CN1500141A - 基因靶向方法和载体 - Google Patents
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Abstract
提供了在真核细胞内特异地改变特定遗传位点的方法和载体。一种方法是使用细胞内荧光探针(FPIC)基因靶向DNA载体来建立和鉴定细胞，其中的载体序列已经通过位点特异性同源重组作用被整合进宿主细胞基因组中。该方法也使用鉴定细胞的体内可检测标记物的编码序列，该细胞含有经位点特异性同源重组作用或非同源重组作用或插入作用而被整合进宿主细胞基因组中的外源载体序列。另外，提供了采用FPIC载体修饰的细胞和由该细胞产生的生物体。
Description
本申请声明，在35U.S.C.§119(e)条款下，对2001年12月4日归档的美国系列号第60/338,768拥有优先权，其全部内容在此合并为参考文献。
发明的背景
发明领域
本发明总体上涉及为了修饰遗传位点而进行的细胞操作，更特殊的是涉及基因靶向载体和在细胞中产生遗传修饰的方法。
背景资料
外源遗传物质被稳定地导入真核细胞和原核细胞的基因组中，这已经在很多情况下为了各种目的而成功实现了，如为了表达外源基因或破坏内源性位点。主要是通过随机的基因组插入或位点特异性同源重组而实现。随机整合涉及将线性化的DNA片段插入宿主细胞的基因组中，插入的位置大部分地是非位点特异的。这些插入趋向于以多聚体(multimer)或多联体(concatemer)存在，大多数往往不引起特异位点的破坏或失活。也存在内源性位点被随机插入事件破坏的可能性，从而经常使分析外源基因对细胞或来自转化细胞的生物体的作用变得很困难。另外，可以观察到外源启动子活性的有效范围有赖于整合的区域。
经位点特异性同源重组将DNA插入宿主基因组中，可使外源DNA分子的单拷贝整合作用靶向宿主基因组的特异区域。同源重组涉及明显相似的核苷酸序列通过特异重组酶的作用而交换。早期的实验试图用外源DNA以位点特异的方式操控细胞内源性基因组DNA序列，集中于酵母作为模型系统。重组作用以酵母基因组和经leu2.sup位点转化作用导入的外源质粒为示范(Hinnen等人(1978)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75，1929)。最近使用哺乳动物细胞的同源重组能力使细胞内源基因组DNA中产生了特异突变的DNA序列。获得功能和丧失功能的等位基因都已经在干细胞和这些细胞产生的动物中产生(见下文)。另外，应用阳性-阴性选择载体和方法促进了含突变DNA序列的细胞和动物的产生和研究(Capecchi等人，(1997)美国专利第5,631,153号)。
已经从胚胎干细胞培育成许多动物，这些干细胞含有经位点特异同源作用而突变的特异位点。这些动物包括来源于嵌合体的小鼠，是通过向胚泡中注射经特异位点同源重组作用靶向的胚胎干细胞而产生的。一些实例包括p53和paraxis位点(Donehower等人，(1992)，Nature，356,215；Burgess等人，(1996)，Nature，384，570)。猪也已经从包括猪的同源重组修饰胚胎干细胞中培育出来(Butler等人，(2002)，Nature，415，103)。
至今，已经设计了主要的两型载体可以靶向基因组的特异区域，以便用外源DNA序列取代内源序列。这些载体已经证明足以在许多不同的细胞类型中产生多种靶向的等位基因。插入型载体含有侧向于编码选择性标记物的内部核苷酸序列的两个同源区域。载体在一个同源区域内被线性化。一个遗传交叉事件和同源重组引起基因组序列的部分复制。染色体内重组经常引起内源复制序列被去除。这种类型靶向载体的缺点是缺少阴性选择标记物，后者可通过去除含有主链或载体序列的细胞而有效地富集正确的靶向作用。另外，在同源区域内的线性化减少了可进行同源重组的DNA序列的数量，因此减少了链交换的机率(Thomas等人，(1986)，Cell，44，49)。最终，染色体内重组必须发生在规定的区域内，否则可发生位点野生型结构的再生。
置换型载体含有两个同源区域，通常侧向于阳性选择性标记物，如编码新霉素磷酸转移酶的基因。阴性选择性标记物通常位于外侧并与其中一个同源区域相邻，以便通过去除含有阴性选择性序列盒的细胞而在总群落中富集正确靶向的细胞。置换型载体导入细胞后，同时或逐步进行阳性和阴性的选择得到了分离的细胞，由于使用阴性选择性标记物，接受位点特异性同源重组的分离细胞具有大约8至12倍富集的机率。在可能是第一个成功的哺乳动物细胞基因靶向实验中，Capecchi等人显示通过使用置换型载体靶向小鼠HPRT和int-2位点(美国专利第5,631,153号)。从此大量位点被成功的靶向，一些通过插入型载体，大多数通过置换型载体。这些载体中的许多包括阴性选择性标记物，位于同源区域之一或两者的外侧，这往往导致靶向的等位基因的鉴定效率增加。
关于这种方法和置换型载体的应用和阳性-阴性选择仍然存在许多缺点。使用许多阴性选择性序列盒如HSV胸苷激酶需要添加抗生素或选择剂如更昔洛韦，它们可对细胞产生不适当的应激，以及引起不必要或不成熟的分化作用。另外，选择富集阴性选择性标记物的细胞要花费相当多的时间，以回收由于缺乏选择性标记物而对药物具有抵抗性的细胞。同样，典型地通过这种方法获得的富集因子最多为大约8至12倍。同样，阳性-阴性选择载体的建立常常在战略上是困难的和费时间的。因此需要可以将外源性核酸分子位点特异性地插入细胞基因组中的靶向载体。本发明满足了这种需求，并提供了其他的优点。
发明简述
提供了通过载体DNA与靶DNA的同源重组作用在真核细胞中修饰基因组DNA序列的方法(图1)。该方法首先需要转化能够与载体进行同源重组的细胞，该载体在此是指FPIC基因靶向载体，含有与在细胞基因组中存在的序列实质上相似的序列。尽管载体可以基本上以随机的方式整合进宿主细胞基因组，对基因组的特异区域没有优先选择，但一定比例的细胞中还是含有通过位点特异性同源重组作用被整合进基因组的基因靶向载体。随后选择转化的宿主细胞以分离和鉴定已成功接受了位点特异同源重组的细胞。根据检测存在特异的转录核苷酸序列的能力进行选择，该序列呈现基因靶向载体中存在的序列。
本发明的FPIC载体包括与宿主细胞基因组中存在的序列实质上同源的第一条DNA序列，以及与宿主细胞基因组中第一条序列的下游或上游的其他序列实质上同源的第三条DNA序列。载体进一步在第一条和第三条DNA序列之间含有第二条DNA序列，它与宿主基因组中存在的序列很少或没有同源性，并使之能够鉴定基因组中被整合进载体序列的细胞。载体也含有第四条DNA序列，可以位于第一条或第二条序列的5’或3’端，与宿主基因组中存在的序列很少或没有同源性，并赋予单独的独特方式来鉴定含有被整合进宿主细胞基因组的序列的细胞。第二条和第四条序列的联合应用可以鉴定已经接受了载体与内源序列同源重组的细胞。相应地，本发明也提供了用这种载体转化的细胞，特别是已经被这种载体介导了同源重组的细胞，以及由这样转化的细胞产生的生物体，其中同源重组赋予了特殊的遗传改变。
在一个实施例中，本发明提供了鉴定已经接受使用FPIC基因靶向载体的位点特异性同源重组的转化细胞的方法。这种方法可以通过，例如，以下步骤来实施，a)采用设计用来进行位点特异性同源重组的FPIC基因靶向载体来转化细胞，其中所述的载体包含，第一条DNA序列与宿主基因组中存在的内源性基因组序列实质上同源；第二条DNA序列编码所述细胞中的阳性选择特征，与细胞内源性基因组序列没有同源性，因此不能接受位点特异性同源重组；第三条DNA序列与宿主基因组中存在的内源性基因组序列实质上同源，并与第一条DNA序列不同；以及第四条DNA序列代表所述细胞中的特异转录序列，不编码功能性蛋白产物并与细胞内源性基因组序列非同源，因此不能接受位点特异性同源重组；其中所述的载体能够在细胞中通过具有内源性靶序列的第一条DNA序列和具有内源性靶DNA序列的第三条DNA序列之间的链交换进行位点特异性同源重组；其中所述的FPIC基因靶向载体中的DNA序列的组成形式是，与靶DNA序列实质上同源的第一条DNA序列，编码阳性选择标记物的第二条DNA序列，与靶DNA序列实质上同源的第三条DNA序列，被转录但不编码功能性蛋白产物的第四条DNA序列；b)繁殖细胞以选择或富集已经成功地用所述FPIC基因靶向载体转化的细胞，通过存在所述第二个DNA序列的阳性可选择标记物基因产物和缺少所述第四条DNA序列转录的无功能序列而选择，和c)从含有所述表现为转录序列不编码功能蛋白的第四条序列的细胞中分离含有所述编码阳性可选择标记物的第二条DNA序列的细胞。这种方法可进一步包括对所述细胞的基因组DNA进行定性的步骤，该细胞携带编码阳性可选择标记物的第二条DNA序列，但不携带第四条DNA序列，该序列编码转录序列但不编码位点特异同源重组事件的功能性蛋白产物，该事件可进行细胞靶DNA的修饰。
