TW202338094A - 功能性dna卡匣及質體 - Google Patents

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Abstract

本發明主要提供一種DNA卡匣，其具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、及第1啟動子序列，且自上述第1啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列，上述第1啟動子序列之3'末端鹼基與上述複製起始序列之末端鹼基之距離為450個鹼基以內；以及一種質體，其具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、第1啟動子序列、及質體複製起點，且自上述第1啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列，上述第1啟動子序列之3'末端鹼基與上述複製起始序列之末端鹼基之距離為2000個鹼基以內。

Description

功能性DNA卡匣及質體
本發明主要關於一種能夠於細菌內進行複製之包含複製起始序列及啟動子序列之DNA卡匣、以及質體。 本申請案主張基於2022年1月19日於日本提出申請之特願2022-006523號之優先權，將其內容援用至本文中。
作為生物技術發展基石之DNA選殖技術係使藉由DNA片段之切割黏貼所製備之環狀DNA於大腸桿菌等細胞內以質體形式擴增之方法。近年來，質體DNA不僅用於基因工程之研究，亦被用作基因治療用之原材料。因此，業界正在尋求自宿主之大腸桿菌高純度地大量製備質體DNA之技術。
高純度大量製備的關鍵之一在於增加每個宿主細胞中保持之質體之複製數。質體之中，既有如源自大腸桿菌F因子之質體般每個宿主細胞中僅保持1～2個之質體，亦有如大腸桿菌素E1因子(ColE1)質體般每個宿主細胞中保持數十個～數百個之質體。例如，大量製備質體時一般使用之pUC或pBR322為ColE1型質體(非專利文獻1及2)。
作為於試管內擴增環狀DNA之方法，已知有複製循環反應(RCR)擴增法(專利文獻1～3)。RCR擴增法係使用如下酵素組來複製具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之oriC的環狀DNA之方法：催化環狀DNA進行複製之酵素組、催化岡崎片段連結反應而合成形成環連體(catenane)之2個姊妹環狀DNA之酵素組、以及催化2個姉妹環狀DNA之分離反應之酵素組。因此，RCR擴增法係使具有oriC之環狀DNA進行擴增。然而，難以使插入有oriC之質體以高複製數保持於宿主細胞內(非專利文獻3)。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2016/080424號 [專利文獻2]國際公開第2017/199991號 [專利文獻3]國際公開第2018/159669號 [專利文獻4]美國專利第7,575,860號說明書 [專利文獻5]美國專利第7,776,532號說明書 [專利文獻6]美國專利第8,968,999號說明書 [專利文獻7]國際公開第2019/009361號 [專利文獻8]國際公開第2016/013592號 [非專利文獻]
[非專利文獻1]Yanisch-Perron et al., Gene, 1985, vol.33, p.103-119. [非專利文獻2]Lin-Chao et al., Molecular Microbiology, 1992, vol.6, p.3385-3393. [非專利文獻3]Loebner-Olesen, EMBO Journal, 1999, vol.18(6), p.1712-1721. [非專利文獻4]de Boer et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1983, vol.80, p.21-25. [非專利文獻5]Lockshon and Morris, Journal of Molecular Biology, 1985, vol.181, p.63-74. [非專利文獻6]Folarin et al., Bioengineering, 2019, vol.6(2):54. [非專利文獻7]Hiasa and Marians, The Journal of Biological Chemistry, 1994, vol.269(43), p.26959-26968. [非專利文獻8]Neylon, et al., Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2005, vol.69(3), p.501-526. [非專利文獻9]Vivian, et al., Journal of Molecular Biology, 2007, vol.370, p.481-491. [非專利文獻10]Hartley et al., Genome Research, 2000, vol.10, p.1788-1795. [非專利文獻11]Copeland et al., Nature Reviews Genetics, 2001, vol,2, p.769-779. [非專利文獻12]Su'etsugu et al., Nucleic Acids Research, 2017, vol.45(20), p.11525-11534.
[發明所欲解決之問題]
本發明之主要目的在於提供一種於細菌內之複製數較高、且於細菌內之保持性優異之質體、以及適於製備此種質體之DNA卡匣。 [解決問題之技術手段]
本發明者等人經過努力研究，結果發現，具有按照轉錄流向作為複製起始序列之oriC(origin of chromosome)之方向設計之啟動子、oriC、及質體複製起點的質體於每個宿主細胞中保持之質體之複製數較高，即便具有oriC，亦能夠於宿主細胞內更穩定地保持質體，從而完成本發明。
即，本發明之DNA卡匣等為下述[1]～[23]。 [1]一種DNA卡匣，其具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、及第1啟動子序列，且 自上述第1啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列， 上述第1啟動子序列之3'末端鹼基與上述複製起始序列之末端鹼基之距離為450個鹼基以內。 [2]一種DNA卡匣，其具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、第1啟動子序列、及旋轉酶結合序列，且 自上述第1啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列， 上述第1啟動子序列之3'末端鹼基與上述複製起始序列之末端鹼基之距離為2000個鹼基以內。 [3]如上述[2]之DNA卡匣，其中上述旋轉酶結合序列為源自噬菌體Mu之序列。 [4]如上述[1]至[3]中任一項之DNA卡匣，其於上述第1啟動子序列之3'側進而具有第2啟動子序列之互補序列。 [5]一種質體，其具有如上述[1]至[4]中任一項之DNA卡匣、及質體複製起點。 [6]一種質體，其具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、第1啟動子序列、及質體複製起點，且 自上述第1啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列， 上述第1啟動子序列之3'末端鹼基與上述複製起始序列之末端鹼基之距離為2000個鹼基以內。 [7]如上述[6]之質體，其進而具有旋轉酶結合序列。 [8]如上述[5]至[7]中任一項之質體，其中上述質體複製起點為ColE1型。 [9]如上述[5]至[8]中任一項之質體，其中上述第1啟動子序列與上述複製起始序列之距離為300個鹼基以內。 [10]一種細菌，其含有如上述[5]至[9]中任一項之質體。 [11]如上述[10]之細菌，其為大腸桿菌。 [12]一種質體之製造方法，其係將上述[10]或[11]之細菌進行培養，自所獲得之培養物回收質體。 [13]一種單鏈RNA之製造方法，其包括：藉由如上述[12]之方法製造質體；及自上述質體藉由轉錄獲得RNA。 [14]一種質體之製作方法，其係製作具有DNA卡匣之質體之方法， 上述DNA卡匣具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、及第1啟動子序列，自上述第1啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列，且上述第1啟動子序列之3'末端鹼基與上述複製起始序列之末端鹼基之距離為2000個鹼基以內， 上述製作方法包括：準備上述DNA卡匣；及於具有質體複製起點之質體導入上述DNA卡匣。 [15]一種質體之製作方法，其係製作具有DNA卡匣之質體之方法，包括： 準備具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列之DNA卡匣； 準備具有質體複製起點及啟動子序列之質體；及 將上述DNA卡匣以自上述質體之啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列之方式導入至上述質體。 [16]一種質體之製作方法，其係製作具有DNA卡匣之質體之方法，包括： 準備具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、及旋轉酶結合序列之DNA卡匣； 準備具有質體複製起點及啟動子序列之質體；及 將上述DNA卡匣以自上述質體之啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列之方式導入至上述質體。 [17]如上述[15]或[16]之質體之製作方法，其中上述啟動子序列之3'末端鹼基與上述複製起始序列之末端鹼基之距離為2000個鹼基以內。 [18]如上述[15]至[17]中任一項之質體之製作方法，其中於上述質體導入上述DNA卡匣包括： 製備含有上述質體、上述DNA卡匣、具有RecA家族重組酵素活性之蛋白、及外切核酸酶之反應溶液；及 保溫上述反應溶液而進行同源重組反應； 上述質體具有Ha區及Hb區，上述Hb區位於上述Ha區之下游， 上述DNA卡匣具有與上述Ha區對應之同源性區域、及與上述Hb區對應之同源性區域，且後者位於前者之下游。 [19]一種高複製質體製作用DNA卡匣，其具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、及旋轉酶結合序列，且 上述DNA卡匣為1000個鹼基長度以下。 [20]一種DNA卡匣，其具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、第1啟動子序列、及終止子序列，且 自上述第1啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列， 上述第1啟動子序列之3'末端鹼基與上述複製起始序列之末端鹼基之距離為200個鹼基以內， 上述終止子序列位於上述第1啟動子序列之下游，上述第1啟動子序列之3'末端鹼基與上述終止子序列之5'末端鹼基之距離為600個鹼基以內。 [21]如上述[20]之DNA卡匣，其進而具有分別相對於上述複製起始序列向外插入之一對ter序列。 [22]一種DNA卡匣，其具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、第1啟動子序列、及分別相對於上述複製起始序列向外插入之一對ter序列，且 自上述第1啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列， 上述第1啟動子序列之3'末端鹼基與上述複製起始序列之末端鹼基之距離為200個鹼基以內。 [23]如上述[22]之DNA卡匣，其於上述第1啟動子序列之下游進而具有終止子序列，上述第1啟動子序列之3'末端鹼基與上述終止子序列之5'末端鹼基之距離為600個鹼基以內。 [發明之效果]
導入有本發明之DNA卡匣之質體及本發明之質體改善於宿主細胞內之保持穩定性，亦增大複製數。因此，藉由導入有該質體之細菌及使用該細菌之質體製造方法，能夠容易地進行質體之大量製備。
於本發明及本申請案說明書中，所謂「DNA卡匣」，意指具有特定功能之雙鏈結構DNA。所謂「oriC卡匣」，意指於細菌內發揮功能之含有包含oriC之鹼基序列之雙鏈結構DNA。
＜DNA卡匣＞ 於一形態中，本發明之DNA卡匣係如下之卡匣：其具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、及第1啟動子序列，自上述第1啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列。按照相較於啟動子序列之5'側，3'側更靠近上述複製起始序列之配置來配置啟動子序列，以使自啟動子之轉錄流向上述複製起始序列，藉此，組入有該DNA卡匣之質體於宿主細胞內之保持穩定性改善，每個宿主細胞中之複製數亦改善。
作為能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列，例如，可自NCBI等公共資料庫獲取大腸桿菌、枯草桿菌等細菌中存在之公知之複製起始序列。又，複製起始序列亦可藉由選殖能夠與具有DnaA活性之酵素結合之DNA片段，對其鹼基序列進行解析而獲得。作為本發明中使用之複製起始序列，亦可使用能夠與具有DnaA活性之酵素結合之改型序列，該序列被導入了使公知之複製起始序列之1個或2個以上之鹼基發生置換、缺失或插入之變異。本發明中使用之複製起始序列較佳為oriC及其改型序列，更佳為源自大腸桿菌之oriC及其改型序列。
作為本發明之DNA卡匣所具有之第1啟動子序列，只要為能夠於導入有包含該DNA卡匣之質體的成為宿主之細菌之細胞內作為啟動子發揮功能之鹼基序列，即，能夠與RNA聚合酶之σ因子結合之轉錄起始序列、或能夠與源自噬菌體之RNA聚合酶結合之轉錄起始序列，則並無特別限定。
作為第1啟動子序列，可為某一生物原本所具有之啟動子(野生型啟動子)之鹼基序列，亦可為將野生型啟動子適當改型而成之啟動子(變異型啟動子)之鹼基序列，亦可為人工合成之啟動子之鹼基序列。其中，較佳為大腸桿菌或噬菌體之基因組中存在之各基因之啟動子之鹼基序列或其改型序列。某一生物之基因組所具有之野生型啟動子序列可自各生物之基因序列資料庫獲取。
又，啟動子包括：誘導常態表現之恆常型啟動子(constitutive promoter)、及可於特定培養條件下誘導表現之誘導型啟動子，作為第1啟動子序列，可為恆常型啟動子，亦可為誘導型啟動子，就質體之操作簡便性之觀點而言，較佳為恆常型啟動子。
作為本發明之DNA卡匣所具有之第1啟動子序列，可列舉具有能夠於大腸桿菌等細菌中與σ因子結合之序列的啟動子序列。作為該第1啟動子序列，較佳為具有能夠於大腸桿菌中與σ因子結合之序列的序列，更佳為具有能夠與σ 70因子結合之序列的序列。自轉錄起始位點之-10區及-35區之序列參與啟動子向σ因子之結合。例如，能夠與σ 70因子結合之一致序列(consensus sequence)較佳為-10區中之5'-TATAAT-3'、-35區中之5'-TTGACA-3'。啟動子序列之來源並無特別限定，就使用實績豐富而言，較佳為常用之導入至大腸桿菌等細菌中之質體所具有之各種啟動子之鹼基序列。具體而言，例如可列舉：源自大腸桿菌之trp啟動子、lac啟動子；源自噬菌體之T7啟動子、T3啟動子、T5啟動子；Tac啟動子等合成啟動子等啟動子之鹼基序列或改型序列(非專利文獻4)。再者，所謂啟動子之改型序列，意指導入有使改型前之鹼基序列之1個或2個以上之鹼基發生置換、缺失或插入之變異，且保持作為啟動子之功能不變的鹼基序列。
於本發明之DNA卡匣中，只要於轉錄進入複製起始序列之位置具有第1啟動子序列，則複製起始序列與第1啟動子序列之距離並無特別限制。尤其就充分獲得導入有該DNA卡匣之質體於宿主細胞內之保持穩定性及複製數之改善效果之方面而言，第1啟動子序列之3'末端鹼基與複製起始序列之末端鹼基之距離較佳為2000個鹼基以內、更佳為1000個鹼基以內、進而較佳為600個鹼基以內、進而更佳為500個鹼基以內。再者，自複製起始序列之序列複製雙向進行，複製起始序列本身並無方向性，因此，只要於轉錄進入複製起始序列之位置具有第1啟動子序列，複製起始序列本身可為任意之朝向。
就DNA卡匣之操作簡便性之觀點而言，第1啟動子序列之3'末端鹼基與複製起始序列之末端鹼基之距離可設為450個鹼基以內，較佳為400個鹼基以內，更佳為300個鹼基以內，進而更佳為200個鹼基以內，尤佳為100個鹼基以內。例如，第1啟動子序列之3'末端鹼基與複製起始序列之末端鹼基之距離可為10～80個鹼基以內，亦可為20～80個鹼基以內、20～70個鹼基以內、20～60個鹼基以內、或20～50個鹼基以內。
於一形態中，本發明之DNA卡匣具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、第1啟動子序列、及旋轉酶結合序列(strong gyrase-binding sequence，SGS)。SGS係結合DNA旋轉酶而於DNA中導入負超螺旋之結合序列，能夠進一步提高包含該DNA卡匣之質體於宿主細胞內之平均複製數。作為SGS，可列舉包含作為其一致序列之RNNNRNR[T/G]GRYC[G/T]YNYN[G/T]NY(R＝A或G、Y＝C或T、N＝A、G、C或T)(序列編號32)或其互補序列的序列(非專利文獻5)。SGS只要具有一致序列，可為源自任意物種之序列，例如可使用源自噬菌體之SGS、源自質體之SGS。又，SGS亦可具有一致序列前後之序列，亦可為源自某一物種之SGS之改型序列。該改型序列意指導入有使改型前之鹼基序列之1個或2個以上之鹼基發生置換、缺失或插入之變異，且保持進一步提高包含其之質體於宿主細胞內之平均複製數之功能不變的鹼基序列。SGS可配置於DNA卡匣之任意位置，與複製起始序列及第1啟動子序列相距之距離亦無特別限定。就充分獲得質體於宿主細胞內之保持穩定性及複製數之改善效果之觀點而言，較佳為源自pBR322質體、pSC101質體或噬菌體Mu之SGS，更佳為源自噬菌體Mu之SGS(Mu-SGS)(非專利文獻6)。
於具有SGS之DNA卡匣中，只要於轉錄進入複製起始序列之位置具有第1啟動子序列，SGS之位置、或複製起始序列與第1啟動子序列之距離並無特別限制。例如，可使SGS位於複製起始序列與選自第1啟動子序列、ter序列、終止子序列及第2啟動子序列中之序列之間，亦可使選自第1啟動子序列、ter序列、終止子序列及第2啟動子序列中之序列位於SGS與複製起始序列之間。尤其就充分獲得導入有該DNA卡匣之質體於宿主細胞內之保持穩定性及複製數之改善效果之方面而言，第1啟動子序列之3'末端鹼基與複製起始序列之末端鹼基之距離較佳為2000個鹼基以內，更佳為1000個鹼基以內。
