JP2022518146A

JP2022518146A - 環状一本鎖ｄｎａを用いた標的化されたゲノム改変

Info

Publication number: JP2022518146A
Application number: JP2021539146A
Authority: JP
Inventors: ハンフーチン; シャンチュン
Original assignee: ステレートバイオセラピューティクス，インコーポレイティド
Priority date: 2019-01-04
Filing date: 2020-01-03
Publication date: 2022-03-14
Also published as: US20210340571A1; AU2020204990A1; EP3906044A4; CN113271984A; EP3906044A1; KR20210111276A; WO2020142730A1

Abstract

発明は、環状一本鎖ＤＮＡ（ＣｉＳＳＤ）をドナーテンプレートとして使用したゲノム改変を目的とし、単一または複数の遺伝子改変細胞を作製する方法に関するものである。この方法では、１つ以上のＤＮＡポリヌクレオチドを細胞内に導入し、部位特異的ヌクレアーゼを用いたＤＮＡ修復を誘導する、またその遺伝子改変細胞を選別することが含まれる。【選択図】図１

Description

発明の分野
本発明は、標的化されたゲノム改変のためのドナーテンプレートとして、環状一本鎖ＤＮＡ（ＣｉＳＳＤ）を使用することに関するものである。

配列表、表またはコンピュータプログラムへの参照
配列表は、本明細書と同時に、ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由でＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとしてＥＦＳ－Ｗｅｂによって提出される。ファイル名は２０２０－０ｌ－０３＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５－１３１９０４８００１Ｗ０１．ｔｘｔ、作成日は２０２０年１月３日、サイズは１キロバイトである。ＥＦＳ－Ｗｅｂによって提出された配列表は明細書の一部でり、参照によって本明細書にその全体は組み込まれる。

本発明の背景
一本鎖（ｓｓ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、ＣＲＩＳＰＲ型ゲノム編集において標的化されたゲノム改変のためのドナーテンプレートとして、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡより効果的であることが近年示されている^１－８。具体的に、ｓｓＤＮＡテンプレートは、いくつかの重要な点特徴、すなわち改善された効率性、向上した特異性、減少した細胞毒性の点で、二本鎖テンプレートよりも優れている^７。これらの研究で使用されるｓｓＤＮＡテンプレートは、インビトロで作製された線状一本鎖ＤＮＡ（ＬｉＳＳＤ）であり^１、これは本質的にエラーを起こしやすく、非効率的かつ高価であり、また２ｋｂ未満の短いＤＮＡ配列を運ぶのに限定される。

多くのゲノム編集技術は、これらの線状ｓｓＤＮＡテンプレートを用いることによって達成できない２ｋｂ超のＤＮＡ配列を必要とする。細胞工学で使用するために２ｋｂ超の配列を運ぶことができるＤＮＡテンプレートが必要である。新しいＤＮＡテンプレートは、エラー率が低く、効率的、特異的で、かつ細胞毒性の低いものである必要がある。

本発明は、ドナーテンプレートとして環状一本鎖ＤＮＡ（ＣｉＳＳＤ）を用いる１個以上の遺伝子改変細胞の作製の方法、および標的化されたゲノム改変に関するものである。

図１は、記載された条件下でのＣｉＳＳＤ対ＬｉＳＳＤを用いる挿入効率を示すグラフである。効率はＧＦＰ陽性細胞の割合で測定される。図２は、ＣｉＳＳＤ対ＬｉＳＳＤを比較するための記載された条件下でのＧＦＰ陽性細胞の幾何平均を示すグラフである。ＧＦＰ強度はＡ．Ｕ．で測定される。図３は、各々の記載された条件下での細胞生存率を示すグラフである。

本発明の詳細な説明
本方法は、以下の工程：（ａ）ＤＮＡインサート、５’ホモロジーアーム、３’ホモロジーアームを有するＣｉＳＳＤを細胞に導入し、ここで、５’ホモロジーアームおよび３’ホモロジーアームは細胞内のゲノムＤＮＡ標的領域のポリヌクレオチドと相補的であり、（ｂ）細胞内のゲノムＤＮＡ標的領域にヌクレオチドの切断を誘導し、（ｃ）ＣｉＳＳＤの５’ホモロジーアームおよび３’ホモロジーアームを、標的領域の相補的なポリヌクレオチドとハイブリダイズさせ、（ｄ）ゲノムＤＮＡの標的領域にＤＮＡインサートを挿入し、それによって１以上の遺伝が作製される、を含む。

工程（ａ）において、ＤＮＡインサート、５’ホモロジーアーム、３’ホモロジーアームを有するＣｉＳＳＤを細胞内へ導入する。特定の好ましい実施態様では、ＤＮＡインサートは外因性ＤＮＡである。本明細書で用いる「外因性」は、本来の環境にない核酸またはポリヌクレオチドを指す。すなわち、外因性ＤＮＡインサートは、遺伝子改変細胞に対して外因性である。例えば、外因性ＤＮＡインサートは、別の種から細胞（改変されるべき細胞）に挿入される１つの種からの配列でよく、または再導入される遺伝子改変される細胞に本来的である配列でもよい。天然配列を含み再導入された外因性核酸は、外因性核酸、例えば、レポーターをコードするヌクレオチド配列（例えば、蛍光レポーターまたは抗生物質レポーター）に連結した非天然配列の存在によって天然に存在する配列と、通常、区別され得る。

工程（ａ）では、ＤＮＡインサートは、細胞内ゲノム標的部位のＤＮＡ配列と相補的である、５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームとの間に配置する。本明細書で用いるホモロジーアームは、標的領域の内在性ＤＮＡ配列の一連のヌクレオチド配列に相補的である一連のヌクレオチド配列を指す。ＤＮＡインサートを挟むホモロジーアームは、標的領域中のＤＮＡインサートの特異的挿入を可能にする。標的領域は、所望の挿入または改変が起こる核酸配列を指す。

特定の実施態様では、ＤＮＡインサートは少なくとも１ヌクレオチドである。特定の実施態様では、ＤＮＡインサートは、約０．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、４０ｋｂ、８０ｋｂ、１００ｋｂ、１５０ｋｂまたは２００ｋｂである。本願で使用される「約」は記載値の±１０％を指す。

特定の実施態様では、ＤＮＡインサートの長さは、約０．５ｋｂ～５ｋｂ、約１ｋｂ～５ｋｂ、約１ｋｂ～１０ｋｂ、約１．６ｋｂ～５ｋｂ、約１．６ｋｂ～１０ｋｂ、約２ｋｂ～５ｋｂ、約２ｋｂ～２０ｋｂ、約２．５ｋｂ～５ｋｂ、約２．５ｋｂ～１０ｋｂ、約２．５ｋｂ～２０ｋｂ、および約５ｋｂ～１００ｋｂである。