在另一个实施例中，本发明提供了鉴定已经接受使用FPIC基因靶向载体的位点特异性同源重组的转化细胞的方法。这种方法可以通过例如以下步骤来实施，a)采用设计用来进行位点特异性同源重组的FPIC基因靶向载体来转化细胞，其中所述的载体包含，第一条DNA序列与宿主基因组中存在的内源性基因组序列实质上同源；第二条DNA序列编码转录的核苷酸序列，不编码功能蛋白产物并与细胞内源性基因组序列非同源，因此不能接受位点特异性同源重组；第三条DNA序列与宿主基因组中存在的内源性基因组序列实质上同源，并与第一条DNA序列不同；以及第四条DNA编码阴性可选择标记物，与细胞内源性基因组序列非同源，因此不能接受位点特异性同源重组；其中所述的载体能够在细胞中通过具有内源性靶序列的第一条DNA序列和具有内源性靶DNA序列的第三条DNA序列之间的链交换进行位点特异性同源重组；其中所述的FPIC基因靶向载体中的DNA序列的组成形式是，与靶DNA序列实质上同源的第一条DNA序列，编码转录的序列但不编码功能蛋白产物的第二条DNA序列，与靶DNA序列实质上同源的第三条DNA序列，编码阴性可选择标记物的第四条DNA序列；b)繁殖细胞以选择或富集已经成功地用所述FPIC基因靶向载体转化的细胞，通过存在所述的第二条DNA序列而选择，和c)从含有所述编码阴性可选择标记物的第四条序列的细胞中分离含有所述编码转录序列的第二条DNA序列的细胞。这种方法可进一步包括对所述细胞的基因组DNA进行定性的步骤，所述细胞携带表现为转录序列但不编码功能蛋白产物的第二条DNA序列，但不携带位点特异同源重组事件中的第四条DNA序列，该事件可进行细胞靶DNA的修饰。
也在另一个实施例中，本发明提供了鉴定已经接受使用FPIC基因靶向载体的位点特异性同源重组的转化细胞的方法。这种方法可以通过例如以下步骤来实施，a)采用设计用来进行位点特异性同源重组的FPIC基因靶向载体来转化细胞，其中所述的载体包含，第一条DNA序列与宿主基因组中存在的内源性基因组序列实质上同源；第二条DNA序列编码转录的核苷酸序列，不编码功能蛋白产物并与细胞内源性基因组序列非同源，因此不能接受位点特异性同源重组；第三条DNA序列与宿主基因组中存在的内源性基因组序列实质上同源，并与第一条DNA序列不同；以及第四条DNA序列表现为所述细胞中的一条特异转录序列，它不编码功能蛋白产物并与细胞内源性基因组序列非同源，因此不能进行位点特异性同源重组；其中所述的载体能够在细胞中通过具有内源性靶序列的第一条DNA序列和具有内源性靶DNA序列的第三条DNA序列之间的链交换进行位点特异性同源重组；其中所述的FPIC基因靶向载体中的DNA序列的组成形式是，与靶DNA序列实质上同源的第一条DNA序列，表现为转录序列但不编码功能蛋白产物的第二条DNA序列，与靶DNA序列实质上同源的第三条DNA序列，被转录但不编码功能蛋白产物的第四条DNA序列；b)繁殖细胞以选择或富集已经成功的被所述FPIC基因靶向载体转化的细胞，通过存在表现为不编码功能蛋白产物的转录序列的第二条DNA序列而选择，并以缺少所述第四条DNA序列的不编码功能蛋白产物的转录序列而选择，和c)从含有所述表现为不编码功能蛋白的转录序列的第四条序列的细胞中分离含有所述表现为不编码功能蛋白产物的转录序列的第二条DNA序列的细胞。这种方法可进一步包括对所述细胞的基因组DNA进行定性的步骤，所述细胞携带表现为不编码功能蛋白产物的转录序列的第二条DNA序列，但不携带编码转录序列但不编码位点特异同源重组事件中功能蛋白产物的第四条DNA序列，该事件可进行细胞靶DNA的修饰。
仍然在另一个实施例中，本发明提供了鉴定已经接受使用FPIC基因靶向载体的位点特异性同源重组的转化细胞的方法。这种方法可以通过例如以下步骤来实施，a)采用设计用来进行位点特异性同源重组的FPIC基因靶向载体来转化细胞，其中所述的载体包含，第一条DNA序列与宿主基因组中存在的内源性基因组序列实质上同源；第二条DNA序列编码转录的核苷酸序列，不编码功能蛋白产物并与细胞内源性基因组序列非同源，因此不能接受位点特异性同源重组；第三条DNA序列与宿主基因组中存在的内源性基因组序列实质上同源，并与第一条DNA序列不同；以及第四条DNA编码阳性可选择标记物，与细胞内源性基因组序列非同源，因此不能接受位点特异性同源重组；其中所述的载体能够在细胞中通过具有内源性靶序列的第一条DNA序列和具有内源性靶DNA序列的第三条DNA序列之间的链交换进行位点特异性同源重组；其中所述的FPIC基因靶向载体中的DNA序列的组成形式是，与靶DNA序列实质上同源的第一条DNA序列，表现为转录序列但不编码功能蛋白产物的第二条DNA序列，与靶DNA序列实质上同源的第三条DNA序列，编码阳性可选择标记物的第四条DNA序列；b)繁殖细胞以选择或富集已经成功地用所述FPIC基因靶向载体转化的细胞，通过存在表现为不编码功能蛋白产物的转录序列的第二条DNA序列而选择，并以缺少由所述第四条DNA序列转录的阳性可选择蛋白产物而选择，和c)从含有所述编码阳性可选择标记物的第四条DNA序列的细胞中分离含有所述表现为不编码功能蛋白产物的转录序列的第二条DNA序列的细胞。这种方法可进一步包括对所述细胞的基因组DNA进行定性，所述细胞携带表现为不编码功能蛋白产物的转录序列的第二条DNA序列，但不携带编码位点特异同源重组事件中的阳性可选择标记物的第四条DNA序列，该事件可进行细胞靶DNA的修饰。
本发明的一个目的是提供为修饰内源性核苷酸序列而靶向真核细胞基因组特异区域的位点特异同源重组方法，和组合物，包括以这种位点特异同源重组为特征的细胞和含有这种细胞的非人生物体。相应地，本发明的另一个目的是提供选择和检测接受位点特异同源重组的细胞的方法。本发明的进一步目的是提供应用所述方法的载体。也是本发明的另一个目的，即提供核酸和肽核酸((peptide nucleic acid)(PNA))分子信标探针以鉴定细胞中是否存在特异的非同源基因靶向序列。仍然是本发明的进一步目的，即提供已经通过所述的位点特异同源重组方法修饰的细胞。也是本发明的另一个目的，即提供已经通过所述的位点特异同源重组和检测方法修饰的转基因动物和植物。
相应地，本发明涉及分离的FPIC基因靶向载体，用于在能够接受同源重组的细胞中进行位点特异性同源重组。这种FPIC基因靶向载体包括，第一条DNA序列与靶细胞的细胞内源性基因组DNA序列实质上同源，能够在靶细胞中进行同源重组；第二条DNA序列与细胞内源性基因组序列非同源，不能在靶细胞的基因组中进行同源重组，第二条DNA序列进一步包括能够鉴定含有所述核苷酸序列的细胞的核苷酸序列；第三条DNA序列与细胞内源基因组序列实质上同源，能在靶细胞中接受同源重组；和任选地，第四条DNA序列与靶细胞的细胞内源基因组序列非同源，不能在细胞中接受同源重组，当存在第四条DNA序列时，进一步包括能够从不含有所述核苷酸序列的细胞中鉴定和分离含有所述DNA序列的细胞的核苷酸序列。优选地，FPIC基因靶向载体中的DNA序列组成部分以5’至3’方向连接如下：与细胞内源基因组DNA序列实质上同源的第一条DNA序列，第二条DNA序列，与细胞内源基因组DNA序列实质上同源的第三条DNA序列，和第四条DNA序列。这样的载体以能够进行位点特异性同源重组并导致细胞内源性靶基因组DNA序列的修饰为特征。
如此，本发明也涉及获取转化细胞的方法，该细胞已使用这种FPIC基因靶向载体进行位点特异同源重组。这种方法可通过，例如，以下的步骤实施：在适合载体转化细胞的条件下，将细胞与在此公开的FPIC基因靶向载体接触；在选择存在表现所述第二条DNA序列的转录序列和缺少表现第四条DNA序列的转录序列的条件下，增殖与载体接触的细胞，因此选择或富集用所述FPIC基因靶向载体转化的细胞；和从含有所述第四条DNA的细胞中分离含有所述第二条DNA序列的细胞，从而获得已经使用FPIC基因靶向载体接受位点特异同源重组的转化细胞。
附图简述
图1是对在使用FPIC基因靶向载体的位点定向诱变中涉及的过程进行说明的流程图图解。
图2是经同源重组进行的FPIC基因靶向的分子事件的图解。
图3是几种类型的FPIC基因靶向载体的图解。
图4是在ptch2位点进行FPIC基因靶向的图解。
图5是在paraxis位点进行FPIC基因靶向的图解。
发明详述
本发明基于基因靶向载体的进展，该载体用于通过位点特异性同源重组将修饰作用导入细胞内源基因组靶DNA序列中。相应地，提供了基因靶向载体，以及采用这种载体基因修饰细胞的方法。也提供了使用本发明的基因靶向载体被基因修饰的细胞，以及由这些细胞发育而成的转基因非人生物体，例如采用本发明的靶向载体在一个或多个细胞内源基因组DNA序列中以位点特异的方式进行基因修饰的胚胎干细胞(ES)，以及由这些修饰的(ES)细胞发育而成的非人生物体。
