CN113621686A - 一种适用于多种病原微生物的检测方法 - Google Patents

一种适用于多种病原微生物的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种适用于多种病原微生物的检测方法。所述检测方法包括以下操作：S1:将待测样的DNA作为模板，利用DNA聚合酶以及目标DNA的带有Tag标签的正向引物、带有生物素序列的反向引物进行PCR扩增，制备得到TSPE；S2:将TSPE与链霉菌素亲和素修饰的磁珠混合，经摇晃、洗涤、磁分离后，获得磁珠复合物；S3:将900‑1200nM通用sgRNA、700‑1900nM的FQ探针、1500‑3000nM的Cas14a置于裂解缓冲液中，放置后得到混合液；将磁珠复合物添加至混合液中引发反应，通过荧光板读数器检测荧光信号。本发明具有灵敏度高的优点。

Description

一种适用于多种病原微生物的检测方法
技术领域
本发明涉及医药检测技术的技术领域，尤其涉及一种适用于多种病原微生物的检测方法。
背景技术
许多威胁生命的传染病通常具有相似的体征与症状，为了进一步确定如何用药，需要明确患者感染的细菌或病毒的具体种类。现今，核酸检测系统可用于鉴定细菌或病毒的种类，且具有高度灵敏、诊断速度快的优点。
在病毒和细菌检测领域中，常用的核酸检测系统主要依赖CRISPR-Cas系统。CRISPR-Cas系统(聚簇成规则间隔的短回文重复序列和相关蛋白)是细菌中的一种适应性免疫系统，可整合入侵的外源DNA；当病原体再次入侵时，转录形成crRNA，crRNA与Cas酶形成核糖核蛋白复合物，该复合物与外源DNA上的特定核酸序列(靶核酸序列)配对并切割，使病原体灭活。结合CRISPR-Cas系统的上述性质，再辅以通用荧光核酸传感平台，即可用于病原微生物的检测。
目前，基于CRISPR-Cas系统的核酸检测系统主要包括基于CRISPR-Cas9的核酸检测系统和基于CRISPR-Cas13a/Cas12a的核酸检测系统。这两种检测系统均已应用于临床的核酸检测、区分致病菌种；但是，使用时需要至少满足两点：(1)需要靶核酸序列中的Protospacer相邻基序(PAM)；(2)使用多重sgRNA进行多目标检测时，需要各待测病原体基因组片段中的特定目标和根据不同病原体的特定片段制备的多种sgRNA。这些限制条件都凸显了对不使用PAM、通用sgRNA的新型Cas传感策略的需求。
Harrington等人在古细菌中发现了一种新的CRISPR-Cas酶(Cas14a)。Cas14a是由RNA引导的核酸内切酶，能够靶向ssDNA裂解，不需要PAM即可通过靶ssDNA引发非特异性ssDNA报告基因的侧切。受Cas14a的这一特性的启发，技术人员认为Cas14a是开发病原微生物检测方法的绝佳候选工具。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的之一在于提供一种灵敏度高、可适用于多种病原微生物检测的检测方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种适用于多种病原微生物的检测方法，其特征在于，包括以下操作：S1:将待测样的DNA作为模板，利用DNA聚合酶以及目标DNA的带有Tag标签的正向引物、带有生物素序列的反向引物进行PCR扩增，制备得到TSPE；S2:将TSPE与链霉菌素亲和素修饰的磁珠混合，经摇晃、洗涤、磁分离后，获得磁珠复合物；S3:将900-1200nM通用sgRNA、700-1900nM的FQ探针、1500-3000nM的Cas14a置于裂解缓冲液中，放置后得到混合液；将磁珠复合物添加至混合液中引发反应，通过荧光板读数器检测荧光信号。
进一步的，所述裂解缓冲液内包括：NaCl、Tris-HCl、CoCl2、DTT和MgCl2。
进一步的，所述裂解缓冲液的pH为9-11。
进一步的，所述裂解缓冲液内Mg2+的浓度为14-20mM。
进一步的，通用sgRNA、FQ探针、Cas14a置于裂解缓冲液后，恒温下放置15-25min。
进一步的，S2中可将两种或多种待测样的TSPE与磁珠混合，将制得的磁珠复合物添加至混合液中，进行荧光测试。
