 감염 24시간 후 N2a 세포로부터 수행하였다. qPCR 데이터는 Mock 대조구와 비교되는 상대적인 GSAP 발현에 대한 평균±SD를 나타낸다. 도 4b는 siGSAP로 형질감염된 세포로부터의 대표적인 웨스턴 블랏을 나타낸다. γ-시크리테이즈 서브유닛인 GSAP-16K의 감소를 나타낸다. 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 플라스미드 DNA는 리포첵타민에 의해 siGSAP와 함께 공동 형질감염시켰다. Mock은 무처리 세포이다. 도 4c는 웨스턴 블랏을 기초로 한 그래프를 나타낸다. 결과들은 3회 독립적인 웨스턴 블랏의 평균이다. 데이터는 표시한 타겟 단백질의 상대적인 밴드 강도에 대한 평균±SD를 나타낸다. 결과값들은 β-액틴의 강도에 대하여 정규화 하였다. 밴드 강도는 Kodak MI 소프트웨어를 통해 계산하였다. 도 4D는 siGSAP 감소가 또한 Aβ42의 생성을 억제하는 것을 나타낸다. N2a 세포에서 형질감염 48시간 후에 Aβ42를 검출하기 위해 싸이오플라빈-T 분석을 수행하였다. 세포 용해물 및 배지를 수집하였고, 싸이오플라빈-T와 배양한 후에 분광 광도계를 이용하여 형광을 측정하였다. 결과값은 무처리 세포에 대하여 정규화 하였다. 표시한 바와 같이 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001이다.
도 5a 내지 5h는 GSAP의 억제가 AD 마우스에서의 Aβ를 감소시키는 것을 나타낸다. 도 5a는 실험 스케쥴의 개략도를 나타낸다. 7월령 AD 마우스(n=8)를 8주 동안 주당 2회 diLep9R/siGSAP 또는 diLep9R/siCD4(0.3 mg siRNA/kg)로 정맥 주사 하였고, AD 분석하였다. 도 5b는 siGSAP가 피질 및 해마 모두에서 GSAP를 억제하는 것을 나타낸다. 피질 및 해마는 마우스로부터 적출되었고, qPCR을 분리된 mRNA로부터 수행하였다. GAPDH를 정규화를 위해 사용하였다. 데이터는 GAPDH에 대하여 정규화된 GSAP의 상대적인 발현을 나타낸다(n=4). siCD4을 음성 대조구로 접종하였고, 무처리 마우스를 AD 대조구로 이용하였다. 도 5c는 피질 및 해마로부터의 Aβ생성과 연관된 단백질의 대표적인 웨스턴 블랏을 나타낸다. 도 5d는 피질의 상대적인 단백질 발현, 도 5e는 해마의 상대적인 단백질 발현에 대한 웨스턴 블랏 데이터(n=5)를 나타낸다. 데이터는 각각의 단백질들의 상대적인 밴드 강도에 대한 평균±SD이다. 밴드 강도는 Kodak MI 소프트웨어를 통해 계산하였고, β-액틴의 강도에 대하여 정규화\하였다. 도 5e는 웨스턴 블랏(그룹당 5)으로부터의 해마의 상대적인 단백질 발현을 나타낸다. 데이터는 표시한 표적 단백질의 상대적인 밴드 강도에 대한 평균±SD를 나타낸다. 밴드 강도는 Kodak MI 소프트웨어를 통해 계산하였고, β-액틴 밴드의 강도에 대하여 정규화 하였다. 도 5f는 Aβ 플라크와 같은 β-시트 풍부 단백질에 부착되는 싸이오플라빈-S로 염색된 대표적인 파라핀-침지 섹션 및 그들의 형광을 나타낸다. 양성 형광은 녹색으로서 Aβ 플라크를 나타낸다. 원 배율은 400배이다. 도 5g는 siGSAPfh 처리한 AD 마우스(n=5)의 피질 및 해마로부터의 상대적인 Aβ를 나타낸다. 데이터는 총 픽셀 수에 대하여 정규화된 상대적인 싸이오플라빈-S 양성 영역을 나타낸다. 싸이오플라빈-S 양성 도트를 Image J를 이용하여 계수하고, 총 픽셀에 대하여 정규화하였다. 데이터는 형광강도의 평균±SD를 나타낸다. 도 5h는 행동 변화를 위해 siGSAP(n=8) 또는 siCD4(n=8)로 처리한 마우스로부터의 Y-미로 및 물체 인식 분석을 나타낸다. Y-미로 데이터는 각각의 길로 모든 마우스의 발이 지나갔을 때 계수하였고, 물체 인식은 새로운 물체 근처에서 소비하는 시간을 측정하였다. 데이터는 각각의 실험에 대하여 평균±SD를 나타낸다. 표시한 바와 같이 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001이다.