术语“细胞内源基因组DNA序列”在此定义为正常存在于细胞基因组中的核苷酸序列。如在此公开的，细胞内源基因组DNA序列能够接受使用本发明基因靶向载体的序列进行位点特异性同源重组，因此，可以用作所公开的FPIC基因靶向载体的修饰靶标。包括在此定义中的序列可代表细胞基因组中存在的特异基因的任何编码或非编码区。编码如结构蛋白、分泌蛋白、激素、受体、酶类、转录因子等蛋白产物的基因也包括在此定义中。这些序列也代表调控元件等同体如启动子、增强子或阻遏物元件。细胞内源基因组靶DNA序列的组成形式一般类似于FPIC基因靶向载体中存在的特异序列。即，它含有与FPIC基因靶向载体中存在的序列实质上同源的序列，使得位点特异性同源重组能够进行。
术语“位点特异性同源重组”是指在核苷酸组成上实质上相似的DNA序列之间发生的链交换遗传交叉事件。这种遗传交叉事件可发生在FPIC基因靶向载体和细胞内源基因组DNA序列所包含的序列之间。另外，可能有超过一个位点特异性同源重组事件发生在FPIC基因靶向载体和细胞内源基因组序列中存在的序列之间，可引起置换事件，包含在FPIC基因靶向载体中的DNA序列替代了存在于细胞内源基因组序列中的特异序列。同样，单个位点特异性同源重组事件可发生在FPIC基因靶向载体和细胞内源基因组序列中存在的DNA序列之间，可引起插入事件，其中大部分或整个FPIC基因靶向载体被插入细胞内源基因组序列中的特异位点。
术语“第一条DNA序列”是指存在于FPIC基因靶向载体中DNA序列，它们与细胞内源基因组序列实质上是同源的。正是这些序列，在它们被导入含有相似序列、能够接受所述重组作用的细胞中时，预测可接受位点特异性同源重组。
术语“第二条DNA序列”是指可根据特别的特性被检测其存在的序列，由于缺少启动子和在阳性可选择标记物的上游存在的调控元件，它们可以，但不是必须的，独立于细胞靶向序列而表达。第二条DNA序列定位在第一条和第三条DNA序列之间，后两者与细胞内源基因组DNA序列实质上是同源的。第二条DNA序列与细胞内源基因组DNA序列是非同源的，因此使用这条序列接受位点特异性同源重组。
术语“第三条DNA序列”是指在FPIC基因靶向载体中存在的DNA序列，它们与细胞内源基因组序列实质上是同源的，然而与第一条DNA序列的序列是不同的，但可能是邻近的，或适当接近的。正是这些序列，在它们被导入含有相似序列，能够接受所述的重组作用的细胞的过程中，预测可接受位点特异性同源重组。
术语“第四条DNA序列”是指可根据特别的特性被检测其存在的特异序列，它们定位在第一条和第三条DNA序列的外部。第四条DNA序列含有自己的启动子和调控元件，因此其表达是独立于细胞内源基因组靶DNA序列中存在的调控元件。第四条DNA序列与细胞内源基因组DNA序列是非同源的，因此不能使用这条序列进行位点特异性同源重组。
在一个置换型FPIC基因靶向载体中，第一条，第二条，第三条和第四条DNA序列可如此组织，即第二条DNA序列位于第一条和第三条DNA序列之间，第四条DNA序列位于第一条或第三条DNA序列的5’或3’端。图2图示了用来进行位点特异性同源重组的一个FPIC基因靶向载体的组成形式。
第四条DNA序列可定位在包含在FPIC基因靶向载体中的第一条和第三条序列的上游或下游。上游一般是指载体中第一条和第三条序列的5’，下游一般是指其3’，所述载体含有第一条和第三条DNA序列，在方向上类似于细胞内源基因组序列。应该阐明的是5’和3’分别是指第一条和第三条DNA序列。这种组成形式代表一个置换型载体。第二条DNA序列可能根据第一条和第三条DNA序列而被反转，仍保留可表达性，因此可检测它的存在。另外，与细胞靶DNA中的相似序列比较可能FPIC基因靶向载体中第一条和第三条序列的部分可根据互相的位置而被反转。插入型载体一般在位点特异性同源重组作用下将大部分载体序列插入细胞基因组中。
其他的选择特征可由第五条DNA序列来表现，它位于第四条DNA序列相反的位置上。术语“相反”是指在第一条或第三条DNA序列外部的位置，位于这些序列的另一端，即与编码阳性标记物相关的第四条DNA序列的5’或3’端。
在一个插入型FPIC基因靶向载体中，第一条，第二条和第三条序列可被如此组织起来，即第三条序列可根据第一条序列在载体的线性化过程从5’反转至3’端。所述的反转方向可使载体在位点特异性同源重组过程中在位点特异的位置上的插入，该重组作用发生在FPIC基因靶向载体和细胞内源基因组DNA序列之间。在大多数情况下，整个载体将被插入，实质上同源的DNA序列的部分被复制。第四条DNA的编码序列可以，但不是必须的包含在FPIC基因靶向载体中。
FPIC基因靶向载体的长度可根据所选择的阳性可选择标记物，被转录但不编码功能蛋白产物的核苷酸序列，能够驱动第二条DNA序列编码的阳性可选择标记物表达的启动子存在与否，适当的同源重组所需的第一条和第三条DNA序列的长度，基本载体的长度和在细菌中质粒载体的选择作用如氨苄青霉素抗性和质粒主链复制起始点的大小等而变化。但基于已知质粒和阳性可选择标记物的大小，合理的估计整个载体将在长度上至少为几千碱基对。
术语“分子信标”在此的定义是指鉴定存在细胞内的特异核苷酸序列的探针。分子信标可由仅核酸如DNA或RNA组成，或可由肽核酸(PNA)结合物组成。分子信标与特异核苷酸序列的结合可允许在体外或体内鉴定这些序列的存在。
术语“功能性”在此的定义，就阳性可选择标记物而言，是赋予标记物下面所述的能力，可检测和分离含有编码阳性可检测标记物的DNA的细胞，可从不含有阳性可选择标记物的或含有被转录但不编码功能蛋白的序列的细胞中鉴别出这些细胞。许多选择试剂可因检测存在于细胞中的阳性可选择标记物。这些试剂包括，但不限于，例如G418，次黄嘌呤，博来霉素，潮霉素，嘌呤霉素，杀稻瘟素，列于表I。另外，鉴定标记物存在不需要添加试剂的阳性可选择标记物被认为是功能性的，如果它们可从含有不同的可选择标记物或不含有可选择标记物的细胞中分离含有所述可选择标记物的细胞。一些实例包括，但不限于，荧光蛋白GFP，CFP，YFP，RFP，dsRED和HcRED，也列于表I。
表I.在FPIC基因靶向载体中应用的阳性可选择标记物
| 阳性标记物 | 选择试剂 | 检测方法 |
| NeoR | 卡那霉素 | 细胞生存率 |
| NeoR | G418 | 细胞生存率 |
| HygroR | 潮霉素 | 细胞生存率 |
| hisDR | 组氨醇 | 细胞生存率 |
| GPT | 黄嘌呤 | 细胞生存率 |
| BleoR | 博来霉素 | 细胞生存率 |
| HPRT | 次黄嘌呤 | 细胞生存率 |
| GFP | 紫外线 | 荧光 |
| CFP | 紫外线 | 荧光 |
| YFP | 紫外线 | 荧光 |
| KFP | 紫外线 | 荧光 |
| dsRED | 紫外线 | 荧光 |
| HcRED | 紫外线 | 荧光 |
FPIC基因靶向载体包括两个同源区，第一条和第三条DNA序列，它们与宿主基因组的区域实质上是同源的。典型地，载体含有的第一条和第三条DNA序列的同源性长度为大约50个碱基对和50,000个碱基对之间。也包括第二条和第四条DNA序列，它们编码阳性可选择标记物，阴性可选择标记物，或被转录但不编码功能蛋白的序列，可鉴定FPIC靶向载体整体和其部分在宿主基因组中的存在与否。第二条DNA序列可编码阳性可选择标记物，如，但不限于，例如蓝绿荧光蛋白(cyan fluorescent protein)(CFP)，它定位在两个同源区之间，因此可被包含在位点特异性同源重组应该发生的宿主基因组整合体中。理想地，如果第四条DNA序列被转录但不编码功能蛋白，第二条DNA序列将编码阳性可选择标记物。如果第二条DNA序列编码阳性可选择标记物，第四条DNA序列表现为不编码功能蛋白的转录序列，它定位在同源区之外，因此将不会在同源重组作用下被加入宿主基因组中。可选择地，如果第二条DNA序列表现为不编码功能蛋白的转录序列，第四条DNA序列则编码阳性的可选择标记物。另外，可能第二条DNA序列表现为不编码功能蛋白的转录序列，第四条DNA序列表现为阴性可选择标记物。另外，也可能第二条和第四条DNA序列均表现为不编码功能蛋白的转录序列。选择过程涉及在显微镜下或通过荧光激活细胞分类术(FACS)细胞分选仪分选细胞，这将可以同时和单独的从含有第四条DNA序列的细胞中分离出含有第二条DNA序列的细胞。这些细胞的鉴定涉及采用荧光或其他方法检测阳性可选择标记物，通过应用分子信标技术检测不编码功能蛋白的转录序列，分子信标技术可鉴定细胞中特异的已转录序列。然后细胞可在组织培养中增殖，确定正确位点特异同源重组的基因靶向事件的基因型。应用阳性可选择标记物与可适用于分子信标技术的已转录序列的组合可鉴定已接受位点特异同源重组的细胞，对已有的基因靶向方法学是一个实质上的改良。
