CN103468801A - 一种转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法。该检测方法包括如下步骤：针对所研究目的基因的外显子序列设计靶位点，构建TALEN质粒对；将TALEN质粒对显微注射至受精卵的原核或将TALEN质粒对体外转录为mRNA显微注射至受精卵胞质内；将注射成功的受精卵体外培养；巢式PCR扩增培养得到的单个胚胎的目的基因；将经琼脂糖凝胶电泳鉴定的PCR产物进行测序，根据测序套峰出现的比例判断TALEN质粒的敲除效率，即可判断TALEN质粒内源活性的高低。本方法直接对目的细胞进行显微注射，能够直接评价TALEN质粒的内源活性；且排除了细胞转染效率的干扰，能够更准确的评价TALEN质粒的活性高低。
Description
技术领域
本发明涉及一种转录激活子样效应因子核酸酶的检测方法，特别涉及一种转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法。
背景技术
目前用于检测转录激活子样效应因子核酸酶（transcription
activator-like effector nucleases, TALENs）活性的方法，有如下3种：
靶点酶切检测：该方法将TALEN质粒转染细胞系（GFP质粒共转染观察转染效率），提取转染后细胞的基因组，通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）扩增目的DNA，将PCR扩增的DNA片段经限制性酶切，凝胶电泳检测，未打断序列为敲除成功，计算灰度值与对照组相比。该方法的局限性为：（1）TALEN设计时必须已考虑将靶点选择在有特异酶切位点的区域；（2）若FOLK酶剪切位点在酶切位点以外的部分，内切酶仍可发挥作用，检测不到这样的敲除，检测敲除效率的结果比实际偏低。
SURVEYOR突变检测：该方法将TALEN质粒转染细胞系（GFP质粒共转染观察转染效率），提取转染后细胞的基因组，通过PCR扩增目的DNA，将PCR扩增的DNA片段加入外源DNA后将混合物解链-退火，得到异源多聚DNA片段，用异源多聚检测酶（SURVEYOR Nuclease）按试剂盒步骤进行检测，凝胶电泳显示结果，分析结果得到敲除效率。该方法的局限性为：（1）对PCR产物要求高；（2）敲除效率取决于异源多聚DNA片段的形成比例，不能直接反应确切的敲除效率。
Luciferase SSA检测：首先在luciferase的编码区中央插入一个终止子， 此时luciferase 没有活性。将TALEN剪切的靶点位置序列插在终止子后，在TALEN的剪切作用下，靶点位置双链断裂，细胞通过同源重组方式修复DNA，终止子一并剪切掉，重组的luciferase具有活性。通过与参照的比值变化反应TALEN剪切的活性水平。该方法的局限性为：（1）只检测了TALEN的外源性活性，未在特定种属检测其是否具有内源活性；（2）通过参照比较荧光素活性的高低，只能反映TALEN是否具有活性，而敲除效率的高低不能反映。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法，包括如下步骤：针对所研究目的基因的外显子序列设计靶位点，构建TALEN质粒对；将TALEN质粒对显微注射至受精卵的原核或将TALEN质粒对体外转录为mRNA显微注射至受精卵胞质内；将注射成功的受精卵体外培养；巢式PCR扩增培养得到的单个胚胎的目的基因；将经琼脂糖凝胶电泳鉴定的PCR产物进行测序，根据测序套峰出现的比例判断TALEN质粒的敲除效率，即可判断TALEN质粒内源活性的高低。
所述的靶位点的设计优选为包括如下原则：（1）5’端固定碱基T；（2）从5’端起，第1位碱基不能为T，第2位碱基不能为A；（3）GC含量小于40%；(4) 3’端不能为G；（5）左、右臂靶位点16-19bp；（6）左右臂靶位点间隔18-24bp。
所述的受精卵优选为斑马鱼、大鼠、小鼠或猴等的受精卵。
所述的受精卵优选为通过如下方法获取：雌性大鼠超数排卵后，颈椎脱臼处死，75%（v/v）酒精消毒后剪开腹腔，剪下输卵管置于37℃预热的M2液滴中，体式镜下用尖镊将输卵管壶腹部划开，释放出卵丘-卵母细胞复合体；用透明质酸酶消化卵细胞周围的颗粒细胞，M2洗3-5次后，移入覆盖有矿物油的M16培养液中，置于37℃，5%的CO2培养箱培养；取出卵细胞置于显微镜下观察，选出可见清晰原核的受精卵用于显微注射。
所述的显微注射的方法优选为：安装拉制好的持卵针，持卵针通过塑料管连接于装有矿物油的带微调的注射器，通过调节油泵控制卵的位置；安装虹吸有质粒或mRNA的注射针，注射针通过塑料管连接有压力泵的注射仪；根据注射针的出液量调节注射压力，以可见胞质内有明显膨胀而细胞仍能存活为适宜注射量。
所述的体外培养的条件优选为：将注射成功的受精卵用大鼠胚胎培养液37℃，5%的CO2培养箱培养隔天换液，培养3-5天后用于扩增目的基因检测；所述大鼠胚胎培养液的配方为：葡萄糖7.5 mmol/L，L-谷氨酰胺1 mmol/L，NaCl 77 mmol/L，KCl 1.34 mmol/L，MgCl2 0.44
mmol/L，CaCl2 1.78