도 2a 내지 도 2e는 in vitro 및 in vivo에서 diLep9R이 기능성 siRNA를 전달하는 것을 나타낸다. 도 2a는 N2a 세포를 20:1의 중량비로 diLep9R/siFITC와 배양하였고, 감염 24 시간 후 유동 세포분석기로 형광을 분석한 것을 나타낸다. 히스토그램은 FITC에 대하여 양성인 세포의 % 및 평균 형광 강도(MFI)를 나타낸다. 리포펙타민 2000을 양성 대조구로 사용하였다. 채워진 히스토그램 및 열린 히스토그램은 감염되지 않은 세포 및 소정의 시약으로 감염된 세포와 연관된다. 도 2b는 diLep9R/siSOD1에 의한 SOD-1 사일런싱을 나타낸다. 소정의 시약들로 처리한 세포 및 타겟 mRNA 수준은 감염 24시간 후 qPCR에 의해 분석하였다. GAPDH mRNA 수준은 정규화를 위해 이용하였다. 데이터는 SOD1의 상대적인 발현에 대한 평균±SD를 나타낸다. 인간 CD4를 타겟팅하는 siCD4를 음성 대조구로서 이용하였다. Mock은 무처리 세포를 나타낸다. 도 2c는 diLep9R/siFITC의 생물 분포(Biodistribution)를 나타낸다. diLep9R/siRNA 또는 scrambled/siRNA 복합체들을 정맥 주사하고 18시간 후, 뇌 및 다른 조직들을 마우스로부터 절단하였고, 형광을 분석하였다. 도 2d는 2c에서의 뇌를 각 부분으로 분리하고, 형광으로 분석한 것을 나타낸다. 도 2e는 뇌의 다른 부분에서의 유전자 사일런싱의 분석을 나타낸다. 소정의 시약으로 정맥 주사한지 24 시간 후 뇌의 각 부분을 분리하였다. GAPDH mRNA 수준을 정규화를 위해 사용하였다. 결과들은 3회의 독립실험의 평균이다. 표시한 바와 같이 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001이다.
도 3은 AD 마우스 모델에서의 상승된 GSAP 발현을 나타낸다. 도 3의 A는 AD 마우스 내에서의 피질 및 해마로부터의 상대적인 GSAP mRNA 발현을 나타낸다. 피질 및 해마를 마우스로부터 표시된 개월 수에서 절단하고 GSAP 발현을 qPCR로 분석하였다. GAPDH mRNA 수준은 정규화를 위해 사용하였다. 결과들은 3회의 독립 실험의 평균이다. 데이터는 GSAP의 상대적인 발현에 대한 평균±SD를 나타낸다. 도3의 B는 다른 개월 수에서의 AD 마우스로부터의 해마 및 피질 사이의 GSAP mRNA 발현 비율을 나타낸다.
도 4a 내지 도 4d는 세포 내에서 Aβ 생성의 일부를 siLep9R/siGSAP가 감소시키는 것을 나타낸다. 도 4a는 siLep9R/siGSAP가 GSAP를 억제하는 것을 나타낸다. RT-PCR(좌측 패널) 및 qPCR(우측 패널)을 diLep9R/siGSAP 또는 diLep9R/siCD4로 감염 24시간 후 N2a 세포로부터 수행하였다. qPCR 데이터는 Mock 대조구와 비교되는 상대적인 GSAP 발현에 대한 평균±SD를 나타낸다. 도 4b는 siGSAP로 형질감염된 세포로부터의 대표적인 웨스턴 블랏을 나타낸다. γ-시크리테이즈 서브유닛인 GSAP-16K의 감소를 나타낸다. 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 플라스미드 DNA는 리포첵타민에 의해 siGSAP와 함께 공동 형질감염시켰다. Mock은 무처리 세포이다. 도 4c는 웨스턴 블랏을 기초로 한 그래프를 나타낸다. 결과들은 3회 독립적인 웨스턴 블랏의 평균이다. 데이터는 표시한 타겟 단백질의 상대적인 밴드 강도에 대한 평균±SD를 나타낸다. 결과값들은 β-액틴의 강도에 대하여 정규화 하였다. 밴드 강도는 Kodak MI 소프트웨어를 통해 계산하였다. 도 4D는 siGSAP 감소가 또한 Aβ42의 생성을 억제하는 것을 나타낸다. N2a 세포에서 형질감염 48시간 후에 Aβ42를 검출하기 위해 싸이오플라빈-T 분석을 수행하였다. 세포 용해물 및 배지를 수집하였고, 싸이오플라빈-T와 배양한 후에 분광 광도계를 이용하여 형광을 측정하였다. 결과값은 무처리 세포에 대하여 정규화 하였다. 표시한 바와 같이 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001이다.