在本发明中描述的方法中使用的FPIC基因靶向载体可被如此组织，即第二条DNA序列可操作的定位在两个同源区之间，第四条DNA序列可操作的定位在两个同源区的外部和外侧。可能第二条DNA序列可采用这种方式来定位以破坏或置换外显子或基因组内源区的编码序列，在此位置上可发生位点特异性同源重组，因此可使内源位点失活并因此丧失功能。
在一个方面，第二条DNA序列可被定位，以便置换或插入不表现为外显子或编码序列的基因组区域，如内含子，外显子的不翻译区域或调控元件区域如启动子。在这种情况下，细胞可因在该位点上接受位点特异性同源重组，并不会灭活该特异位点而被选择。
在另一个方面，第二条DNA序列也可包含该序列独特的调控元件，其定位方式为在选择进行位点特异重组的基因组区域中可导入新的调控元件。本发明包括了为了实施位点特异同源重组的所述FPIC基因靶向载体和随后对接受所述重组的细胞的鉴定。
现在所描述的本发明也包括了根据FPIC基因靶向载体已接受位点特异同源重组的细胞和在此所述的鉴定方法。另外，现在所描述的本发明包括来自这些细胞的转基因非人动物和在此所描述的方法，所述的这些细胞使用FPIC基因靶向载体已接受了位点特异同源重组。
也包括来自这些细胞的转基因植物和在此所描述的方法，所述的这些细胞使用FPIC基因靶向载体已接受了位点特异性同源重组。以往已经证实了植物通过阳性-阴性选择可接受位点特异性同源重组以及基因靶向，因此可接受FPIC基因靶向载体和在此所描述的方法(Siebert等人，(2002)，Plant Cell，14，1121；Hanin等人，(2001)，Plant J.，28，671；Xiaohui等人，(2001)，Gene，272，249)。
在本发明中所描述的方法中，大多数被整合进宿主细胞中的载体可以基本上随机的方式进行，不需优选基因组的特异区域。但合理的建议是一定比例的第一条DNA载体通过位点特异性同源重组作用整合进宿主细胞基因组中。随后的细胞选择可分离和鉴定成功接受位点特异性同源重组作用的细胞。选择作用是基于FPIC基因靶向载体的组成形式和组成成分。FPIC基因靶向载体包括两个同源区，第一条和第三条DNA序列，它们与宿主基因组区域实质上是同源的。也包括第二条DNA序列和可选择的第四条DNA序列，它们可鉴定FPIC基因靶向载体整体和其部分在宿主基因组中存在与否。第二条DNA序列定位在两个同源区之间，因此可被包含在位点特异性同源重组应该发生的宿主基因组整体中。选择过程涉及显微镜下或通过FACS细胞分选仪来进行细胞分选，这样可同时和单独的从含有第四条DNA序列的细胞中分离含有第二条DNA序列的细胞。然后细胞在组织培养中增殖，并确定正确位点特异同源重组的基因靶向事件的基因型。
现在所描述的本发明的FPIC基因靶向载体方法可如此组织起来，即第二条DNA序列被可操作性的定位在两个同源区之间。可能第二条DNA序列可以此模式被定位以破环或置换基因组内源区域的外显子或编码序列，其位置可发生位点特异性同源重组，可使内源位点失活并丧失功能。
第二条DNA序列可被定位，即它可置换或插入不表现为外显子或编码序列的基因组区域中，如内含子，外显子的不翻译区域或调控元件区域如启动子。在这种情况下，细胞可因在该位点上接受位点特异性同源重组，并不会灭活该特异位点而被选择。
在第三种情况下，可能第二条DNA序列也包含该序列独特的调控元件，其定位方式为在选择进行位点特异重组的基因组区域中可导入新的调控元件。
第二条和第四条DNA序列的序列组成一般与细胞内源基因组DNA序列是非同源的，因此不能接受位点特异性同源重组。因此所有的位点特异同源重组是编码与细胞内源基因组DNA序列实质上同源的区域的第一条和第三条DNA序列的结果，因此能够接受链交换的遗传交叉过程。另外，第二条和第四条DNA序列可根据相互的位置和根据细胞内源基因组DNA序列以方向独立的方式被定位。但第二条DNA序列的这种定位，需要不依赖细胞内源基因组DNA调控元件的这些序列的转录。
许多优选的阳性可选择标记物可用于FPIC基因靶向载体中(见表I)。这些序列可选择含有阳性可选择标记物的细胞，以便将所述细胞区分于那些不含有阳性可选择标记物的细胞。用作第二条DNA序列的最广泛使用的阳性可选择标记物可能编码新霉素磷酸转移酶基因产物。其他适合第二条DNA序列的阳性可选择标记物包括，但不限于，编码杀稻瘟素抗性，嘌呤霉素抗性，博来霉素抗性和潮霉素抗性的序列。这些阳性可选择标记物的几种也可适用于使用FPIC基因靶向载体在植物中进行位点特异性同源重组。
术语“阴性可选择标记物”包括任何特异的基因，DNA序列，蛋白，肽或氨基酸序列，当导入细胞中或接近细胞时，可具有通过细胞杀伤的作用将细胞从一个总的群体中消除的能力。术语“阴性选择作用”是指通过实现可杀死所述细胞的方法学而对细胞进行选择的作用。为了，许多阴性可选择标记物可用来增强或补充鉴定已接受位点特异同源重组的细胞的可能性。这些标记物包括，但不限于，胸苷激酶，白喉毒素A链，次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(hprt)和黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(gpt)，见表II。
表II.用于共转化方法中的阴性可选择标记物
| 阴性标记物 | 选择试剂 | 检测方法 |
| 白喉毒素 | 无 | 细胞杀伤 |
| 蓖麻毒素 | 无 | 细胞杀伤 |
| HPRT | 6-硫鸟嘌呤 | 细胞杀伤 |
| HSV-胸苷激酶 | 更昔洛韦，无环鸟 | 细胞杀伤 |
| GPT | 6-硫鸟嘌呤 | 细胞杀伤 |
| 胞嘧啶脱氨酶 | 5-氟代-胞嘧啶 | 细胞杀伤 |
“突变中DNA序列”在此是指任何改变了细胞内源基因组DNA序列的序列。这样的改变可导致细胞DNA序列功能容量的失活。这样的改变也可增强细胞序列DNA的功能容量或对细胞DNA序列的功能容量无影响。
“突变的DNA序列”在此是指任何可在使用FPIC基因靶向载体的过程中接受改变的细胞内源基因组DNA序列。一般预测突变的DNA序列将在FPIC基因靶向载体和细胞内源基因组DNA序列之间的位点特异重组作用下而产生。“突变的靶细胞”是能够接受位点特异性同源重组的细胞，它含有通过使用如在此所公开的存在于FPIC基因靶向载体中的突变DNA序列在细胞基因组内建立的突变DNA序列。
术语“实质上非同源的DNA”或“实质上不同源的DNA”是指不含有与靶DNA序列相似并足以发生位点特异同源重组过程的核苷酸序列的DNA序列。不相似序列的这种不能接受与靶DNA序列的位点特异同源重组的能力的原因是两条序列之间碱基对组成的不匹配。
在细胞基因组中建立突变的DNA序列具有许多应用上的益处。例如X-连锁基因可用来分析组织培养中的功能关系，如果由FPIC基因靶向载体靶向的特定细胞类型是雄性来源的话。另外，采用FPIC基因靶向载体对胚胎干细胞的操作可建立研究人类疾病的动物模型。例如p53位点，已经成功的采用阳性-阴性选择技术在鼠胚胎干细胞中被灭活，这些细胞已被用于建立这个位点编码的蛋白产物缺陷的小鼠(Donehower等人，(1992)，Nature，356，215)。这些小鼠在发育上是正常的，但易于发生特发性肿瘤。FPIC基因靶向载体和技术可在胚胎干细胞和由所述细胞建立的动物中产生相似的基因修饰。FPIC基因靶向载体和技术的其他应用包括产生获取功能的等位基因，可研究许多细胞和生理现象。许多原癌基因已经被当作获取功能的等位基因来分析，包括c-myc，细胞周期蛋白D1和ErbB-2(综述见Hutchinson等人，(2000)，Oncogene，19，130)。使用FPIC基因靶向载体和在此所描述的方法可有效地进行胚胎干细胞和来自这些细胞的转基因动物的丧失和获取功能的研究。
FPIC基因靶向载体和方法可用于建立和鉴定已接受载体和细胞内源基因组靶序列之间位点特异同源重组的细胞。载体实质上可富集鉴定接受所述过程的细胞。“实质上富集”是指明显增加鉴定接受载体和细胞DNA序列之间位点特异同源重组的细胞可能性的能力。可能性的明显增加是当与非特异插入或整合事件相比，至少两倍的同源重组事件，优选至少10倍，更优选至少100倍，甚至更优选10,000倍。使用FPIC基因靶向载体获得的实质上富集的细胞群包括大约1％，更优选10％，甚至更优选99％的分离细胞接受了在FPIC基因靶向载体序列与细胞内源基因组靶序列之间的位点特异同源重组。