就DNA卡匣之操作簡便性之觀點而言，第1啟動子序列之3'末端鹼基與複製起始序列之末端鹼基之距離可較佳設為450個鹼基以內，可更佳設為400個鹼基以內，可進而較佳設為300個鹼基以內，可進而更佳設為200個鹼基以內，可尤佳設為100個鹼基以內。於第1啟動子序列之3'末端鹼基與複製起始序列之間配置SGS之情形時，第1啟動子序列之3'末端鹼基與SGS之末端之距離可較佳設為450個鹼基以內，可更佳設為400個鹼基以內，可進而較佳設為300個鹼基以內，可進而更佳設為200個鹼基以內，可尤佳設為100個鹼基以內。例如，第1啟動子序列之3'末端鹼基與複製起始序列之末端鹼基之距離、或者第1啟動子序列之3'末端鹼基與SGS之末端之距離亦可設為10～80個鹼基以內，亦可為20～80個鹼基以內、20～70個鹼基以內、20～60個鹼基以內、或20～50個鹼基以內。
本發明之DNA卡匣除具有第1啟動子序列與複製起始序列以外，亦可具有分別相對於複製起始序列向外插入之一對ter序列。或本發明之DNA卡匣除具有第1啟動子序列與複製起始序列以外，亦可具有DNA多聚體分離酵素識別之鹼基序列(專利文獻3)。藉此，於試管內利用RCR擴增法(專利文獻1～3)等使包含該DNA卡匣之質體擴增之情形時，能夠抑制DNA多聚體之產生，效率良好地獲得該質體之擴增產物。
關於ter序列，所謂「相對於複製起始序列向外插入」，意指以如下方向插入ter序列：於具有與ter序列結合而抑制複製之活性的蛋白之組合作用下，對於自如oriC之複製起始序列朝向外側之方向之複製而允許進行複製，另一方面，對於向複製起始序列進入之方向之複製則不允許複製而停止進行。因此，關於ter序列，所謂「分別相對於複製起始序列向外插入之一對」，意指於複製起始序列之5'側插入一個ter序列、於複製起始序列之3'側插入另一個ter序列的狀態。作為於複製起始序列之5'側插入之ter序列，例如可列舉後述序列編號1～16表示之序列。作為於複製起始序列之3'側插入之ter序列，例如可列舉包含於複製起始序列之5'側插入之鹼基序列之互補序列的序列。ter序列只要為分別相對於複製起始序列向外插入之一對，可存在於任意之位置。
例如，作為基於具有與DNA上之ter序列結合而抑制複製之活性之蛋白、與ter序列而成的複製終止系統，已知於大腸桿菌中為Tus-ter系統(非專利文獻7或8)、於芽孢桿菌屬(Bacillus)細菌中為RTP-ter系統(非專利文獻9)。作為ter序列，可使用能夠用於該等系統之ter序列或其改型序列。再者，所謂ter序列之改型序列，意指導入有使改型前之鹼基序列之1個或2個以上之鹼基發生置換、缺失或插入之變異，且保持作為ter序列之功能不變的鹼基序列。於使用Tus-ter系統之情形時，質體複製時使用Tus蛋白；於使用RTP-ter系統之情形時，質體複製時使用RTP蛋白。
本發明之DNA卡匣或質體所具有之ter序列可為野生型，亦可為變異型。作為可用於Tus-ter系統之野生型ter序列，可列舉5'-GN[A/G][T/A]GTTGTAAC[T/G]A-3'(序列編號1)，較佳為包含5'-G[T/G]A[T/A]GTTGTAAC[T/G]A-3'(序列編號2)、5'-GTATGTTGTAACTA-3'(序列編號3)、5'-AGTATGTTGTAACTAAAG-3'(序列編號4)、5'-GGATGTTGTAACTA-3'(序列編號5)、5'-GTATGTTGTAACGA-3'(序列編號6)、5'-GGATGTTGTAACTA-3'(序列編號7)、5'-GGAAGTTGTAACGA-3'(序列編號8)、或5'-GTAAGTTGTAACGA-3'(序列編號9)之鹼基序列。又，作為本發明之DNA卡匣或質體所具有之ter序列，較佳為變異型ter序列。作為變異型ter序列，可列舉包含序列編號1之鹼基序列中之一個或數個鹼基經置換之改型序列的鹼基序列。作為本發明之DNA卡匣所具有之變異型ter序列，較佳為5'-GN[A/G][T/A]GTTGTAcC[T/G]A-3'(序列編號10)、5'-GTATGTTGTAcCTA-3'(序列編號11)。
作為可用於RTP-ter系統之ter序列，可列舉包含5'-AC[T/A][A/G]ANNNNN[C/T]NATGTACNAAAT-3'(序列編號12)之鹼基序列。作為用以於本發明之DNA卡匣所具有之RTP-ter系統中使用之ter序列，較佳為包含5'-ACTAATT[A/G]A[A/T]C[T/C]ATGTACTAAAT-3'(序列編號13)、5'-ACTAATT[A/G]A[A/T]C[T/C]ATGTACTAAATTTTCA-3'(序列編號14)、5'-GAACTAATTAAACTATGTACTAAATTTTCA-3'(序列編號15)、或5'-ATACTAATTGATCCATGTACTAAATTTTCA-3'(序列編號16)之鹼基序列。
一對ter序列只要分別相對於複製起始序列向外插入，其配置並無特別限定，可配置於第1啟動子序列之5'側，亦可配置於3'側。亦可配置於複製起始序列與其他序列(例如SGS)之間，亦可配置於外側。ter序列之3'末端鹼基與複製起始序列末端之距離例如可為2000個鹼基以內，亦可為1500個鹼基以內、1000個鹼基以內。於一形態中，就DNA卡匣之操作簡便性之觀點而言，ter序列之3'末端鹼基與複製起始序列之5'末端鹼基之距離較佳為300個鹼基以內，更佳為200個鹼基以內。又，複製起始序列之3'末端鹼基與該ter序列之互補序列之5'末端鹼基之距離較佳為300個鹼基以內，更佳為200個鹼基以內。
於試管內利用RCR擴增法等進行擴增之情形時，就抑制DNA多聚體之產生、效率良好地獲得該質體之擴增產物之觀點而言，ter序列之3'末端鹼基與複製起始序列之5'末端鹼基之距離、或者複製起始序列之3'末端鹼基與該ter序列之互補序列之5'末端鹼基之距離較佳為300個鹼基以內，更佳為200個鹼基以內。例如，ter序列之3'末端鹼基與複製起始序列之5'末端鹼基之距離、或者複製起始序列之3'末端鹼基與該ter序列之互補序列之5'末端鹼基之距離可為10～80個鹼基以內，亦可為20～80個鹼基以內、20～70個鹼基以內、20～60個鹼基以內、或20～50個鹼基以內。於與複製起始序列鄰接地配置SGS之情形時，ter序列之3'末端鹼基與複製起始序列或SGS之5'末端鹼基之距離、或者複製起始序列或SGS之3'末端鹼基與該ter序列之互補序列之5'末端鹼基之距離較佳為300個鹼基以內，更佳為200個鹼基以內，例如，可為10～80個鹼基以內，亦可為20～80個鹼基以內、20～70個鹼基以內、20～60個鹼基以內、或20～50個鹼基以內。
本發明之DNA卡匣可於第1啟動子序列之下游具有終止子序列。作為本發明之DNA卡匣，可較佳地將該終止子序列配置於第1啟動子序列之3'側且進而為複製起始序列之3'側。第1啟動子序列之3'末端鹼基與該終止子序列之5'末端鹼基之距離並無特別限定，可為2500個鹼基以內，較佳為2000個鹼基以內，更佳為1000個鹼基以內，進而較佳為600個鹼基以內。
於第1啟動子序列之3'側且進而為複製起始序列之3'側配置終止子序列之情形時，複製起始序列之3'末端鹼基與該終止子序列之5'末端鹼基之距離並無特別限定，例如可為2000個鹼基以內，亦可為1500個鹼基以內、1000個鹼基以內，於一形態中，就DNA卡匣之操作簡便性之觀點而言，較佳為300個鹼基以內，更佳為200個鹼基以內。例如，ter序列之複製起始序列之3'末端鹼基與該終止子序列之5'末端鹼基之距離可為10～80個鹼基以內，亦可為20～80個鹼基以內、20～70個鹼基以內、20～60個鹼基以內、或20～50個鹼基以內。
作為本發明之DNA卡匣所具有之終止子序列，只要為能夠於成為導入有包含該DNA卡匣之質體之宿主的細菌之細胞內作為終止子發揮功能之鹼基序列，即，使轉錄終止之鹼基序列，則無特別限定。
作為終止子序列，可為某一生物原本含有之終止子(野生型終止子)之鹼基序列，亦可為將野生型終止子適當改型而成之終止子(變異型終止子)之鹼基序列，亦可為人工合成之終止子之鹼基序列。其中，較佳為大腸桿菌或噬菌體之基因組中存在之各基因之終止子之鹼基序列或其改型序列。於細菌之終止子序列之情形時，可為Rho依賴性，亦可為Rho非依賴性。作為細菌之終止子序列，例如可列舉：編碼大腸桿菌之甲酸去氫酶之基因(fdhF)之終止子序列、核糖體RNA基因(rrnB等)之T1或T2終止子(尤其是T1終止子)序列等。某一生物之基因組所含有之野生型終止子序列可自各生物之基因序列資料庫獲取。
又，於一形態中，本發明亦關於一種DNA卡匣，其具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、第1啟動子序列、及終止子序列，且自上述第1啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列，上述終止子序列位於上述第1啟動子序列之下游。於該DNA卡匣中，上述第1啟動子序列之3'末端鹼基與上述複製起始序列之末端鹼基之距離為200個鹼基以內，上述第1啟動子序列之3'末端鹼基與上述終止子序列之5'末端鹼基之距離為600個鹼基以內，例如為300個鹼基以上600個鹼基以內。該DNA卡匣亦可進而具有分別相對於上述複製起始序列向外插入之一對ter序列。於該DNA卡匣中，上述終止子序列可位於上述第1啟動子序列之下游且上述複製起始序列之下游。該DNA卡匣可於上述第1啟動子序列之下游具有包含分別相對於複製起始序列向外插入之一對ter序列的上述複製起始序列，進而，上述終止子序列位於上述複製起始序列之下游。於一形態中，該DNA卡匣之長度為300～2000個鹼基對(bp)，較佳為350～1000個鹼基對，更佳為400～1000個鹼基對。
