RU2817017C2

RU2817017C2 - Трансгенные животные и трансгенные эмбрионы, продуцирующие сконструированную нуклеазу

Info

Publication number: RU2817017C2
Application number: RU2021106372A
Authority: RU
Inventors: Гоо ДЗАНГ; Соо Янг ЮМ; Гиеонг Мин ГИМ; Вон Ю ЛИ; Дзи Хиун ПАРК
Original assignee: Ларт Био Ко., Лтд.
Priority date: 2018-08-16
Filing date: 2019-08-14
Publication date: 2024-04-09

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к трансгенному животному бычьих, содержащему первую клетку, имеющую геном, содержащий первый инструмент, который содержит полинуклеотид, кодирующий белок Cas9, и последовательность инвертированного концевого повтора (ITR) на 5’-конце и 3’-конце указанного первого инструмента, и вторую клетку, имеющую геном, содержащий второй инструмент, который содержит полинуклеотид, кодирующий направляющую РНК, способную к специфическому связыванию с целевым сайтом, и ITR последовательность на 5’-конце и 3’-конце указанного второго инструмента, а также к бычьему эмбриону. При этом целевым сайтом является эндополинуклеотид указанного животного, или экзополинуклеотид, включенный в геном указанного животного и расположенный между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью. Изобретение обеспечивает более эффективную манипуляцию с генами с применением трансгенного животного или трансгенного эмбриона, в котором могут быть экспрессированы компоненты сконструированной нуклеазы. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 58 ил., 19 табл., 6 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Подробности, раскрытые в настоящем описании, относятся к трансгенному животному и трансгенному эмбриону, которые продуцируют компоненты сконструированной нуклеазы.

В частности, подробности, раскрытые в настоящем описании, относятся к химерному трансгенному животному и химерному трансгенному эмбриону, геном которых включает полинуклеотид, кодирующий компонент сконструированной нуклеазы.

Более конкретно, подробности, раскрытые в настоящем описании, относятся к трансгенному животному и трансгенному эмбриону, которые включают первую клетку, имеющую геном, в котором полинуклеотид, кодирующий компонент сконструированной нуклеазы, расположен в первом локусе; и вторую клетку, имеющую геном, в котором полинуклеотид, кодирующий компонент сконструированной нуклеазы, расположен во втором локусе, который отличается от первого локуса.

Кроме того, подробности, раскрытые в настоящем описании, относятся к трансгенному животному и трансгенному эмбриону, которые включают первую клетку, имеющую геном, в котором первый полинуклеотид, кодирующий компонент сконструированной нуклеазы, расположен в первом локусе; и вторую клетку, имеющую геном, в котором второй полинуклеотид, кодирующий компонент сконструированной нуклеазы, расположен в первом локусе. В этом случае последовательность первого полинуклеотида отличается от последовательности второго полинуклеотида.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Современная тенденция заключается в том, что манипуляции с генами с использованием средства генной инженерии, включая CRISPR/Cas9, применяются к различным видам животных и растений.

Традиционные манипуляции с генами основывались на способе предоставления средства генной инженерии клетке или индивиду извне. Однако у этого способа есть проблема в том, что эффективность манипуляций с генами является низкой, когда средство генной инженерии вводят в клетку или индивиду извне.

Когда применяют трансгенное животное, имеющее геном, в который вставлен ген, кодирующий средство генной инженерии, средство генной инженерии может экспрессироваться в животном или клетке, тем самым давая более высокую эффективность манипуляций с генами.

Дополнительно, когда применяют трансгенное животное, имеющее геном, в который вставлен ген, кодирующий средство генной инженерии, может быть получено множество животных с нокином или нокаутом различных генов. Через вышеизложенное, трансгенное животное, имеющее геном, в который вставлен ген, кодирующий средство генной инженерии, может применяться в качестве платформенной технологии.

Кроме того, когда трансгенным животным является крупное животное, применимость может быть лучше, чем у мелкого животного.

Поэтому существует необходимость в разработке большого животного, имеющего геном, в которой вставлен ген, кодирующий средство генной инженерии, однако, манипуляция с генами в больших животных прогрессирует медленнее из-за технических ограничений, по сравнению с мелкими животными.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[Техническая проблема]

В одном варианте, настоящее раскрытие относится к трансгенному животному, которое включает полинуклеотид, который кодирует компоненты сконструированной нуклеазы.

В другом варианте, настоящее открытие относится к трансгенному эмбриону, который включает полинуклеотид, который кодирует компоненты сконструированной нуклеазы.

Объектом настоящего раскрытия является обеспечение более эффективной манипуляции с генами с применением трансгенного животного или трансгенного эмбриона, в котором могут быть экспрессированы компоненты сконструированной нуклеазы.

Другим объектом настоящего раскрытия является получение множества клеток, эмбрионов и/или животных с нокином или нокаутом разных генов с применением трансгенного животного или трансгенного эмбриона, в которых могут быть экспрессированы компоненты сконструированной нуклеазы.

[Техническое решение]

Согласно одному аспекту настоящего раскрытия, в данном изобретении представлено трансгенное животное, содержащее первую клетку, которая имеет геном, включающий первый инструмент, и вторую клетку, которая имеет геном, включающий второй инструмент,

где первый инструмент и второй инструмент включают, по меньшей мере, один из полинуклеотидов, кодирующих РНК-направляемую эндонуклеазу и полинуклеотидов, кодирующих направляющую нуклеиновую кислоту, которая может специфически связываться с целевым сайтом, соответственно,

где целевым сайтом является эндополинуклеотид животного или экзополинуклеотид, расположенный между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью, включенной в геном животного,

где первый инструмент присутствует в первом локусе генома первой клетки, второй инструмент присутствует во втором локусе генома второй клетки, и первый локус отличается от второго локуса.

Согласно другому аспекту настоящего раскрытия, в данном изобретении представлено трансгенное животное, содержащее первую клетку, которая имеет геном, включающий первый инструментарий, и вторую клетку, которая имеет геном, включающий второй инструментарий,

где первый инструмент и второй инструмент содержат, по меньшей мере, один из полинуклеотидов, кодирующих РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотидов, кодирующих направляющую нуклеиновую кислоту, которые могут специфически связываться с целевым сайтом, соответственно,

где последовательность первого инструмента отличается от последовательности второго инструмента, первый инструмент присутствует в первом локусе генома первой клетки, второй инструмент присутствует во втором локусе генома второй клетки, и первый локус является таким же, как и второй локус.

Согласно одному аспекту настоящего раскрытия, в данном изобретении представлен трансгенный эмбрион, содержащий первую клетку, которая имеет геном, включающий первый инструментарий, и вторую клетку, которая имеет геном, включающий второй инструментарий,

где целевым сайтом является эндополинуклеотид эмбриона или экзополинуклеотид, расположенный между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью, включенной в геном эмбриона,

Согласно другому аспекту настоящего раскрытия, настоящее изобретение представляет трансгенный эмбрион, содержащий первую клетку, которая имеет геном, включающий первый инструментарий, и вторую клетку, которая имеет геном, включающий второй инструментарий,

где экзополинуклеотид расположен между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью в геноме трансгенного эмбриона,

Согласно одному аспекту настоящего раскрытия, в настоящем изобретении представлено трансгенное животное, содержащее первую клетку, которая имеет геном, включающий первый инструментарий и целевой сайт, и вторую клетку, которая имеет геном, включающий второй инструментарий и модифицированный сайт,

где целевой сайт включает первую область, вторую область и третью область,

где первая область расположена на 5’ конце второй области, и третья область расположена на 3’ конце второй области,

где модифицированный сайт включает четвертую область, пятую область и шестую область,

где четвертая область расположена на 5’ конце пятой области, и шестая область расположена на 3’ конце пятой области,

где последовательность первой области такая же, как последовательность четвертой области,

где последовательность третьей области такая же, как последовательность шестой области,

где последовательность второй области отличается от последовательности пятой области.

Согласно другому аспекту настоящего раскрытия, настоящее изобретение представляет трансгенный эмбрион, содержащий первую клетку, которая имеет геном, включающий первый инструментарий и целевой сайт, и вторую клетку, которая имеет геном, включающий второй инструментарий и модифицированный сайт,

Согласно одному аспекту настоящего раскрытия, настоящее изобретение представляет способ получения трансгенного эмбриона, в котором экспрессируется компонент сконструированной нуклеазы, где способ включает микроинъекцию вектора в оплодотворенную яйцеклетку или эмбрион,

где вектор включает транспозонный ген и полинуклеотид, кодирующий компоненты сконструированной нуклеазы,

где вектором является плазмидный вектор или вирусный вектор.

Согласно другому аспекту настоящего раскрытия, настоящее изобретение представляет способ получения трансгенного эмбриона, в котором экспрессируется компонент сконструированной нуклеазы, где способ включает:

i) получение трансгенной донорной клетки, в которой экспрессируется компонент сконструированной нуклеазы; и

ii) трансплантацию ядра трансгенной донорной клетки в энуклеированную яйцеклетку.

Согласно первому аспекту настоящего раскрытия, настоящее изобретение представляет способ получения трансгенного животного, в котором экспрессируется компонент сконструированной нуклеазы, где способ включает:

i) получение трансгенного эмбриона, в котором экспрессируется компонент сконструированной нуклеазы; и

ii) трансплантацию трансгенного эмбриона в матку суррогатной матери.

Согласно одному аспекту настоящего раскрытия, настоящее изобретение представляет способ получения эмбриона, имеющего геном, который включает редактирование генома, происходящее в целевом сайте, присутствующем в геноме, где способ включает обеспечение направляющей нуклеиновой кислоты, способной связываться с целевым сайтом в оплодотворенной яйцеклетке или эмбрионе,

где оплодотворенная яйцеклетка или эмбрион имеет геном, включающий полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу,

где направляющая нуклеиновая кислота имеет форму РНК, или форму, включенную в плазмидный вектор или вирусный вектор.

Согласно другому аспекту настоящего раскрытия, настоящее изобретение представляет способ получения эмбриона, имеющего геном, который включает редактирование генома, происходящее в целевом сайте, присутствующем в геноме, где способ включает:

i) получение трансгенной донорной клетки, имеющей геном, включающий полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и редактирование генома, которое происходит в целевом сайте, присутствующем в геноме; и

Согласно первому аспекту настоящего раскрытия, настоящее изобретение представляет способ получения животного, имеющего геном, который включает редактирование генома, происходящее в целевом сайте, присутствующем в геноме, где способ включает:

i) получение эмбриона, имеющего геном, включающий полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и редактирование генома, происходящее в целевом сайте, присутствующем в геноме; и

ii) трансплантацию эмбриона в матку суррогатной матери.

Согласно еще одному аспекту настоящего раскрытия, настоящее изобретение представляет способ получения эмбриона, имеющего геном, который включает редактирование генома происходящее в целевом сайте, присутствующем в геноме, где способ включает предоставление, по меньшей мере, одного или материалов и условий, способных воздействовать на экспрессию контрольного элемента в оплодотворенной яйцеклетке или эмбрионе,

где оплодотворенная яйцеклетка или эмбрион имеет геном, включающий:

i) полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу;

ii) полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, способную связываться с целевым сайтом; и

iii) элемент контроля экспрессии, который расположен в, по меньшей мере, одном из 5’ конца полинуклеотида, кодирующей РНК-направляемую эндонуклеазу, и 5’ конца полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновой кислоты.

Согласно первому аспекту настоящего раскрытия, настоящее изобретение представляет способ получения эмбриона, имеющего геном, который включает редактирование генома происходящее в целевом сайте, присутствующем в геноме, где способ включает:

i) получение трансгенной донорной клетки, имеющей геном,

где геном включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, способную связываться с целевым сайтом, элемент контроля экспрессии, который расположен в, по меньшей мере, одном из 5’ конца полинуклеотида, кодирующей РНК-направляемую эндонуклеазу, и 5’ конца полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновой кислоты,

где геном включает редактирование генома, которое происходит в целевом сайте, присутствующем в геноме; и

Согласно еще одному аспекту настоящего раскрытия, настоящее изобретение представляет способ получения животного, имеющего геном, который включает редактирование генома происходящее в целевом сайте, присутствующем в геноме, где способ включает:

i) получение эмбриона, имеющего геном,

[Эффекты изобретения]

Согласно технологии, раскрытой в настоящем описании, возникают следующие эффекты.