FPIC基因靶向载体可能被设计成可在内源调控元件的控制下驱动第二条DNA序列的转录为FPIC基因靶向载体靶向的特异基因。在这种情况下，载体被构建，这样第二条DNA序列足以缺少驱动这些序列转录的上游元件。在FPIC基因靶向载体和细胞内源基因组靶序列之间的同源重组提供了随后要驱动第二条DNA序列转录的靶基因的特异调控元件。如果不发生位点特异性同源重组，第二条DNA序列大多数经常不被转录，因此对足以驱动这些序列的转录提供了内源性的细胞调控元件。这样一个载体组成形式的实例是将第二条DNA序列定位在第一条DNA序列和第三条DNA序列之间，其中第一条DNA序列与细胞内源基因组靶DNA是实质上同源的，并含有一个启动子和部分5’未翻译区，第三条DNA序列与细胞内源基因组靶DNA实质上是同源的，并含有内含子和下游外显子的一部分。FPIC基因靶向载体和细胞内源基因组靶序列之间的位点特异同源重组可在内源调控元件的控制下对第二条DNA序列进行定位。
就靶向修饰的基因功能而言，对于第二条DNA序列的定位可有许多种情况，可产生许多表现型。例如，可能不需要破坏内源位点就可能在FPIC基因靶向载体和细胞内源基因组靶序列之间实现位点特异同源重组。这可以通过将第二条DNA序列定位在一个内含子或非编码区内而实现，这样将所述的第二条DNA序列导入宿主细胞的基因组中不会破坏调控，外显或编码序列。这样一个载体的组成形式的实例是将第二条DNA序列定位在第一条DNA序列和第三条DNA序列之间，其中第一条DNA序列与细胞内源基因组靶DNA实质上是同源的，并含有一个外显子和一个内含子的一部分，第三条DNA序列与细胞内源基因组靶DNA实质上是同源的，并含有一个内含子的一部分和一个下游的外显子。在FPIC基因靶向载体和细胞内源基因组靶序列之间的位点特异同源重组可在内含子中定位阳性可选择标记物，因此不会破坏重要的外显编码序列。一个要求是第二条DNA序列必须由存在于FPIC基因靶向载体中的调控元件控制。
将突变的DNA序列导入能够接受位点特异同源重组的靶细胞基因组中，并不限制于建立丧失功能或获得功能的等位基因。例如，可能为了驱动由位点特异同源重组靶向的特异细胞内源位点的表达，将外源调控序列导入细胞或转基因动物或植物中新的组织-和/或细胞类型特异的区域，所述的动物或植物是从由FPIC基因靶向载体靶向的细胞建立的。为此目的使用的FPIC基因靶向载体和方法学可指导或控制任何基因实质上空间和时间上的表达模式，这些基因能够接受位点特异性同源重组。在此所述为此目的所述技术的应用实例是导入来自原癌基因c-myc编码序列的上游Pit-1位点的启动子和调控元件。这种情况可使c-myc在发育中和成体垂体的促生长激素细胞，垂体催乳素细胞(lactotrope)和促甲状腺素细胞中异位表达，并提供了一种垂体肿瘤发生的模型(Rhodes等人，(1996)，Mol.Cell Endocrinol.，124，163；Baxter等人，(2001)，75，9790)。表III列举了许多已定性的调控序列，它们可通过FPIC基因靶向方法被用来驱动内源位点的表达。
表III.调控元件的实例.
| 调控区 | 表达模式 |
| Pit-1 | 垂体 |
| 促乳泌素 | 垂体催乳素细胞 |
| 生长激素 | 垂体促生长激素细胞 |
| 肌原蛋白 | 骨骼肌 |
| A晶状体蛋白 | 眼晶状体 |
| 精蛋白 | 睾丸 |
| P-lim | 拉特克囊，运动神经元 |
| GATA-3 | 肝脏 |
| 胰岛素 | 胰腺 |
| GnRH | 下丘脑 |
| 抗肌萎缩蛋白 | 心肌和骨骼肌 |
可以理解的是，可以接受位点特异同源重组的任何类型细胞可被FPIC基因靶向载体和方法处理以对细胞内源基因组DNA序列进行突变。能够接受位点特异同源重组的细胞可来自许多生物体和物种，包括但不限于，人，鼠，绵羊，猪，牛，猿，犬和猫。一般，任何能够接受位点特异同源重组的真核细胞可成功地被FPIC基因靶向载体和方法靶向，在细胞内源基因组DNA中中产生突变的DNA序列。
当建立含有需要通过使用FPIC基因靶向载体和方法或共转化方法产生的修饰作用的转基因非人动物时，优选的细胞类型是胚胎干细胞。这些细胞一般来自植入之前的胚胎内细胞群，并在组织培养中增殖进行基因操作。在通过使用FPIC基因靶向载体和方法突变细胞内源基因组DNA序列的过程中，细胞经微注射技术被导入胚泡中，所述的胚泡被植入至假孕的雌性宿主中(Hogan等人，(编者)(1994)，鼠胚的操作，实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)。司选择地，桑椹胚聚集方法可用于建立含有基因修饰干细胞的胚胎(Kong等人，(2000)，Lab Anim.，29，25)。在出生后阶段仍然存活的胚胎经常表现嵌合的细胞成分，其中一定比例的细胞来自胚泡来源，一定比例的细胞来自那些通过FPIC基因靶向载体和技术突变的起源。嵌合的动物随后被繁殖成为对FPIC基因靶向载体和技术突变的等位基因来说是杂合性和纯合性的。
在此所述的FPIC基因靶向技术被用于纠正人体中的特异基因缺陷。例如，可能通过FPIC基因靶向载体和细胞内源基因组DNA序列之间的位点特异同源重组在人干细胞中产生突变的DNA序列，随后将这些细胞移植到病人体内，以纠正特异的基因疾患或补充特异基因产物。基因灭活的其他潜在应用是细胞表面上蛋白受体的破坏。例如其中已经采用适当的FPIC基因靶向载体破坏了假定病毒受体表达的细胞系或生物体进行病毒检测，以证实受体实际上参与了病毒的感染。进一步，适当的FPIC基因靶向载体被用于产生特异基因缺陷的转基因动物模型。例如，许多基因缺陷已经通过特异基因不能表达功能基因产物而被定性，如α和β地中海贫血，血友病，高歇病(Gaucher’s disease)和影响α1-抗胰蛋白酶，ADA，PNP，苯丙酮尿症，家族性高胆固醇血症和视网膜母细胞瘤产生的缺陷。含有一个或多个与这些疾病状态或编码特异基因缺陷的修饰作用有关的等位基因被破坏的转基因动物可用作治疗的模型。对于出生时成活的这些动物，可以进行实验性治疗。但当基因缺陷影响生存时，转基因动物的适当后代(如F0，F1)可用于研究基因治疗的体内技术。
FPIC基因靶向载体被设计特别用来在细胞的内源基因组DNA中突变DNA序列，所述细胞能够接受位点特异性同源重组。FPIC基因靶向载体的成分包括至少一个与细胞内源基因组DNA序列实质上同源的DNA区，一个使人能够从不含有这些序列的细胞中鉴别含有这些序列的细胞的DNA序列，至少一个其他的DNA序列，它可使人从不含有这些序列的细胞中鉴别和分离出含有这些序列的细胞。(图3)
另外，优选的是，FPIC基因靶向载体在被导入细胞中突变细胞内源基因组DNA序列之前被线性化，因为线性化载体可较环状载体表现明显更高的靶向频率(Thomas等人，(1986)，Cell，44，49)。但是，可能不需要线性化就可使用FPIC基因靶向载体达到这些目的。
为了靶向不同的等位基因，不同的调控元件可以，但不是必须的，用于转录第二条和第四条DNA序列，特别是第二条DNA序列，它可被定位在置换载体中实质上同源的两个区域之间。通过操纵第二条和第四条DNA序列的转录水平，可成功地进行靶向，其中这些序列由于异染色质的组成或邻近的调控元件对这些水平是很敏感的，所述的水平可影响阳性标记物的表达或可影响位点特异性同源重组的过程。表IV列出了可用于现在所描述的本发明中的更普遍的调控区域。
表IV.用来驱动可选择标记物表达的调控区R
| 调控区 | 来源 |
| 磷酸甘油酸激酶(PGK) | 哺乳动物 |
| SV-40(早期) | 哺乳动物，病毒 |
| 巨细胞病毒(CMV) | 病毒 |
| 鲁斯氏肉瘤病毒(RSV) | 病毒 |
| 莫洛尼白血病毒(MMLV) | 病毒 |
| MCl | 病毒 |
成功进行位点特异同源重组所需要的FPIC基因靶向载体的长度是重要的参数，经常依赖于建立突变DNA序列所要靶向的特异基因。载体的长度也依赖于几种因素。代表第二条和第四条DNA序列的DNA序列的选择将影响总的载体长度，因为序列组成是根据不同的转录的或表达的DNA序列，阳性或阴性可选择标记物而变化的。另外，在置换型载体中，第一条和第三条DNA序列的长度是重要的参数，为了进行成功的基因靶向必须被正确确定，两条序列与细胞内源基因组靶DNA序列实质上是同源的。一般来说，一个同源区可小至25bp(Ayares等人，(1986)，Genetics，83，5199)，尽管推荐使用明显更大的区域。直至一个特定的长度，在FPIC基因靶向载体同源性数量的增加可增加靶向的效率(Zhang等人，(1994)，Mol.Cell Biol.，14，2404)。在大多数情况下，整个载体的长度最小为1kb，通常最大不超过500kb，尽管载体长度也可依赖于用来构建载体的技术。例如，可能用粘粒，细菌人工染色体(BAC)，或酵母人工染色体(YAC)构建FPIC基因靶向载体，作为两个实质上的同源区的供给者，因此产生了一个明显很大的载体(Ananvoranich等人，(1997)，BioTechniques，23，812；Cocchia等人.，(2000)，Nucleic Acids Res.，28，E81)。载体的长度也包括质粒主链序列，如编码复制起始点的序列，以及细菌药物抗性产物如氨苄青霉素，如果它们在用载体转化细胞前没有被移除的话。