mmol/L，NaHCO3 25
mmol/L，丙酮酸钠0.59 mmol/L，乳酸钠25 mmol/L，牛血清白蛋白0.3%（质量体积比，g/mL）。
所述的敲除效率的计算公式为：敲除效率=出现套峰样本数/总的测序样本数×100%。
本发明与现有技术相比具有如下优点和效果：
（1）以往的检测方法均是在可传代的细胞系（hepatocellular carcinoma即HCC细胞，293T细胞等）进行外源活性检测，本方法直接对目的细胞（大鼠、小鼠、猴等的受精卵）进行显微注射，能够直接评价TALEN质粒进行靶基因敲除的内源活性。
（2）以往的检测方法有的（Luciferase SSA检测）只能反映活性的有无，不能反映活性的高低；有的受转染效率、酶切位点（靶点酶切检测）或异源多聚DNA片段形成比例（SURVEYOR突变检测）的影响，不能准确反映TALEN质粒的实际敲除效率。本方法通过直接受精卵显微注射，可以直接判断TALEN质粒或质粒转录的mRNA是否注射成功，避免进行质粒的细胞转染这一实验过程，排除了细胞转染效率的干扰，能够更准确的评价TALEN质粒的活性高低。
附图说明
图1是质粒敲除检测结果图，A：未敲除；B：敲除成功。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 质粒的构建与体外转录
在NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）搜索NLRC4基因相关信息，限定物种为大鼠。找到NLRC4的基因序列（Gene ID：298784），在外显子1利用TALEN Targeter （https://boglab.plp.iastate.edu/）按如下原则在线选择TALEN识别的靶位点：（1）5’端固定碱基T；（2）从5’端起，第1位碱基不能为T，第2位碱基不能为A；（3）GC含量小于40%；（4）3’端不能为G；（5）左、右臂靶位点16-19bp；（6）左右臂靶位点间隔18-24bp。外显子1序列如下：
GTGAACTTTATAAAGGAAAACAGCCAAGCCCTTATTCAGAGGATGGGCATAGTGGTTATAAAGCAAATCTGTGATGACCTATTTGCATTGAACGTTCTCAACGGGGAAGAAGTTGCCATCATTTGCAGTCATCGGGTGGAGCAGGACGCTGCACGAGACATCGTCCATATGATTTTGAAGAAGGGCTCAGCGGCCTGCAACCTCTTTCTTAAGAGTCTTGAAAACTGGAACTATCCTGTGTATCAGGACTTAACTGGACACA。
选择的TALEN识别靶位点如上述有下划线标记的序列所示，针对TALEN所识别的靶位点分别构建对应的TALEN质粒的左臂和右臂。TALEN质粒左臂和右臂的构建模块如下表所示：
TALEN左臂的构建：将识别靶位点左臂的前10个组装模块（NN1，NG2，NN3，NI4，NG5，NN6，NI7，HD8，HD9，NG10）连接到骨架载体p-FUS-A；将识别靶位点左臂的后7个组装模块（NI11，NG12，NG13，NG14，NN15，HD16，NI17）连接到骨架载体p-FUS-B7；两者均用限制性内切酶BsaI酶切后，与NG模块一起连接到骨架载体p-TAL3上（限制性内切酶Esp3I酶切线性化）。得到识别NLRC4基因外显子靶位点的TALEN质粒左臂，其中插入序列1836bp。
TALEN右臂的构建：将识别靶位点左臂的前10个组装模块（NN1，HD2，NI3，NI4，NI5，NG6，NN7，NI8，NG9，NN10）连接到骨架载体p-FUS-A；将识别靶位点左臂的后5个组装模块（NN11，HD12，NI13，NI14，NN15，HD15）连接到骨架载体p-FUS-B5；两者均用限制性内切酶BsaI酶切后，与NG模块一起连接到骨架载体p-TAL3上（限制性内切酶Esp3I酶切线性化）。得到识别NLRC4基因外显子靶位点的TALEN质粒右臂，其中插入序列1632bp。
识别特定碱基的组装模块和骨架载体p-FUS-A，p-FUS-B(1-10)，p-TAL3上（均购自addgene公司）。上述TALEN质粒左臂和右臂是通过将连接产物转化到DH5α感受态细胞，涂布LB平板培养得到单菌落，培养单菌落提取质粒得到。TALEN质粒左臂和右臂通过PCR和测序鉴定是否正确；所用鉴定引物为：F：catcgcgcaatgcactgac，R：ggcgacgaggtggtcgttgg，在通过PCR鉴定（扩增条件为：95℃/3min + 35×(95℃/15sec +55℃/15sec + 72℃/3min)+72℃/8min+4˚℃/1min；TALEN质粒左臂扩增片段1800-1900bp，TALEN质粒右臂扩增片段1600-1700bp）正确的质粒通过测序进一步验证。
实施例2 受精卵的获取
雌性大鼠超数排卵后，颈椎脱臼处死，75%（v/v）酒精消毒后剪开腹腔，剪下输卵管置于37℃预热的M2液滴中，体式镜下用尖镊将输卵管壶腹部划开，释放出卵丘-卵母细胞复合体；用透明质酸酶消化卵细胞周围的颗粒细胞，M2洗3-5次后，移入覆盖有矿物油的M16培养液中，置于37℃，5%的CO2培养箱培养。取出卵细胞置于显微镜下观察，选出可见清晰原核的受精卵用于显微注射。