进一步的，所述检测方法还包括：Cas14a的表达和纯化、通用sgRNA的制备。
本发明的有益效果为：
(1)本发明检测方法通过调节添加于裂解缓冲液中通用sgRNA、FQ探针、Cas14a的含量，以及对裂解缓冲液pH及成分的限定，使体系对病原微生物的灵敏度提高；
(2)本发明检测方法能够对多个待测样进行粗检，具有应用价值。
附图说明
图1是本发明实施例2-4以及对比例1的荧光检测结果；
图2是本发明实施例5、6以及对比例2的荧光检测结果。
具体实施方式
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
实施例1
(1)Cas14a的表达和纯化
S1.准备克隆载体(pLBH531-MBP-Cas14a1)，购自Jennifer Doudna Lab质粒。使用带有10xHis-MBP-Cas14a1的表达载体转化大肠杆菌transtta(DE3)，然后在无菌的LB培养基(10g/L胰蛋白、5g/L酵母提取液和10g/LNaCl溶液)中37℃恒温培养，过程中持续摇动，直至OD600＝0.6。
S2.向上述培养基中添加异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，直至终浓度为1mM，并在18℃恒温摇动培养基12h，离心，收集细菌细胞，将收集的细菌细胞重悬于裂解缓冲液(50mMTris-HCl，20mM咪唑，1mMDTT，500mMNaCl，0.2mMPMSF，pH＝7.5)中。
S3.使用超声细胞破碎系统，将上述裂解缓冲液中的细菌细胞于冰中破碎，然后在4℃下离心30分钟，分离碎片，并用0.22um的过滤器过滤上清液，最后在冰浴中通过Bio-ScaleTM Mini NuviaTM IMAC(Bio-Rad Laborataries，Inc)进行纯化。
S4.将上述操作中得到的含有蛋白质的流分与TEV蛋白酶在4℃中孵育过夜，分别除去MBP和His-tag。
S5.将上述操作中得到的蛋白质交换至平衡溶液(2MNaCl，20mM Tris-HCl，5mMβ巯基乙醇)中，并加载至HiTrapTM Heparion HP(GE Healthcare)上；将蛋白质从平衡溶液洗脱到洗脱液(20mM HEPES，pH7.5，0.5mM TCEP，1.250M NaCl)中，得到Cas14a，冰浴储存备用。
(2)通用sgRNA的制备
从含有T7启动子、与如表1所示序列匹配的核苷酸靶序列(SEQ ID NO.1)和sgRNA抗性的pUC19载体中PCR扩增通用sgRNA的模板。使用扩增的PCR产物作为DNA模板，通过T7快速高产RNA合成试剂盒在37℃下体外转录通过sgRNA 16小时，然后使用RNA纯化试剂盒(NEB)纯化，得到通用sgRNA，-70℃下储存备用。
表1通用sgRNA的序列
Figure BDA0003207087510000041
(3)TSPE的制备
S1.大肠杆菌的培养与cDNA的制备：大肠杆菌，购自中国工业文化收藏中心(CICC)，按照生产商的指导进行培养。即用LB培养基(10g/L胰蛋白、5g/L酵母提取液和10g/L氯化钠)接种大肠杆菌，37℃恒温，180rpm过夜培养，待其生长至108CFU/mL后，将细菌以10000rpm离心10分钟，并使用细菌RNA试剂盒(
Figure BDA0003207087510000042
细菌RNA试剂盒，OMEGA)提取细菌RNA。
将上述提取得到的细菌RNA，使用PrimeScript II第一链cDNA合成试剂盒(Takara)在42℃的热循环条件下60分钟，然后在70℃的热循环条件下5分钟，最终，获得大肠杆菌的cDNA。
S2.大肠杆菌TSPE的制备:通过MegAlign软件(DNASTAR)选择大肠杆菌的目标区域(SEQ ID NO.2)。引物是由Premier软件根据目标区域设计的，其中正向引物(SEQ ID NO.3)结合了Tag标签，反向引物(SEQ ID NO.4)结合了生物素标签，序列如表2所示。
将200nM具有大肠杆菌特异性的正反向引物(其中正向引物带有Tag序列，反向引物带有生物素序列)以及大肠杆菌的cDNA分别作为模板，添加DreamTaqTM热启动DNA聚合酶(Thermo)，采用传统的PCR技术，进行PCR扩增，分别制备得到TSPE。