与细胞内源基因组DNA序列实质上同源的，并接受位点特异同源重组以在细胞靶标中建立突变DNA序列的FPIC基因靶向载体DNA序列优选与细胞的对应部分具有明显高的同源性。在位点特异性同源重组的遗传交叉和链交换过程中，高同源性可进行有效的碱基配对。在FPIC基因靶向和细胞DNA序列之间的碱基配对不匹配都可影响重组反应。例如，优选在FPIC基因靶向置换载体中的第一条和第三条DNA序列与细胞内源基因组DNA序列是100％同源的，次优选的是80％的同源，更次优选的是50％的同源。第二条和第四条DNA序列一般对细胞内源基因组DNA序列是非同源的，因此含有这些序列就不能接受位点特异性同源重组。
在特定的情况下，在发生在FPIC基因靶向载体和细胞内源基因组靶DNA序列之间的位点特异同源重组过程中，去除已经掺入至细胞基因组中的DNA序列是有益的。这是由于这些序列的表达可潜在的负面影响细胞或生物体的活力和生存。可选择地，导入宿主细胞基因组中的调控元件反过来可影响与这些元件并排的内源位点的表达。从宿主基因组中去除序列可能通过许多方法。Cre-Lox技术可成功地用于经FPIC基因靶向载体和技术去除已导入细胞内源基因组DNA中的特异序列(Cre-Lox的综述见Ryding等人，(2001)，J.Endocrinol.，171，1)。例如，编码阳性可选择标记物的序列和相应的调控元件在细胞转化前可侧向位于FPIC基因靶向载体的Lox P重组位点。将这些序列导入宿主细胞基因组中后，Cre重组酶的暂时或稳定表达将可以去除一个Lox P位点和所有定位在Lox P位点之间的所有序列。存在许多去除序列的Cre-Lox技术的应用实例。Kaartinen等人已经证明经腺病毒感染16细胞期桑椹胚通过暂时表达Cre可去除侧向1ox P位点的新霉素磷酸转移酶基因盒(Kaartinen等人，(2001)，Genesis，31，126)。Xu等人通过在Ella启动子控制下与表达Cre小鼠的杂交以及对含有Cre表达质粒的基因盒的细胞进行前核注射，可成功地去除侧向于新霉素磷酸转移酶基因盒的lox P(Xu等人(2001)，Genesis，30，1)。因此，如果FPIC基因靶向载体被配置以置换或纠正缺陷的细胞外显序列，如为了进行人体基因治疗，转录的序列和相应的第二条DNA序列的调控元件可在完成FPIC基因靶向载体和宿主DNA之间的位点特异同源重组后被去除。
在此公开的FPIC基因靶向载体和方法可用于在植物中突变DNA序列。实际上，存在有植物谱系中的几个同源重组的实例(Siebert等人，(2002)，Plant Cell，14，1121，综述见Schaefer，(2002)，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol Biol.，53，477)。另外，所述的同源重组已经使用阳性-阴性选择技术被用来靶向几种植物位点，包括乙醇脱氢酶和原卟啉原氧化酶(PPO)位点(Xiaohui等人，(2001)，Gene，272，249；Hanin等人，(2001)，Plant J.，28，671)。假定有许多抗性标记物，它们可用来实施FPIC基因靶向方法，以经位点特异性同源重组产生突变的DNA序列。这些标记物包括新霉素磷酸转移酶，以及任何除草剂或杀虫剂抗性位点，其中这些位点在导入植物细胞的过程中可容受阳性可选择的特征。在使用FPIC基因靶向载体和方法建立的植物中的突变通过导入外源调控元件，可在内源位点表达水平上包括丧失功能，获得功能或修饰。丧失功能或获得功能的突变可通过去除特异的内源DNA序列或改变序列而产生，所述的序列改变可改变特异植物基因编码的氨基酸组成。另外，“敲入”(knock-in)实验可在植物中实施，通过使用FPIC基因靶向载体和方法将外源基因或编码区导入到一个内源位点中。
FPIC基因靶向载体导入植物细胞中，可通过许多方法实现，包括以前在将外源DNA插入原生质体中时所建立的方法(Hain等人，(1985)，Mol.Gen.Genet.，199，161；Negrutiu等人，(1987)，Plant Mol.Biol.，8，363；Paszkowski等人，(1984)，EMBO J.，3，2717)。微注射也可成功地将FPIC基因靶向载体导入植物细胞中(Dela Pena等人，(1987)，Nature，325，274；Crossway等人(1986)，Mol.Gen.Genet.，202，179)。另外，可能经脂质体介导的转染将FPIC基因靶向载体导入植物细胞中(Deshayes等人，(1985)，EMBO J.，4，2731)。在成功地将FPIC基因靶向载体导入植物细胞的过程中，位点特异性同源重组可根据FPIC基因靶向载体的构建和组成形式突变细胞内源基因组DNA序列。
在本发明中所述的细胞分离策略包括通过使用FACStar PlusTM细胞分选仪来进行细胞分选，以及人工分离技术，但本发明不限于这种仪器或其他分离技术(图1)。其他的细胞分选仪器也可用来有效的分离表达特异DNA序列或反之其他独特DNA序列的表达的细胞。这些包括但不限于FACS Vantage SE I，和FACS Vantage SE 11或能够基于本发明中所描述的方法进行分选细胞的任何仪器。
在某些情况下，在细胞内检测特异核苷酸序列存在与否的策略设计使用分子信标。分子信标(molecular beacon)是可在体外和/或体内与特异核苷酸序列结合的核酸或肽核酸结合物。分子信标与靶核苷酸序列的结合经常可引起特异波长光的发射，这依赖于分子信标的设计(Tyagi等人，(1996)，Nature Biotechnol.，14，303；Tyagi等人，(1998)，Nature Biotechnol.，16，49；Vet等人，(1999)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，6394；Kostrikis等人，(1998)，Science，279，1228)。分子信标典型地包括一条对两个互补的臂序列中内含的靶核苷酸特异的寡核苷酸序列。其他类型的分子信标包括经常为了添加的稳定性与蛋白或氨基酸序列结合的序列。荧光基团如EDANS与5’磷酸基团结合，淬灭剂如DABCYL与3’羟基基团结合。不同的荧光基团和DABCYL对其的淬灭效率的实例列在表V。在分子信标序列与靶序列结合的过程中，淬灭剂和荧光基团是分离的，因此可使荧光具有特异的波长。荧光可有效的在体外或体内鉴定特异靶核苷酸序列的存在与否。可以使用与分子信标探针结合的染料如与SybGreenTM标记物结合的染料。
表V.分子信标中DABCYL对不同荧光基团的淬灭作用
| 荧光基团 | 最大发射光(nm) | 光谱重叠(10-15M-1cm3 | 淬灭效率(％) |
| 香豆素 | 475 | 1.28 | 99.3 |
| EDANS | 491 | 1.12 | 99.5 |
| 荧光素 | 515 | 1.02 | 99.9 |
| 荧光黄 | 523 | 0.87 | 99.2 |
| BODIPY | 525 | 0.85 | 95.0 |
| 曙红 | 543 | 0.55 | 98.2 |
| 四甲基若丹明 | 575 | 0.15 | 98.7 |
| 德克萨斯红 | 615 | 0.01 | 99.1 |
分子信标技术可用于在活细胞中鉴定特异的核苷酸序列。电穿孔，脂质转染(lipofection)和磷酸钙沉淀法已经成功地用于将分子信标导入活细胞内(Matsuo，(1998)，Biochim.Biophys.Acta，1379，178；Sazani等人，(2001)，Nucleic Acids Res.，29，3965；Doyle等人，(2001)，40，53；Dirks等人，(2001)，Histochem.Cell BioL，115，3)。FPIC基因靶向策略可以使用所有这些方法或其中之一，成功地将分子信标探针导入细胞中以鉴定在这些细胞中存在的特异核苷酸序列。
FPIC基因靶向载体用于FPIC基因靶向法，用来筛选含有第二条DNA序列的转化靶细胞。这样的筛选步骤实质上可富集那些已发生同源重组的转化靶细胞。如在此所使用的，“实质上的富集作用”是指相比于同源转化体与非同源转化体中的比例，至少富集两倍的转化靶细胞，优选10倍的富集，更优选的1000倍的富集，最优选的10,000倍富集，也就是转化靶细胞与转化细胞的比例。在一些情况下，同源重组与随机整合相比的频率是大约1000中出现1次，在某些情况下，低于10,000个转化细胞中出现1次。通过FPIC基因靶向载体和本发明的方法获得的实质上的富集作用经常可产生一些细胞群，其中大约1％，更优选大约20％，最优选大约95％的收获细胞群含有转化的靶细胞，其中在转化的靶细胞中FPIC基因靶向载体已经被同源整合。这种实质上富集的转化靶细胞群然后被用于随后的基因操作，细胞培养实验或产生转基因生物体，如转基因动物或植物。