实施例3 显微注射与体外培养
将取出的卵细胞置于显微镜下观察，选出可见清晰原核的受精卵用于显微注射。将TALEN质粒对显微注射至受精卵的原核，或将TALEN质粒体外转录为mRNA后显微注射至受精卵胞质内。
安装拉制好的持卵针，持卵针通过塑料管连接于装有矿物油的带微调的注射器，通过调节油泵控制卵的位置。安装虹吸有质粒或mRNA的注射针，注射针通过塑料管连接有压力泵的注射仪。根据注射针的出液量调节注射压力，以可见胞质内有明显膨胀而细胞仍能存活为适宜注射量。将注射成功的受精卵用大鼠胚胎培养液（葡萄糖7.5 mmol/L，L-谷氨酰胺1 mmol/L，NaCl 77 mmol/L，KCl 1.34 mmol/L，MgCl2 0.44
mmol/L，CaCl2 1.78
mmol/L，NaHCO3 25
mmol/L，丙酮酸钠0.59 mmol/L，乳酸钠25 mmol/L，牛血清白蛋白0.3%（质量体积比，g/mL））于37℃，5%的CO2培养箱培养，隔天换液，培养3-5天后用于扩增目的基因检测。
实施例4 巢式PCR扩增单个胚胎目的基因
将单个胚胎吸入碱性裂解液（200 mM KOH，50 mM 二硫苏糖醇），65℃孵育10分钟后加入中和液（900 mM Tris-HCl pH 8.3，300 mM KCl，200 mM HCl）。在裂解液中加入随机引物（100µM），10×PCR buffer，dNTPs，Taq聚合酶，最后加水至60µL反应体系，92℃变性1分钟，37℃退火2分钟，10秒/度升温至55℃后，55℃延伸4分钟，共50个循环。取上述富集的基因组作模板，加入外侧引物：GATCCCAGTCATGGGCACAA（上游），GTGTGTATGTGTGCGCGTTT（下游），25µL反应体系，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环。进一步取上述PCR产物作模板，加入内侧引物：ACACATACACACACGGCTCA（上游），AGTGTGGACTGCCTCTGAAG（下游），25µL反应体系，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，共30个循环。
实施例5 测序鉴定
将最终PCR产物（279bp）经琼脂糖凝胶电泳鉴定，根据条带大小鉴定扩增成功的PCR产物进行测序分析。当目的基因靶点敲除后，PCR扩增时的模板为杂合，进行扩增后的产物除了目的片段外，还有与目的片段长度相近的片段，用凝胶电泳也无法分离开，这样的两种PCR产物在测序时从靶位点之后的测序结果即会有两种碱基信号，因此结果会出现套峰（图1，左图未见套峰表明质粒未敲除，右图可见套峰表明质粒敲除成功）。根据所检测样本中套峰出现的比例，即可直接判断该TALEN质粒的敲除效率。计算公式如下：敲除效率=阳性样本数（出现套峰样本数）/总的测序样本数×100%。本例中取卵50枚，成功注射后存活40枚，体外培养后送测样本35个，出现套峰样本3个，敲除效率为：3/35×100%=8.57%。敲除效率的高低直接反应TALEN质粒内源活性的高低。选择活性高的质粒进行后续的基因敲除动物实验。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉大学
<120> 一种转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法
<130> 1
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 262
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<400> 1
gtgaacttta taaaggaaaa
cagccaagcc cttattcaga ggatgggcat agtggttata
60
aagcaaatct gtgatgacct
atttgcattg aacgttctca acggggaaga agttgccatc
120
atttgcagtc atcgggtgga
gcaggacgct gcacgagaca tcgtccatat gattttgaag
180
aagggctcag cggcctgcaa
cctctttctt aagagtcttg aaaactggaa ctatcctgtg
240
tatcaggact taactggaca ca
262
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴定引物F
<400> 2
catcgcgcaa tgcactgac
19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 鉴定引物R
<400> 3
ggcgacgagg tggtcgttgg
20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 外侧上游引物
<400> 4