又，於一形態中，本發明亦關於一種DNA卡匣，其具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、第1啟動子序列、及分別相對於上述複製起始序列向外插入之一對ter序列，且自上述第1啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列，上述第1啟動子序列之3'末端鹼基與上述複製起始序列之末端鹼基之距離為200個鹼基以內。該DNA卡匣於上述第1啟動子序列之下游進而具有終止子序列，上述第1啟動子序列之3'末端鹼基與上述終止子序列之5'末端鹼基之距離可為600個鹼基以內。分別相對於複製起始序列向外插入之一對ter序列於DNA卡匣中之位置並無特別限定，於一形態中，該DNA卡匣於上述第1啟動子序列之下游具有包含分別相對於複製起始序列向外插入之一對ter序列的上述複製起始序列。ter序列之3'末端鹼基與複製起始序列之距離、或者複製起始序列與該ter序列之互補序列之5'末端鹼基之距離較佳為300個鹼基以內，更佳為200個鹼基以內，例如可為10～80個鹼基以內，亦可為20～80個鹼基以內、20～70個鹼基以內、20～60個鹼基以內、或20～50個鹼基以內。於一形態中，該DNA卡匣可為300～2000個鹼基對，較佳為350～1000個鹼基對，更佳為400～1000個鹼基對。
作為本發明之DNA卡匣，較佳為進而於第1啟動子序列之3'側且複製起始序列之5'側具有第2啟動子序列之互補序列。按與第1啟動子序列正面相撞之方向(逆向)插入第2啟動子序列，利用自該第2啟動子之逆向轉錄來抵消轉錄進入複製起始序列之效果，藉此，能夠進一步改善包含該DNA卡匣之質體於宿主細胞內之保持穩定性，提高每個宿主細胞中之平均複製數。
第2啟動子序列之互補序列於DNA卡匣中之位置只要為第1啟動子序列之3'側且複製起始序列之5'側，則其位置並無特別限定。例如，可使第1啟動子序列與第2啟動子序列之互補序列接近，亦可使第1啟動子序列與複製起始序列接近。
作為該第2啟動子序列，可採用與上述第1啟動子序列中所列舉之啟動子序列相同者。該第2啟動子序列較佳為與第1啟動子序列不同種類之啟動子序列，更佳為誘導型啟動子。於一形態中，可使用恆常型啟動子作為第1啟動子序列，使用誘導型啟動子作為第2啟動子。
＜質體＞ 本發明亦關於一種質體，其具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、第1啟動子序列、及質體複製起點，且自上述第1啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列，上述第1啟動子序列之3'末端鹼基與上述複製起始序列之末端鹼基之距離為2000個鹼基以內。於該質體中，例如第1啟動子序列之3'末端鹼基與複製起始序列之末端鹼基之距離可設為1000個鹼基以內，較佳為600個鹼基以內，更佳為500個鹼基以內，進而較佳為400個鹼基以內，尤佳為300個鹼基以內。與上述本發明之DNA卡匣同樣地，該質體中之質體複製起點較佳為ColE1型。又，與上述本發明之DNA卡匣同樣地，該質體可進而於上述第1啟動子序列之3'側且上述複製起始序列之5'末端側具有第2啟動子序列之互補序列，亦可具有SGS，亦可具有分別相對於上述複製起始序列向外插入之一對ter序列，亦可進而於第1啟動子序列之下游具有終止子序列。又，本發明亦關於一種於具有質體複製起點之質體導入本發明之DNA卡匣而成之質體。該等本發明之質體於宿主細胞內之保持穩定性及平均複製數改善。因此，本發明之質體較佳為向質體所具有之上述複製起始序列能夠發揮功能之宿主細胞導入之質體。
作為本發明之質體所具有之質體複製起點，例如可列舉：ColE1型、p15A型、psC101型、P1型、F型、R1型、R6Kγ型、λ型、ϕB2型、ϕB0型、RK2型、P4型等於大腸桿菌內發揮功能之質體複製起點，就複製數較多而言，尤佳為ColE1型。作為ColE1型複製起點，可列舉：作為pUC、pGEM、pTZ、pBR322等質體之複製起點的pMB1，作為pBluescript等質體之複製起點的ColE1，或者該等之改型序列。作為該改型序列，可使用導入有使改型前之鹼基序列之1個或2個以上之鹼基發生置換、缺失或插入之變異，且保持作為質體複製起點之功能不變的鹼基序列。
DNA卡匣或各序列向質體之導入可利用於環狀DNA中組入DNA片段時常用之各種基因改型技術來進行。例如可以下述方式於質體導入DNA卡匣：於DNA卡匣之兩端設置與待導入該DNA卡匣之對象質體所具有之限制酵素部位相同種類之限制酵素部位，將經限制酵素消化之DNA卡匣片段與質體片段藉由結紮(ligation)進行連結。又，亦可將質體直鏈狀化後，與DNA卡匣片段進行連結後製成環狀。導入各序列之情形亦相同。亦可於具有質體複製起點及如上所述之啟動子之質體中，以使自該啟動子之轉錄流向複製起始序列之方式導入複製起始序列而獲得本發明之質體。質體之直鏈狀化可藉由限制酵素處理、或以質體為模板之PCR擴增來進行。作為直鏈狀DNA片段彼此之連結反應，例如有In fusion法(專利文獻4)、Gibson Assembly法(專利文獻5及6)、Recombination Assembly法(專利文獻7)。
作為於環狀質體中直接組入DNA卡匣片段之方法，已知例如利用定點重組機制之Gateway選殖(非專利文獻10)，市售有試劑套組(Thermo fisher公司製造)。Gateway選殖中，作為待插入直鏈狀DNA片段之對象的環狀DNA需具有被定點重組酵素識別之重組序列。此外，作為於細胞內對環狀DNA進行直鏈狀DNA片段之插入或置換之方法，已知利用同源重組機制之Recombineering法(非專利文獻11)。另外，亦可如後述實施例所示，於DNA卡匣片段之兩端附加與質體中之目標區域為同源性之鹼基序列，使用RecA家族重組酵素與視需要之外切核酸酶，進行體外(in vitro)同源重組反應，藉此於質體中組入DNA卡匣片段。該反應可採用OriCiro Cell-free切換系統(OriCiro Cell-free switching system)(Oriciro Genomics公司製造)。
於一形態中，本發明亦關於一種具有DNA卡匣之質體之製作方法，其包括：準備具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列的DNA卡匣；及於具有質體複製起點之質體導入上述DNA卡匣；且於上述質體導入上述DNA卡匣包括：製備含有上述質體、上述DNA卡匣、具有RecA家族重組酵素活性之蛋白、及外切核酸酶之反應溶液；及保溫上述反應溶液而進行同源重組反應。於該方法中，上述質體具有Ha區及Hb區，上述Hb區位於上述Ha區之下游，又，上述DNA卡匣具有與上述Ha區對應之同源性區域、及與上述Hb區對應之同源性區域，且後者位於前者之下游。
同源重組反應可參照後述實施例來實施，簡單來說，準備於兩端附加有被質體中欲導入DNA卡匣之目標區域隔開之Ha區及Hb區各自之同源性鹼基序列的DNA卡匣片段(即，兩端具有與Ha區對應之同源性區域、及與Hb區對應之同源性區域的DNA卡匣片段)。製作含有該DNA卡匣、質體、RecA家族重組酵素、及外切核酸酶之反應溶液，將其進行保溫，藉此，可實施同源重組反應。作為反應溫度，較佳為20～48℃之溫度範圍內，更佳為24～42℃之溫度範圍內。
上述RecA家族重組酵素意指具有如下功能(RecA家族重組酵素活性)之蛋白：於單鏈狀態或雙鏈狀態之DNA上聚合形成長絲(filament)，對ATP(三磷酸腺苷)等三磷酸核苷具有水解活性，搜索同源區域進行同源重組。作為RecA家族重組酵素蛋白，可列舉：原核生物RecA同源物(大腸桿菌RecA等)、噬菌體RecA同源物、古細菌RecA同源物、真核生物RecA同源物等，可為野生型蛋白，亦可為於野生型蛋白中導入有使1～30個例如1～10個、較佳為1～5個胺基酸發生缺失、附加或置換之變異，且保持RecA家族重組酵素活性的改型體。反應溶液中之RecA家族重組酵素蛋白之量並無特別限定，於反應之起始時點，例如較佳為0.01～100 μM，更佳為0.1～100 μM，進而較佳為0.1～50 μM，進而更佳為0.5～10 μM，尤佳為1.0～5.0 μM。
上述外切核酸酶只要為具有自直鏈狀DNA之3'末端或5'末端起依次進行水解之酵素活性者，其種類或生物學來源並無特別限制。例如，作為3'→5'外切核酸酶，較佳為外切核酸酶III等外切核酸酶III家族型之AP核酸內切酶，作為5'→3'外切核酸酶，較佳為T5外切核酸酶。
作為Ha區及Hb區、以及與Ha區對應之同源性區域及與Hb區對應之同源性區域之鹼基對長度，較佳為10個鹼基對以上，更佳為15鹼基對以上，進而較佳為20個鹼基對以上。又，作為Ha區及Hb區之鹼基對長度，較佳為500個鹼基對以下，更佳為300個鹼基對以下，進而較佳為200個鹼基對以下，進而更佳為150個鹼基對以下。