PCR体系为：DreamTaqTM热启动DNA聚合酶1μL，10X buffer 5μL，10mM dNTPs 1μL，上下游引物(正反向引物)各1μL，DNA模板1μL，用ddH2O补足至50μL体系。
操作步骤如下：初始变性在94℃5分钟，然后在94℃30s，55℃30s和72℃30s，并对大肠杆菌DNA进行32个循环；最后，获得TSPE。
表2.大肠杆菌匹配的扩增序列及引物序列
Figure BDA0003207087510000051
(4)磁珠复合物的制备
将20μL的TSPE与20μL链霉菌素亲和素修饰的磁珠(MBs，4mg/ml，NewEnglandsBiolabs)混合，室温下摇晃1小时；然后，用PBS洗涤五次后，通过磁分离获得磁珠复合物。
(5)检测
将700-1900nM的FQ探针、1500-3000nM的Cas14a与900-1200nM通用sgRNA置于1x裂解缓冲液(25mM NaCl，20mM Tris-HCl，5mMCoCl2，1mM DTT和14mM MgCl2，pH＝9.0)中，37℃下放置25分钟，制得混合液；
将磁珠复合物添加至混合液中引发反应(15μl，384孔微孔板规格)，通过荧光板读数器(BioTek H1微孔板读数器)检测荧光强度即可。
实施例2
实施例2与实施例1的制备过程相同，其检测过程具体如下：
将1600nM的FQ探针、2000nM的Cas14a与1000nM通用sgRNA置于1x裂解缓冲液(25mMNaCl，20mM Tris-HCl，5mMCoCl2，1mM DTT和14mM MgCl2，pH＝9.0)中，37℃下放置25分钟，制得混合液；
将磁珠复合物添加至混合液中引发反应(15μl，384孔微孔板规格)，通过荧光板读数器(BioTek H1微孔板读数器)在37℃下监控荧光信号60分钟，整理最高荧光值于图1中。
实施例3
实施例3与实施例2的制备过程相同，区别在于裂解缓冲液中Mg2+的含量不同，检测操作具体如下：
将1600nM的FQ探针、2000nM的Cas14a与1000nM通用sgRNA置于1x裂解缓冲液(25mMNaCl，20mM Tris-HCl，5mMCoCl2，1mM DTT和16mM MgCl2，pH＝9.0)中，37℃下放置25分钟，制得混合液；
将磁珠复合物添加至混合液中引发反应(15μl，384孔微孔板规格)，通过荧光板读数器(BioTek H1微孔板读数器)在37℃下监控荧光信号60分钟，整理最高荧光值于图1中。
实施例4
实施例4与实施例2的制备过程相同，区别在于裂解缓冲液中Mg2+的含量不同，检测操作具体如下：
将1600nM的FQ探针、2000nM的Cas14a与1000nM通用sgRNA置于1x裂解缓冲液(25mMNaCl，20mM Tris-HCl，5mMCoCl2，1mM DTT和20mM MgCl2，pH＝9.0)中，37℃下放置25分钟，制得混合液；
将磁珠复合物添加至混合液中引发反应(15μl，384孔微孔板规格)，通过荧光板读数器(BioTek H1微孔板读数器)在37℃下监控荧光信号60分钟，整理最高荧光值于图1中。
实施例5
实施例5与实施例3的制备过程相同，区别在于裂解缓冲液的pH值不同，检测操作具体如下：
将1600nM的FQ探针、2000nM的Cas14a与1000nM通用sgRNA置于1x裂解缓冲液(25mMNaCl，20mM Tris-HCl，5mMCoCl2，1mM DTT和16mM MgCl2，pH＝10.0)中，37℃下放置20分钟，制得混合液；
将磁珠复合物添加至混合液中引发反应(15μl，384孔微孔板规格)，通过荧光板读数器(BioTek H1微孔板读数器)在37℃下监控荧光信号60分钟，整理最高荧光值于图2中。
实施例6
实施例6与实施例3的制备过程相同，区别在于裂解缓冲液的pH值不同，检测操作具体如下：
将1600nM的FQ探针、2000nM的Cas14a与1000nM通用sgRNA置于1x裂解缓冲液(25mMNaCl，20mM Tris-HCl，5mMCoCl2，1mM DTT和16mM MgCl2，pH＝11.0)中，37℃下放置15分钟，制得混合液；