gatcccagtc atgggcacaa
20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 外侧下游引物
<400> 5
gtgtgtatgt gtgcgcgttt
20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 内侧上游引物
<400> 6
acacatacac acacggctca
20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 内侧下游引物
<400> 7
agtgtggact gcctctgaag
20
Claims (7)
1.一种转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法，其特征在于包括如下步骤：针对所研究目的基因的外显子序列设计靶位点，构建TALEN质粒对；将TALEN质粒对显微注射至受精卵的原核或将TALEN质粒对体外转录为mRNA显微注射至受精卵胞质内；将注射成功的受精卵体外培养；巢式PCR扩增培养得到的单个胚胎的目的基因；将经琼脂糖凝胶电泳鉴定的PCR产物进行测序，根据测序套峰出现的比例判断TALEN质粒的敲除效率，即可判断TALEN质粒内源活性的高低。
2.根据权利要求1所述的转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法，其特征在于：所述的靶位点的设计包括如下原则：（1）5’端固定碱基T；（2）从5’端起，第1位碱基不能为T，第2位碱基不能为A；（3）GC含量小于40%；(4) 3’端不能为G；（5）左、右臂靶位点16-19bp；（6）左右臂靶位点间隔18-24bp。
3.根据权利要求1所述的转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法，其特征在于：所述的受精卵为斑马鱼、大鼠、小鼠或猴的受精卵。
4.根据权利要求1所述的转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法，其特征在于：所述的受精卵通过如下方法获取：雌性大鼠超数排卵后，颈椎脱臼处死，75%酒精消毒后剪开腹腔，剪下输卵管置于37℃预热的M2液滴中，体式镜下用尖镊将输卵管壶腹部划开，释放出卵丘-卵母细胞复合体；用透明质酸酶消化卵细胞周围的颗粒细胞，M2洗3-5次后，移入覆盖有矿物油的M16培养液中，置于37℃，5%的CO2培养箱培养；取出卵细胞置于显微镜下观察，选出可见清晰原核的受精卵用于显微注射。
5.根据权利要求1所述的转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法，其特征在于：所述的显微注射的方法为：安装拉制好的持卵针，持卵针通过塑料管连接于装有矿物油的带微调的注射器，通过调节油泵控制卵的位置；安装虹吸有质粒或mRNA的注射针，注射针通过塑料管连接有压力泵的注射仪；根据注射针的出液量调节注射压力，以可见胞质内有明显膨胀而细胞仍能存活为适宜注射量。
6.根据权利要求1所述的转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法，其特征在于：所述的体外培养的条件为：将注射成功的受精卵用大鼠胚胎培养液37℃，5%的CO2培养箱培养隔天换液，培养3-5天后用于扩增目的基因检测；所述大鼠胚胎培养液的配方为：葡萄糖7.5 mmol/L，L-谷氨酰胺1 mmol/L，NaCl
77 mmol/L，KCl 1.34 mmol/L，MgCl2
0.44 mmol/L，CaCl2 1.78 mmol/L，NaHCO3 25 mmol/L，丙酮酸钠0.59 mmol/L，乳酸钠25 mmol/L，牛血清白蛋白0.3%。
7.根据权利要求1所述的转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法，其特征在于：所述的敲除效率的计算公式为：敲除效率=出现套峰样本数/总的测序样本数×100%。
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|---|---|---|---|---|
| WO2011101696A1 (en) * | 2010-02-18 | 2011-08-25 | Cellectis | Improved meganuclease recombination system |
| CN102839156A (zh) * | 2012-08-15 | 2012-12-26 | 华东师范大学 | 一种在小鼠胚胎细胞中基因定点突变的构建方法 |
-
2013
- 2013-08-27 CN CN2013103757837A patent/CN103468801A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Non-Patent Citations (1)
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