도 5a 내지 5h는 GSAP의 억제가 AD 마우스에서의 Aβ를 감소시키는 것을 나타낸다. 도 5a는 실험 스케쥴의 개략도를 나타낸다. 7월령 AD 마우스(n=8)를 8주 동안 주당 2회 diLep9R/siGSAP 또는 diLep9R/siCD4(0.3 mg siRNA/kg)로 정맥 주사 하였고, AD 분석하였다. 도 5b는 siGSAP가 피질 및 해마 모두에서 GSAP를 억제하는 것을 나타낸다. 피질 및 해마는 마우스로부터 적출되었고, qPCR을 분리된 mRNA로부터 수행하였다. GAPDH를 정규화를 위해 사용하였다. 데이터는 GAPDH에 대하여 정규화된 GSAP의 상대적인 발현을 나타낸다(n=4). siCD4을 음성 대조구로 접종하였고, 무처리 마우스를 AD 대조구로 이용하였다. 도 5c는 피질 및 해마로부터의 Aβ생성과 연관된 단백질의 대표적인 웨스턴 블랏을 나타낸다. 도 5d는 피질의 상대적인 단백질 발현, 도 5e는 해마의 상대적인 단백질 발현에 대한 웨스턴 블랏 데이터(n=5)를 나타낸다. 데이터는 각각의 단백질들의 상대적인 밴드 강도에 대한 평균±SD이다. 밴드 강도는 Kodak MI 소프트웨어를 통해 계산하였고, β-액틴의 강도에 대하여 정규화\하였다. 도 5e는 웨스턴 블랏(그룹당 5)으로부터의 해마의 상대적인 단백질 발현을 나타낸다. 데이터는 표시한 표적 단백질의 상대적인 밴드 강도에 대한 평균±SD를 나타낸다. 밴드 강도는 Kodak MI 소프트웨어를 통해 계산하였고, β-액틴 밴드의 강도에 대하여 정규화 하였다. 도 5f는 Aβ 플라크와 같은 β-시트 풍부 단백질에 부착되는 싸이오플라빈-S로 염색된 대표적인 파라핀-침지 섹션 및 그들의 형광을 나타낸다. 양성 형광은 녹색으로서 Aβ 플라크를 나타낸다. 원 배율은 400배이다. 도 5g는 siGSAPfh 처리한 AD 마우스(n=5)의 피질 및 해마로부터의 상대적인 Aβ를 나타낸다. 데이터는 총 픽셀 수에 대하여 정규화된 상대적인 싸이오플라빈-S 양성 영역을 나타낸다. 싸이오플라빈-S 양성 도트를 Image J를 이용하여 계수하고, 총 픽셀에 대하여 정규화하였다. 데이터는 형광강도의 평균±SD를 나타낸다. 도 5h는 행동 변화를 위해 siGSAP(n=8) 또는 siCD4(n=8)로 처리한 마우스로부터의 Y-미로 및 물체 인식 분석을 나타낸다. Y-미로 데이터는 각각의 길로 모든 마우스의 발이 지나갔을 때 계수하였고, 물체 인식은 새로운 물체 근처에서 소비하는 시간을 측정하였다. 데이터는 각각의 실험에 대하여 평균±SD를 나타낸다. 표시한 바와 같이 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 펩타이드
펩타이드는 펩트론사로부터 합성하였고, 서열은 하기에 나타내었다.
렙틴-폴리9아르기닌-시스테인:
YQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLGGGGRRRRRRRRRc,
스크램블된 폴리9아르기닌-시스테인:
EVGQSDYSSYARTSIRASLTFGGGGRRRRRRRRRc.
펩타이드는 30% DMSO를 함유하는 PBS 내에서 100 mg/ml 농도로 용해하였다. 렙틴 다이머(lep-18)를 제조하기 위해, 펩타이드를 10% DMSO를 함유하는 PBS 내에서 at 10 mg/ml 조건 하, 3일간 실온 배양하였다. 다이머 생성은 종래 알려진 DTNB(5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid))를 이용한 Ellman's test[56, 69]에 의해 확인하였다. 컨쥬게이션 효율은 90% 이상이었다.
실시예 2: siRNA
듀플렉스 siRNA를 STPharm으로부터 얻었다. 타겟 siRNA 서열은 GSAP에 대해 디자인되었거나 종래 공지되었다(Novina, C.D., et al., siRNA-directed inhibition of HIV-1 infection. Nat Med, 2002. 8(7): p. 681-6). siRNA 서열은 하기에 나타내었다.
GSAP 타겟팅 siRNA(siGSAP):5'-AUGCAGAGCUGGACGACAUUU-3';
인간 CD4 타겟팅 siRNA(siCD4):5'-GAUCAAGAGACUCCUCAGUTT-3';
루시퍼라제 타겟팅 siRNA(siLuc):5'-GGACAUUACUAGUGACUCA-3'
Nero2A 세포 내에서 siGSAP를 2.4 μg의 siRNA의 형질주입에 의해 스크리닝하였고, 0.3 mg siRNA/kg을 in vivo 실험에서 사용하였다. CD4 유전자(siCD4) 및 루시퍼라제(siLuc) 타겟팅 siRNA를 대조구로서 사용하였다.
실시예 3: 사이즈 및 표면 전하 측정
실온에서 30분간 5.2 μg(400 pmole)의 siRNA를 400 μl의 DPBS(pH 7.4) 내의 100 μg의 Lep9R 이량체(diLep9R)와 30분간 실온에서 1:20의 중량비로 복합체를 형성시켰다. 평균 유체역학적 직경 및 형성된 나노파티클의 제타전위를 동적 광 산란(Zeta-sizer-nano analyzer ZS; Malvern instruments)을 이용하여 측정하였다.
실시예 4: 전기 영동상 변화 분석(EMSA)
50 pmole의 siRNA를 DPBS(pH7.4) 내의 다른 중량비(1 내지 30)의 Lep9R 이량체 펩타이드와 복합체를 형성시켰고, 30분간 실온에서 배양시켰다. 샘플은 에티듐 브로마이드(EtBr)를 함유하는 1% 아가로스 겔 내로 로딩하였고, 전기 영동하였다.