反應溶液內含有之質體及DNA卡匣之量並無特別限定，例如於反應之起始時點，可設為0.4 pM以上、較佳為4 pM以上、更佳為40 pM以上。就同源重組效率更高而言，於反應溶液內在反應之起始時點時含有之質體及DNA卡匣之總濃度較佳為100 nM以下，更佳為40 nM以下，進而較佳為4 nM以下，尤佳為0.4 nM以下。
反應溶液進而含有三磷酸核苷(選自ATP、GTP、CTP、UTP、m5UTP中之1種以上)及去氧三磷酸核苷(選自dATP、dGTP、dCTP及dTTP中之1種以上)之至少一者、鎂離子(Mg 2 ＋)源(Mg(OAc) 2、MgCl 2、MgSO 4等)，較佳為進而含有用以使三磷酸核苷或去氧三磷酸核苷再生之再生酵素與其受質之組合(肌酸激酶與肌酸磷酸酯之組合、丙酮酸激酶與磷酸烯醇丙酮酸之組合、乙酸激酶與乙醯磷酸之組合、多磷酸激酶與多磷酸之組合、核苷二磷酸激酶與三磷酸核苷之組合等)。
作為供導入本發明之質體之宿主細胞，較佳為大腸桿菌、枯草桿菌、放線菌、古細菌等細菌，更佳為大腸桿菌或放線菌，進而較佳為常用於質體大量製備之大腸桿菌。供組入本發明之DNA卡匣之質體並無特別限定，藉由在公知之任意質體中組入本發明之DNA卡匣，能夠提高每個宿主細胞中保持之質體之複製數，又，能夠於宿主細胞內更穩定地保持質體。該質體較佳為具有上述質體複製起點者，更佳為用於進行大量製備之質體，進而較佳為作為具有如ColE1或pMB1之ColE1型質體複製起點之質體的pUC、pBR322、pBluescript、pGEM或pTZ質體，進而更佳為pUC，尤佳為pUC18或pUC19、pUC57、pBluescript及其衍生質體之類的每個宿主細胞中之平均複製數達500～700或其以上之高複製質體。藉由在此種高複製質體中組入本發明之DNA卡匣，能夠進一步提高其複製數。於一形態中，本發明之質體於宿主細胞(較佳為大腸桿菌)內發揮功能時，每個宿主細胞中保持之質體之平均複製數為1個複製以上，較佳為10以上，更佳為20以上，進而較佳為20～10000，進而更佳為500～5000。又，於一形態中，亦可根據所使用之啟動子之特性來選擇質體。
關於組入有本發明之DNA卡匣之質體向宿主細胞之導入，可藉由向細菌細胞中導入質體時常用之各種方法或其變化方法實施。作為質體之導入方法，例如可列舉：PEG(聚乙二醇)法、化學法、電穿孔法等。該等方法可藉由常規方法實施。
本發明之DNA卡匣具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列。亦可採用RCR擴增法於試管內擴增組入有該卡匣之質體。
＜質體之製作方法＞ 於一形態中，本發明亦關於一種質體之製作方法，其包括：準備具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、及第1啟動子序列之DNA卡匣；及於具有質體複製起點之質體導入上述DNA卡匣。該DNA卡匣為具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、及第1啟動子序列之DNA卡匣，且自上述第1啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列，上述第1啟動子序列之3'末端鹼基與上述複製起始序列之末端鹼基之距離為2000個鹼基以內。於一形態中，與製作時使用之質體相比，所製成之質體為高複製質體，於同一條件下於宿主細胞(較佳為大腸桿菌)內發揮功能時，每個宿主細胞中保持之質體之平均複製數更高。
於該方法中，導入至質體之DNA卡匣只要於轉錄進入複製起始序列之位置具有第1啟動子序列，複製起始序列與第1啟動子序列之距離並無特別限制。例如，第1啟動子序列之3'末端鹼基與複製起始序列之末端鹼基之距離可設為1000個鹼基以內，較佳為600個鹼基以內，更佳為500個鹼基以內，進而較佳為400個鹼基以內，尤佳為300個鹼基以內。與上述本發明之DNA卡匣同樣地，該方法中之質體複製起點較佳為ColE1型。又，與上述本發明之DNA卡匣同樣地，該方法中之DNA卡匣可進而於上述第1啟動子序列之3'側且上述複製起始序列之5'末端側具有第2啟動子序列之互補序列，亦可具有SGS，亦可具有分別相對於上述複製起始序列向外插入之一對ter序列，亦可進而於第1啟動子序列之下游具有終止子序列。
如上所述，亦可藉由在具有質體複製起點及如上所述之啟動子之質體中，以自該啟動子之轉錄流向複製起始序列之方式導入複製起始序列，而獲得本發明之質體。因此，於一形態中，本發明亦關於一種製作具有DNA卡匣之質體之方法，其包括：準備具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列之DNA卡匣；準備具有質體複製起點及啟動子序列之質體；及將上述DNA卡匣以自上述質體之啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列之方式導入至上述質體。按照相較於上述質體之啟動子序列之5'側，3'側更靠近上述複製起始序列的配置，將上述複製起始序列導入至上述質體，藉此，能夠使自上述質體之啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列。於上述方法中，上述DNA卡匣亦可進而具有選自旋轉酶結合序列、第2啟動子序列及終止子序列等之1個以上之序列。又，上述方法亦可包括：將進而具有選自旋轉酶結合序列、第2啟動子序列及終止子序列等之1個以上之序列的DNA卡匣導入至上述質體。又，於一形態中，本發明亦關於一種製作具有DNA卡匣之質體之方法，其包括：準備具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、及旋轉酶結合序列之DNA卡匣；準備具有質體複製起點及啟動子序列之質體；及將上述DNA卡匣以自上述質體之啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列之方式導入至上述質體。
所製成之質體較佳為高複製質體，與製作時使用之質體相比，於同一條件下於宿主細胞(較佳為大腸桿菌)內發揮功能時，每個宿主細胞中保持之質體之平均複製數更高。各步驟可參照本發明之DNA卡匣、質體及質體製作方法之記載來實施。於一形態中，上述啟動子序列之3'末端鹼基與上述複製起始序列之末端鹼基之距離為2000個鹼基以內，較佳為1000個鹼基以內，更佳為600個鹼基以內，進而較佳為500個鹼基以內。
進而，於一形態中，本發明亦關於一種高複製質體製作用DNA卡匣，其具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、及旋轉酶結合序列。該DNA卡匣亦可進而具有選自第2啟動子序列及終止子序列等中之1個以上之序列。以自上述質體之啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列之方式，將該DNA卡匣導入至具有質體複製起點及啟動子序列之質體，藉此可製作高複製質體。該高複製質體製作用DNA卡匣之長度並無特別限定，例如為300個鹼基以上2000個鹼基以內，較佳為1000個鹼基以內，更佳為600個鹼基以內，進而較佳為500個鹼基以內。
＜質體之製造方法＞ 將組入有本發明之DNA卡匣之質體或本發明之質體導入至大腸桿菌等宿主細胞而獲得之轉形體，進行培養使之增殖，藉此，能夠於該宿主細胞內複製質體。自宿主細胞之培養物進行提取，視需要純化而回收所複製之質體，藉此，能夠大量製造質體。轉形體之培養、或自轉形體之質體回收可藉由大腸桿菌等細菌之培養或DNA提取所採用之一般方法實施。
於本發明之DNA卡匣或本發明之質體中之啟動子為誘導型啟動子之情形時，藉由用以誘導該誘導型啟動子進行表現之特定培養條件來培養宿主細胞。藉此，該質體於宿主細胞中之保持穩定性、及每個宿主細胞中之複製數進一步改善，能夠回收更大量之質體。
組入有本發明之DNA卡匣之質體及本發明之質體可用於基因工程之研究，或可用作基因治療用之原材料。例如，可使用該質體作為病毒製作用載體。又，亦可使用組入有本發明之DNA卡匣之質體或本發明之質體作為原料，製造mRNA之類的單鏈RNA。RNA之製造可藉由自質體DNA轉錄RNA常用之一般方法實施。 [實施例]
其次，藉由實施例等對本發明進行更詳細之說明，但本發明並不限定於該等例。
[實施例1] 製備包含oriC之3種DNA片段，製造於不含oriC序列之質體pUC4K(GenBank登錄號：X06404，全長3.9 kbp)中組入有該等DNA片段之質體。將該等質體導入至大腸桿菌而製造轉形體，對增殖性與複製所得之質體進行研究。
＜oriC卡匣片段之製備＞ 製備作為oriC_ter卡匣(378 bp，序列編號19)之DNA片段：於該DNA片段中，與源自大腸桿菌染色體之oriC序列(序列編號17)之5'側鄰接地連結野生型ter序列(terWT序列，序列編號18)，與上述oriC之3'側鄰接地連結terWT序列之互補序列，並且，於兩末端具有與位於pUC4K之pUC origin之外側且相鄰之40 bp之區域為同源性的重疊序列。terWT序列為包含序列編號4之鹼基序列之序列。 製備作為PoriC_terG16卡匣(426 bp，序列編號24)之DNA片段：於該DNA片段中，與源自大腸桿菌染色體之oriC序列(序列編號20)之5'側鄰接地連結變異型ter序列(terG16序列，序列編號21)，於上述oriC之3'側之附近連結terG16序列之互補序列，進而於terG16序列之5'側之附近配置Tac啟動子序列(序列編號22)，進而於terG16序列之互補序列之3'側之附近配置大腸桿菌fdhF基因之終止子序列(序列編號23)。terG16序列為包含序列編號4之鹼基序列之單鹼基變異序列(序列編號11)之序列。 製備作為PoriC卡匣(390 bp，序列編號25)之DNA片段：該DNA片段係自PoriC_terG16卡匣去除oriC序列之5'側之terG16序列及oriC序列之3'側之terG16序列之互補序列。
