JP2022540153A - 新規ｃｒｉｓｐｒ ｄｎａターゲティング酵素及びシステム - Google Patents

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Abstract

本開示は、標的化した形で核酸を操作するための新規システム、方法、及び組成物について記載する。本開示は、核酸を標的化して修飾するための、天然に存在しないエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲシステム、成分、及び方法について記載する。各システムが、一体となって核酸を標的化する１つ以上のタンパク質成分と１つ以上の核酸成分とを含む。

Description

関連出願
本願は、２０１９年７月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／８７３，１０８号、２０１９年７月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／８７３，１１８号、２０１９年９月３日に出願された米国仮特許出願第６２／８９５，４０６号、及び２０１９年９月３日に出願された米国仮特許出願第６２／８９５，４２２号の優先権の利益を主張し、これらの各々の全内容は、本明細書によって参照により援用される。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、全体として参照により本明細書で援用される配列表を含む。２０２０年７月１０日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、Ａ２１８６－７０２２ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔというファイル名で、サイズは２４６，７３９バイトである。
本開示は、新規のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ：ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子を使用する遺伝子発現のゲノム編集及び調節のためのシステム及び方法に関する。
近年、ゲノムシーケンシング技術及び解析の進歩により、原核生物の生合成経路からヒト病理に及ぶまでの多種多様な自然領域における生物学的活性の遺伝的基礎に関して重要な洞察が得られている。得られた大量の情報を完全に理解し、評価するためには、対応したゲノム及びエピゲノム操作のシーケンス技術の規模、有効性、及び容易さの向上が必要となる。このような新規技術は、バイオテクノロジー、農業、及びヒト治療薬を含めた数多くの領域における新規適用の開発を加速させることになる。
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子は、まとめてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとして知られ、外来の遺伝的エレメントから特定の種を防御する古細菌及び細菌の適応免疫系である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは極めて多様な一群のタンパク質エフェクター、非コードエレメント、並びに遺伝子座構成を含み、その幾つかの例がエンジニアリングされ、適合されることにより、重要なバイオテクノロジーの進歩が生み出されている。
宿主防御に関与するこのシステムの成分には、核酸を修飾する能力を有する１つ以上のエフェクタータンパク質と、エフェクタータンパク質をファージ核酸上の特異的配列に標的化することを担うＲＮＡガイドエレメントとが含まれる。ＲＮＡガイドはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）で構成され、１つ又は複数のエフェクタータンパク質による標的核酸の操作を実現するために追加的なトランス活性化型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要とすることもある。ｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡへのタンパク質結合を担うダイレクトリピートと、所望の核酸標的配列に相補的なスペーサー配列とからなる。ＣＲＩＳＰＲシステムは、ｃｒＲＮＡのスペーサー配列を修飾することにより、別のＤＮＡ又はＲＮＡ標的を標的化するよう再プログラム化し得る。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、大きく２つのクラスに分けることができる：クラス１システムは、一緒になってｃｒＲＮＡの周りに複合体を形成する複数のエフェクタータンパク質で構成され、クラス２システムは、ＲＮＡガイドと複合体化して核酸基質を標的化する単一のエフェクタータンパク質からなる。クラス２システムのシングルサブユニットのエフェクター組成は、エンジニアリング及び適用移行に一層簡便な成分セットを提供し、従ってこれまでプログラム可能なエフェクターの重要な供給源となっている。それにも関わらず、核酸及びポリヌクレオチド（即ち、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は任意のハイブリッド、誘導体、又は修飾体）を修飾するための、その独自の特性によって新規適用を実現する、より小さなエフェクター及び／又はユニークなＰＡＭ配列要件を有するエフェクターなどの現在のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを越える更なるプログラム可能なエフェクター及びシステムが依然として必要とされている。
この開示は、最初にゲノムデータベースから計算により同定され、その後、エンジニアリングされ、実験的に検証された、新規の単一エフェクタークラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのための非天然のエンジニアリングされたシステム及び組成物を提供する。特に、これらのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの成分の同定により、非天然環境、例えば、システムが最初に発見されたもの以外の細菌、又は哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）などの真核細胞における使用が可能になる。これらの新規エフェクターは、既存のクラス２ ＣＲＩＳＰＲエフェクターのオルソログ及びホモログと比較して配列及び機能が異なる。
一態様において、本開示は、配列番号１～２９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含むＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質；及びダイレクトリピート配列と標的核酸へのハイブリダイゼーション能を有するスペーサー配列とを含むＲＮＡガイドを含む、ＣＬＵＳＴ．２００９１６のエンジニアリングされた天然に存在しないクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓシステムを提供し、ここで、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ＲＮＡガイドに結合し、スペーサー配列に相補的な標的核酸配列を修飾することができる。一態様において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が配列番号１～２９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又はＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸；及びダイレクトリピート配列と標的核酸へのハイブリダイゼーション能を有するスペーサー配列とを含むＲＮＡガイド、又はＲＮＡガイドをコードする核酸を含む、ＣＬＵＳＴ．２００９１６のエンジニアリングされた天然に存在しないクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓシステムを提供し、ここで、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ＲＮＡガイドに結合し、スペーサー配列に相補的な標的核酸配列を修飾することができる。
本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、又は３つ）のＲｕｖＣドメイン又は少なくとも１つの分割されたＲｕｖＣドメインを含む。
本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号３０～４５、７７～９４、又は１２２～１３８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号３０、１２２、７７、又は７８のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号３１又は１２３のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号３１、１２３、７９、又は８０のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号３２又は１２４のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号３２又は１２４のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号３３又は１２５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号３４又は１２６のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号３５又は１２７のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号３５又は１２７のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号３６又は１２８のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号３６又は１２８のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号３７又は１２９のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号３８又は１３０のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号３８又は１３０のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号３８又は１３０のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号３９又は１３１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号３１又は１２３のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号４０又は１３２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号４１又は１３３のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号４１又は１３３のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号３９又は１３１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号３９、１３１、８１、又は８２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号４２、１３４、８３、又は８４のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号４３、１３５、８５、又は８６のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号４３、１３５、８７、又は８８のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号４４、１３６、８９、又は９０のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号４５又は１３７のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号４６、１３８、９１、又は９２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号４５、１３７、９３、又は９４のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。
本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号１（ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ３３０００１３２３２）、配列番号２６（ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７０）、配列番号２８（ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７５）、配列番号２９（ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７７）、又は配列番号２５（ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５６９）に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の同一性を有するタンパク質である。
本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の認識能を有し、ここで、ＰＡＭ配列は核酸配列を含み、これは５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＹＹＮ－３’、５’－ＨＨＮ－３’、５’－ＹＫＮ－３’、又は５’－ＨＢＮ－３’として記載される核酸配列を含み、Ｎは任意のヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣ）であり、ＹはＣ又はＴであり、ＫはＧ又はＴであり、ＢはＧ、Ｔ、又はＣであり、ＨはＡ、Ｃ、又はＴである。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ＰＡＭ配列は、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＹＹＮ－３’、又は５’－ＨＨＮ－３’として記載される核酸配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ＰＡＭ配列は、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＹＹＮ－３’、又は５’－ＨＨＮ－３’として記載される核酸配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ＰＡＭ配列は、５’－ＴＴＮ－３’又は５’－ＹＫＮ－３’として記載される核酸配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ＰＡＭ配列は、５’－ＴＴＮ－３’として記載される核酸配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ＰＡＭ配列は、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＹＹＮ－３’、又は５’－ＨＢＮ－３’として記載される核酸配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ＰＡＭ配列は、５’－ＴＴＮ－３’又は５’－ＹＫＮ－３’として記載される核酸配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み、ＰＡＭ配列は、５’－ＴＴＮ－３’又は５’－ＨＨＮ－３’として記載される核酸配列を含む。
本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＲＮＡガイドのスペーサー配列は約１４ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドを含む。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＲＮＡガイドのスペーサー配列は２０～３５ヌクレオチドを含む。
本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は触媒残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を含む。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、標的核酸を切断する。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ペプチドタグ、蛍光タンパク質、塩基編集ドメイン、ＤＮＡメチル化ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、局在化因子、転写修飾因子、光ゲート制御因子、化学誘導性因子、又はクロマチン可視化因子を更に含む。
本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸は、細胞（例えば、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞）での発現にコドン最適化される。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結されている。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸は、ベクター内にある。一部の実施形態において、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、又は単純ヘルペスベクターを含む。
本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、標的核酸はＤＮＡ分子である。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、標的核酸はＰＡＭ配列を含む。
本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、非特異的ヌクレアーゼ活性を有する。
本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びＲＮＡガイドによる標的核酸の認識により、標的核酸の修飾が生じる。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、標的核酸の修飾は、二本鎖切断イベントである。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、標的核酸の修飾は、一本鎖切断イベントである。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、標的核酸の修飾により、挿入イベントが生じる。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、標的核酸の修飾により、欠失イベントが生じる。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、標的核酸の修飾により、細胞毒性又は細胞死が生じる。
本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、システムはドナー鋳型核酸を更に含む。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸はＤＮＡ分子である。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸はＲＮＡ分子である。
本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、システムはｔｒａｃｒＲＮＡを含まない。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、システムは任意選択でｔｒａｃｒＲＮＡを含む。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は自己プロセシングである。
本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、システムは、ナノ粒子、リポソーム、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃を含む送達組成物中に存在する。
本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、システムは細胞内にある。一部の実施形態において、細胞は真核細胞である。一部の実施形態において、細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態において、細胞はヒト細胞である。一部の実施形態において、細胞は原核細胞である。
別の態様において、本開示は、遺伝子修飾された細胞を提供し、ここで、細胞は、配列番号１～２９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含むＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質；及びダイレクトリピート配列と標的核酸へのハイブリダイゼーション能を有するスペーサー配列とを含むＲＮＡガイドを含む。別の態様において、本開示は、遺伝子修飾された細胞を提供し、ここで、細胞は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が配列番号１～２９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又はＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸；及びダイレクトリピート配列と標的核酸へのハイブリダイゼーション能を有するスペーサー配列とを含むＲＮＡガイド、又はＲＮＡガイドをコードする核酸を含む。
本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、又は３つ）のＲｕｖＣドメイン又は少なくとも１つの分割されたＲｕｖＣドメインを含む。
本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、又は配列番号２９に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の同一性を有するタンパク質である。
本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＹＹＮ－３’、５’－ＨＨＮ－３’、５’－ＹＫＮ－３’、又は５’－ＨＢＮ－３’として記載される核酸配列を含むＰＡＭ配列の認識能を有し、ここで、Ｎは任意のヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣ）であり、ＹはＣ又はＴであり、ＫはＧ又はＴであり、ＢはＧ、Ｔ、又はＣであり、ＨはＡ、Ｃ、又はＴである。
本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号３０～４５、７７～９４、又は１２２～１３８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。
本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、スペーサー配列は約１４ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドを含む。本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、スペーサー配列は２０～３５ヌクレオチドを含む。
本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は触媒残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を含む。本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、標的核酸を切断する。本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ペプチドタグ、蛍光タンパク質、塩基編集ドメイン、ＤＮＡメチル化ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、局在化因子、転写修飾因子、光ゲート制御因子、化学誘導性因子、又はクロマチン可視化因子を更に含む。
本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸は、細胞（例えば、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞）での発現にコドン最適化される。本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結されている。本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸は、ベクター内にある。一部の実施形態において、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、又は単純ヘルペスベクターを含む。
本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、細胞はｔｒａｃｒＲＮＡを含まない。本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、細胞は任意選択でｔｒａｃｒＲＮＡを含む。本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は自己プロセシングである。
本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、細胞は真核細胞である。本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、細胞は哺乳動物細胞である。本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、細胞はヒト細胞である。本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、細胞は原核細胞である。
本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、標的核酸はＤＮＡ分子である。本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、標的核酸はＰＡＭ配列を含む。
本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、非特異的ヌクレアーゼ活性を有する。
本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びＲＮＡガイドによる標的核酸の認識により、標的核酸の修飾が生じる。本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、標的核酸の修飾は、二本鎖切断イベントである。本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、標的核酸の修飾は、一本鎖切断イベントである。本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、標的核酸の修飾により、挿入イベントが生じる。本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、標的核酸の修飾により、欠失イベントが生じる。本明細書に記載される細胞のいずれかの一部の実施形態において、標的核酸の修飾により、細胞毒性又は細胞死が生じる。
別の態様において、本開示は、（ａ）システムを提供すること；及び（ｂ）システムを細胞に送達することを含む、本明細書に記載されるシステムを細胞内の標的核酸に結合する方法を提供し、ここで、細胞は標的核酸を含み、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質はＲＮＡガイドに結合し、スペーサー配列は標的核酸に結合する。一部の実施形態において、細胞は真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞である。
別の態様において、本開示は、標的核酸を修飾する方法であって、配列番号１～２９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含むＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質；及びダイレクトリピート配列と標的核酸へのハイブリダイゼーション能を有するスペーサー配列とを含むＲＮＡガイドを含む、エンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを、標的核酸に送達することを含む方法を提供し、ここで、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質はＲＮＡガイドへの結合能を有し、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びＲＮＡガイドによる標的核酸の認識により、標的核酸の修飾が生じる。別の態様において、本開示は、標的核酸を修飾する方法であって、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が配列番号１～２９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又はＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸；及びダイレクトリピート配列と標的核酸へのハイブリダイゼーション能を有するスペーサー配列とを含むＲＮＡガイド、又はＲＮＡガイドをコードする核酸を含む、エンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを、標的核酸に送達することを含む方法を提供し、ここで、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質はＲＮＡガイドへの結合能を有し、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びＲＮＡガイドによる標的核酸の認識により、標的核酸の修飾が生じる。
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、又は配列番号２９に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の同一性を有するタンパク質である。
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＹＹＮ－３’、５’－ＨＨＮ－３’、５’－ＹＫＮ－３’、又は５’－ＨＢＮ－３’として記載される核酸配列を含むＰＡＭ配列の認識能を有し、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ＹはＣ又はＴであり、ＫはＧ又はＴであり、ＢはＧ、Ｔ、又はＣであり、ＨはＡ、Ｃ、又はＴである。
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号３０～４５、７７～９４、又は１２２～１３８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態において、スペーサー配列は約１４ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドを含む。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態において、スペーサー配列は２０～３５ヌクレオチドを含む。
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は触媒残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を含む。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、標的核酸を切断する。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ペプチドタグ、蛍光タンパク質、塩基編集ドメイン、ＤＮＡメチル化ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、局在化因子、転写修飾因子、光ゲート制御因子、化学誘導性因子、又はクロマチン可視化因子を更に含む。
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸は、細胞（例えば、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞）での発現にコドン最適化される。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結されている。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸は、ベクター内にある。一部の実施形態において、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、又は単純ヘルペスベクターを含む。
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態において、細胞はｔｒａｃｒＲＮＡを含まない。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態において、細胞は任意選択でｔｒａｃｒＲＮＡを含む。
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態において、標的核酸はＤＮＡ分子である。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態において、標的核酸はＰＡＭ配列を含む。
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、非特異的ヌクレアーゼ活性を有する。
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態において、標的核酸の修飾は、二本鎖切断イベントである。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態において、標的核酸の修飾は、一本鎖切断イベントである。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態において、標的核酸の修飾により、挿入イベントが生じる。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態において、標的核酸の修飾により、欠失イベントが生じる。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態において、標的核酸の修飾により、細胞毒性又は細胞死が生じる。
別の態様において、本開示は、標的核酸の編集方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるシステムを標的核酸に接触させることを含む。別の態様において、本開示は、標的核酸の発現を改変する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるシステムを標的核酸に接触させることを含む。別の態様において、本開示は、標的核酸のある部位におけるペイロード核酸の挿入を標的化する方法であって、本明細書に記載されるシステムを標的核酸に接触させることを含む、方法を提供する。別の態様において、本開示は、標的核酸の部位からのペイロード核酸の切出しを標的化する方法であって、本明細書に記載されるシステムを標的核酸に接触させることを含む、方法を提供する。別の態様において、本開示は、ＤＮＡ標的核酸の認識時に一本鎖ＤＮＡを非特異的に分解する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるシステムを標的核酸に接触させることを含む。
別の態様において、本開示は、試料中の標的核酸の検出方法であって、（ａ）本明細書に記載されるシステム及び標識されたレポーター核酸を前記試料に接触させることであって、スペーサー配列が標的核酸にハイブリダイズすると、標識されたレポーター核酸の切断が起こること；及び（ｂ）前記標識されたレポーター核酸の切断によって生成される検出可能シグナルを測定することであって、それにより前記試料中における前記標的核酸の存在を検出することを含む方法を提供する。
本明細書に提供されるシステム又は方法のいずれかの一部の実施形態において、接触は、直接接触又は間接接触を含む。本明細書に提供されるシステム又は方法のいずれかの一部の実施形態において、間接的に接触することは、ＲＮＡガイド及び／又はＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の産生を可能にする条件下で、本明細書に記載されるＲＮＡガイド又はＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする１つ以上の核酸を投与することを含む。本明細書に提供されるシステム又は方法のいずれかの一部の実施形態において、接触は、インビボでの接触又はインビトロでの接触を含む。本明細書に提供されるシステム又は方法のいずれかの一部の実施形態において、標的核酸をシステムと接触させることは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びガイドＲＮＡが標的核酸に到達することを可能にする条件下で、核酸を含む細胞をシステムと接触させることを含む。本明細書に提供されるシステム又は方法のいずれかの一部の実施形態において、インビボで細胞をシステムと接触させることは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びガイドＲＮＡが細胞に到達するか又は細胞内で産生されることを可能にする条件下で、細胞を含む対象にシステムを投与することを含む。
別の態様において、本開示は、（ａ）標的核酸のターゲティング及び編集方法；（ｂ）核酸の認識に応じた一本鎖核酸の非特異的分解方法；（ｃ）二本鎖標的のスペーサー相補鎖の認識に応じた二本鎖標的の非スペーサー相補鎖のターゲティング及びニッキング方法；（ｄ）二本鎖標的核酸のターゲティング及び切断方法；（ｅ）試料中の標的核酸の検出方法；（ｆ）二本鎖核酸の特異的編集方法；（ｇ）二本鎖核酸の塩基編集方法；（ｈ）細胞における遺伝子型特異的又は転写状態特異的細胞死又は休眠の誘導方法；（ｉ）二本鎖核酸標的におけるインデルの作成方法；（ｊ）二本鎖核酸標的への配列の挿入方法；又は（ｋ）二本鎖核酸標的における配列の欠失又は逆位形成方法である、インビトロ又はエキソビボでの方法における使用のための、本明細書に提供されるシステムを提供する。
本明細書に記載されるエフェクターは、限定はされないが、１）新規核酸編集特性及び制御機構、２）送達戦略におけるより高い汎用性に比したより小さいサイズ、３）遺伝子型によって惹起される細胞死などの細胞過程、及び４）プログラム可能なＲＮＡ誘導型ＤＮＡ挿入、切出し、及び動員、及び５）非ヒト共生源を介した既存の免疫の差別化されたプロファイルを含めた更なる特徴を提供する。例えば、実施例１～５及び図１Ａ～３７を参照のこと。本明細書に記載される新規ＤＮＡターゲティングシステムがゲノム及びエピゲノム操作技法のツールボックスに加わることにより、特異的でプログラムされた摂動への幅広い適用が実現する。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明から、及び特許請求の範囲から明らかであろう。
図面は、ＣＬＵＳＴ．２００９１６と呼ばれるタンパク質クラスターの分析結果を表す一連の概略表現である。
実施例２に記載されているインビボネガティブ選択スクリーニングアッセイの構成要素の概略表現である。２個のＤＲが隣接する且つＪ２３１１９によって発現されるｐＡＣＹＣ１８４又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）必須遺伝子の両鎖から均一にサンプリングした非代表的スペーサーを含むＣＲＩＳＰＲアレイライブラリを設計した。 実施例２に記載されているインビボネガティブ選択スクリーニングワークフローの概略表現である。ＣＲＩＳＰＲアレイライブラリは、エフェクタープラスミドにクローニングした。エフェクタープラスミド及び非コードプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換し、続いてｐＡＣＹＣ１８４又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）必須遺伝子からの転写物に対して干渉を付与するＣＲＩＳＰＲアレイのネガティブ選択用に成長させた。エフェクタープラスミドの標的化シーケンシングを使用して、枯渇したＣＲＩＳＰＲアレイを同定した。スモールＲＮＡｓｅｑを更に実施して、成熟ｃｒＲＮＡ及び潜在的ｔｒａｃｒＲＮＡの要件を特定できる。 ＣＬＵＳＴ．２００９１６エフェクターのＲｕｖＣ及びＺｎフィンガードメインを示す概略図であり、これは、表７に示される配列のコンセンサス配列に基づく。 代表的なＣＬＵＳＴ．２００９１６遺伝子座の保存されたエフェクター（ｅ＿Ａ）及びＣＲＩＳＰＲアレイエレメントを示す概略配列表現である。 ＣＬＵＳＴ．２００９１６のＣＲＩＳＰＲダイレクトリピートエレメントの例の複数の配列アラインメントを示す一連の配列である。図２は、出現順に、それぞれ配列番号１６２、３０、４１、４１、３１、３１、３１－３２、３２－３５、３５－３６、３６、４０、３９、３９、３９、３９、３９、３９、１６３、１６３、４３、４３、４６、４４、４２、４５、４５、１６４、１６４、１６４、３８、３８、３８及び３７を開示する。 ＣＬＵＳＴ．２００９１６エフェクタータンパク質の系統樹の概略表現である。 ＣＬＵＳＴ．２００９１６エフェクタータンパク質の多重配列アラインメントの概略表現であり、ＲｕｖＣドメインの保存されている触媒残基の位置、及びジンクフィンガードメインの保存された触媒残基の位置を図示する。 同上。 非コード配列を有する、ｐＡＣＹＣ１８４及びダイレクトリピート転写方向を標的とするスペーサーについてのエンジニアリングされた組成物の枯渇活性の程度を示す、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ３３０００１３２３２（配列番号１に記載のエフェクター）のグラフである。「順」方向のダイレクトリピート（５’－ＣＡＡＣ…ＡＧＡＣ－［スペーサー］－３’）及び「逆」方向のダイレクトリピート（５’－ＧＴＣＴ…ＧＴＴＧ－［スペーサー］－３’）の枯渇の程度がそれぞれ実線及び破線で示される。 図４Ａは、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド上の位置による、非コード配列を有する、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ３３０００１３２３２の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。図４Ｂは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、Ｅ．Ｃｌｏｎｉ上の位置による、非コード配列を有する、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ３３０００１３２３２の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。トップ鎖上及びボトム鎖上の標的を別々に、アノテートされた遺伝子の向きに関して示す。バンドの大きさは枯渇の程度を示し、明るいバンドはヒット閾値の３に近い。２つのグラジエントは、相対的な転写物の存在度を示すＲＮＡシーケンシングのヒートマップである。 同上。 ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ３３０００１３２３２（非コード配列を含む）のＰＡＭ配列の予測としての、Ｅ．Ｃｌｏｎｉの枯渇した標的に隣接する配列のＷｅｂＬｏｇｏである。 は、非コード配列を有しない、ｐＡＣＹＣ１８４及びダイレクトリピート転写方向を標的とするスペーサーについてのエンジニアリングされた組成物の枯渇活性の程度を示す、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ３３０００１３２３２（配列番号１に記載のエフェクター）のグラフである。「順」方向のダイレクトリピート（５’－ＣＡＡＣ…ＡＧＡＣ－［スペーサー］－３’）及び「逆」方向のダイレクトリピート（５’－ＧＴＣＴ…ＧＴＴＧ－［スペーサー］－３’）の枯渇の程度がそれぞれ実線及び破線で示される。 図７Ａは、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド上の位置による、非コード配列を有しない、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ３３０００１３２３２の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。図７Ｂは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、Ｅ．Ｃｌｏｎｉ上の位置による、非コード配列を有しない、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ３３０００１３２３２の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。トップ鎖上及びボトム鎖上の標的を別々に、アノテートされた遺伝子の向きに関して示す。バンドの大きさは枯渇の程度を示し、明るいバンドはヒット閾値の３に近い。グラジエントは、相対的な転写物の存在度を示すＲＮＡシーケンシングのヒートマップである。 同上。 ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ３３０００１３２３２（非コード配列を含まない）のＰＡＭ配列の予測としての、Ｅ．Ｃｌｏｎｉの枯渇した標的に隣接する配列のＷｅｂＬｏｇｏである。 非コード配列を有する、ｐＡＣＹＣ１８４及びダイレクトリピート転写方向を標的とするスペーサーについてのエンジニアリングされた組成物の枯渇活性の程度を示す、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７０（配列番号２６に記載のエフェクター）のグラフである。「順」方向のダイレクトリピート（５’－ＧＴＴＣ…ＧＣＧＣ－［スペーサー］－３’）及び「逆」方向のダイレクトリピート（５’－ＧＣＧＣ…ＧＡＡＣ－［スペーサー］－３’）の枯渇の程度がそれぞれ実線及び破線で示される。 図１０Ａは、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド上の位置による、非コード配列を有する、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７０の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。図１０Ｂは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、Ｅ．Ｃｌｏｎｉ上の位置による、非コード配列を有する、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７０の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。トップ鎖上及びボトム鎖上の標的を別々に、アノテートされた遺伝子の向きに関して示す。バンドの大きさは枯渇の程度を示し、明るいバンドはヒット閾値の３に近い。グラジエントは、相対的な転写物の存在度を示すＲＮＡシーケンシングのヒートマップである。 同上。 ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７０（非コード配列を含む）のＰＡＭ配列の予測としての、Ｅ．Ｃｌｏｎｉの枯渇した標的に隣接する配列のＷｅｂＬｏｇｏである。 非コード配列を有しない、ｐＡＣＹＣ１８４及びダイレクトリピート転写方向を標的とするスペーサーについてのエンジニアリングされた組成物の枯渇活性の程度を示す、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７０（配列番号２６に記載のエフェクター）のグラフである。「順」方向のダイレクトリピート（５’－ＧＴＴＣ…ＧＣＧＣ－［スペーサー］－３’）及び「逆」方向のダイレクトリピート（５’－ＧＣＧＣ…ＧＡＡＣ－［スペーサー］－３’）の枯渇の程度がそれぞれ実線及び破線で示される。 図１３Ａは、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド上の位置による、非コード配列を有しない、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７０の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。図１３Ｂは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、Ｅ．Ｃｌｏｎｉ上の位置による、非コード配列を有しない、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７０の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。トップ鎖上及びボトム鎖上の標的を別々に、アノテートされた遺伝子の向きに関して示す。バンドの大きさは枯渇の程度を示し、明るいバンドはヒット閾値の３に近い。グラジエントは、相対的な転写物の存在度を示すＲＮＡシーケンシングのヒートマップである。 同上。 ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７０（非コード配列を含まない）のＰＡＭ配列の予測としての、Ｅ．Ｃｌｏｎｉの枯渇した標的に隣接する配列のＷｅｂＬｏｇｏである。 非コード配列を有する、ｐＡＣＹＣ１８４及びダイレクトリピート転写方向を標的とするスペーサーについてのエンジニアリングされた組成物の枯渇活性の程度を示す、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７５（配列番号２８に記載のエフェクター）のグラフである。「順」方向のダイレクトリピート（５’－ＣＣＡＴ…ＡＧＡＣ－［スペーサー］－３’）及び「逆」方向のダイレクトリピート（５’－ＧＴＣＴ…ＡＴＧＧ－［スペーサー］－３’）の枯渇の程度がそれぞれ実線及び破線で示される。 図１６Ａは、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド上の位置による、非コード配列を有する、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７５の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。図１６Ｂは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、Ｅ．Ｃｌｏｎｉ上の位置による、非コード配列を有する、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７５の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。トップ鎖上及びボトム鎖上の標的を別々に、アノテートされた遺伝子の向きに関して示す。バンドの大きさは枯渇の程度を示し、明るいバンドはヒット閾値の３に近い。グラジエントは、相対的な転写物の存在度を示すＲＮＡシーケンシングのヒートマップである。 同上。 ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７５（非コード配列を含む）のＰＡＭ配列の予測としての、Ｅ．Ｃｌｏｎｉの枯渇した標的に隣接する配列のＷｅｂＬｏｇｏである。 非コード配列を有しない、ｐＡＣＹＣ１８４及びダイレクトリピート転写方向を標的とするスペーサーについてのエンジニアリングされた組成物の枯渇活性の程度を示す、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７５（配列番号２８に記載のエフェクター）のグラフである。「順」方向のダイレクトリピート（５’－ＣＣＡＴ…ＡＧＡＣ－［スペーサー］－３’）及び「逆」方向のダイレクトリピート（５’－ＧＴＣＴ…ＡＴＧＧ－［スペーサー］－３’）の枯渇の程度がそれぞれ実線及び破線で示される。 図１９Ａは、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド上の位置による、非コード配列を有しない、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７５の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。図１９Ｂは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、Ｅ．Ｃｌｏｎｉ上の位置による、非コード配列を有しない、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７５の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。トップ鎖上及びボトム鎖上の標的を別々に、アノテートされた遺伝子の向きに関して示す。バンドの大きさは枯渇の程度を示し、明るいバンドはヒット閾値の３に近い。グラジエントは、相対的な転写物の存在度を示すＲＮＡシーケンシングのヒートマップである。 同上。 ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７５（非コード配列を含まない）のＰＡＭ配列の予測としての、Ｅ．Ｃｌｏｎｉの枯渇した標的に隣接する配列のＷｅｂＬｏｇｏである。 非コード配列を有する、ｐＡＣＹＣ１８４及びダイレクトリピート転写方向を標的とするスペーサーについてのエンジニアリングされた組成物の枯渇活性の程度を示す、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７７（配列番号２９に記載のエフェクター）のグラフである。「順」方向のダイレクトリピート（５’－ＧＴＣＧ…ＣＧＡＣ－［スペーサー］－３’）及び「逆」方向のダイレクトリピート（５’－ＧＴＣＧ…ＣＧＡＣ－［スペーサー］－３’）の枯渇の程度がそれぞれ実線及び破線で示される。 図２２Ａは、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド上の位置による、非コード配列を有する、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７７の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。図２２Ｂは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、Ｅ．Ｃｌｏｎｉ上の位置による、非コード配列を有する、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７７の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。トップ鎖上及びボトム鎖上の標的を別々に、アノテートされた遺伝子の向きに関して示す。バンドの大きさは枯渇の程度を示し、明るいバンドはヒット閾値の３に近い。グラジエントは、相対的な転写物の存在度を示すＲＮＡシーケンシングのヒートマップである。 同上。 ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７７（非コード配列を含む）のＰＡＭ配列の予測としての、Ｅ．Ｃｌｏｎｉの枯渇した標的に隣接する配列のＷｅｂＬｏｇｏである。 非コード配列を有しない、ｐＡＣＹＣ１８４及びダイレクトリピート転写方向を標的とするスペーサーについてのエンジニアリングされた組成物の枯渇活性の程度を示す、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７７（配列番号２９に記載のエフェクター）のグラフである。「順」方向のダイレクトリピート（５’－ＧＴＣＧ…ＣＧＡＣ－［スペーサー］－３’）及び「逆」方向のダイレクトリピート（５’－ＧＴＣＧ…ＣＧＡＣ－［スペーサー］－３’）の枯渇の程度がそれぞれ実線及び破線で示される。 図２５Ａは、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド上の位置による、非コード配列を有しない、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７７の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。図２５Ｂは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、Ｅ．Ｃｌｏｎｉ上の位置による、非コード配列を有しない、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７７の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。トップ鎖上及びボトム鎖上の標的を別々に、アノテートされた遺伝子の向きに関して示す。バンドの大きさは枯渇の程度を示し、明るいバンドはヒット閾値の３に近い。グラジエントは、相対的な転写物の存在度を示すＲＮＡシーケンシングのヒートマップである。 同上。 ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７７（非コード配列を含まない）のＰＡＭ配列の予測としての、Ｅ．Ｃｌｏｎｉの枯渇した標的に隣接する配列のＷｅｂＬｏｇｏである。 非コード配列を有する、ｐＡＣＹＣ１８４及びダイレクトリピート転写方向を標的とするスペーサーについてのエンジニアリングされた組成物の枯渇活性の程度を示す、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５６９（配列番号２５に記載のエフェクター）のグラフである。「順」方向のダイレクトリピート（５’－ＧＴＣＴ…ＣＡＧＧ－［スペーサー］－３’）及び「逆」方向のダイレクトリピート（５’－ＣＣＴＧ…ＡＧＡＣ－［スペーサー］－３’）の枯渇の程度がそれぞれ実線及び破線で示される。 図２８Ａは、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド上の位置による、非コード配列を有する、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５６９の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。図２８Ｂは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、Ｅ．Ｃｌｏｎｉ上の位置による、非コード配列を有する、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５６９の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。トップ鎖上及びボトム鎖上の標的を別々に、アノテートされた遺伝子の向きに関して示す。バンドの大きさは枯渇の程度を示し、明るいバンドはヒット閾値の３に近い。グラジエントは、相対的な転写物の存在度を示すＲＮＡシーケンシングのヒートマップである。 同上。 ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５６９（非コード配列を含む）のＰＡＭ配列の予測としての、Ｅ．Ｃｌｏｎｉの枯渇した標的に隣接する配列のＷｅｂＬｏｇｏである。 非コード配列を有しない、ｐＡＣＹＣ１８４及びダイレクトリピート転写方向を標的とするスペーサーについてのエンジニアリングされた組成物の枯渇活性の程度を示す、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５６９（配列番号２５に記載のエフェクター）のグラフである。「順」方向のダイレクトリピート（５’－ＧＴＣＴ…ＣＡＧＧ－［スペーサー］－３’）及び「逆」方向のダイレクトリピート（５’－ＣＣＴＧ…ＡＧＡＣ－［スペーサー］－３’）の枯渇の程度がそれぞれ実線及び破線で示される。 図３１Ａは、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド上の位置による、非コード配列を有しない、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５６９の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。図３１Ｂは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、Ｅ．Ｃｌｏｎｉ上の位置による、非コード配列を有しない、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５６９の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。トップ鎖上及びボトム鎖上の標的を別々に、アノテートされた遺伝子の向きに関して示す。バンドの大きさは枯渇の程度を示し、明るいバンドはヒット閾値の３に近い。グラジエントは、相対的な転写物の存在度を示すＲＮＡシーケンシングのヒートマップである。 同上。 図３２は、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５６９（非コード配列を含まない）のＰＡＭ配列の予測としての、Ｅ．Ｃｌｏｎｉの枯渇した標的に隣接する配列のＷｅｂＬｏｇｏである。 二本鎖ＤＮＡ標的基質の調製及び標識を示す概略表現である。 図３４Ａは、配列番号１のエフェクターによる二本鎖ＤＮＡ標的基質（標的Ａ；配列番号５７）の切断を示す。配列番号５８の非標的基質（非標的Ｂ）は陰性対照である。図３４Ｂは、配列番号２８のエフェクターによる二本鎖ＤＮＡ標的基質（標的Ｃ；配列番号５９）の切断を示す。配列番号６０の非標的基質（非標的Ｄ）は陰性対照である。図３４Ｃは、配列番号２６のエフェクターによる二本鎖ＤＮＡ標的基質（標的Ｅ；配列番号６１）の切断を示す。配列番号６２の非標的基質（非標的Ｆ）は陰性対照である。図３４Ｄは、配列番号２７のエフェクターによる二本鎖ＤＮＡ標的基質（標的Ｇ；配列番号６３）の切断を示す。配列番号６４の非標的基質（非標的Ｈ）は陰性対照である。図３４Ｅは、配列番号２５のエフェクターによる二本鎖ＤＮＡ標的基質（標的Ｉ；配列番号６５）の切断を示す。配列番号６６の非標的基質（非標的Ｊ）は陰性対照である。 同上。 同上。 同上。 同上。 ＣＬＵＳＴ．２００９１６エフェクター活性を測定するための実施例４に記載されている蛍光枯渇アッセイの概略表現である。 図３６Ａは、標的１（配列番号６７）、標的２（配列番号６８）、標的３（配列番号６９）、標的４（配列番号７０）、標的５（配列番号７１）についての配列番号２８のエフェクターのＧＦＰ枯渇率（非標的／標的）のプロットを示す。図３６Ｂは、標的７（配列番号７２）、標的８（配列番号７３）、標的９（配列番号７４）、標的１０（配列番号７５）、標的１１（配列番号７６）についての配列番号２５のエフェクターのＧＦＰ枯渇率（非標的／標的）のプロットを示す。図３６Ａ及び図３６Ａの枯渇率の値は、１２時間にわたって行われた測定から計算された。 同上。 ＨＥＫ２９３細胞のＡＡＶＳ１標的遺伝子座において、配列番号２４、配列番号２８、及び配列番号２５のエフェクターによって誘導されるインデルを示す。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、天然に多様であり、プログラム可能なバイオテクノロジーに生かすことのできる様々な活性機構及び機能要素が含まれている。天然では、これらのシステムが外来ＤＮＡ及びウイルスに対する効率的な防御を実現する一方で、自己と非自己の判別を提供して自己標的化を回避している。エンジニアリングされた設定では、これらのシステムは、分子技術の多様なツールボックスを提供し、ターゲティング空間の境界を画定する。本明細書に記載される方法を用いて、シングルサブユニットのクラス２エフェクターシステム内に、ＲＮＡによるプログラムが可能な核酸操作の能力を拡張する、更なる機構及びパラメータが発見された。
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本発明の実施又は試験においては、本明細書に記載されるものと同様の又は等価な方法及び材料を使用し得るが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書において言及される刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は全て、全体として参照により援用される。矛盾が生じる場合、定義を含め、本明細書が優先するものとする。加えて、材料、方法、及び例は例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。出願人は、特許法の標準的な慣行に従って、「を含む」、「から本質的になる」、又は「からなる」という移行句を使用して、任意の開示された発明を代替的に請求する権利を留保する。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のものを示さない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「核酸」への言及は、１つ以上の核酸を意味する。
本明細書において、「好ましくは」、「適切に」、「一般的に」、及び「典型的に」などの用語は、請求される発明の範囲を制限するため、又は特定の特徴が請求される発明の構造又は機能にとって重大、必須、又は更に重要であることを示唆するために使用されるものではないことに留意されたい。むしろ、これらの用語は、本発明の特定の実施形態において利用できる、又は利用できない、代替又は追加の特徴を強調することを単に意図するものである。
本発明を説明及び定義する目的で、用語「実質的に」は、任意の定量的比較、値、測定、又は他の表現に帰することができる固有の不確実性の程度を表すために本明細書で使用されることに留意されたい。用語「実質的に」はまた、問題となっている主題の基本的な機能に変化をもたらすことなく、記載される参照物から定量的表現が変化し得る程度を表すために本明細書で使用される。
用語「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム」は、本明細書で使用されるとき、ＣＲＩＳＰＲエフェクターをコードする配列、ＲＮＡガイド、並びに他の配列及びＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの転写物を含む、ＣＲＩＳＰＲエフェクターの発現に関与する、又はその活性を導く核酸及び／又はタンパク質を指す。
用語「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質」、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクター」、「ＣＲＩＳＰＲエフェクター」、「エフェクター」、「エフェクタータンパク質」、「ＣＲＩＳＰＲ酵素」などは、本明細書で同義的に使用されるとき、酵素活性を実行するタンパク質又はＲＮＡガイドによって指定される核酸上の標的部位に結合するタンパク質を指す。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、エンドヌクレアーゼ活性、ニッカーゼ活性、及び／又はエキソヌクレアーゼ活性を有する。
用語「ＲＮＡガイド」、「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、及び「ガイド配列」は、本明細書で使用されるとき、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡなどの標的核酸への本明細書に記載されるエフェクターのターゲティングを促進する任意のＲＮＡ分子を指す。例示的な「ＲＮＡガイド」としては、限定はされないが、ｃｒＲＮＡ、並びにｔｒａｃｒＲＮＡ及び／又はモジュレーターＲＮＡのいずれかとハイブリダイズ又は融合したｃｒＲＮＡが挙げられる。一部の実施形態において、ＲＮＡガイドは、単一のＲＮＡ分子に融合された、又は別個のＲＮＡ分子としての、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡガイドは、単一のＲＮＡ分子に融合された、又は別個のＲＮＡ分子としての、ｃｒＲＮＡ及びモジュレーターＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ＲＮＡガイドは、単一のＲＮＡ分子に融合された、又は別個のＲＮＡ分子としての、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びモジュレーターＲＮＡを含む。
用語「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ」は、本明細書で使用されるとき、ＣＲＩＳＰＲエフェクターによって核酸配列を特異的に認識するために使用されるガイド配列を含むＲＮＡ分子を指す。典型的には、ｃｒＲＮＡは、標的認識を媒介する配列と、ｔｒａｃｒＲＮＡと二重鎖を形成する配列とを含む。ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズする配列を含み得る。次にはｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖は、ＣＲＩＳＰＲエフェクターに結合し得る。本明細書で使用されるとき、用語「プレｃｒＲＮＡ」は、ＤＲ－スペーサー－ＤＲ配列を含むプロセシングされていないＲＮＡ分子を指す。本明細書で使用される場合、「成熟ｃｒＲＮＡ」という用語は、プレｃｒＲＮＡの処理された形態を指す。成熟ｃｒＲＮＡは、ＤＲスペーサー配列を含んでもよく、ここで、ＤＲはプレｃｒＲＮＡのＤＲの短縮型であり、且つ／又はスペーサーはプレｃｒＲＮＡのスペーサーの短縮型である。
用語「ＣＲＩＳＰＲエフェクター複合体」、「エフェクター複合体」、又は「監視複合体」は、本明細書で使用されるとき、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質及びＲＮＡガイドを含む複合体を指す。ＣＲＩＳＰＲエフェクター複合体は、１つ以上のアクセサリータンパク質を更に含み得る。１つ以上のアクセサリータンパク質は、非触媒的及び／又は非標的結合であり得る。
用語「トランス活性化ｃｒＲＮＡ」又は「ｔｒａｃｒＲＮＡ」は、本明細書で使用されるとき、ＣＲＩＳＰＲエフェクターが特定の標的核酸に結合するために必要な構造及び／又は配列モチーフを形成する配列を含むＲＮＡ分子を指す。
用語「ＣＲＩＳＰＲアレイ」は、本明細書で使用されるとき、最初のＣＲＩＳＰＲリピートの最初のヌクレオチドから始まって最後の（末端）ＣＲＩＳＰＲリピートの最後のヌクレオチドで終わる、ＣＲＩＳＰＲリピートとスペーサーとを含む核酸（例えば、ＤＮＡ）セグメントを指す。典型的には、ＣＲＩＳＰＲアレイ中の各スペーサーは２つのリピート間に位置する。用語「ＣＲＩＳＰＲリピート」、「ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート」、及び「ダイレクトリピート」は、本明細書で使用されるとき、複数の短い定方向に反復する配列を指し、これはＣＲＩＳＰＲアレイ内で配列変異をごく僅かしか又は全く示さない。
用語「モジュレーターＲＮＡ」は、本明細書に記載されるとき、ＣＲＩＳＰＲエフェクター又はＣＲＩＳＰＲエフェクターを含む核タンパク質複合体の活性を調節する（例えば、増加又は減少させる）任意のＲＮＡ分子を指す。一部の実施形態において、モジュレーターＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲエフェクター又はＣＲＩＳＰＲエフェクターを含む核タンパク質複合体のヌクレアーゼ活性を調節する。
本明細書で使用されるとき、用語「標的核酸」は、ＲＮＡガイド中のスペーサーの全体又は一部に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸を指す。一部の実施形態において、標的核酸は遺伝子を含む。一部の実施形態において、標的核酸は非コード領域（例えば、プロモーター）を含む。一部の実施形態において、標的核酸は一本鎖である。一部の実施形態において、標的核酸は二本鎖である。「転写活性部位」は、本明細書で使用されるとき、活発に転写されている核酸配列中の部位を指す。
用語「活性化したＣＲＩＳＰＲエフェクター複合体」、「活性化したＣＲＩＳＰＲ複合体」、及び「活性化した複合体」は、本明細書で使用されるとき、標的核酸を修飾することができるＣＲＩＳＰＲエフェクター複合体を指す。一部の実施形態において、活性化したＣＲＩＳＰＲ複合体は、活性化したＣＲＩＳＰＲ複合体が標的核酸に結合した後、標的核酸を修飾することができる。一部の実施形態において、活性化したＣＲＩＳＰＲ複合体の標的核酸への結合により、コラテラルＲＮＡ切断などの追加の切断イベントが生じる。
用語「切断イベント」は、本明細書で使用されるとき、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡなどの核酸の切断を指す。一部の実施形態において、切断イベントは、本明細書で使用されるとき、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムのヌクレアーゼによって作り出される標的核酸における切断を指す。一部の実施形態において、切断イベントは二本鎖ＤＮＡ切断である。一部の実施形態において、切断イベントは一本鎖ＤＮＡ切断である。一部の実施形態において、切断イベントは、コラテラル核酸の切断を指す。
用語「コラテラル核酸」は、本明細書で使用されるとき、活性化したＣＲＩＳＰＲ複合体によって非特異的に切断される核酸基質を指す。用語「コラテラルＤＮアーゼ活性」は、本明細書でＣＲＩＳＰＲエフェクターに言及して使用されるとき、活性化したＣＲＩＳＰＲ複合体の非特異的ＤＮアーゼ活性を指す。用語「コラテラルＲＮアーゼ活性」は、本明細書でＣＲＩＳＰＲエフェクターに言及して使用されるとき、活性化したＣＲＩＳＰＲ複合体の非特異的ＲＮアーゼ活性を指す。
用語「ドナー鋳型核酸」は、本明細書で使用されるとき、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲエフェクターが標的核酸を修飾した後、標的配列又は標的近位配列に、鋳型化された変更を行うために使用できる核酸分子を指す。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は二本鎖核酸である。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は一本鎖核酸である。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は線状である。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は環状（例えば、プラスミド）である。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は外因性核酸分子である。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は内因性核酸分子（例えば、染色体）である。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの誘導体、又はそれらの組み合わせを含む核酸を指すために同義的に使用され得る。当業者に周知の方法を使用して、本発明による遺伝子発現構築物及び組換え細胞を構築することができる。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、インビボ組換え技術、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術が挙げられる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８９，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、及びＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）に記載される技術を参照されたい。
用語「遺伝子修飾」又は「遺伝子エンジニアリング」は、広義には、細胞のゲノム又は核酸の操作を指す。同様に、用語「遺伝子エンジニアリングされた」及び「エンジニアリングされた」は、操作されたゲノム又は核酸を含む細胞を指す。遺伝子修飾の方法としては、例えば、異種遺伝子発現、遺伝子又はプロモーターの挿入又は欠失、核酸変異、遺伝子発現又は不活性化の変化、酵素エンジニアリング、定向進化、知識ベースの設計、ランダム突然変異誘発法、遺伝子シャッフリング、及びコドン最適化が挙げられる。
用語「組換え」は、核酸、タンパク質、又は細胞が遺伝子修飾、エンジニアリング、又は組換えの産物であることを示す。一般に、用語「組換え」は、複数の供給源に由来する遺伝物質を含むか、又はそれらによってコードされる、核酸、タンパク質、又は細胞を指す。本明細書で使用されるとき、用語「組換え」という用語はまた、内因性核酸又はタンパク質の変異型を含む、変異核酸又はタンパク質を含む細胞を説明するために使用され得る。用語「組換え細胞」及び「組換え宿主」は、同義的に使用することができる。一部の実施形態において、組換え細胞は、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲエフェクターを含む。ＣＲＩＳＰＲエフェクターは組換え細胞における発現のためにコドン最適化することができる。一部の実施形態において、本明細書に開示される組換え細胞は、ＲＮＡガイドを更に含む。一部の実施形態において、本明細書に開示される組換え細胞のＲＮＡガイドは、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。一部の実施形態において、本明細書に開示される組換え細胞は、モジュレーターＲＮＡを含む。一部の実施形態において、組換え細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などの原核細胞である。一部の実施形態において、組換え細胞は、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞などの真核細胞である。
ＣＬＵＳＴ．２００９１６の同定
この出願は、本明細書において「ＣＬＵＳＴ．２００９１６」と呼ばれる新規タンパク質ファミリーの同定、エンジニアリング、及び使用に関する。図２Ａに示すように、ＣＬＵＳＴ．２００９１６のタンパク質は、ＲｕｖＣドメイン（ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、及びＲｕｖＣ ＩＩＩと表示される）及びＺｎフィンガードメインを含む。表６に示すように、ＣＬＵＳＴ．２００９１６のエフェクターのサイズは、約６５０アミノ酸～約８５０アミノ酸の範囲である。したがって、以下に示すように、ＣＬＵＳＴ．２００９１６のエフェクターは、当技術分野で知られているエフェクターよりも小さい。例えば、表１を参照されたい。
Figure 2022540153000002
ＣＬＵＳＴ．２００９１６のエフェクターは、他の特定の機能との強力な共出現パターンを呈するタンパク質を検索及び同定するために、計算方法及びアルゴリズムを使用して同定された。特定の実施形態において、これらの計算的方法は、ＣＲＩＳＰＲアレイにごく近接して共出現するタンパク質を同定することに関するものであった。本明細書に開示される方法は、非コード及びタンパク質コードの両方の（例えば、細菌遺伝子座の非コード範囲にあるファージ配列の断片；又はＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１タンパク質）、他の特徴にごく近接した範囲内に天然に出現するタンパク質の同定においても有用である。本明細書に記載される方法及び計算は１つ以上の計算装置で実施されてもよいことが理解される。
ゲノム又はメタゲノムデータベースから一組のゲノム配列が入手された。データベースは、ショートリード、又はコンティグレベルデータ、又はアセンブルされたスキャフォールド、又は生物の完全ゲノム配列を含んだ。同様に、データベースは、原核生物、若しくは真核生物からのゲノム配列データを含んでもよく、又はメタゲノム環境試料からのデータを含んでもよい。データベースリポジトリの例としては、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ＮＣＢＩ）のＲｅｆＳｅｑ、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋ、ＮＣＢＩの全ゲノムショットガン（Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｈｏｔｇｕｎ：ＷＧＳ）、及びジョイントゲノム研究所（Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＪＧＩ）の統合微生物ゲノム（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｇｅｎｏｍｅｓ：ＩＭＧ）が挙げられる。
一部の実施形態において、指定される最小長さのゲノム配列データの選択には、最小サイズ要件が課される。特定の例示的実施形態において、最小コンティグ長さは、１００ヌクレオチド、５００ｎｔ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、４０ｋｂ、又は５０ｋｂであってもよい。
一部の実施形態において、公知の又は予測されるタンパク質は、完全な又は選択された一組のゲノム配列データから抽出される。一部の実施形態において、公知の又は予測されるタンパク質は、ソースデータベースによって提供されるコード配列（ＣＤＳ）アノテーションを抽出することから取られる。一部の実施形態において、予測タンパク質は、計算的方法を適用してヌクレオチド配列からタンパク質を同定することにより決定される。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＭａｒｋスイートを使用してゲノム配列からタンパク質が予測される。一部の実施形態では、Ｐｒｏｄｉｇａｌを使用してゲノム配列からタンパク質が予測される。一部の実施形態では、同じ一組の配列データに対して複数のタンパク質予測アルゴリズムが用いられ、得られる一組のタンパク質から重複が排除されてもよい。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイはゲノム配列データから同定される。一部の実施形態では、ＰＩＬＥＲ－ＣＲを使用してＣＲＩＳＰＲアレイが同定される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ認識ツール（ＣＲＩＳＰＲ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｔｏｏｌ：ＣＲＴ）を使用してＣＲＩＳＰＲアレイが同定される。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイは、最小限の回数（例えば２、３、又は４回）繰り返されるヌクレオチドモチーフを同定する発見的手法によって同定され、ここで繰り返されるモチーフの連続する出現間の間隔は、指定される長さ（例えば、５０、１００、又は１５０ヌクレオチド）を超えない。一部の実施形態では、同じ一組の配列データに対して複数のＣＲＩＳＰＲアレイ同定ツールが用いられ、得られる一組のＣＲＩＳＰＲアレイから重複が排除されてもよい。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイ（本明細書では「ＣＲＩＳＰＲ近位タンパク質クラスター」と呼ばれる）にごく近接しているタンパク質が同定される。一部の実施形態において、近接性はヌクレオチド距離として定義され、２０ｋｂ、１５ｋｂ、又は５ｋｂ以内であってもよい。一部の実施形態において、近接性は、タンパク質とＣＲＩＳＰＲアレイとの間にあるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の数として定義され、特定の例示的距離は、１０、５、４、３、２、１、又は０個のＯＲＦであり得る。ＣＲＩＳＰＲアレイとごく近接した範囲内にあると同定されたタンパク質は、次に相同タンパク質クラスターにまとめられる。一部の実施形態において、ｂｌａｓｔｃｌｕｓｔを使用してＣＲＩＳＰＲ近位タンパク質クラスターが形成される。特定の他の実施形態において、ｍｍｓｅｑｓ２を使用してＣＲＩＳＰＲ近位タンパク質クラスターが形成される。
ＣＲＩＳＰＲ近接タンパク質クラスターのメンバー間に強力な共出現パターンを確立するため、予め編成された完全な一組の公知の及び予測されるタンパク質に対してタンパク質クラスターの各メンバーのＢＬＡＳＴ検索が実施されてもよい。一部の実施形態では、ＵＢＬＡＳＴ又はｍｍｓｅｑｓ２を使用して類似のタンパク質が検索されてもよい。一部の実施形態では、ファミリー内のタンパク質の代表的なサブセットについてのみ検索が実施されてもよい。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ近接タンパク質クラスターがメトリックによって順位付けされるか又はフィルタリングされることにより共出現が決定される。１つの例示的メトリックは、特定のＥ値閾値に至るまでのＢＬＡＳＴマッチの数に対するタンパク質クラスター内の要素の数の比である。一部の実施形態では、一定のＥ値閾値が使用されてもよい。他の実施形態では、Ｅ値閾値は、タンパク質クラスターの最も離れたメンバーによって決定されてもよい。一部の実施形態において、大域的な一組のタンパク質がクラスター化され、共出現メトリックは、含まれる１つ又は複数の大域的クラスターの要素の数に対するＣＲＩＳＰＲ近接タンパク質の要素の数の比である。
一部の実施形態において、手動でのレビュープロセスを用いることにより、クラスター中のタンパク質の天然に存在する遺伝子座構造に基づいてエンジニアリングされるシステムの潜在的機能性及び最小限の一組の成分が評価される。一部の実施形態において、手動でのレビューにはタンパク質クラスターの図解表現が役立ち得るとともに、これは、ペアワイズでの配列類似性、系統樹、供給源生物／環境、予測される機能性ドメイン、及び遺伝子座構造の図解描写を含む情報を含み得る。一部の実施形態において、遺伝子座構造の図解描写は、高い代表性を有する近隣タンパク質ファミリーをフィルタリングし得る。一部の実施形態において、代表性は、含んでいる１つ又は複数の大域的クラスターの１つ又は複数のサイズに対する関連する近隣タンパク質の数の比によって計算されてもよい。特定の例示的実施形態において、タンパク質クラスターの図解表現は、天然に存在する遺伝子座のＣＲＩＳＰＲアレイ構造の描写を含み得る。一部の実施形態において、タンパク質クラスターの図解表現は、推定ＣＲＩＳＰＲアレイの長さに対する保存されたダイレクトリピートの数、又は推定ＣＲＩＳＰＲアレイの長さに対するユニークなスペーサー配列の数の描写を含み得る。一部の実施形態において、タンパク質クラスターの図解表現は、ＣＲＩＳＰＲアレイとの推定エフェクターの様々な共出現メトリックの描写を含み、新規ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを予測し、及びその成分を同定し得る。
ＣＬＵＳＴ．２００９１６のプール型スクリーニング
本明細書で同定された、エンジニアリングされたＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性、メカニズム、及び機能パラメータを効率的に検証するために、実施例２で説明されるように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるプール型スクリーニングアプローチを使用した。第一に、ＣＲＩＳＴ．２００９１６ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの保存タンパク質及び非コードエレメントの計算的同定から、ＤＮＡ合成及び分子クローニングを用いて個別の成分を単一の人工発現ベクター（一実施形態ではｐＥＴ－２８ａ＋骨格をベースとする）にアセンブルする。第２の実施形態では、エフェクター及び非コードエレメントをｍＲＮＡ転写物に転写し、異なるリボソーム結合部位を用いて個々のエフェクターを翻訳する。
第二に、天然のｃｒＲＮＡ及びターゲティングスペーサーを、第２のプラスミドｐＡＣＹＣ１８４を標的化する非天然スペーサーを含むプロセシングされていないｃｒＲＮＡのライブラリに置き換える。このｃｒＲＮＡライブラリをエフェクター及び非コードエレメントを含むベクター骨格（例えばｐＥＴ－２８ａ＋）にクローニングし、その後、続いてこのライブラリをｐＡＣＹＣ１８４プラスミド標的と共に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換する。結果的に、得られる各大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、ただ１つのターゲティングアレイを含む。代替的実施形態では、非天然スペーサーを含むプロセシングされていないｃｒＲＮＡのライブラリが、Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．２：２００６．０００８；及びＧｅｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５（１９）：５６７３－８４（これらの各々の内容全体は参照により本明細書に援用される）に記載されるものなどの資料から引用される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）必須遺伝子を更に標的化する。この実施形態において、必須遺伝子機能を破壊する新規ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの正の標的化された活性は、細胞死又は成長停止を生じさせる。一部の実施形態において、必須遺伝子ターゲティングスペーサーをｐＡＣＹＣ１８４標的と組み合わせることができる。
第三に、抗生物質選択下で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を成長させる。一実施形態において、三重抗生物質選択：エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲエフェクターシステムを含むｐＥＴ－２８ａ＋ベクターの形質転換の成功を確認するためのカナマイシン、並びにｐＡＣＹＣ１８４標的ベクターの同時形質転換の成功を確認するためのクロラムフェニコール及びテトラサイクリンが用いられる。ｐＡＣＹＣ１８４は通常、クロラムフェニコール及びテトラサイクリンに対する耐性を付与するため、抗生物質選択下では、このプラスミドを標的化する新規ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの正の活性により、エフェクター、非コードエレメント、及びｃｒＲＮＡライブラリの特異的活性エレメントを活性に発現する細胞が排除されることになる。典型的には、生存細胞の集団は、形質転換の１２～１４時間後に分析される。一部の実施形態において、生存細胞の分析は、形質転換後６～８時間、形質転換後８～１２時間、形質転換後最大２４時間、又は形質転換後２４時間を超えて、行われる。早い時点と比較した後の時点における生存細胞集団を調べると、不活性ｃｒＲＮＡと比較してシグナルの枯渇が生じる。
一部の実施形態において、二重抗生物質選択が用いられる。クロラムフェニコール又はテトラサイクリンのいずれかを抜き取って選択圧を除去すると、ターゲティング基質、配列特異性、及び効力に関する新規情報を得ることができる。例えば、選択された遺伝子又は選択されていない遺伝子におけるｄｓＤＮＡの切断により、選択された遺伝子及び選択されていない遺伝子の両方の枯渇が観察される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるネガティブ選択が生じ得る。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが転写又は翻訳に干渉する場合（例えば、結合又は転写物の切断によって）、選択は、選択されていない耐性遺伝子というよりむしろ、選択された耐性遺伝子の標的に対してのみ観察される。
一部の実施形態では、カナマイシンのみを使用して、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含むｐＥＴ－２８ａ＋ベクターの形質転換の成功が確認される。この実施形態は、成長の変化を観察するためにカナマイシン以外の更なる選択が必要ないため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）必須遺伝子を標的化するスペーサーを含むライブラリに好適である。この実施形態では、クロラムフェニコール及びテトラサイクリン依存性が取り除かれ、ライブラリ中のそれらの標的（存在する場合）が、ターゲティング基質、配列特異性、及び効力に関するネガティブ又はポジティブの更なる情報源を提供する。
ｐＡＣＹＣ１８４プラスミドは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性に影響を及ぼし得る多様な一組の特徴及び配列を含むため、プール型スクリーンからの活性ｃｒＲＮＡをｐＡＣＹＣ１８４にマッピングすることにより、種々の活性機構及び機能パラメータを示唆するものであり得る活性パターンが提供される。このようにして、異種原核生物種における新規ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの再構成に必要な特徴をより包括的に試験し、研究することができる。
本明細書に記載されるインビボプール型スクリーンの重要な利点としては、以下が挙げられる：
（１）汎用性－プラスミド設計により、複数のエフェクター及び／又は非コードエレメントを発現させることが可能になる；ライブラリクローニング戦略により、計算的に予測されたｃｒＲＮＡの両方の転写方向の発現が実現する；
（２）活性機構及び機能パラメータの包括的試験により、核酸切断を含めた多様な干渉機構を評価し；転写、プラスミドＤＮＡ複製などの特徴の共出現；及びｃｒＲＮＡライブラリについてのフランキング配列を調べて、４Ｎの複雑さ等価のＰＡＭを確実に決定することができる；
（３）感度－ｐＡＣＹＣ１８４は低コピープラスミドであり、僅かな干渉率であっても、プラスミドによってコードされる抗生物質耐性を除去することができるため、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ活性について高感度を実現する；及び
（４）効率－ＲＮＡシーケンシングについてより高い速度及びスループットを実現する最適化された分子生物学ステップは、タンパク質発現試料をスクリーンにおける生存細胞から直接採取することができる。
このインビボプール型スクリーンを用いてその作動可能なエレメント、機構及びパラメータ、並びにその内因性細胞環境の外部でエンジニアリングされたシステムにおいて活性であり再プログラム化されるその能力を評価することにより、本明細書に記載される新規ＣＲＩＳＴ．２００９１６ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓファミリーを評価した。
ＣＲＩＳＰＲエフェクターの活性及び修飾
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＴ．２００９１６のＣＲＩＳＰＲエフェクター及びＲＮＡガイドは、他の成分を含み得る二元複合体を形成する。二元複合体は、ＲＮＡガイド中のスペーサー配列に相補的な核酸基質（即ち、配列特異的基質又は標的核酸）への結合時に活性化される。一部の実施形態において、配列特異的基質は二本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態において、配列特異的基質は一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態において、配列特異的基質は一本鎖ＲＮＡである。一部の実施形態において、配列特異的基質は二本鎖ＲＮＡである。一部の実施形態において、配列特異性は、ＲＮＡガイド（例えば、ｃｒＲＮＡ）中のスペーサー配列と標的基質の完全な一致を必要とする。他の実施形態において、配列特異性は、ＲＮＡガイド（例えば、ｃｒＲＮＡ）中のスペーサー配列と標的基質の部分的な（連続的又は非連続的な）一致を必要とする。
一部の実施形態において、二元複合体は標的基質への結合時に活性化した状態になる。一部の実施形態において、活性化した複合体は、「複数回の代謝回転」活性を呈し、従って標的基質への作用時（例えば、それの切断時）、活性化した複合体は活性化した状態のままである。一部の実施形態において、活性化した二元複合体は「単回の代謝回転」活性を呈し、従って標的基質への作用時、二元複合体は不活性状態に戻る。一部の実施形態において、活性化した二元複合体は非特異的な（即ち、「コラテラル」）切断活性を呈し、従って複合体は非標的核酸を切断する。一部の実施形態において、非標的核酸は、ＤＮＡ分子（例えば、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ）である。一部の実施形態において、非標的核酸は、ＲＮＡ分子（例えば、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ）である。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲエフェクターは、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグ、又はｍｙｃタグを含めた１つ以上のペプチドタグに融合することができる。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲエフェクターは、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質又は黄色蛍光タンパク質）など、検出可能部分に融合することができる。一部の実施形態において、本開示のＣＲＩＳＰＲエフェクター及び／又はアクセサリータンパク質は、タンパク質を組織、細胞、又は細胞の領域に侵入又は局在化させるペプチド又は非ペプチド部分に融合される。例えば、本開示のＣＲＩＳＰＲエフェクターは、ＳＶ４０（シミアンウイルス４０）ＮＬＳ、ｃ－Ｍｙｃ ＮＬＳ、又は他の好適な単節型ＮＬＳなどの核局在化配列（ＮＬＳ）を含んでもよい。ＮＬＳは、ＣＲＩＳＰＲエフェクターのＮ末端及び／又はＣ末端に融合されてもよく、且つ単独で融合されても（即ち、単一のＮＬＳ）、又はコンカテマー化されてもよい（例えば、２、３、４個等のＮＬＳの鎖）。
一部の実施形態において、少なくとも１つの核外輸送シグナル（ＮＥＳ）が、ＣＲＩＳＰＲエフェクターをコードする核酸配列に取り付けられている。一部の実施形態において、Ｃ末端及び／又はＮ末端ＮＬＳ又はＮＥＳは、真核細胞、例えばヒト細胞における最適な発現及び核ターゲティングのために取り付けられる。
ＣＲＩＳＰＲエフェクターにタグが融合される実施形態において、かかるタグは、例えば、液体クロマトグラフィー又は固定化したアフィニティー若しくはイオン交換試薬を利用するビーズ分離による、ＣＲＩＳＰＲエフェクターの親和性ベース又は電荷ベースの精製を促進し得る。非限定的な例として、本開示の組換えＣＲＩＳＰＲエフェクターはポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグを含み、精製のため、固定化された金属イオンを含むクロマトグラフィーカラムにロードされる（例えば、樹脂上に固定化されたキレートリガンドによってキレートされたＺｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋イオン、この樹脂は、個々に調製された樹脂又は市販の樹脂若しくはＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓによって商品化されているＨｉｓＴｒａｐ ＦＦカラムなどの既製のカラムであってもよい。ローディングステップの後、カラムは任意選択で、例えば１つ以上の好適な緩衝溶液を使用してリンスされ、次にＨｉｓタグが付加されたタンパク質が好適な溶出緩衝液を使用して溶出される。それに代えて又は加えて、本開示の組換えＣＲＩＳＰＲエフェクターがＦＬＡＧタグを利用する場合、かかるタンパク質は、本業界で公知の免疫沈降法を用いて精製されてもよい。タグが付加された本開示のＣＲＩＳＰＲエフェクター又はアクセサリータンパク質について他の好適な精製方法が当業者には明らかであろう。
本明細書に記載されるタンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲエフェクター又はアクセサリータンパク質）は、核酸分子又はポリペプチドのいずれとしても送達又は使用することができる。核酸分子を使用する場合、ＣＲＩＳＰＲエフェクターをコードする核酸分子をコドン最適化することができる。核酸は、任意の目的の生物、詳細にはヒト細胞又は細菌での使用にコドン最適化することができる。例えば、核酸は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、又は非ヒト霊長類を含めた任意の非ヒト真核生物向けにコドン最適化することができる。コドン使用表が、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で利用可能な「コドン使用データベース（Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ）」において容易に利用可能であり、これらの表を幾つもの方法で適合させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）（全体として参照により本明細書に援用される）を参照のこと。特定の配列を特定の宿主細胞での発現にコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムもまた、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）など、利用可能である。
一部の例では、真核生物（例えば、ヒト、又は他の哺乳類細胞）細胞で発現させるためのＣＲＩＳＰＲエフェクターをコードする本開示の核酸は、１つ以上のイントロン、即ち、第１の端部（例えば、５’末端）にスプライスドナー配列を含み、且つ第２の端部（例えば、３’末端）にスプライスアクセプター配列を含む１つ以上の非コード配列を含む。本開示の様々な実施形態において、限定なしに、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）イントロン、β－グロビンイントロン、及び合成イントロンを含め、任意の好適なスプライスドナー／スプライスアクセプターを使用することができる。それに代えて又は加えて、ＣＲＩＳＰＲエフェクター又はアクセサリータンパク質をコードする本開示の核酸は、ＤＮＡコード配列の３’末端に、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの転写終結シグナルを含み得る。一部の例では、ポリＡシグナルは、ＳＶ４０イントロンなどのイントロンにごく近接して、又はそれに隣接して位置する。
非活性化／不活性化ＣＲＩＳＰＲエフェクター
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲエフェクターが、減少したヌクレアーゼ活性、例えば、野生型ＣＲＩＳＰＲエフェクターと比較したとき少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％のヌクレアーゼ不活性化となるようにＣＲＩＳＰＲ酵素を修飾することができる。ヌクレアーゼ活性は、当技術分野で周知の幾つかの方法、例えば、タンパク質のヌクレアーゼドメインへの突然変異の導入によって減少させることができる。一部の実施形態において、ヌクレアーゼ活性の触媒残基が同定され、それらのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基（例えば、グリシン又はアラニン）に置換することによりヌクレアーゼ活性を減少させてもよい。
不活性化されたＣＲＩＳＰＲエフェクターは、１つ以上の機能的ドメインを含むか、又はそれと関連づけられ得る（例えば、融合タンパク質、リンカーペプチド、「ＧＳ」リンカーなどを介して）。こうした機能性ドメインは様々な活性、例えば、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、核酸結合活性、及びスイッチ活性（例えば、光誘導性）を有することができる。一部の実施形態において、機能性ドメインは、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）、ＶＰ６４、ＶＰ１６、Ｆｏｋ１、Ｐ６５、ＨＳＦ１、ＭｙｏＤ１、及びビオチン－ＡＰＥＸである。
不活性化されたＣＲＩＳＰＲエフェクター上に１つ以上の機能性ドメインを位置させることは、その機能性ドメインが帰属する機能的効果による影響を標的に及ぼすのに正しい空間上の向きとなることを可能にする。例えば、機能性ドメインが転写活性化因子（例えば、ＶＰ１６、ＶＰ６４、又はｐ６５）である場合、その転写活性化因子は、それが標的の転写に影響を及ぼすことが可能になる空間上の向きに置かれる。同様に、転写リプレッサーが標的の転写に影響を及ぼすように位置し、及びヌクレアーゼ（例えば、Ｆｏｋ１）が標的を切断又は部分的に切断するように位置する。一部の実施形態において、機能性ドメインはＣＲＩＳＰＲエフェクターのＮ末端に位置する。一部の実施形態において、機能性ドメインはＣＲＩＳＰＲエフェクターのＣ末端に位置する。一部の実施形態において、不活性化されたＣＲＩＳＰＲエフェクターは、Ｎ末端に第１の機能性ドメイン及びＣ末端に第２の機能性ドメインを含むように修飾される。
スプリット酵素
本開示はまた、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲエフェクターのスプリットバージョンも提供する。スプリットバージョンのＣＲＩＳＰＲエフェクターは送達に有利であり得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは酵素の２つの部分に分割され、それらが一緒になって実質的に機能性のＣＲＩＳＰＲエフェクターを含む。
分割は、１つ又は複数の触媒ドメインが影響を受けないような方法で行われ得る。ＣＲＩＳＰＲエフェクターはヌクレアーゼとして機能してもよく、又は本質的に（例えば、その触媒ドメインにある１つ又は複数の突然変異に起因して）触媒活性がごく僅かしかない又は全くないＲＮＡ結合タンパク質である不活性化された酵素であってもよい。
一部の実施形態では、ヌクレアーゼローブ及びα－ヘリックスローブが別個のポリペプチドとして発現する。これらのローブはそれ自体には相互作用を及ぼさないが、ＲＮＡガイドがそれらを複合体へと動員し、その複合体が完全長ＣＲＩＳＰＲエフェクターの活性を再現し、部位特異的ＤＮＡ切断を触媒する。修飾されたＲＮＡガイドを使用すると、二量化が妨げられることによりスプリット酵素活性が無効になり、誘導性の二量化システムの開発が可能となる。スプリット酵素については、例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．“Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａ ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１１２．１０（２０１５）：２９８４－２９８９（全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。
一部の実施形態において、スプリット酵素は、例えばラパマイシン感受性二量化ドメインを利用することにより、二量化パートナーに融合されてもよい。これにより、ＣＲＩＳＰＲエフェクター活性を時間的に制御するための化学誘導性ＣＲＩＳＰＲエフェクターの作成が可能になる。このようにして２つの断片に分割されていることによりＣＲＩＳＰＲエフェクターを化学誘導性にすることができ、ＣＲＩＳＰＲエフェクターの制御された再アセンブルにはラパマイシン感受性二量化ドメインを使用することができる。
分割点は、典型的にはインシリコで設計され、コンストラクトにクローニングされる。この過程でスプリット酵素に突然変異が導入されてもよく、非機能性ドメインが除去されてもよい。一部の実施形態において、スプリットＣＲＩＳＰＲエフェクターの２つの部分又は断片（即ち、Ｎ末端及びＣ末端断片）は、例えば野生型ＣＲＩＳＰＲエフェクターの配列の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％を含む完全なＣＲＩＳＰＲエフェクターを形成することができる。
自己活性化型又は不活性化型酵素
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲエフェクターは、自己活性化型又は自己不活性化型であるように設計されてもよい。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは自己不活性化型である。例えば、ＣＲＩＳＰＲエフェクターをコードするコンストラクトに標的配列を導入することができる。従ってＣＲＩＳＰＲエフェクターが標的配列を切断するとともに、それによって酵素をコードするコンストラクトがその発現を自己不活性化し得る。自己不活性化ＣＲＩＳＰＲシステムの構築方法については、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ Ｓｅｌｆ－Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２４（２０１６）：Ｓ５０（全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。
一部の他の実施形態では、弱いプロモーター（例えば、７ＳＫプロモーター）の制御下で発現する更なるＲＮＡガイドが、ＣＲＩＳＰＲエフェクターをコードする核酸配列を標的化して、その発現を（例えば、核酸の転写及び／又は翻訳を妨げることにより）妨げ及び／又は阻止することができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクターと、ＲＮＡガイドと、ＣＲＩＳＰＲエフェクターをコードする核酸を標的化するＲＮＡガイドとを発現するベクターを細胞にトランスフェクトすると、ＣＲＩＳＰＲエフェクターをコードする核酸の効率的な破壊につながり、ＣＲＩＳＰＲエフェクターレベルを低下させることができ、従ってゲノム編集活性を制限することができる。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクターのゲノム編集活性は、哺乳類細胞における内因性ＲＮＡシグネチャ（例えば、ｍｉＲＮＡ）を通じて調節することができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクターをコードするｍＲＮＡの５’－ＵＴＲにｍｉＲＮＡ相補配列を用いることにより、ＣＲＩＳＰＲエフェクタースイッチを作ることができる。このスイッチは、標的細胞中のｍｉＲＮＡに選択的且つ効率的に応答する。従って、このスイッチは、異種細胞集団内で内因性ｍｉＲＮＡ活性を感知することによりゲノム編集を差次的に制御し得る。従って、このスイッチシステムは、細胞内ｍｉＲＮＡ情報に基づく細胞型選択的なゲノム編集及び細胞エンジニアリングのフレームワークを提供し得る（Ｈｉｒｏｓａｗａ ｅｔ ａｌ．“Ｃｅｌｌ－ｔｙｐｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｗｉｔｃｈ，”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１７ Ｊｕｌ ２７；４５（１３）：ｅ１１８）。
誘導性ＣＲＩＳＰＲエフェクター
ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、誘導性、例えば、光誘導性又は化学誘導性であってもよい。この機構により、ＣＲＩＳＰＲ酵素中の機能性ドメインを活性化させることが可能になる。光誘導能は、当該技術分野において公知の様々な方法により、例えば、スプリットＣＲＩＳＰＲエフェクターにおいてＣＲＹ２ＰＨＲ／ＣＩＢＮ対が用いられる融合複合体を設計することにより実現し得る（例えば、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．“Ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｔｅｓ，”Ｎａｔｕｒｅ，５００．７４６３（２０１３）：４７２を参照のこと）。化学誘導能は、例えば、スプリットＣＲＩＳＰＲエフェクターにおいてＦＫＢＰ／ＦＲＢ（ＦＫ５０６結合タンパク質／ＦＫＢＰラパマイシン結合ドメイン）対が用いられる融合複合体を設計することにより実現し得る。ラパマイシンは融合複合体の形成に必要であり、従ってＣＲＩＳＰＲエフェクターを活性化する（例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．“Ａ ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３３．２（２０１５）：１３９－１４２を参照のこと）。
更に、ＣＲＩＳＰＲエフェクターの発現は、誘導性プロモーター、例えば、テトラサイクリン又はドキシサイクリン制御下での転写活性化（Ｔｅｔ－Ｏｎ及びＴｅｔ－Ｏｆｆ発現システム）、ホルモン誘導性遺伝子発現システム（例えば、エクジソン誘導性遺伝子発現システム）、及びアラビノース誘導性遺伝子発現システムによって調節することができる。ＲＮＡとして送達される場合、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の発現は、小分子様テトラサイクリンを感知することのできるリボスイッチによって調節されてもよい（例えば、Ｇｏｌｄｆｌｅｓｓ ｅｔ ａｌ．“Ｄｉｒｅｃｔ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＲＮＡ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４０．９（２０１２）：ｅ６４－ｅ６４を参照のこと）。
誘導性ＣＲＩＳＰＲエフェクター及び誘導性ＣＲＩＳＰＲシステムの様々な実施形態が、例えば、米国特許第８８７１４４５号明細書、米国特許出願公開第２０１６０２０８２４３号明細書、及び国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）に記載されている。
機能性突然変異
本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲエフェクターに様々な突然変異又は修飾を導入して特異性及び／又はロバスト性を改善することができる。一部の実施形態において、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識するアミノ酸残基が同定される。本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲエフェクターは、例えば、ＰＡＭを認識するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、異なるＰＡＭを認識するように更に修飾されてもよい。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、例えば、５’－ＴＴＮ－３’を認識することができ、ここで、「Ｎ」は任意の核酸塩基である。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲエフェクターは、１つ以上のアミノ酸残基を突然変異させることにより、１つ以上の機能活性が改変され得る。例えば、一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、１つ以上のアミノ酸残基を突然変異させることにより、そのヘリカーゼ活性が改変される。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、１つ以上のアミノ酸残基を突然変異させることにより、そのヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌクレアーゼ活性又はエキソヌクレアーゼ活性）が改変される。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、１つ以上のアミノ酸残基を突然変異させることにより、ＲＮＡガイドと機能的に関連するその能力が改変される。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、１つ以上のアミノ酸残基を突然変異させることにより、標的核酸と機能的に関連するその能力が改変される。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲエフェクターは標的核酸分子の切断能を有する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは標的核酸分子の両方の鎖を切断する。しかしながら、一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、１つ以上のアミノ酸残基を突然変異させることにより、その切断活性が改変される。例えば、一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、ＣＲＩＳＰＲエフェクターが標的核酸を切断する能力を増加させる１つ以上の突然変異を含んでもよい。別の例において、一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、酵素が標的核酸の切断能を有しないものとなる１つ以上の突然変異を含んでもよい。他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、この酵素が標的核酸の鎖の切断能（即ち、ニッカーゼ活性）を有するものとなる１つ以上の突然変異を含んでもよい。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、ＲＮＡガイドがハイブリダイズする鎖に相補的な標的核酸の鎖を切断する能力を有する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、ＲＮＡガイドがハイブリダイズする標的核酸の鎖を切断する能力を有する。
一部の実施形態において、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲエフェクターの１つ以上の残基は、アルギニン部分に変異している。一部の実施形態において、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲエフェクターの１つ以上の残基は、グリシン部分に変異している。一部の実施形態において、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲエフェクターの１つ以上の残基は、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲエフェクターの系統的アラインメントのコンセンサス残基に基づいて変異する。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲエフェクターは、１つ以上の所望の機能活性（例えば、ヌクレアーゼ活性及び機能的にＲＮＡガイドと相互作用する能力）を保持しつつ酵素のサイズを縮小させるため、１つ以上のアミノ酸残基に欠失を含むようにエンジニアリングされてもよい。このトランケート型ＣＲＩＳＰＲエフェクターは有利には、負荷に制限のある送達システムとの組み合わせで用いられてもよい。
一態様において、本開示は、図２Ａに示されるドメイン構成を維持しつつ、本明細書に記載される核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）と少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の核酸配列を提供する。別の態様において、本開示はまた、図２Ａに示されるドメイン構成を維持しつつ、本明細書に記載されるアミノ酸配列と少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列も提供する。
一部の実施形態において、核酸配列は、本明細書に記載される配列と同じである一部分（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ヌクレオチド、例えば、連続又は非連続ヌクレオチド）を少なくとも有する。一部の実施形態において、核酸配列は、本明細書に記載される配列と異なる一部分（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ヌクレオチド、例えば、連続又は非連続ヌクレオチド）を少なくとも有する。
一部の実施形態において、アミノ酸配列は、本明細書に記載される配列と同じである一部分（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００アミノ酸残基、例えば、連続又は非連続アミノ酸残基）を少なくとも有する。一部の実施形態において、アミノ酸配列は、本明細書に記載される配列と異なる一部分（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００アミノ酸残基、例えば、連続又は非連続アミノ酸残基）を少なくとも有する。
２つのアミノ酸配列、又は２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するには、それらの配列が最適な比較を目的としてアラインメントされる（例えば、最適なアラインメントとなるように第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方にギャップが導入されてもよく、及び比較を目的として非相同配列が無視されてもよい）。一般に、比較を目的としてアラインメントされる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも８０％でなければならず、及び一部の実施形態では、参照配列の長さの少なくとも９０％、９５％、又は１００％である。次に、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第１の配列におけるある位置が第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占有されているとき、次にはそれらの分子は当該の位置において同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列を最適にアラインメントするために導入する必要があるギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れた、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である。本開示の目的上、配列の比較及び２つの配列間におけるパーセント同一性の決定は、ギャップペナルティーを１２、ギャップ伸長ペナルティーを４、及ｓびフレームシフトギャップペナルティーを５としたＢｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリング行列を用いて達成することができる。
ＲＮＡガイド及びＲＮＡガイド修飾
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡガイドは、ウラシル（Ｕ）を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡガイドは、チミン（Ｔ）を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡガイドのダイレクトリピート配列は、ウラシル（Ｕ）を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡガイドのダイレクトリピート配列は、チミン（Ｔ）を含む。一部の実施形態において、表３又は８によるダイレクトリピート配列は、表３又は８の対応する配列においてチミンとして示される１つ以上の場所に、ウラシルを含む配列を含む。
一部の実施形態において、ダイレクトリピートは、内因性ＣＲＩＳＰＲアレイにおいて繰り返される配列の１つのコピーのみを含む。一部の実施形態において、ダイレクトリピートは、内因性ＣＲＩＳＰＲアレイに見られる１つ以上のスペーサー配列に隣接する（例えば、フランキング）完全長配列である。一部の実施形態において、ダイレクトリピートは、内因性ＣＲＩＳＰＲアレイに見られる１つ以上のスペーサー配列に隣接する（例えば、フランキング）完全長配列の一部（例えば、プロセシングされた部分）である。
スペーサー長さ
ＲＮＡガイドのスペーサー長さは約１４～５０ヌクレオチドの範囲であってもよい。ＲＮＡガイドのスペーサー長さは約２０～３５ヌクレオチドの範囲であってもよい。一部の実施形態において、ＲＮＡガイドのスペーサー長さは、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１６ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド、少なくとも１９ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２１ヌクレオチド、又は少なくとも２２ヌクレオチドである。一部の実施形態において、スペーサー長さは、１５～１７ヌクレオチド、１５～２３ヌクレオチド、１６～２２ヌクレオチド、１７～２０ヌクレオチド、２０～２４ヌクレオチド（例えば、２０、２１、２２、２３、又は２４ヌクレオチド）、２３～２５ヌクレオチド（例えば、２３、２４、又は２５ヌクレオチド）、２４～２７ヌクレオチド、２７～３０ヌクレオチド、３０～４５ヌクレオチド（例えば、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、又は４５ヌクレオチド）、３０又は３５～４０ヌクレオチド、４１～４５ヌクレオチド、４５～５０ヌクレオチド、又はそれ以上である。本出願の成熟ｃｒＲＮＡに対応する近似スペーサー長を表２に示す。一部の実施形態において、表２で特定されたスペーサー長さは、本出願の成熟ｃｒＲＮＡにとって好ましいスペーサー長さである。一部の実施形態において、本出願のＲＮＡガイド（プレｃｒＲＮＡ又は成熟ｃｒＲＮＡ）のための好ましいスペーサー長さは、約２４ヌクレオチドである。
Figure 2022540153000003
一部の実施形態において、ＲＮＡガイドのダイレクトリピート長さは少なくとも１６ヌクレオチドであり、又は１６～２０ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチド）である。一部の実施形態において、ＲＮＡガイドのダイレクトリピート長さは約２２～３６ヌクレオチドである。例示的な完全長のダイレクトリピート配列（例えば、プレｃｒＲＮＡ又はプロセシングされていないｃｒＲＮＡのダイレクトリピート配列）及び成熟ｃｒＲＮＡのダイレクトリピート配列（例えば、プロセシングされたｃｒＲＮＡのダイレクトリピート配列）を表３に示す。表８も参照されたい。
Figure 2022540153000004
本明細書で使用されるとき、用語「プロトスペーサー隣接モチーフ」又は「ＰＡＭ」は、エフェクター及びＲＮＡガイドを含む複合体が結合する標的配列に隣接するＤＮＡ配列を指す。一部の実施形態において、酵素活性のためにＰＡＭが必要である。本明細書で使用されるとき、用語「隣接」は、複合体のＲＮＡガイドが、ＰＡＭに直接隣接する標的配列に特異的に結合、相互作用、又は会合する場合を含む。このような場合、標的配列とＰＡＭの間にヌクレオチドは存在しない。用語「隣接」はまた、標的化部分が結合する標的配列とＰＡＭとの間に少数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ）のヌクレオチドが存在する場合を含む。一部の実施形態において、本出願のエフェクターに対応するＰＡＭは、表４に示される。本明細書で使用されるとき、Ｎはそれぞれ、任意のヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣ）又はそのサブセット（例えば、Ｙ（Ｃ又はＴ）、Ｋ（Ｇ又はＴ）、Ｂ（Ｇ、Ｔ、又はＣ）、Ｈ（Ａ、Ｃ、又はＴ）であり得る。例えば、一部の実施形態において、５’－ＴＴＮ－３’のＰＡＭ配列は、５’－ＴＴＴ－３’又は５’－ＴＴＧ－３’のＰＡＭ配列を指す。
Figure 2022540153000005
一部の実施形態において、ＲＮＡガイドは、ｔｒａｃｒＲＮＡを更に含む。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡは必要でない（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡは任意選択である）。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡは、表９に示される非コード配列の一部である。例えば、一部の実施形態において、任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡは、表５の配列である。
Figure 2022540153000006
Figure 2022540153000007
ＲＮＡガイド配列は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成及び標的への結合の成功は許容するが、同時にヌクレアーゼ活性の成功は許容しない（即ち、ヌクレアーゼ活性のない／インデルを生じさせない）ような方法で修飾されてもよい。こうした修飾ガイド配列は、「デッドガイド」又は「デッドガイド配列」と称される。こうしたデッドガイド又はデッドガイド配列はヌクレアーゼ活性の点で触媒的に不活性又はコンホメーション的に不活性であってもよい。デッドガイド配列は、典型的には、活性な切断を生じるそれぞれのガイド配列よりも短い。一部の実施形態において、デッドガイドは、ヌクレアーゼ活性を有するそれぞれのガイドＲＮＡと比べて５％、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％短い。ＲＮＡガイドのデッドガイド配列は、１３～１５ヌクレオチド長（例えば、１３、１４、又は１５ヌクレオチド長）、１５～１９ヌクレオチド長、又は１７～１８ヌクレオチド長（例えば、１７ヌクレオチド長）であってもよい。
従って、一態様において、本開示は、本明細書に記載されるとおりの機能性ＣＬＵＳＴ．２００９１６ＣＲＩＳＰＲエフェクターと、ＲＮＡガイドとを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲシステムを提供し、ここでＲＮＡガイドはデッドガイド配列を含み、従ってＲＮＡガイドは、検出可能な切断活性なしにＣＲＩＳＰＲシステムが細胞の目的のゲノム遺伝子座に向けられるような標的配列へのハイブリダイズ能を有する。
デッドガイドの詳細な説明は、例えば、国際公開第２０１６０９４８７２号パンフレット（全体として参照により本明細書に援用される）に記載される。
誘導性ＲＮＡガイド
ＲＮＡガイドは、誘導性システムの成分として作成することができる。このシステムの誘導可能な性質により、遺伝子編集又は遺伝子発現の時空間的制御が可能となる。一部の実施形態において、誘導性システムの刺激としては、例えば、電磁放射線、音響エネルギー、化学エネルギー、及び／又は熱エネルギーが挙げられる。
一部の実施形態において、ＲＮＡガイドの転写は、誘導性プロモーター、例えば、テトラサイクリン又はドキシサイクリン制御下での転写活性化（Ｔｅｔ－Ｏｎ及びＴｅｔ－Ｏｆｆ発現システム）、ホルモン誘導性遺伝子発現システム（例えば、エクジソン誘導性遺伝子発現システム）、及びアラビノース誘導性遺伝子発現システムによって調節することができる。誘導性システムの他の例としては、例えば、小分子２ハイブリッド転写活性化システム（ＦＫＢＰ、ＡＢＡ等）、光誘導性システム（フィトクロム、ＬＯＶドメイン、又はクリプトクロム）、又は光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）が挙げられる。これらの誘導性システムは、例えば、国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット及び米国特許第８７９５９６５号明細書（これらはそれぞれ全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。
化学修飾
ガイドＲＮＡのリン酸骨格、糖、及び／又は塩基に化学修飾を適用することができる。ホスホロチオエートなどの骨格修飾はリン酸骨格上の電荷を修飾し、オリゴヌクレオチドの送達及びヌクレアーゼ耐性に役立つ（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，“Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ，ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ．，２４（２０１４），ｐｐ．３７４－３８７を参照のこと）；２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｆ、及びロックド核酸（ＬＮＡ）などの糖修飾は、塩基対合及びヌクレアーゼ耐性の両方を亢進させる（例えば、Ａｌｌｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．“Ｆｕｌｌｙ ２‘－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｕｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ，”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４８．４（２００５）：９０１－９０４を参照のこと）。化学修飾塩基、とりわけ２－チオウリジン又はＮ６－メチルアデノシンなどは、より強い塩基対合又はより弱い塩基対合のいずれも可能にすることができる（例えば、Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ－ｇｒａｄｅ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ ｂｙ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”Ｆｒｏｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０１２ Ａｕｇ ２０；３：１５４を参照のこと）。加えて、ＲＮＡは、蛍光色素、ポリエチレングリコール、又はタンパク質を含めた種々の機能性部分との５’末端及び３’末端の両方のコンジュゲーションに適している。
化学的に合成されるＲＮＡガイド分子には、幅広い種類の修飾を適用することができる。例えば、オリゴヌクレオチドを２’－ＯＭｅで修飾してヌクレアーゼ耐性を改善すると、ワトソン・クリック塩基対合の結合エネルギーを変化させることができる。更には、２’－ＯＭｅ修飾は、オリゴヌクレオチドがトランスフェクション試薬、タンパク質又は細胞中の任意の他の分子とどのように相互作用するかに影響を及ぼし得る。これらの修飾の効果は経験的試験によって決定することができる。
一部の実施形態において、ＲＮＡガイドは１つ以上のホスホロチオエート修飾を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡガイドは、塩基対合を亢進させること及び／又はヌクレアーゼ耐性を増加させることを目的として１つ以上のロックド核酸を含む。
これらの化学修飾の概要については、例えば、Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ，”Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６ Ｓｅｐ １０；２３３：７４－８３；国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット；及び米国特許第８７９５９６５号明細書（この各々が全体として参照により援用される）を参照することができる。
配列修飾
本明細書に記載されるＲＮＡガイド、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡの配列及び長さは最適化することができる。一部の実施形態において、ＲＮＡガイドの最適化された長さは、プロセシングされた形態のｔｒａｃｒＲＮＡ及び／若しくはｃｒＲＮＡを同定することによるか、又はｃｒＲＮＡのＲＮＡガイドについての経験的な長さ研究によって決定されてもよい。
ＲＮＡガイドはまた、１つ以上のアプタマー配列も含むことができる。アプタマーは、特異的な標的分子に結合することのできるオリゴヌクレオチド又はペプチド分子である。アプタマーは、遺伝子エフェクター、遺伝子アクチベーター、又は遺伝子リプレッサーに特異的であってもよい。一部の実施形態において、アプタマーはタンパク質に特異的であり、次にはそのタンパク質が特異的遺伝子エフェクター、遺伝子アクチベーター、又は遺伝子リプレッサーに特異的であって、それを動員し／それに結合するものであってもよい。エフェクター、アクチベーター、又はリプレッサーは融合タンパク質の形態で存在することができる。一部の実施形態において、ＲＮＡガイドは、同じアダプタータンパク質に特異的な２つ以上のアプタマー配列を有する。一部の実施形態において、２つ以上のアプタマー配列は異なるアダプタータンパク質に特異的である。アダプタータンパク質としては、例えば、ＭＳ２、ＰＰ７、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ、及びＰＲＲ１を挙げることができる。従って、一部の実施形態において、アプタマーは、本明細書に記載されるとおりのアダプタータンパク質のうちのいずれか１つに特異的に結合する結合タンパク質から選択される。一部の実施形態において、アプタマー配列はＭＳ２ループである。アプタマーの詳細な説明については、例えば、Ｎｏｗａｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｃａｓ９ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ，”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２０１６ Ｎｏｖ １６；４４（２０）：９５５５－９５６４；及び国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット（これらはそれぞれ全体として参照により本明細書に援用される）を参照することができる。
ガイド：標的配列一致要件
ＣＲＩＳＰＲシステムでは、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、又は１００％であってもよい。オフターゲット相互作用を減少させるため、例えば、相補性が低い標的配列と相互作用するガイドを減少させるため、ＣＲＩＳＰＲシステムに突然変異を導入して、ＣＲＩＳＰＲシステムが標的配列と、８０％、８５％、９０％、又は９５％より高い相補性を有するオフターゲット配列との間を区別できるようにしてもよい。一部の実施形態において、相補性の程度は、８０％～９５％、例えば、約８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は９５％である（例えば、１８ヌクレオチドを有する標的と、１、２、又は３個のミスマッチを有する１８ヌクレオチドのオフターゲットとの間を区別する）。従って、一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、９４．５％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、又は９９．９％より高い。一部の実施形態において、相補性の程度は１００％である。
当該分野では、機能性となるのに十分な相補性があるならば、完全な相補性は要件とならないことが公知である。スペーサー／標的に沿ったミスマッチの位置を含め、スペーサー配列と標的配列との間へのミスマッチ、例えば１個以上のミスマッチ、例えば１又は２個のミスマッチの導入により、切断効率の調節を生かすことができる。典型的には、ミスマッチ、例えば二重ミスマッチが中心寄りに位置するほど（即ち、３’末端又は５’末端にあるのでない）；切断効率がより大きい影響を受ける。従って、スペーサー配列に沿ったミスマッチ位置の選択により、切断効率を調節することができる。例えば、標的の１００％未満の切断が（例えば、細胞集団中で）所望される場合、スペーサー配列にスペーサーと標的配列との間の１又は２個のミスマッチを導入してもよい。
ＣＲＩＳＰＲシステムの使用方法
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムには、非常に多数の細胞型における標的ポリヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、転位、不活性化、又は活性化）を含め、多種多様な有用性がある。このＣＲＩＳＰＲシステムは、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ検出（例えば、特異的高感度酵素レポーターアンロッキング（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｌｏｃｋｉｎｇ：ＳＨＥＲＬＯＣＫ））、核酸の追跡及び標識、エンリッチメントアッセイ（バックグラウンドからの所望の配列の抽出）、循環腫瘍ＤＮＡの検出、次世代ライブラリの調製、薬物スクリーニング、疾患診断及び予後判定、及び様々な遺伝的障害の治療において、幅広い範囲にわたる適用を有する。
ＤＮＡ／ＲＮＡ検出
一態様において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、ＤＮＡ／ＲＮＡ検出において使用することができる。シングルエフェクターＲＮＡ誘導型ＤＮアーゼをＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）で再プログラム化することにより、特異的一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）センシング用のプラットフォームがもたらされ得る。そのＤＮＡ標的の認識時、活性化したＶ型単一エフェクターＤＮＡガイドＤＮａｓｅは、近隣非標的ｓｓＤＮＡの「コラテラル」切断に関与する。このｃｒＲＮＡによってプログラム化されるコラテラル切断活性により、ＣＲＩＳＰＲシステムが特異的ＤＮＡの存在を標識ｓｓＤＮＡの非特異的分解によって検出することが可能となる。
ＤＮＡ検出適用においては、コラテラルｓｓＤＮＡ活性をレポーターと組み合わせることができ、例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ標的化ＣＲＩＳＰＲトランスレポーター（ＤＮＡ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｔａｒｇｅｔｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ｔｒａｎｓ ｒｅｐｏｒｔｅｒ：ＤＥＴＥＣＴＲ）法と呼ばれる方法などであり、これは、アトモル濃度のＤＮＡ検出感度を実現する（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６０（６３８７）：４３６－４３９，２０１８を参照のこと）（これは全体として参照により本明細書に援用される）。本明細書に記載される酵素を使用する一つの適用は、インビトロ環境における非特異的ｓｓＤＮＡの分解である。フルオロフォア及び消光剤に連結した「レポーター」ｓｓＤＮＡ分子もまた、未知のＤＮＡ試料（一本鎖又は二本鎖のいずれか）と共にこのインビトロシステムに加えることができる。未知のＤＮＡ片中に標的配列を認識すると、このエフェクター複合体がレポーターｓｓＤＮＡを切断し、蛍光リードアウトが生じる。
他の実施形態において、ＳＨＥＲＬＯＣＫ法（特異的高感度酵素レポーターアンロッキング（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ＵｎＬＯＣＫｉｎｇ））もまた、核酸増幅及びレポーターｓｓＤＮＡのコラテラル切断に基づいたアトモル濃度（又は単一分子）感度のインビトロ核酸検出プラットフォームを提供し、標的のリアルタイム検出を可能にする。ＳＨＥＲＬＯＣＫにおけるＣＲＩＳＰＲの使用方法については、例えば、Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．“Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２，”Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５６（６３３６）：４３８－４４２（２０１７）（これは全体として参照により本明細書に援用される）に詳細に記載される。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、マルチプレックス化したエラーロバストな蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｅｒｒｏｒ－ｒｏｂｕｓｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＭＥＲＦＩＳＨ）において使用することができる。こうした方法については、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｐａｔｉａｌｌｙ ｒｅｓｏｌｖｅｄ，ｈｉｇｈｌｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ＲＮＡ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１５ Ａｐｒ ２４；３４８（６２３３）：ａａａ６０９０（これは全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。
核酸の追跡及び標識
細胞過程は、タンパク質、ＲＮＡ、及びＤＮＡの間での分子相互作用網に依存する。タンパク質－ＤＮＡ及びタンパク質－ＲＮＡ相互作用の正確な検出は、かかる過程を理解する鍵である。インビトロ近接性標識技法は、レポーター基、例えば光活性化可能な基と組み合わせたアフィニティータグを用いることにより、インビトロで目的のタンパク質又はＲＮＡの近くにあるポリペプチド及びＲＮＡを標識する。紫外線照射後、光活性化可能な基がタグ付加分子にごく近接したタンパク質及び他の分子と反応し、それによってそれらを標識する。標識された相互作用分子は、続いて回収し、同定することができる。このＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、例えば、プローブを選択のＲＮＡ配列に標的化することができる。こうした適用はまた、動物モデルにおいても疾患又は培養が困難な細胞型のインビボイメージングに適用することができる。核酸の追跡及び標識方法については、例えば、米国特許第８７９５９６５号明細書；国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット；及び国際公開第２０１７０７０６０５号パンフレット（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）に記載されている。
ハイスループットスクリーニング
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）ライブラリの調製に使用することができる。例えば、費用対効果の高いＮＧＳライブラリを作成するため、ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して標的遺伝子のコード配列を破壊することができ、同時に次世代シーケンシングによって（例えば、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ＰＧＭシステムで）、ＣＲＩＳＰＲエフェクターがトランスフェクトされたクローンをスクリーニングすることができる。ＮＧＳライブラリの調製方法に関する詳細な説明については、例えば、Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，”ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１５．１（２０１４）：１００２（これは全体として参照により本明細書に援用される）を参照することができる。
エンジニアリングされた細胞
微生物（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、及び微細藻類）は、合成生物学に広く用いられている。合成生物学の発展には、様々な臨床応用を含め、幅広い有用性がある。例えば、プログラム可能なＣＲＩＳＰＲシステムを使用して、例えば癌関連ＲＮＡを標的転写物として用いる標的化した細胞死のため、毒性ドメインのタンパク質を分割することができる。更に、例えばキナーゼ又は酵素などの適切なエフェクターとの融合複合体により、合成生物系においてタンパク質間相互作用が関わる経路に影響を及ぼすことができる。
一部の実施形態において、ファージ配列を標的化するＲＮＡガイド配列を微生物に導入することができる。従って、本開示はまた、微生物（例えば産生菌株）にファージ感染に対する「ワクチンを接種する」方法も提供する。
一部の実施形態において、本明細書に提供されるＣＲＩＳＰＲシステムを使用して微生物をエンジニアリングすることにより、例えば、収率を改善し又は発酵効率を改善することができる。例えば、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを使用して酵母などの微生物をエンジニアリングすることにより、発酵性糖からバイオ燃料若しくはバイオポリマーを生成し、又は発酵性糖源としての農業廃棄物に由来する植物由来のリグノセルロースを分解することができる。より詳細には、本明細書に記載される方法を使用して、バイオ燃料生産に必要な内因性遺伝子の発現を修飾し、及び／又はバイオ燃料合成を妨げ得る内因性遺伝子を修飾することができる。これらの微生物エンジニアリング方法については、例えば、Ｖｅｒｗａａｌ ｅｔ ａｌ．，“ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ ｅｎａｂｌｅｓ ｆａｓｔ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，”Ｙｅａｓｔ，２０１７ Ｓｅｐ ８．ｄｏｉ：１０．１００２／ｙｅａ．３２７８；及びＨｌａｖｏｖａ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ ｆｏｒ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－ｆｒｏｍ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｔｏ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．，２０１５ Ｎｏｖ １；３３：１１９４－２０３（これらはそれぞれ全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。
一部の実施形態において、本明細書で提供されるＣＲＩＳＰＲシステムは、真核細胞又は真核生物をエンジニアリングするために使用することができる。例えば、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲシステムは、植物細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、爬虫類細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞、寄生虫細胞、節足動物細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、又はヒト細胞に限定されない真核細胞をエンジニアリングするために使用することができる。一部の実施形態において、真核細胞はインビトロ培養物中にある。一部の実施形態において、真核細胞はインビボである。一部の実施形態において、真核細胞はエキソビボである。
遺伝子ドライブ
遺伝子ドライブは、特定の遺伝子又は遺伝子群の遺伝形質に有利な偏りが出る現象である。本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを使用して遺伝子ドライブを構築することができる。例えば、遺伝子の特定のアレルを標的化して破壊することにより、細胞に第２のアレルをコピーさせて配列を固定するようにＣＲＩＳＰＲシステムを設計することができる。このコピーのため、第１のアレルが第２のアレルに変換されることになり、子孫に第２のアレルが遺伝する可能性が高くなる。どのように本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを使用して遺伝子ドライブを構築するかに関する詳細な方法については、例えば、Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇｅｎｅ ｄｒｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｆｅｍａｌｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｌａｒｉａ ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｖｅｃｔｏｒ Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ，”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１６ Ｊａｎ；３４（１）：７８－８３（これは全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。
プール型スクリーニング
本明細書に記載されるとおり、プール型ＣＲＩＳＰＲスクリーニングは、細胞増殖、薬剤耐性、及びウイルス感染などの生物学的機構に関与する遺伝子を同定するための強力なツールである。細胞がバルクで本明細書に記載されるＲＮＡガイドコードベクターのライブラリによって形質導入され、選択的チャレンジの適用前及び適用後にｇＲＮＡの分布が測定される。プール型ＣＲＩＳＰＲスクリーンは、細胞生存及び増殖に影響を及ぼす機構に対して良好に機能し、個々の遺伝子の活性の測定にまで（例えば、エンジニアリングされたレポーター細胞株を使用することにより）拡張することができる。一度に１つの遺伝子のみが標的化されるアレイ化されたＣＲＩＳＰＲスクリーンでは、ＲＮＡ－ｓｅｑをリードアウトとして使用することが可能になる。一部の実施形態において、本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲシステムは単一細胞ＣＲＩＳＰＲスクリーンに使用することができる。プール型ＣＲＩＳＰＲスクリーニングに関する詳細な説明については、例えば、Ｄａｔｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｏｏｌｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｒｅａｄ－ｏｕｔ，”Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，２０１７ Ｍａｒ；１４（３）：２９７－３０１（これは全体として参照により本明細書に援用される）を参照することができる。
飽和突然変異誘発（「バッシング（ｂａｓｈｉｎｇ）」）
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムはインサイチュー飽和突然変異誘発に使用することができる。一部の実施形態では、プール型ＲＮＡガイドライブラリを使用して、特定の遺伝子又は調節エレメントに関するインサイチュー飽和突然変異誘発を実施することができる。かかる方法では、決定的な最小の特徴及びそれらの遺伝子又は調節エレメント（例えば、エンハンサー）の個別的な脆弱性を明らかにすることができる。これらの方法については、例えば、Ｃａｎｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，“ＢＣＬ１１Ａ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎ ｓｉｔｕ ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，”Ｎａｔｕｒｅ，２０１５ Ｎｏｖ １２；５２７（７５７７）：１９２－７（これは全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。
治療上の適用
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを使用して、標的核酸を編集して、標的核酸を修飾することができる（例えば、１つ以上のアミノ酸残基を挿入、欠失、又は変異させることによって）。例えば、一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、望ましい核酸配列を含む外因性ドナー鋳型核酸（例えば、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子）を含む。本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムで誘導される切断イベントの分解時に、細胞の分子機構は、切断イベントを修復及び／又は分解する際に、外因性ドナー鋳型核酸を利用することができる。或いは、細胞の分子機構は、切断イベントを修復及び／又は分解する際に、内因性鋳型を利用することができる。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、挿入、欠失、及び／又は点突然変異を生じる標的核酸を修飾するために使用され得る。一部の実施形態において、挿入は、傷のない挿入である（すなわち、標的核酸への意図された核酸配列の挿入は、切断イベントの分解時に追加の意図されない核酸配列を生じない）。ドナー鋳型核酸は、二本鎖又は一本鎖核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）であってもよい。外因性ドナー鋳型核酸の設計方法については、例えば、国際公開第２０１６０９４８７４号パンフレット（この内容全体が参照により本明細書に明示的に援用される）に記載されている。
別の態様において、本開示は、ＲＮＡ配列特異的干渉；ＲＮＡ配列特異的遺伝子調節；ＲＮＡ、ＲＮＡ産物、ｌｎｃＲＮＡ、非コードＲＮＡ、核ＲＮＡ、又はｍＲＮＡのスクリーニング；突然変異誘発；ＲＮＡスプライシングの阻害；蛍光インサイチュハイブリダイゼーション；育種；細胞休眠の誘導；細胞周期停止の誘導；細胞成長及び／又は細胞増殖の減少；細胞アネルギーの誘導；細胞アポトーシスの誘導；細胞壊死の誘導；細胞死の誘導；又はプログラムされた細胞死の誘導からなる群から選択される方法における本明細書に記載されるシステムの使用を提供する。
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、様々な治療上の適用を有し得る。一部の実施形態において、新規ＣＲＩＳＰＲシステムは、様々な疾患及び障害、例えば、遺伝性障害（例えば、単一遺伝子疾患）又はヌクレアーゼ活性によって治療することができる疾患（例えば、Ｐｃｓｋ９ターゲティング又はＢＣＬ１１ａターゲティング）を治療するために使用することができる。一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、対象、例えば、ヒト患者などの哺乳類の治療に用いられる。哺乳類対象はまた、イヌ、ネコ、ウマ、サル、ウサギ、ラット、マウス、雌ウシ、ヤギ、又はヒツジなど、家畜化された哺乳類であってもよい。
この方法は、病態又は疾患が感染性であることを含んでもよく、ここで感染性病原体は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）、及び単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ２）からなる群から選択される。
一態様において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、ＲＮＡ、毒性ＲＮＡ、及び／又は変異ＲＮＡ（例えば、スプライシング欠陥又はトランケーション）の過剰発現によって引き起こされる疾患を治療するために使用することができる。例えば、有毒なＲＮＡの発現は、核封入体の形成及び脳、心臓、又は骨格筋の遅発性変性変化に関連し得る。一部の実施形態において、障害は筋強直性ジストロフィーである。筋緊張性ジストロフィーにおいて、有毒なＲＮＡの主な病原性効果は、結合タンパク質を隔離し、選択的スプライシングの調節を損なうことである（例えば、Ｏｓｂｏｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡ－ｄｏｍｉｎａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ，” Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２００９ Ａｐｒ １５；１８（８）：１４７１－８１を参照）。筋強直性ジストロフィー（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉａ ｍｙｏｔｏｎｉｃａ（ＤＭ））は、極めて広範囲の臨床的特徴を生じるため、遺伝学者にとって特に興味深いものである。現在ＤＭ１型（ＤＭ１）と呼ばれている古典的な形態のＤＭは、細胞質ゾルプロテインキナーゼをコードする遺伝子であるＤＭＰＫの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）におけるＣＴＧリピートの拡大によって引き起こされる。本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、過剰発現されたＲＮＡ又は毒性ＲＮＡ、例えば、ＤＭＰＫ遺伝子、又はＤＭ１骨格筋、心臓、又は脳において誤調節された選択的スプライシングのいずれかを標的とすることができる。
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、プラダー・ウィリ症候群、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、先天性角化異常症などの様々な疾患を引き起こすＲＮＡ依存性機能に影響を与えるトランス作用性変異を標的とすることもできる。本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを使用して治療できる疾患のリストは、Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ，” Ｃｅｌｌ，１３６．４（２００９）：７７７－７９３及び国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレットに要約される（これらはそれぞれ全体として参照により本明細書に援用される）。
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、例えば、原発性加齢性タウオパチー（ＰＡＲＴ）／神経原線維変化（ＮＦＴ）優勢老人性認知症（アルツハイマー病（ＡＤ）で見られるものと同様のＮＦＴを伴うが、プラークを伴わない）、ボクシング認知症（慢性外傷性脳症）、及び進行性核上性麻痺などの原発性及び続発性タウオパチーを含む、様々なタウオパチーの治療にも使用できる。タウオパチー及びこれらの疾患を治療する方法の有用なリストは、例えば、国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット（本明細書において全体として参照により援用される）に記載されている。
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、スプライシングの欠陥及び疾患を引き起こし得るシス作用性スプライシングコードを破壊する変異を標的化するためにも使用できる。これらの疾患としては、例えば、ＳＭＮ１遺伝子の欠失に起因する運動ニューロン変性疾患（例えば、脊髄性筋萎縮症）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、前頭側頭型認知症、及び第１７染色体に関連するパーキンソニズム（ＦＴＤＰ－１７）、及び嚢胞性線維症が挙げられる。
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、特にＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス活性のために更に使用することができる。エフェクタータンパク質は、ウイルスＲＮＡ配列を標的化するために選択された適切なＲＮＡガイドを使用してウイルスＲＮＡを標的化することができる。
更に、インビトロＲＮＡセンシングアッセイを使用して特定のＲＮＡ基質を検出することができる。ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、生細胞でのＲＮＡベースのセンシングに使用できる。適用例は、例えば、疾患特異的ＲＮＡのセンシングによる診断である。
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムの治療用途の詳細な説明は、例えば、米国特許第８７９５９６５号明細書、欧州特許第３００９５１１号明細書、国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット、及び国際公開第２０１７０７０６０５号パンフレット（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）に見出すことができる。
植物における適用
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、植物において幅広い種類の有用性がある。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して植物のゲノムをエンジニアリングすることができる（例えば、生産を向上させる、所望の翻訳後修飾を有する生産品にする、又は工業製品を生産するための遺伝子を導入する）。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して、植物に所望の形質を（例えば、ゲノムに対する遺伝性修飾を伴い又は伴わず）導入し、又は植物細胞若しくは全植物における内因性遺伝子の発現を調節することができる。
一部の実施形態において、本ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して、特異的タンパク質、例えば、アレルゲンタンパク質（例えば、ピーナッツ、ダイズ、レンズマメ、エンドウマメ、サヤマメ、及びヤエナリ中のアレルゲンタンパク質）をコードする遺伝子を同定、編集、及び／又はサイレンシングすることができる。タンパク質をコードする遺伝子を同定、編集、及び／又はサイレンシングする方法に関する詳細な説明については、例えば、Ｎｉｃｏｌａｏｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｐｅａｎｕｔ ａｎｄ ｌｅｇｕｍｅ ａｌｌｅｒｇｙ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１（３）：２２２－８（２０１１）、及び国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット（これらはそれぞれ全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。
ＣＲＩＳＰＲシステムの送達
本開示及び当技術分野の知識を通じて、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステム、又はその成分、その核酸分子、又はその成分をコードする若しくは提供する核酸分子は、ベクター、例えば、プラスミド、又はウイルス送達ベクターなどの様々な送達システムによって送達することができる。本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲエフェクター及び／又はいずれかのＲＮＡ（例えば、ＲＮＡガイド）は、適切なベクター、例えば、プラスミド、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、及び他のウイルスベクターなどのウイルスベクター、又はそれらの組み合わせを使用して送達することができる。エフェクター及び１つ以上のＲＮＡガイドは、１つ以上のベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターにパッケージングすることができる。
一部の実施形態において、ベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターは、例えば、筋肉内注射、静脈内投与、経皮投与、鼻腔内投与、経口投与、又は粘膜投与によって目的の組織に送達される。かかる送達は、１回用量又は複数回用量のいずれによるものであってもよい。当業者は、本明細書において実際に送達される投薬量が、ベクターの選択、標的細胞、生物、組織、治療対象の全般的な状態、求められる形質転換／修飾の程度、投与経路、投与様式、及び求められる形質転換／修飾の種類を含むがこれらに限定されず、種々の要因に応じて大きく異なり得ることを理解する。
特定の実施形態において、送達は、アデノウイルスによるものであり、これは少なくとも１×１０５粒子（粒子単位、ｐｕとも称される）のアデノウイルスを含有する１回用量におけるものであることができる。一部の実施形態において、好ましくは用量は少なくとも約１×１０６粒子、少なくとも約１×１０７粒子、少なくとも約１×１０８粒子、及び少なくとも約１×１０９粒子のアデノウイルスである。送達方法及び用量については、例えば、国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット及び米国特許第８４５４９７２号明細書（これらはそれぞれ全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。
一部の実施形態において、送達はプラスミドによるものである。投薬量は、応答を引き出すのに十分な数のプラスミドであり得る。ある場合には、プラスミド組成物中のプラスミドＤＮＡの好適な分量は、約０．１～約２ｍｇであってもよい。プラスミドは概して、（ｉ）プロモーター；（ｉｉ）プロモーターに作動可能に連結された、核酸ターゲティングＣＲＩＳＰＲエフェクターをコードする配列；（ｉｉｉ）選択可能マーカー；（ｉｖ）複製起点；及び（ｖ）（ｉｉ）の下流にある且つそれに作動可能に連結された転写ターミネーターを含むことになる。プラスミドはまた、ＣＲＩＳＰＲ複合体のＲＮＡ成分もコードすることができるが、代わりに、これらのうちの１つ以上が異なるベクターにコードされてもよい。投与頻度は、医学又は獣医学の実践者（例えば、医師、獣医師）、又は当業者の範囲内にある。
別の実施形態において、送達はリポソーム又はリポフェクチン製剤などによるものであり、当業者に公知の方法によって調製することができる。かかる方法については、例えば、国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット及び米国特許第５５９３９７２号明細書；同第５５８９４６６号明細書；及び同第５５８０８５９号明細書（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）に記載されている。
一部の実施形態において、送達はナノ粒子又はエキソソームによるものである。例えば、エキソソームはＲＮＡ送達に特に有用であることが示されている。
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の成分を細胞に導入する更なる手段は、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）の使用によるものである。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドがＣＲＩＳＰＲエフェクターに連結される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクター及び／又はＲＮＡガイドが１つ以上のＣＰＰとカップリングされ、細胞内部へと輸送する（例えば、植物プロトプラスト）。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクター及び／又は１つ又は複数のＲＮＡガイドが、細胞送達のため１つ以上のＣＰＰにカップリングされている１つ以上の環状又は非環状ＤＮＡ分子によってコードされる。
ＣＰＰは、生体分子を受容体非依存的に細胞膜を越えて輸送する能力を有するタンパク質又はキメラ配列のいずれかに由来する３５アミノ酸未満の短鎖ペプチドである。ＣＰＰは、カチオン性ペプチド、疎水性配列を有するペプチド、両親媒性ペプチド、プロリンリッチな抗微生物配列を有するペプチド、及びキメラ又は双節型ペプチドであってもよい。ＣＰＰの例としては、例えば、Ｔａｔ（これはＨＩＶ １型によるウイルス複製に必要な核転写活性化因子タンパク質である）、ペネトラチン、カポジ線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナルペプチド配列、インテグリンβ３シグナルペプチド配列、ポリアルギニンペプチドＡｒｇ配列、グアニンリッチ分子輸送体、及びスイートアローペプチドが挙げられる。ＣＰＰ及びその使用方法については、例えば、Ｈａｅｌｌｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０１５；１３２４：３９－５８；Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｂｙ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ，”Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，２０１４ Ｊｕｎ；２４（６）：１０２０－７；及び国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）に記載されている。
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムのための様々な送達方法はまた、例えば、米国特許第８７９５９６５号明細書、欧州特許第３００９５１１号明細書、国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット、及び国際公開第２０１７０７０６０５号パンフレット（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）にも記載されている。
以下の例に本発明を更に記載するが、これらの例は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１－ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの成分の同定
このタンパク質ファミリーは、上記の計算方法を使用して同定された。ＣＬＵＳＴ．２００９１６システムは、廃水、淡水沼沢林土壌、淡水堆積物、甲殻類、微生物マット、根圏、及び土壌環境に限定されない環境から採取された無培養のメタゲノム配列に見られるＣＲＩＳＰＲシステムに関連するシングルエフェクターを含む（表６）。例示的なＣＬＵＳＴ．２００９１６エフェクターには、以下の表６及び７に示されるものが含まれる。これらのシステムのダイレクトリピート配列及びスペーサー長さの例を表８に示す。任意選択で、システムは、表９に掲載される非コード配列に含まれるｔｒａｃｒＲＮＡを含む。
Figure 2022540153000008
Figure 2022540153000009
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実施例２－エンジニアリングされたＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの機能検証
ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの成分を特定した後、機能検証のために以下の遺伝子座を選択した：１）３３０００１３２３２と称されるメタゲノムソースからの遺伝子座（配列番号１）、２）ＳＲＲ６８３７５７０と称されるメタゲノムソースからの遺伝子座（配列番号２６）、３）ＳＲＲ６８３７５７５（配列番号２８）と称されるメタゲノムソースからの遺伝子座、４）ＳＲＲ６８３７５７７（配列番号２９）と称されるメタゲノムソースからの遺伝子座、及び５）ＳＲＲ６８３７５６９と称されるメタゲノムソースからの遺伝子座（配列番号２５）。
ＤＮＡ合成及びエフェクターライブラリクローニング
例示的なＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性を試験するために、ｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターを使用してシステムを設計及び合成した。簡潔に言えば、表７に示すように、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ３３０００１３２３２エフェクター（配列番号１）、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７０エフェクター（配列番号２６）、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７５エフェクター（配列番号２８）、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７７エフェクター（配列番号２９）、及びＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５６９エフェクター（配列番号２５）をコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化核酸配列を合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、ｐＥＴ－２８ａ（＋）（ＥＭＤ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に由来するカスタム発現システムに個別にクローニングした。ベクターは、ｌａｃプロモーター及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リボソーム結合配列の制御下にあるＣＬＵＳＴ．２００９１６エフェクターをコードする核酸を含んでいた。ベクターはまた、ＣＬＵＳＴ．２００９１６エフェクターのオープンリーディングフレームに続くＪ２３１１９プロモーターによってドライブされるＣＲＩＳＰＲアレイライブラリのアクセプター部位も含んでいた。表９に示すように、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ３３０００１３２３２エフェクター（配列番号１）に使用される非コード配列は配列番号４９に記載され、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７０エフェクター（配列番号２６）に使用される非コード配列は配列番号５４に記載され、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７５エフェクター（配列番号２８）に使用される非コード配列は配列番号５３に記載され、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７７エフェクター（配列番号２９）に使用される非コード配列は配列番号５５に記載され、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５６９エフェクター（配列番号２５）に使用される非コード配列は配列番号５６に記載される。ＣＬＵＳＴ．２００９１６エフェクターが非コード配列なしでｐＥＴ２８ａ（＋）に個別にクローニングされた、追加の条件が試験された。図１Ａを参照されたい。
「リピート－スペーサー－リピート」配列を含むオリゴヌクレオチドライブラリ合成（ＯＬＳ）プールが計算的に設計され、ここで、「リピート」は、エフェクターに関連するＣＲＩＳＰＲアレイに見られるコンセンサスダイレクトリピート配列に相当し、「スペーサー」は、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）必須遺伝子をタイリング（ｔｉｌｉｎｇ）する配列に相当する。特に、表８に示すように、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ３３０００１３２３２エフェクター（配列番号１）に使用されるリピート配列は配列番号３０に記載され、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７０エフェクター（配列番号２６）に使用されるリピート配列は配列番号４４に記載され、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７５エフェクター（配列番号２８）に使用されるリピート配列は配列番号４６に記載され、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７７エフェクター（配列番号２９）に使用されるリピート配列は配列番号４５に記載され、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５６９エフェクター（配列番号２５）に使用されるリピート配列は配列番号４３に記載される。スペーサー長さは、内因性ＣＲＩＳＰＲアレイに見られるスペーサー長さの最頻値によって決定した。リピート－スペーサー－リピート配列には、前述のＣＲＩＳＰＲアレイライブラリアクセプター部位、及びより大規模なプールからの特異的リピート－スペーサー－リピートライブラリの特定の増幅を実現するユニークなＰＣＲプライミング部位への断片の双方向クローニングを実現する、制限部位が付加された。
次に、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリ法を使用して、リピート－スペーサー－リピートライブラリをプラスミドにクローニングした。簡潔に言えば、本発明者らは初めに、ユニークなＰＣＲプライマーを使用してＯＬＳプール（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）から各リピート－スペーサー－リピートを増幅し、ＢｓａＩを使用してプラスミド骨格を事前に線形化して、潜在的バックグラウンドを低減した両方のＤＮＡ断片は、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に添加する前に、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で精製し、製造者の指示に従ってインキュベートした。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応物を更に精製及び濃縮して、細菌スクリーニングの後続のステップで最大の形質転換効率を実現した。
異なるリピート－スペーサー－リピートエレメントとＣＲＩＳＰＲエフェクターとを含むプラスミドライブラリを、Ｌｕｃｉｇｅｎが推奨するプロトコルに従ってＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（登録商標）（Ｂｉｏ－ｒａｄ）を使用してＥ．ＣｌｏｎｉエレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に電気穿孔した。ライブラリを、精製ｐＡＣＹＣ１８４プラスミドで共形質転換するか、又はｐＡＣＹＣ１８４を含むＥ．Ｃｌｏｎｉエレクトロコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に直接形質転換し、ＢｉｏＡｓｓａｙ（登録商標）ディッシュ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）のクロラムフェニコール（Ｆｉｓｈｅｒ）、テトラサイクリン（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）、カナマイシン（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）を含む寒天培地に播種し、３７℃で１０～１２時間インキュベートした。近似コロニー数を推定して細菌プレート上に十分なライブラリ提示を確保した後、細菌を回収し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してプラスミドＤＮＡを抽出し、「出力ライブラリ」を作成した。Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングケミストリーに適合性のあるバーコード及び部位を含むカスタムプライマーを使用してＰＣＲを実行することにより、形質変換前の「入力ライブラリ」及び回収後の「出力ライブラリ」の両方からバーコード付きの次世代シーケンシングライブラリを生成し、これをプールし、Ｎｅｘｔｓｅｑ５５０（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）にロードして、エフェクターを評価した。一貫性を確保するために、各スクリーンに対して少なくとも２つの独立したバイオロジカルレプリケートが実施された。図１Ｂを参照されたい。
細菌スクリーンシーケンシング解析
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｂｃｌ２ｆａｓｔｑを使用してスクリーン入力及び出力ライブラリの次世代シーケンシングデータをデマルチプレックス化した。各試料について得られたｆａｓｔｑファイル中のリードが、スクリーニングプラスミドライブラリ用のＣＲＩＳＰＲアレイエレメントを含んだ。ＣＲＩＳＰＲアレイのダイレクトリピート配列を用いてアレイの向きを決定し、スペーサー配列をソース（ｐＡＣＹＣ１８４又はＥ．Ｃｌｏｎｉ）又は陰性対照配列（ＧＦＰ）にマッピングすることにより対応する標的を決定した。各試料について、所与のプラスミドライブラリ中の各ユニークなアレイエレメントのリード総数（ｒａ）をカウントし、以下のとおり規格化した：（ｒａ＋１）／全てのライブラリアレイエレメントの総リード数。所与のアレイエレメントに関する規格化出力リード数を規格化入力リード数で除すことにより、枯渇スコアを計算した。
酵素活性及び細菌細胞死を生じさせる特異的パラメータを同定するため、本発明者らは次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を用いて入力及び出力プラスミドライブラリのＰＣＲ産物中における個々のＣＲＩＳＰＲアレイ（即ち、リピート－スペーサー－リピート）の表現を定量化し、比較した。アレイの枯渇率は、規格化された出力リード数を規格化された入力リード数で割ったものとして定義された。枯渇率が０．３未満（３倍を超える枯渇）の場合、アレイは「強力に枯渇した」と見なし、図３、図６、図９、図１２、図１５、図１８、図２１、図２４、及び図２７に「ヒット閾値」の破線で示した。バイオロジカルレプリケートにわたるアレイ枯渇率を計算する際には、全実験にわたる所与のＣＲＩＳＰＲアレイについての最大枯渇率の値をとった（即ち、強力に枯渇したアレイは、全てのバイオロジカルレプリケートで強力に枯渇していなければならない）。各スペーサー標的について、アレイ枯渇率及び以下の特徴：標的鎖、転写物ターゲティング、ＯＲＩターゲティング、標的配列モチーフ、フランキング配列モチーフ、及び標的二次構造を含む行列を作成した。この行列中の異なる特徴がＣＬＵＳＴ．２００９１６システムについての標的枯渇を説明する程度を調査した。
図３、図９、図１５、図２１、及び図２７は、所与の標的について、スクリーン出力対スクリーン入力におけるシーケンシングリードの規格化された比率をプロットすることによる、非コード配列と共にエンジニアリングされた組成物の干渉活性の程度を示す。結果は各ＤＲ転写方向につきプロットされる。組成物の機能的スクリーニングにおいて、活性ＲＮＡガイドと複合体を形成した活性エフェクターは、クロラムフェニコール及びテトラサイクリンに対する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）耐性を付与するｐＡＣＹＣ１８４の能力に干渉し、細胞死及びプール内のスペーサーエレメントの枯渇をもたらす。初期ＤＮＡライブラリ（画面入力）と生存形質転換大腸菌（画面出力）のディープシーケンスの結果を比較すると、活性でプログラム可能なＣＲＩＳＰＲシステムを可能にする特定の標的配列及びＤＲ転写方向が示唆される。スクリーンはまた、エフェクター複合体がＤＲの１つの方向でのみ活性であることも示す。このように、スクリーンは、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ３３０００１３２３２エフェクターがＤＲの「順」方向（５’－ＣＡＡＣ…ＡＧＡＣ－［スペーサー］－３’）で活性であったこと（図３）、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７０エフェクターがＤＲの「逆」方向（５’－ＧＣＧＣ…ＧＡＡＣ－［スペーサー］－３’）で活性であったこと（図９）。ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７５エフェクターがＤＲの「順」方向（５’－ＣＣＡＴ…ＡＧＡＣ－［スペーサー］－３’）で活性であったこと（図１５）。ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７７エフェクターがＤＲの「順」方向（５’－ＧＴＣＧ…ＣＧＡＣ－［スペーサー］－３’）で活性であったこと（図２１）、及びＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５６９エフェクターがＤＲの「逆」方向（５’－ＣＣＴＧ…ＡＧＡＣ－［スペーサー］－３’）で活性であったこと（図２７）を示した。
図４Ａ及び図４Ｂは、それぞれ、ｐＡＣＹＣ１８４及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｅ．Ｃｌｏｎｉ必須遺伝子を標的化するＣＬＵＳＴ．２００９１６ ３３０００１３２３２エフェクター（＋非コード配列）についての強力に枯渇した標的の位置を示す。図１０Ａ及び図１０Ｂは、それぞれ、ｐＡＣＹＣ１８４及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｅ．Ｃｌｏｎｉ必須遺伝子を標的化するＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７０エフェクター（＋非コード配列）についての強力に枯渇した標的の位置を示す。図１６Ａ及び図１６Ｂは、それぞれ、ｐＡＣＹＣ１８４及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｅ．Ｃｌｏｎｉ必須遺伝子を標的化するＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７５エフェクター（＋非コード配列）についての強力に枯渇した標的の位置を示す。図２２Ａ及び図２２Ｂは、それぞれ、ｐＡＣＹＣ１８４及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｅ．Ｃｌｏｎｉ必須遺伝子を標的化するＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７７エフェクター（＋非コード配列）についての強力に枯渇した標的の位置を示す。図２８Ａ及び図２８Ｂは、それぞれ、ｐＡＣＹＣ１８４及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｅ．Ｃｌｏｎｉ必須遺伝子を標的化するＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５６９エフェクター（＋非コード配列）についての強力に枯渇した標的の位置を示す。
枯渇した標的の隣接配列を分析して、非コード配列を有するＣＬＵＳＴ．２００９１６エフェクターのＰＡＭ配列を決定した。ＣＬＵＳＴ．２００９１６エフェクター３３０００１３２３２、ＳＲＲ６８３７５７０、ＳＲＲ６８３７５７５、ＳＲＲ６８３７５７７、及びＳＲＲ６８３７５６９（非コード配列を有する）のＰＡＭ配列のＷｅｂＬｏｇｏ表現（Ｃｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４：１１８８－９０，２００４）は、それぞれ図５、図１１、図１７、図２３、及び図２９に示され、ここで、位置「２０」は、標的の５’末端に隣接するヌクレオチドに対応する。
更に、図６、図１２、図１８、図２４、及び図３０は、ＣＬＵＳＴ．２００９１６エフェクターが非コード配列の非存在下で活性を保持することを示す。図３と一致して、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ３３０００１３２３２エフェクター（非コード配列を有しない）は、ＤＲの「順」方向（５’－ＣＡＡＣ…ＡＧＡＣ－［スペーサー］－３’）で活性であった（図６）。図９と一致して、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７０エフェクターは、ＤＲの「逆」方向（５’－ＧＣＧＣ…ＧＡＡＣ－［スペーサー］－３’）で活性であった（図１２）。図１５と一致して、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７５エフェクターは、ＤＲの「順」方向（５’－ＣＣＡＴ…ＡＧＡＣ－［スペーサー］－３’）で活性であった（図１８）。図２１と一致して、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７７エフェクターは、ＤＲの「順」方向（５’－ＧＴＣＧ…ＣＧＡＣ－［スペーサー］－３’）で活性であった（図２４）。図２７と一致して、ＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５６９エフェクターは、ＤＲの「逆」方向（５’－ＣＣＴＧ…ＡＧＡＣ－［スペーサー］－３’）で活性であった（図３０）。
図７Ａ及び図７Ｂは、それぞれ、ｐＡＣＹＣ１８４及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｅ．Ｃｌｏｎｉ必須遺伝子を標的化するＣＬＵＳＴ．２００９１６ ３３０００１３２３２エフェクター（非コード配列を含まない）についての強力に枯渇した標的の位置を示す。図１３Ａ及び図１３Ｂは、それぞれ、ｐＡＣＹＣ１８４及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｅ．Ｃｌｏｎｉ必須遺伝子を標的化するＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７０エフェクター（＋非コード配列）についての強力に枯渇した標的の位置を示す。図１９Ａ及び図１９Ｂは、それぞれ、ｐＡＣＹＣ１８４及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｅ．Ｃｌｏｎｉ必須遺伝子を標的化するＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７５エフェクター（＋非コード配列）についての強力に枯渇した標的の位置を示す。図２５Ａ及び図２５Ｂは、それぞれ、ｐＡＣＹＣ１８４及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｅ．Ｃｌｏｎｉ必須遺伝子を標的化するＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５７７エフェクター（＋非コード配列）についての強力に枯渇した標的の位置を示す。図３１Ａ及び図３１Ｂは、それぞれ、ｐＡＣＹＣ１８４及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｅ．Ｃｌｏｎｉ必須遺伝子を標的化するＣＬＵＳＴ．２００９１６ ＳＲＲ６８３７５６９エフェクター（＋非コード配列）についての強力に枯渇した標的の位置を示す。
枯渇した標的の隣接配列を分析して、非コード配列を有しないＣＬＵＳＴ．２００９１６エフェクターのＰＡＭ配列を決定した。ＣＬＵＳＴ．２００９１６エフェクター３３０００１３２３２、ＳＲＲ６８３７５７０、ＳＲＲ６８３７５７５、ＳＲＲ６８３７５７７、及びＳＲＲ６８３７５６９（非コード配列を有しない）のＰＡＭ配列のＷｅｂＬｏｇｏ表現は、それぞれ図８、図１４、図２０、図２６、及び図３２に示され、ここで、位置「２０」は、標的の５’末端に隣接するヌクレオチドに対応する。
実施例３－ＣＬＵＳＴ．２００９１６エフェクターによる二本鎖ＤＮＡ切断
この実施例は、ＣＬＵＳＴ．２００９１６エフェクターによる二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断を実証する。
ＤＲ－スペーサー－ＤＲ配列を含むＲＮＡガイド配列は、５つのＣＬＵＳＴ．２００９１６エフェクター：配列番号１、配列番号２８、配列番号２６、配列番号２７、及び配列番号２５のエフェクターについて合成された。ＲＮＡガイドの各スペーサーは、ＤＮＡ標的配列の１本の鎖に相補性を有するように生成された。例えば、配列番号１のエフェクターについて、配列番号１３９のＲＮＡガイドのスペーサー配列は、標的Ａ（配列番号５７）に対して相補性を有するが、非標的Ｂ（配列番号５８）に対して相補性を有しないように設計され、したがって、これを陰性対照として使用した。配列番号１、配列番号２８、配列番号２６、配列番号２７、及び配列番号２５のエフェクターに対応する標的、非標的対照、及びＲＮＡガイド配列を表１０に示す。表１０の太字の配列（例えば、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、及び配列番号６５の標的配列中の太字の配列）は、表１０のプレｃｒＲＮＡが結合する配列（例えば、それぞれ、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、及び配列番号１４３のプレｃｒＲＮＡ配列）に対応する。
Figure 2022540153000020
Figure 2022540153000021
全てのエフェクターのＲＮＡガイド配列は、インビトロ転写（ＩＶＴ）を使用して調製された。ＩＶＴ反応用の二本鎖ＤＮＡ鋳型は、Ｔ７プロモーター（ＩＤＴ）を有する市販の合成オリゴ鋳型を使用したＰＣＲによって調製された。二本鎖ＤＮＡ鋳型をＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ合成キットＮＥＢ）とインキュベートした後、ＤＮａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理してＤＮＡ鋳型を除去することにより、ＩＶＴを実施した。ＩＶＴ産物は、ＲＮＡプレップキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してクリーンアップされた。
標識されたｄｓＤＮＡ標的及び非標的基質は、ＩＲ８００標識フォワードプライマー及び非標識リバースプライマーを使用したＰＣＲによって生成された。得られたＰＣＲ産物は、図３３に示されるように、スペーサー相補鎖上にＩＲ８００標識を含んでいた。これらの基質はＳＰＲＩビーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して精製し、濃度はナノドロップ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。
切断アッセイは、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴを含む緩衝液中で実施した。複合体化ＲＮＰ（エフェクター＋対応するＲＮＡガイド）は、精製された各エフェクターを表１のＲＮＡガイドと１：２の比率でインキュベートすることによって形成された。次に、複合体化したＲＮＰを１００ｎＭのｄｓＤＮＡ基質に加え、インキュベートした。反応物をＲＮａｓｅカクテルで処理してインキュベートした後、プロテイナーゼＫとインキュベートした。ｄｓＤＮＡ切断を検出するため、反応物からのＤＮＡ産物を１５％ＴＢＥ－尿素ゲルで分析した。ゲルは、ＩＲ８００蛍光用の蛍光デジタルイメージングシステム（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で画像化した。
図３４Ａ、図３４Ｂ、図３４Ｃ、図３４Ｄ、及び図３４Ｅに示すように、標的特異的切断は、それぞれ配列番号１、配列番号２８、配列番号２６、配列番号２７、及び配列番号２５のエフェクターＲＮＰで、ｄｓＤＮＡ標的につき観察された。完全長の標的／非標的バンド及び切断バンドが示される。図３４Ａ、図３４Ｂ、図３４Ｃ、図３４Ｄ、及び図３４Ｅの５～７列に示されるように、各エフェクターＲＮＰについて、切断はエフェクターＲＮＰ濃度と正の相関があった。ＲＮＡガイドの非存在下（図３４Ａ、図３４Ｂ、図３４Ｃ、図３４Ｄ、及び図３４Ｅの２～４列）又はエフェクターＲＮＰの非存在下（図３４Ａ、図３４Ｂ、図３４Ｃ、図３４Ｄ、及び図３４Ｅの１列）において検出可能な切断活性は観察されなかった。更に、図３４Ａ、図３４Ｂ、図３４Ｃ、図３４Ｄ、及び図３４Ｅの１２～１４列に示すように、非標的ｄｓＤＮＡとインキュベートしたエフェクターＲＮＰについて、検出可能な切断活性は観察されなかった。例えば、標的Ａ用に設計されたＲＮＡガイドを有する非標的Ｂでは、検出可能な切断は観察されなかった（図３４Ａの１２～１４列）。
この実施例は、配列番号１、配列番号２８、配列番号２６、配列番号２７、及び配列番号２５のエフェクターは、ヌクレアーゼ活性を有し、標的特異的ｄｓＤＮＡ切断を触媒することを示す。
実施例４－ＣＬＵＳＴ．２００９１６エフェクターによるＧＦＰのターゲティング
この実施例は、ＣＬＵＳＴ．２００９１６エフェクターの活性を測定するための蛍光枯渇アッセイ（ＦＤＡ）の使用を説明する。
このアッセイでは、ＧＦＰを標的とするように設計された活性ＣＲＩＳＰＲシステムが、ＧＦＰをコードする二本鎖ＤＮＡ領域に結合して切断することにより、ＧＦＰ蛍光の枯渇が生じる。ＦＤＡアッセイには、インビトロでの転写及び翻訳が含まれ、これにより、ＣＬＵＳＴ．２００９１６エフェクターをコードするＤＮＡ鋳型、及びダイレクトリピート（ＤＲ）－スペーサー－ダイレクトリピート（ＤＲ）を有するＴ７プロモーター下のプレｃｒＲＮＡ配列を含むＤＮＡ鋳型からのＲＮＰの産生が可能になる。スペーサーはＧＦＰを標的とした。同じワンポット反応において、ＧＦＰ及びＲＦＰも標的及び蛍光レポーターの両方として産生された（図３５）。標的ＧＦＰプラスミド配列は配列番号１４４に示され、ＲＦＰプラスミド配列は配列番号１４５に示される。ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ Ｐｌｅｘプレートリーダーを使用して、ＧＦＰ及びＲＦＰの蛍光値を３７℃で２０分ごとに、１２時間にわたって測定した。ＲＦＰは標的化されなかったため、その蛍光は影響を受けず、そのため、内部シグナル対照として使用された。
配列番号１４４
Figure 2022540153000022
 配列番号１４５
Figure 2022540153000023
Figure 2022540153000024
配列番号２８及び配列番号２５のエフェクターのそれぞれについて、５つのＧＦＰ標的（及び１つの非標的）を設計した。ダイレクトリピート（ＤＲ）配列及びスペーサー長さは、エフェクターごとに異なる。ＦＤＡアッセイに使用されるＲＮＡガイド配列、標的配列、及び非標的対照配列を表１１に示す。表１１に示されるプレｃｒＲＮＡ配列は、インビトロでの転写及び翻訳混合物中に存在するヌクレアーゼによってＲＮＡが分解されないように、５’末端にＴ７プロモーターを含み、ＲＮＡの３’末端をキャップするヘアピンモチーフを含む。
Figure 2022540153000025
Figure 2022540153000026
Figure 2022540153000027
ＧＦＰシグナルをＲＦＰシグナルに規格化し、３つの技術的複製の平均蛍光を各時点で取得した。次に、非ＧＦＰターゲティングＲＮＡガイド（代わりにカナマイシン耐性遺伝子を標的とし、ＧＦＰシグナルを枯渇させない）とインキュベートしたエフェクターのＧＦＰシグナルを、ＧＦＰターゲティングＲＮＡガイドとインキュベートしたエフェクターのＧＦＰシグナルで割ることにより、ＧＦＰ蛍光枯渇を計算した。得られた値は、図３６Ａ及び図３６Ｂにおいて「枯渇」と呼ばれる。
１又は約１の枯渇は、非ＧＦＰターゲティングプレｃｒＲＮＡ及びＧＦＰターゲティングプレｃｒＲＮＡに関してＧＦＰ枯渇にほとんど又は全く差異がないことを示した（例えば、１０ＲＦＵ／１０ＲＦＵ＝１）。１を超える枯渇は、非ＧＦＰターゲティングプレｃｒＲＮＡ及びＧＦＰターゲティングプレｃｒＲＮＡに関してＧＦＰ枯渇に差異があることを示した（例えば、１０ＲＦＵ／５ＲＦＵ＝２）。ＧＦＰシグナルの枯渇は、エフェクターが機能的ＲＮＰを形成し、ＧＦＰコード領域内に二本鎖ＤＮＡ切断を導入することによってＧＦＰの産生に干渉したことを示した。ＧＦＰ枯渇の程度は、ＣＬＵＳＴ．２００９１６エフェクターの特異的活性と主に相関していた。
図３６Ａ及び図３６Ｂは、それぞれ、配列番号２８及び配列番号２５のエフェクターによって形成され、各ＧＦＰ標的（配列番号２８につき標的１～５、配列番号２５につき標的７～１１）につき２０分ごとに測定された、ＲＮＰの枯渇曲線を示す。各標的において、配列番号２８のエフェクター又は配列番号２５のエフェクターで形成されたＲＮＰの枯渇値は１より大きかった。
これは、ＣＬＵＳＴ．２００９１６エフェクターがＧＦＰの産生への干渉能を有する機能的ＲＮＰを形成したことを示唆している。
実施例５－ＣＬＵＳＴ．２００９１６エフェクターによる哺乳動物遺伝子のターゲティング
この実施例は、一過性トランスフェクションによって哺乳動物細胞に導入されたＣＬＵＳＴ．２００９１６エフェクターによる哺乳動物ＡＡＶＳ１標的に対するインデル評価を説明する。
配列番号２４、配列番号２８、及び配列番号２５のエフェクターをｐｃｄａ３．１骨格（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。次に、プラスミドをマキシプレップし、１μｇ／μＬに希釈した。ＲＮＡガイドの調製では、ＲＮＡガイドをコードするｄｓＤＮＡ断片は、標的配列の足場及びＵ６プロモーターを含むウルトラマー（ｕｌｔｒａｍｅｒ）によって誘導された。ウルトラマーを１０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌにｐＨ７．５で再懸濁し、最終ストック濃度を１００μＭにした。続いてワーキングストックを１０μＭに希釈し、再度１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌを使用して、ＰＣＲ反応の鋳型として使用した。ＲＮＡガイドの増幅は、次の成分を用いた５０μＬの反応物で行われた：前述の鋳型０．０２μｌ、フォワードプライマー２．５μｌ、リバースプライマー２．５μｌ、ＮＥＢ ＨｉＦｉポリメラーゼ２５μＬ、及び水２０μｌ。サイクリング条件は、１×（９８℃で３０秒）、３０×（９８℃で１０秒、６７℃で１５秒）、１×（７２℃で２分）であった。ＰＣＲ産物は１．８Ｘ ＳＰＲＩ処理でクリーンアップされ、２５ｎｇ／μＬに規格化された。試験したＡＡＶＳ１標的遺伝子座につき調製したＲＮＡガイド配列：ＴＧＧＣＣＴＧＧＧＴＣＡＣＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＧ（配列番号１５８）を表１２に示す。
Figure 2022540153000028
トランスフェクションの約１６時間前に、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ中の２５，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞１００μｌを９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。トランスフェクションの日、細胞は７０～９０％コンフルエントであった。トランスフェクトするウェルごとに、０．５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００と９．５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭの混合物を調製し、次に室温で５～２０分間インキュベートした（溶液１）。インキュベーション後、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ：ＯｐｔｉＭＥＭ混合物を、１８２ｎｇのエフェクタープラスミド及び１４ｎｇのＲＮＡガイド及び最大１０μＬの水を含む別の混合物に添加した（溶液２）。陰性対照について、ＲＮＡガイドは溶液２に含まれていなかった。溶液１と溶液２の混合物をピペッティングにより上下に混合し、次に室温で２５分間インキュベートした。インキュベーション後、２０μＬの溶液１と溶液２の混合物を、細胞を含む９６ウェルプレートの各ウェルに滴下した。トランスフェクションの７２時間後、各ウェルの中央に１０μＬのＴｒｙｐＬＥを添加して細胞をトリプシン処理し、約５分間インキュベートする。次に、１００μＬのＤ１０培地を各ウェルに加え、混合して細胞を再懸濁した。次に細胞を５００ｇで１０分間スピンダウンし、上清を廃棄した。ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ緩衝液を、元の細胞懸濁液量の１／５に加えた。細胞を６５℃で１５分間、６８℃で１５分間、９８℃で１０分間インキュベートした。
次世代シーケンシング用の試料は、２ラウンドのＰＣＲによって調製された。第１のラウンド（ＰＣＲ１）は、標的に応じて特定のゲノム領域を増幅するために使用された。ＰＣＲ１産物はカラム精製により精製した。ＰＣＲラウンド２（ＰＣＲ２）は、Ｉｌｌｕｍｉｎａのアダプター及びインデックスを付加するために行われた。次に、反応物をプールし、カラム精製によって精製した。シーケンシングの実行は、１５０サイクルのＮｅｘｔＳｅｑ ｖ２．５の中出力又は高出力キットで行われた。
図３７は、配列番号２４、配列番号２８、及び配列番号２５のエフェクターでトランスフェクションした後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＡＶＳ１標的遺伝子座のパーセントインデルを示す。各エフェクターについて、ドットは２つのバイオ複製で測定されたインデルのパーセントを反映し、バーは２つのバイオ複製物で測定されたインデルの平均パーセントを反映する。配列番号２４、配列番号２８、及び配列番号２５の各エフェクターについて、パーセントインデルは、破線で示されている陰性対照のパーセントインデルよりも高い。
この実施例は、ＣＬＵＳＴ．２００９１６エフェクターが哺乳動物細胞においてヌクレアーゼ活性を有することを示唆している。
他の実施形態
本発明はその詳細な説明を伴い説明されているが、前述の説明は例示であり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定する意図はないことが理解されるべきである。他の態様、利点、及び変形例が、以下の特許請求の範囲内にある。

Claims (60)

  1. ＣＬＵＳＴ．１３３１２０のエンジニアリングされた天然に存在しないクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓシステムであって、
    （ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が配列番号１～２９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又は前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸；及び
    （ｂ）ダイレクトリピート配列と標的核酸へのハイブリダイゼーション能を有するスペーサー配列とを含むＲＮＡガイド
    を含み、
    前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、前記ＲＮＡガイドに結合し、前記スペーサー配列に相補的な前記標的核酸配列を修飾することができる、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。
  2. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、少なくとも１つのＲｕｖＣドメイン又は少なくとも１つの分割されたＲｕｖＣドメインを含む、請求項１に記載のシステム。
  3. 前記ダイレクトリピート配列が、配列番号３０～４５、７７～９４、又は１２２～１３８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む、請求項１又は２に記載のシステム。
  4. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、配列番号１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、又は配列番号２９に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の同一性を有するタンパク質である、請求項１～３のいずれか一項に記載のシステム。
  5. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の認識能を有し、前記ＰＡＭ配列が、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＹＹＮ－３’、５’－ＨＨＮ－３’、５’－ＹＫＮ－３’、又は５’－ＨＢＮ－３’として記載される核酸配列を含み、Ｎが任意のヌクレオチドであり、ＹがＣ又はＴであり、ＫがＧ又はＴであり、ＢがＧ、Ｔ、又はＣであり、ＨがＡ、Ｃ、又はＴである、請求項１～４のいずれか一項に記載のシステム。
  6. 前記ＲＮＡガイドの前記スペーサー配列が、約１４ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のシステム。
  7. 前記ＲＮＡガイドの前記スペーサー配列が、２０～３５ヌクレオチドを含む、請求項６に記載のシステム。
  8. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、触媒残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のシステム。
  9. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、前記標的核酸を切断する、請求項１～８のいずれか一項に記載のシステム。
  10. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、ペプチドタグ、蛍光タンパク質、塩基編集ドメイン、ＤＮＡメチル化ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、局在化因子、転写修飾因子、光ゲート制御因子、化学誘導性因子、又はクロマチン可視化因子を更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のシステム。
  11. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする前記核酸が、細胞での発現にコドン最適化される、請求項１～１０のいずれか一項に記載のシステム。
  12. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする前記核酸が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１～１１のいずれか一項に記載のシステム。
  13. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする前記核酸が、ベクター内にある、請求項１～１２のいずれか一項に記載のシステム。
  14. 前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、又は単純ヘルペスベクターを含む、請求項１３に記載のシステム。
  15. 前記標的核酸がＤＮＡ分子である、請求項１～１４のいずれか一項に記載のシステム。
  16. 前記標的核酸が、ＰＡＭ配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のシステム。
  17. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、非特異的ヌクレアーゼ活性を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のシステム。
  18. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びＲＮＡガイドによる前記標的核酸のターゲティングにより、前記標的核酸の修飾が生じる、請求項１～１７のいずれか一項に記載のシステム。
  19. 前記標的核酸の前記修飾が、二本鎖切断イベントである、請求項１８に記載のシステム。
  20. 前記標的核酸の前記修飾が、一本鎖切断イベントである、請求項１８に記載のシステム。
  21. 前記標的核酸の前記修飾により、挿入イベントが生じる、請求項１８に記載のシステム。
  22. 前記標的核酸の前記修飾により、欠失イベントが生じる、請求項１８に記載のシステム。
  23. 前記修飾により細胞毒性又は細胞死が生じる、請求項１８～２２のいずれか一項に記載のシステム。
  24. ドナー鋳型核酸を更に含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のシステム。
  25. 前記ドナー鋳型核酸がＤＮＡである、請求項２４に記載のシステム。
  26. 前記ドナー鋳型核酸がＲＮＡである、請求項２４に記載のシステム。
  27. 前記システムがｔｒａｃｒＲＮＡを含まない、請求項１～２６のいずれか一項に記載のシステム。
  28. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が自己プロセシングである、請求項１～２７のいずれか一項に記載のシステム。
  29. 前記システムが、ナノ粒子、リポソーム、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃を含む送達組成物中に存在する、請求項１～２８のいずれか一項に記載のシステム。
  30. 細胞内にある、請求項１～２８のいずれか一項に記載のシステム。
  31. 前記細胞が真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞である、請求項３０に記載のシステム。
  32. 前記細胞が原核細胞である、請求項３０に記載のシステム。
  33. （ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が配列番号１～２９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又は前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸；及び
    （ｂ）ダイレクトリピート配列と標的核酸へのハイブリダイゼーション能を有するスペーサー配列とを含むＲＮＡガイド
    を含む、遺伝子修飾された細胞。
  34. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、配列番号１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、又は配列番号２９に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の同一性を有するタンパク質である、請求項３３に記載の遺伝子修飾された細胞。
  35. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＹＹＮ－３’、５’－ＨＨＮ－３’、５’－ＹＫＮ－３’、又は５’－ＨＢＮ－３’として記載される核酸配列を含むＰＡＭ配列の認識能を有し、Ｎが任意のヌクレオチドであり、ＹがＣ又はＴであり、ＫがＧ又はＴであり、ＢがＧ、Ｔ、又はＣであり、ＨがＡ、Ｃ、又はＴである、請求項３３又は３４に記載の遺伝子修飾された細胞。
  36. 前記ダイレクトリピート配列が、配列番号３０～４５、７７～９４、又は１２２～１３８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された細胞。
  37. 前記スペーサー配列が、約１４ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドを含む、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された細胞。
  38. 前記スペーサー配列が、２０～３５ヌクレオチドを含む、請求項３７に記載の遺伝子修飾された細胞。
  39. 前記細胞がｔｒａｃｒＲＮＡを含まない、請求項３３～３８のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された細胞。
  40. 前記細胞が真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞である、請求項３３～３９のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された細胞。
  41. 前記細胞が原核細胞である、請求項３３～３９のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された細胞。
  42. 請求項１～３２のいずれか一項に記載のシステムを、細胞内の標的核酸に結合させる方法であって、
    （ａ）前記システムを提供すること；及び
    （ｂ）前記システムを前記細胞に送達すること
    を含み、前記細胞が前記標的核酸を含み、前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が前記ＲＮＡガイドに結合し、前記スペーサー配列が前記標的核酸に結合する、方法。
  43. 前記細胞が真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞である、請求項４２に記載の方法。
  44. 標的核酸を修飾する方法であって、
    （ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が配列番号１～２９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又は前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸；及び
    （ｂ）ダイレクトリピート配列と前記標的核酸へのハイブリダイゼーション能を有するスペーサー配列とを含むＲＮＡガイド；
    を含み、
    前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質がＲＮＡガイドへの結合能を有し、
    前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びＲＮＡガイドによる前記標的核酸の認識により、前記標的核酸の修飾が生じる、
    エンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを、標的核酸に送達することを含む方法。
  45. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、配列番号１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、又は配列番号２９に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の同一性を有するタンパク質である、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＹＹＮ－３’、５’－ＨＨＮ－３’、５’－ＹＫＮ－３’、又は５’－ＨＢＮ－３’として記載される核酸配列を含むＰＡＭ配列の認識能を有し、Ｎが任意のヌクレオチドであり、ＹがＣ又はＴであり、ＫがＧ又はＴであり、ＢがＧ、Ｔ、又はＣであり、ＨがＡ、Ｃ、又はＴである、請求項４４又は４５に記載の方法。
  47. 前記ダイレクトリピート配列が、配列番号３０～４５、７７～９４、又は１２２～１３８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む、請求項４４～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記スペーサー配列が、約１４ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドを含む、請求項４４～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記スペーサー配列が、２０～３５ヌクレオチドを含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記システムがｔｒａｃｒＲＮＡを含まない、請求項４４～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記標的核酸がＤＮＡ分子である、請求項４４～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記標的核酸がＰＡＭ配列を含む、請求項４４～５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、非特異的ヌクレアーゼ活性を含む、請求項４４～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記標的核酸の前記修飾が、二本鎖切断イベントである、請求項４４～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記標的核酸の前記修飾が、一本鎖切断イベントである、請求項４４～５３のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記標的核酸の前記修飾により、挿入イベントが生じる、請求項４４～５３のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記標的核酸の前記修飾により、欠失イベントが生じる、請求項４４～５３のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記標的核酸の修飾により、細胞毒性又は細胞死が生じる、請求項５４～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 標的核酸の編集方法であって、請求項１～３２のいずれか一項に記載のシステムを前記標的核酸に接触させることを含む、方法。
  60. 標的核酸の発現を改変する方法であって、請求項１～３２のいずれか一項に記載のシステムを前記標的核酸に接触させることを含む、方法。
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