실시예 5: 세포 배양 및 형질전환
쥐 신경 아세포종(Neuro2a, N2a)세포를 ATCC로부터 얻었고, 10% 태아소혈청, 페니실린(100 IU/ml) 및 스트렙토마이신(100 μg/ml)를 함유하는 DMEM 내에서 배양하였다. 20:1 중량비의 Lep9R/siRNA 복합체(50 μg의 Lep9R 이량체 및 2.4 μg(200 pmole)의 FITC-표지 siRNA(siFITC))를 200 μl DMEM 내에서 30분간 실온에서 배양하는 것에 의해 준비하였다. 복합체를 200 μl의 DMEM 부피의 6 웰 조직 배양 플레이트 내에 접종한 N2a 세포(2×105 세포/웰)로 첨가하였다. 형질주입 24시간 후 플로우 유동세포분석(flow cytometry)를 이용하여 siRNA 흡수에 대해 세포를 분석하였다.
실시예 6: 동물 실험
모든 절차를 한양대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)(2013-0111)에 의해 승인된 가이드라인 및 프로토콜에 따라 수행하였다. 7월령 수컷 3xTg(B6;129-Psen1tm1Mpm Tg(APPSwe,tauP301L)1Lfa/Mmjax) 마우스(Jackson Lab)를 in vivo 실험에 사용하였다. 상기 마우스들은 Aβ 플라크 및 tangled tau 및 행동의 형성을 포함하는 분자 생물학적 변화 내의 병리학적 생리학적 특성과 같은 알츠하이머병을 나타낸다[55, 56].
Balb/c 마우스는 qPCR의 대조구로서 이용하였다. siRNA의 전신적(systemic) 전달을 위해, diLep9R/siRNA 복합체(0.3 mg siRNA/kg 체중량 및 100 μg의 diLep9R, 20:1 중량비)로 주당 2회씩 8주 동안 정맥 주사를 수행하였다. 모든 실험에 있어서, 대조구 마우스 그룹(n=4)은 DPBS(pH 7.4)로 주사하였다.
실시예 7: 유전자 사일런싱 분석
siRNA 복합체에 노출 24시간 후, RNAiso 키트(Takara)를 이용하여 신경아세포종 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. diLep9R/siRNA로 정맥주사하고 24시간 후 In vivo 유전자 사일런싱을 분석하였다. 뇌 조직을 마우스로부터 얻었고, RNAiso에서 분쇄하여 제조자의 지침에 따라 추출하였다. 1 μg의 총 RNA를 iScriptTM cDNA 합성 키트(Bio-rad)를 이용하여 cDNA로 역전사하였다. 유전자-특이적 프라이머를 갖는 SYBR 전혼합(premix) Ex Taq 완전 실시간(perfect real time)(Takara)을 이용하여, 100 ng의 합성된 cDNA 상에서 실-시간 PCR(qPCR)을 수행하였다. 역전사 PCR(RT-PCR)을 위해, 제조 제안에 따라 하기의 프라이머들로 합성된 1 μg의 cDNA와 함께 TaKaRa Taq 키트(Takara)를 이용하였다. 모든 프라이머는 Cosmogenetech사로부터 합성되었고, 서열은 하기에 나타내었다.
GSAP 정방향(역 전사) : TGA TAA CGG AGT GCT GCT GCT TAC TGA
GSAP 역방향(역 전사) : CTG CAC GTC CAC TTT CAT AAG CCC AAA
GSAP 정방향(리얼-타임) : TGT CCG GCT CCC TCC GCT TAT T
GSAP 역방향(리얼-타임) : TTT TTC AGC AGC CGG GCC ACA
GAPDH 정방향(역 전사) : ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC
GAPDH 역방향(역 전사) : TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA
GAPDH 정방향(리얼-타임) : GGC AAA TTC AAC GGC ACA GT
GAPDH 역방향(리얼-타임) : GGG TCT CGC TCC TGG AAG AT
역 전사 PCR 생성물은 0.7% 아가로스겔 상에 로딩하였고, KODAK MI(Kodak)을 이용하여 UV광에 의해 가시화하였다.
실시예 8: 웨스턴 블랏
세포는 형질주입 48시간 후 RIPA 버퍼로 용해시켰고, 조직은 RIPA 버퍼(10 mg 조직에 대하여 100 μl) 내에서 균질화(homogenize) 하였다. 단백질 분해효소 저해제 혼합물(protease inhibitor cocktail)(Thermo scientific pierce)는 사용 전 RIPA 버퍼와 혼합하였다. 샘플의 단백질 농도는 BCA 분석 키트(Thermo scientific pierce)에 의해 측정하였다. 공지된 절차에 따라(Beloor, J., et al., Arginine-engrafted biodegradable polymer for the systemic delivery of therapeutic siRNA. Biomaterials, 2012. 33(5): p. 1640-50)웨스턴 블랏을 수행하였다. 단일클론 항체, 항-GSAP(Abcam), 항-아밀로이드β(Covance), 항-PS1, 항-BACE1(Millipore), β-액틴(Santa cruz), HRP 접합 항-토끼 IgG 및 항-마우스 IgG(Abcam)을 각각의 단백질을 검출하기위해 이용하였다. ECL 기질 용액(GE Healthcare)를 항체 배양된 막에 적용하였고, image station(Kodak)을 이용하여 가시화하였다. 상대적인 밴드 강도를 KODAK MI(Kodak)을 이용하여 측정하였고, β-액틴에 대해 정규화하였다.