將各oriC卡匣之鹼基序列示於表1。表中，5'末端之大寫字母區域表示Tac啟動子序列，3'末端之大寫字母區域表示fdhF終止子序列，中央附近之大寫字母區域表示oriC序列。又，方框包圍之區域表示terWT序列、terG16序列、及該等之互補序列。又，oriC_ter卡匣之5'末端與3'末端之小寫字母區域表示重疊序列。
[表1]
＜oriC卡匣片段向pUC4K之組入＞ 採用利用同源重組反應之OriCiro Cell-free切換系統，於pUC4K中組入各oriC卡匣片段。將pUC4K中之目標區域設定為ColE1型質體所共通之區域，且係位於ColE1 origin(ColE1型質體原本具有之oriC)之外側的相鄰之60 bp之區域。首先，以各oriC卡匣片段為模板，使用表2記載之引子組進行PCR，藉此，獲得兩末端附加有與目標區域(60 bp)同源性之鹼基序列(重疊序列)之DNA片段作為擴增產物。表2之各引子之鹼基序列中，大寫字母所示區域為重疊序列。
[表2]
於OriCiro Cell-free切換系統之反應中，使用200 pM之pUC4K、及200 pM之附加有重疊序列之oriC卡匣片段。按照套組說明書進行RCR擴增反應後，對1 μL該稀釋溶液進行瓊脂糖電泳，將分離出之條帶進行SYBR(註冊商標)Green染色。
將染色結果示於圖1。圖中，「PoriC」之泳道(lane)係於pUC4K中組入PoriC卡匣所得之質體pUC4K-PoriC之RCR擴增產物經過電泳後之泳道，「PoriC_terG16」之泳道係於pUC4K中組入PoriC_terG16卡匣所得之質體pUC4K-PoriC_terG16之RCR擴增產物經過電泳後之泳道。如圖1所示，不含terG16序列之pUC4K-PoriC中，多聯體(concatemer)之產物亦附帶地得以擴增。相對於此，pUC4K-PoriC_terG16中，多聯體之擴增被抑制，以超螺旋單體(Supercoiled monomer)形式進行RCR擴增。該等結果表明，PoriC_terG16卡匣作為RCR之複製起點發揮功能，又，即便為於ter之一致序列存在鹼基置換之terG16序列，亦發揮抑制多聯體之功能。
＜導入組入有oriC卡匣之質體後之轉形體＞ 將於pUC4K中組入各oriC卡匣所得之質體、及pUC4K(10 ng)分別藉由化學法導入至大腸桿菌DH5α株(Takara Bio公司製造)。其後，將其一部分於含100 μg/mL卡本西林(carbenicillin)之LB瓊脂培養基中，於30℃下培養41小時。將培養後之各瓊脂培養基之光透射照片示於圖2。
如圖2所示，導入於pUC4K中組入oriC_ter卡匣所得之質體pUC4K-oriC_ter之情形時，與導入pUC4K之情形時相比，生成之菌落明顯較小，轉形後大腸桿菌之生長受到抑制。相對於此，導入組入有於oriC之5'側按轉錄流向oriC之方向配置啟動子序列之oriC卡匣的pUC4K-PoriC及pUC4K-PoriC_terG16後之轉形體中，觀察到形成與導入pUC4K之情形時大小為相同程度之菌落。未檢測到因oriC序列附近有無terG16序列所引起之生長差異。根據該等結果確認，藉由組入按轉錄流向oriC之方向配置啟動子序列之oriC卡匣，改善質體於大腸桿菌內之保持穩定性，導入該質體後之轉形體基本上正常生長。
將導入有pUC4K-PoriC_terG16之轉形大腸桿菌之細胞內pUC4K-PoriC_terG16之複製數，與導入有pUC4K之轉形大腸桿菌之細胞內pUC4K之複製數進行比較。具體而言，自瓊脂平板培養基中選擇複數個大腸桿菌菌落，將各轉形大腸桿菌於含50 μg/mL卡本西林之液體培養基10 mL中，於37℃下進行16小時之振盪培養。作為液體培養基，使用LB液體培養基或2×YT液體培養基。測定經培養後之培養液之濁度(600 nm之吸光度：A 600)，分取[濁度(A 600)]×[體積(mL)]＝3時之體積，藉此使供於計測之樣品中之大腸桿菌數一致，進行質體提取。質體提取時使用市售之DNA提取套組(製品名「QIAprep Spin Miniprep Kit」，QIAGEN公司製造)。對於利用50 μL之10 mM Tris-Cl(pH值8.5)溶液所溶離之質體DNA溶液，使用氟量計(製品名「Quantus(註冊商標) Fluorometer」，Promega公司製造)進行濃度測定。
將所獲得之質體DNA溶液之質體濃度之測定結果示於圖3。圖3(A)係於LB培養基中培養之結果，圖3(B)係於2×YT培養基中培養之結果。再者，自LB培養基中之5個獨立菌落、自2×YT培養基中之3個獨立菌落進行質體提取，示出其平均值與標準誤差。又，關於培養後之菌濁度，於導入有pUC4K-PoriC之轉形大腸桿菌與導入有pUC4K之轉形大腸桿菌之間未見明顯差異，從而確認兩者於增殖性方面相差無幾。
如圖3所示，無論於LB培養基或2×YT培養基之情形時，自導入有pUC4K-PoriC_terG16之轉形大腸桿菌回收之質體均為導入有pUC4K之轉形大腸桿菌之2倍以上。根據該等結果確認，藉由對pUC4K組入PoriC_terG16卡匣，每個大腸桿菌細胞中之複製數增大了約2.5倍。pUC4K之複製數為500～700，由此推測pUC4K-PoriC_terG16之複製數增加至1000～1800左右。又，使用組入ter序列為野生型之PoriC_ter卡匣所得之pUC4K-PoriC_ter，進行相同之複製數測定，結果，pUC4K-PoriC_ter雖然與pUC4K相比每個大腸桿菌中之複製數增大，但與pUC4K-PoriC_terG16相比複製數增加之能力較低。
[實施例2] 構建T7oriC卡匣，研究該卡匣插入對pUC質體之複製數產生之影響，即，自T7啟動子之轉錄誘導所致之影響，上述T7oriC卡匣係於實施例1所製備之PoriC_terG16卡匣之Tac啟動子序列之3'側與terG16序列之5'側，按與Tac啟動子序列正面相撞之方向插入誘導型之T7啟動子，以利用自T7啟動子之轉錄來抵消進入oriC之轉錄之效果。表3之T7oriC卡匣之鹼基序列中，標註下劃線之區域表示T7啟動子序列之互補序列。
[表3]
與實施例1同樣地，製備包含T7oriC卡匣之DNA片段，將其組入至pUC4K而製備質體pUC4K_T7oriC。
其次，T7啟動子之轉錄需要T7噬菌體之RNA聚合酶(T7 RNAP)。因此，於IPTG依賴性地表現T7 RNAP之大腸桿菌NovaBlue(DE3)株(Novagen公司製造)中導入pUC4K_T7oriC或pUC4K，獲得轉形體。將所獲得之轉形體於含抗生素之LB培養基(包含50 μg/mL卡本西林)(－IPTG)或對含抗生素之LB培養基添加1mM IPTG所得之培養基(＋IPTG)(10 mL)中，於37℃下培養16小時。
與實施例1同樣地，自培養後之培養液統一細胞數地提取質體，測定所獲得之質體DNA溶液之濃度。將測定結果示於圖4(A)。自2個獨立菌落進行質體提取，示出其平均值與標準誤差。
又，使用代替IPTG而用乳糖來與大腸桿菌增殖期對應地自動誘導之用於大腸桿菌培養系統之自動誘導培養基(製品名「MagicMedia(註冊商標)E.coli Expression Medium」，Thermo Fisher Scientific公司製造)，同樣地將導入pUC4K_T7oriC、pUC4K-PoriC_terG16或pUC4K所得之轉形大腸桿菌進行培養，自培養後之培養液統一細胞數地提取質體，測定所獲得之質體DNA溶液之濃度。將測定結果示於圖4(B)。自2個獨立菌落進行質體提取，示出其平均值與標準誤差。
如圖4(A)所示，於無IPTG誘導之狀態下，自導入有pUC4K_T7oriC之轉形大腸桿菌回收之質體量比導入有pUC4K之轉形大腸桿菌多，進而藉由IPTG誘導，自導入有pUC4K_T7oriC之轉形大腸桿菌回收之質體量進一步增大。根據該等結果可知，利用T7oriC卡匣，使逆向之T7啟動子發揮功能來誘導自該T7啟動子之轉錄，藉此，增大每個宿主細胞中之複製數之效果進一步提昇。又，於圖4(B)中亦顯示，與導入有pUC4K_T7oriC之轉形大腸桿菌相比，導入有pUC4K_PoriC_terG16之轉形大腸桿菌更能改善每個宿主細胞中之複製數。
[實施例3] 製備對每個宿主細胞中之複製數為中等程度之質體組入實施例2所製備之T7oriC卡匣而成之質體，研究T7oriC卡匣對質體複製數之影響。作為每個宿主細胞中之複製數為中等程度之質體，使用pETcoco-2(Merk公司製造)及pET-dnaG(非專利文獻12)。
關於pETcoco-2，於培養基中存在葡萄糖之情形時，自F質體之origin進行複製，於細胞內達到1～2複製；於存在阿拉伯糖之情形時，自RK-2質體之origin進行複製，於細胞內達到20～50複製。另一方面，pET-dnaG雖為ColE1型質體，但與經過序列改型之高複製化pUC質體相比，細胞內複製數較低。
利用基於OriCiro Cell-free切換系統之同源重組反應，於pETcoco-2中組入T7oriC卡匣。將pETcoco-2中之同源重組反應之目標區域設定為位於pETcoco-2原本具有之origin之外側的相鄰之60 bp之區域。首先，以T7oriC卡匣為模板，使用表4記載之引子組進行PCR，藉此，獲得兩末端附加有與同源重組反應之目標區域(60 bp)同源性之鹼基序列(重疊序列)之DNA片段作為擴增產物。表4之各引子之鹼基序列中，大寫字母所示區域為重疊序列。
[表4]
與實施例1同樣地，利用同源重組反應，將附加有重疊序列之T7oriC卡匣片段插入至pETcoco-2，製備質體pETcoco-T7oriC。
又，與實施例1同樣地，利用同源重組反應，將使用ColE1_Fw引子與ColE1_Rv引子附加重疊序列後之PoriC_terG16卡匣插入至pET-dnaG，製備質體pET-dnaG-PoriC_terG16。
將對大腸桿菌DH5α株導入pETcoco-2或pETcoco-T7oriC所得之轉形大腸桿菌，於包含0.1%阿拉伯糖及75 μg/mL安比西林之LB液體培養基(10 mL)中，於37℃下進行16小時之振盪培養。與實施例1同樣地，自所獲得之培養液統一細胞數地提取質體，計測質體之濃度。將測定結果示於圖5(A)。再者，使用各樣品中之2個獨立菌落進行實驗，示出其平均值與標準誤差。
將對大腸桿菌DH5α株導入pET-dnaG或pET-dnaG-PoriC_terG16所得之轉形大腸桿菌，於包含75 μg/mL安比西林之LB液體培養基(4 mL)中，於37℃下進行16小時之振盪培養。與實施例1同樣地，自所獲得之培養液統一細胞數地提取質體，計測質體之濃度。將測定結果示於圖5(B)。
如圖5所示，無論為何種質體，藉由組入T7oriC卡匣或PoriC_terG16卡匣，均觀察到細胞內複製數增加之傾向。
[實施例4] 於PoriC_terG16卡匣中插入噬菌體Mu之旋轉酶結合序列(Mu-SGS)(非專利文獻6)而製備PoriC_sg卡匣，研究PoriC_sg卡匣對pUC質體之複製數產生之影響。
製備作為PoriC_sg卡匣(582 bp，序列編號31)之DNA片段：該DNA片段係於PoriC_terG16卡匣序列中，於oriC之5'側連結SGS。將鹼基序列示於表5。表中，5'末端之大寫字母區域表示Tac啟動子序列，3'末端之大寫字母區域表示fdhF終止子序列，標註下劃線之大寫字母區域表示SGS(粗體字為SGS之一致序列)，中央附近之大寫字母區域表示oriC序列。又，方框包圍之區域表示terG16序列及其互補序列。
[表5]
與實施例1同樣地，利用同源重組反應，製備包含PoriC_sg卡匣之DNA片段，將其組入至pUC4K而製備質體pUC4K_PoriC_sg。 將對大腸桿菌DH5α株導入pUC4K-PoriC_terG16或pUC4K_PoriC_sg所得之轉形大腸桿菌，於包含75 μg/mL安比西林之LB液體培養基(3 mL)中，於37℃下進行16小時之振盪培養。與實施例1同樣地，自所獲得之培養液統一細胞數地提取質體，計測質體之濃度。將測定結果示於圖6。
對於pUC4K_PoriCsg，使用5個獨立菌落進行實驗，示出其平均值與標準誤差。對於pUC4K-PoriC_terG16，使用1個菌落。關於培養後之菌濁度，於具有pUC4K-PoriC_terG16之株與具有pUC4K_PoriC_sg之株之間未見明顯差異。如圖6所示，藉由組入SGS，pUC4K-PoriC_terG16之複製數增加2.7倍，表明藉由組入SGS使細胞內複製數進一步增加。於實施例1中，推測pUC4K-PoriC_terG16之複製數為1000～1800，由此推測pUC4K_PoriC_sg之複製數增加至2700～5000左右。
[實施例5] 以實施例1之表1所示之oriC_ter卡匣(序列編號19)為模板，使用表6記載之引子組進行PCR，藉此，獲得兩端具有相對於pUC4K之安比西林耐性基因啟動子下游之60 bp之重疊序列、且不含ter序列之DNA片段oriCb作為擴增產物。表6之各引子之鹼基序列中，大寫字母所示區域為重疊序列。利用同源重組反應，將DNA片段oriCb組入至pUC4K而製備質體pUC4K_oriCb。
[表6]
同樣地，使用表7記載之引子組代替表6記載之引子組，製作作為oriCb序列之反轉形式的不含ter序列之DNA片段oriCc。利用同源重組反應，將獲得之DNA片段oriCc組入至pUC4K而製備質體pUC4K_oriCc。表7之各引子之鹼基序列中，大寫字母所示區域為重疊序列。
[表7]
於同源重組反應中，藉由與OriCiro Cell-free切換系統相同之方法，使用RecA家族重組酵素蛋白與3'→5'外切核酸酶，將附加有重疊序列之oriC卡匣片段插入至pUC4K。作為RecA家族重組酵素蛋白，使用大腸桿菌RecA之野生型(專利文獻8)，作為3'→5'外切核酸酶，使用外切核酸酶III。
作為同源重組反應，於5 μL之反應液(1 μM之RecA、80 mU/μL之外切核酸酶III、20 mM之Tris-HCl(pH值8.0)、4 mM之DTT、1 mM之乙酸鎂、100 μM之ATP、4 mM之磷酸肌酸、20 ng/μL之肌酸激酶、50 mM之麩胺酸鉀、150 mM之TMAC、5質量%之PEG8000、及10體積%之DMSO)中添加200 pM之pUC4K與200 pM之附加有重疊序列之oriC卡匣片段，於37℃下保溫30分鐘。繼而，將反應後之反應溶液0.5 μL混合至使表8所示組成之反應用混合物中包含60 nM之Tus所得之混合液4.5 μL，而製備RCR擴增反應溶液(5 μL)，將該RCR擴增反應溶液於30℃下保溫16小時，藉此進行RCR擴增反應。Tus係藉由包括親和管柱層析及凝膠過濾管柱層析之步驟，自Tus之大腸桿菌表現株純化而製備。
[表8]
反應用混合物
反應緩衝液
Tris-HCl(pH值8.0) 20 mM
二硫蘇糖醇 8 mM
麩胺酸鉀 150 mM
Mg(OAc) 2 10 mM
磷酸肌酸 4 mM
ATP 1 mM
GTP、CTP、UTP 分別為1 mM
dNTPs 分別為0.1 mM
tRNA 50 ng/μL
NAD 0.25 mM
硫酸銨 10 mM
牛血清白蛋白(BSA) 0.5 mg/mL
肌酸激酶 20 ng/μL
酵素組
SSB 400 nM
IHF 20 nM
DnaG 400 nM
DnaN 40 nM
PolIII* 5 nM
DnaB、DnaC 20 nM
DnaA 100 nM
RNaseH 10 nM
Ligase 50 nM
PolI 50 nM
GyrA、GyrB 50 nM
Topo IV 5 nM
Topo III 50 nM
RecQ 50 nM
表8中：SSB表示源自大腸桿菌之SSB，IHF表示源自大腸桿菌之IhfA與IhfB之複合體，DnaG表示源自大腸桿菌之DnaG，DnaN表示源自大腸桿菌之DnaN，Pol III*表示作為包含源自大腸桿菌之DnaX、HolA、HolB、HolC、HolD、DnaE、DnaQ及HolE之複合體的DNA聚合酶III*複合體，DnaB表示源自大腸桿菌之DnaB，DnaC表示源自大腸桿菌之DnaC，DnaA表示源自大腸桿菌之DnaA，RNaseH表示源自大腸桿菌之RNaseH，Ligase表示源自大腸桿菌之DNA連接酶，Pol I表示源自大腸桿菌之DNA聚合酶I，GyrA表示源自大腸桿菌之GyrA，GyrB表示源自大腸桿菌之GyrB，Topo IV表示源自大腸桿菌之ParC與ParE之複合體，Topo III表示源自大腸桿菌之拓樸異構酶III，RecQ表示源自大腸桿菌之RecQ。
SSB係藉由包括硫酸銨沈澱及離子交換管柱層析之步驟，自SSB之大腸桿菌表現株純化而製備。 IHF係藉由包括硫酸銨沈澱及親和管柱層析之步驟，自IhfA與IhfB之大腸桿菌共表現株純化而製備。 DnaG係藉由包括硫酸銨沈澱、陰離子交換管柱層析及凝膠過濾管柱層析之步驟，自DnaG之大腸桿菌表現株純化而製備。 DnaN係藉由包括硫酸銨沈澱及陰離子交換管柱層析之步驟，自DnaN之大腸桿菌表現株純化而製備。 Pol III*係藉由包括硫酸銨沈澱、親和管柱層析及凝膠過濾管柱層析之步驟，自DnaX、HolA、HolB、HolC、HolD、DnaE、DnaQ及HolE之大腸桿菌共表現株純化而製備。 DnaB及DnaC係藉由包括硫酸銨沈澱、親和管柱層析及凝膠過濾管柱層析之步驟，自DnaB與DnaC之大腸桿菌共表現株純化而製備。 DnaA係藉由包括硫酸銨沈澱、透析沈澱及凝膠過濾管柱層析之步驟，自DnaA之大腸桿菌表現株純化而製備。 GyrA及GyrB係藉由包括硫酸銨沈澱、親和管柱層析及凝膠過濾管柱層析之步驟，自GyrA之大腸桿菌表現株與GyrB之大腸桿菌表現株之混合物純化而製備。 Topo IV係藉由包括硫酸銨沈澱、親和管柱層析及凝膠過濾管柱層析之步驟，自ParC之大腸桿菌表現株與ParE之大腸桿菌表現株之混合物純化而製備。 Topo III係藉由包括硫酸銨沈澱及親和管柱層析之步驟，自Topo III之大腸桿菌表現株純化而製備。 RecQ係藉由包括硫酸銨沈澱、親和管柱層析及凝膠過濾管柱層析之步驟，自RecQ之大腸桿菌表現株純化而製備。 RNaseH、Ligase、Pol I係使用市售之源自大腸桿菌之酵素(TAKARA BIO公司製造)。
RCR擴增反應結束後，用RCR反應緩衝液(表8所示組成中之「反應緩衝液」)將RCR擴增反應溶液之一部分(0.4 μL)稀釋成原濃度之十分之一後，於30℃下保溫30分鐘。
圖7(A)表示pUC4K、pUC4K_oriCb及pUC4K_oriCc之結構模式圖。圖7(A)中，「DUE」表示oriC之雙鏈斷開區域。如圖7(A)所示，質體pUC4K_oriCb與質體pUC4K_oriCc均為於質體pUC4K內存在之安比西林耐性基因之啟動子之下游插入有oriC，僅oriC之方向不同的質體。採用與實施例1相同之方法，於大腸桿菌DH5α株中導入該等質體之任一者進行轉形。使用包含50 μg/mL康黴素代替100 μg/mL卡本西林之LB瓊脂培養基，除此以外，藉由與實施例1相同之方法培養，結果於各情形時，均形成與導入pUC4K之情形時相比大小為相同程度之菌落，未檢測到大腸桿菌之生長受到抑制。
使用包含50 μg/mL康黴素代替50 μg/mL卡本西林之LB液體培養基，除此以外，藉由與實施例1相同之方法，使用LB液體培養基培養所獲得之菌落。關於培養後之菌濁度，於所使用之各株之間未見明顯差異。藉由與實施例1相同之方法，自培養後之培養液統一細胞數地提取質體，測定所獲得之質體DNA溶液之濃度。將測定結果示於圖7(B)。自4個獨立菌落進行質體提取，求出相對於pUC4K之相對質體濃度，示出其平均值與標準誤差。
如圖7(B)所示，與pUC4K相比，pUC4K_oriCb及pUC4K_oriCc均每個大腸桿菌中之複製數增大。該等結果表明，藉由以使自如質體內存在之安比西林耐性基因之啟動子(源自大腸桿菌之恆常型啟動子)之類的任意一般基因之啟動子之轉錄流向oriC之方式進行組合，亦使質體之細胞內複製數增加。又，亦表明，不依賴於啟動子及oriC之方向，若自啟動子之轉錄流向oriC，則質體之細胞內複製數增加。
圖1係於實施例1中，對質體之RCR擴增產物進行瓊脂糖電泳而分離之條帶(band)之染色圖像，上述質體係於pUC4K中組入各oriC卡匣而成之質體。 圖2係於實施例1中，對導入有質體或pUC4K之轉形大腸桿菌進行培養後之含抗生素之瓊脂培養基之光透射照片，上述質體係於pUC4K中組入各oriC卡匣而成之質體。 圖3(A)、(B)係表示於實施例1中，導入有質體或pUC4K之轉形大腸桿菌經過培養後回收之質體濃度之測定結果之圖，上述質體係於pUC4K中組入oriC卡匣而成之質體。 圖4係表示於實施例2中，將導入有pUC4K_T7oriC、pUC4K-PoriC_terG16或pUC4K之轉形大腸桿菌於添加IPTG之LB培養基(圖4(A))或自動誘導培養基(圖4(B))中進行培養後回收之質體濃度之測定結果之圖。 圖5係表示於實施例3中，導入有pETcoco-T7oriC(圖5(A))或pET-dnaG-PoriC_terG16(圖5(B))之轉形大腸桿菌經過培養後回收之質體濃度之測定結果之圖。 圖6係表示於實施例4中，導入有pUC4K-PoriC_terG16或pUC4K-PoriC_sg之轉形大腸桿菌經過培養後回收之質體濃度之測定結果之圖。 圖7之圖7(A)係實施例5中使用之一部分質體之模式圖；圖7(B)係表示於實施例5中，導入有pUC4K、pUC4K_oriCb或pUC4K_oriCc之轉形大腸桿菌經過培養後回收之質體濃度之測定結果之圖。
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Claims (23)

  1. 一種DNA卡匣，其具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、及第1啟動子序列，且 自上述第1啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列， 上述第1啟動子序列之3'末端鹼基與上述複製起始序列之末端鹼基之距離為450個鹼基以內。
  2. 一種DNA卡匣，其具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、第1啟動子序列、及旋轉酶結合序列，且 自上述第1啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列， 上述第1啟動子序列之3'末端鹼基與上述複製起始序列之末端鹼基之距離為2000個鹼基以內。
  3. 如請求項2之DNA卡匣，其中上述旋轉酶結合序列為源自噬菌體Mu之序列。
  4. 如請求項1或2之DNA卡匣，其於上述第1啟動子序列之3'側進而具有第2啟動子序列之互補序列。
  5. 一種質體，其具有如請求項1或2之DNA卡匣、及質體複製起點。
  6. 一種質體，其具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、第1啟動子序列、及質體複製起點，且 自上述第1啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列， 上述第1啟動子序列之3'末端鹼基與上述複製起始序列之末端鹼基之距離為2000個鹼基以內。
  7. 如請求項6之質體，其進而具有旋轉酶結合序列。
  8. 如請求項6或7之質體，其中上述質體複製起點為ColE1型。
  9. 如請求項6或7之質體，其中上述第1啟動子序列與上述複製起始序列之距離為300個鹼基以內。
  10. 一種細菌，其含有如請求項6或7之質體。
  11. 如請求項10之細菌，其為大腸桿菌。
  12. 一種質體之製造方法，其係將如請求項10之細菌進行培養，自所獲得之培養物回收質體。
  13. 一種單鏈RNA之製造方法，其包括：藉由如請求項12之方法製造質體；及自上述質體藉由轉錄獲得RNA。
  14. 一種質體之製作方法，其係製作具有DNA卡匣之質體之方法， 上述DNA卡匣具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、及第1啟動子序列，自上述第1啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列，且上述第1啟動子序列之3'末端鹼基與上述複製起始序列之末端鹼基之距離為2000個鹼基以內， 上述製作方法包括：準備上述DNA卡匣；及於具有質體複製起點之質體導入上述DNA卡匣。
  15. 一種質體之製作方法，其係製作具有DNA卡匣之質體之方法，包括： 準備具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列之DNA卡匣； 準備具有質體複製起點及啟動子序列之質體；及 將上述DNA卡匣以自上述質體之啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列之方式導入至上述質體。
  16. 一種質體之製作方法，其係製作具有DNA卡匣之質體之方法，包括： 準備具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、及旋轉酶結合序列之DNA卡匣； 準備具有質體複製起點及啟動子序列之質體；及 將上述DNA卡匣以自上述質體之啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列之方式導入至上述質體。
  17. 如請求項15或16之質體之製作方法，其中上述啟動子序列之3'末端鹼基與上述複製起始序列之末端鹼基之距離為2000個鹼基以內。
  18. 如請求項15或16之質體之製作方法，其中於上述質體導入上述DNA卡匣係包括： 製備含有上述質體、上述DNA卡匣、具有RecA家族重組酵素活性之蛋白、及外切核酸酶之反應溶液；及 保溫上述反應溶液而進行同源重組反應； 上述質體具有Ha區及Hb區，上述Hb區位於上述Ha區之下游， 上述DNA卡匣具有與上述Ha區對應之同源性區域、及與上述Hb區對應之同源性區域，且後者位於前者之下游。
  19. 一種高複製質體製作用DNA卡匣，其具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、及旋轉酶結合序列，且 上述DNA卡匣為1000個鹼基長度以下。
  20. 一種DNA卡匣，其具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、第1啟動子序列、及終止子序列，且 自上述第1啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列， 上述第1啟動子序列之3'末端鹼基與上述複製起始序列之末端鹼基之距離為200個鹼基以內， 上述終止子序列位於上述第1啟動子序列之下游，上述第1啟動子序列之3'末端鹼基與上述終止子序列之5'末端鹼基之距離為600個鹼基以內。
  21. 如請求項20之DNA卡匣，其進而具有分別相對於上述複製起始序列向外插入之一對ter序列。
  22. 一種DNA卡匣，其具有能夠與具有DnaA活性之酵素結合之複製起始序列、第1啟動子序列、及分別相對於上述複製起始序列向外插入之一對ter序列，且 自上述第1啟動子序列之轉錄流向上述複製起始序列， 上述第1啟動子序列之3'末端鹼基與上述複製起始序列之末端鹼基之距離為200個鹼基以內。
  23. 如請求項22之DNA卡匣，其於上述第1啟動子序列之下游進而具有終止子序列，上述第1啟動子序列之3'末端鹼基與上述終止子序列之5'末端鹼基之距離為600個鹼基以內。
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