また、いくつかの実施態様では、ＤＮＡインサートのサイズは、約１ｋｂ～約３ｋｂ、約３ｋｂ～約６ｋｂ、約６ｋｂ～約９ｋｂ、約９ｋｂ～約１２ｋｂ、約１２ｋｂ～約１５ｋｂ、約１５ｋｂ～約１８ｋｂ、または約１８ｋｂ～約２１ｋｂの範囲でよい。

いくつかの実施態様では、ＤＮＡインサートは、マーカーまたはレポーター、例えば蛍光マーカー、抗生物質マーカーまたは任意の好適なマーカーをコードするヌクレオチド配列を含んでよい。本明細書で用いる「マーカー」または「レポーター」は、例えば蛍光または抗生物質耐性によって所望の細胞の同定および選択を可能にする特徴を意味する。例えば、インサートは、リポーター（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰまたは任意の好適なリポーター）またはリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよい。例えば、レポーターは、Ｎ末端ＧＦＰ融合レポーターである。

いくつかの実施態様では、ＤＮＡインサートは、各転写ユニットが細胞産物（例えば、タンパク質またはＲＮＡ）を産生することができる、転写ユニットをコードするヌクレオチド配列でもよい。いくつかの実施態様では、ＤＮＡインサートは、タンパク質、例えば免疫調節タンパク質（例えば、サイトカイン）、抗体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、成長因子、Ｔ細胞受容体、または他のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。

工程（ｂ）では、細胞内でゲノムＤＮＡの標的領域にヌクレオチドの切断を誘導する。特定の実施態様では、切断は二重鎖切断（ＤＳＢ）となる。特定の実施態様では、一本鎖ＤＮＡ切断またはニックとなる。ＣＲＩＳＰＲなどの精度の高いゲノム編集技術では、所望の配列変化（標的配列）近傍に切断を誘導する^３２。ＣＲＩＳＰＲは、削除、破壊、置換、挿入、置換および修復をつくるために適用され得る。これらの異なる改変のためのドナーテンプレートの構成要素は一般的には同じで、５’ホモロジーアーム、ＤＮＡインサート、３’ホモロジーアームの３つの要素からなる。ＣＲＩＳＰＲ型遺伝子編集は、遺伝子配列を破壊することにより遺伝子ノックアウトを作製することができるが、外因性ＤＮＡの挿入（ノックイン）またはゲノム配列の置換のための効率は、現在の方法では非常に低い^３３。特定の実施態様では、ＣｉＳＳＤはノックイン改変を作製することによってＣＲＩＳＰＲと共に使用され得る。

二本鎖切断は、先に記載した、ＣＲＩＳＰＲ^{３２，３３}、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ（ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＡｃｔｉｖａｔｏｒ－ＬｉｋｅＥｆｆｅｃｔｏｒＮｕｃｌｅａｓｅ）^３７、またはメガヌクレアーゼ^３８を用いる遺伝子編集システムなどの任意の好適なメカニズムによって導入され得る。簡単にいえば、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集システムは、短い「ガイド」ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）によって特定のＤＮＡ配列（標的配列）に標的化し得るＣＲＩＳＰＲというプログラム可能なＤＮＡエンドヌクレアーゼを用いて、標的化されたＤＳＢを作製する^３２。ＣＲＩＳＰＲ型改変において使用するためのガイドＲＮＡ（すなわち、ｃｒＲＮＡ、およびｔｒａｃｒＲＮＡ）は、任意の方法によって作製することができる。特定の実施態様では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは化学的に合成してもよい。その他の実施例では、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、インビトロ転写によって構築および合成してもよい。

ＣＲＩＳＰＲシステムは、一本鎖ＤＮＡの切断すなわちニックを導入するようにさらに操作される^３９。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は特定のＤＮＡ配列と結合するように操作することができ、ＤＳＢは融合したＦｏｋｌ（または他の好適なＤＮＡ切断ドメイン）によって導入され、ＤＮＡの１本鎖を切断し、次いで一対のＺＦＮがＤＳＢを導入する。各フィンガーは特定のＤＮＡ配列を認識し、フィンガーは、ＺＦＮに類似するより長い標的配列ＴＡＬＥＮ機能を標的化するように一緒に融合される。操作されたＴＡＬはＦｏｋｌ（または他の好適なＤＮＡ切断ドメイン）に融合される。ＴＡＬは標的配列に結合し、複数のＴＡＬはより長い配列を標的化するように一緒に融合され得る。メガヌクレアーゼは、制限酵素と類似の形式で機能して、特定の標的部位でＤＳＢを作製する。

工程（ｃ）において、ＣｉＳＳＤの５’ホモロジーアームおよび３’ホモロジーアームは、ゲノムＤＮＡの標的部位において相補的なポリヌクレオチドとハイブリダイズする。特定の実施態様では、ホモロジーアームは少なくとも５０ｎｔ長である。特定の実施態様では、ホモロジーアームは、１００ｎｔ～１０００ｎｔ長、または５０ｎｔ～３０００ｎｔ長の範囲でよい。好ましい実施態様では、ホモロジーアームは約２００ｎｔ～４００ｎｔ長、例えば約３００ｎｔ長である。

工程（ｄ）で、ＤＮＡインサートはゲノムＤＮＡの標的部位に挿入される。いくつかの実施態様では、ＤＮＡインサートは、相同組換え修復（ＨＤＲ）によってゲノムＤＮＡの標的領域に挿入される。本明細書で使用される「相同組換え修復」または「ＨＤＲ」は、相同な核酸（外因性核酸、例えばテンプレート核酸）を用いるＤＮＡ損傷を修復する過程を指す。ＨＤＲは、ＤＳＢに隣接する配列に相同配列（５’ホモロジーアームおよび３’ホモロジーアーム）を含むＤＮＡを使用して修復をテンプレート化する。本明細書に記載する実施態様は、５’ホモロジーアームおよび３’ホモロジーアームは、ＤＳＢに隣接する相補配列に相補的である。本明細書に記載する実施態様では、ＤＮＡインサートは、５’ホモロジーアームおよび３’ホモロジーアームによって隣接され、ＤＳＢが作製された後に相同領域に結合する。２つの相同組換え型クロスオーバーは５’ホモロジーアームおよび３’ホモロジーアーム領域で起こり、クロスオーバーは相同領域で解消される。したがって、インサートはゲノム内に挿入される。細胞内ＨＤＲ機構では、第２の鎖の合成がＤＳＢを修復するためのテンプレートを提供するためにＤＮＡインサートを使用し、編集は標的部位に組み込まれる^３２。

一つの好ましい実施態様では、任意の工程（ｅ）が含まれる。工程（ｅ）では、ＤＮＡインサートを有する１つ以上の細胞が選択される。ＤＮＡインサートを有する１つ以上の遺伝子改変細胞を選択することは、ＤＮＡインサートによりコードされたマーカーまたはレポーター（例えば、蛍光マーカーなど）を同定することを含み得る。いくつかの実施態様では、ＤＮＡインサートを有する１つ以上の遺伝子改変細胞を選択することは、細胞が特定の抗生物質に対して耐性であるか否かを同定することを含み得、ＤＮＡインサートは特定の抗生物質に対する耐性をコードする。

本発明によれば、本明細書に記載のＣｉＳＳＤは、同様のＤＮＡインサート長を有するＬｉＳＳＤよりも、細胞内にＤＮＡインサートを統合する統合効率が高い。いくつかの実施態様では、ＣｉＳＳＤの統合効率は、ＬｉＳＳＤの統合効率よりも、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、または少なくとも約１００％超など、約１０％～約１００％高い。さらに、
ドナーとしてＣｉＳＳＤを用いる本発明は、優れた特異性、低い細胞毒性、および低いオフターゲット効果を有する。ＣｉＳＳＤテンプレートは、迅速性、信頼性、費用対効果、拡張性、調整可能で、およびクローン性のある方法を用いて作製することができる。

本発明において使用するためのＣｉＳＳＤは、当業者に知られているに任意の好適な方法によって作製され得る。好適な方法は、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ，ＵＳＡ）および既に記載の方法を含んでよい^{１６，１７，３４}。特定の実施態様では、当業者には明らかなように、ＣｉＳＳＤはスプリントオリゴを用いて線状ＤＮＡの両端を橋渡し、次いでＴ４リガーゼで両端を連結することによって作製することができる。

特定の実施態様では、ＣｉＳＳＤはリコンビナーゼ（例えば、ＦＬＰまたはＣＲＥ）、およびＦＬＰまたはＣＲＥのための結合部位を含む部分的二重鎖ＤＮＡを用いて作製することができる。例えば、特定の実施態様では、線状ｓｓＤＮＡが使用でき、線状ｓｓＤＮＡの両端は組換え部位（例えばＦＲＴ）を含む。次に、オリゴをアニーリングして、組換え部位がＤＮＡの二重鎖領域にある、部分的二重鎖ＤＮＡを作製する。次に、ＦＬＰなどのリコンビナーゼを用いて、２つの組換え部位（例えばＦＲＴ）間の組換えを促進して、部分二重鎖領域を有する環状ｓｓＤＮＡ8（ＣｉＳＳＤ）を作製する。

特定の実施態様では、ＣｉＳＳＤはＭ１３型システムでファージミドベクターを用いて作製することができる。これらの方法は、などのファージミドベクターへのドナーインサートの構築およびクローニングを含むがこれらに限定されない^１６。公知の配列のｐＳｃａｆはＭ１３型法で使用され得るが、ｐＳｃａｆは、例えば、少なくとも１つのシス配列または１つ超のシス配列において改変することもできる。これらの改変は、公知のｐＳｃａｆ配列と異なる、約１ｎｔ、約２ｎｔ、約３ｎｔ、約４ｎｔ、約５ｎｔ、約６ｎｔ、約７ｎｔ、約８ｎｔ、約９ｎｔ、約１０ｎｔ、約２０ｎｔ、約３０ｎｔ、約４０ｎｔ、または約５０ｎｔを含み得る。本発明者らは、ｐＳｃａｆを１つ以上の改変シス配列を含むように改変することによって、本発明者らは、各ＣｉＳＳＤの長さに渡る均質性が約９０％、約９５％、または約９９％などに増加することを認識した。

特定の実施態様では、バクテリオファージ型システムが使用され得る。

特定の実施態様では、Ｍ１３型システムが使用され、ＣｉＳＳＤはイニシエーター配列またはターミネーター配列を含んでもよい。Ｍ１３型システムの特定の実施態様では、ＣｉＳＳＤはＭ１３のパッケージング配列、」およびＭ１３の複製開始点からのイニシエーター配列およびターミネーター配列を含んでよい。

ドナーインサートを構築およびクローニングするために有用な方法は、別の箇所で説明されている^１６。ドナーインサートは、クローン性および分子スクリーニングのためＥ．ｃｏｌｉ株で増殖させることができ^１９、これらのインサートを有する組換えＣｉＳＳＤは、ヘルパープラスミドを用いて作製することができる。任意の好適なヘルパープラスミドが使用可能であるが、例として、Ｍ１３ｃｐおよび先に記載したものを含む^{１７，２０}。ファージミドの例は、ｐ６７ＰＣＧを含むがこれに限定されない。対象のドナーインサートを有するＣｉＳＳＤは、単利したファージ粒子を抽出することによってドナーテンプレートとして精製され得る。好適な抽出方法は別の箇所に記載される^９。任意の好適なＥ．Ｃｏｌｉが使用可能で、例としてＸＬ１－ＢｌｕｅおよびＤＨ１１Ｓを含むがこれらに限定されない。Ｆ線毛を持つ他の好適なＥ．Ｃｏｌｉも使用可能である。

本方法によって製造された遺伝子改変細胞は、細胞治療、例えばＣＡＲ－Ｔ細胞治療において使用することができる。ＣＡＲ－Ｔ細胞治療^{２５，２６}では、大量の改変細胞が臨床用途のために迅速に作製されなければならない。慣用的方法を用いると、細胞毒性が、改変中のＴ細胞集団を減少させ、改変細胞の重要な量を得ることを遅らせる。本明細書で提供された実施態様では、ＣＲＩＳＰＲノックイン実験中のヒト一次Ｔ細胞中のＣｉＳＳＤの細胞毒性は低減され得る。

特定の実施態様では、改変されるべき細胞はヒト細胞でよい。いくつかの実施例では、細胞はＴ細胞でよい。他の実施態様では、細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはマクロファージでよい。特定の実施態様では、遺伝子改変細胞は幹細胞でもよい。また、いくつかの実施態様では、遺伝子改変細胞は、非ヒト胚性幹細胞、非胚性幹細胞（例えば、造血幹細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、臍帯血幹細胞、羊水幹細胞、またはそれらの任意の組み合わせである。

特定の実施態様では、細胞はＴ細胞である。また、特定の実施態様では、細胞はナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）である。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４－ＣＤ８－ダブルネガティブＴ細胞、ＮＫ細胞、またはそれらの任意の組み合わせである。また、いくつかの実施態様は、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、ＮＫ細胞、またはそれらの任意の組み合わせである。

いくつかの実施例では、インサートはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細胞はＣＡＲ改変Ｔ細胞である。いくつかの実施態様では、遺伝子改変細胞は、ＣＡＲ改変ＮＫ細胞、ＣＡＲ改変マクロファージ、またはＣＡＲ改変造血細胞である。また、特定の実施態様では、改変されるべき細胞はヒト細胞でよい。

特定の実施態様では、インサートは、遺伝子改変細胞への遺伝子コーディング領域を含んでよい。特定の実施態様では、インサートは、１つ以上のアリル上の遺伝子の機能を破壊し得る。バイアレリック改変は、ＣｉＳＳＤドナーの高い効率から利益を受けることができ、Ｔ細胞により低いい細胞毒性は、ヒト健康適用へのＣｉＳＳＤの価値を明確に示す。これらの改変Ｔ細胞は、代替的な細胞表現型によって反映されているように、改善された免疫療法について現在評価されている。

本技術の方法は、本明細書で記載したものなどのＣｉＳＳＤで遺伝子改変された細胞を含む細胞治療を提供することによって、それを必要とする対象における疾患、障害または症状を治療することも含む。細胞はＴ細胞でよく、ＣｉＳＳによって行われたＤＮＡインサートはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードすることができる。これらの方法では、遺伝子改変細胞はＣＡＲ改変Ｔ細胞でよい。

本技術の方法は、本明細書で記載したものなどのＣｉＳＳＤで遺伝子改変された細胞を含む細胞治療を提供することによって、それを必要とする対象における疾患、障害または症状を治療することも含む。

いくつかの実施態様では、本発明は、本明細書に記載されているものなどのＣｉＳＳＤを用いて１つ以上の非ヒト胚性幹細胞を遺伝子改変することも含む。これらの実施態様では、ＣｉＳＳＤ遺伝子改変非ヒト胚性幹細胞を内細胞塊に移植し、１つ以上のＣｉＳＳＤ遺伝子改変非ヒト胚性幹細胞から少なくとも部分的に産生された胚を対象にトランスフェクトすることにより、１つ以上のトランスジェニック動物または非ヒト哺乳動物を作製することも含むことができる。

本手法は、ヒトなどの哺乳動物を治療するのに有用である。

これらを総合すると、本開示は、遺伝子療法（例えば、エクスビボおよび／またはインビボｏ）および細胞療法（例えばエクスビボ）、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ（ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＡｃｔｉｖａｔｏｒ－ＬｉｋｅＥｆｆｅｃｔｏｒＮｕｃｌｅａｓｅ）、およびメガヌクレアーゼを含むＨＤＲ技術を含むがこれらに限定されない、遺伝子操作用途のために有益である。遺伝子改変細胞の追加の適用は、トランスジェニック動物を含むが、これに限定されない。本方法の利点は、改善された統合効率、オフターゲット統合の制限を含み、細胞毒性を低減し得る。

当業者は、多種多様な送達メカニズムまたはさらなる治療的使用も本発明に好適であることを認識するであろう。

以下の実施例は本発明をさらに例証する。これらの実施例は、単に本発明を例証するにすぎず、限定的に解されるものではない。

実施例１．ＨＤＲドナーテンプレート用のＣｉＳＳＤの作製（データの裏付けのない実施例）
ＣｉＳＳＤ作製のための１つの方法を実施例１に示す。ＣｉＳＳＤは一般的に以下のように作製される。ドナーインサートを構築してファージミドベクターにクローニングした後^１６、Ｅ．Ｃｏｌｉ株でクローン性および分子スクリーニングのために増殖させ^１９、ヘルパープラスミドの存在下で組換えＣｉＳＳＤとして産生し^{１７，２０}、単利したファージ粒子を抽出してドナーテンプレートとして精製した^９。使用され得るＥ．Ｃｏｌｉ株は、ＸＬｌ－ＢｌｕｅおよびＤＨ１１Ｓを含むが、Ｆ線毛を持つ他のＥ．Ｃｏｌｉ株も使用可能である。ＤＨ１ＩＳは、Ｍ１３を慢性感染中ほとんど溶菌しないため、他の菌株に比べてＭ１３調製物中の細菌ゲノム汚染量を低減する^２１。

Ｍ１３ｃｐヘルパープラスミドは、ヘルパーファージのコンタミネーションを避けるために使用される^２０。ファージミドベクターｐＳｃａｆ^６はクローニングに使用され、以前はＤＮＡオリガミのバイオファブリケーション用のｓｓＤＮＡスキャフォールドを製造するために操作された。これらの研究で、ベクター上の第２の部分的なＦ１－ｏｒｉでの「リーキーな」イニシエーターおよびターミネーターに起因して、ｐＳｃａｆは産物均一性を示す^１６。意図した完全長の産物は、産生された総ｓｓＤＮＡのちょうど４６～８３％を含む^１６。均一性はｐＳｃａｆシス配列を改変することによって改善され、ファージミド（例えばｐ６７ＰＣＧ）はｐＳｃａｆを変更することによって構築され、ＣｉＳＳＤ中９５％超の長さの均一性を達成する。ファージミドへのこれらの変化は、クローニング工程を含む、３週間未満にカスタムＣｉＳＳＤの産生を可能にし得る。ＣＲＩＳＰＲ実験に好適なＤＮＡ量は、５ｍｌの培養液から得られる。

Ｍ１３は、インビトロ法を用いて作製されたＬｉＳＳＤと比較して、大きなカーゴ容量、例えば２ｋｂ超、を有するＣｉＳＳＤを作製する際に有用であり得る。例えば４ｋｂ、８ｋｂおよび１２ｋｂのサイズの異なる３つのインサートが作製され、ｐ６７ＰＣＧファージミドにクローン化される。Ｍ１３は、これらのインサートからサイズの増大するＣｉＳＳＤを作製するために使用される。成長時間が短くなることがあるが、添加された外因性マグネシウムを増やすことで補正が可能である^２７。

ファージミドベクターｐ６７ＰＣＧの構築：ファージミドベクターｐ６７ＰＣＧは、ｐＳｃａｆベクターの二重ｆｌ－ｏｒｉ^１６から、Ｍ１３ｓｓＤＮＡイニシエーターおよびＭ１３ｓｓＤＮＡターミネーターをベクターにクローニングすることによって作製される。このベクターは、複数のＩＩ型制限酵素の認識配列を有するクローニングサイトを有し、ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅＡｓｓｅｍｂｌｙを用いて組換え体ｐ６７ＰＣＧを作製可能である^２２。ターミネーター配列は、Ｓｐｅｃｔｈｒｉｅら（１９９２）のΔ２９デザイン^２８の代わりに、ｐＳｃａｆからのトリプルチミン変異体^１６を含む。ｐ６７ＰＣＧベクターはＤＮＡシーケンシングで確認される。

一本鎖相同組換え修復テンプレート（ｓｓＨＤＲＴ）のクローニング：ドナーテンプレートの配列はｄｓＤＮＡとして作製され、酵素を用いたＧｏｌｄｅｎＧａｔｅＡｓｓｅｍｂｌｙによってｐ６７ＰＣＧベクターに配置される^２２。ファージミドは、ｓｓＤＮＡ合成イニシエーター配列とターミネーター配列との間の消化部位をＩＩ制限酵素消化により受容される。先に述べたような他のレポーターコンストラクトを使用することもできる^７。この技術では、Ｌｉら（２０１７）によるＮ末端ＧＦＰリポーター構造^１を使用する。具体的には３つの遺伝子座特異的コンストラクトを使用する：ＲＡＢ１１Ａ（ｐＴＲ１４３；ａｄｄｇｅｎｅ＃１１２０１２）、ＣＤ４（ｐＴＲ１５２；ａｄｄｇｅｎｅ＃１１２０１８）、およびＣＬＴＡ（ｐＴＲ１５３ａｄｄｇｅｎｅ＃１１２０１６）。追加の組換えｐ６７ＰＣＧファージミドは、Ｍ１３システムのカーゴ容量の限界を試験するために、４ｋｂ、８ｋｂ、および１２ｋｂのインサートサイズで構築される。

組換えファージミドの産生およびＣｉＳＳＤ精製：Ｍ１３ｃｐヘルパープラスミドによる形質転換によってＸＬｌ－Ｂｌｕｅ－ＭＲＦ’ヘルパー株（ＸＬｌＢｌａｃｋ）を作製する^２０。化学的なコンピテント細胞はＴＳＳ（１０％ＰＥＧ－８０００，３０ｍＭＭｇＣ１_２，５％ＤＭＳＯ，２ｘＹＴ，ｐＨ６，濾過済み）で作製する。ｐ６７ＰＣＧ＋インサートでＸＬｌＢｌａｃｋを形質転換し、ファージ産生培養を行う。クローンは、選別し、カナマイシン（５０ｐｇ／ｍｌ）、カルベニシリン（１００ｐｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（２５ｐｇ／ｍｌ）を添加した３ｍｌの２ｘＹＴ培地（１．６％トリプトン，１％イースト抽出物，０．２５％ＮａＣｌ）で１８時間（３０℃，２２５ｒｐｍ）成長される。３ｍｌのスターター培養を使用して、１００ｍｌの２ｘＹＴ培地、１０ｍｌリン酸緩衝液（７％リン酸水素２カリウム，３％リン酸ナトリウム一塩基性，ｐＨ７，オートクレーブ済み）、１ｍＬ５０％グルコース、０．５ｍＬ１ＭＭｇＣｌ_２、および同一の３つの抗生物質を播種する。培養液は、さらに２４時間（３０℃，２２５ｒｐｍ）成長される。

この培養液を遠心分離ボトルに移し、氷上で３０分間インキュベートする。菌体は４℃で７，０００ｇ、１５分間の遠心分離でペレット化する。ファージ粒子を含む上清を、４ｇのＰＥＧ－８０００および３ｇのＮａＣｌを含む別の遠心分離ボトルに移す。ボトルを撹拌し、氷上で３０分間インキュベートする。沈殿したファージ粒子を、４℃、９，０００ｇで１５分間遠心分離しペレット化する。ペレットを３ｍｌのＴＥバッファーに再懸濁し、再度遠心分離して、残留する細胞破片を除去する（１５，０００ｇ，１５分間、４℃）。上清を６ｍｌのＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（０．２ＭＮａＯＨ，１％ＳＤＳ）を含む５０ｍｌコニカルチューブに移し、撹拌する。４．５ｍｌのＮｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（３ＭＫＯＡｃ，ｐＨ５．５）を加え、再度撹拌し、１５分間氷上でインキュベートする。この混合物を４℃で１５，０００ｇ、１５分間遠心分離する。上清を２７ｍｌの試薬級エタノールを含む５０ｍｌコニカルチューブに上澄み液を移す。内容物を転倒して混合し、－２０℃で一晩置く。

ＤＮＡ沈殿物を、４℃で１６，０００ｇ、１５分間、遠心分離してペレット化する。このペレットを９ｍｌの氷冷した７０％エタノールで洗浄し、１６，０００ｇで５分間、４℃で遠心分離する。このペレットを５～１０分間自然乾燥させた後、１ｍｌのｌｏｗＴＥに再懸濁する。この容量で、約１ｇ／ｍｌのＣｉＳＳＤが得られる。

ＣｉＳＳＤの濃度は、ｓｓＤＮＡについてＮａｎｏＤｒｏｐで測定し、収量は液体培養物１ｍｌあたり１０ｇである。吸光度比（Ａ２６０ｎｍ／２８０ｎｍおよび２６０ｎｍ／２３０ｎｍ）は、一連の工程からの一致した純度（それぞれ、１．８、及び＞２）を反映する。組換えＣｉＳＳＤは、カスタムデザインしたスタッガード（staggered）シークエンスプライマーを用いたＤＮＡシークエンシングによって完全な範囲が検証される。ＤＮＡはＴＥで標準濃度（１μｇ／μｌ）に調整し、－２０℃で保存する。

代替法－ファージミド調製物中の染色体ＤＮＡの混入：Ｍ１３は溶解性感染よりも慢性感染を引き起こす。それでも、ＸＬ１－Ｂｌｕｅを含むいくつかのバクテリア宿主株では、検出可能なレベルの汚染染色体ＤＮＡが上清に放出する。Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ１ＩＳは、この問題を解決するよう操作されている^２１。いくつかの場合には、ＸＬｌ－Ｂｌｕｅが宿主として使用される。これらの場合には、ＤＮＡ分子（小さなｓｓＤＮＡおよび大きな染色体ｄｓＤＮＡ）の再生率の違いは、汚染されたゲノムＤＮＡを除去するのに役立つ。

代替法－ウイルス粒子の透過型電子顕微鏡検査：目視で、組換えファージ粒子のサイズの均一性を確認する。イメージングの前に、各Ｍ１３調製物からの上清（５Ｌ）を適用する。電子顕微鏡写真は、ＦＥＩＴＥＣＮＡＩＴ１２透過型電子顕微鏡で、４ｋ×４ｋの電荷結合素子カメラ（ＵｌｔｒａＳｃａｎ４０００，Ｇａｔａｎ）を用いて、２６，０００倍および５２，０００倍の倍率で撮影する。ＥＭＡＮ２ソフトウェアを使用してクラス平均値を得る。

代替法－ＣｉＳＳＤのヌクレオチド長の均一性：ＣｉＳＳＤのアリコート（１ｐｇ／μｌで５μｌ）は、合成５’－リン酸化低分子干渉ＤＮＡ（ｓｉＤＮＡ）によってガイドされた消化によるＰｆＡｇｏを用いて線状化する^２９。ＰｆＡｇｏは、ガイドｓｉＤＮＡ（１５～３１ｎｔ長）および標的ｓｓＤＮＡとともに５：１：１の割合でインキュベートする。混合物を陽イオンの補因子として０．５ｍＭＭｎ^２＋とともに７５℃で１時間インキュベートする。あるいは、酵素の認識配列を持つ二重鎖形成オリゴヌクレオチドによって、制限消化を行う。線状化後、ターミナルトランスフェラーゼを用いて、３’末端にＢｉｇＤｙｅ（商標）ターミネーター「Ａ」を共有結合で付加する。線状化されたＣｉＳＳＤの長さのばらつきは、シーケンシング装置（ＡＢＩ３７３０）およびＰＯＰ７ポリマーを用いて、標準的な変性条件下で測定される。

代替法－ＣｉＳＳＤの超らせん性：ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いたＤＮＡ染色および２％アガロースゲルでの電気泳動により、ＣｉＳＳＤおよびニックによりＣｉＳＳＤから生成された線状ｓｓＤＮＡの割合を測定する。超らせん構造の環状分子は、同じサイズおよび配列の線状分子よりも速く移動する。実験のために製造されるＣｉＳＳＤの再環状化形態が再確認される。これらの分子は、いずれかの超らせん環状ｓｓＤＮＡよりも電気泳動中ゆっくりと移動する緩やかな環状である。

代替法－ｓｓＤＮＡクローンからのＭ１３配列の除去：ＣｉＳＳＤには、合成およびパッケージングに不可欠なＭ１３配列が含まれる。場合によっては、これらの配列は切除され、線状化したＣｉＳＳＤドナークローンはネガティブ精製およびポジティブ精製の両方で単離される。まず、１対のｓｉＤＮＡガイドは、Ｍ１３のシス配列を挟む２つの一本鎖開裂事象を標的化するように設計される。ＰｆＡｇｏは両方の位置で切断するために用いられる。ＰｆＡｇｏを２つのガイドｓｉＤＮＡ（いずれも２１ｎｔ長）およびファージミドテンプレートＣｉＳＳＤと共に５：１：１のモル比でインキュベートする。混合物を、０．５ｍＭＭｎ^２＋とともに７５℃で１時間インキュベートする。二重開裂はＣｉＳＳＤから２つの線状誘導体を生じる：１つはＭ１３配列、他方はドナーテンプレート配列。いずれかの位置で１つが切断されたＣｉＳＳＤは線状化されるが、両方の配列は保持される。

ストレプトアビジンをコートした磁気ビーズ（ＭｙＯｎｅ（商標）ストレプトアビジンＣｌ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＣｉＳＳＤの（＋）鎖Ｍ１３配列と塩基対となる相補的な（－）鎖配列のビオチン化された６０ｍｅｒ合成オリゴヌクレオチドを使用する。このハイブリダイゼーションのプロトコールは、ｓｓＤＮＡのネガティブおよびポジティブ精製の両方に使用される。

ストレプトアビジンをコートしたビーズは、撹拌して再懸濁し、同容量の洗浄バッファーで３回洗浄する。ビーズは２ｘＢ＆ＷＢｕｆｆｅｒに再懸濁し、最終濃度を５μｇ／μｌにする。同容量のビオチン化オリゴヌクレオチドの水を加えて、オリゴをビーズに固定する。混合物を室温で１５分間ゆっくりと回転させながらインキュベートする。混合物をｌｘＢ＆ＷＢｕｆｆｅｒで３回洗浄した後、再懸濁し、２．５μｇ／μｌ（ビーズ濃度）とする。

開裂されたＣｉＳＳＤＤＮＡは、１ｍｇのＤｙｎａｂｅａｄｓが５００ｐｍｏｌのビオチン化オリゴヌクレオチドと結合するように、固定されたキャプチャー配列と１：５の比率で、ＰＣＲチューブ内で混合する。これを６５℃に加熱し、毎分－５℃ずつ２３℃まで温度を低下させ、その後２０分間保持する。ドナーテンプレート配列は上清に残り、その上清はビーズを１５分間磁気分離した後、新しいチューブに移す。上清中の核酸をエタノール沈殿させ洗浄した後、５０倍容量のｌｏｗＴＥに再懸濁する。２回目のハイブリダイゼーションによるキャプチャーは、ドナーテンプレート配列をポジティブ精製で濃縮するために行われる。ドナー配列に相補的なビオチン化オリゴヌクレオチド（６０ｍｅｒ）を使用する以外は、基本的に前回と同様に行う。最終的な収量として、元のＣｉＳＳＤ濃度の約２５％が回収される。

代替法－磁気ビーズによる核酸精製：核酸精製用の磁気ビーズは、先に述べたように準備する^３０。作業溶液（５０ｍｌ）を以下のように調製する。１ｍｌカルボキシル酸修飾磁気ビーズ溶液（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ＃６５１５２１０５０５０２５０）を、磁気スタンド上で３ｘ１ｍｌのＲＮａｓｅなしのＴＥバッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ，１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）で洗浄する。ビーズペレットをＤＮＡ沈殿バッファー（ＲＮａｓｅなし）：（ｌＭＮａＣｌ；１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．０；１ｍＭＥＤＴＡ；１８％ｗ／ｖＰＥＧ８０００（ＳｉｇｍａＢｉｏＵｌｔｒａ）；０．０５％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ））に再懸濁する。沈殿液中の磁気ビーズを核酸サンプルに適切な比率で加え、室温で１０分間インキュベートする。ビーズに結合した核酸は磁気で固定化され、ＲＮａｓｅなしの７０％エタノールで２回洗浄する。ビーズを室温で５～１０分空気乾燥させ、ＲＮａｓｅフリーＨ_２Ｏに核酸を溶出させる。

代替法－ＣｉＳＳＤの拡張性のある精製スキーム：新生ポリマーを選択的にキャッチアンドリリースするための方法及び組成物は、マルチキロベースｓｓＤＮＡの拡張性のある分離を可能にし、使用され場合により拡張性のあるＣｉＳＳＤ精製のために改変される^３１。

実施例２（データ裏付けのある実施例）
目的は、ＣｉＳＳＤがＬｉＳＳＤよりも優れたＤＮＡドナーテンプレートとして機能することを証明することであった。概念実証として、ＲＡＢ１１ＡのＮ末端にＧＦＰ融合をもたらすドナーテンプレートを既述の通り使用した^７。このドナーテンプレートは、３０６ｂｐの左ホモロジーアーム、ＧＦＰコーディング配列、および３１５ｂｐの右ホモロジーアームから構成された。ＤＮＡ二重鎖切断を誘導するために、５’－ＧＧＴＡＧＴＣＧＴＡＣＴＣＧＴＣＧＴＣＧ－３’（配列番号１）、次いでプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列および２つの核局在化シグナル（２ＮＬＳ）を有するストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９タンパク質を標的化するｓｇＲＮＡ購入した（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ，ＵＳＡ）。モデル生物として、挿入効率および細胞生存性を試験するために２９３ＦＴ細胞を使用した。ドナーテンプレートをポリメラーゼサイクリングアセンブリによって合成し、ヴベクターにクローン化した。ＣｉＳＳＤを、ＰＣＲ増幅二本鎖ＤＮＡからＤＮＡの一本鎖を酵素的に消化して製造した。先ず、線状二本鎖ＤＮＡを、フォワードプライマー（ＧＧＴＡＧＣＴＡＧＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＡＣ）（配列番号２）およびリバースプライマー（／５Ｐｈｏｓ／ＡＣＧＡＴＧＴＧＧＧＡＧＡＡＧＧＣＡＧＴＣ）（配列番号３）とともに、Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ，ＵＳＡ）を用いるＰＣＲによって増幅した。リン酸化された鎖をＧｕｉｄｅ－ｉｔ（商標）ＬｏｎｇｓｓＤＮＡＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Ｔａｋａｒａ，ＵＳＡ）で分解し、線状の一本鎖ＤＮＡを形成した。最後に、ＣｉＳＳＤを、対象の配列およびを単一のＭ１３複製起点をコードするＭ１３ファージから抽出した。要するに、対象の配列を２つの野生型Ｍ１３の複製起点の間でベクターにクローニングした。その後、ＣＲＩＭシステムを用いてＥ．ｃｏｌｉＸＬｌ－Ｂｌｕｅゲノムのｉｃｄ遺伝子に統合し^{３５，３６}、Ｍ１３パッケージングシグナルを欠くＭ１３ヘルパープラスミドを形質転換した。得られたＥ．ｃｏｌｉは、対象の配列および単一のＭ１３複製起点をコードするＭ１３ファージのクローン集団を産生した。これを２ｘＹＴ培地で、３７℃で一晩インキュベートし、Ｍｌ３ファージから環状一本鎖のＭ１３ファージゲノムを前述の方法で精製した^１６。エタノール沈殿で精製したＭｌ３ファージゲノムを、２９３ＦＴへのトランスフェクションのために、Ｈ_２Ｏに溶解した。２９３ＦＴにおけるＣｉＳＳＤとＬｉＳＳＤとの比較のために、Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を使用した。２９３ＦＴ細胞を、１０％ＦＢＳ添加のＤＭＥＭで維持し、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。２９３ＦＴ細胞をトリプシン処理し、同量のＰＢＳで１回洗浄した。その後、細胞をＲバッファー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）に再懸濁した。エレクトロポレーションごとに、１２．５ｐｍｏｌの精製したＣａｓ９および５０ｐｍｏｌのｓｇＲＮＡを５μＬのＲバッファー中で、１０分間、室温で混合した。ｓｇＲＮＡを含まないＣａｓ９については、ｓｇＲＮＡを同量のＴＥバッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ）に置き換えた。その後、ＤＮＡドナーテンプレートおよび１５０，０００個の２９３ＦＴ細胞を含む５μＬのＲバッファーと混合し、以下のパラメータ：１１５０Ｖ／２０ｍｓ／２パルスを用いてエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションされた細胞を、２４ウェルプレート中、予め温めておいた１０％ＦＢＳ添加のＤＭＥＭ１ｍＬに播種した。４日後、２００μＬトリプシンで細胞をトリプシン化し、１０％ＦＢＳ添加のフェノールレッドなしのＤＭＥＭ６００μＬを加えて安定化させた。４００μＬの細胞懸濁液をＰＢＳで１回洗浄し、ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（商標）ＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＩｍａｇｉｎｇＫｉｔ、Ｂｌｕｅ／Ｒｅｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）で生細胞および死細胞を染色した後、ＢＤＡｃｃｕｒｉ（商標）Ｃ６ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｅｒを用いてフローサイトメトリーで解析した。ドナーテンプレートが正しく統合された細胞のみがＧＦＰ－ＲＡＢｌ１Ａ融合タンパク質を産生するので、ＧＦＰ陽性細胞の割合を測定することによって、ＤＮＡドナーテンプレートの効率を算出した。各サンプルのＧＦＰ陽性細胞からＧＦＰの強度の幾何平均を測定した。実際、ＣｉＳＳＤ＋Ｃａｓ９＋ｇＲＮＡは、ＬｉＳＳＤ＋Ｃａｓ９＋ｇＲＮＡよりも高い効率を示し（図１）、ＣｉＳＳＤ＋Ｃａｓ９＋ｇＲＮＡは、ＬｉＳＳＤ＋Ｃａｓ９＋ｇＲＮＡよりも有意に強い強度を示した（図２）。生存率を測定するために、各サンプルの細胞の総数をＣｏｕｎｔｅｓｓＩＩＦＬＡｕｔｏｍａｔｅｄＣｅｌｌＣｏｕｎｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）で測定した。フローサイトメトリーのデータから、ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（商標）ＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＩｍａｇｉｎｇＫｉｔ，Ｂｌｕｅ／Ｒｅｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）で決定した生細胞をカウントすることにより、生細胞の割合を決定した。次に、ＣｏｕｎｔｅｓｓＩＩＦＬＡｕｔｏｍａｔｅｄＣｅｌｌＣｏｕｎｔｅｒでカウントした細胞の総数に、フローサイトメトリーで測定した生存率を乗じて、各サンプルの生細胞の総数を決定した。最後に、生細胞の総数を「エレクトロポレーションなし」のサンプルで正規化し、図３に示す生存率を算出した。ＣｉＳＳＤ＋Ｃａｓ９＋ｇＲＮＡおよびＬｉＳＳＤ＋Ｃａｓ９＋ｇＲＮＡの生存率は同程度であったが、ｄｓＤＮＡ（プラスミドＤＮＡ）＋Ｃａｓ９＋ｇＲＮＡよりも有意に高い生存率を有する。

以上は本発明の好ましい実施態様を説明するものであり、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を逸脱することなく変更が可能であることを理解されたい。

参考文献
1. Li, H. et al. Design and specificity of long ssDNA donors for CRISPR-based knock-in. bioRxiv (2017).
2. Codner, G. F. et al. Application of long single-stranded DNA donors in genome editing: generation and validation of mouse mutants. BMC Biol 16, 70 (2018).
3. Lanza, D. G. et al. Comparative analysis of single-stranded DNA donors to generate conditional null mouse alleles. BMC Biol 16, 69 (2018).
4. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B. & Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nat Protoc 13, 195-215 (2018).
5. Xiao, Q. et al. Intracellular generation of single-strand template increases the knock-in efficiency by combining CRISPR/Cas9 with AAV. Mol Genet Genomics 293, 1051-1060 (2018).
6. Du, J. et al. Quantitative assessment of HR and NHEJ activities via CRISPR/Cas9-induced oligodeoxynucleotide-mediated DSB repair. DNA Repair (Amst) 70, 67-71 (2018).
7. Roth, T. L. et al. Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting. Nature 559, 405-409 (2018).
8. Dokshin, G. A., Ghanta, K. S., Piscopo, K. M. & Mello, C. C. Robust Genome Editing With Short Single-Stranded and Long, Partially Single-Stranded DNA Donors in Caenorhabditiselegans. Genetics (2018).
9. Vieira, J. & Messing, J. Production of single-stranded plasmid DNA. Methods in Enzymology 152, 3-11 (1978).
10. Hindley, J. & Phear, G. A. Sequencing long DNA fragments cloned in bacteriophage M13 by using internal primers. The sequence analysis of a yeast DNA fragment containing a replication origin. Biochem J 199, 819-823 (1981).
11. Messing, J. & Vieira, J. A new pair of M13 vectors for selecting either DNA strand of double-digest restriction fragments. Gene 19, 269-276 (1982).
12. Norris, K., Norris, F., Christiansen, L. & Fiil, N. Efficient site-directed mutagenesis by simultaneous use of two primers. Nucleic Acids Res 11, 5103-5112 (1983).
13. Zoller, M. J. & Smith, M. Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any fragment of DNA. Nucleic Acids Res 10, 6487-6500 (1982).
14. Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K. & Silverman, G. J. Phage Display: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001).
15. Nam, K. T. et al. Virus-enabled synthesis and assembly of nanowires for lithium ion battery electrodes. Science 312, 885-888 (2006).
16. Nafisi, P. M., Aksel, T. & Douglas, S. M. Construction of a novel phagemid to produce custom DNA origami scaffolds. bioRxiv ＼(2018).
17. Tsedev, U. Engineering M13 Bacteriophage platforms for cancer therapy applications. Masters Dissertation, Department of Mechanical Engineering, MIT., 48 (2015).
18. Weiss, G. A. & Sidhu, S. S. Design and evolution of artificial M13 coat proteins. J Mol Biol 300, 213-219 (2000).
19. Dotto, G. P. & Horiuchi, K. Replication of a plasmid containing two origins of bacteriophage. J Mol Biol 153, 169-176 (1981).
20. Chasteen, L., Ayriss, J., Pavlik, P. & Bradbury, A. R. Eliminating helper phage from phage display. Nucleic Acids Res 34, e145 (2006).
21. Lin, J. J., Smith, M., Jessee, J. & Bloom, F. DH11S: an Escherichia coli strain for preparation of single-stranded DNA from phagemid vectors. Biotechniques 12, 718-721 (1992).
22. Engler, C., Kandzia, R. & Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One 3, e3647 (2008).
23. Skene, P. J. & Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. Elife 6, (2017).
24. Kosicki, M., Tomberg, K. & Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nat Biotechnol 36, 765-771 (2018).
25. Gross, G., Waks, T. & Eshhar, Z. Expression of immunoglobulin-T-cell receptor chimeric molecules as functional receptors with antibody-type specificity. Proc Natl Acad Sci U S A 86, 10024-10028 (1989).
26. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A. & June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med 365, 725-733 (2011).
27. Reddy, P. & McKenney, K. Improved method for the production of M13 phage and single-stranded DNA for DNA sequencing. Biotechniques 20, 854-6, 858, 860 (1996).
28. Specthrie, L. et al. Construction of a microphage variant of filamentous bacteriophage. J Mol Biol 228, 720-724 (1992).
29. Swarts, D. C. et al. Argonaute of the archaeon Pyrococcus furiosus is a DNA-guided nuclease that targets cognate DNA. Nucleic Acids Res 43, 5120-5129 (2015).
30. Rohland, N. & Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res 22, 939-946 (2012).
31. Krieg, E. & Shih, W. M. Selective Nascent Polymer Catch-and-Release Enables Scalable Isolation of Multi-Kilobase Single-Stranded DNA. Angew. Chem. Int. Ed. 57, 714 -7718 (2018).
32. Paix et al. Precision genome editing using synthesis-dependent repair of Cas9-induced DNA breaks. PNAS E10745-E10754 (2017).
33. Miura et al. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols 13(1) 195-215 (2018).
34. Shepherd et al. Bioproduction of pure, kilobase-scale single-stranded DNA. Scientific Reports 9(6121) (2019).
35. Haldimann, A. & Wanner, B. Conditional-Replication, Integration, Excision, and Retrieval Plasmid-Host Systems for Genetic Structure-Function Studies of Bacteria. J. Bacteriol. 183(21): 6284-6393 (2001).
36. U.S. Pat. Pub. No. 20070128728A1.
37. Gaj et al. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-Based Methods for Genome Engineering. Trends in Biotech. 31(7): 397-405 (2013).
38. Silva et al. Meganucleases and Other Tools for Targeted Genome Engineering: Perspectives and Challenges for Gene Therapy. Curr. Gene Ther. 11(1): 11-27 (2011).
39. Ran et al. Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity. Cell 154(6): 1380-1389 (2013).

Claims

１つまたは複数の遺伝子改変細胞を作製する方法であって、以下：
ＤＮＡインサート、５’ホモロジーアーム、および３’ホモロジーアームを有する環状一本鎖ＤＮＡ（ＣｉＳＳＤ）を細胞に導入する工程であって、前記５’ホモロジーアームおよび３’ホモロジーアームが、前記細胞内ゲノムＤＮＡの標的領域のポリヌクレオチドに相補的である、工程；
前記細胞内ゲノムＤＮＡの標的領域にヌクレオチド切断を誘導する工程；
ＣｉＳＳＤの５’ホモロジーアームおよび３’ホモロジーアームを、前記ゲノムＤＮＡの標的領域内の前記相補的ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせる工程；および
前記ゲノムＤＮＡの標的領域に前記ＤＮＡインサートを挿入する工程、
を含み、これにより、１つ以上の遺伝子改変細胞が作製される、方法。
前記ＤＮＡインサートを有する１つ以上の細胞を選択することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記ヌクレオチド切断が二本鎖ヌクレオチド切断である、請求項１に記載の方法。
前記ヌクレオチド切断が、Ｃａｓヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮヌクレアーゼの部位特異的ヌクレアーゼによって誘導される、請求項１に記載の方法。
前記ＣｉＳＳＤが、イニシエーター配列およびターミネーター配列をさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞がＴ細胞またはナチュラルキラー細胞である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
前記ＤＮＡインサートがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
前記遺伝子改変細胞がＣＡＲ改変Ｔ細胞である、請求項７項に記載の方法。
前記遺伝子改変細胞がＣＡＲ改変ナチュラルキラー細胞である、請求項７項に記載の方法。
前記遺伝子改変細胞が非ヒト胚性幹細胞である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
前記インサートが約２ｋＢ～２０ｋＢである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
前記インサートが約２ｋＢ～１０ｋＢである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
前記インサートが約１．６ｋＢ～５ｋＢである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
前記５’ホモロジーアームおよび３’ホモロジーアームが、それぞれ、約５０ヌクレオチド～３０００ヌクレオチド長である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
前記５’ホモロジーアームおよび３’ホモロジーアームが、それぞれ、約３００～５００ヌクレオチド長である、請求項１４に記載の方法。
疾患、障害、または状態の治療を必要とする対象における疾患、障害、または状態を治療するための方法で、請求項１に記載の１つ以上の遺伝子改変細胞を、それを必要とする前記対象に投与することを含む、方法。