실시예 9: 싸이오플라빈 T 분석
싸이오플라빈 T(ThT) 용액(200 nM, Sigma-aldrich)을 종래 알려진 내용[70-72]을 기초로 한 변형에 따라 새롭게 제조하였다. 20 μg의 세포 용해물 및 50 μl의 세포 배양 배지를 200 μl의 ThT 용액과 함께 배양하였고, UV/형광 리더(spectraMax M2; Molecular devices)를 이용하여 450 nm의 여기(excitation) 파장 및 490 nm의 방출(emission) 파장에서 형광을 측정하였다. 상대적인 형광강도를 무처리 샘플에 비례하여 계산하였다.
실시예 10: In vivo Image
diLep9R(100 μg)을 400 pmole의 siFITC(1:40 몰 비율)와 복합체를 형성시켰고, 그 후 마우스에 정맥 주사하였다. 접종 18시간 후, 마우스를 해부하여 뇌, 간, 폐, 지라 및 신장을 image station(Kodak)에 의한 형광 이미지를 위해 수집하였다.
실시예 11: 행동기능 검사(Behavioral tests)
종래 기술된 내용[73-75]을 기초로 수정된 프로토콜에 따라 행동기능 검사를 수행하였다. 요컨대, Y-maze를 가지고 Y-maze 시험을 수행하였고, and total entries with all of feet were counted when mice go in to different way from last entry. 검은 상단-오픈 상자(400 mm×350 mm×350 mm)를 우드락(wood lark)으로 제조하였고, 3가지 다른 목표(object)(유사 크기, 다른 모양)를 준비하여 검은 종이로 덮어씌웠다. 마우스의 움직임은 CCD 카메라를 이용하여 추적하였고, 마우스가 5 mm 내로 목표와 가까워졌을 때, 목표 주변에서의 시간 소비를 계수(counting)하였다. 계수 영역은 마우스가 접근하여 대상을 향하였을 때에만 계수하도록 설정하였다. 첫 30분간은 목표 없이 스테이지에 친숙해지도록 하였고, 30분 후, 두 번째 30분간은 목표를 구별하도록 하였다. 1시간 후, 목표 중 하나를 새로운 목표로 교환하고, 추적을 수행하였다. 어떠한 목표에 대하여도 5초 이상 머무르지 않는 마우스의 기록은 제외하였다.
실시예 12: 싸이오플라빈S 염색
종래 기술된 내용[76-79]을 기초로한 변형에 따라 싸이오플라빈S 염색을 수행하였다. 샘플들은 포르말린에서 하루 동안 고정하였고, 하루 동안 세척하였다. 탈수(dehydration) 및 파라핀 침지 후, 마이크로톰(microtome)(Leica RM2145, Wetzlar)을 이용하여 관상 절편(coronal sections)을 얻었다. 절편은 탈파라핀화하고, 80% 에탄올 내에서 준비된 0.1% 싸이오플라빈S로 염색하였다. 마운팅 배지(Vector)를 함유하는 DAPI에 의해 마운팅한 후, 형광 현미경(Nikon)을 이용하여 형광 이미지를 얻었다.
실시예 13: 통계적 분석
비-모수 만 휘트니(Mann Whitney) 테스트에 의해 데이터를 분석하였다. 시간 주기를 넘는 측정과 관련된 in vivo 및 in vitro 모두에서의 실험을 반복 측정 아노바 테스트(Anova test)에 의해 분석하였다. P<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실험결과
1. diLep9R의 특성
C-말단에 시스테인 잔기를 갖는 폴리-9-아르기닌(9R)과 컨쥬게이션된 렙틴 유래 펩타이드(Lep)인 Lep9R을 합성하였다. C-말단의 시스테인 잔기는, Lep9R 이량체(diLep9R)를 형성하기 위하여 Lep9R의 시스테인 말단의 두 프리 싸이올 그룹 사이의 이황화결합을 형성하기위해 도입하였다(참조 도 1의 A). Lep9R 이량체는 3일간의 반응 후 대략 80%의 효율로 형성되었고, 컨쥬게이션 비율(%)은 Ellman 테스트에 의해 실험재료 및 방법란에서 서술한 것과 같이 측정하였다(참조: 도 1의 B). 펩타이드의 이량체화는 결합활성(avidity) 효과에 의한 결합 친화성을 현저하게 증가시킬 수 있다. 다음으로 diLep9R이 siRNA 복합체화 및 유전자 사일런싱의 도입에서 더 유용한지 시험하였다. siRNA를 배양 후 처음으로, 일정한 총량의 Lep9R 및 diLep9R를 가지고 다양한 중량비에서 EMSA(Electrophoresis mobility shift assay)를 수행하였다. diLep9R은 용량-의존적 방법으로 siRNA에 결합하고, 20:1의 중량비(diLep9R 100 μg:siRNA 400 pmole)에서 완전히 억제시켰으나, Lep9R은 30:1의 중량비(Lep9R 100 μg:siRNA 600 pmole)에서 siRNA를 완전히 억제시켰다(참조: 도 1의 C).
diLep9R/siRNA 나노파티클의 물리적 및 화학적 특성을 동적 광 산란(dynamic light scattering, DLS)을 이용하여 측정하였다. 30:1(Lep9R:siRNA) 및 20:1(Lep18R:siRNA)의 중량비에서, 나노파티클의 사이즈가 174.9 nm, 239.3 nm로 특정되었고, 제타 포텐셜이 +54.4±4.76 mv, +38.5±5.15 mv로 각각 측정되었다(참조: 도 1의 D 및 E).