下面理论上的实施例作为实施例而被展示，并不能解释为对本发明范围的一种限制。
实施例1
采用FPIC基因靶向载体在胚胎干细胞中灭活ptch2位点
1.ptch2靶向载体的构建
ptch2是一个跨膜功能区受体，据推测在胚胎发育和出生后的过程中参与刺猬的信号转导的调控(Motoyama等人，(1998)，Nat.Genet.，18，104；Carpenter等人，PNAS，95，13630，每一篇在此都合并作为参考文献)。ptch2靶向载体可从λ噬菌体小鼠基因组DNA文库中，采用噬菌体克隆而构建，所述的噬菌体含有横跨外显子5至11的基因组序列，这个区域包含ptch2受体的跨膜区2至8(图4)。简言之，理论上1.7kb的同源区3’区域，在此是指第一条DNA序列，可从ptch2噬菌体克隆中分离的基因组DNA通过PCR扩增，并侧向于Kpn1和Not1位点。该片段可被亚克隆进pPOLYLINKER质粒，该质粒此后称为pPolylinkerl.7。理论上同源区的5’区域含有外显子5，6以及外显子7的大多数5’区域，在此称为第三条DNA序列，可用限制性酶BamHl和Ncol从基因组克隆中去除，用Klenow片段DNA聚合酶填平，并将平端亚克隆进pPolylinkerl.7的Hpa1位点，以产生这里称为pPolylinkerl.7upper的质粒。编码抗生素抗性标记物新霉素磷酸转移酶的DNA片段，在磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子的控制下，在此是指第二条DNA序列，随后被插入同源区5’和3’区域之间，以取代跨膜功能区2、3和4的编码区，从而使受体灭活，并产生被称为P2的质粒。在巨细胞病毒(CMV)启动子控制下，编码转录的但无功能序列的DNA片段，在此是指第四条DNA序列，可被亚克隆进同源区5’区域上游，因此产生在此称为P2TV的载体。
2.用ptch2靶向载体转化胚胎干细胞
存在于靶向载体的3’末端和同源区3’端下游的Not1位点可用来在胚胎干细胞(ES)进行细胞转化前进行线性化。100μg P2TVG载体被线性化，苯酚/氯仿提取，乙醇沉淀，并在胚胎干细胞转化前重悬在无菌蒸馏水中，浓度为1μg/μl。干细胞在明胶包被的10cm培养板，于M15培养基中在37℃，5％CO2增殖至大约50％融合，所述的培养基在Dulbecco′s最小限制性培养基(DMEM)中含有15％FCS，0.1mM非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠，10-4Mβ-巯基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，50μg/ml青霉素，50μg/ml链霉素，1000U/ml LIF。细胞在无血清DMEM中冲洗，并以每个10cm培养板的胚胎干细胞，用8μg线性化载体采用LipofectamineTM试剂通过脂质转染技术根据生产厂商的说明书(Invitrogen Corp.；Carlsbad CA)转化细胞。在转染后24至48小时，细胞或者被收获在FACStar PlusTM细胞分选仪中分离，或是如下所述进行抗生素选择。细胞的收获包括在无菌蒸馏磷酸盐缓冲盐水(PBS)中冲洗两次，然后用1ml 0.05％胰蛋白酶/EDTA，在每个10cm培养板中胰蛋白酶消化15分钟。去除剩余的胰蛋白酶，细胞重新悬浮在细胞分选缓冲液中，缓冲液PBS中含有1mM EDTA，25mM HEPES，pH7.0和1％透析的FCS，细胞密度为10×106细胞/毫升。在分选之前细胞在5％CO2中保持在冰上。
3.导入细胞内分子信标
a)用P2TVG转染的胚胎干细胞置于200μg/ml遗传霉素(geneticin)(G418)中进行选择，筛选已经被稳定地掺入阳性可选择标记物新霉素磷酸转移酶的细胞。细胞被选择12天，阳离子脂质转染，磷酸钙，自由摄取或电穿孔步骤被用于实现分子信标探针的导入，该探针在第四条DNA序列中包含的结构性启动子的控制下可特异性地与转录的无功能序列杂交。分子信标探针与这些转录的无功能序列的杂交可发出特异波长的荧光发射光，它是用来检测的特异分子信标的独特特性。
b)可选择地，分子信标探针可在转染后48小时被导入细胞中，随后收获胚胎干细胞用FACS细胞分选仪进行分离。
4.分离ptch2靶向和非靶向的胚胎干细胞
如上所述收获胚胎干细胞，并在FACS细胞分选仪中进行大容量分选，分离由于与含有分子信标探针的第四条DNA序列转录物特异杂交而发出荧光的细胞。不包括荧光细胞的已分选细胞群和未分选细胞被铺板，随后分离DNA并测定基因型。这些细胞的增殖在200μg/ml遗传霉素(G418)的选择条件下进行，筛选已经稳定地掺入了阳性可选择标记物新霉素磷酸转移酶的细胞。
5.通过位点特异性同源重组对ptch2突变进行基因型确认
基因组DNA可从分选的胚胎干细胞群和/或未分选的阴性对照细胞中通过下面的方法分离。细胞在10cm培养板中生长至大约80％融合，在培养板中直接加入1ml含有100mM氯化钠，50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM EDTA和0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)的裂解缓冲液。细胞在室温下孵育15分钟，转移至1.5ml Eppendorf管中，并在55℃轻轻振摇孵育过夜。裂解物用等容积的1∶1苯酚/氯仿提取两次，用氯仿提取一次。用等容积的异丙醇沉淀基因组DNA。在15000xg离心后，基因组DNA沉淀物重悬浮在300μl无菌蒸馏水中。
每个样品中的基因组DNA可以通过PCR进行基因定型，采用对PGK启动子序列特异的寡核苷酸引物和对正在同源区3’端下游的序列特异的寡核苷酸引物(图4)。20pmole每种寡核苷酸与100ng基因组DNA在终浓度为200μM的每种dNTP，2.5mM MgCl2，IX PCR缓冲液和1U Taq DNA聚合酶(Invitrogen Corp.)存在下混合在一起。通过使用下列的循环参数进行扩增：94.0℃ 2分钟，然后进行35个循环的96℃30秒，58℃ 30秒和72℃ 2.5分钟。反应产物和1kb的梯度分子量标准品一起在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶用溴化乙锭染色以进行PCR产物的紫外线检测。检测到1.7kb PCR产物表明通过实施FPIC基因靶向技术获得了正确的基因靶向。
实施例2
采用FPIC基因靶向载体灭活胚胎干细胞中的paraxis位点
1.paraxis靶向载体的构建
paraxis是一个碱性的螺旋-转角-螺旋转录因子，涉及控制哺乳动物胚胎发育过程中的体节形成(Burgess等人，(1995)，168，296；Burgess等人，(1996)，Nature，384，570；Barnes等人，(1997)，Devel.Biol.，189，95，每一篇在此合并为参考文献)。阳性-阴性选择paraxis靶向载体的构建以前已经有所描述(Burgess等人，见前，1996)。这个载体可被修饰，成功地和有效地实施FPIC靶向技术。
paraxis基因组组成形式包括被一个5kb内含子分隔的两个外显子(图5)。第一个外显子含有起始蛋氨酸密码子和可进行DNA结合和二聚化的碱性螺旋-转角-螺旋(bHLH)功能区。第一个外显子可选择被删除以去除通过bHLH功能区而包含起始蛋氨酸的序列，因此可灭活paraxis蛋白产物。3.0kb的同源区5’区域，在此是指第一条DNA序列，可用于paraxis位点5’末端的同源重组。2.0kb的同源区3’区域，在此是指第三条DNA序列，可用于paraxis位点3’末端的同源重组。在PGK启动子控制下的新霉素磷酸转移酶，在此是指第二条DNA序列，用于取代外显子1的大部分，以及内含子1的5’区域(图5)。FPIC基因靶向载体的第四条DNA序列表现为CMV启动子，它可驱动与分子信标探针特异杂交的无功能序列的转录。含有这些序列的载体在所述的顺序中是指PTV-1。
2.用paraxis靶向载体转化胚胎干细胞
胚胎干细胞生长至大约50％融合，用4μg线性化的PTV-1转染。如上所述根据生产厂商的说明书(Invitrogen Corp.)经脂质转染法完成转染。
3.导入细胞内分子信标