将磁珠复合物添加至混合液中引发反应(15μl，384孔微孔板规格)，通过荧光板读数器(BioTek H1微孔板读数器)在37℃下监控荧光信号60分钟，整理最高荧光值于图2中。
对比例1
对比例1与实施例2的区别在于裂解缓冲液中Mg2+的含量不同，检测操作具体如下：
将1600nM的FQ探针、2000nM的Cas14a与1000nM通用sgRNA置于1x裂解缓冲液(25mMNaCl，20mM Tris-HCl，5mMCoCl2，1mM DTT和12mM MgCl2，pH＝9.0)中，37℃下放置25分钟，制得混合液；
将磁珠复合物添加至混合液中引发反应(15μl，384孔微孔板规格)，通过荧光板读数器(BioTek H1微孔板读数器)在37℃下监控荧光信号60分钟，整理最高荧光值于图1中。
对比例2
对比例2与实施例3的区别在于裂解缓冲液的pH值不同，检测具体如下：
将1600nM的FQ探针、2000nM的Cas14a与1000nM通用sgRNA置于1x裂解缓冲液(25mMNaCl，20mM Tris-HCl，5mMCoCl2，1mM DTT和16mM MgCl2，pH＝8.0)中，37℃下放置30分钟，制得混合液；
将磁珠复合物添加至混合液中引发反应(15μl，384孔微孔板规格)，通过荧光板读数器(BioTek H1微孔板读数器)在37℃下监控荧光信号60分钟，整理最高荧光值于图2中。
综上，本发明检测方法通过将1500-3000nM的Cas14a、900-1200nM通用sgRNA和700-1900nM的FQ探针添加于裂解缓冲液中复合，然后，向混合液中添加待测样制得的磁珠复合物来引发反应，并通过荧光板读数器监测荧光信号，完成检测。
结合图1和图2可知，裂解缓冲液的pH值及Mg2+的含量会对检测的灵敏度造成影响，通过将控制裂解缓冲液的pH值为9-11、Mg2+的含量为14-20mM，可进一步保证本发明检测方法的灵敏度。
另外，除上述实施例中的大肠杆菌外，本发明还可用于伤寒杆菌、铜绿假单胞菌、酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、SARS-CoV-2等病原微生物的检测。在检测时，可将两种或多种待测样的TSPE与磁珠混合，将制得的磁珠复合物添加至混合液中，进行荧光测试。
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (7)

1.一种适用于多种病原微生物的检测方法，其特征在于，包括以下操作：
S1:将待测样的DNA作为模板，利用DNA聚合酶以及目标DNA的带有Tag标签的正向引物、带有生物素序列的反向引物进行PCR扩增，制备得到TSPE；
S2:将TSPE与链霉菌素亲和素修饰的磁珠混合，经摇晃、洗涤、磁分离后，获得磁珠复合物；
S3:将900-1200nM通用sgRNA、700-1900nM的FQ探针、1500-3000nM的Cas14a置于裂解缓冲液中，放置后得到混合液；将磁珠复合物添加至混合液中引发反应，通过荧光板读数器检测荧光信号。
2.根据权利要求1所述的适用于多种病原微生物的检测方法，其特征在于，所述裂解缓冲液内包括：NaCl、Tris-HCl、CoCl2、DTT和MgCl2。
3.根据权利要求2所述的适用于多种病原微生物的检测方法，其特征在于，所述裂解缓冲液的pH为9-11。
4.根据权利要求2所述的适用于多种病原微生物的检测方法，其特征在于，所述裂解缓冲液内Mg2+的含量为14-20mM。
5.根据权利要求2所述的适用于多种病原微生物的检测方法，其特征在于，通用sgRNA、FQ探针、Cas14a置于裂解缓冲液后，恒温下放置15-25min。
6.根据权利要求1所述的适用于多种病原微生物的检测方法，其特征在于，S2中可将两种或多种待测样的TSPE与磁珠混合，将制得的磁珠复合物添加至混合液中，进行荧光测试。
7.根据权利要求1所述的适用于多种病原微生物的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括：Cas14a的表达和纯化、通用sgRNA的制备。
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