2. diLep9R에 의한 기능성 siRNA의 효과적 전달
다음으로 diLep9R이 신경아세포종, N2a 세포를 발현하는 렙틴 수용체에서 기능성 siRNA를 더 잘 전달하는지 시험하였다. 세포를 FITC 표지된 siRNA(siFITC)와 복합체를 형성한 Lep9R 또는 diLep9R로 감염시켰다. FACS 분석은 Lep9R(15%, MFI=41) 및 siFITC(3.91%, MFI=5.7), 리포펙타민 2000(32.45%, MFI=22) 또는 스크램블된-9R(1.25%, MFI=4.2)과 비교하여 diLep9R이 siFITC를 높은 효율(78.59%. MFI=221.1)로 전달한다는 것을 보여준다(참조: 도 2의 A). 더욱이 siSOD1과 복합된 diLep9R은 N2a의 80% 사일런싱을 보이지만, Lep9R/siSOD1은 60%의 사일런싱을 보인다. 리포펙타민은 대조구와 비교하여 55%의 유전자 사일런싱을 보인다. 상술한 데이터는 siRNA와 diLep9R의 더 나은 결합이 더 높은 유전자 사일런싱을 야기하는 것을 명확하게 보여준다.
다음으로 diLep9R/siFITC를 마우스에 전신적으로(systemically) 주사하였고, diLep9R 또는 스크램블9R과 결합된 siFITC의 주사 18시간 후 구획화시킨 조직으로부터 형광을 측정하였다. 놀랍게도, 유의한 형광이 diLep9R/siFITC로 주사한 마우스에서만 검출되었고(참조: 도 2의 C), 구획화된 뇌의 추가적인 분석은 강한 형광 신호가 시상하부(hypothalamus), 피질(cortex) 및 해마(hippocampus)에서 관찰됨을 밝혔다(참조: 도 2의 D). 전달된 siRNA의 기능성을 확인하기 위해, 100 μg의 diLep9R 또는 스크램블 펩타이드와 결합한 400 pmole의 siSOD1 또는 siCD4를 매일 3회씩 주사하였다. 오직 diLep9R/siSOD1 처리한 마우스만이, 후각 망울(olfactory bulb), 피질(cortex), 해마(hippocampus) 및 시상(thalamus)/시상하부(hypothalamus)에서 각각 40%, 50%, 60% 및 60%로 발현 감소를 보였다(참조: 도 2의 E). 최대 사일런싱이 해마 및 시상/시상하부로부터 관찰되었다.
종래 Liu 등은 DNA 전달을 위해 펩타이드를 사용하였다(Liu et al., Biomaterials, 31:5246(2010)). 그러나 그것이 siRNA 전달에 사용될 수 있을지는 시험되지 않았다. 렙틴-유래의 펩타이드가 기능성 siRNA를 전달하는것을 시험하기 위해, 100 μg의 diLep9R과 결합한 400 pmole의 siFITC를 정맥 주사하였다.
3. AD 마우스 모델 내의 GSAP(Camma secretase activating protein)의 과발현
다음으로 7, 9, 11, 13월령 AD 마우스 뇌로부터 GSAP(Camma secretase activating protein)의 발현을 분석하였고, 피질보다 해마 내에서 상승한 GSAP 발현을 RT-PCR에 의해 관찰하였다(참조: 도3). 피질 내의 GSAP 발현이 대조구 Balb/c 마우스에 비하여 0.5배로 유지된 것에 반해, 해마 내의 GSAP 발현은 1.2배 내지 4.2배(7-13월) 상승 조절되었다. CSAP 발현 수준은 나이가 동등한 Balb/c 마우스 대조구에 대하여 정규화하였다. 기록한 바와 같이 GSAP 발현은 AD 마우스 내에서 영향을 받지 않았다.
4. diLep9R/siGSAP에 의한 N2a 세포 내의 아밀로이드-β(Aβ) 생성 억제
Aβ 생성에서 siGSAP의 기능적 효과를 평가하기 위해, siGSAP를 diLep9R과 결합시킨 뒤, N2a 세포에 감염(transfect)시켰다. 감염 48시간 후, GSAP 발현을 RT-PCR, qPCR, Aβ의 생성과 연관된 단백질에 대한 웨스턴 블랏으로 측정하였고, 최종적으로 Aβ의 존재를 시험하기 위해 싸이오플라빈 T분석을 수행하였다(참조: 도 4). APP를 발현하는 DNA를 갖는 siGSAP를 N2a 세포 내로 공동-감염(co-transfect)시키는 경우, GSAP 발현은 웨스턴블랏, RT-PCR 및 qPCR(참조: 도 4A)에 의해서 80% 가까이 감소되었고, 상기 감소는 γ-시크리테이즈의 활성 부분인 GSAP-16K의 60% 억제, 아밀로이드 전구 단백질(amyloid precursor protein, APP) 세포 내부 도메인(intracellular domain, AICD)의 생성의 결과를 야기한다(참조: 도 4B). APP 수준의 변화가 없는 동안, AICD는 오직 diLep9R/siGSAP를 처리한 세포에서만 25% 까지 증가하였다. 이러한 결과는 siGSAP에 의한 GSAP 감소가 γ-시크리테이즈 활성을 억제하고, β-시크리테이즈 만이 활발하게 cut APP leaving transmembrain and cytoplasmic parts of APP resulting in stacking of non-cleaved AICD. 더욱이 GSAP 감소가 Aβ 생성 생성을 억제하는지 보기위하여, Aβ 검출을 위한 싸이오플라빈 T 분석을 위해 세포 용해물 및 배지를 수집하였다. 싸이오플라빈 T는 Aβ와 같은 베타 시트-풍부 구조(beta-sheet rich structure)에 결합하는 형광 화합물이다. 싸이오플라빈 T를 갖는 배양 샘플은 세포 용해물 및 배지로부터의 Aβ 분비물이 대조구와 비교하여 각각 35%, 30% 감소되었다(참조: 도 4D).
5. siGSAP의 전신성 전달은 뇌에서의 Aβ 축적을 감소시키고, AD 행동을 개선한다.
최종적으로 siGSAP의 전신성 주입이 Aβ 생성을 감소시키고, AD 마우스 행동을 개선시키는 것을 측정하였다. 마우스는 diLep9R/siGSAP를 8주 동안 주당 2회 주사하였고, 행동 테스트를 AD 마우스 내의 Aβ의 합성과 연관된 단백질 뿐만아니라 GSAP 측정에 의해 수행하였다(참조: 도 5A). siGSAP로 처리한 마우스는 대뇌 피질 및 해마 모두에서 GSAP 발현의 50%에 가까운 감소를 보였다(참조: 도 5B). 더욱이 Aβ 형성과 연관된 단백질의 분석은 AD 진행의 억제에 대한 유의한 양성 효과를 나타내었다. GSAP의 억제는 대뇌피질 및 해마 모두에서 그것의 활성 형태인 GSAP-16K를 50% 억제하는 결과를 낳는다(참조: 도 5B). 그러나, β-시크리테이즈(BACE1) 및 프레세닐린1(PS1) 전체(full-length) 발현 수준은, 상기 단백질들이 γ-시크리테이즈과 직접 연결되지 않았기 때문에 siGSAP에 의해 변경되지 않았다. 반면에 프레세닐린 1의 활성 형태인 PS1 C-말단 조각(fragment)(PS1-CTF)은 대뇌 피질 및 해마에서 각각 31% 및 47% 감소하였다. GSAP-16K 및 PS1-CTF의 감소는 APP 세포내부 도메인(AICD) 증가(대뇌피질에서 70%, 해마에서 82%)를 이끄는 γ-시크리테이즈의 형성을 억제한다. GSAP의 억제는 때로 대뇌 피질 및 해마에서의 Aβ 축적을 40% 감소시켰다(참조: 도 5D 및 5E). 더욱이 샘플 뇌로부터 얻은 파라핀-침지 뇌 구역을 Aβ에 부착되는 싸이오플라빈 S로 염색한 결과, siCD4 처리 또는 위약 처리와 비교하여 siGSAP로 처리한 마우스에서의 Aβ의 감소를 명확히 나타내었다(참조: 도 5F). Aβ 축적의 감소는 siCD4 또는 위약처리 AD 마우스와 비교하여 siGSAP 처리 마우스로부터 얻은 해마에서 70% 이하, 대뇌피질에서 30% 이하였다(참조: 도 5G). 다음으로 Aβ 축적이 해마에서 유의하게 감소하기 때문에, GSAP의 감소가 AD 마우스의 행동에 영향을 주는지 시험하였다. 예상한대로, Y자형 미로 및 대상 인식 시험 모두에서 크게 개선된 행동을 관찰하였다. Y자형 미로는 새로운 환경을 탐구하기 위한 설치류의 의욕을 측정하기 위한 행동 시험이다. siGSAP 처리 마우스는 입장(entry)에 있어서의 60% 가까운 증가 및 모양, 색 및 질감과 같은 대상의 물리적 특성을 지각하는 능력, 그것의 용도를 이해하는 것, 물체와의 이전의 경험 및 다른 것들과 어떻게 연관되는지(Zhang, R., et al., Novel Object Recognition as a Facile Behavior Test for Evaluating Drug Effects in AβPP/PS1 Alzheimer's Disease Mouse Model. Journal of Alzheimer's Disease, 2012. 31(4): p. 801-812)를 포함하는 대상 인식에 있어서의 80%에 가까운 증가를 보였다(참조: 도 5H). 본 데이터는 AD 마우스의 siGSAP 전신성 처리가 뇌에서의 Aβ 축적 및 γ-시크리테이즈의 감소에 의해 AD를 개선시키는 것을 명백하게 나타낸다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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<120> Brain Specific Nuecleic Acid delivery
<130> PN140099
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 146
<212> PRT
<213> Leptin of human
<400> 1
Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr
1 5 10 15
Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ala
20 25 30
Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile
35 40 45
Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln Val
50 55 60
Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln Ile Ala Asn Asp Leu
65 70 75 80
Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys
85 90 95
Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu Ser Leu Asp Gly
100 105 110
Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg
115 120 125
Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln Leu Asp Val Ser Pro
130 135 140
Glu Cys
145
Claims (19)
- 하기 일반식 1로 표시되는 컨쥬게이트의 이량체(dimer)를 포함하는 핵산분자의 뇌 운반용 조성물:
[일반식 1]
Lep-CP 또는 CP-Lep
상기 일반식에서,
Lep은 렙틴 또는 서열목록 제 1 서열로 표시되는 렙틴의 1-33, 12-32, 15-32 또는 61-90 아미노산 서열을 포함하는 렙틴-유래 뇌 타겟팅 펩타이드이고,
CP는 아르기닌, 히스티딘 및 리신으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 양이온성 펩타이드(cationic peptide)로 구성된 폴리펩타이드임.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 렙틴-유래 뇌 타겟팅 펩타이드는 서열목록 제 1 서열로 표시되는 렙틴의 61-90 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 양이온성 펩타이드는 아르기닌인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 8-18 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 8-12 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 컨쥬게이트의 Lep와 CP 간의 결합은 펩타이드 링커를 통하여 형성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 컨쥬게이트는 컨쥬게이트 이량체의 형성을 위한 상호 결합부위를 포함하며, 상기 상호 결합부위는 이황화결합, 이민결합, 에스테르 결합 또는 아미드 결합을 위한 것인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 10 항에 있어서, 상기 상호 결합부위는 복수개의 상기 컨쥬게이트 단량체 간의 이황화결합 형성을 위한, 하나 이상의 시스테인인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 핵산은 siRNA, 안티센스 핵산, 또는 핵산 앱타머인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 13 항에 있어서, 상기 핵산은 5 내지 200개의 염기쌍으로 구성된 siRNA, 안티센스 핵산 또는 핵산 앱타머인 것을 특징으로 하는 조성물.
- (a) 제1항, 제3항, 제5항 내지 제8항, 제10항, 제11항, 제13항 및 제14항 중 어느 한 항에 따른 조성물; 및
(b) γ-시크리테이즈 활성 단백질(GSAP) 발현을 억제하는 siRNA를 포함하는 알츠하이머 질환에 대한 예방 또는 치료용 조성물.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
핵산분자의 뇌 운반은 전신성 투여를 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 17 항에 있어서,
상기 전신성 투여는 정맥(intravenous) 투여인 것을 특징으로 하는 조성물.
- (a) Lep 및 CP 간의 직접 공유 결합 또는 펩타이드 링커를 통한 공유결합을 통해, 일반식 1의 컨쥬게이트 단량체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 제조한 컨쥬게이트 단량체 간의 결합을 통해, 컨쥬게이트 이량체를 포함하는 핵산분자의 뇌 운반용 조성물을 제조하는 단계를 포함하고,
상기 컨쥬게이트는 컨쥬게이트 이량체의 형성을 위한 상호 결합부위를 포함하며, 상기 상호 결합부위는 이황화결합, 이민결합, 에스테르 결합 또는 아미드 결합을 위한 것인, 핵산분자의 뇌 운반용 조성물의 제조방법:
[일반식 1]
Lep-CP 또는 CP-Lep
상기 일반식에서,
Lep은 렙틴 또는 서열목록 제 1 서열로 표시되는 렙틴의 1-33, 12-32, 15-32 또는 61-90 아미노산 서열을 포함하는 렙틴-유래 뇌 타겟팅 펩타이드이고,
CP는 아르기닌, 히스티딘 및 리신으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 양이온성 펩타이드(cationic peptide)로 구성된 폴리펩타이드임.
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|---|---|---|---|
| KR1020140080144A KR102234112B1 (ko) | 2014-06-27 | 2014-06-27 | 뇌 특이적 핵산 전달 |
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| KR1020140080144A KR102234112B1 (ko) | 2014-06-27 | 2014-06-27 | 뇌 특이적 핵산 전달 |
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|---|---|
| KR20160001917A KR20160001917A (ko) | 2016-01-07 |
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ID=55168658
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| KR1020140080144A KR102234112B1 (ko) | 2014-06-27 | 2014-06-27 | 뇌 특이적 핵산 전달 |
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| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102234112B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023068850A1 (ko) * | 2021-10-22 | 2023-04-27 | 한양대학교 산학협력단 | 세포사멸 억제 단백질을 포함하는 허혈성 뇌졸중 예방 또는 치료용 조성물 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040043932A1 (en) | 1998-08-21 | 2004-03-04 | Patricia Grasso | Leptin-related peptides |
| US20130149309A1 (en) | 2009-08-05 | 2013-06-13 | Paul Greengard | Novel regulatory proteins and inhibitors |
-
2014
- 2014-06-27 KR KR1020140080144A patent/KR102234112B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040043932A1 (en) | 1998-08-21 | 2004-03-04 | Patricia Grasso | Leptin-related peptides |
| US20130149309A1 (en) | 2009-08-05 | 2013-06-13 | Paul Greengard | Novel regulatory proteins and inhibitors |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Biomaterials, 31(19). p.5246-5257, 2010. |
| Nanomedicine, 7(3), p.365-382, 2012. |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023068850A1 (ko) * | 2021-10-22 | 2023-04-27 | 한양대학교 산학협력단 | 세포사멸 억제 단백질을 포함하는 허혈성 뇌졸중 예방 또는 치료용 조성물 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20160001917A (ko) | 2016-01-07 |
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