a)用PTV-1转染的胚胎干细胞置于200μg/ml遗传霉素(G418)的选择条件下，筛选已稳定掺入阳性可选择标记物新霉素磷酸转移酶的细胞。细胞被选择12天，阳离子脂质转染，磷酸钙沉淀，电穿孔或自由摄取的步骤被用于实现分子信标探针的导入，该探针在第四条DNA序列中包含的结构性活性启动子的控制下可特异性地与转录的无功能序列杂交。分子信标探针与这些转录的无功能序列的杂交可发出特异波长的荧光发射光，它是用来检测的特异分子信标的独特特性。
b)可选择地，分子信标探针在转染后48小时被导入细胞内，然后收获胚胎干细胞经FACS细胞分选仪进行分离。
4.从未靶向的胚胎干细胞中分离靶向的paraxis
收获细胞，如上所述进行或不进行抗生素选择，并在FACS细胞分选仪中进行大容量分选，从不发生荧光的细胞中分离发荧光者。分选的无荧光细胞群被以10×106细胞/10cm培养板的密度铺板，然后增殖至80％融合以分离DNA和基因定型。这些细胞的增殖在200μg/ml遗传霉素(G418)的选择条件下进行，筛选已经稳定地掺入了阳性可选择标记物新霉素磷酸转移酶的细胞。
5.通过位点特异性同源重组对paraxis突变进行基因型确认
基因组DNA从分选的胚胎干细胞群或未分选的阴性对照细胞如上所述被分离。这些样品中的基因组DNA，随后通过PCR使用寡核苷酸引物进行基因定型，所述的引物对neo编码序列3’端的牛生长激素多腺苷酸化信号和正在同源区3’端下游的序列特异的寡核苷酸是特异的(图5)。反应体积和条件如上所述，除此之外，引物退火温度为55℃。反应产物与1kb梯度分子量标准品一起在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶用溴化乙锭染色以进行PCR产物的紫外线检测。使用来自样品细胞群的DNA检测到的被分选可使细胞发荧光的1.5kb PCR产物显示有位点特异性同源重组和成功的基因靶向作用。
尽管本发明就以上的实例进行了描述，但可以理解的是各种修饰和变化包含在本发明的精神和范围之内。相应地，本发明仅通过下面的权利要求被限制。
Claims (37)
1.一种获得转化细胞的方法，该细胞已经使用FPIC基因靶向载体进行了位点特异性同源重组，该方法包括：
a)在适合载体转化细胞的条件下，将细胞与设计用来进行位点特异同源重组的FPIC基因靶向载体接触，其中所述的载体包括：
第一条DNA序列，与细胞内源基因组序列实质上同源，并能够在所述细胞中进行同源重组，
第二条DNA序列，与细胞内源基因组序列实质上不同源，不能在所述细胞中进行同源重组，所述的第二条DNA序列进一步含有核苷酸序列，能够用于鉴定含所述核苷酸序列的细胞，
第三条DNA序列，与细胞内源基因组序列实质上同源，并能够在所述细胞中进行同源重组，
第四条DNA序列，与细胞内源基因组序列实质上不同源，不能在所述细胞中进行同源重组，所述的第四条DNA序列进一步含有核苷酸序列，能够从不含有所述核苷酸序列的细胞中鉴定和分离出含有所述核苷酸序列的细胞；
b)在选择存在代表所述第二条DNA序列的转录序列和缺少代表第四条DNA序列的转录序列的条件下增殖细胞，从而选择或富集用所述
FPIC基因靶向载体转化的细胞；和
c)从含有所述第四条DNA的细胞中分离含有所述第二条DNA序列的细胞，从而获得已经使用FPIC基因靶向载体接受位点特异同源重组的转化细胞。
2.权利要求1的方法，进一步包括对所述转化细胞的基因组DNA进行定性，该细胞携带有编码阳性可选择标记物的第二条DNA序列，但不携带编码转录的选择特征的第四条DNA序列，该特征是可修饰细胞靶DNA的位点特异同源重组事件所具有的。
3.权利要求1的方法，其中所述的FPIC基因靶向载体包含阳性可选择标记物，可以通过在抗生素的存在下孵育所述细胞，或通过荧光发射光检测到。
4.权利要求1的方法，其中所述的FPIC基因靶向载体包含阴性可选择标记物，可以通过在抗生素的存在下孵育所述细胞检测到。
5.权利要求1的方法，其中所述的FPIC基因靶向载体包含阴性可选择标记物，可以不采用抗生素或药物而检测到。
6.权利要求1的方法，其中所述的细胞是能够同源重组的。
7.权利要求1的方法，其中所述的细胞是多细胞生物体的细胞。
8.权利要求1的方法，其中所述的细胞是植物细胞。
9.权利要求1的方法，其中所述的细胞已经接受了多次位点特异性同源重组，以多次修饰内源细胞基因组。
10.权利要求1的方法，其中所述的转化细胞被用于产生多细胞的生物体。
11.权利要求1的方法，其中所述的细胞是胚胎干细胞。
12.一种用于在可接受同源重组的细胞中进行位点特异同源重组的分离的细胞内荧光探针(FPIC)基因靶向载体，该载体包括：
第一条DNA序列，与细胞内源基因组序列实质上同源，并能够在所述细胞中进行同源重组，
第二条DNA序列，与细胞内源基因组序列实质上不同源，不能在所述细胞中进行同源重组，所述的第二条DNA序列进一步含有核苷酸序列，能够用于鉴定含所述核苷酸序列的细胞，
第三条DNA序列，与细胞内源基因组序列实质上同源，并能够在所述细胞中进行同源重组，
第四条DNA序列，与细胞内源基因组序列实质上不同源，不能在所述细胞中进行同源重组，所述的第四条DNA序列进一步含有核苷酸序列，能够从不含有所述核苷酸序列的细胞中鉴定和分离出含有所述核苷酸序列的细胞，
所述的FPIC基因靶向载体按5’至3’的方向，包含与细胞内源基因组DNA序列实质上同源的第一条DNA序列，第二条DNA序列，与细胞内源基因组DNA序列实质上同源的第三条DNA序列，和第四条DNA序列；和
其中所述的载体能进行位点特异性同源重组，导致细胞内源靶基因组DNA序列的修饰。
13.权利要求12的FPIC基因靶向载体，其中所述的细胞内源基因组靶DNA包含外显子和内含子。
14.权利要求13的FPIC基因靶向载体，其中所述的载体含有所述外显子和内含子的全部或部分，它们与细胞靶基因组DNA序列实质上是同源的。
15.权利要求12的FPIC基因靶向载体，其中所述的载体含有全部或部分的调控元件，它们与细胞靶基因组DNA序列实质上是同源的。
16.权利要求12的FPIC基因靶向载体，其中所述的载体含有与细胞靶基因组DNA序列实质上同源的序列改变，所述的改变包括删除、取代、添加、点突变或其组合。
17.权利要求12的FPIC基因靶向载体，其中所述的第二条DNA序列编码所述细胞中转录的无功能选择特征，并与细胞内源基因组序列不同源，因此不能进行位点特异性同源重组。
18.权利要求12的FPIC基因靶向载体，其中所述的第四条DNA序列编码所述细胞中转录的无功能选择特征，与细胞内源基因组序列不同源，因此不能进行位点特异性同源重组。
19.权利要求12的FPIC基因靶向载体，其中所述的第四条DNA序列包含编码荧光蛋白的核苷酸序列。
20.权利要求19的FPIC基因靶向载体，其中所述的荧光蛋白是GFP，CFP，YFP，RFP，dsRED，或HcRED。
21.权利要求12的FPIC基因靶向载体，其中所述的第二条DNA序列包含编码抗生素抗性标记物的核苷酸序列。
22.权利要求21的FPIC基因靶向载体，其中所述的抗生素抗性标记物是新霉素、嘌呤霉素、杀稻瘟素、博来霉素、梅衣灵或潮霉素。
23.权利要求12的FPIC基因靶向载体，其中所述的第二条DNA序列包含编码荧光蛋白的核苷酸序列。
24.权利要求23的FPIC基因靶向载体，其中所述的荧光蛋白是GFP，CFP，YFP，RFP，dsRED，或HcRED。
25.权利要求12的FPIC基因靶向载体，其中所述的第四条DNA序列包含编码阴性选择剂的核苷酸序列。
26.权利要求25的FPIC基因靶向载体，其中所述的阴性选择试剂是胸苷激酶或白喉毒素A链。
27.权利要求12的FPIC基因靶向载体，其中所述的载体进一步包含第五条DNA序列，它与细胞内源基因组DNA序列不同源，并位于所述第一条和第三条DNA序列的外侧和5’端。
28.权利要求12的FPIC基因靶向载体，其中每一条所述的第四条和第五条DNA序列均编码可选择的转录序列，它可从不含编码所述可选择转录序列的DNA的细胞中分离含有编码所述可选择转录序列的DNA的细胞。
29.权利要求12的FPIC基因靶向载体，其中所述的第一条DNA序列和所述的第三条DNA序列的实质上同源的序列，每一条大约为50个碱基对至50,000个碱基对。
30.权利要求12的FPIC基因靶向载体转化的细胞。
31.权利要求30的细胞，其中所述的载体引起至少一个细胞内源基因组靶DNA序列的修饰。
32.权利要求31的细胞，其中所述的载体将至少一个外源调控元件导入细胞内源基因组靶DNA序列中。
33.权利要求30的细胞，是胚胎干细胞。
34.一种转基因非人动物，是从权利要求31所述的细胞产生的。
35.一种富集细胞群，包括权利要求1所述方法产生的细胞，其中所述的细胞已经经受了位点特异性同源重组。
35.一种非人转基因动物，从权利要求35的细胞产生。
37.一种转基因植物，从权利要求35的细胞产生。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |