BR112019017657A2

BR112019017657A2 - método para replicação ou amplificação de dna circular

Info

Publication number: BR112019017657A2
Application number: BR112019017657A
Authority: BR
Inventors: Su'etsugu Masayuki; Nara Seia
Original assignee: Oriciro Genomics Inc
Priority date: 2017-02-28
Filing date: 2018-02-28
Publication date: 2020-04-07
Also published as: RU2019130498A; US11685940B2; JPWO2018159669A1; JP6960684B2; IL268944A; KR20190123287A; EP3591051A1; RU2752611C2; SG11201907899TA; WO2018159669A1; CA3054881A1; RU2019130498A3; EP3591051A4; KR102491725B1; CN110446783A; AU2018228154A1; US20200115727A1; US20240018561A1

Abstract

a presente invenção refere-se a um método que possibilita a replicação ou amplificação de dna circular, particularmente dna circular de cadeia longa, em um sistema livre de célula. especificamente, é provido um método para inibir a geração de um multímero de dna, que é um subproduto, durante a replicação ou amplificação de dna circular tendo uma sequência de iniciação de replicação (origem de cromossomo (oric)) utilizando as seguintes enzimas: (1) primeiro, as enzimas que catalisam a replicação de dna circular; (2) segundo, as enzimas que catalisam uma reação de ligação de fragmentos de okazaki, para sintetizar moléculas de dois dnas circulares irmãos formando um catenano; e (3) terceiro, as enzimas que catalisam uma reação de separação das moléculas de dois dnas circulares irmãos. além disso, é provido um método que compreende a introdução de oric no dna circular utilizando um transposon.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO PARA REPLICAÇÃO OU AMPLIFICAÇÃO DE DNA CIRCULAR.

CAMPO TÉCNICO [0001] A presente invenção refere-se a um método para replicação ou amplificação de DNA circular. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um método capaz de eficazmente replicar ou amplificar DNA circular em um sistema livre de células. A presente invenção também se refere a um ácido nucleico capaz de ser utilizado como um cassete funcional para a preparação de DNA circular.

TÉCNICA ANTECEDENTE [0002] A tecnologia de clonagem de DNA, na qual baseia-se o desenvolvimento biotecnológico, é uma técnica para amplificação de DNA circular que foi preparado cortando-se e unindo-se fragmentos de DNA como plasmídeo em células de E. coli, etc. Uma utilização de uma tecnologia de clonagem de DNA que emprega células para amplificar o DNA circular necessita de procedimentos difíceis, tais como o cultivo, extração/purificação de células de produtos amplificados e similares. Além disso, o ambiente para experimentar tal clonagem de DNA é limitado, uma vez que é necessário preparar organismos geneticamente modificados para a realização de clonagem de DNA que utiliza células.

[0003] Um método comum usado para a amplificação de DNA in vitro é a reação em cadeia da polimerase (PCR). No entanto, uma amplificação de DNA in vitro usando PCR não permite que o DNA circular seja amplificado como ele é. Os métodos de amplificação in vitro de DNA circular incluem a amplificação por círculo rolante (RCA) (NPL 1, PTL 1, PTL 2, PTL 3). No entanto, se o DNA circular fosse amplificado usando a amplificação por círculo rolante, um iniciador específico ao DNA alvo necessitaria ser projetado a cada momento. Além disso, o produto

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2/84 de amplificação que resulta diretamente da amplificação por círculo rolante é um DNA linear, assim, seria necessário realizar uma etapa de ciclização adicional para ciclizar o produto de amplificação obtido, tal como uma incubação com uma enzima de recombinação. Outro método relatado é um método de obtenção de um produto de replicação monomérico, replicando-se um minicromossomo de E. coli (DNA circular oriC) e, em seguida, separando-o para obter um produto de replicação circular monomérico que foi relatado (NPLs 2 a 5). No entanto, em relação às condições de reação aplicadas nestas publicações, foi demonstrado experimentalmente que a eficiência de replicação das moléculas de DNA circular é apenas de aproximadamente 15 a 40% do DNA molde adicionado e, assim, que a quantidade amplificada não atinge nem o dobro (NPLs 3 a 6). Além disso, o tamanho do DNA circular utilizado como molde nestas publicações é apenas inferior a 10 kbp.

[0004] Como mostrado acima, a amplificação de DNA circular usando a amplificação de DNA in vitro convencional foi desvantajosa na medida em que precisou que os iniciadores fossem ligados ao DNA molde, produziu DNA linear como produto de amplificação, e limitou o tamanho do DNA que pode ser amplificado para alguns kbp. Além disso, houve um problema que, quando um produto de amplificação circular pretende ser produzido utilizando um sistema de replicação de minicromossomos de Escherichia coli, o DNA circular molde não pode ser amplificado nem mesmo para duplicar.

LISTA DE CITAÇÃO

LITERATURA DE PATENTES [0005] PTL 1: Publicação de Patente Japonesa Não Examinada N^Q. 2005-229950 [0006] PTL 2: Publicação de Patente Japonesa Não Examinada N^Q. 2008-161182

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3/84 [0007] PTL 3: Publicação de Patente Japonesa Não Examinada N^Q. 2012-501173

LITERATURA DE NÃO PATENTE [0008] NPL 1: Fakruddin M et al., J Pharm Bioallied Sei. 2013, 5: 245-252 [0009] NPL 2: Peng H & Marians KJ. PNAS. 1993, 90: 8571-8575 [0010] NPL 3: Hiasa H & Marians KJ. J Biol Chem. 1994, 269:

32655-32659 [0011] NPL 4: Funnell B et al., J Biol Chem. 1986, 261: 5616-5624 [0012] NPL 5: Hiasa H et al., J Biol Chem. 1994, 269: 2093-2099 [0013] NPL 6: Hiasa H & Marians KJ. J Biol Chem. 1994, 269:

26959-26968

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

PROBLEMA TÉCNICO [0014] A presente invenção provê um método capaz de eficazmente replicar ou amplificar DNA circular em um sistema livre de células. A presente invenção também provê um ácido nucleico capaz de ser utilizado como um cassete funcional para a preparação de DNA circular.

SOLUÇÃO PARA O PROBLEMA [0015] Os presentes inventores realizaram extensivos estudos para resolver o problema acima e constataram que, quando DNA circular possuindo uma sequência de origem de replicação (origem de cromossomo (or/C)) é replicado ou amplificado usando os seguintes grupos enzimáticos:

(1) um primeiro grupo enzimático, que catalisa a replicação de DNA circular;

(2) um segundo grupo enzimático, que catalisa a maturação de fragmentos de Okazaki e sintetiza dois DNAs circulares irmãos constituindo um catenano; e

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4/84 (3) um terceiro grupo enzimático, que catalisa a separação de dois DNAs circulares irmãos, a geração de um multímero de DNA como um subproduto pode ser suprimida utilizando um mecanismo de terminação de replicação empregando ter-Tus, e/ou um mecanismo de separação de multímero de DNA utilizando um sistema de recombinação específica de sítio, tal como dif-XerCD. Além disso, os presentes inventores também constataram que, mesmo em um caso no qual o DNA circular não compreendendo oriC está presente em uma concentração extremamente baixa, o DNA circular pode ser replicado ou amplificado pela introdução de oriC no DNA circular usando um transposon.

[0016] Na presente descrição, a reação de replicação ou amplificação de DNA circular utilizando os grupos enzimáticos descritos acima (1), (2), e (3) é referida como RCR (reação do ciclo de replicação) em alguns casos.

[0017] Além disso, na presente descrição, o termo multímero de DNA significa DNA multimérico gerado sob replicação ou amplificação de DNA circular. Aqui, o DNA multimérico significa que o DNA participante é multimerizado, quando o DNA circular utilizado como molde é definido como um monômero. Na presente descrição, o multímero de DNA é simplesmente referido como multímero às vezes.

[0018] Em outras palavras, o presente pedido abrange o seguinte aspecto sem ser por ele limitado.

[0019] [1] Um método para replicação de DNA circular em um sistema livre de células, compreendendo as seguintes etapas:

(1) formar uma mistura de reação de DNA circular como molde com uma solução de reação compreendendo:

um primeiro grupo enzimático, que catalisa a replicação de DNA circular,

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5/84 um segundo grupo enzimático, que catalisa a maturação de fragmentos de Okazaki e sintetiza dois DNAs circulares irmãos constituindo um catenano, e um terceiro grupo enzimático, que catalisa a separação de dois DNAs circulares irmãos; e (2) reagir a mistura de reação formada na etapa (1), em que o DNA circular inclui uma sequência de origem de replicação (origem de cromossomo (or/C)) que pode se ligar a uma enzima possuindo atividade de DnaA, e inclui ainda um par de sequências ter que é inserido externamente em relação a oriC, e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, em que quando o DNA circular tem as sequências ter, a solução de reação na etapa (1) compreende ainda uma proteína possuindo a atividade de inibir a replicação por ligação com as sequências ter, e quando o DNA circular tem a sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, a solução de reação da etapa (1) compreende ainda a enzima de separação de multímero de DNA.

[0020] [2] O método de acordo com [1] acima, em que a enzima de separação de multímero de DNA é Cre ou XerCD.

[0021] [3] Um método para a replicação de DNA circular em um sistema livre de células, compreendendo as seguintes etapas:

um primeiro grupo enzimático, que catalisa a replicação de DNA circular, um segundo grupo enzimático, que catalisa a maturação de fragmentos de Okazaki e sintetiza dois DNAs circulares irmãos constituindo um catenano, e

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6/84 um terceiro grupo enzimático que catalisa a separação de dois DNAs circulares irmãos; e (2) reagir a mistura de reação formada na etapa (1), em que o DNA circular inclui uma sequência de origem de replicação (origem de cromossomo (or/C)) que pode se ligar a uma enzima possuindo atividade de DnaA, e inclui ainda um par de sequências ter que é inserido externamente em relação a oriC, e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por XerCD, em que quando o DNA circular tem as sequências ter, a solução de reação na etapa (1) compreende ainda uma proteína possuindo a atividade de inibir a replicação por ligação com as sequências ter, e quando o DNA circular tem a sequência nucleotídica reconhecida por XerCD, a solução de reação da etapa (1) compreende ainda uma proteína XerCD.

[0022] [4] O método de acordo com qualquer um dos [1] a [3] acima, em que o par de sequências ter que são inseridas externamente em relação a oriC compreende: uma sequência compreendendo qualquer uma das sequências mostradas na SEQ ID N^QS: 1 a 14, que é inserida com uma sequência ter no lado do terminals' de oriC; e uma sequência compreendendo uma sequência complementar a qualquer uma das sequências mostradas na SEQ ID N^QS: 1 a 14, que é inserida como a outra sequência ter no lado do terminal-3' de oriC.

[0023] [5] O método de acordo com qualquer um dos [1] a [4] acima, em que a proteína possuindo a atividade de inibir a replicação por ligação com as sequências ter é uma proteína Tus ou uma proteína RTP. [0024] [6] O método de acordo com [2] ou [3] acima, em que a sequência nucleotídica reconhecida por XerCD é uma sequência compreendendo qualquer uma das sequências mostradas na SEQ ID N^QS: 15 a 24, ou uma sequência complementar a ela.

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7/84 [0025] [7] O método de acordo com [2] acima, em que a sequência nucleotídica reconhecida por Cre é uma sequência compreendendo qualquer uma das sequências mostradas na SEQ ID N^QS: 30 a 35, ou uma sequência complementar a ela.

[0026] [8] Um ácido nucleico, que é DNA linear tendo um comprimento de 273 pb a 2,0 kb, e compreende oriC, e um par de sequências ter que é inserido externamente em relação a oriC e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA.

[0027] [9] Um ácido nucleico, que é DNA linear tendo um comprimento de 273 pb a 2,0 kb, e compreende oriC, e um par de sequências ter que é inserido externamente com respeito a oriC e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por XerCD.

[0028] [10] Um método para replicar DNA circular em um sistema livre de células, compreendendo as seguintes etapas:

(1) preparar DNA circular compreendendo oriC: adicionando um transposon oriC e transposase em um tampão para formar um transposoma oriC, em que o transposon oriC é DNA linear compreendendo uma sequência de origem de replicação (origem de cromossomo (oriC)) que pode se ligar a uma enzima possuindo atividade de DnaA, e compreendendo sequências de extremidade externa (OE) em ambos os seus terminais; e reagir o transposoma oriC com o DNA circular não compreendendo oriC em um tampão para realizar uma reação de transferência, (2) formar uma mistura de reação do DNA circular compreendendo oriC obtido na etapa (1) com uma solução de reação compreendendo:

um primeiro grupo enzimático, que catalisa a replicação de DNA circular,

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8/84 um segundo grupo enzimático, que catalisa a maturação de fragmentos de Okazaki e sintetiza dois DNAs circulares irmãos constituindo um catenano, e um terceiro grupo enzimático que catalisa a separação de dois DNAs circulares irmãos; e (3) reagir a mistura de reação formada na etapa (2).

[0029] [11] O método de acordo com o [10] acima, em que a sequência OE compreende a sequência mostrada na SEQ ID N^Q: 25 (5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3') e uma sequência complementar a ela, e a sequência OE compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID N^Q: 25 é inserida no terminal-5' do DNA linear na etapa (1), e a sequência OE compreendendo uma sequência complementar à sequência mostrada na SEQ ID N^Q: 25 é inserida no terminal-3' do DNA linear.

[0030] [12] O método de acordo com o [10] ou [11] acima, em que o DNA circular compreendendo oriC compreende ainda um par de sequências ter que é inserido externamente em relação a oriC, e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, em que quando o DNA circular tem as sequências ter, a solução de reação na etapa (2) compreende ainda uma proteína possuindo a atividade de inibir a replicação por ligação com as sequências ter, e quando o DNA circular tem a sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, a solução de reação da etapa (2) compreende ainda a enzima de separação de multímero de DNA.

[0031] [13] O método de acordo com o [10] ou [11] acima, em que o DNA circular compreendendo oriC compreende ainda um par de sequências ter que é inserido externamente em relação a oriC, e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por XerCD, em que

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9/84 quando o DNA circular tem as sequências ter, a solução de reação na etapa (2) compreende ainda uma proteína possuindo a atividade de inibir a replicação por ligação com as sequências ter, e quando o DNA circular tem a sequência nucleotídica reconhecida por XerCD, a solução de reação da etapa (2) compreende ainda uma proteína XerCD.

[0032] [14] O método de acordo com qualquer um dos [10] a [13] acima, em que o transposon oriC na etapa (1) compreende ainda um par de sequências ter que é inserido externamente em relação a oriC, e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, em que quando o DNA linear tem as sequências ter, a solução de reação na etapa (2) compreende ainda uma proteína possuindo a atividade de inibir a replicação por ligação com as sequências ter, e quando o DNA circular tem a sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, a solução de reação da etapa (2) compreende ainda a enzima de separação de multímero de DNA.

[0033] [15] O método de acordo com qualquer um dos [10] a [13] acima, em que o transposon oriC na etapa (1) compreende ainda um par de sequências ter que é inserido externamente em relação a oriC, e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por XerCD, em que quando o DNA linear tem as sequências ter, a solução de reação na etapa (2) compreende ainda uma proteína possuindo a atividade de inibir a replicação por ligação com as sequências ter, e quando o DNA circular tem a sequência nucleotídica reconhecida por XerCD, a solução de reação da etapa (2) compreende ainda uma proteína XerCD.

[0034] [16] O método de acordo com qualquer um dos [10] a [15] acima, compreendendo ainda:

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10/84 (4) remover o transposon oriC do DNA circular replicado ou amplificado no produto de reação da etapa (3).

[0035] [17] Um ácido nucleico, que é DNA linear com um comprimento de 311 pb a 2,0 kb, e compreende oriC, e um par de sequências ter que é inserido externamente em relação a oriC, e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, e também compreende sequências de extremidade externa (OE) em ambos os seus terminais.

[0036] [18] Um ácido nucleico, que é DNA linear com um comprimento de 311 pb a 2,0 kb, e compreende oriC, e um par de sequências ter que é inserido externamente em relação a oriC, e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por XerCD, e também compreende sequências de extremidade externa (OE) em ambos os seus terminais.

[0037] [19] Um kit para replicar DNA circular, compreendendo uma combinação de:

um primeiro grupo enzimático, que catalisa a replicação de DNA circular;

um segundo grupo enzimático, que catalisa a maturação de fragmentos de Okazaki e sintetiza dois DNAs circulares irmãos constituindo um catenano;

um terceiro grupo enzimático, que catalisa a separação de dois DNAs circulares irmãos;

um transposon oriC, que é DNA linear compreendendo uma sequência de origem de replicação (origem de cromossomo (oriC)) que pode se ligar a uma enzima possuindo atividade de DnaA, e compreendendo sequências de extremidade externa (OE) em ambos os seus terminais; e transposase.

[0038] [20] O kit de acordo com o [19] acima, em que o

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11/84 transposon oriC compreende ainda um par de sequências ter que é inserido externamente em relação a oriC, e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA.

[0039] [21] O kit de acordo com o [20] acima, compreendendo ainda:

uma proteína possuindo a atividade de inibir a replicação por ligação com as sequências ter; e/ou uma enzima de separação de multímero de DNA.

[0040] [22] O kit de acordo com o [19] acima, em que o transposon oriC compreende ainda um par de sequências ter que é inserido externamente em relação a oriC, e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por XerCD.

[0041] [23] O kit de acordo com o [22] acima, compreendendo ainda: uma proteína possuindo a atividade de inibir a replicação por ligação com as sequências ter; e/ou uma proteína XerCD.

EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO [0042] De acordo com o método do presente pedido, quando DNA circular com uma sequência de origem de replicação (origem de cromossomo (oriC) é replicado ou amplificado usando os seguintes grupos enzimáticos:

(1) Um primeiro grupo enzimático, que catalisa a replicação de DNA circular;

(2) Um segundo grupo enzimático, que catalisa a maturação de fragmentos de Okazaki e sintetiza dois DNAs circulares irmãos constituindo um catenano; e (3) um terceiro grupo enzimático, que catalisa a separação de dois DNAs circulares irmãos, a geração de um multímero de DNA como um subproduto pode ser suprimida. Além disso, uma concentração

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12/84 extremamente baixa de DNA circular pode ser replicada ou amplificada pela introdução de oriC no DNA circular usando um transposon. A partir destas constatações, um produto de replicação ou um produto de amplificação pode ser eficazmente obtido de acordo com o método do presente pedido.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0043] A Figura 1 mostra um modelo do ciclo de replicação de DNA circular.

[0044] A Figura 2 é uma vista esquemática mostrando a introdução de cassete oriC utilizando um transposon e a subsequente reação de replicação ou amplificação.

[0045] A Figura 3 inclui uma vista esquemática (a) mostrando a supressão da geração de um multímero de DNA utilizando a sequência de terminação ter e uma proteína Tus, e uma fotografia eletroforética em gel (b) mostrando os seus resultados.

[0046] A Figura 4 inclui uma vista esquemática (a) mostrando a supressão da geração de um multímero de DNA utilizando as sequências de recombinação específicas de sítio dif e XerCD, e uma fotografia eletroforética em gel (b) mostrando os seus resultados.

[0047] A Figura 5 é uma vista esquemática mostrando DNA circular ori-ter de 15 kb e DNA circular ori-dif de 15 kb.

[0048] A Figura 6 é uma fotografia eletroforética em gel mostrando o resultado da realização da titulação Tus com respeito à supressão da geração de um multímero de DNA, utilizando a sequência de terminação ter e uma proteína Tus.

[0049] A Figura 7 é uma fotografia eletroforética em gel que mostra o resultado da realização da titulação do DNA com respeito à supressão da geração de um multímero de DNA, utilizando a sequência de terminação ter e uma proteína Tus.

[0050] A Figura 8 é uma fotografia eletroforética em gel mostrando o

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13/84 resultado da supressão da geração de um multímero de DNA por XerCD. [0051] A Figura 9 é uma fotografia eletroforética em gel que mostra o resultado da amplificação de um plasmídeo de 15-kb por transferência de transposon oriC.

[0052] A Figura 10 é uma fotografia eletroforética em gel que mostra o resultado da amplificação de um plasmídeo de 9,3-kb derivado de termófilo com uma elevada taxa de conteúdo GC por transferência de transposon oriC.

[0053] A Figura 11 é uma fotografia eletroforética em gel que mostra o resultado da amplificação de um plasmídeo de 15-kb por transferência de transposon oriC.

[0054] A Figura 12 é uma fotografia eletroforética em gel que mostra o resultado da amplificação de um plasmídeo de 15-kb por transferência de transposon oriC, em um caso em que a quantidade de DNA utilizada na reação de transferência de transposon oriC é alterada.

[0055] A Figura 13 é uma fotografia eletroforética em gel que mostra o resultado da amplificação de um plasmídeo de 9,3-kb derivado de termófilo com uma elevada taxa de conteúdo GC por transferência de transposon oriC.

[0056] A Figura 14 é uma fotografia eletroforética em gel que mostra o resultado da realização de uma digestão com enzima de restrição (Kpnl e Nhel) em uma produção de amplificação de um plasmídeo de 9,3 kb derivado de termófilo com uma elevada taxa de conteúdo GC por transferência de transposon oriC.

[0057] A Figura 15 é uma fotografia eletroforética em gel que mostra o resultado do estudo da ciclização de ÀDNA.

[0058] A Figura 16 é uma fotografia eletroforética em gel que mostra o resultado da ciclização de ÀDNA e da amplificação de DNA circular por transferência de transposon oriC.

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14/84 [0059] A Figura 17 é uma fotografia eletroforética em gel que mostra o resultado da ciclização de ÀDNA e a digestão com a enzima de restrição (Hindlll) realizada em um produto de amplificação de DNA circular preparado por transferência de transposon oriC.

[0060] A Figura 18 é uma vista esquemática que mostra a reação de dissociação de um transposon oriC.

[0061] A Figura 19 é um gráfico que mostra a avaliação da dissociação de um transposon oriC compreendendo Km-or/C.

[0062] A Figura 20 é um gráfico que mostra a avaliação de um gene de resistência à Amp recuperado após a dissociação de um transposon oriC.

[0063] A Figura 21 é uma vista esquemática que mostra a reação de dissociação de um transposon oriC e a reação de remoção do transposon oriC por divagem.

[0064] A Figura 22 é uma fotografia eletroforética em gel que mostra o resultado da supressão da geração de um multímero de DNA por Cre.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES [0065] A seguir, a presente invenção será especificamente descrita. No entanto, a presente invenção não se limita às seguintes descrições. Os termos científicos e os termos técnicos utilizados em relação à presente invenção têm significados que são comumente compreendidos por uma pessoa versada na técnica, a menos que de outro modo especificado na presente descrição.

DNA circular [0066] O DNA circular que é utilizado como molde é preferivelmente uma fita dupla. O DNA circular utilizado como molde não é particularmente limitado, desde que inclua uma sequência de origem de replicação (origem de cromossomo (oriC)) que possa se ligar a uma enzima possuindo atividade de DnaA, e os exemplos

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15/84 incluem DNA circular natural, tal como um cromossomo circular de microrganismos, DNA circular criado pela ligação do DNA circular natural que foi cortado por processamento enzimático, etc. com outro fragmento de DNA, e ciclização do produto ligado, DNA circular criado pela realização de um tratamento de circularização no DNA existente em um estado linear na natureza, e DNA circular que foi artificialmente sintetizado totalmente. Com respeito às sequências de origem de replicação (oriC) que podem se ligar a uma enzima possuindo atividade de DnaA (pode ser descrita a seguir simplesmente como sequência de origem de replicação ou oriC), as sequências de origem de replicação publicamente conhecidas existentes em bactérias, tais como E. coli, Bacillus subtilis, podem ser obtidas a partir de um banco de dados público, tal como o NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). ou então, a sequência de origem de replicação pode ser obtida por clonagem de um fragmento de DNA, que pode se ligar a uma enzima possuindo atividade de DnaA e analisar sua sequência de bases.

[0067] O DNA circular que é para ser utilizado como molde na presente invenção pode ser um DNA circular contendo uma sequência de origem de replicação desde o começo, ou o DNA circular originalmente sem uma sequência de origem de replicação, porém incorporando posteriormente uma sequência de origem de replicação.

[0068] Como um método de preparação de DNA circular usado como molde pela introdução de uma sequência de origem de replicação em DNA circular originalmente sem uma sequência de origem de replicação, um meio conhecido por uma pessoa versada na técnica pode ser aplicado. Em uma modalidade, a introdução de uma sequência de origem de replicação no DNA circular sem uma tal sequência de origem de replicação pode ser realizada pela adição de DNA transposon compreendendo uma sequência de origem de

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16/84 replicação, que é um DNA linear fosforilado no terminal-5' compreendendo uma sequência de origem de replicação e também compreendendo sequências de extremidade externa (OE) em ambos os seus terminais, e transposase em um tampão para formar um transposoma compreendendo uma sequência de origem de replicação e, em seguida, reagir o transposoma compreendendo a sequência de origem de replicação com o DNA circular sem a tal sequência de origem de replicação em um tampão, para realizar uma reação de transferência.

[0069] O DNA circular que é usado como molde na presente invenção pode incluir sequências de genes marcadores que são resistentes a fármacos, tais como canamicina, ampicilina, tetraciclina, etc. de acordo com a finalidade.

[0070] Além disso, o DNA circular que é utilizado como molde na presente invenção pode estar em um estado purificado, ou pode estar na forma de uma suspensão de extração de bactérias incluindo o DNA circular. Um único tipo de DNA circular pode ser usado como molde, porém também é possível utilizar uma mistura de diversos tipos de DNAs circulares, como uma biblioteca de DNA, em um tubo de teste como molde.

[0071] Não há limite para o comprimento do DNA circular usado como molde na presente invenção, e o comprimento pode ser de 1 kb (1.000 de comprimento de base) ou maior, 5 kb (5.000 de comprimento de base) ou maior, 8 kb (8.000 de comprimento de base) ou maior, 10 kb (10.000 de comprimento de base) ou maior, 50 kb (50.000 de comprimento de base) ou maior, 100 kb (100.000 de comprimento de base) ou maior, 200 kb (200.000 de comprimento de base) ou maior, 500 kb (500.000 de comprimento de base) ou maior, 1000 kb (1.000.000 de comprimento de base) ou maior, ou 2000 kb (2.000.000 de comprimento de base) ou maior.

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Primeiro, segundo e terceiro grupos enzimáticos

1. Primeiro Grupo Enzimático [0072] Na presente descrição, o primeiro grupo enzimático significa um grupo de enzimas que catalisa a replicação de DNA circular.

[0073] Um exemplo de um primeiro grupo enzimático que catalisa a replicação de DNA circular é o grupo enzimático exposto em Kaguni JM & Kornberg A. Cell. 1984, 38:183-90. Especificamente, os exemplos do primeiro grupo enzimático incluem uma ou mais enzimas ou grupo enzimático selecionado de um grupo que consiste em uma enzima com atividade de DnaA, um ou mais tipos de proteína nucleoide, uma enzima ou grupo enzimático tendo atividade de DNA girase, proteína de ligação de fita simples (SSB), uma enzima com atividade de helicase tipo-DnaB, uma enzima com atividade de carregador de DNA helicase, uma enzima com atividade de DNA primase, uma enzima com atividade de grampo de DNA, e uma enzima ou grupo enzimático com atividade de DNA polimerase ΙΙΓ, e combinações de todas as enzimas ou grupos enzimáticos mencionados acima.

[0074] A enzima tendo atividade de DnaA não é particularmente limitada em sua origem biológica, desde de que tenha uma atividade iniciadora que seja similar àquela do DnaA, que é uma proteína iniciadora de E. coli, e o DnaA derivado de E. coli pode ser preferivelmente utilizado. O DnaA derivado de Escherichia coli pode estar contido como um monômero na solução de reação em uma quantidade de 1 nM a 10 μΜ, preferivelmente em uma quantidade de 1 nM a 5 nM, 1 nM a 3 μΜ, 1 nM a 1,5 μΜ, 1 nM a 1,0 μΜ, 1 nM a 500 nM, 50 nM a 200 nM, ou 50 nM a 150 nM, porém sem estar limitado a ela.

[0075] Uma proteína nucleoide é proteína no nucleoide. O um ou mais tipos de proteínas nucleoides usados na presente invenção não

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18/84 estão particularmente limitados em sua origem biológica, desde que tenham uma atividade que seja similar àquela da proteína nucleoide de E. coli. Por exemplo, IHF derivado de Escherichia coli, isto é, um complexo de IhfA e/ou IhfB (um heterodímero ou um homodímero), ou HU derivado de Escherichia coli, isto é, um complexo de hupA e hupB, pode ser preferivelmente utilizado. O IHF derivado de Escherichia coli pode estar contido como um hetero/homo dímero em uma solução de reação em uma concentração de 5 nM a 400 nM. Preferivelmente, o IHF derivado de Escherichia coli pode estar contido em uma solução de reação em uma faixa de concentração de 5 nM a 200 nM, 5 nM a 100 nM, 5 nM a 50 nM, 10 nM a 50 nM, 10 nM a 40 nM, ou 10 nM a 30 nM, porém, a faixa de concentração não é limitada a estas. O HU derivado de Escherichia coli pode estar contido em uma solução de reação em uma faixa de concentração de 1 nM a 50 nM e, preferivelmente, pode estar contido ali em uma faixa de concentração de 5 nM a 50 nM ou de 5 nM a 25 nM, porém, a faixa de concentração não é limitada a estas.

[0076] Uma enzima ou grupo enzimático que tem atividade de DNA girase não é particularmente limitado em sua origem biológica, desde que tenha uma atividade que seja similar àquela do DNA girase de E. coli. Por exemplo, um complexo de GyrA e GyrB derivado de Escherichia coli pode ser preferivelmente utilizado. Um tal complexo de GyrA e GyrB derivado de Escherichia coli pode estar contido como um heterotetrâmero em uma solução de reação em uma faixa de concentração de 20 nM a 500 nM e, preferivelmente, pode estar contido ali em uma faixa de concentração de 20 nM a 400 nM, 20 nM a 300 nM, 20 nM a 200 nM, 50 nM a 200 nM, ou 100 nM a 200 nM, porém, a faixa de concentração não é limitada a estas.

[0077] Uma proteína de ligação de fita simples (SSB) não é particularmente limitada em sua origem biológica, desde que tenha

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19/84 uma atividade que seja similar àquela da proteína de ligação de fita simples de E. coli. Por exemplo, a SSB derivada de Escherichia coli pode ser preferivelmente utilizada. Uma tal SSB derivada de Escherichia coli pode estar contida como um homotetrâmero em uma solução de reação em uma faixa de concentração de 20 nM a 1000 nM e, preferivelmente, pode estar contida ali em uma faixa de concentração de 20 nM a 500 nM, 20 nM a 300 nM, 20 nM a 200 nM, 50 nM a 500 nM, 50 nM a 400 nM, 50 nM a 300 nM, 50 nM a 200 nM, 50 nM a 150 nM, 100 nM a 500 nM, ou 100 nM a 400 nM, porém, a faixa de concentração não é limitada a estas.

[0078] Uma enzima tendo atividade de helicase tipo-DnaB não é particularmente limitada em sua origem biológica, desde que tenha uma atividade que seja similar àquela do DnaB de E. coli. Por exemplo, o DnaB derivado de Escherichia coli pode ser preferivelmente utilizado. Tal DnaB derivado de Escherichia coli pode estar contido como um homo-hexâmero em uma solução de reação em uma faixa de concentração de 5 nM a 200 nM e, preferivelmente, pode estar contido ali em uma faixa de concentração de 5 nM a 100 nM, 5 nM a 50 nM, ou 5 nM a 30 nM, porém, a faixa de concentração não é limitada a estas.

[0079] Uma enzima tendo atividade de carregador de DNA helicase não é particularmente limitada em sua origem biológica, desde que tenha uma atividade que seja similar àquela do DnaC de E. coli. Por exemplo, o DnaC derivado de Escherichia coli pode ser preferivelmente utilizado. Tal DnaC derivado de Escherichia coli pode estar contido como um homo-hexâmero em uma solução de reação em uma faixa de concentração de 5 nM a 200 nM e, preferivelmente, pode estar contido ali em uma faixa de concentração de 5 nM a 100 nM, 5 nM a 50 nM, ou 5 nM a 30 nM, porém, a faixa de concentração não é limitada a estas.

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20/84 [0080] Uma enzima com atividade de DNA primase não é particularmente limitada em sua origem biológica, desde que tenha uma atividade que seja similar àquela do DnaG de E. coli. Por exemplo, o DnaG derivado de Escherichia coli pode ser preferivelmente utilizado. Tal DnaG derivado de Escherichia coli pode estar contido como um monômero em uma solução de reação em uma faixa de concentração de 20 nM a 1000 nM e, preferivelmente, pode estar contido ali em uma faixa de concentração de 20 nM a 800 nM, 50 nM a 800 nM, 100 nM a 800 nM, 200 nM a 800 nM, 250 nM a 800 nM, 250 nM a 500 nM, ou 300 nM a 500 nM, porém, a faixa de concentração não é limitada a estas.

[0081] Uma enzima com atividade de grampo de DNA não é particularmente limitada em sua origem biológica, desde que tenha uma atividade que seja similar àquela de DnaN de E. coli. Por exemplo, o DnaN derivado de Escherichia coli pode ser preferivelmente utilizado. Tal DnaN derivado de Escherichia coli pode estar contido como um homodímero em uma solução de reação em uma faixa de concentração de 10 nM a 1000 nM e, preferivelmente, pode estar contido ali em uma faixa de concentração de 10 nM a 800 nM, 10 nM a 500 nM, 20 nM a 500 nM, 20 nM a 200 nM, 30 nM a 200 nM, ou 30 nM a 100 nM, porém, a faixa de concentração não é limitada a estas.

[0082] Uma enzima ou grupo enzimático com atividade de DNA polimerase ΙΙΓ não é particularmente limitado em sua origem biológica, desde que seja uma enzima ou grupo enzimático tendo uma atividade que seja similar àquela do complexo de DNA polimerase III* de E. coli. Por exemplo, um grupo enzimático compreendendo qualquer um de DnaX, HolA, HolB, HolC, HolD, DnaE, DnaQ, e HolE derivado de Escherichia coli, preferivelmente, um grupo enzimático compreendendo um complexo de DnaX, HolA, HolB e DnaE derivado

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21/84 de Escherichia coii e, mais preferivelmente, uma enzima compreendendo um complexo de DnaX, HolA, HolB, HolC, HolD, DnaE, DnaQ, e HolE derivado de Escherichia coii, podem ser preferivelmente utilizados. Um tal complexo de DNA polimerase III* derivado de Escherichia coii pode estar contido como um heteromultímero em uma solução de reação em uma faixa de concentração de 2 nM a 50 nM e, preferivelmente, pode estar contido ali em uma faixa de concentração de 2 nM a 40 nM, 2 nM a 30 nM, 2 nM a 20 nM, 5 nM a 40 nM, 5 nM a 30 nM, ou 5 nM a 20 nM, porém, a faixa de concentração não é limitada a estas.

2. Segundo Grupo Enzimático [0083] Na presente descrição, o segundo grupo enzimático significa um grupo de enzimas que catalisa a maturação de fragmentos de Okazaki e sintetiza dois DNAs circulares irmãos constituindo um catenano.

[0084] Na presente invenção, os dois DNAs circulares irmãos constituindo um catenano são dois DNAs circulares sintetizados por replicação de DNA e então unidos.

[0085] Os exemplos do segundo grupo enzimático que catalisa a maturação de fragmentos de Okazaki e sintetiza dois DNAs circulares irmãos constituindo um catenano podem incluir, por exemplo, uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma enzima que tem atividade de DNA polimerase I, uma enzima que tem atividade de DNA ligase, e uma enzima que tem atividade de RNaseH, ou uma combinação destas enzimas.

[0086] Uma enzima que tem atividade de DNA polimerase I não é particularmente limitada em sua origem biológica, desde que tenha uma atividade que seja similar a DNA polimerase I de E. coii. Por exemplo, a DNA polimerase I derivada de Escherichia coii pode ser preferivelmente utilizada. Tal DNA polimerase I derivada de

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Escherichia coli pode estar contida como um monômero em uma solução de reação em uma faixa de concentração de 10 nM a 200 nM e, preferivelmente, pode estar contida ali em uma faixa de concentração de 20 nM a 200 nM, 20 nM a 150 nM, 20 nM a 100 nM, 40 nM a 150 nM, 40 nM a 100 nM, ou 40 nM a 80 nM, porém, a faixa de concentração não é limitada a estas.

[0087] Uma enzima que tem atividade de DNA ligase não é particularmente limitada em sua origem biológica, desde que tenha uma atividade que seja similar a DNA ligase de E. coli. Por exemplo, a DNA ligase derivada de Escherichia coli ou a DNA ligase de fago T4 pode ser preferivelmente utilizada. Tal DNA ligase derivada de Escherichia coli pode estar contida como um monômero em uma solução de reação em uma faixa de concentração de 10 nM a 200 nM e, preferivelmente, pode estar contida ali em uma faixa de concentração de 15 nM a 200 nM, 20 nM a 200 nM, 20 nM a 150 nM, 20 nM a 100 nM, ou 20 nM a 80 nM, porém, a faixa de concentração não é limitada a estas.

[0088] A enzima com atividade de RNaseH não é particularmente limitada em termos de origem biológica, desde que tenha a atividade de decompor a cadeia de RNA de um híbrido de RNA-DNA. Por exemplo, a RNaseH derivada de Escherichia coli pode ser preferivelmente utilizada. Tal RNaseH derivada de Escherichia coli pode estar contida como um monômero em uma solução de reação em uma faixa de concentração de 0,2 nM a 200 nM e, preferivelmente, pode estar contida ali em uma faixa de concentração de 0,2 nM a 200 nM, 0,2 nM a 100 nM, 0,2 nM a 50 nM, 1 nM a 200 nM, 1 nM a 100 nM, 1 nM a 50 nM, ou 10 nM a 50 nM, porém, a faixa de concentração não é limitada a estas.

3. Terceiro Grupo Enzimático [0089] Na presente descrição, o terceiro grupo enzimático significa

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23/84 um grupo de enzimas que catalisa a separação de dois DNAs circulares irmãos.

[0090] Um exemplo de um terceiro grupo enzimático que catalisa a separação de dois DNAs circulares irmãos é o grupo de enzimas apresentado, por exemplo, no grupo enzimático descrito em Peng H & Marians KJ. PNAS. 1993, 90: 8571-8575. Especificamente, os exemplos do terceiro grupo enzimático incluem uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma enzima que tem atividade de topoisomerase IV, uma enzima que tem atividade de topoisomerase III, e uma enzima que tem atividade de helicase tipo-RecQ; ou uma combinação das enzimas mencionadas acima.

[0091] A enzima com atividade de topoisomerase III não é particularmente limitada em termos de origem biológica, desde que tenha a mesma atividade que a da topoisomerase III de Escherichia coli. Por exemplo, a topoisomerase III derivada de Escherichia coli pode ser preferivelmente utilizada. Tai topoisomerase III derivada de Escherichia coli pode estar contida como um monômero em uma solução de reação em uma faixa de concentração de 20 nM a 500 nM e, preferivelmente, pode estar contida ali em uma faixa de concentração de 20 nM a 400 nM, 20 nM a 300 nM, 20 nM a 200 nM, 20 nM a 100 nM, ou 30 a 80 nM, porém, a faixa de concentração não é limitada a estas.

[0092] A enzima com atividade de helicase tipo-RecQ não é particularmente limitada em termos de origem biológica, desde que tenha a mesma atividade que a da RecQ de Escherichia coli. Por exemplo, a RecQ derivada de Escherichia coli pode ser preferivelmente utilizada. Tal RecQ derivada de Escherichia coli pode estar contida como um monômero em uma solução de reação em uma faixa de concentração de 20 nM a 500 nM e, preferivelmente, pode estar contida ali em uma faixa de concentração de 20 nM a 400 nM, 20

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24/84 nM a 300 nM, 20 nM a 200 nM, 20 nM a 100 nM, ou 30 a 80 nM, porém, a faixa de concentração não é limitada a estas.

[0093] Uma enzima com atividade de topoisomerase IV não é particularmente limitada em sua origem biológica, desde que tenha uma atividade que seja similar à topoisomerase IV de Escherichia coli. Por exemplo, a topoisomerase IV derivada de Escherichia coli, que é um complexo de ParC e ParE, pode ser preferivelmente utilizada. Tal topoisomerase IV derivada de Escherichia coli pode estar contida como um heterotetrâmero em uma solução de reação em uma faixa de concentração de 0,1 nM a 50 nM e, preferivelmente, pode estar contida ali em uma faixa de concentração de 0,1 nM a 40 nM, 0,1 nM a 30 nM, 0,1 nM a 20 nM, 1 nM a 40 nM, 1 nM a 30 nM, 1 nM a 20 nM, 1 nM a 10 nM, ou 1 nM a 5 nM, porém, a faixa de concentração não é limitada a estas.

[0094] Os primeiro, segundo e terceiro grupos enzimáticos fornecidos acima podem ser aqueles que estão comercialmente disponíveis, ou podem ser extraídos de microrganismos e purificados quando necessário. A extração e purificação de enzimas a partir de microrganismos podem ser realizadas, quando necessário, utilizando meios que estão disponíveis a uma pessoa versada na técnica.

[0095] Quando enzimas, exceto as enzimas derivadas de Escherichia coli descritas acima, são utilizadas como o primeiro, segundo e terceiro grupos enzimáticos, cada uma delas pode ser usada em uma correspondente faixa de concentração, como uma unidade de atividade enzimática, na faixa de concentração que é especificada em relação à enzima derivada de Escherichia coli descrita acima.

[0096] A solução de reação, contendo sistemas de expressão de proteínas livres de células das enzimas mencionadas acima, pode ser misturada como está, com o DNA circular que constitui um molde para

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25/84 formar uma mistura de reação para replicação e amplificação de DNA circular. O sistema de expressão de proteínas livre de células pode ser um sistema de translação livre de células que compreende um RNA total contendo o RNA consistindo em uma sequência que é complementar à sequência de bases dos genes que codificam as enzimas acima, mRNA ou produto de transcrição in vitro como o RNA molde, ou pode ser um sistema de transcrição/translação livre de células que compreende genes que codificam diferentes enzimas ou vetores de expressão, incluindo os genes que codificam diferentes enzimas como o DNA molde.

Método para replicação de DNA circular (A) [0097] Em um aspecto, o presente pedido refere-se a um método para replicar ou amplificar DNA circular em um sistema livre de células, compreendendo as seguintes etapas:

um primeiro grupo enzimático, que catalisa a replicação de DNA circular, um segundo grupo enzimático, que catalisa a maturação de fragmentos de Okazaki e sintetiza dois DNAs circulares irmãos constituindo um catenano, e um terceiro grupo enzimático, que catalisa a separação de dois DNAs circulares irmãos; e (2) reagir a mistura de reação formada na etapa (1), em que o DNA circular inclui uma sequência de origem de replicação (origem de cromossomo (oriC)) que pode se ligar a uma enzima possuindo atividade de DnaA, e inclui ainda um par de sequências ter que é inserido externamente em relação a oriC, e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por XerCD, em que quando o DNA circular tem as sequências ter, a

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26/84 solução de reação na etapa (1) compreende ainda uma proteína possuindo a atividade de inibir a replicação por ligação com as sequências ter, e quando o DNA circular tem a sequência nucleotídica reconhecida por XerCD, a solução de reação na etapa (1) compreende ainda uma proteína XerCD (a seguir também referido como Método (A) na presente descrição).

[0098] Sem ser limitado pela teoria, no Método (A), o DNA circular é replicado ou amplificado através do ciclo de replicação mostrado na Figura 1 ou pela repetição deste ciclo de replicação. Na presente descrição, replicação de DNA circular significa que, é gerada a mesma molécula que a do DNA circular usado como molde. A replicação de DNA circular pode ser confirmada pelo fenômeno de que a quantidade de DNA circular no produto de reação após o término da reação é aumentada em comparação à quantidade de DNA circular usada como molde no início da reação. Preferivelmente, a replicação de DNA circular significa que a quantidade de DNA circular no produto de reação é aumentada pelo menos duas vezes, 3 vezes, 5 vezes, 7 vezes ou 9 vezes, em comparação à quantidade de DNA circular no início da reação. A amplificação de DNA circular significa que a replicação de DNA circular progride e a quantidade de DNA circular no produto de reação é aumentada exponencialmente em relação à quantidade de DNA circular usada como molde no início da reação.

[0099] No método do presente pedido, a frase sistema livre de células significa que a reação de replicação não é realizada nas células. Quer dizer, o método do presente pedido realizado em um sistema isento de células pretende significar que o presente método é realizado in vitro. O mesmo se aplica ao Método (B) descrito mais tarde.

[0100] O DNA circular a ser misturado com a solução de reação é

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27/84 como descrito na seção acima < DNA circular >. A quantidade de DNA molde utilizada por reação não é particularmente limitada. Por exemplo, no início da reação, o DNA circular pode estar presente em uma concentração de 10 ng/μΙ ou menos, 5 ng/μΙ ou menos, 1 ng/μΙ ou menos, 0,8 ng/μΙ ou menos, 0,5 ng/μΙ ou menos, 0,1 ng/μΙ ou menos, 50 pg/μΙ ou menos, 5 pg/μΙ ou menos, 0,5 pg/μΙ ou menos, 50 fg/μΙ ou menos, 5 fg/μΙ ou menos, ou 0,5 fg/μΙ ou menos, na solução de reação. Além disso, no início da reação, uma molécula de DNA circular por reação é permitida estar presente como molde, de modo a poder ser utilizada na replicação ou amplificação.

[0101] O DNA circular usado como molde no Método (A) compreende um par de sequências ter que é inserido externamente em relação a oriC, e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por XerCD. Quando este DNA circular tem as sequências ter, a solução de reação na etapa (1) compreende ainda uma proteína possuindo a atividade de inibir a replicação por ligação com as sequências ter, e quando o DNA circular tem a sequência nucleotídica reconhecida por XerCD, a solução de reação na etapa (1) compreende ainda uma proteína XerCD.

[0102] Tal como uma proteína que tem a atividade de inibir a replicação por ligação com as sequências ter e/ou XerCD, um produto comercialmente disponível pode ser utilizado, ou um produto extraído de microrganismos e similares, que é então purificado quando necessário, também pode ser utilizado. A extração e purificação de uma enzima a partir de microrganismos pode ser realizada, quando apropriado, usando-se meios disponíveis a uma pessoa versada na técnica.

[0103] Uma combinação de sequências ter no DNA e uma proteína possuindo a atividade de inibir a replicação por ligação com as sequências ter é um mecanismo de terminação da replicação. Este

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28/84 mecanismo foi encontrado em uma pluralidade de tipos de bactérias e, por exemplo, em Escherichia coli, este mecanismo tem sido conhecido como um sistema Tus-ter (Hiasa, H., and Marians, K. J., J. Biol. Chem., 1994, 269: 26959-26968; Neylon, C., et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev., setembro de 2005, págs.501-526) e em bactérias Bacillus, este mecanismo tem sido conhecido como um sistema RTP-ter (Vivian, et al., J. Mol. Biol., 2007, 370: 481-491). No método do presente pedido, utilizando este mecanismo, a geração de um multímero de DNA como um subproduto pode ser suprimida. A combinação das sequências ter no DNA e a proteína com a atividade de inibir a replicação por ligação com as sequências ter não é particularmente limitada, em termos de sua origem biológica.

[0104] Em uma modalidade preferida, no método do presente pedido, uma combinação de sequências ter e uma proteína Tus é utilizada. A sequência ter usada em combinação com a proteína Tus pode ser uma sequência compreendendo 5'GN[A/G][T/A]GTTGTAAC[T/G]A-3' (SEQ ID N^Q: 1), ou mais preferivelmente, 5'-G[T/G]A[T/A]GTTGTAAC[T/G]A-3' (SEQ ID N^Q: 2), 5'GTATGTTGTAACTA-3' (SEQ ID N^Q: 3), 5'-AGTATGTTGTAACTAAAG-3' (SEQ ID N^Q: 4), 5'-GGATGTTGTAACTA-3' (SEQ ID N^Q: 5), 5'GTATGTTGTAACGA-3' (SEQ ID N^Q: 6), 5'-GGATGTTGTAACTA-3' (SEQ ID N^Q: 7), 5'-GGAAGTTGTAACGA-3' (SEQ ID N^Q: 8), ou 5'GTAAGTTGTAACGA-3' (SEQ ID N^Q: 9). A origem da proteína Tus não é particularmente limitada, porém é preferivelmente uma proteína Tus derivada de Escherichia coli. A proteína Tus pode ser compreendida em uma solução de reação em uma faixa de concentração de 1 nM a 200 nM, e pode ser preferivelmente compreendida em uma faixa de concentração de 2 nM a 200 nM, 2 nM a 100 nM, 5 nM a 200 nM, 5 nM a 100 nM, 10 nM a 100 nM, 20 nM a 100 nM, ou 20 nM a 80 nM, porém, a faixa de concentração não é limitada a estas.

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29/84 [0105] Em outra modalidade preferida, no método do presente pedido, uma combinação de sequências ter e uma proteína RTP é utilizada. A sequência ter usada em combinação com a proteína RTP é uma sequência com 23 a 30 nucleotídeos de comprimento, compreendendo 5'-AC[T/A][A/G]ANNNNN[C/T]NATGTACNAAAT-3' (SEQ ID N^Q: 10), ou preferivelmente 5'ACTAATT[A/G]A[A/T]C[T/C]ATGTACTAAAT-3' (SEQ ID N^Q: 11), 5'ACTAATT[A/G]A[A/T]C[T/C]ATGTACTAAATTTTCA-3' (SEQ ID N^Q:

12) , 5'-GAACTAATTAAACTATGTACTAAATTTTCA-3' (SEQ ID N^Q:

13) , ou 5'-ATACTAATTGATCCATGTACTAAATTTTCA-3' (SEQ ID N^Q:

14) . Quando uma sequência com 23 a 30 nucleotídeos de comprimento, compreendendo qualquer uma das sequências mostradas na SEQ ID N°^s: 10 a 12, é selecionada como uma sequência ter, esta sequência pode ter uma identidade de sequência de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou de pelo menos 95% da SEQ ID N^Q: 13 ou 14. A origem da proteína RTP não é particularmente limitada, porém é preferivelmente uma proteína RTP derivada de bactérias de Bacillus e, mais preferivelmente, uma proteína RTP derivada de Bacillus subtilis. A proteína Tus pode ser compreendida em uma solução de reação em uma faixa de concentração de 1 nM a 200 nM, e pode ser preferivelmente compreendida em uma faixa de concentração de 2 nM a 200 nM, 2 nM a 100 nM, 5 nM a 200 nM, 5 nM a 100 nM, 10 nM a 100 nM, 20 nM a 100 nM, ou 20 nM a 80 nM, porém, a faixa de concentração não é limitada a estas. Quanto às sequências ter, a frase inserida externamente em relação a oriC significa que as sequências ter são inseridas de modo que a replicação realizada na direção de curso para fora de oriC é permitida pela ação de uma combinação com uma proteína que tem a atividade de inibir a replicação por ligação com as sequências ter, enquanto a replicação realizada na direção de curso

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30/84 voltada para oriC não é permitida e é finalizada. As setas das sequências ter mostradas na Figura 3(a) e Figura 5 mostram o estado em que cada par de sequências ter é inserido externamente em relação a oriC. Consequentemente, com respeito à sequência ter, a frase um par de sequências ter é inserido externamente em relação a oriC' significa que uma sequência compreendendo qualquer uma das sequências mostradas na SEQ ID N°^s: 1 a 14 é inserida como uma sequência ter no lado do terminal-5' de oriC, e uma sequência compreendendo uma sequência complementar a qualquer uma das sequências mostradas na SEQ ID N°^s: 1 a 14 é inserida como a outra sequência ter no lado do terminal-3' de oriC.

[0106] As sequências ter podem estar presentes em quaisquer posições, desde que cada par de sequências ter seja inserido externamente em relação a oriC. Por exemplo, um par de sequências ter pode estar presente em uma região oposta a oriC, ou também pode estar presente em uma região próxima ou adjacente a ambos os lados de oriC. Quando um par de sequências ter está presente em uma região próxima ou adjacente a ambos os lados de oriC, o oriC e um par de sequências ter podem ser preparados como um cassete funcional. Assim, é vantajoso que a introdução de oriC e de um par de sequências ter no DNA possa ser facilitada e que o custo de preparação do DNA circular usado como molde possa ser reduzido.

[0107] Uma combinação de uma sequência reconhecida por XerCD no DNA e uma proteína XerCD é um mecanismo de separação de um multímero de DNA (Ip, S. C. Y., et al., EMBO J., 2003, 22: 6399-6407). A proteína XerCD é um complexo de XerC e XerD. Como tal sequência reconhecida por XerCD, foram conhecidas uma sequência dif, uma sequência cer, e uma sequência psi (Colloms, et al., EMBO J., 1996, 15(5): 1172-1181; Arciszewska, L.

K., et al., J. Mol. Biol., 2000, 299: 391-403). No método do presente

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31/84 pedido, utilizando este mecanismo, a geração de um multímero de DNA como um subproduto pode ser suprimida. A combinação da sequência reconhecida por XerCD no DNA e da proteína XerCD não é particularmente limitada, em termos de sua origem biológica. Além disso, os fatores de promoção de XerCD foram conhecidos e, por exemplo, a função de dif é promovida por uma proteína FtsK (Ip, S. C. Y., et al., EMBO J., 2003, 22: 6399-6407). Em uma modalidade, uma tal proteína FtsK pode ser compreendida em uma solução de reação usada no método do presente pedido.

[0108] A sequência reconhecida por XerCD pode ser uma sequência compreendendo 5'-GGTGCG[C/T][A/G][T/C]AANNNNNNTTATG[T/G]TAAA[T/C]-3' (SEQ ID N²: 15), 5'-GGTGCG[C/T]A[T/C]AANNNNNNTTATG[T/G]TAAAT-3' (SEQ ID N²: 16), 5'-GGTGCGC[A/G][T/C]AANNNNNNTTATGTTAAA[T/C]-3' (SEQ ID N²: 17), 5'-GGTGCG[C/T][A/G]CAANNNNNNTTATG[T/G]TAAA[T/C]-3' (SEQ ID N²: 18), 5'-GGTGCGCATAANNNNNNTTATGTTAAAT-3' (SEQ ID N²: 19), 5'-GGTGCGTACAANNNNNNTTATGGTAAAT-3' (SEQ ID N²: 20), 5'-GGTGCGCGCAANNNNNNTTATGTTAAAC-3' (SEQ ID N²: 21),

5'-GGTGCGCATAATGTATATTATGTTAAAT-3'	(SEQ	ID	N²
22/sequência dif), 5'-GGTGCGTACAAGGGATGTTATGGTAAAT-3'	(SEQ	ID	N²
23/sequência cer), ou 5'-GGTGCGCGCAAGATCCATTATGTTAAAC-3'	(SEQ	ID	N²

24/sequência psi), ou uma sequência complementar a qualquer uma destas sequências. A porção nucleotídica nas posições 1 a 11 na SEQ ID N°^s: 15 a 24 é um sítio de ligação a XerC, e a parte nucleotídica nas

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32/84 posições 18 a 28 na SEQ ID N°^s: 15 a 24 é um sítio de ligação a XerD. Uma vez que a porção nucleotídica nas posições 12 a 17 na SEQ ID N°^s: 15 a 21 (isto é, uma porção de 6 nucleotídeos consistindo em NNNNNN) não é uma região de ligação a XerC ou XerD, a sua sequência não é particularmente limitada. Preferivelmente, a sequência de nucleotídeos nas posições 12 a 17 da SEQ ID N°^s: 15 a 21 (isto é, uma porção de 6 nucleotídeos consistindo em NNNNNN) pode ter uma identidade de sequência de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou de pelo menos 95% da sequência de nucleotídeos nas posições 12 a 17 da SEQ ID N°^s: 22 a 24.

[0109] A proteína XerCD é preferivelmente uma proteína XerCD derivada de Escherichia coli. A proteína XerCD pode ser compreendida em uma solução de reação em uma faixa de concentração de 1 nM a 200 nM, e pode ser preferivelmente compreendida em uma faixa de concentração de 5 nM a 200 nM, 5 nM a 150 nM, 10 nM a 200 nM, 10 nM a 150 nM, 20 nM a 200 nM, 20 nM a 150 nM, ou 20 nM a 100 nM, porém, a faixa de concentração não é limitada a estas.

[0110] A sequência reconhecida por XerCD pode estar presente em qualquer posição no DNA circular. Por exemplo, a sequência reconhecida por XerCD pode estar presente em uma região oposta a oriC, ou também pode estar presente em uma região próxima ou adjacente a oriC. Quando a sequência reconhecida por XerCD está presente em uma região próxima ou adjacente a oriC, o oriC e a sequência reconhecida por XerCD podem ser preparados como um cassete funcional. Assim, é vantajoso que a introdução de oriC e da sequência reconhecida por XerCD no DNA possa ser facilitada e o custo de preparação do DNA circular usado como molde possa ser reduzido.

[0111] Na presente descrição, a identidade (%) entre duas

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33/84 sequências nucleotídicas pode ser determinada por inspeção visual e cálculo matemático. Além disso, a identidade (%) também pode ser determinada usando programas de computador. Exemplos de tais programas de computador de comparação de sequência podem incluir o Programa BLASTN, que está disponível no site da Biblioteca Nacional de Medicina dos Estados Unidos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10; versão 2.2.7 ou Algoritmo WUBLAST2.0. Com respeito aos parâmetros padrão de WU-BLAST2.0, os parâmetros padrão descritos no site da internet a seguir (http://blast.wustl.edu) podem estar disponíveis.

[0112] O primeiro, segundo e terceiro grupos enzimáticos contidos na solução de reação são como descritos na seção Primeiro, segundo e terceiro grupos enzimáticos acima.

[0113] Em uma certa modalidade, o primeiro grupo enzimático usado no método do presente pedido pode incluir uma combinação de uma enzima com atividade de DnaA, uma ou mais proteínas nucleoides, uma enzima ou um grupo enzimático com atividade de DNA girase, uma proteína de ligação de DNA de fita simples (SSB), uma enzima com atividade de helicase tipo-DnaB, uma enzima com atividade de carregador de DNA helicase, uma enzima com atividade de DNA primase, uma enzima com atividade de grampo de DNA, e uma enzima ou um grupo enzimático com atividade de DNA polimerase ΙΙΓ. Aqui, a uma ou mais proteínas nucleoides podem ser IHF ou HU, a enzima ou o grupo enzimático com atividade de DNA girase pode ser um complexo de GyrA e GyrB, a enzima com atividade de helicase tipo-DnaB pode ser DnaB helicase, a enzima com atividade de carregador de DNA helicase pode ser um carregador de DnaC helicase, a enzima com atividade de DNA primase pode ser DnaG primase, a enzima com atividade de grampo de DNA pode ser

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DnaN clamp, e a enzima ou o grupo enzimático com a atividade de DNA polimerase III* pode ser uma enzima ou um grupo enzimático compreendendo qualquer um de DnaX, HolA, HolB, HolC, HolD, DnaE, DnaQ e HolE.

[0114] Em outra modalidade, o segundo grupo enzimático usado no método da presente invenção pode incluir uma combinação de uma enzima com atividade de DNA polimerase I e uma enzima com atividade de DNA ligase. De outro modo, o segundo grupo enzimático pode incluir uma combinação de uma enzima com atividade de DNA polimerase I, uma enzima com atividade de DNA ligase, e uma enzima com atividade de RNaseH.

[0115] Em uma outra modalidade, o terceiro grupo usado no método do presente pedido pode incluir uma enzima com atividade de topoisomerase III e/ou uma enzima com atividade de topoisomerase IV. De outro modo, o terceiro grupo enzimático pode incluir uma combinação de uma enzima com atividade de topoisomerase III e uma enzima com atividade de helicase tipoRecQ. De outro modo, o terceiro grupo enzimático também pode ser uma combinação de uma enzima com atividade de topoisomerase III, uma enzima com atividade de helicase tipo-RecQ, e uma enzima com atividade de topoisomerase IV.

[0116] A solução de reação pode compreender um tampão, ATP, GTP, CTP, UTP, dNTP, uma fonte de íons de magnésio, e uma fonte de íons de metal alcalino.

[0117] O tampão contido na solução de reação não é particularmente limitado, desde que seja adequadamente utilizado em uma faixa de pH de 7 a 9 e, preferivelmente, a pH 8. Os exemplos de tampão podem incluir Tris-HCI, Hepes-KOH, um tampão de fosfato, MOPS-NaOH e Tricina-HCI. Um tampão preferido é Tris-HCI. A concentração do tampão pode ser selecionada, quando apropriado,

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35/84 por uma pessoa versada na técnica, e assim, não é particularmente limitada. No caso de Tris-HCI, por exemplo, uma concentração de 10 mM a 100 mM, 10 mM a 50 mM, ou de 20 mM pode ser selecionada.

[0118] ATP significa trifosfato de adenosina. No início da reação, a concentração de ATP contida na solução de reação pode estar em uma faixa de, por exemplo, 0,1 mM a 3 mM e, preferivelmente, em uma faixa de concentração de 0,1 mM a 2 mM, 0,1 mM a 1,5 mM, ou 0,5 mM a 1,5 mM.

[0119] GTP, CTP e UTP significam guanosina trifosfato, citidina trifosfato, e uridina trifosfato, respectivamente. No início da reação, as concentrações de GTP, CTP e UTP contidas na solução de reação podem estar independentemente, por exemplo, em uma faixa de 0,1 mM a 3,0 mM e, preferivelmente, em uma faixa de concentração de 0,5 mM a 3,0 mM ou 0,5 mM a 2,0 mM.

[0120] dNTP é um termo geral para trifosfato de desoxiadenosina (dATP), desoxiguanosina trifosfato (dGTP), desoxicitidina trifosfato (dCTP), e desoxitimidina trifosfato (dTTP). No início da reação, a concentração de dNTP contida na solução de reação pode estar, por exemplo, em uma faixa de 0,01 a 1 mM e, preferivelmente, em uma faixa de concentração de 0,05 mM a 1 mM ou 0,1 mM a 1 mM.

[0121] A fonte de íons de magnésio é uma substância que fornece íons de magnésio (Mg²⁺) na solução de reação. Exemplos de fonte de íons de magnésio incluem Mg(OAc)2, MgCÍ2, e MgSCri. Uma fonte de íons de magnésio preferida é Mg(OAc)2. No início da reação, a concentração da fonte de íons de magnésio contida na solução de reação pode ser, por exemplo, uma concentração que é necessária para fornecer 5 a 50 Mm de íons de magnésio na solução de reação.

[0122] A fonte de íons de metais alcalinos é uma substância que fornece íons de metais alcalinos na solução de reação. Exemplos de íons de metais alcalinos podem incluir íons de sódio (Na⁺) e íons de

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36/84 potássio (K⁺). Exemplos da fonte de ions de metais alcalinos podem incluir glutamato de potássio, aspartato de potássio, cloreto de potássio, acetato de potássio, glutamato de sódio, aspartato de sódio, cloreto de sódio, e acetato de sódio. Uma fonte de íons de metais alcalinos preferida é o glutamato de potássio. No início da reação, a concentração da fonte de íons de metais alcalinos contida na solução de reação pode estar em uma concentração que é necessária para fornecer íons de metais alcalinos em uma faixa de 100 mM a 300 mM, na solução de reação, porém a concentração não é limitada a isto. Mantendo um bom equilíbrio com aplicações anteriores, 150 mM podem ser subtraídos da concentração da fonte de íons de metais alcalinos descrita acima.

[0123] A solução de reação pode compreender ainda um inibidor de adsorção não específica de proteína ou um inibidor de adsorção não específica de ácido nucleico. Preferivelmente, a solução de reação pode compreender ainda um inibidor de adsorção não específica de proteína e um inibidor de adsorção não específica de ácido nucleico. Em razão da presença de um tal inibidor de adsorção não específica de proteína e/ou um inibidor de adsorção não específica de ácido nucleico na solução de reação, a adsorção não específica entre proteínas e/ou entre uma proteína e DNA circular, ou a adesão de uma proteína e DNA circular sobre a superfície de um vaso podem ser suprimidas, de modo que a melhoria da eficiência de reação pode ser esperada.

[0124] O inibidor de adsorção não específica de proteína é uma proteína que é irrelevante à reação de replicação ou amplificação no método do presente pedido. Exemplos de uma tal proteína podem incluir albumina de soro bovino (BSA), lisozima, gelatina, heparina e caseína. O inibidor de adsorção não específico de proteína pode estar contido na solução de reação em uma faixa de concentração de 0,02 a

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2,0 mg/ml e, preferivelmente, em uma faixa de concentração de 0,1 a 2,0 mg/ml, 0,2 a 2,0 mg/ml, ou 0,5 a 2,0 mg/ml, porém, a faixa de concentração não é limitada a estas.

[0125] O inibidor de adsorção não específica de ácido nucleico é uma molécula de ácido nucleico ou um fator semelhante ao ácido nucleico que é irrelevante à reação de replicação ou amplificação no método do presente pedido. Exemplos de uma tal molécula de ácido nucleico ou de um fator semelhante ao ácido nucleico podem incluir tRNA (RNA de transferência), rRNA (RNA ribossômico), mRNA (RNA mensageiro), glicogênio, heparina, oligo DNA, poli(l-C) (poliinosinapolicitidina), poli(dl-dC) (polidesoxiinosina-polidesoxicitidina), poli(A) (poliadenina), e poli(dA) (polidesoxiadenina). O inibidor de adsorção não específica de ácido nucleico pode estar contido na solução de reação em uma faixa de concentração de 1 a 500 ng/μΙ e, preferivelmente, em uma faixa de concentração de 10 a 500 ng/μΙ, 10 a 200 ng/μΙ, ou 10 a 100 ng/μΙ, porém, a faixa de concentração não é limitada a estas. Mantendo um bom equilíbrio com aplicações anteriores, quando tRNA é selecionado como um inibidor de adsorção não específica de ácido nucleico, 50 ng/μΙ podem ser subtraídos da concentração de tRNA.

[0126] A solução de reação pode compreender ainda exonuclease específica de DNA linear ou helicase tipo-RecG. Preferivelmente, a solução de reação pode compreender ainda exonuclease específica de DNA linear e helicase tipo-RecG. Em razão da presença de exonuclease específica de DNA linear e/ou helicase tipo-RecG na solução de reação, a redução da quantidade gerada de DNA linear como resultado de dupla divagem ou similar durante a reação de replicação ou amplificação, e a melhoraria de rendimento de um produto super espiral de interesse podem ser esperados.

[0127] A exonuclease específica de DNA linear é uma enzima que

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38/84 sucessivamente hidrolisa o DNA linear a partir do seu terminal-5' ou terminal-3'. A exonuclease específica de DNA linear não é particularmente limitada em termos de tipo ou origem biológica, desde que tenha a atividade de sucessivamente hidrolisar DNA linear a partir de seu terminal-5' ou terminal-3'. Por exemplo, podem ser utilizados RecBCD, exonuclease λ, exonuclease III, exonuclease VIII, exonuclease T5, exonuclease T7, e DNase dependente de ATP Plasmid-Safe™ (epicentro). Uma preferida exonuclease específica de DNA linear é RecBCD. A exonuclease de DNA linear pode estar contida na solução de reação em uma faixa de concentração de 0,01 a 1,0 U/pL e, preferivelmente, em uma faixa de concentração de 0,1 a 1,0 U/pL, porém, a faixa de concentração não é limitada a estas. A unidade de atividade enzimática (U) da exonuclease de DNA linear é uma unidade obtida quando a quantidade de enzima necessária para converter 1 nmol de desoxirribonucleotídeos de DNA linear para ser solúvel em ácido durante uma reação a 37°C por 30 minutos é fixada em 1 U.

[0128] Helicase tipo-RecG é uma enzima que é considerada ser a helicase superando uma estrutura de DNA gerada como um subproduto por colisão entre parentes de replicação no término da reação de alongamento. A helicase tipo-RecG não é particularmente limitada em termos de origem biológica, desde que tenha a mesma atividade que a RecG derivada de Escherichia coli. Por exemplo, a RecG derivada de Escherichia coli pode ser preferivelmente utilizada. A RecG derivada de Escherichia coli pode estar contida como um monômero na solução de reação em uma faixa de concentração de 100 nM a 800 nM e, preferivelmente, em uma faixa de concentração de 100 nM a 500 nM, 100 nM a 400 nM, ou 100 nM a 300 nM, porém, a faixa de concentração não é limitada a estas. A helicase tipo-RecG pode ser utilizada em uma correspondente faixa de concentração,

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39/84 como uma unidade de atividade enzimática, à faixa de concentração que é especificada em relação a RecG-derivada de Escherichia coli descrita acima.

[0129] A solução de reação pode compreender ainda um sal de amônio. Exemplos de sal de amônio podem incluir sulfato de amônio, cloreto de amônio, e acetato de amônio. Um sal de amônio particularmente preferido é o sulfato de amônio. O sal de amônio pode estar contido na solução de reação em uma faixa de concentração de 0,1 mM a 100 mM e, preferivelmente, em uma faixa de concentração de 0,1 mM a 50 mM, 1 mM a 50 mM, ou 1 mM a 20 mM, porém, a faixa de concentração não é limitada a estas.

[0130] Quando o DNA ligase derivado de Escherichia coli, que é uma enzima possuindo atividade de DNA ligase, é usada como uma enzima pertencente ao segundo grupo enzimático, seu cofator, NAD (nicotinamida adenina dinucleotídeo) está contido na solução de reação. NAD pode estar contido na solução de reação em uma faixa de concentração de 0,01 mM a 1,0 mM e, preferivelmente, em uma faixa de concentração de 0,1 mM a 1,0 mM, ou 0,1 mM a 0,5 mM, porém a faixa de concentração não é limitada a estas.

[0131] A solução de reação usada no método da presente invenção pode compreender ainda um agente redutor. Exemplos de um agente redutor preferido podem incluir DTT, β-mercaptoetanol, e glutationa. Um agente redutor preferido é o DTT.

[0132] A solução de reação usada no método da presente invenção pode compreender ainda uma enzima e um substrato, que são usados para a regeneração de ATP. Exemplos de uma combinação de uma enzima e um substrato em um sistema de regeneração de ATP podem incluir creatina quinase e creatina fosfato, e piruvato quinase e fosfoenolpiruvato. A enzima no sistema de regeneração de ATP é, por exemplo, mioquinase. Uma combinação

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40/84 preferida da enzima e do substrato no sistema de regeneração de ATP é creatina quinase e creatina fosfato.

[0133] A etapa (2) descrita acima é uma etapa pf reagindo a mistura de reação formada na etapa (1). A etapa (2) pode ser, por exemplo, uma etapa de reação da mistura de reação em uma temperatura variando de 15°C a 80°C, 15°C a 50°C, ou 15°C a 40°C. Preferivelmente, a etapa (2) pode ser uma etapa de manutenção de temperatura sob uma condição isotérmica. Tais condições isotérmicas não são particularmente limitadas, desde que a reação de replicação de DNA possa progredir sob as condições. Por exemplo, as condições isotérmicas podem ser uma temperatura constante incluída em uma faixa de 20°C a 80°C, ou em uma faixa de 25°C a 50°C, ou em uma faixa de 25°C a 40°C, ou a aproximadamente 30°C, que é a temperatura ótima da DNA polimerase. Na presente descrição, os termos manter sob uma condição isotérmica e reagir a uma condição isotérmica significa que a temperatura é mantida na faixa de temperatura descrita acima durante a reação. O tempo para manter a temperatura pode ser determinado, quando apropriado, dependendo da quantidade de um produto de replicação ou de um produto de amplificação do DNA circular de interesse. O tempo de retenção pode ser ajustado para ser, por exemplo, de 1 a 24 horas.

[0134] Alternativamente, o método da presente invenção pode compreender, como a etapa (2) descrita acima, uma etapa de incubação da mistura de reação formada na etapa (1) em um ciclo de temperatura de repetição de incubação a 30°C ou superior e incubação a 27°C ou inferior. A incubação a 30°C ou superior não é particularmente limitada, desde que a temperatura esteja em uma faixa de temperatura capaz de iniciar a replicação de DNA circular compreendendo oriC. Por exemplo, a temperatura pode ser de 30 a

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80°C, 30 a 50°C, 30 a 40°C, ou 37°C. A incubação a 30°C ou superior pode ser realizada por 10 segundos a 10 minutos por ciclo, embora não seja particularmente limitada a isto. A incubação a 27°C ou inferior não é particularmente limitada, desde que seja uma temperatura na qual a iniciação da replicação é suprimida e a reação de alongamento de DNA progride. Por exemplo, a temperatura pode ser de 10 a 27°C, 16 a 25°C, ou 24°C. A incubação a 27°C ou inferior pode ser preferivelmente determinada dependendo do comprimento do DNA circular a ser amplificado, porém não é particularmente limitada a isto. Por exemplo, a incubação pode ser realizada durante 1 a 10 segundos por 1000 bases em um único ciclo. O número de ciclos de temperatura não é particularmente limitado, porém pode ser de 10 a 50 ciclos, 20 a 40 ciclos, 25 a 35 ciclos, ou 30 ciclos.

[0135] O método do presente pedido pode incluir, após término da etapa de incubação da mistura de reação sob condições isotérmicas, uma etapa de purificação do produto de replicação ou do produto de amplificação do DNA circular, conforme necessário de acordo com o objetivo. A purificação de DNA circular pode ser realizada quando necessária utilizando meios disponíveis a uma pessoa versada na técnica.

[0136] O DNA circular que foi replicado ou amplificado usando o método do presente pedido pode ser colocado em uso para propósitos subsequentes, tais como transformação, na forma de uma mistura de reação após a reação como ela é, ou em uma forma purificada da mistura de reação.

Método para replicação de DNA circular (A') [0137] Sabe-se que, como no caso da combinação de XerCD e dif, mesmo no caso de utilizar-se uma combinação de Cre e sua sequência de identificação loxP, a separação de um multímero de DNA pode ser realizada (Ip, S. C. Y. et al., EMBO J., 2003, 22: 6399

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6407). Os presentes inventores constataram que a geração de um multímero de DNA como um subproduto pode ser suprimida mesmo usando-se uma combinação de uma enzima de separação de multímero de DNA e sua sequência de identificação, em vez da combinação de XerCD e dif do Método (A).

[0138] Em uma modalidade, o presente pedido refere-se a um método para a replicação ou amplificação de DNA circular em um sistema livre de células, compreendendo as seguintes etapas:

um primeiro grupo enzimático, que catalisa a replicação de DNA circular, um segundo grupo enzimático, que catalisa a maturação de fragmentos de Okazaki e sintetiza dois DNAs circulares irmãos constituindo um catenano, e um terceiro grupo enzimático, que catalisa a separação de dois DNAs circulares irmãos; e (2) reagir a mistura de reação formada na etapa (1), em que o DNA circular inclui uma sequência de origem de replicação (origem de cromossomo (oriC)) que pode se ligar a uma enzima possuindo atividade de DnaA, e inclui ainda um par de sequências ter que é inserido externamente em relação a oriC, e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, em que quando o DNA circular tem as sequências ter, a solução de reação na etapa (1) compreende ainda uma proteína possuindo a atividade de inibir a replicação por ligação com as sequências ter, e quando o DNA circular tem a sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, a solução de reação da etapa (1) compreende ainda a enzima de separação de multímero

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43/84 de DNA (em seguida também referido como Método (A') na presente descrição).

[0139] Isto é, o Método (A') é um método no qual a XerCD do Método (A) é estendida a uma enzima de separação de multímero de DNA e a sequência nucleotídica reconhecida por XerCD no Método (A) é estendida à sequência nucleotídica reconhecida pela enzima de separação de multímero e DNA. Consequentemente, a explicação feita no Método para replicação de DNA circular (A) com respeito às configurações individuais do Método (A) também se aplica ao método (A').

[0140] A enzima de separação de multímero de DNA é uma enzima que causa a recombinação genética de modo que possa ser obtida a separação do multímero de DNA. Uma enzima de recombinação específica de sítio, que pode reconhecer uma sequência nucleotídica específica e pode gerar recombinação genética no sítio da sequência nucleotídica, pode ser utilizada como uma enzima de separação de multímero de DNA. A sequência nucleotídica específica reconhecida pela enzima de separação de multímero de DNA é referida como uma sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA. Realizando a recombinação genética de acordo com uma combinação de uma enzima de separação de multímero de DNA e uma sequência nucleotídica reconhecida pela enzima de separação de multímero de DNA, um multímero de DNA pode ser separado. No método (A'), utilizando este mecanismo, a geração de um multímero de DNA como um subproduto pode ser suprimida. Como tal, uma enzima de separação de multímero de DNA, pode ser utilizado um produto comercialmente disponível, ou também pode ser usada uma enzima extraída de microrganismos e similares, que é então purificada quando necessário. A extração e purificação de uma enzima a partir de

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44/84 microrganismos pode ser realizada, quando apropriado, utilizando meios disponíveis a uma pessoa versada na técnica.

[0141] Exemplos de combinação da enzima de separação de multímero de DNA e da sequência nucleotídica reconhecida pela enzima de separação de multímero de DNA podem incluir: XerCD e uma sequência dif; Cre e uma sequência loxP (Siegel, R. W., et al.., FEBS Lett., 2001, 499(1-2): 147-153; Araki, K., et al., Nucleic Acids Res.: 1997, 25(4): 868-872); enzima recombinante FLP derivada de levedura germinativa (Saccharomyces verevisiae) e uma sequência FRT (Broach, J. R., et al., Cell, 1982, 29(1):227-234); enzima recombinante DreO derivada de bacteriófago D6 e uma sequência rox (Anastassiadis, K., et al., Dis. Model. Mech., 2009, 2: 508-515); enzima recombinante R derivada de Zygosacchromyces rouxii e uma sequência RS (Araki, H., et al., J. Mol. Biol., 1985, 182(2): 191-203); e uma família de enzimas recombinantes de serina (por exemplo, Gin, γδ, Tn3, e Hin) e as suas sequências de reconhecimento (Smith, M. C., et al., Mol. Microbiol., 2002, 44: 299), porém não são limitados a isso.

[0142] A XerCD e a sequência dif são como descritas acima na seção < Método para replicação circular de DNA (A) >.

[0143] A combinação de Cre e uma sequência loxP não é particularmente limitada, em termos de sua origem biológica. Cre é preferivelmente uma proteína Cre derivada de bacteriófago P1. Cre pode ser compreendida em uma solução de reação em uma faixa de concentração de 0,01 a 200 mU/μΙ, e pode ser preferivelmente compreendida em uma faixa de concentração de 0,1 a 150 mU/μΙ, 0,1 a 100 mU/μΙ, 0,5 a 100 mU/μΙ, 0,5 a 80 mU/μΙ, 0,1 a 50 mU/μΙ, 1 a 50 mU/μΙ, ou 1 a 30 mU/μΙ, porém, a faixa de concentração não é limitada a estas.

[0144] A sequência loxP reconhecida por Cre pode ser uma

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45/84 sequência compreendendo 5'ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3' (SEQ ID N^Q: 30) isto é, um consenso loxP, ou 5'ATAACTTCGTATAGtATACATTATACGAAGTTAT-3' (SEQ ID N^Q: 31/10x511), 5'-ATAACTTCGTATAGgATACtTTATACGAAGTTAT-3' (SEQ ID N^Q: 32/lox2272), 5'ATAACTTCGTATAtacctttcTATACGAAGTTAT-3' (SEQ ID N^Q: 33/loxFAS), 5'-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAcggta-3' (SEQ ID N^Q: 34/lox RE), 5'taccgTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3' (SEQ ID N^Q: 35/lox LE), que são sequências loxP mutantes (em que a letra minúscula indica um nucleotídeo mutante ao consenso), ou uma sequência complementar a qualquer uma destas sequências.

[0145] A enzima recombinante FLP derivada de levedura germinativa (Saccharomyces verevisiae) pode ser compreendida em uma solução de reação em uma faixa de concentração de 1 nM a 200 nM, e pode ser preferivelmente compreendida em uma faixa de concentração de 5 nM a 200 nM, 5 nM a 150 nM, 10 nM a 200 nM, 10 nM a 150 nM, 20 nM a 200 nM, 20 nM a 150 nM, ou 20 nM a 100 nM, porém a faixa de concentração não é limitada a estas. A sequência FRT reconhecida por FLP pode ser uma sequência compreendendo 5'GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC-3' (SEQ ID N^Q: 36), ou uma sequência complementar a esta.

[0146] A enzima recombinante DreO derivada de bacteriófago D6 pode ser compreendida em uma solução de reação em uma faixa de concentração de 1 nM a 200 nM, e pode ser preferivelmente compreendida em uma faixa de concentração de 5 nM a 200 nM, 5 nM a 150 nM, 10 nM a 200 nM, 10 nM a 150 nM, 20 nM a 200 nM, 20 nM a 150 nM, ou 20 nM a 100 nM, porém, a faixa de concentração não é limitada a estas. A sequência rox reconhecida por DreO pode ser uma

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46/84 sequência compreendendo 5'TAACTTTAAATAATGCCAATTATTTAAAGTTA-3' (SEQ ID N^Q: 37), ou uma sequência complementar a esta.

[0147] A enzima recombinante R derivada de Zygosacchromyces rouxii pode ser compreendida em uma solução de reação em uma faixa de concentração de 1 nM a 200 nM, e pode ser preferivelmente compreendida em uma faixa de concentração de 5 nM a 200 nM, 5 nM a 150 nM, 10 nM a 200 nM, 10 nM a 150 nM, 20 nM a 200 nM, 20 nM a 150 nM, ou 20 nM a 100 nM, porém a faixa de concentração não é limitada a estas. A sequência RS reconhecida pela enzima R pode ser uma sequência compreendendo a sequência descrita em Araki, H. et al. (J. Mol. Biol., 1985, 182(2): 191-203) ou uma sequência complementar a ela.

[0148] A família da enzima recombinante de serina (γδ, Tn3, Gin, e Hin) pode ser compreendida em uma solução de reação em uma faixa de concentração de 1 nM a 200 nM, e pode ser preferivelmente compreendida em uma faixa de concentração de 5 nM a 200 nM, 5 nM a 150 nM, 10 nM a 200 nM, 10 nM a 150 nM, 20 nM a 200 nM, 20 nM a 150 nM, ou 20 nM a 100 nM, porém a faixa de concentração não é limitada a estas. A família da enzima recombinante de serina γδ e Tn3, e sua sequência de reconhecimento res podem, cada uma, ser uma sequência compreendendo a sequência descrita em Grindley N. D. F. et al. (Cell, 1982, 30: 19-27) ou uma sequência complementar a ela. A família da enzima recombinante de serina Gin e sua sequência de reconhecimento podem, cada uma, ser uma sequência compreendendo a sequência descrita em Kahmann. R. et al. (Cell, 1985, 41: 771-780) ou uma sequência complementar a ela. A família da enzima recombinante de serina Hin e sua sequência de reconhecimento podem, cada uma, ser uma sequência compreendendo a sequência descrita em Glasgow. A. C. et al. (J. Biol.

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Chem., 1989, 264: 10072-10082) ou uma sequência complementar a ela.

[0149] A sequência reconhecida pela enzima de separação de multímero de DNA pode estar presente em qualquer posição no DNA circular. Por exemplo, a sequência reconhecida pela enzima de separação de multímero de DNA pode estar presente em uma região próxima ou adjacente a oriC, ou pode também estar presente em uma região oposta a oriC.

Método para replicação de DNA circular (B) [0150] Em uma modalidade, o presente pedido refere-se a um método para a replicação ou amplificação de DNA circular em um sistema livre de células, compreendendo as seguintes etapas:

(1) preparar DNA circular compreendendo oriC: adicionando transposon oriC e transposase em um tampão para formar um transposoma oriC, em que o transposon oriC é DNA linear compreendendo uma sequência de origem de replicação (origem de cromossomo (oriC)) que pode se ligar a uma enzima possuindo atividade de DnaA, e compreendendo sequências de extremidade externa (OE) em ambos os seus terminais; e reagindo o transposoma oriC com o DNA circular não compreendendo oriC em um tampão para realizar uma reação de transferência, (2) formar uma mistura de reação de DNA circular compreendendo oriC obtido na etapa (1) com uma solução de reação compreendendo:

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48/84 um terceiro grupo enzimático, que catalisa a separação de dois DNAs circulares irmãos; e (3) reagir a mistura de reação formada na etapa (2) (a seguir também referida como Método (B) na presente descrição).

[0151] Sem ser limitado pela teoria, no Método (B), oriC é introduzido no DNA circular não compreendendo oriC, usando um transposon, de modo a preparar DNA circular compreendendo oriC e, em seguida, o presente DNA circular compreendendo oriC é replicado ou amplificado. Uma vista esquemática é mostrada na Figura 2. A etapa indicada com os termos formação de transposoma e reação de transferência na Figura 2 corresponde à etapa (1) descrita acima. Com respeito à replicação e amplificação, nas etapas (2) e (3) descritas acima, o DNA circular é replicado ou amplificado através do ciclo de replicação mostrado na Figura 1, ou pela repetição deste ciclo de replicação. As definições de replicação e amplificação de DNA circular são como descritas acima.

[0152] O DNA circular compreendendo oriC a ser misturado com a solução de reação é como descrito na seção DNA circular acima. A quantidade de DNA circular compreendendo oriC usado em uma única reação é como descrito acima com respeito à quantidade de DNA molde usado no Método (A).

[0153] Além disso, a explicação relativa aos grupos enzimáticos compreendidos na solução de reação e outros componentes opcionalmente compreendidos na solução de reação é a mesma que para o Método (A). Além do mais, a etapa (3) descrita acima é realizada da mesma maneira que a etapa (2) no Método (A). O método compreendendo ainda uma etapa de purificação do produto de replicação ou do produto de amplificação do DNA circular e a utilização do DNA circular replicado ou amplificado pela aplicação do

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49/84 método do presente pedido são também os mesmos que aqueles para o Método (A).

[0154] As sequências OE em ambos terminais do transposon oriC podem ser quaisquer sequências, desde que seja conhecido por uma pessoa versada na técnica que as sequências são reconhecidas por transposase e podem ser utilizadas como sequências OE. Em uma modalidade preferida, a sequência OE compreende a sequência mostrada na SEQ ID N^Q: 25 (5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3') ou uma sequência complementar a ela, e a sequência OE compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID N^Q: 25 é inserida no terminal-5' do DNA linear na etapa (1), e a sequência OE compreendendo uma sequência complementar à sequência mostrada na SEQ ID N^Q: 25 é inserida no terminal-3'do DNA linear.

[0155] Na etapa descrita acima (1), a concentração de transposon oriC usada na formação de transposoma oriC pode ser de 20 a 200 nM, e pode ser preferivelmente de 40 a 160 nM.

[0156] A origem biológica da transposase não é particularmente limitada, desde que seja uma enzima que reconheça a sequência OE, forme um transposoma, e transfira DNA transposon para DNA circular. Por exemplo, a transposase derivada de Escherichia coli pode ser preferivelmente utilizada. Uma proteína mutante Tn5 altamente ativa (E54K, L372P) é particularmente preferível (Goryshin, I. Y., e Reznikoff, W. S., J. Biol. Chem., 1998, 273: 7367-7374). Como tal transposase, um produto comercialmente disponível pode ser utilizado, ou também pode ser usada uma enzima extraída de microrganismos, que é então purificada quando necessário. A extração e purificação de enzimas a partir de microrganismos pode ser realizada, quando apropriado, utilizando meios disponíveis a uma pessoa versada na técnica. Quando uma proteína mutante Tn5 altamente ativa (E54K, L372P) é usada como tal transposase, a concentração de proteína

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50/84 usada na formação de transposoma oriC na etapa (1) descrita acima pode ser de 50 a 200 nM, e pode ser preferivelmente de 80 a 150 nM.

[0157] O tampão usado na etapa (1) não é particularmente limitado, desde que seja adequado para ser usado a pH 6 a 9 e, preferivelmente, a pH 7,5. Exemplos de tampão podem incluir ácido Tris-acético, Tris-HCI, Hepes-KOH, um tampão de fosfato, MOPSNaOH e Tricina-HCI. O tampão preferido é ácido Tris-acético ou TrisHCI. A concentração do tampão não é particularmente limitada e pode ser selecionada, quando apropriado, por uma pessoa versada na técnica. Quando o tampão é ácido Tris-acético ou Tris-HCI, por exemplo, a concentração de 10 mM a 100 mM, 10 mM a 50 mM, ou 20 mM pode ser selecionada.

[0158] Na etapa (1), a etapa de formar um transposoma oriC é realizada pela incubação a uma temperatura de aproximadamente 30°C por aproximadamente 30 minutos.

[0159] A reação de transferência na etapa (1) é realizada a uma temperatura ótima da transposase, que é, por exemplo, 37°C. O tempo necessário para a reação de transferência pode ser selecionado, quando apropriado, por uma pessoa versada na técnica, e pode ser, por exemplo, de aproximadamente 15 minutos. Além disso, na reação de transferência da etapa (1), tRNA pode ser adicionado. Com respeito à concentração de tRNA adicionado na reação de transferência na etapa (1), por exemplo, uma concentração de 10 a 200 ng/μΙ, 30 a 100 ng/μΙ, ou 50 ng/μΙ pode ser selecionada.

[0160] Em uma modalidade, o DNA circular compreendendo oriC na etapa (2) pode compreender ainda um par de sequências ter que é inserido externamente em relação a oriC, e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, tal como XerCD ou Cre. Neste caso, quando o DNA circular tem as sequências ter, a solução de reação na etapa (2) compreende

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51/84 ainda uma proteína possuindo a atividade de inibir a replicação por ligação com as sequências ter, e quando o DNA circular tem a sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, tal como XerCD ou Cre, a solução de reação na etapa (2) compreende ainda a enzima de separação de multímero de DNA, tal como XerCD ou Cre.

[0161] Por outro lado, em outra modalidade, um par de sequências ter que é inserido externamente em relação à oriC e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, tal como XerCD ou Cre, são preparados de modo que sejam compreendidos em uma parte do transposon oriC, de modo que um par de sequências ter e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida pela enzima de separação de multímero de DNA, tal como XerCD ou Cre, também possam ser introduzidos no DNA circular utilizando o transposon. Especificamente, nesta modalidade, o DNA linear na etapa (1) compreende ainda um par de sequências ter que é inserido externamente em relação a oriC e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, tal como XerCD ou Cre; e quando o DNA linear tem as sequências ter, a solução de reação na etapa (2) compreende ainda uma proteína possuindo a atividade de inibir a replicação por ligação à sequências ter; e quando o DNA circular tem a sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, tal como XerCD ou Cre, a solução de reação na etapa (2) compreende ainda uma proteína XerCD.

[0162] Aqui, definições e explicações com respeito a um par de sequências ter que é inserido externamente em relação a oriC e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, tal como XerCD ou Cre, e a proteína possuindo a atividade de inibir a replicação por ligação com as

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52/84 sequências ter e/ou uma enzima de separação de multímero de DNA, tal como XerCD ou Cre, são as mesmas que aquelas descritas acima referentes ao Método (A) ou Método (A').

[0163] Em uma modalidade, o Método (B) compreende ainda a etapa (4) de remoção do transposon oriC do DNA circular replicado ou amplificado no produto de reação da etapa (3).

[0164] A etapa de remover o transposon oriC pode compreender um tratamento com transposase em uma concentração de 0,1 a 30 nM, preferivelmente 1 a 20 nM e, mais preferivelmente, de 3 a 10 nM, e um tratamento de conversão do terminal de DNA para uma fita simples, usando exonuclease de DNA de fita simples dependente de DNA de fita dupla de cadeia reta, tal como Exolll. O tampão utilizado no tratamento com transposase pode ser o tampão usado na etapa (1). O tampão usado no tratamento com a exonuclease de DNA de fita simples pode ser um tampão com qualquer composição, desde que a exonuclease de DNA de fita simples possa atuar ali.

[0165] Além disso, a etapa de remoção do transposon oriC compreende ainda um tratamento usando uma enzima de restrição correspondente a um local da enzima de restrição compreendido na sequência do transposon oriC. Este tratamento é direcionado especificamente para divagem do transposon oriC. Portanto, neste caso, é selecionada uma enzima de restrição correspondente a um local da enzima de restrição, que é compreendido no transposon oriC porém não é compreendido em uma região que não a região do transposon oriC no DNA circular replicado e/ou amplificado. Para a divagem de fita dupla, que é específica à região compreendida no transposon oriC, CRISPR-Cas9 pode ser utilizado em vez da enzima de restrição. Neste caso, uma sequência específica à região compreendida no transposon oriC é designada como RNA guia.

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Cassete funcional (ácido nucleico) [0166] Em um aspecto, o presente pedido refere-se a um ácido nucleico compreendendo oriC, e um par de sequências ter que é inserido externamente em relação a oriC e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, tal como XerCD ou Cre. O ácido nucleico é preferivelmente DNA linear, e mais preferivelmente um ácido nucleico de fita dupla. O comprimento do ácido nucleico não é particularmente limitado, desde que o ácido nucleico possa ser utilizado na preparação de DNA circular. Em uma modalidade preferida, o comprimento do ácido nucleico é de 273 pb a 2,0 kb, 273 pb a 1,5 kb, ou 273 pb a 1,0 kb. O menor comprimento do ácido nucleico é de 273 pb. Uma vez que o comprimento de oriC é de 245 pb, e o comprimento de uma sequência dif, que é a sequência mais curta entre um par de sequências ter e a sequência de reconhecimento da enzima de separação de multímero de DNA, é de 28 pb, o comprimento de 273 pb é o comprimento obtido conectando diretamente as duas sequências acima entre si.

[0167] O ácido nucleico descrito acima pode ser utilizado como um cassete funcional para a preparação de DNA circular usado como molde no Método (A) do presente pedido.

[0168] Em outra modalidade, o presente pedido se refere a um ácido nucleico compreendendo oriC, e um par de sequências ter que é inserido externamente em relação a oriC e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, tal como XerCD ou Cre, e ainda, sequências de extremidade externa (OE) em ambos os seus terminais. O ácido nucleico é preferivelmente DNA linear, e é mais preferivelmente ácido nucleico de fita dupla. O comprimento do ácido nucleico não é particularmente limitado, desde que o ácido nucleico possa ser utilizado na preparação de DNA circular. Em uma modalidade preferida, o comprimento do

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54/84 ácido nucleico é de 311 pb a 2,0 kb, 311 pb a 1,5 kb, ou 311 pb a 1,0 kb. O menor comprimento do ácido nucleico é de 311 pb. O comprimento de oriC é de 245 pb, e o comprimento de uma sequência dif, que é a sequência mais curta entre um par de sequências ter e a sequência de reconhecimento da enzima de separação de multímero de DNA, é de 28 pb, e ainda, o comprimento das duas sequências OE é de 38 pb. Assim, o comprimento de 311 pb é o comprimento obtido conectando diretamente estas sequências entre si.

[0169] O ácido nucleico descrito acima pode ser utilizado como um cassete funcional que atua como um transposon oriC no Método (B) do presente pedido.

[0170] Aqui, definições e explicações com respeito a um par de sequências ter que é inserido externamente em relação a oriC e/ou a sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, tal como XerCD ou Cre, e a proteína possuindo a atividade de inibir a replicação por ligação com as sequências ter e/ou uma enzima de separação de multímero de DNA, tal como XerCD ou Cre, são as mesmas que aquelas descritas acima referentes ao Método (A) ou Método (A').

[0171] O cassete funcional descrito acima é vantajoso pelo fato de o custo de preparação de DNA circular compreendendo oriC, que é usado como molde nos Métodos (A), (A') e (B), poder ser reduzido.

Kit [0172] Em um aspecto, o presente pedido refere-se a um kit para a replicação ou amplificação de DNA circular, compreendendo uma combinação de:

um primeiro grupo enzimático, que catalisa a replicação de DNA circular, um segundo grupo enzimático, que catalisa a

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55/84 maturação de fragmentos de Okazaki e sintetiza dois DNAs circulares irmãos constituindo um catenano; e um terceiro grupo enzimático, que catalisa a separação de dois DNAs circulares irmãos;

DNA linear compreendendo oriC, e um par de sequências ter que é inserido externamente em relação a oriC e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, tal como XerCD ou Cre; e quando o DNA linear tem as sequências ter, uma proteína possuindo a atividade de inibir a replicação por ligação com as sequências ter, e/ou quando o DNA linear tem a sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, tal como XerCD ou Cre, a enzima de separação de multímero de DNA corresponde à sequência, tal como XerCD ou Cre (a seguir também referida como Kit (A) na presente descrição).

[0173] Os ingredientes e as concentrações específicos dos componentes individuais incluídos no kit (A) da presente invenção são os mesmos que aqueles descritos nas seções acima < Primeiro, segundo e terceiro grupos enzimáticos >, <Método para amplificação de DNA circular (A)> e <Método para amplificação de DNA circular (A') >.

[0174] Em outra modalidade, o presente pedido refere-se a um kit para a replicação ou amplificação de DNA circular, compreendendo uma combinação de:

um primeiro grupo enzimático, que catalisa a replicação de DNA circular, um segundo grupo enzimático, que catalisa a maturação de fragmentos de Okazaki e sintetiza dois DNAs circulares irmãos constituindo um catenano; e um terceiro grupo enzimático, que catalisa a separação de dois DNAs circulares irmãos;

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56/84 um transposon oriC, que é DNA linear compreendendo uma sequência de origem de replicação (origem de cromossomo (oriC)) que pode se ligar a uma enzima que tem atividade de DnaA, e compreendendo sequências de extremidade externa (OE) em ambos os seus terminais; e transposase (a seguir também referida como Kit (B) na presente descrição).

[0175] O Kit (B) é um kit para a realização do método (B) do presente pedido.

[0176] Em uma certa modalidade, o transposon oriC incluído no Kit (B) pode compreender ainda um par de sequências ter que é inserido externamente em relação a oriC, e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, tal como XerCD ou Cre. Neste caso, o Kit (B) pode incluir ainda uma proteína possuindo a atividade de inibir a replicação por ligação com as sequências ter, e/ou uma enzima de separação de multímero de DNA correspondente à sequência reconhecida pela enzima de separação de multímero de DNA inserida no transposon oriC.

[0177] O componente e a concentração específicos de cada componente constitucional incluído no kit (B) da presente invenção são como descritos nas seções acima < Primeiro, segundo e terceiro grupos enzimáticos >, e < Método para amplificação de DNA circular (B) >.

[0178] Os kits (A) e (B) do presente pedido podem ser um kit compreendendo todos os componentes constitucionais descritos acima. De qualquer forma, se o kit do presente pedido for um kit para fins de ser utilizado no método do presente pedido, ele pode não compreender alguns dos componentes constitucionais descritos acima. Quando o presente kit é um kit que não compreende alguns dos componentes constitucionais descritos acima, um profissional

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57/84 pode adicionar componentes necessários para o kit na amplificação, de modo a realizar os métodos de amplificação (A) e (B) do presente pedido.

[0179] Os kits (A) e (B) da presente invenção podem compreender ainda componentes constitucionais adicionais contendo um ou mais componentes selecionados de um inibidor de adsorção não específica de proteínas, um inibidor de adsorção não específica de ácido nucleico, exonuclease específica de DNA linear, helicase tipo-RecG, um sal de amônio, NAD, um agente redutor, e uma combinação de uma enzima e um substrato no sistema de regeneração de ATP. Tais componentes constitucionais adicionais podem ser incluídos como um kit simples no kit do presente pedido, ou podem ser providos como outro kit, que está na premissa de ser usado em conjunto com o kit do presente pedido.

[0180] Os kits (A) e (B) do presente pedido podem incluir uma mistura dos componentes constitucionais descritos acima, que são acondicionados como um único item. De outra forma, o kit da presente invenção pode incluir os componentes constitucionais descritos acima, que são, cada um, acondicionados separadamente, ou o kit da presente invenção pode ainda incluir vários tipos de componentes constitucionais, que são reunidos ou misturados e depois acondicionados. Além disso, os kits (A) e (B) da presente invenção podem incluir um manual de instrução incluindo instruções para a realização dos métodos (A) e (B) e para a amplificação de DNA circular do presente pedido.

EXEMPLOS [0181] A presente invenção é explicada especificamente baseada nos EXEMPLOS. Observa-se que a presente invenção não é limitada à variação fornecida nos seguintes Exemplos.

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Exemplo 1: Replicação de DNA circular associada com supressão de multímero de DNA, utilizando a sequência de terminação ter e proteína Tus

Materiais e métodos [0182] O DNA circular a ser usado como molde foi preparado como a seguir. Um fragmento de oriC foi inserido em um vetor de plasmídeo M13mp18 para produzir DNA circular de 8,0-kb. Em uma região oposta a oriC neste DNA circular de 8,0-kb, um fragmento de DNA contendo duas sequências ter (sublinhadas) de frente uma para a outra (5'-ACTTTAGTTACAACATACTTATT-Ni7RAATAAGTATGTTGTAACTAAAGT-3' (SEQ ID N^Q: 26)) foi inserida, para produzir DNA circular de 8,0-kb inserido em ter (Figura 3(a)). Este DNA circular de 8,0-kb foi usado como DNA molde, e o DNA circular de 8,0-kb mencionado acima foi usado como DNA de controle que não continha uma sequência ter.

[0183] Tus foi preparada gerando-a a partir de uma cepa de Escherichia coli expressando Tus de acordo com uma etapa compreendendo cromatografia em coluna de afinidade e cromatografia em coluna de filtração em gel.

[0184] Uma solução de reação com a composição mostrada na Tabela 1, e uma solução de reação com a composição mostrada na Tabela 1, na qual Tus foi adicionada a uma concentração final de 2 nM ou 5 nM, foram preparadas. A cada uma destas soluções de reação, DNA molde ou DNA de controle foi adicionado a uma concentração final de 0,8 ng/μΙ, e foram depois misturados entre si em gelo. Em seguida, a mistura obtida foi incubada em uma incubadora a 30°C durante uma hora por reação. O volume total para uma única reação foi ajustado a 10 microlitros. À solução de reação, [a-³²P]dATP foi adicionado, e após o término de uma reação de replicação de DNA, uma alíquota da solução de reação foi submetida à eletroforese em gel

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59/84 de agarose (0,5% 1 x TAE, 150 V, 100 minutos, 14°C). Em seguida, um produto incorporado com ³²P foi detectado com Placa de Imageação BAS, confirmando assim a geração de uma estrutura super espiralada de interesse.

Tabela 1

Tampão de Reação
Tris-HCI (pH 8,0)	20 mM
Ditiotreitol	8 mM
Glutamato de potássio	150 mM
Mg(OAc)2	10 mM
Fosfato de creatina	4 mM
ATP	1 mM
GTP, CTP, UTP	1 mM cada
dNTPs	0,1 mM cada
tRNA	50 ng/qL
NAD	0,25 mM
Sulfato de amônio	10 mM
Albumina de soro bovino (BSA)	0,5mg/ml
Creatina quinase	20 ng/qL
Grupo enzimático
SSB	400 nM
IHF	20 nM
DnaG	400 nM
DnaN	40 nM
Pollll*	5 nM
DnaB, DnaC	20 nM
DnaA	100 nM
RNaseH	10 nM
Ligase	50 nM
Poll	50 nM
GyrA, GyrB	50 nM
Topo IV	5 nM
Topo III	50 nM
RecQ	50 nM

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60/84 [0185] Na tabela, SSB indica SSB derivada de E. coli, IHF indica um complexo de IhfA e IhfB derivado de E. coli, DnaG indica DnaG derivado de E. coli, DnaN indica DnaN derivado de E. coli, PollH* indica complexo de DNA polimerase III* consistindo em um complexo de DnaX, HolA, HolB, HolC, HolD, DnaE, DnaQ, e HolE, DnaB indica DnaB derivado de E. coli, DnaG indica DnaG derivado de E. coli, DnaA indica RNaseH derivada de E. coli, ligase indica DNA ligase derivada de E. coli, Poll indica DNA polimerase I derivada de E. coli, GyrA indica GyrA derivada de E. coli, GyrB indica GyrB derivada de E. coli, Topo IV indica um complexo de ParC e ParE derivado de E. coli, Topo III indica topoisomerase III derivada de E. coli, e RecQ indica RecQ derivada de E. coli.

[0186] A SSB foi preparada por purificação de uma cepa de E. coli expressando SSB em etapas que incluem a precipitação de sulfato de amônio e cromatografia em coluna de troca iônica.

[0187] IHF foi preparada por purificação de uma cepa de E. coli coexpressando IhfA e IhfB por etapas que incluem a precipitação de sulfato de amônio e cromatografia em coluna de afinidade.

[0188] DnaG foi preparado por purificação de uma cepa de E. coli expressando DnaG por etapas que incluem a precipitação de sulfato de amônio e cromatografia em coluna de troca aniônica e cromatografia em coluna de filtração em gel.

[0189] DnaN foi preparado por purificação de uma cepa de E. coli expressando DnaN por etapas que incluem a precipitação de sulfato de amônio e cromatografia em coluna de troca aniônica.

[0190] PollH* foi preparado por purificação de uma cepa de E. coli coexpressando DnaX, HolA, HolB, HolC, HolD, DnaE, DnaQ, e HolE por etapas que incluem a precipitação de sulfato de amônio e cromatografia em coluna de afinidade e cromatografia em coluna de filtração em gel.

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61/84 [0191] DnaB e DnaC foram preparados por purificação de uma cepa de E. coii coexpressando DnaB e DnaC por etapas que incluem a precipitação de sulfato de amônio, cromatografia em coluna de afinidade e cromatografia em coluna de filtração em gel.

[0192] DnaA foi preparado por purificação de uma cepa de E. coii expressando DnaA por etapas que incluem a precipitação de sulfato de amônio, precipitação por diálise, e cromatografia em coluna de filtração em gel.

[0193] GyrA e GyrB foram preparados por purificação de uma mistura de uma cepa de E. coii expressando GyrA e uma cepa de E. coii expressando GyrB por etapas que incluem a precipitação de sulfato de amônio, cromatografia em coluna de afinidade e cromatografia em coluna de filtração em gel.

[0194] Topo IV foi preparado por purificação de uma mistura de uma cepa de E. coii expressando ParC e uma cepa de E. coii expressando ParE por etapas que incluem a precipitação de sulfato de amônio, cromatografia em coluna de afinidade e cromatografia em coluna de filtração em gel.

[0195] Topo III foi preparada por purificação e uma cepa de E. coii expressando Topo III por etapas que incluem a precipitação de sulfato de amônio e cromatografia em coluna de afinidade.

[0196] RecQ foi preparada por purificação de uma cepa de E. coii expressando RecQ por etapas que incluem a precipitação de sulfato de amônio, cromatografia em coluna de afinidade e cromatografia em coluna de filtração em gel.

[0197] Enzimas comercialmente disponíveis derivadas de E. coii foram usadas para RNaseH, Ligase e Poli (Takara Bio Inc.).

Resultados [0198] O resultado da detecção de um produto de replicação é apresentado na Figura 3.

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62/84 [0199] Pode ser confirmado que, quando o DNA circular de 8,0-kb inserido em ter foi usado como molde e Tus foi compreendida na solução de reação, o DNA circular com uma estrutura super espiralada de interesse foi replicado e amplificado, enquanto suprimindo a geração de um multímero como um subproduto. Por outro lado, quando o DNA circular de 8,0-kb não compreendendo uma sequência ter foi usado como molde e a solução de reação não compreendia Tus, observou-se a geração de DNA circular com uma estrutura super espiralada de interesse, porém ao mesmo tempo, também se observou a geração de um multímero como um subproduto.

[0200] O sistema Tus-ter é um mecanismo de finalização da replicação de um cromossomo circular. De acordo com os resultados experimentais apresentados no presente exemplo, confirmou-se que a geração de um multímero de DNA não específico pode ser suprimida pela incorporação deste sistema em uma reação de replicação ou amplificação de DNA circular.

Exemplo 2: Replicação de DNA circular associada com a supressão de multímero de DNA utilizando-se sequências de recombinação específicas do sítio dif e XerCD

Materiais e Métodos [0201] O DNA circular de 12-kb inserido em dif para ser utilizado como molde foi preparado realizando uma reação de recombinação em células de Escherichia coli, de modo que a sequência dif (SEQ ID N^Q:22) foi compreendida em uma região oposta à oriC do DNA circular (Figura 4(a)). Especificamente, usando Escherichia coli expressando um grupo de proteínas de recombinação de fago λ, realizou-se uma reação de recombinação intracelular para preparar DNA circular com um comprimento desejado, incluindo um cassete compreendendo oriC e um gene de resistência à canamicina, e uma região de 4,2 kb a montante e uma região de 6,0 kb a jusante da região dif no cromossomo de Escherichia coli.

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63/84 [0202] Como DNA de controle não compreendendo uma sequência dif, foi utilizado o DNA circular de 8,0-kb descrito no Exemplo 1.

[0203] XerCD foi preparada purificando-a a partir de uma cepa de Escherichia coli coexpressando XerC e XerD de acordo com uma etapa compreendendo a precipitação de sulfato de amônio e cromatografia em coluna de afinidade.

[0204] Uma solução de reação com a composição mostrada na Tabela 1 do Exemplo 1, e uma solução de reação com a composição mostrada na Tabela 1 na qual XerCD foi adicionada a uma concentração final de 3,5 nM, 7 nM, 14 nM, ou 35 nM, foram preparadas. A cada uma destas soluções de reação, DNA molde ou DNA de controle foi adicionado a uma concentração final de 0,8 ng/μΙ, e foram depois misturados entre si em gelo. Em seguida, a mistura obtida foi incubada em uma incubadora a 30°C durante uma hora por reação. O volume total para uma única reação foi ajustado a 10 microlitros. À solução de reação, [a-³²P]dATP foi adicionado, e após o término da reação, um subproduto foi detectado da mesma maneira que o do Exemplo 1. Em seguida, a sua estrutura foi confirmada.

Resultados [0205] O resultado da detecção de um produto de replicação é apresentado na Figura 4(b).

[0206] Pode ser confirmado que, quando um DNA circular de 12kb inserido em dif foi usado como molde e XerCD foi compreendida na solução de reação, o DNA circular com uma estrutura super espiralada de interesse foi replicado e amplificado, enquanto suprimindo a geração de um multímero como um subproduto. Por outro lado, quando o DNA circular de 8,0-kb não compreendendo uma sequência dif foi usado como molde e a solução de reação não compreendia XerCD, observou-se a geração de DNA circular com uma estrutura

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64/84 super espiralada de interesse, porém ao mesmo tempo, também se observou a geração de um multímero como um subproduto.

[0207] O sistema XerCD-dif é um mecanismo de condução de separação de um multímero de DNA. De acordo com os resultados experimentais apresentados no presente exemplo, confirmou-se que a geração de um multímero de DNA não específico pode ser suprimida pela incorporação deste sistema em uma reação de replicação ou amplificação de DNA circular.

Exemplo 3: Influência da posição da sequência ter ou da sequência dif em DNA circular [0208] Nos exemplos 1 e 2, o DNA molde foi preparado de modo que a sequência ter ou a sequência dif fosse posicionada em uma região oposta a oriC no DNA circular. No Exemplo 3, uma reação de replicação ou amplificação foi realizada no DNA circular, no qual a sequência ter ou a sequência dif foi disposta em uma posição próxima ou adjacente a oriC.

Materiais e Métodos [0209] De modo a construir DNA circular de 15-kb, usando o genoma de Escherichia coli como molde, um fragmento de DNA de 15kb não contendo oriC foi amplificado e preparado.

[0210] Como DNA circular, no qual as sequências ter estavam dispostas próximas a oriC, preparou-se DNA circular ori-ter de 15 kb como a seguir. Um cassete ori-ter foi conectado com o fragmento de DNA de 15-kb descrito acima, seguido por circularização, para produzir o DNA circular ori-ter (Figura 5). A sequência de cassete oriter (0,38 kb) foi como a seguir, e as sequências ter voltadas para fora (partes sublinhadas) estavam presentes em ambos os terminais do cassete oriC (letras minúsculas).

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65/84 cassete ori-ter:

5'AGTATGTTGTAACTAAAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTA T acagatcgtgcgatctactgtggataactctgtcaggaagcttggatcaaccggtagttatccaaa gaacaactgttgttcagtttttgagttgtgtataacccctcattctgatcccagcttatacggtccagga tcaccg atcattcacag tt aatg atcctttccag g ttg tt g atcttaaaag ccg g atcctt g ttatccac ag g g cag tg cg atcctaataag ag atcacaatag aacag atctctaaataaatag atcttcttttta atacccaqqatccATTTAACATAATATACATTATGCGCACCTTTAGTTAC AACATACT-3' (SEQ ID N^Q: 27) [0211] Como DNA circular, no qual a sequência dif estava disposta próxima a oriC, preparou-se DNA circular ori-dif de 15 kb como a seguir. Um cassete ori-dif foi conectado com o fragmento de DNA de 15-kb descrito acima, seguido por circularização, para produzir o DNA circular ori-dif (Figura 5). A sequência de cassete ori-dif (0,32 kb) foi como a seguir, e a sequência dif (parte sublinhada) estava presente adjacente ao lado a montante do cassete oriC (letras minúsculas).

cassete ori-dif:

5'ATTT AACAT AAT AT ACATT AT G CG CACC AAGT AT acagatcgtgcgatctact gtgg ataactctgtcaggaagcttggatcaaccggtagttatccaaagaacaactgttgttcagtttttgagt tg tg tataacccctcattctg atcccag cttatacg g tccag g atcaccg atcattcacag ttaatg at cctttccag gttgttgatcttaaaagccggatccttgttatccacagggcagtgcgatcctaataaga gatcacaatagaacagatctctaaataaatagatcttctttttaatacccaggatcc-3' (SEQ ID N^Q: 28) [0212] De modo a estudar a supressão da geração de um multímero de DNA que era dependente de ter e Tus, adicionou-se Tus a uma solução de reação com a composição mostrada na Tabela 2 abaixo a uma concentração final de 0, 2, 6, 20 ou 60 nM e, em seguida, foi adicionado DNA circular à mistura de reação a uma

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66/84 concentração final de 0,5 ng/μΙ, 5 pg/μΙ, 50 fg/μΙ, ou 0,5 fg/μΙ. A mistura assim obtida reagiu a 30°C durante 3 horas ou 17 horas.

[0213] De modo a estudar a supressão da geração de um multímero de DNA por XerCD, adicionou-se XerCD a uma solução de reação com a composição mostrada na Tabela 2 abaixo a uma concentração final de 0, 30, ou 60 nM e, em seguida, adicionou-se DNA circular à mistura de reação a uma concentração final de 0,5 ng/μΙ. A mistura assim obtida reagiu a 30°C por duas horas.

[0214] O produto de reação foi submetido à eletroforese em gel de agarose (0,5% 1 χ TBE, 60 V, 60 minutos), e foi depois tingido com SybrGreen I (Takara Bio Inc.), de modo que o DNA foi detectado.

Tabela 2

Tampão de Reação
Tris-HCI (pH 8,0)	20 mM
Ditiotreitol	8 mM
Acetato de potássio	150 mM
Mg(OAc)2	10 mM
Fosfato de creatina	4 mM
ATP	1 mM
GTP, CTP, UTP	1 mM cada
dNTPs	0,1 mM cada
tRNA	50 ng/μΕ
NAD	0,25 mM
Sulfato de amônio	10 mM
Albumina de soro bovino (BSA)	0,5 mg/ml
Creatina quinase	20 ng/μΕ

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Grupo enzimático
SSB	400 nM
IHF	20 nM
DnaG	400 nM
DnaN	40 nM
Pollll*	5 nM
DnaB, DnaC	20 nM
DnaA	100 nM
RNaseH	10 nM
Ligase	50 nM
Poll	50 nM
GyrA, GyrB	50 nM
Topo IV	5 nM
Topo III	50 nM
RecQ	50 nM

[0215] As enzimas individuais apresentadas na tabela são as mesmas que as descritas no Exemplo 1, e estas enzimas foram preparadas ou adquiridas pelos métodos descritos no Exemplo 1. Resultado 1 Supressão da geração de multímero de DNA que depende de ter e Tus (1) Titulação Tus [0216] O resultado da detecção de um produto de replicação/amplificação é mostrado na Figura 6. A quantidade de DNA molde foi de 0,5 ng/μΙ, Tus foi usada na quantidade conforme mostrado na Figura 6, e a reação foi realizada a 30°C durante 3 horas. [0217] Quando o DNA circular ori-ter de 15 kb foi utilizado como molde e Tus foi compreendido na solução de reação, pode ser confirmado que o DNA circular com uma estrutura super espiralada de

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68/84 interesse era replicado ou amplificado, enquanto suprimindo a geração de um multímero como um subproduto. Além disso, à medida que a concentração de Tus na solução de reação foi aumentada, o efeito de suprimir a geração de um multímero foi aumentado. Especificamente, quando Tus estava presente em uma concentração de 20 nM ou 60 nM, a geração de um multímero foi reduzida a um nível no qual a sua geração dificilmente pode ser confirmada.

[0218] Por outro lado, quando o DNA circular ori-dif de 15 kb foi usado como molde e Tus estava compreendida na solução de reação, o efeito de suprimir a geração de um multímero não foi observado. Este resultado mostra que o sistema Tus-ter contribui para o efeito de supressão da geração de um multímero.

[0219] Além disso, o resultado mencionado acima mostra que, mesmo no caso em que as sequências ter estão dispostas em posições próximas ou adjacentes a oriC no DNA circular usado como molde, obtém-se o efeito de suprimir a geração de um multímero. Isto é, as posições das sequências inseridas no DNA circular não influenciam o efeito de suprimir a geração de um multímero.

(2) Titulação de DNA [0220] O resultado da detecção de um produto de replicação/amplificação é mostrado na Figura 7. O DNA molde e Tus foram usados em cada quantidade, como mostrado na Figura 7, e a reação foi realizada a 30°C durante 17 horas.

[0221] Quando o DNA circular ori-ter de 15 kb foi usado como molde e Tus foi compreendida na solução de reação, pode ser confirmado que o DNA circular com uma estrutura super espiralada de interesse foi replicado ou amplificado, enquanto suprimindo a geração de um multímero como um subproduto. Em particular, confirmou-se que, mesmo embora a quantidade de DNA molde fosse reduzida a 0,5 fg/μΙ, este efeito pode ser observado.

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Resultado 2 Supressão da geração de multímero de DNA por XerCD [0222] O resultado da detecção de um produto de replicação/amplificação é mostrado na Figura 8. A quantidade de DNA molde foi de 0,5 ng/μΙ, XerCD foi utilizada na quantidade como mostrado na Figura 8, e a reação foi realizada a 30°C durante duas horas.

[0223] Quando o DNA circular ori-dif de 15 kb foi usado como molde e XerCD foi compreendida na solução de reação, pode-se confirmar que o DNA circular com uma estrutura super espiralada de interesse foi replicado ou amplificado, enquanto suprimindo a geração de um multímero como um subproduto. Além disso, à medida em que a concentração de XerCD na solução de reação foi aumentada, o efeito de suprimir a geração de um multímero foi aumentado.

[0224] Além disso, o resultado mencionado acima mostra que, mesmo no caso em que a sequência dif está disposta em uma posição próxima ou adjacente a oriC no DNA circular usado como molde, obtém-se o efeito de suprimir a geração de um multímero. Isto é, a posição da sequência dif inserida no DNA circular não influencia o efeito de suprimir a geração de um multímero.

[0225] A partir dos resultados 1 e 2 mencionados acima, constatou-se que mesmo no caso em que as sequências ter e a sequência dif estavam dispostas próximas ou adjacentes a oriC, as sequências funcionaram eficazmente e suprimiram a geração de um multímero de DNA. As sequências ter e a sequência dif que podem estar dispostas próximas a oriC, significa que, estas sequências, juntamente com oriC, podem ser utilizadas como um cassete funcional na construção de DNA circular.

Exemplo 4: Introdução de cassete oriC utilizando transposon (1) [0226] A fim de replicar ou amplificar DNA circular de acordo com o método do presente pedido, oriC precisa ser introduzido no DNA

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70/84 circular usado como molde. No exemplo 4, foi estudada a introdução de um cassete oriC utilizando um transposon (Figura 2).

Materiais e Métodos [0227] Como uma transposase (Tnp), foi usado um mutante Tn5 altamente ativo (E54K, L372P). Esta proteína foi preparada purificando-a a partir de uma cepa de Escherichia coli expressando-a de acordo com uma etapa compreendendo a precipitação de sulfato de amônio e cromatografia em coluna de afinidade.

[0228] Como um transposon oriC, um fragmento de DNA consistindo na seguinte sequência, na qual as sequências de extremidade externa (OE) (partes sublinhadas) estão presentes em ambos os terminais de uma sequência compreendendo oriC, que foi então 5'-fosforilada, foi utilizado.

transposon oriC:

5'CT GT CT CTT AT ACACAT CT q aag atccg g cag aag aatg g ctg g g atcg tg g gttaa ttt actcaaataagtatacagatcgtgcgatctactgtggataactctgtcaggaagcttggatcaacc ggtagttatccaaagaacaactgttgttcagtttttgagttgtgtataacccctcattctgatcccagctt atacggtccaggatcaccgatcattcacagttaatg atcctttccag g ttg ttg atcttaaaag ccg g atccttgttatccacagggcagtgcgatcctaataagagatcacaatagaacagatctctaaataa atag atcttctttttaatacccag gatcccagg tctttctcaag ccqacAG AT GT GT AT AAG A GACAG-3' (SEQ ID N^Q: 29) [0229] A reação de transferência de oriC foi realizada incubandose 116 nM de Tnp e 48 nM de transposon oriC em um tampão (ácido Tris-acético 10 mM [pH 7,5], 15 % de glicerol, glutamato de potássio 50 mM, DTT 1 mM, e EDTA 0,1 mM) a 30°C por 30 minutos, obtendo assim um transposoma oriC. O transposoma oriC (0,5 μΙ) e o DNA alvo (10 fM) foram incubados em um tampão (5 μΙ; Tris-HCI 10 mM [pH 7,5], glutamato de potássio 150 mM e Mg(oAc)2 10 mM) a 37°C por 15

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71/84 minutos, para realizar uma reação de transferência. Como tal DNA alvo, foi utilizado um plasmídeo de expressão do gene de Escherichia coli de 15-kb (plasmídeo pTT8), ou um plasmídeo de 9,3-kb extraído de uma cepa de Thermus thermophilus HB8 altamente termófila. Em seguida, um tratamento de inativação térmica foi realizado a 70°C por 5 minutos.

[0230] Uma alíquota (0,5 μΙ) da mistura de reação obtida a partir da reação de transferência de oriC, descrita acima, foi adicionada à solução de reação com a composição mostrada na Tabela 2 do Exemplo 3, e a mistura assim obtida foi depois reagida a 30°C por 3 horas. O produto de reação foi submetido à eletroforese em gel de agarose (0,5% 1 χ TBE, 60 V, 60 minutos), e foi em seguida tingido com SybrGreen (Takara Bio Inc.), de modo que o DNA fosse detectado.

Resultados [0231] O resultado obtido no caso da utilização do plasmídeo de expressão do gene de Escherichia coli de 15-kb como DNA alvo é mostrado na Figura 9, e o resultado obtido no caso da utilização do plasmídeo de 9,3-kb (plasmídeo pTT8) extraído de uma cepa de Thermus thermophilus HB8 altamente termófila como DNA alvo é mostrado na Figura 10.

[0232] Quando uma alíquota da mistura de reação obtida a partir da reação de transferência de oriC, na qual Tnp estava presente, foi utilizada no método para a replicação ou amplificação de DNA circular, foi encontrado um super espiral, que era um produto de replicação/produto de amplificação. Por outro lado, quando Tnp não estava presente na reação de transferência de oriC, um tal produto de replicação/produto de amplificação não foi encontrado, mesmo após o método para a replicação ou amplificação de DNA circular ter sido realizado.

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72/84 [0233] Além disso, o resultado mencionado acima mostra que oriC pode ser eficazmente introduzido no DNA alvo, em particular, em uma concentração extremamente baixa, que foi de 10 fM (0,1 pg/μΙ), e que o DNA alvo pode ser amplificado de acordo com o método para a replicação ou amplificação de DNA circular do presente pedido. Este resultado mostra que a introdução de oriC no DNA alvo pode ser facilmente obtida com alta eficiência utilizando um transposon para um cassete oriC, e que o assim obtido DNA circular compreendendo oriC pode ser também eficazmente amplificado de acordo com o método para a replicação ou amplificação de DNA circular do presente pedido. Exemplo 5: Introdução de cassete oriC utilizando transposon (2) [0234] Foram utilizados os mesmos transposase (Tnp) e transposon oriC que no Exemplo 4.

[0235] A reação de transferência de oriC foi realizada incubandose 116 nM de Tnp e 144 nM de transposon oriC em um tampão (ácido Tris-acético 10 mM [pH 7,5], 15% de glicerol, glutamato de potássio 50 mM, DTT 1 mM, e EDTA 0,1 mM) a 30°C por 30 minutos, obtendo assim um transposoma oriC. O transposoma oriC (0,5 μΙ) e o DNA alvo (1pM (50 pg (3 χ 10⁶ moléculas)/5 μΙ) e tRNA (50 ng/μΕ) foram incubados em um tampão (5 μΙ; Tris-HCI 10 mM [pH 7,5], glutamato de potássio 150 mM e Mg(oAc)2 10 mM) a 37°C por 15 minutos, para realizar uma reação de transferência. Como tal DNA alvo, foi utilizado um plasmídeo de expressão do gene de Escherichia coli de 15-kb. Em seguida, um tratamento de inativação térmica foi realizado a 70°C por 5 minutos.

[0236] Uma alíquota (0,5 μΙ) da mistura de reação obtida a partir da reação de transferência de oriC descrita acima foi adicionada a 5 μΙ da solução de reação com a composição mostrada na Tabela 2 do Exemplo 3, e a mistura assim obtida foi depois reagida a 30°C por 4 horas. O produto de reação foi submetido à eletroforese em gel de

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73/84 agarose (0,5% 1 x TBE, 60 V, 55 minutos), e foi depois tingido com SybrGreen I (Takara Bio Inc.), de modo que o DNA fosse detectado. O resultado é mostrado na Figura 11. Como no Exemplo 4, quando uma alíquota da mistura de reação obtida a partir da reação de transferência de oriC, na qual Tnp estava presente, foi utilizada na reação de replicação ou amplificação de DNA circular, foi encontrado um super espiral, que era um produto de replicação/produto de amplificação. Por outro lado, quando Tnp não estava presente na reação de transferência de oriC, um tal produto de replicação/produto de amplificação não foi encontrado, mesmo após a reação de replicação ou amplificação de DNA circular ter sido realizada.

[0237] Além disso, a quantidade de aditivo do DNA alvo na reação de transferência de oriC foi alterada para 1 pM (50 pg (3 x 10⁶moléculas)/5 μΙ), 0,1 pM (5 pg (3 x 10⁵ moléculas)/5 μΙ), 10 fM (500 fg (3 x 10⁴ moléculas)/5 μΙ), e 1 fM (50 fg (3 x 10³ moléculas)/5 μΙ), e foi realizada a mesma reação que a descrita acima. O resultado é apresentado na Figura 12. O resultado mostra que oriC pode ser suficientemente introduzido no DNA alvo em uma concentração extremamente baixa, que foi de 1 fM (50 fg (3000 molecules)/5 μΙ), e que o DNA alvo pode ser amplificado de acordo com o método de replicação ou amplificação de DNA circular do presente pedido.

Exemplo 6: Amplificação de plasmídeo termófilo por transferência de transposon oriC [0238] A reação de transferência de oriC e a reação de replicação ou amplificação de DNA circular foram realizadas da mesma forma que no Exemplo 5, com a exceção que, um plasmídeo de 9,3-kb (pTT8) extraído de uma cepa de Thermus thermophilus HB8 altamente termófila foi utilizado em uma quantidade de 50 fg como DNA alvo na reação de transferência de oriC. O resultado é mostrado na Figura 13. [0239] Quando o plasmídeo pTT8 é digerido com Kpn I e Nhe I, são

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74/84 gerados fragmentos de 5,3 kb, 1,7 kb, 1,3 kb e 1,0 kb, como mostrado no mapa de plasmídeos da Figura 14. O produto de replicação/produto de amplificação obtido pela reação descrita acima foi digerido com as enzimas de restrição Kpn I e Nhe I. O resultado é mostrado na Figura

14. Quando o produto de replicação/produto de amplificação obtido pela reação descrita acima foi digerido com Kpn I e Nhe I, a geração de fragmentos de 5,3 kb, 1,7 kb, 1,3 kb, e 1,0 kb foi confirmada, como no caso do plasmídeo pTT8. Este resultado mostra que o produto de replicação/produto de amplificação obtido pela reação descrita acima é DNA circular, que foi obtido realizando a transferência de transposon oriC no plasmídeo pTT8, e depois replicando e/ou amplificando a resultante.

[0240] Estes resultados mostram que, mesmo no caso do uso de um plasmídeo de 9,3-kb com uma alta porcentagem de conteúdo GC (porcentagem de conteúdo GC: aproximadamente 70%), que foi derivada de células heterólogas, oriC pode ser eficazmente introduzido no DNA alvo em uma concentração extremamente baixa, como no Exemplo 5, e o DNA alvo pode ser amplificado de acordo com o método para a replicação ou amplificação de DNA circular do presente pedido.

Exemplo 7: Amplificação de λΡΝΑ por transferência de transposon oriC [0241] ÀDNA é DNA linear derivado de bacteriófago. Este DNA foi circularizado e oriC foi depois introduzido ali por transferência de transposon oriC, preparando assim o DNA circular. Em seguida, o método para a replicação ou amplificação de DNA circular do presente pedido foi realizado em DNA circular.

(1) Anelamento e reação de reparo de lacuna [0242] Uma reação de anelamento foi realizada como a seguir: 160 ng/μΙ de ÀDNA (48 kb/Toyobo Co., Ltd.) foram adicionados em um

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75/84 tampão (Tris-HCI 10 mM (pH 7,5), NaCI 50 mM, e EDTA 1mM), para obter 5 μΙ de solução. Esta solução foi incubada a 65°C por 5 minutos e, em seguida, foi resfriada a 4°C a uma taxa decrescente de temperatura de -0,5°C/30 s, e os sítios de COS em ambos os terminais do ÀDNA foram conectados entre si para circularização.

[0243] Uma reação de reparo de lacuna foi realizada como a seguir. Após o término da reação de anelamento, 0,5 μΙ de solução obtida foram adicionados a uma solução de reação compreendendo 50 nM de ligase, 50 nM de Pol I, 20 mU/μΙ Exo III, 5 nM de Gyrase, e 0,1 mg/ml de BSA (em que, como um tampão de reação, foi utilizado o tampão de reação com a composição mostrada na Tabela 2 (isto é, o tampão de reação não compreendendo o grupo enzimático mostrado na Tabela 2)), e a mistura assim obtida foi em seguida reagida a 30°C durante 16 horas.

[0244] O produto de reação obtido como resultado da reação de reparo de lacuna foi submetido à eletroforese em gel de agarose (0,5% 1 x TBE, 60 V, 55 minutos), e foi tingido com SybrGreen I (Takara Bio Inc.), de modo que o DNA fosse detectado. O resultado é mostrado na Figura 15. No produto de reação obtido como resultado da reação de reparo de lacuna, observou-se uma banda de um super enrolamento mostrando a presença de DNA circularizado sem intervalos.

(2) Transferência de transposon oriCe amplificação de λΡΝΑ [0245] O produto de reação (1 μΙ) obtido como resultado da reação de reparo de lacuna foi usado como uma solução compreendendo DNA alvo, a reação de transferência de oriC e a reação de replicação ou amplificação de DNA circular foram realizadas da mesma maneira que no Exemplo 5. Aqui, para a reação de replicação ou amplificação de DNA circular, utilizou-se a solução de reação com a composição mostrada na Tabela 2 do Exemplo 3, na qual se adicionaram mais 60 nM de RecG e 0,5 U/μΙ de RecJf (NEB). RecG foi preparada gerando-a

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76/84 a partir de uma cepa de Escherichia coli expressando RecG de acordo com uma etapa compreendendo precipitação de sulfato de amônio e cromatografia em coluna de afinidade. O resultado é mostrado na Figura 16.

[0246] Quando o ÀDNA é digerido com a enzima de restrição Hindlll, são gerados fragmentos de 27 kb, 9,4 kb, 6,6 kb, 2,3 kb e 2,0 kb. O produto de replicação/produto de amplificação obtido pela reação descrita acima foi digerido com a enzima de restrição Hindlll (37°C, 3 horas). O resultado é mostrado na Figura 17. Quando o produto de replicação/produto de amplificação obtido pela reação descrita acima foi digerido com Hindlll, confirmaram-se os fragmentos de 7 kb, 9,4 kb, 6,6 kb, 2,3 kb e 2,0 kb, como no caso do ÀDNA. Este resultado mostra que o produto de replicação/produto de amplificação obtido pela reação descrita acima é DNA circular, que foi obtido realizando transferência de transposon oriC em ÀDNA circularizado e, em seguida, replicando e/ou amplificando o ÀDNA resultante.

[0247] Estes resultados mostram que, mesmo no caso de DNA linear, a reação de replicação ou amplificação de DNA circular do presente pedido pode ser utilizada realizando-se uma reação de transferência de oriC após circularização do DNA linear.

Exemplo 8: Remoção de transposon or/C (1) [0248] Foi estudada a possibilidade de remoção do oriC introduzido no DNA circular de acordo com uma reação de transferência de oriC.

(1) DNA circular [0249] O transposon oriC do Exemplo 5 compreende um gene de resistência à canamicina (Km) e oriC. Por outro lado, um plasmídeo de expressão do gene de Escherichia colide 15-kb compreende um gene de resistência à ampicilina (Amp). O DNA circular (referido como p15k::Km-o/7C), no qual um transposon oriC foi transferido para uma

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77/84 região que codifica o gene de resistência à ampicilina de um plasmideo de expressão do gene de Escherichia coli de 15-kb, entre os plasmídeos obtidos pela reação de transferência de oriC do Exemplo 5, foi selecionado e recuperado. Especificamente, os plasmídeos obtidos pela reação de transferência de oriC do Exemplo 5 foram transformados em Escherichia coli, e os transformantes, que se tornaram sensíveis a Amp e resistentes a Km, foram clonados por triagem.

(2) Dissociação de transposon oriC [0250] A região correspondente ao transposon oriC transferido pela reação de transferência de oriC é dissociada usando transposase. Além disso, as regiões de 9-pb são formadas duplicadamente em ambos os terminais do transposon oriC, quando o transposon oriC é transferido pela reação de transferência de oriC. Assim, na remoção do transposon oriC, é necessário tratar estar regiões de 9-pb após a finalização da conexão, de modo que as regiões não possam estar presentes duplamente. O terminal do DNA compreendendo a região de 9-pb, que foi gerada pela extração de transposon oriC, foi convertido em um terminal de fita simples utilizando Exolll, que era uma exonuclease de DNA de fita simples dependente de DNA de fita dupla de cadeia linear. A seguir, utilizando a porção duplicada das regiões de 9-pb, as fitas simples foram aneladas entre si e foram circularizadas. A Figura 18 mostra uma vista esquemática das mesmas.

[0251] Especificamente, foi realizada a seguinte reação.

[0252] A reação de dissociação de transposon oriC foi realizada incubando-se 0 a 30 nM (0 nM, 3 nM, 10 nM e 30 nM) de transposase e 2 ng/μΙ de p15k::Km-o/7C em um tampão (5 μΙ; Tris-HCI 10 mM [pH 7,5], glutamato de potássio 150 mM e Mg(oAc)2 10 mM) a 37°C por 16 horas. Em seguida, um tratamento de inativação térmica foi realizado a 70°C por 5 minutos.

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78/84 [0253] Foram adicionados tampão Takara Exolll (Tris-HCI 50 mM (pH 8,0), MgCI₂ 5 mM, e DTT 1 mM) e Exolll 20 mU/μΙ (Takara) a 1 μΙ do produto de reação de dissociação de transposon oriC, resultando em um volume final de 5 μΙ. Esta mistura reagiu a 30°C por 10 minutos, de modo que fosse tratada com Exolll.

[0254] O produto de reação tratado com Exolll foi incubado a 65°C por 5 minutos e, em seguida, resfriado a 4°C a uma taxa decrescente de temperatura de -0,5°C/30 s, para realizar anelamento.

(2) Confirmação da dissociação de transposon oriC por transformação [0255] Escherichia coii foi transformada usando 2 μΙ de amostra obtidos nas células acima (2) e químicas competentes (Escherichia coii DH5a) 50. As células transformadas foram semeadas em uma placa incluindo 100 pg/ml de ampicilina, 25 μΙ/ml de canamicina, e foram então incubadas a 37°C durante a noite.

[0256] A formação de colônias quando a transposase não foi adicionada em (2) acima (0 nM) foi estabelecida em 100, e a unidade relativa de formação de colônias (%) quando a concentração de transposase foi alterada foi então calculada.

(4) Resultados [0257] Os resultados são apresentados na Figura 19 e Figura 20 [0258] A partir do resultado apresentado na Figura 19, torna-se evidente que as células transformadas com resistência à canamicina foram reduzidas dependendo da concentração da transposase adicionada. Quando 30 nM de transposase foram adicionados, quase não estavam presentes células transformadas com resistência à canamicina. Este resultado mostra que o transposon oriC pode ser dissociado pela adição de transposase.

[0259] Além disso, a partir do resultado apresentado na Figura 20,

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79/84 torna-se evidente que o gene da ampicilina uma vez destruído podería ser retornado pela inserção de transposon oriC, dependendo do tratamento com Exolll.

Exemplo 9: Remoção de transposon oriC (2) [0260] A remoção de transposon oriC através da realização de um tratamento usando uma enzima de restrição correspondente ao sítio da enzima de restrição compreendido na sequência de transposon oriC, em paralelo com a realização de um tratamento com Exolll, foi estudada. A Figura 21 mostra uma sua vista esquemática.

(1) DNA circular [0261] Foi utilizado o mesmo DNA circular que aquele do Exemplo

8.

(2) Dissociação de transposon oriC [0262] A reação de dissociação de transposon oriC foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 8, com a exceção do uso de 10 nM de transposase.

[0263] Foram adicionados tampão Takara Exolll (Tris-HCI 50 mM (pH 8,0), MgCI₂ 5 mM, e DTT 1 mM) e Exolll 20 mU/μΙ (Takara) sozinho, ou Exolll 20 mU/μΙ (Takara) e Nhel 0,6 U/μΙ (NEB), foram adicionados a 1 μΙ do produto de reação de dissociação de transposon oriC, de modo a resultar em um volume final de 5 μΙ. Esta mistura reagiu a 30°C por 10 minutos, de modo a realizar um tratamento com Exolll.

[0264] O produto de reação tratado com Exolll e Nhel foi incubado a 65°C por 5 minutos, e foi então resfriado a 4°C a uma taxa decrescente de temperatura de -0,5°C/30 s, para realizar anelamento.

(3) Confirmação da dissociação de transposon oriC por transformação [0265] A transformação foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 8. Em seguida, a unidade de formação de colônia foi calculada.

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80/84 (4) Resultado [0266] O resultado é apresentado na Tabela 3

Tabela 3

	Unidade de formação de colônia
	Resistência à Amp	Resistência à Km
Exolll + / Nhel -	155	75
Exolll + / Nhel +	157	20

[0267] Este resultado mostra que o problema de um plasmídeo contendo transposons que não foram dissociados a partir de DNA circular mesmo usando transposase permanece como um segundo plano, e pode ser reduzido por divagem do sítio de DNA transposon com a enzima de restrição (Nhel).

Exemplo 10: Supressão da geração de multímero de DNA por Cre Materiais e Métodos [0268] Utilizando pUC19 (Takara Bio Inc.) como molde, PCR foi realizada com os iniciadores SUE1156: 5'CTATGCGGCATCAGAGCAG-3' (SEQ ID N^Q: 38) e SUE1361: 5'GTTAAGCCAGCCCCGACAC-3' (SEQ ID N^Q: 39), de modo a preparar um fragmento de DNA pUC de 2,6 kb.

[0269] Como um DNA circular no qual uma sequência loxP foi disposta em uma posição próxima ao oriC, o DNA circular pUC19OLDT foi preparado como a seguir. Um fragmento de DNA pUC foi conectado com um cassete OLDT para circularização, produzindo desse modo o DNA circular pUC19-OLDT. A sequência de cassete OLDT (0,41 kb) é como a seguir, e o cassete OLDT tem uma sequência loxP (parte sublinhada) adjacente ao lado a montante do cassete oriC (parte com letras minúsculas).

cassete OLDT:

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5'-CGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACAG TATGTTGTAACTAAAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGT TATACAGATCGTGCgatctactgtggataactctgtcaggaagcttggatcaaccggtag ttatccaaagaacaactgttgttcagtttttgagttgtgtataacccctcattctgatcccagcttatacg gtccaggatcaccgatcattcacagttaatg atcctttccag g ttg ttg atcttaaaag ccg g atcctt g ttatccacag g g cag tg eg atcctaataag ag atcacaatag aacag atetetaaataaatag a tcttctttttaatacCCAGGATCCATTTAACATAATATACATTATGCGCACCT TTAGTTACAACATACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGA

GTGCACCAT-3' (SEQ ID N^Q: 40) [0270] Como um DNA circular de controle que não tem uma tal sequência ΙοχΡ, o DNA circular pUC-o/7C300 foi preparado como a seguir. Um fragmento de DNA pUC foi conectado com um cassete oriC300 para circularização, produzindo desse modo o DNA circular pUC-o/7C300. A sequência de cassete oriC300 (0,41 kb) é como a seguir, e o cassete oriC300 tem um cassete oriC (parte em letras minúsculas).

cassete O/7C300:

5'-CGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACAG T AT GTT GT AACT AAAgatctactgtggataactctgtcaggaagcttggatcaaccggta gttatccaaagaacaactgttgttcagtttttgagttgtgtataacccctcattctgatcccagcttatac ggtccaggatcaccgatcattcacagttaatg atcctttccag g ttg ttg atcttaaaag ccg g atcct tg ttatccacag g g cag tg cg atcctaataag ag atcacaatag aacag atetetaaataaatag atcttctttttaatacTTT AGTT ACAACAT ACT ATGCGGCAT CAG AG CAG ATT GTACTGAGAGTGCACCAT-3' (SEQ ID N^Q: 41) [0271] Cre foi adquirida de NEB e foi utilizada.

[0272] Uma solução de reação com a composição mostrada na Tabela 2 do Exemplo 3, e uma solução de reação com a composição mostrada na Tabela 2 do Exemplo 3 na qual Cre foi adicionada a uma concentração final de 1 mU/μΙ, 3 mU/μΙ, 10 mU/μΙ ou 30 mU/μΙ, foram preparadas. A cada uma destas soluções de reação, DNA circular

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82/84 pUC19-0LDT ou DNA circular pUC-o/7C300 foi adicionado a uma concentração final de 0,01 ng/μΙ, e foram depois misturadas entre si em gelo. Em seguida, a mistura obtida foi incubada em uma incubadora a 33°C por 3 horas por reação.

[0273] O produto de reação foi submetido à eletroforese em gel de agarose (0,5% χ TBE, 60 V, 60 minutos), e foi depois corado com SybrGreen I (Takara Bio Inc.), de modo que fosse detectado DNA. Resultados [0274] O resultado da detecção de um produto de replicação/amplificação é apresentado na Figura 22.

[0275] Pode ser confirmado que, quando o DNA circular pUC19OLDT, no qual uma sequência loxP foi disposta próxima ao oriC, foi utilizado como molde e Cre foi compreendida na solução de reação, o DNA circular tendo uma estrutura super espiralada de interesse foi replicado ou amplificado, enquanto suprimindo a geração de um multímero como um subproduto. Neste momento, a aparência de um produto intermediário durante a separação de um multímero de um monômero também foi constatada. Além disso, aumentando a concentração de Cre na solução de reação, o efeito de supressão da geração de um multímero foi aumentado.

[0276] Quando o DNA circular pUC19-o/7C300 não possuindo uma sequência loxP foi utilizado como molde, os efeitos de Cre não foram observados.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL [0277] De acordo com a presente invenção, pode ser provido um método capaz de simples e eficazmente replicar e amplificar DNA circular e, particularmente, DNA circular de cadeia longa.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS DE TEXTO LIVRE

SEQ ID N^Q: 1: sequência ter (consenso) SEQ ID N^Q: 2: sequência ter (consenso)

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SEQ ID N²: 3: sequência ter (terA, B, D, E, ou H)

SEQ ID N²: 4: sequência ter (terA, B, D, E, ou H)

SEQ ID N²: 5: sequência ter (terC)

SEQ ID N²: 6: sequência ter (terF)

SEQ ID N²: 7: sequência ter (terG)

SEQ ID N²: 8: sequência ter (terl)

SEQ ID N²: 9: sequência ter (tarJ)

SEQ ID N²: 10: sequência ter (Bacillus, consenso)

SEQ ID N²: 11: sequência ter (Bacillus subtilis, consenso)

SEQ ID N²: 12: sequência ter (Bacillus subtilis, consenso)

SEQ ID N²: 13: sequência ter (terVII)

SEQ ID N²: 14: sequência ter (terIX)

SEQ ID N²: 15: sequência reconhecida por XerCD (consenso)

SEQ ID N²: 16: sequência reconhecida por XerCD (consenso, dif e cer) SEQ ID N²: 17: sequência reconhecida por XerCD (consenso, dif e psi) SEQ ID N²: 18: sequência reconhecida por XerCD (consenso, cer, e psi)

SEQ ID N²: 19: sequência dif

SEQ ID N²: 20: sequência cer

SEQ ID N²: 21: sequência psi

SEQ ID N²: 22: sequência dif

SEQ ID N²: 23: sequência cer

SEQ ID N²: 24: sequência psi

SEQ ID N²: 25: Sequência de extremidade externa (OE)

SEQ ID N²: 26: fragmento de DNA compreendendo um par de sequências ter

SEQ ID N²: 27: cassete ori-ter

SEQ ID N²: 28: cassete ori-dif

SEQ ID N²: 29: transposon oriC

SEQ ID N²: 30: consenso loxP

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84/84

SEQ ID N^Q: 31

SEQ ID N^Q: 32

SEQ ID N^Q: 33

SEQ ID N^Q: 34

SEQ ID N^Q: 35

SEQ ID N^Q: 36

SEQ ID N^Q: 37

SEQ ID N^Q: 38

SEQ ID N^Q: 39

SEQ ID N^Q: 40

SEQ ID N^Q: 41 sequência Iox511 sequência Iox2272 sequência loxFAS sequência lox RE sequência lox LE sequência FRT sequência rox iniciador SUE1156 iniciador SUE1361 cassete OLDT cassete 0/7C300

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para replicação de DNA circular em um sistema livre de células, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:

(1) formar uma mistura de reação de DNA circular como um molde com uma solução de reação compreendendo:

um primeiro grupo enzimático, que catalisa a replicação de DNA circular, um segundo grupo enzimático, que catalisa a maturação de fragmento de Okazaki e sintetiza dois DNAs circulares irmãos constituindo um catenano, e um terceiro grupo enzimático, que catalisa a separação de dois DNAs circulares irmãos; e (2) reagir a mistura de reação formada na etapa (1), em que o DNA circular inclui uma sequência de origem de replicação (origem de cromossomo (oriC)) que pode se ligar a uma enzima possuindo atividade de DnaA, e inclui ainda um par de sequências ter que é inserido externamente em relação a oriC, e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, em que quando o DNA circular tem as sequências ter, a solução de reação na etapa (1) compreende ainda uma proteína possuindo uma atividade de inibir a replicação por ligação com as sequências ter, e quando o DNA circular tem a sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, a solução de reação da etapa (1) compreende ainda a enzima de separação de multímero de DNA.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a enzima de separação de multímero de DNA é Cre ou XerCD.

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2/6
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o par de sequências ter que são inseridas externamente em relação a oriC compreende: uma sequência compreendendo qualquer uma das sequências mostradas na SEQ ID N^QS: 1 a 14, que é inserida como uma sequência ter no lado do terminal-5' de oriC; e uma sequência compreendendo uma sequência complementar a qualquer uma das sequências mostradas na SEQ ID N^QS: 1 a 14, que é inserida como a outra sequência ter no lado do terminal-3' de oriC.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a proteína possuindo uma atividade de inibir a replicação por ligação com as sequências ter é uma proteína Tus ou uma proteína RTP.
5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica reconhecida por XerCD é uma sequência compreendendo qualquer uma das sequências mostradas na SEQ ID N^QS: 15 a 24, ou uma sequência complementar a ela.
6. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica reconhecida por Cre é uma sequência compreendendo qualquer uma das sequências mostradas na SEQ ID N^QS: 30 a 35, ou uma sequência complementar a ela.
7. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que é DNA linear com um comprimento de 273 pb a 2,0 kb, e compreende oriC, e um par de sequências ter que é cada inserida externamente em relação a oriC, e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA.
8. Método para replicação de DNA circular em um sistema livre de célula, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:

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3/6 (1) preparar DNA circular compreendendo oriC·.

adicionar um transposon oriCe transposase em um tampão para formar um transposoma oriC, em que o transposon oriC é DNA linear compreendendo uma sequência de origem de replicação (origem de cromossomo (oriC)) que pode se ligar a uma enzima possuindo atividade de DnaA, e compreendendo sequências de extremidade externa (OE) em ambos os seus terminais; e reagir o transposoma oriC com o DNA circular não compreendendo oriC em um tampão, para realizar uma reação de transferência, (2) formar uma mistura de reação de DNA circular compreendendo oriC obtido na etapa (1) com uma solução de reação compreendendo:

um primeiro grupo enzimático, que catalisa a replicação de DNA circular, um segundo grupo enzimático, que catalisa a maturação de fragmentos de Okazaki e sintetiza dois DNAs circulares irmãos constituindo um catenane, e um terceiro grupo enzimático, que catalisa a separação de dois DNAs circulares irmãos; e (3) reagir a mistura de reação formada na etapa (2).
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a sequência OE compreende a sequência mostrada na SEQ ID N^Q: 25 (5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3') e uma sequência complementar a ela, e a sequência OE compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID N^Q: 25 é inserida no terminal-5' do DNA linear na etapa (1), e a sequência OE compreendendo uma sequência complementar à sequência mostrada na SEQ ID N^Q: 25 é inserida no terminal-3' do DNA linear.
10. Método de acordo com a reivindicação 8 ou 9,

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4/6 caracterizado pelo fato de que o DNA circular compreendendo oriC compreende ainda um par de sequências que são inseridas externamente em relação a oriC, e/ou uma sequência reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, em que quando o DNA circular tem as sequências ter, a solução de reação na etapa (2) compreende ainda uma proteína possuindo a atividade de inibir a replicação por ligação com as sequências ter, e quando o DNA circular tem a sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, a solução de reação da etapa (2) compreende ainda a enzima de separação de multímero de DNA.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que o transposon oriC na etapa (1) compreende ainda um par de sequências que cada é inserida externamente em relação a oriC, e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, em que quando o DNA linear tem as sequências ter, a solução de reação na etapa (2) compreende ainda uma proteína possuindo a atividade de inibir a replicação por ligação com as sequências ter, e quando o DNA circular tem a sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, a solução de reação da etapa (2) compreende ainda a enzima de separação de multímero de DNA.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende ainda:

(4) remover o transposon oriC do DNA circular replicado ou amplificado no produto de reação na etapa (3).
13. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que é DNA

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5/6 circular com um comprimento de 311 pb a 2,0 kb, e compreende oriC, e um par de sequências que é cada inserida externamente em relação a oriC, e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA, e compreende também sequências de extremidade externa (OE) em ambos os seus terminais.
14. Kit para a replicação de DNA circular, caracterizado pelo fato de que compreende uma combinação de:

um primeiro grupo enzimático, que catalisa a replicação de DNA circular;

um segundo grupo enzimático, que catalisa a maturação de fragmentos de Okazaki e sintetiza dois DNAs circulares irmãos constituindo um catenano;

um terceiro grupo enzimático, que catalisa a separação de dois DNAs circulares irmãos;

um transposon oriC, que é DNA linear compreendendo uma sequência de origem de replicação (origem de cromossomo (oriC)) que pode se ligar a uma enzima possuindo atividade de DnaA, e compreendendo sequências de extremidade externa (OE) em ambos os seus terminais; e transposase.
15. Kit de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o transposon oriC compreende ainda um par de sequências ter que cada é inserida externamente em relação a oriC, e/ou uma sequência nucleotídica reconhecida por uma enzima de separação de multímero de DNA.
16. Kit de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que compreende ainda:

uma proteína possuindo uma atividade de inibir a replicação por ligação com as sequências ter,