Согласно варианту, раскрытому в настоящем описании, может быть представлено трансгенное животное, которое включает полинуклеотид, который кодирует компонент сконструированной нуклеазы. Дополнительно, может быть представлено трансгенное животное, в котором манипуляция с генами может быть проведена более эффективно. Более того, может быть представлена платформенное трансгенное животное для получения клеток, эмбрионов и/или животных с нокинами или нокаутами разных генов.

Согласно другому варианту осуществления, раскрытому в настоящем описании, может быть представлен трансгенный эмбрион, который включает полинуклеотид, который кодирует компонент сконструированной нуклеазы. Дополнительно, может быть представлен трансгенный эмбрион, в котором манипуляция с генами может проводиться более эффективно. Более того, может быть представлен платформенный трансгенный эмбрион для получения клеток, эмбрионов и/или животных с нокинами и нокаутами разных генов.

[КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ]

На ФИГ. 1 показан инструмент, который включает полинуклеотид, который кодирует компонент сконструированной нуклеазы.

На ФИГ. 2 показаны некоторые варианты осуществления полинуклеотида, который кодирует компонент сконструированной нуклеазы.

На ФИГ. 3 показаны хромосомы, образованные из генома, присутствующего в клетке.

На ФИГ. 4 показано несколько форм инструмента, вставленного в хромосому.

На ФИГ. 5 показана соматическая клетка и зародышевая клетка, которые соответственно имеют геном, в который вставлен инструмент.

На ФИГ. 6 показана 1-клеточная стадия оплодотворенной яйцеклетки, которая имеет геном, в который вставлен инструмент; и эмбрион в 2-клеточной стадии, эмбрион в 4-клеточной стадии, эмбрион в 8-клеточной стадии и эмбрион в 16-клеточной стадии, полученный делением из оплодотворенной яйцеклетки в 1-клеточной стадии.

На ФИГ. 7 показан эмбрион в 2-клеточной стадии, эмбрион в 4-клеточной стадии, эмбрион в 8-клеточной стадии и эмбрион в 16-клеточной стадии, в котором инструмент вставлен в каждый геном некоторых клеток.

На ФИГ. 8 показан: инструмент, который включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу без элемента контроля экспрессии, и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту; и форма, в которой конкретный целевой сайт отщепляется в геноме, в который вставлен инструмент.

На ФИГ. 9 показаны некоторые варианты осуществления инструмента, которые включают элемент контроля экспрессии.

На ФИГ. 10 показаны некоторые варианты осуществления элемента контроля экспрессии.

На ФИГ. 11 показаны некоторые варианты осуществления инструмента, который включает полинуклеотид, имеющий PAM последовательность.

На ФИГ. 12 показан процесс редактирования генома в инструменте, который включает полинуклеотид, имеющий PAM последовательность.

На ФИГ. 13 показан другой процесс редактирования генома в инструменте, который включает полинуклеотид, имеющий PAM последовательность.

На ФИГ. 14 показан еще одни процесс редактирования генома в инструменте, который включает полинуклеотид, имеющий PAM последовательность.

На ФИГ. 15 показан процесс нокина в полинуклеотид, кодирующий целевой белок, и полинуклеотид, кодирующий линкер к донорному полинуклеотиду; и процесс получения целевого белка из клетки, в которой имеется нокин донорного полинуклеотида, или трансгенного животного, которое включает клетку.

На ФИГ. 16 показан способ выбора клеток, имеющих геном, в которой вставлен поверхностный инструмент.

На ФИГ. 17 показан способ выбора клеток, в котором редактирование генома происходит в поверхностном инструменте.

На ФИГ. 18 показан геном, в который вставлен суицидный инструмент, клетка, имеющая геном, в который вставлен суицидный инструмент, форма, в которой происходит редактирование генома в суицидном инструменте, и клетка, в которой происходит редактирование генома в суицидном инструменте.

На ФИГ. 19 показана форма генома, в который вставлен SRY нокаутированный инструмент и геном, в котором SRY ген нокаутирован в геноме, в который вставлен SRY нокаутированный инструмент.

На ФИГ. 20 показаны геномы, в которые вставлен Инструмент классификации XY хромосомы, и способ, в котором эмбрионы, имеющие XX хромосому, и эмбрионы, имеющие XY хромосому классифицированы инструментом классификации XY хромосомы.

На ФИГ. 21 показан вариант осуществления исключающего инструмента, в котором экспрессия транспосазы может контролироваться индуцируемым промотором и ткань-специфическим промотором.

На ФИГ. 22 показан другой вариант осуществления исключающего инструмента, в котором экспрессия транспосазы может контролироваться индуцируемым промотором и ткань-специфическим промотором.

На ФИГ. 23 показан вариант осуществления исключающего инструмента, в котором экспрессия рекомбиназы может контролироваться индуцируемым промотором и ткань-специфическим промотором.

На ФИГ. 24 показана часть вектора, в который включен ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (ген зеленого флуоресцентного белка), и часть вектора в который включен ген, кодирующий красный флуоресцентный белок (ген красного флуоресцентного белка).

На ФИГ. 25 показаны изображения, иллюстрирующие экспрессию флуоресцентного белка в донорной клетке, имеющей геном, в который вставлен инструмент, включающий ген, кодирующий флуоресцентный белок (ген флуоресцентного белка).

На ФИГ. 26 показаны изображения, иллюстрирующие результат ОТ-ПЦР, который показывает присутствие/отсутствие экспрессии мРНК гена зеленого флуоресцентного белка или гена красного флуоресцентного белка в клонированном эмбрионе; и результат ПЦР ДНК, который подтверждает вставку гена зеленого флуоресцентного белка или гена красного флуоресцентного белка в геном клонированного эмбриона.

На ФИГ. 27 показаны изображения, иллюстрирующие экспрессию флуоресцентного белка в клонированном эмбрионе, имеющем геном, в который вставлен инструмент, включающий ген флуоресцентного белка.

На ФИГ. 28 показано частичное строение некоторых векторов, где каждый вектор включает ген флуоресцентного белка.

На ФИГ. 29 показаны изображения, иллюстрирующие трансгенную корову, имеющую геном, в который вставлен инструмент, имеющий ген, кодирующий желтый флуоресцентный белок (ген желтого флуоресцентного белка), и результаты, подтверждающие экспрессию желтого флуоресцентного белка у трансгенной коровы.

На ФИГ. 30показаны изображения, иллюстрирующие результаты, подтверждающие экспрессию зеленого флуоресцентного белка у трансгенной коровы, имеющей геном, в который вставлен инструмент, включающий ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок.

На ФИГ. 31 показаны изображения, иллюстрирующие трансгенную корову, имеющую геном, в который вставлен инструмент, который включает элемент контроля экспрессии, ген зеленого флуоресцентного белка и ген красного флуоресцентного белка; и результаты, подтверждающие экспрессию красного флуоресцентного белка, где трансгенную корову обрабатывают материалом, который воздействует на элемент контроля экспрессии.

На ФИГ. 32 показаны изображения, иллюстрирующие результаты ПЦР ДНК и ОТ-ПЦР, подтверждающие вставку и транскрипцию гена зеленого флуоресцентного белка у трансгенной коровы, имеющей геном, в который вставлен инструмент, который включает элемент контроля экспрессии, ген зеленого флуоресцентного белка и ген красного флуоресцентного белка, и результаты ПЦР ДНК, подтверждающие, что ген зеленого флуоресцентного белка удален, и только ген красного флуоресцентного белка присутствует согласно обработке материалом, который воздействует на элемент контроля экспрессии у трансгенной коровы.

На ФИГ. 33 показаны изображения, иллюстрирующие детеныша коровы, имеющего геном, в который вставлен инструмент, включающий ген флуоресцентного белка, и экспрессия флуоресцентного белка в первичных клетках детеныша коровы.

На ФИГ. 34 показаны изображения, иллюстрирующие результаты анализа ПЦР ДНК, подтверждающие присутствие гена флуоресцентного белка в геноме детеныша коровы, имеющего геном, в который вставлен инструмент, включающий ген, кодирующий флуоресцентный белок.

На ФИГ. 35 показаны изображения, иллюстрирующие разницу уровня экспрессии флуоресцентного белка по количеству инструментов, включающих ген зеленого флуоресцентного белка, вставленных в геном.

На ФИГ. 36 показаны изображения, иллюстрирующие визуальные результаты и результаты ELISA, подтверждающие экспрессию зеленого флуоресцентного белка в молоке коровы, которая имеет геном, в который вставлен инструмент, включающий ген зеленого флуоресцентного белка.

На ФИГ. 37 показаны схематические диаграммы, иллюстрирующие вектор экспрессии енРНК и вектор экспрессии Cas9 для нокаутирования гена зеленого флуоресцентного белка, вставленного в геном клетки.

На ФИГ. 38 показаны изображения, иллюстрирующие визуальные результаты того, что зеленый флуоресцентный белок не экспрессируется, и результаты, подтверждающие вставки ген зеленого флуоресцентного белка, после трансфекции вектора экспрессии енРНК и вектора экспрессии Cas9 в бычьи фибробласты, которые имеют геном, в который вставлен инструмент, включающий ген флуоресцентного белка.

На ФИГ. 39 показаны изображения, иллюстрирующие результаты того, что имеется нокин донорной ДНК, в случае, где первичные клетки, имеющие геном, в который вставлен инструмент, включающий ген зеленого флуоресцентного белка, трансфицированы нРНК, способной поражать ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок, Cas9, и донорной ДНК (ген устойчивости к пуромицину).

На ФИГ. 40 показаны изображения, иллюстрирующие то, что зеленый флуоресцентный белок не экспрессируется в первичных клетках, которые были трансфицированы вектором экспрессии енРНК, вектором экспрессии CRISPR/Cas9 и вектором экспрессии донорной ДНК (гена устойчивости к пуромицину), которые поражают зеленый флуоресцентный белок.

На ФИГ. 41 показана схематическая диаграмма, иллюстрирующая способ, в котором нокинирован донорный полинуклеотид, который поражает ген зеленого флуоресцентного белка, присутствующий в геноме бычьих первичных клеток.

На ФИГ. 42 показаны изображения, иллюстрирующие то, что ген красного флуоресцентного белка, который поражает ген зеленого флуоресцентного белка в бычьих первичных клетках, имеющих геном, в который вставлен ген зеленого флуоресцентного белка, нокинирован и затем экспрессирован.

На ФИГ. 43 показана схематическая диаграмма, иллюстрирующая вектор, в который включен инструмент, включающий spCas9 ген, и изображения, иллюстрирующие трансгенный эмбрион и трансгенную корову, каждый из которых имеет геном, в который вставлен инструмент, включающий ген spCas9.

На ФИГ. 44 показаны визуальные результаты, иллюстрирующие экспрессию красного флуоресцентного белка в первичных клетках трансгенной коровы, имеющей геном, в который вставлен инструмент, включающий ген spCas9; результаты ПЦР ДНК, иллюстрирующие вставку гена spCas9 в геном трансгенной коровы; и результаты ОТ-ПЦР, иллюстрирующие экспрессию гена spCas9, который вставлен в геном трансгенной коровы.

На ФИГ. 45 показана схематическая диаграмма, иллюстрирующая процесс нокинирования целевого гена с применением коровы, имеющей геном, в который вставлен ген Cas9.

На ФИГ. 46 показаны изображения, иллюстрирующие результаты нокаута гена PRNP, гена бета-лактоглобулина (BLG), гена ретинобластомы 1 (Rb1), гена nanog, гена p53 и гена бета-казеина (BCN), с применением коровы, имеющей геном, в который вставлен ген spCas9.

На ФИГ. 47 показаны изображения, иллюстрирующие результаты электрофореза и анализа последовательности, подтверждающие нокаут гена PRNP после инъекции направляющей нуклеиновой кислоты, поражающей ген PRNP, в бластоциты, которые были получены с применением бычьих гамет, имеющих геном, в который вставлен ген spCas9.

На ФИГ. 48 показаны изображения, иллюстрирующие то, что красный флуоресцентный белок экспрессируется в первичных клетках детеныша коровы, полученного натуральным разведением коров, имеющих геном, в который вставлен ген spCas9; и вставку гена spCas9 и гена Fat1 в геном детеныша бычьих посредством ПЦР ДНК.

На ФИГ. 49 показаны изображения, иллюстрирующие результаты электрофореза, подтверждающие вставку гена PRNP после трансфекции енРНК, поражающей ген PRNP, в первичные клетки трансгенной коровы, имеющей геном, в который вставлен ген spCas9.

На ФИГ. 50 показаны схематические диаграммы, иллюстрирующие часть донорного полинуклеотидного вектора для HDR и донорного полинуклеотидного вектора для HITI.

На ФИГ. 51 показаны изображения, иллюстрирующие результаты, подтверждающие нокин гена mcherry посредством HITI.

На ФИГ. 52 показаны изображения, иллюстрирующие результаты, подтверждающие нокин гена mcherry посредством HDR.

На ФИГ. 53 показаны изображения, иллюстрирующие эмбрион, в котором нокинирован ген mcherry, который получен через ядерный транспорт соматической клетки; и экспрессию mcherry в эмбрионе, в котором нокинирован ген mcherry.

На ФИГ. 54 показана схематическая диаграмма, иллюстрирующая часть конечного вектора экспрессии для осуществления экспрессии spCas9 и енРНК.

На ФИГ. 55 показаны изображения, иллюстрирующие экспрессию красного флуоресцентного белка в первичных клетках трансгенной коровы, имеющей геном, в который вставлен инструмент, включающий полинуклеотиды, которые кодируют ген spCas9, и енРНК; и результаты fПЦР, подтверждающие вставки гена бета-лактоглобулина в фибробласты трансгенной коровы.

На ФИГ. 56 показана схематическая диаграмма, иллюстрирующая часть векторов, в которых экспрессия РНК-направляемой эндонуклеазы может контролироваться.

На ФИГ. 57 показано изображение, иллюстрирующее результаты, подтверждающие, посредством ПЦР ДНК, присутствие/отсутствие вставок целевого гена в соответствии с присутствием/отсутствием обработки клеток Cre рекомбиназой, в котором экспрессия РНК-направляемой эндонуклеазы может контролироваться.

На ФИГ. 58 показано изображение, иллюстрирующее последовательность донорного вектора для HDR, в котором затененные части во всей последовательности представляют первое плечо гомологии и второе плечо гомологии, соответственно.

НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно варианту осуществления, представленному в настоящем описании, может быть представлен трансгенный эмбрион, который имеет геном, в который вставлен полинуклеотид, кодирующий компонент сконструированной нуклеазы.

Например, может быть представлена трансгенная оплодотворенная яйцеклетка или трансгенный эмбрион, который имеет геном, включающий полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, которая включена между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью. Более конкретно, эмбрионом может быть эмбрион парнокопытного животного. Кроме того, может быть представлена трансгенная оплодотворенная яйцеклетка или трансгенный эмбрион, который дополнительно включает полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, которая способна специфически связываться с целевым сайтом, присутствующем в геноме оплодотворенной яйцеклетки или эмбриона, между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью. В это время, элемент контроля экспрессии может быть включен в, по меньшей мере, один из 5’ конца полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и 5’ конца полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту.

В другом примере, может быть представлен трансгенный эмбрион, который включает первую клетку, которая имеет геном, включающий первый инструмент, и вторую клетку, которая имеет геном, включающий второй инструмент, где первый инструмент присутствует на первом локусе, второй инструмент присутствует на втором локусе, и первый локус и второй локус являются разными. Первый инструмент и второй инструмент могут включать, по меньшей мере, один из полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемый эндонуклеотид, и полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту, которая может специфически связываться с целевым сайтом. Целевым сайтом может быть эндополинуклеотид эмбриона или экзополинуклеотид, включенный в геном эмбриона, и может быть включен между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью. В это время, последовательность первого инструмента может быть такой же, или отличаться от последовательности второго инструмента.

В другом примере, может быть представлен трансгенный эмбрион, который включает первую клетку, имеющую геном, который включает первый инструмент, и вторую клетку, имеющую геном, который включает второй инструмент, где первый инструмент присутствует на первом локусе, второй инструмент присутствует на втором локусе и первый локус и второй локус являются одинаковыми. Первый инструмент и второй инструмент могут включать, один из полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемый эндонуклеотид, и полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту, которая может специфически связываться с целевым сайтом. Целевым сайтом может быть эндополинуклеотид эмбриона или экзополинуклеотид, включенный в геном эмбриона, и может быть включен между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью. В это время, последовательность первого инструмента отличается от последовательности второго инструмента. Геном первой клетки может дополнительно включать третий инструмент, который имеет такую же последовательность, как первый инструмент. Геном второй клетки может дополнительно включать четвертый инструмент, который имеет такую же последовательность, как второй инструмент. Трансгенный эмбрион может дополнительно включать третью клетку, имеющую геном, который не включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту.

В другом примере, может быть представлен трансгенный эмбрион, который включает первую клетку, имеющую геном, который включает первый инструмент и целевой сайт, и вторую клетку, имеющую геном, который включает целевой сайт. Первый инструмент может включать, по меньшей мере, один из полинуклеотида, кодирующего первую РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотида, кодирующего первую направляющую нуклеиновую кислоту, которая может связываться с целевым сайтом, и геном второй клетки может не включать полинуклеотид, кодирующий вторую РНК-направляемую эндонуклеазу и полинуклеотид, кодирующий вторую направляющую нуклеиновую кислоту, которая может специфически связываться с целевым сайтом. Дополнительно, ITR последовательность может быть дополнительно включена в 5' конец и 3' конец первого инструмента. В это время, последовательность полинуклеотида, кодирующая первую РНК-направляемую эндонуклеазу, и последовательность полинуклеотида, кодирующая вторую РНК-направляемую эндонуклеазу могут быть одинаковыми или отличаются друг от друга, и последовательность полинуклеотида, кодирующего первую направляющую нуклеиновую кислоту и последовательность полинуклеотида, кодирующего вторую направляющую нуклеиновую кислоту могут быть одинаковыми или отличаются друг от друга. Целевым сайтом может быть эндополинуклеотид. Более конкретно, целевым сайтом может быть основная последовательность от 18 п.о. до 25 п.о., присутствующая на геноме трансгенного эмбриона. Целевым сайтом может быть экзополинуклеотид. Целевым сайтом может быть последовательность, соседняя к 5' концу или 3' концу PAM последовательности, и целевой сайт и PAM последовательность могут быть включены между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью.

Согласно другому варианту осуществления, представленному настоящим описанием, может быть представлен способ получения трансгенного эмбриона, который имеет геном, в который вставлен полинуклеотид, кодирующий компонент сконструированной нуклеазы.

Один способ получения трансгенного эмбриона может включать микроинъекцию вектора, который включает транспозонный ген и полинуклеотид, кодирующий компонент сконструированной нуклеазы, в оплодотворенную яйцеклетку или эмбрион. Дополнительно, способ может включать микроинъекцию транспосазы, которая может взаимодействовать с транспозонным геном, в оплодотворенную яйцеклетку или эмбрион. Транспосаза может быть в форме белка, полипептида или полинуклеотида, кодирующего транспосазу. Полинуклеотидом может быть включен в плазмидный вектор или вирусный вектор. Кроме того, полинуклеотид, кодирующий транспосазу может быть введен в дин вектор вместе с полинуклеотидом, кодирующим транспозонный ген и компонент сконструированной нуклеазы, и затем введен микроинъекцией в оплодотворенную яйцеклетку или эмбрион. Один тип трансгенного эмбриона, который может быть получен вышеуказанным способом, может включать первую клетку, в которой полинуклеотид, кодирующий компонент первой сконструированной нуклеазы, имеет геном, включенный в первый локус, и вторую клетку, в которой полинуклеотид, кодирующий компонент второй сконструированной нуклеазы, имеет геном, включенный во второй локус, который отличается от первого локуса. В это время, последовательность полинуклеотида, кодирующего компонент первой сконструированной нуклеазы, и последовательность полинуклеотида, кодирующего компонент второй сконструированной нуклеазы, могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга. Другой тип трансгенного эмбриона, который может быть получен вышеуказанным способом, может включать первую клетку, в которой полинуклеотид, кодирующий компонент первой сконструированной нуклеазы, имеет геном, включенный в первый локус, и вторую клетку, в которой полинуклеотид, кодирующий компонент второй сконструированной нуклеазы, имеет геном, включенный в первый локус. В это время, последовательность полинуклеотида, кодирующего компонент первой сконструированной нуклеазы, и последовательность полинуклеотида, кодирующего компонент второй сконструированной нуклеазы, могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга.

Другой способ получения трансгенного эмбриона может включать получение трансгенной донорной клетки, в котором экспрессируется компонент сконструированной нуклеазы, и трансплантацию ядра трансгенной донорной клетки в энуклеированную яйцеклетку. Получение трансгенной донорной клетки может включать трансформацию клетки вектором, который включает полинуклеотид, кодирующий транспозонный ген и компонент сконструированной нуклеазы. Дополнительно, получение трансгенной донорной клетки может дополнительно включать трансформацию клетки транспосазой, которая может взаимодействовать с транспозонным геном. Транспосаза может быть в форме белка, полипептида или полинуклеотида, кодирующего транспосазу. Полинуклеотид может быть включен к плазмидный вектор или вирусный вектор. Кроме того, полинуклеотидв, кодирующие транспосазу, могут быть введены в один вектор вместе с полинуклеотидом, кодирующим транспозонный ген и компонент сконструированной нуклеазы, и затем введен микроинъекцией в оплодотворенную яйцеклетку или эмбрион.

Согласно еще одному варианту осуществления, представленному в настоящем описании, может быть представлено трансгенное животное, имеющее геном, в который вставлен полинуклеотид, кодирующий компонент сконструированной нуклеазы.

Например, может быть представлено трансгенное животное, имеющее геном, который включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, который включен между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью. Более конкретно, животным может быть парнокопытное животное. Дополнительно, может быть представлено трансгенное животное, где полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, которая может специфически связываться с целевым сайтом, присутствующий в животном, дополнительно включен между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью. В это время, элемент контроля экспрессии может быть включен в один или более из 5' конца полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и 5' конца полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновой кислоты.

В другом примере, может быть представлено химерное трансгенное животное, которое включает первую клетку, имеющую геном, включающий инструмент, и вторую клетку, имеющую геном, не включающий инструмент. Более конкретно, может быть представлено трансгенное животное, которое включает первую клетку, имеющую геном, который включает первый инструмент и целевой сайт, и вторую клетку, имеющую геном, который включает целевой сайт. Первый инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид из полинуклеотида, кодирующего первую РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотида, кодирующего первую направляющую нуклеиновую кислоту, которая может связываться с целевым сайтом, и геном второй клетки может не включать полинуклеотид, кодирующий вторую РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотид, кодирующий вторую направляющую нуклеиновую кислоту, которая может специфически связываться с целевым сайтом. Дополнительно, ITR последовательность может быть дополнительно включена в 5' конец и 3' конец первого инструмента. В это время, последовательность полинуклеотида, кодирующего первую РНК-направляемую эндонуклеазу, и последовательность полинуклеотида, кодирующего вторую РНК-направляемую эндонуклеазу, могут быть одинаковыми или отличаются друг от друга, и последовательность полинуклеотида, кодирующего первую направляющую нуклеиновую кислоту и последовательность полинуклеотида, кодирующего вторую направляющую нуклеиновую кислоту, могут быть одинаковыми или отличаются друг от друга. Целевым сайтом может быть эндополинуклеотид. Более конкретно, целевым сайтом может быть основная последовательность от 18 п.о. до 25 п.о., присутствующая в геноме трансгенного животного. Целевым сайтом может быть экзополинуклеотид. Целевым сайтом может быть последовательность, соседняя к 5' концу или 3' концу PAM последовательности, и целевой сайт и PAM последовательность могут быть включены между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью.

В другом примере, может быть представлено трансгенное животное, которое включает первую клетку, которая имеет геном, включающий первый инструмент, и вторую клетку, которая имеет геном, включающий второй инструмент, где первый инструмент присутствует на первом локусе, второй инструмент присутствует на втором локусе, и первый локус и второй локус являются разными. Первый инструмент и второй инструмент могут включать, по меньшей мере, один из полинуклеотидов, кодирующих РНК-направляемый эндонуклеотид и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, которая может специфически связываться с целевым сайтом. Целевым сайтом может быть эндополинуклеотид животного или экзополинуклеотид, который включен на геноме животного и может быть включен между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью. В это время, последовательность первого инструмента и последовательность второго инструмента могут быть одинаковыми или отличаются друг от друга.

В другом примере, может быть представлено трансгенное животное, которое включает первую клетку, которая имеет геном, включающий первый инструмент, и вторую клетку, которая имеет геном, включающий второй инструмент, где первый инструмент присутствует на первом локусе, второй инструмент присутствует на втором локусе, и первый локус и второй локус являются одинаковыми. Первый инструмент и второй инструмент может включать, по меньшей мере, один из полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемый эндонуклеотид, и полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту, которая может специфически связываться с целевым сайтом. Целевым сайтом может быть эндополинуклеотид животного или экзополинуклеотид, который включен в геном животного и может быть включен между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью. В это время, последовательность первого инструмента и последовательность второго инструмента отличаются друг от друга. Геном первой клетки может дополнительно включать третий инструмент, который имеет такую же последовательность, как и первый инструмент. Геном второй клетки может дополнительно включать четвертый инструмент, который имеет такую же последовательность, как и второй инструмент. Трансгенное животное может дополнительно включать третью клетку, которая имеет геном, который не включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту.

Согласно другому типовому варианту осуществления, представленному в настоящем описании, может быть представлен способ получения трансгенного животного, которое имеет геном, в который вставлен полинуклеотид, кодирующий компонент сконструированной нуклеазы.

Один способ получения трансгенного животного может включать микроинъекцию вектора, который включает транспозонный ген и полинуклеотид, кодирующий компонент сконструированной нуклеазы, в оплодотворенную яйцеклетку или эмбрион. Дополнительно, получение трансгенного эмбриона может дополнительно включать микроинъекцию транспосазы, которая может взаимодействовать с транспозонным геном, в оплодотворенную яйцеклетку или эмбрион.

Другой способ получения трансгенного животного может включать получение трансгенной донорной клетки, в которой экспрессируется компонент сконструированной нуклеазы, и трансплантацию ядра трансгенной донорной клетки в энуклеированную яйцеклетку животного. Получение трансгенной донорной клетки может включать трансформацию клетки вектором, который включает транспозонный ген и полинуклеотид, кодирующий компонент сконструированной нуклеазы. Дополнительно, получение трансгенной донорной клетки может дополнительно включать трансформацию клетки транспосазой, которая может взаимодействовать с транспозонным геном. Транспосаза может быть белком, полипептидом или полинуклеотидом, кодирующим транспосазу. Полинуклеотид может быть включен в плазмидный вектор или вирусный вектор. Кроме того, полинуклеотид, кодирующий транспосазу, может быть в форме, в которой полинуклеотид включен в один вектор вместе с транспозонным геном и полинуклеотидом, кодирующим компонент сконструированной нуклеазы.

Согласно варианту осуществления, представленному в настоящем описании, может быть представлен трансгенный эмбрион, который имеет геном с редактированным геном.

Например, может быть представлен трансгенный эмбрион, имеющий геном, который включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновой кислоты, между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью, и где эндополинуклеотид нокаутирован. В это время, направляющая нуклеиновой кислоты может специфически связываться с эндополинуклеотидом. Формой, в которой эндополинуклеотид нокаутирован, может быть i) форма, в которой, по меньшей мере, один нуклеотид не включен в последовательность эндополинуклеотида, ii) форма, в которой, по меньшей мере, один нуклеотид дополнительно включен в последовательность эндополинуклеотида, и iii) форма, в которой, по меньшей мере, один нуклеотид исключен из последовательности эндополинуклеотида, и, по меньшей мере, один нуклеотид дополнительно включен туда.

В другом примере, может быть представлен трансгенный эмбрион, который включает первую клетку, имеющую геном, который включает первый инструмент, и целевой сайт, и вторую клетку, имеющую геном, который включает второй инструмент, и модифицированный сайт. Последовательность первого инструмента может быть такой же или отличаться от последовательности второго инструмента. Целевым сайтом может быть эндополинуклеотид. Целевым сайтом может быть экзополинуклеотид. Модифицированным сайтом может быть такой, в котором последовательность целевого сайта была изменена редактированием генома. Более конкретно, целевой сайт может включать первую область, вторую область и третью область, и модифицированная последовательность может включать четвертую область, пятую область и шестую область. В это время, последовательность первой области такая же, как для четвертой области, последовательность третьей области такая же, как для шестой области, и последовательность второй области отличается от последовательности четвертой области. Каждая из второй области и пятой области может включать РАМ последовательность. Каждая из третьей области и шестой области может включать РАМ последовательность. Последовательность пятой области может быть в i) форме, в которой, по меньшей мере, один нуклеотид не включен в последовательность второй области, ii) форме, в которой, по меньшей мере, один нуклеотид дополнительно включен в последовательность второй области, или iii) форме, в которой, по меньшей мере, один нуклеотид исключен из последовательности второй области и, по меньшей мере, один нуклеотид дополнительно включен туда. В случаях ii) и iii), по меньшей мере, один нуклеотид, который включен дополнительно, может включать один или более из редактирующего разрешающего компонента, полинуклеотида, кодирующего белок или РНК, белка РНК, полинуклеотида, кодирующего нефункциональный полипептид, полинуклеотида, кодирующего нетранслированную РНК, нетранскрибируемый полинуклеотид, искусственный интрон и элемент контроля экспрессии.

В еще одном примере, может быть представлен трансгенный эмбрион, который включает первую клетку, имеющую геном, который включает первый инструмент и целевой сайт, и вторую клетку, которая не включает инструмент, но имеет геном, включающий модифицированный ген. В это время, первый инструмент может включать один или более из полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу и полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту. Модифицированным сайтом может быть такой, в котором последовательность целевого сайта была изменена редактированием генома. Более конкретно, целевая последовательность может включать первую область, вторую область и третью область, и модифицированная последовательность может включать четвертую область, пятую область и шестую область. В это время, последовательность первой области такая же, как для четвертой области, последовательность третьей области такая же, как для шестой области, и последовательность второй области отличается от последовательности четвертой области. Последовательность пятой области может быть в i) форме, в которой, по меньшей мере, один нуклеотид не включен в последовательность второй области, ii) форме, в которой, по меньшей мере, один нуклеотид дополнительно включен в последовательность второй области, и iii) форме, в которой, по меньшей мере, один нуклеотид исключен из последовательности второй области и, по меньшей мере, один нуклеотид дополнительно включен туда.

Согласно другому варианту осуществления, представленному в настоящем описании, может быть представлено трансгенное животное, которое имеет геном с редактированным геном.

Например, может быть представлено трансгенное животное, имеющее геном, который включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью, и где эндополинуклеотид нокаутирован. В это время, направляющая нуклеиновая кислота может специфически связываться c эндополинуклеотидом. Формой, в которой эндополинуклеотид нокаутирован, моет быть одна из i) формы, в которой, по меньшей мере, один нуклеотид не включен в последовательность эндополинуклеотида, ii) формы, в которой, по меньшей мере, один нуклеотид дополнительно включен в последовательность эндополинуклеотида, и iii) формы, в которой, по меньшей мере, один нуклеотид исключен из последовательности эндополинуклеотида и, по меньшей мере, один нуклеотид дополнительно включен туда.

В другом примере, может быть представлено трансгенное животное, которое включает первую клетку, имеющую геном, который включает первый инструмент и целевой сайт, и вторую клетку, имеющую геном, который включает второй инструмент и модифицированный сайт. Последовательность первого инструмента может быть такой же или отличаться от последовательности второго инструмента. В это время, первый инструмент и/или второй инструмент может включать один или более из полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту. Целевым сайтом может быть эндополинуклеотид. Целевым сайтом может быть экзополинуклеотид. Модифицированным сайтом может быть такой, в котором последовательность целевого сайта моет быть изменена редактированием генома. Более конкретно, целевая последовательность может включать первую область, вторую область и третью область, и модифицированная последовательность может включать четвертую область, пятую область и шестую область. В это время, последовательность первой области такая же, как для четвертой области, последовательность третьей области такая же, как для шестой области, и последовательность второй области отличается от последовательности четвертой области. Вторая область и пятая область могут включать PAM последовательность. Третья область и шестая область могут включать PAM последовательность. Последовательность пятой области может быть в i) форме, в которой, по меньшей мере, один нуклеотид не включен в последовательность второй области, ii) форме, в которой, по меньшей мере, один нуклеотид дополнительно включен в последовательность второй области, и iii) форме, в которой, по меньшей мере, один нуклеотид исключен из последовательности второй области и, по меньшей мере, один нуклеотид дополнительно включен туда. В случаях ii) и iii), по меньшей мере, один дополнительно включенный нуклеотид может включать один или более из редактирующего разрешающего компонента, полинуклеотида, кодирующего белок или РНК, полинуклеотида, кодирующего нефункциональный полипептид, полинуклеотида, кодирующего нетранслированную РНК, нетранскрибируемого полинуклеотида, искусственного интрона и элемента контроля экспрессии. Целевой сайт и модифицированный сайт могут быть последовательностями, соседними к PAM последовательности. Каждый из целевого сайта и модифицированного сайта может включать первую ITR последовательность в 5' направлении, и включать вторую ITR последовательность в 3' направлении.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[Определение терминов]

Трансформация (генная модификация)

В настоящем документе термин “трансформация (генная модификация)” относится к искусственной трансформации полинуклеотида, включенного в геном животного в клетке. Трансформация включает делецию и замещение части полинуклеотида, включенного в геном животного в клетке, и вставку нуклеотида или полинуклеотида в геном животного.

В настоящем документе термин “трансформация (генная модификация)” включает добавление, модификацию и делецию белка или РНК, которые могут экспрессироваться в клетке.

Сайт-специфическая трансформация

В настоящем документе термин “сайт-специфическая трансформация” относится к трансформации, которая происходит в определенной локации на геноме животного в клетке. Определенная локация может быть определена нуклеотидной последовательностью на геноме животного. Например, РНК-направляемая эндонуклеаза может распознавать нуклеотидную последовательность, которая способна комплементарно связываться с частью направляющей нуклеиновой кислоты, на геноме животного, тем самым приводя к сайт-специфической трансформации.

Трансформированная клетка (трансгенная клетка)

В настоящем документе термин “трансформированная клетка (трансгенная клетка)” относится к клетке, которая включает трансформированную часть генома животного в клетке.

В геному животного в клетке, первая клетка, включающая трансформированную часть, может проходить претерпевать цитокенез. Геном животного второй клетки, полученной при цитокенезе первой клетки, может включать часть, которая имеет такую же нуклеотидную последовательность, как и трансформированная часть первой клетки. В настоящем документе термин “трансформированная клетка” включает первую клетку и вторую клетку.

Трансгенное животное (трансформированное животное)

В настоящем документе термин “трансгенное животное (трансформированное животное)” относится к животному, которое включает, по меньшей мере, одну трансформированную клетку. Животное F0 может включать первую трансформированную клетку. Животное F0 может давать потомство F1. По меньшей мере, одна трансформированная клетка, которая включена в F1 и потомство F1, может включать геном животного, который включает часть, имеющую ту же нуклеотидную последовательность, что и трансформированная часть генома животного первой трансформированной клетки. В настоящем документе термин “трансгенное животное” включает F0, F1 и потомство F1.

Даже в случае, когда прямая искусственная манипуляция для трансформации не применяется во время получения животного F1 или после получения животного F1, если животное F1 включает трансформированную клетку, животное F1 может считаться трансгенным животным.

В случае, когда F1 получают из животного F0 после применения прямой искусственной манипуляции для трансформации, животное F1 может считаться трансгенным животным.

Эндополинуклеотид

В настоящем документе термин “эндополинуклеотид” относится к полинуклеотиду, который включен в геном животного в клетке, в котором не происходила трансформация.

Первая клетка, в которой не происходила трансформация, может перенести цитокенез. Вторая клетка, которая получена цитокенезом первой клетки, может быть трансформированной клеткой. Вторая клетка может включать полинуклеотид, который имеет ту же последовательность, что и эндополинуклеотид, включенный в первую клетку. В настоящем документе термин “эндополинуклеотид” включает полинуклеотид, имеющий ту же последовательность, что и эндополинуклеотид первой клетки, среди полинуклеотидов, включенных во вторую клетку.

Экзополинуклеотид

В настоящем документе термин “экзополинуклеотид” относится к полинуклеотиду, который введен в клетку. Клетка может не быть или быть трансформированной клеткой. Экзополинуклеотид может быть вставлен в геном животного в клетке, или может присутствовать независимо от генома животного в клетке.

Первая клетка, в которую введен экзополинуклеотид, может проходить цитокенез. Вторая клетка, которую получают цитокенезом первой клетки, могут включать полинуклеотид, который имеет ту же последовательность, что и экзополинуклеотид. В настоящем документе термин “экзополинуклеотид” включает полинуклеотид, который имеет ту же последовательность, что и экзополинуклеотид первой клетки среди полинуклеотидов, включенных во вторую клетку.

Животное (F0), включающее клетку, в которую введен экзополинуклеотид, может давать потомство (F1). F1 и потомство F1 может включать клетку, которая включает полинуклеотид, который имеет ту же последовательность, что и экзополинуклеотид F0. В настоящем документе термин “экзополинуклеотид” включает полинуклеотид, который имеет ту же последовательность, что и экзополинуклеотид F0 среди полинуклеотидов, включены в клетку F1 и потомство F1.

Вставка

В настоящем документе термин “вставка” включает “нуклеотидную вставку” и “полинуклеотидую вставку”. В настоящем документе термин “нуклеотидная вставка” относится к добавлению нуклеотида в середину, 5' конец или 3' конец нуклеиновой кислоты. В настоящем документе термин “полинуклеотидная вставка” относится к добавлению полинуклеотида в середину, 5' конец или 3' конец нуклеиновой кислоты.

Делеция

В настоящем документе термин “делеция” включает “нуклеотидную делецию” и “полинуклеотидную делецию”. В настоящем документе термин “нуклеотидная делеция” относится к делеции нуклеотида, включенного в нуклеиновую кислоту. В настоящем документе термин “полинуклеотидная делеция” относится к делеции полинуклеотида, включенного в нуклеиновую кислоту.

Замещение

В настоящем документе термин “замещение” включает “нуклеотидное замещение” и “полинуклеотидное замещение”. В настоящем документе термин “нуклеотидное замещение” относится к замещению нуклеотида, включенного в нуклеиновую кислоту, другим нуклеотидом. В настоящем документе термин “полинуклеотидное замещение” относится к замещению полинуклеотида, включенного в нуклеиновую кислоту, другим полинуклеотидом.

Нокин (нок-ин)

В настоящем документе термин “нокин” относится к вставке или замещению экзополинуклеотида, включающего ген, в геном животного в клетке.

Например, экзополинуклеотид, включающий ген человеческого альбумина, может быть вставлен в геном животного, отличного от человека, в клетке. В этом случае, клетка, включающая геном животного, отличного от человека, может быть способна экспрессироваться человеческий альбумин, и этот процесс может быть назван нокином гена человеческого альбумина.

Нокаут (нок-аут)

В настоящем документе термин “нокаут” относится к гену, присутствующему на геноме животного в клетке, не способной функционировать. Ген может быть нокаутирован трансформацией полинуклеотида в соответствующем гене, расположенном на геноме животного в клетке.

Например, экзополинуклеотид, включающий ген человеческого альбумина, может быть вставлен в нуклеотидную последовательность, которая соответствует экзону гена не человеческого альбумина, присутствующему на геноме животного, отличного от человека, в клетке. В этом случае, клетка не может экспрессировать не человеческий альбумин, и этот процесс может быть назван нокаутом гена не человеческого альбумина.

В другом примере, часть экзона гена не человеческого альбумина, присутствующего на геноме животного, отличного от человека, в клетке, может быть удален с применением сконструированной нуклеазы, которая нацелена на часть экзона гена не человеческого альбумина, в качестве целевого сайта. В этом случает, клетка не может экспрессировать не человеческий альбумин, и этот процесс может быть назван нокаутом гена не человеческого альбумина.

Сконструированная нуклеаза

В настоящем документе термин “сконструированная нуклеаза” относится к белку, способному к сайт-специфической трансформации в геноме животного, или комплексу, включающему белок. Белком может быть не модифицированный белок, обнаруженный в природе, или модифицированный/сконструированный белок.

Сконструированная нуклеаза по настоящему раскрытию может включать нуклеазу с «цинковыми пальцами» (ZFN), нуклеазу на основе эффектора, подобного активатору транскрипции (TALEN) и систему CRISPR/фермент, но не ограничена ими.

Целевой сайт

Целевой сайт сконструированной нуклеазы может относиться к области нуклеиновой кислоты, которая может быть распознана компонентом сконструированной нуклеазы.

Например, целевым сайтом системы CRISPR/фермент может быть, по меньшей мере, одна нуклеотидная последовательность, которая идентична или способна иметь комплементарное связывание с частичной областью направляющей нуклеиновой кислоты на нуклеиновой кислоте.

В настоящем документе, в качестве примера термина “такая же нуклеотидная последовательность”, может быть указано отношение между урацилом (U) и тимином (T). В настоящем документе, в качестве примера термина “нуклеотидная последовательность, способная к комплементарному связыванию”, может быть указано отношение между урацилом (U) и аденином (A).

Целевым сайтом может быть эндополинуклеотид, присутствующий на геноме.

Целевым сайтом может быть экзополинуклеотид, который вставлен в геном.

Система CRISPR/фермент

Система CRISPR/фермент относится к комплексу, который включает белок, способный расщеплять часть целевого сайта через взаимодействие с целевым сайтом на геноме животного в клетке или целевым сайтом экзополинуклеотида.

Система CRISPR/фермент может включать направляющую нуклеиновую кислоту и РНК-направляемую эндонуклеазу.

Направляющая нуклеиновая кислота

В настоящем документе термин “направляющая нуклеиновая кислота” относится к нуклеиновой кислоте, которая может связываться с целевым сайтом генома животного в клетке или целевым сайтом экзополинуклеотида. В настоящем документе термин “направляющая нуклеиновая кислота” включает одноцепочечную направляющую нуклеиновую кислоту (однонитевую направляющую нуклеиновую кислоту) и направляющую нуклеиновую кислоту, состоящую из нуклеиновой кислоты с, по меньшей мере, двумя нитями.

Одноцепочечная направляющая нуклеиновая кислота (однонитевая направляющая нуклеиновая кислота) может включать нРНК. нРНК может включать, по меньшей мере, один из протоспейсерный домен, первый комплементарный домен, второй комплементарный домен, проксимальный домен и хвостовой домен.

Протоспейсерным доменом является домен, который включает нуклеотидную последовательность, которая может иметь комплементарное связывание с частью целевого сайта генома животного, или частью целевого сайта экзополинуклеотида

Первый комплементарный домен и второй комплементарный домен являются доменами, которые могут иметь комплементарное связывание друг с другом и поэтому способны взаимодействовать с РНК-направляемой эндонуклеазой. Второй комплементарный домен может быть расположен ниже первого комплементарного домена.

Проксимальный домен может быть расположен ниже второго комплементарного домена.

Хвостовой домен может быть расположен на 3' конце нРНК.

Направляющая нуклеиновая кислота, состоящая из нуклеиновой кислоты с, по меньшей мере, двумя нитями, может включать двойную нРНК. Двойная нРНК может включать крРНК и тракрРНК. крРНК может включать протоспейсерный домен и первый комплементарный домен. тракрРНК может включать второй комплементарный домен, проксимальный домен и хвостовой домен.

РНК-направляемая эндонуклеаза

В настоящем документе термин “РНК-направляемая эндонуклеаза” относится к полипептиду или белку, которые включают домен, способный взаимодействовать с полинуклеотидом, и домен, способный расщеплять середину полинуклеотида.

РНК-направляемая эндонуклеаза может включать белок SpCas9, CjCas9, StCas9, SaCas9, NmCas9, Cpf1 и его мутант, но не ограничена ими.

Согласно цели модификации/конструирования, РНК-направляемая эндонуклеаза может включать мертвую Cas9, Cas9 никазу, eSpCas9 и SpCas9-HF1, но не ограничена ими.

РНК-направляемая эндонуклеаза может расщеплять двойную нить через взаимодействие с нуклеиновой кислотой, или может расщеплять одну нить двойной нити через взаимодействие с нуклеиновой кислотой. Альтернативно, РНК-направляемая эндонуклеаза может взаимодействовать с нуклеиновой кислотой, но может не расщеплять нуклеиновую кислоту.

В случае, когда РНК-направляемая эндонуклеаза взаимодействует с нуклеиновой кислотой и тем самым расщепляет двойную нить или нить двойной нити, нуклеотидная вставка или полинуклеотидная вставка может возникать в расщепленной области. Альтернативно, в случае, когда РНК-направляемая эндонуклеаза взаимодействует с нуклеиновой кислотой и тем самым расщепляет двойную нить или нить двойной нити, нуклеотидная делеция или полинуклеотидная делеция может возникать в расщепленной области.

Целевой сайт системы CRISPR/фермент

Целевой сайт генома животного в клетке или целевой сайт экзополинуклеотида может быть нуклеотидной последовательностью, соседней к 5' концу или 3' концу последовательности соседнего к протоспейсеру мотива (PAM).

PAM последовательность может включать NGG, NNGRRT, NNAGAAW, NNNNGATT, NNNVRYAC и TTN, но не ограничена ими. N может быть любой из A, T, U, G и C. V может быть любой из A, C и G. W может быть любой из A и T. Y может быть любой из C и T.

PAM последовательность может варьироваться в зависимости от РНК-направляемой эндонуклеазы. Например, PAM последовательностью для SpCas9 или его мутанта может быть NGG. Например, PAM последовательностью для SaCas9 или его мутанта может быть NNGRRT. Например, PAM последовательностью для StCas9 или его мутанта может быть NNAGAAW. Например, PAM последовательностью для NmCas9 или его мутанта может быть NNNGATT. Например, PAM последовательностью для CjCas9 или его мутанта может быть NNNVRYAC. Например, PAM последовательностью для Cpf1 и его мутанта может быть TTN.

Транспозонная система

Транспозон

В настоящем документе термин “транспозон” относится к полинуклеотиду, который может быть транслоцирован внутри генома животного в клетке. Дополнительно, термин “транспозон” относится к полинуклеотиду, который может быть транслоцирован между нуклеиновой кислотой и геномом животного в клетке.

Транспозон может быть поделен на транспозон I класса (ретротранспозон) и транспозон II класса (ДНК транспозон).

Транспозон I класса работает так, что РНК транскрибируется из транспозонной ДНК нуклеиновой кислоты или в геном животного в клетке и затем ДНК, которая обратно транскрибирована из РНК, вставляется в другое место в геноме животного.

Транспозон II класса работает так, что транспозонная ДНК в нуклеиновой кислоте или геноме животного расщепляется в клетке, и расщепленная транспозонная ДНК вставляется в другое место генома животного.

Транспозон II класса может включать первый полинуклеотид на 5' конце и второй полинуклеотид на 3' конце и третий полинуклеотид. Первый полинуклеотид и второй полинуклеотид могут включать последовательность инвертированного концевого повтора (далее, ITR). Третий полинуклеотид может быть расположен между первым полинуклеотидом и вторым полинуклеотидом. Третий полинуклеотид может включать экзополинуклеотид. Третий полинуклеотид может включать полинуклеотид, кодирующий транспосазу.

Если не указано иное, термин “транспозон” относится к случаю, когда транспозоном является транспозон II класса, однако, в случае, когда не существует проблемы с технической точки зрения, даже если “транспозон” интерпретируется как транспозон I класса, нет необходимости интерпретировать транспозон как транспозон II класса.

Транспосаза

В настоящем документе термин “транспосаза” относится к белку, который может расщеплять транспозон II класса или вставлять транспозон II класса и геноме животного, через взаимодействие с ITR последовательностями, расположенными на обоих концах транспозона II класса, расположенного в нуклеиновой кислоте или геноме животного в клетке.

Транспосаза может включать hobo/Ac/Tam, P элемент, Sleeping Beauty (SB), Frog Prince, Hsmar1, Hsmar2, piggyBac (PB), Tol2 и их мутант, но не ограничена ими.

Транспосаза может расщеплять транспозоны, присутствующие в нуклеиновой кислоте или геноме животного в клетке.

Транспосаза может вставлять транспозон II класса в геном животного.

Место, в которое транспосаза вставляет транспозон II класса в геном животного, может быть не связано с нуклеотидной последовательностью на геноме животного.

Место, в которое транспосаза вставляет транспозон II класса в геном животного, может быть определено конкретной нуклеотидной последовательностью на геноме животного, которая может быть распознана транспосазой. Например, в случае Sleeping Beauty, транспосаза Sleeping Beauty может вставлять транспозон через распознавание TA последовательности на геноме животного. Дополнительно, транспосаза piggyBac может вставлять транспозон через распознавание TTAA последовательности на геноме животного.

Транспосаза и транспозон II класса могут применяться для вставки экзополинуклеотида в геном животного в клетке. Например, экзополинуклеотид может быть вставлен в геном животного в клетке через доставку, в клетку, экзополинуклеотида, включающего ITR последовательность, которая способна взаимодействовать с транспосазой piggyBac и piggyBac на 5' конце и 3' конце, соответственно.

В этом случае нет необходимости определять заранее место, в которое должен быть вставлен экзополинуклеотид, или изменение нуклеотидной последовательности экзополинуклеотида в зависимости от места, в которое должен быть вставлен экзополинуклеотид.

Дополнительно, не существует предела в количестве экзополинуклеотидов, которые могут быть вставлены в геном животного в клетке. Следовательно, уровень экспрессии целевого белка клетки может быть повышен вставкой множества экзополинуклеотидов, кодирующих целевой белок, в геном животного в клетке.

Дополнительно, местом, в которое экзополинуклеотид вставляется транспосазой, может быть место, где экспрессия гена клеткой не ингибируется. Например, в случае piggyBac транспосазы, транспозон может быть вставлен в интрон, 5' UTR или 3' UTR в геноме животного.

Сайт-специфическая рекомбинация

В настоящем документе термин “сайт-специфическая рекомбинация” относится к явлению, при котором две нуклеотидных последовательности с одинаковым или идентичным свойством на нуклеиновой кислоте или геноме животного образуют пару, и поэтому происходит реципрокный обмен между парой нуклеотидных последовательностей. В этом случае, нуклеотидные последовательности, в которых произошел реципрокный обмен, называют сайтом распознавания рекомбиназы (RRS). Дополнительно, белок, который взаимодействует с парой RRS и способствует сайт-специфической рекомбинации, называют сайт-специфической рекомбиназой (SSR).

Сайт распознавания рекомбиназы

Сайт распознавания рекомбиназы (RRS) по настоящему раскрытию может включать loxp, rox, FRT, attP, attB и их мутант, но не ограничен ими. Мутант loxp может включать loxp66, loxp71, loxp72, loxp2722, loxp5171 и loxpm2, но не ограничен ими. Мутант rox может включать rox4R, rox6R и rox2N, но не ограничен ими. Мутант FRT может включать F3, F5, F10, F11, F12, F13, F14, F15 и F16, но не ограничен ими.

В RRS, два могут образовывать пару и тем самым взаимодействовать с SSR. В loxp или мутанте loxp, два из одинаковых RRS могут образовывать пару. В rox или мутанте rox, два из одинаковых RRS могут образовывать пару. В FRT или мутанте FRT, два из одинаковых RRS могут образовывать пару. attP может образовывать пару с attB.

Сайт-специфическая рекомбиназа

Сайт-специфическая рекомбиназа (SSR) или рекомбиназа по настоящему раскрытию может включать Cre, Dre, Flp, KD, B2, B3, lambda, HK022, HP1, гамма дельта, ParA, Tn3, Hin, Gin, Pin, phiC31, Bxb1, R4, или их мутанты, но не ограничена ими.

SSR может взаимодействовать с парой RRS. Cre или мутант Cre может специфически взаимодействовать с loxp или мутантом loxp. Dre или мутант Dre может специфически взаимодействовать с rox или мутантом rox. Flp или мутант Flp может специфически взаимодействовать с FRT или мутантом FRT. PhiC31 ли мутант phiC31 может специфически взаимодействовать с attP и attB.

Типы сайт-специфической рекомбинации

Сайт-специфическая рекомбинация по настоящему раскрытию может включать вставку, делецию, инверсию и обмен.

Сайт-специфическая рекомбинация может быть обратимой или необратимой.

Вставка

Когда один из пары RRS расположены на первой нуклеиновой кислоте и другой расположен на второй нуклеиновой кислоте, может происходить вставка второй нуклеиновой кислоты в первую нуклеиновую кислоту через взаимодействие с SSR, которая является специфической к паре RRS.

Когда вставка является обратимой, вторая нуклеиновая кислота может быть удалена взаимодействием с SSR.

Делеция

Если пара RRS расположена в одном направлении относительно нуклеиновой кислоты, делеция полинуклеотида, расположенного между парой RRS может происходить через взаимодействие с SSR, которая является специфической к паре RRS.

Если делеция является обратимой, может происходить вставка полинуклеотида, расположенного между парой RRS.

Инверсия

Если пара RRS расположена в противоположных направлениях относительно нуклеиновой кислоты, инверсия полинуклеотида, расположенного между парой RRS, может происходить через взаимодействие с SSR, которая является специфической к паре RRS.

Если инверсия является обратимой, может происходить инверсия полинуклеотида, расположенного между парой RRS.

Обмен

Если RRS A и RRS B образуют пару, и RRS C и RRS D образуют пару, RRS A и RRS C могут быть расположены на первой нуклеиновой кислоте и RRS B и RRS D могут быть расположены на второй нуклеиновой кислоте. В первой нуклеиновой кислоте, RRS C может быть расположена значительно ниже RRS A, и во второй нуклеиновой кислоте, RRS D может быть значительно ниже RRS B. В этом случае, может происходить взаимодействие с SSR, которая является специфической к первой паре RRS, и взаимодействие с SSR, которая образует пару со второй парой RRS. Обмен может происходить между полинуклеотидом, который расположен между RRS A и RRS C, и полинуклеотидом, который расположен между RRS B и RRS D.

Если обмен является обратимым, обмен может происходить снова между полинуклеотидом, который расположен между RRS A и RRS C, и полинуклеотидом, который расположен между RRS B и RRS D.

Маркерный ген

В настоящем документе термин “маркерный ген” относится к гену, который вставлен в геном животного в клетке так, чтобы выбирать клетки, для которых достигнута желаемая трансформация. Когда экзополинуклеотид, содержащий полинуклеотид, кодирующий маркерный ген, вводят в клетку и затем экзополинуклеотид вставляют в геном животного, маркерный ген может экспрессироваться в клетке, тем самым помогая в отборе клеток.

Маркерный ген может включать ген устойчивости к антибиотикам, ген устойчивости к антибиотикам, антигенный ген, ген люциферазы, ген бета-галктозидазы, ген, кодирующий флуоресцентный белок, поверхностный маркерный ген и суицидальный ген, но не ограничен ими.

Ген устойчивости к антибиотикам

Если маркерным геном является ген устойчивости к антибиотикам, выбор клеток может проводиться культивированием вместе с антибиотиком. Антибиотик может включать ампициллин, хлорамфеникол, тетрациклин и канамицин, но не ограничен ими.

Антигенный ген

Если маркерным геном является ген, кодирующий антиген или ген, включающий нуклеотид, который может действовать как антиген, выбор клеток может проводиться культивированием вместе с антителом, которое может специфически действовать на антиген. Антиген может включать поверхностный антиген. Поверхностный антиген может включать CD молекулу. Антитело может взаимодействовать с магнитной частицей или флуорофором.

Ген люциферазы

Если маркерным геном является ген люциферазы, выбор клеток может проводиться культивированием вместе люциферином.

Ген бета-галктозидазы

Если маркерным геном является ген бета-галктозидазы, выбор клеток может проводиться культивированием вместе с 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-d-галактопиранозидом (X-gal).

Ген, кодирующий флуоресцентный белок (ген флуоресцентного белка)

Если маркерным геном является ген, кодирующий флуоресцентный белок, выбор клеток может производиться измерением сигнала флуоресценции. Флуоресцентный белок может включать зеленый флуоресцентный белок (далее, GFP), желтый флуоресцентный белок (далее, YFP) и красный флуоресцентный белок (далее, RFP), но не ограничен ими.

Суицидальный ген

Если маркерным геном является суицидальный ген, выбор клеток может проводиться культивированием вместе с пролекарством, которое образует пару с суицидальным геном. Суицидальный ген может включать ген тимидинкиназы, ген цитозиндеаминазы, ген цитохрома P450, ген нитроредуктазы, ген нуклеозидфосфорилазы пурина и ген карбоксипептидазы G2, но не ограничен ими. Пролекарство может включать ацикловир, ганцикловир, 5-фторцитозин, циклофосфамид, ифосфамид, 5-[азиридин-1-ил]-2,4-динитробензамид (CB1954), 6-метилпурин-2-дезоксирибозид (MeP-dR), арабинофуранозил-2-фтораденин монофосфат (F-araA) и N, N-[(2-хлорэтил)(2-мезилоксиэтил)амино]бензойную кислоту) (CMDA), но не ограничен ими.

Элемент контроля экспрессии

В настоящем документе термин “элемент контроля экспрессии” включает элемент контроля транскрипции, элемент контроля посттранскрипционной обработки, элемент контроля трансляции и элемент контроля посттрансляционной модификации.

Элемент контроля транскрипции

В настоящем документе термин “элемент контроля транскрипции” относится к материалу или нуклеотидной последовательности, которая способна инициировать, способствовать, ингибировать или заканчивать синтез мРНК из РНК или полинуклеотида, кодирующего полипептид.

Элемент контроля транскрипции может включать энхансер, сайленсер, репрессор, активатор, ингибитор, промотор, стоп-кодон транскрипции и loxp-стоп-кодон-loxp транскрипции (далее, LTL), но не ограничен ими. Стоп-кодон транскрипции может включать поли T последовательность (термин "поли T последовательность" применяется взаимозаменяемо с термином "поли A последовательность") и AATAAA последовательность, но не ограничен ими.

Элемент контроля посттранскрипционной обработки

В настоящем документе термин “элемент контроля посттранскрипционной обработки” относится к химическому соединению, полинуклеотиду или ферменту, который способен вызывать модификацию структуры мРНК, синтезированной из полинуклеотида.

Элемент контроля посттранскрипционной обработки может включать химическое соединение, полинуклеотид или фермент, который может вызывать 5' кэпирование, 3' расщепление, 3' полиаденилирование или сплайсинг, но не ограничен ими.

Элемент контроля трансляции

В настоящем документе термин “элемент контроля трансляции” относится к материалу или нуклеотидной последовательности, которая способна инициировать, способствовать, ингибировать или заканчивать синтез полипептида из мРНК.

Элемент контроля трансляции может включать 3' нетранслированную область (далее, 3’ UTR), 5' нетранслированную область (далее, 5’UTR), экзон, интрон, инициирующий кодон, стоп-кодон, последовательность Козака, IRES, полинуклеотид, кодирующий 2A пептид, loxp-стоп-кодон-loxp (далее, LSL), но не ограничен ими.

Элемент контроля посттрансляционной модификации

В настоящем документе термин “элемент контроля посттрансляционной модификации” относится к химическому соединению, полинуклеотиду или ферменту, которые могут вызывать модификацию структуры полипептида, синтезированного из мРНК.

Элемент контроля посттрансляционной модификации может включать химическое соединение или фермент, который может вызывать гликозилирование, сворачивание, убиквитинирование, сумоилирование, ацетилирование и фосфорилирование полипептида, который транскрибирован и транслирован из полинуклеотида, но не ограничен ими.

Промотор

“Промотор” по настоящему раскрытию является последовательностью нуклеиновой кислоты, которая взаимодействует с РНК полимеразой в нуклеиновой кислоте и тем самым инициирует транскрипцию. “Промотор” по настоящему раскрытию включает конститутивный промотор, ткань-специфический промотор и индуцируемый промотор.

Конститутивный промотор

“Конститутивный промотор” по настоящему раскрытию относится к промотору, который позволяет инициировать транскрипцию независимо от изменения среды в клетке. Конститутивный промотор может включать CMV промотор, CAG промотор и U6 промотор, но не ограничен ими.

Ткань-специфический промотор

“Ткань-специфический промотор” по настоящему раскрытию относится к промотору, который способен инициировать транскрипцию только в определенной ткани животного. Ткань-специфический промотор может включать специфический к ткани молочной железы промотор или специфический к репродуктивному органу промотор, но не ограничен ими.

Специфический к ткани молочной железы промотор может включать альфа-казеиновый промотор, бета-казеиновый промотор, каппа-казеиновый промотор, мю-казеиновый промотор и бета-лактоглобулиновый промотор, но не ограничен ими.

Специфический к репродуктивному органу промотор может включать специфический к яичникам промотор и специфический к яичкам промотор, но не ограничен ими.

Индуцируемый промотор

“Индуцируем промотор” по настоящему раскрытию относится к промотору, который инициирует транскрипцию в ответ на изменения внутриклеточной среды или внеклеточной среды. Индуцируемый промотор может включать химически индуцируемый промотор, индуцируемый температурой промотор и индуцируемый светом промотор, но не ограничен ими.

Химически индуцируемый промотор может включать индуцируемый антибиотиком промотор, индуцируемый спиртом промотор, индуцируемый стероидом промотор и индуцируемый металлом промотор, но не ограничен ими. Индуцируемый антибиотиком промотор может включать Tet-on промотор и Tet-off промотор, но не ограничен ими. Индуцируемый стероидом промотор может включать индуцируемый эстрогеном промотор, но не ограничен ими. Индуцируемый металлом промотор может включать индуцируемый медью промотор, но не ограничен ими.

Индуцируемый температурой промотор может включать индуцируемый тепловым шоком промотор и индуцируемый холодовым шоком промотор, но не ограничен ими. Индуцируемый тепловым шоком промотор может включать Hsp промотор, но не ограничен ими.

Доставка

В настоящем документе термин “доставка” может относиться к введению экзополинуклеотида в орган, ткань, клетку или субклеточную органеллу живого организма.

В настоящем документе термин “доставка” также может относиться к введению полипептида или белка в орган, ткань, клетку или субклеточную органеллу живого организма.

В настоящем раскрытии, термин “доставка” может применяться взаимозаменяемо с термином “предоставление”.

Не вирусная доставка

Доставка может включать не вирусную доставку.

Не вирусная доставка может применять вектор депротеинезированной нуклеиновой кислоты. Вектор депротеинезированной нуклеиновой кислоты может включать вектор кольцевой нуклеиновой кислоты и вектор линейной нуклеиновой кислоты. Вектор кольцевой нуклеиновой кислоты может включать плазмидный вектор, но не ограничен ими.

Не вирусная доставка может использовать не вирусный вектор. Не вирусный вектор может включать искусственную хромосому, липосому, полимер, гибрид жир-полимер, неорганическую наночастицу и органическую наночастицу, но не ограничен ими.

Не вирусная доставка может включать микроинъекцию, генную пушку, электропорацию, сонопорацию, фотопорацию, магнитофекцию и гидропорацию, но не ограничен ими.

Вирусная доставка

Доставка гена может включать вирусную доставку.

Вирусная доставка может применяться вирусный вектор на основе РНК. Вирусный вектор на основе РНК может включать онкоретровирусный вектор, лентивирусный вектор и вектор спумавируса человека, но не ограничен ими.

Вирусная доставка может применять вирусный вектор на основе ДНК. Вирусный вектор на основе ДНК может включать аденовирусный вектор, адено-ассоциированный вирусный вектор, вектор вируса Эпштейн-Барр, вектор герпесвируса и вектор поксвируса, но не ограничен ими.

В случае вирусной доставки, ее преимущество состоит в превосходной эффективности доставки гена большого размера.

Микроинъекция

В настоящем документе термин “микроинъекция” относится к инъекции материала в орган, ткань, клетку или субклеточную органеллу живого организма. Материал может включать химическое соединение, полинуклеотид или полипептид.

В настоящем документе термин “микроинъекция” может включать микроинъекцию гаметы, микроинъекцию зиготы, микроинъекцию эмбриона и микроинъекцию соматической клетки.

В настоящем документе термин “микроинъекция гаметы” относится к микроинъекции материала, содержащего полинуклеотид, в гамете. В настоящем документе термин “микроинъекция гаметы” включает методику микроинъекции материала, содержащего полинуклеотид, в гамете, и получение трансгенного животного через стадию фертилизации, стадию дифференциации и т.д.

В настоящем документе термин “микроинъекция зиготы” относится к микроинъекции материала, содержащего полинуклеотид, в зиготе. В настоящем документе термин “ микроинъекция зиготы” включает методику микроинъекции материала, содержащего полинуклеотид, в зиготе, и получение трансгенного животного через стадию дифференциации и т.д.

В настоящем документе термин “ микроинъекция эмбриона” относится к микроинъекци материала, содержащего полинуклеотид, в эмбрионе. В настоящем документе термин “ микроинъекция эмбриона” включает методику микроинъекци материала, содержащего полинуклеотид, в эмбрион, и получение трансгенного животного через стадию дифференциации, и т.д.

“Микроинъекция соматической клетки” по настоящему раскрытию относится к микроинъекци материала, содержащего полинуклеотид, в соматической клетке.

Ядерный транспорт

В настоящем документе термин “ядерный транспорт” относится к удалению ядра из ооцита и введение донорского ядра, полученного из другой клетки, в ооцит. В настоящем документе термин “ядерный транспорт соматической клетки (SCNT)” относится к ядерному транспорту, при котором клеткой, содержащей донорское ядро, является соматическая клетка.

В настоящем документе термин “ядерный транспорт” включает методику удаления ядра из ооцита животного и получения животного, которое включает ту же генетическую информацию, как и клетка животного, содержащая донорское ядро, через стадию введения донорского ядра, полученного из клетки животного, стадию перепрограммирования, стадию дифференциации и стадию трансплантации через суррогатную мать. В настоящем документе, когда животным, включающим донорское ядро является соматическая клетка, термин “ядерный транспорт соматической клетки (SCNT)” включает методику получения животного, которое включает ту же генетическую информацию, что и соматическая клетка, через стадии, описанные выше.

Трансгенное животное может быть получено через доставку клетки, включающей донорское ядро. Например, трансгенное животное может быть получено через ядерный транспорт соматической клетки (SCNT) после микроинъекции соматической клетки.

Животное

Животное по настоящему раскрытию может включать животное, отличное от человека.

Животное может включать млекопитающее.

Млекопитающее может включать копытное.

Копытное может включать непарнокопытное. Непарнокопытное может включать лошадей, но не ограничено ими.

Копытное может включать парнокопытное. Парнокопытное может включать свиней, оленей, коров, овец и коз, но не ограничено ими.

Млекопитающее может включать грызунов. Грызун может включать крыс и мышей, но не ограничен ими.

Млекопитающее может включать лагоморфа. Лагоморф может включать кроликов и зайцев, но не ограничен ими.

Биореактор

“Биореактор” по настоящему раскрытию относится к организму, который может вызывать биологическую или химическую реакцию, которая происходит в живом организме.

Организм может включать клетку, колонию клеток и животное. Организм может включать трансгенную клетку, колонию трансгенных клеток и трансгенное животное. Например, биореактором может быть трансгенная мышь. Альтернативно, биореактором может быть трансгенная крыса. Альтернативно, биореактором может быть трансгенная корова.

Биореактор может применяться для получения целевого материала. Целевой материал может включать целевой белок. Например, когда биореактором является трансгенная корова, в которой нокинирован ген человеческого альбумина, трансгенная корова может применяться для вырабатывания человеческого альбумина.

[ЧАСТЬ I] Инструмент

1. Определение инструмента

В настоящем документе термин “инструмент” относится к экзополинуклеотиду, который вставлен или может быть вставлен в геном животного в клетке. Клеткой, в которую может быть вставлен инструмент, может быть или не быть трансформированной клеткой.

В настоящем документе термин “инструмент” может относиться к экзополинуклеотиду для трансформации генома животного в клетке. Например, инструмент может включать полинуклеотид, кодирующий целевой белок в геноме животного в клетке. В другом примере, инструмент может включать компоненты сконструированной нуклеазы или полинуклеотида, кодирующего компоненты сконструированной нуклеазы, способные проводить сайт-специфическую трансформацию в геноме животного в клетке. В другом примере, инструмент может включать транспозон.

2. Компоненты инструмента

Инструмент может включать первую концевую область на 5' конце, вторую концевую область на 3' конце и коровый домен, расположенный между первой концевой областью и второй концевой областью.

Первая концевая область и вторая концевая область могут включать, по меньшей мере, один редактирующий разрешающий компонент. Первая концевая область и вторая концевая область может включать одинаковый полинуклеотид. Первая концевая область и вторая концевая область могут включать полинуклеотиды, отличающиеся друг от друга.

ITR последовательность может быть включена в первую концевую область и вторую концевую область, и полинуклеотид, присутствующий между ITR последовательностями, может быть включен в коровый домен.

Коровый домен может включать редактирующий разрешающий компонент.

Коровый домен может включать полинуклеотид, кодирующий белок или РНК.

Коровый домен может включать полинуклеотид, кодирующий не функциональный пептид.

Коровый домен может включать полинуклеотид, кодирующий искусственный интрон.

Коровый домен может включать полинуклеотид, кодирующий не функциональную РНК.

Коровый домен может включать нетранскрибируемый полинуклеотид.

Коровый домен может включать нетранслируемый полинуклеотид.

Коровый домен может включать элемент контроля экспрессии.

Коровый домен может включать промотор.

2-1. Редактирующий разрешающий компонент

2-1-1. Сайт распознавания рекомбиназы

Инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий RRS. RRS может включать loxp, rox, FRT, attP, attB и их мутант, но не ограничен ими. loxp мутант может включать loxp66, loxp71, loxp72, loxp2722, loxp5171 и loxpm2, но не ограничен ими. rox мутант может включать rox4R, rox6R и rox2N, но не ограничен ими. FRT мутант может включать F3, F5, F10, F11, F12, F13, F14, F15 и F16, но не ограничен ими.

2-1-2. Последовательность инвертированного концевого повтора (ITR)

Инструмент может включать, по меньшей мере, одну ITR последовательность. ITR последовательность может взаимодействовать с hobo/Ac/Tam, P элементом, Sleeping Beauty (SB), Frog Prince, Hsmar1, Hsmar2, piggyBac (PB), Tol2, или их мутантом.

2-1-3. Целевой сайт сконструированной нуклеазы

Инструмент может включать, по меньшей мере, один целевой сайт сконструированной нуклеазы. Целевой сайт сконструированной нуклеазы может включать целевой сайт системы CRISPR/фермент. Целевым сайтом может быть нуклеотидная последовательность, соседняя к 5' концу или 3' концу PAM последовательности.

Инструмент может включать часть целевого сайта сконструированной нуклеазы на одном его конце. Инструмент может включать другую часть целевого сайта сконструированной нуклеазы и PAM последовательность на другом его конце.

2-2. Полинуклеотид, кодирующий белок или РНК

2-2-1. Целевой белок

Инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий белок. Тип целевого белка не ограничен, пока целевой белок может вырабатываться в клетке или животном, которое становится субъектом методики трансформации.

Целевой белок может включать компоненты сконструированной нуклеазы. Например, целевой белок может включать ZFN, TALEN, РНК-направляемую эндонуклеазу или ее модифицированную/сконструированную форму, но не ограничен ими.

Целевой белок может включать белок, полученный из животного, отличного от человека. Например, целевой белок может включать не человеческий альбумин, не человеческий интерлейкин, не человеческий инсулин, не человеческий эритропоэтин, не человеческое антитело, не человеческую омега-3 или их модифицированную/сконструированную форму, но не ограничен ими.

Целевой белок может включать белок, полученный от человека. Например, целевой белок может включать человеческий альбумин, человеческий интерлейкин, человеческий инсулин, человеческий эритропоэтин, человеческую гамма цепь, человеческую дельта цепь, человеческую альфа цепь, человеческую мю цепь, человеческую эпсилон цепь, человеческую каппа цепь, человеческую лямбда цепь или их модифицированную/сконструированную форму, но не ограничен ими.

2-2-2. Маркерный ген

Инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий маркерный ген. Маркерный ген может включать ген устойчивости к антибиотикам, антигенный ген, ген люциферазы, ген бета-галктозидазы, ген флуоресцентного белка и суицидальный ген, но не ограничен ими.

2-2-3. Сайт-специфическая рекомбиназа

Инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий SSR. SSR может включать Cre, Dre, Flp, KD, B2, B3, лямбда, HK022, HP1, гамма дельта, ParA, Tn3, Hin, Gin, Pin, phiC31, Bxb1, R4, или их мутант, но не ограничен ими.

2-2-4. Транспосаза

Инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий транспосазу. Транспосаза может включать hobo/Ac/Tam, P элемент, Sleeping Beauty (SB), Frog Prince, Hsmar1, Hsmar2, piggyBac (PB), Tol2 и их мутант, но не ограничен ими.

2-2-5. Эндонуклеаза

Инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий эндонуклеазу. Эндонуклеаза может включать ZFN, TALEN и РНК-направляемую эндонуклеазу, но не ограничен ими.

Инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу. РНК-направляемая эндонуклеаза может включать Cas9 или мутант Cas9. РНК-направляемая эндонуклеаза может включать Cpf1 или мутант Cpf1, но не ограничен ими.

2-2-6. Направляющая нуклеиновая кислота

Инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, который кодирует, по меньшей мере, одну из крРНК, тракрРНК и нРНК.

2-3. Полинуклеотид, кодирующий не функциональный полипептид

Инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий не функциональный полипептид.

Полинуклеотид, кодирующий не функциональный полипептид может включать часть полинуклеотида, кодирующего целевой белок, часть маркерного гена, часть полинуклеотида, кодирующего сайт-специфическую рекомбиназу, часть полинуклеотида, кодирующего транспосазу и часть полинуклеотида, кодирующего эндонуклеазу, но не ограничен ими.

Полинуклеотид, кодирующий не функциональный полипептид может включать стоп-кодон.

Полинуклеотид, кодирующий не функциональный полипептид может включать LSL.

Полинуклеотид, кодирующий не функциональный полипептид может включать полинуклеотид, кодирующий 2A пептид.

Полинуклеотид, кодирующий не функциональный полипептид может включать IRES.

2-4. Полинуклеотид, кодирующий нетранслированную РНК

Инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий нетранслированную РНК.

Полинуклеотид, кодирующий нетранслированную РНК, может включать направляющую нуклеиновую кислоту.

Полинуклеотид, кодирующий нетранслированную РНК, может включать AATAAA последовательность.

Полинуклеотид, кодирующий нетранслированную РНК, может включать поли T.

Полинуклеотид, кодирующий нетранслированную РНК, может не включать инициирующий кодон.

Полинуклеотид, кодирующий нетранслированную РНК, может не содержать последовательность Козака.

2-5. Нетранскрибируемый полинуклеотид

Инструмент может включать, по меньшей мере, один нетранскрибируемый полинуклеотид.

Нетранскрибируемый полинуклеотид может быть промотором.

Нуклеотидная последовательность нетранскрибируемого полинуклеотида может быть нуклеотидная последовательность, которая не присутствует в геноме животного в клетке. В этом случае, когда применяется сконструированная нуклеаза, которая нацелена на нетранскрибируемый полинуклеотид в качестве целевого сайта, сайт-специфическая трансформация может быть проведена, не взаимодействуя с геномом животного в клетке.

Нуклеотидная последовательность нетранскрибируемого полинуклеотида может быть такой же, как для части полинуклеотида, кодирующего белок или РНК, которые обычно экспрессируются в клетках. В этом случае, промотор может не быть расположен выше нетранскрибируемого полинуклеотида.

Нетранскрибируемый полинуклеотид может применяться в качестве целевого сайта сконструированной нуклеазы. Например, в случае, когда инструмент, включающий нетранскрибируемый полинуклеотид, вставляют в геном животного в клетке, сайт-специфическая трансформация может происходить в нетранскрибируемом полинуклеотиде через введение Cas9 и нРНК, которые являются такими же, как часть нетранскрибируемого полинуклеотида или способны к комплементарному связыванию с ним, в клетке.

2-6. Искусственный интрон

Инструмент может включать, по меньшей мере, один искусственный интрон.

Искусственный интрон может быть включен в инструмент отдельно или в сочетании с полинуклеотидом, кодирующим целевой белок.

Искусственный интрон может быть расположен в транскриптоне полинуклеотида, кодирующего целевой белок.

Искусственный интрон может включать сайт донора сплайсинга на 5' конце и сайт акцептора сплайсинга на 3' конце.

По меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий RRS, может быть включен между сайтом донора сплайсинга и сайтом акцептора сплайсинга искусственного интрона.

Искусственный интрон может включать стоп-кодон.

Искусственный интрон может включать энхансер.

Искусственный интрон может быть удален сплайсингом.

Искусственный интрон может быть выбран из любой группы, состоящей из a) интрона, который получают из природного интрона или самого целевого сайта, b) интрона, который модифицирован замещением, делецией и/или вставкой нуклеотида, полученного из натурального интрона, c) природного интрона из другого целевого гена, d) интрона, который получен из другого интрона, e) химерного интрона, который состоит из последовательностей разных интронов, индуцированных из, по меньшей мере, одной последовательности натурального интрона целевого гена и/или другого гена, f) нового синтезированного интрона синтазы и g) их сочетания.

Искусственный интрон может повышать или снижать экспрессию полинуклеотида, кодирующего целевой белок.

Искусственный интрон может повышать или снижать экспрессию полинуклеотида в геноме.

2-7. Элемент контроля экспрессии

Инструмент может включать, по меньшей мере, один элемент контроля экспрессии.

Элемент контроля экспрессии может включать элемент контроля транскрипции. Элемент контроля транскрипции такой же, как предложен выше.

Элемент контроля экспрессии может включать элемент контроля посттранскрипционной обработки. Элемент контроля посттранскрипционной обработки такой же, как предложен выше.

Элемент контроля экспрессии может включать элемент контроля трансляции. Элемент контроля трансляции такой же, как предложен выше.

Элемент контроля экспрессии может включать элемент контроля посттрансляционной модификации. Элемент контроля посттрансляционной модификации такой же, как предложен выше.

2-8. Промотор

Инструмент может включать промотор.

Промотор может включать конститутивный промотор. Конститутивный промотор такой же, как предложен выше.

Промотор может включать ткань-специфический промотор. Ткань-специфический промотор такой же, как предложен выше.

Промотор может включать индуцируемый промотор. Индуцируемый промотор такой же, как предложен выше.

2-9. Конструирование инструмента

2-9-1. ITR последовательность-сайт распознавания рекомбиназы или целевой сайт сконструированной нуклеазы-ITR последовательность

Первая концевая область и вторая концевая область инструмента может включать ITR последовательность. Коровый домен инструмента может включать, по меньшей мере, один сайт распознавания рекомбиназы.

Инструмент может обеспечивать место, на котором может быть произведена вставка или обмен экзополинуклеотида без оказания фатального действия на экспрессию гена геномом животного в клетке.

2-9-2. ITR последовательность-целевой сайт сконструированной нуклеазы-ITR последовательность

Первая концевая область и вторая концевая область инструмента может включать ITR последовательность. Коровый домен инструмента может включать, по меньшей мере, один целевой сайт сконструированной нуклеазы.

2-9-3. ITR последовательность-полинуклеотид, кодирующий сконструированную нуклеазу-сайт распознавания рекомбиназы-ITR последовательность

Первая концевая область и вторая концевая область инструмента может включать ITR последовательность. Коровый домен инструмента может включать полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу. Коровый домен инструмента может включать, по меньшей мере, один сайт распознавания рекомбиназы.

Полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, может быть вставлен в инструмент с применением, по меньшей мере, одного сайта распознавания рекомбиназы. Целевой сайт, на котором может происходить сайт-специфическая трансформация, может быть изменен с применением сайта распознавания рекомбиназы.

По меньшей мере, один сайт распознавания рекомбиназы может включать сайт распознавания рекомбиназы 1 (RRS1) и сайт распознавания рекомбиназы 2 (RRS2). Сайт распознавания рекомбиназы 1 (RRS1) может быть расположен выше полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и сайт распознавания рекомбиназы 2 (RRS2) может быть расположен ниже полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу. Полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу в инструменте, может быть обменен с разными экзополинуклеотидами с применением сайта распознавания рекомбиназы 1 (RRS1) и сайта распознавания рекомбиназы 2 (RRS2).

2-9-4. ITR последовательность-полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу-полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту-сайт распознавания рекомбиназы-элемент контроля экспрессии-ITR последовательность

Первая концевая область и вторая концевая область инструмента может включать ITR последовательность. Коровый домен инструмента может включать полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу. Коровый домен инструмента может включать полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту. Коровый домен инструмента может включать, по меньшей мере, один сайт распознавания рекомбиназы. Коровый домен инструмента может включать, по меньшей мере, один из элемента, контролирующего экспрессию РНК-направляемой эндонуклеазы, и элемента, контролирующего экспрессию направляющей нуклеиновой кислоты.

По меньшей мере, один сайт распознавания рекомбиназы может быть расположен выше или ниже полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу. Элемент, контролирующий экспрессию полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, может быть вставлен или удален с применением, по меньшей мере, одного сайта распознавания рекомбиназы.

По меньшей мере, один сайт распознавания рекомбиназы может быть расположен выше или ниже полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту. Элемент, контролирующий экспрессию полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту, может быть вставлен или удален с применением, по меньшей мере, одного сайта распознавания рекомбиназы.

По меньшей мере, один сайт распознавания рекомбиназы может включать сайт распознавания рекомбиназы 1 (RRS1) и сайт распознавания рекомбиназы 2 (RRS2). Сайт распознавания рекомбиназы 1 (RRS1) может быть расположен выше полинуклеотида, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, и сайт распознавания рекомбиназы 2 (RRS2) может быть расположен ниже полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту. Полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту в инструменте может быть удален с применением сайта распознавания рекомбиназы 1(RRS1) и сайта распознавания рекомбиназы 2 (RRS2).

2-9-5. ITR последовательность-маркерный ген-ITR последовательность

Первая концевая область и вторая концевая область инструмента может включать ITR последовательность. Коровый домен инструмента может включать полинуклеотид, кодирующий, по меньшей мере, один маркерный ген. По меньшей мере, один маркерный ген может включать суицидальный ген.

Маркерный ген может быть нокаутирован сайт-специфической трансформацией полинуклеотида, кодирующего маркерный ген.

2-9-6. Сайт распознавания рекомбиназы-полинуклеотид, кодирующий транспосазу-сайт распознавания рекомбиназы

Первая концевая область инструмента может включать сайт распознавания рекомбиназы 1 (RRS1). Вторая концевая область инструмента может включать сайт распознавания рекомбиназы 2 (RRS2), который образует пару с сайтом распознавания рекомбиназы 1 (RRS1). Коровый домен инструмента может включать полинуклеотид, кодирующий транспосазу. Транспосаза может включать только эксцизионную транспосазу.

Транспозон, включенный в геном животного в клетке, может быть удален с применением инструмента.

2-9-7. Целевой сайт сконструированной нуклеазы-ITR последовательность-экзополинуклеотид-ITR последовательность-целевой сайт сконструированной нуклеазы

Первая концевая область и вторая концевая область инструмента может включать целевой сайт сконструированной нуклеазы. Коровый домен инструмента может включать первую ITR последовательность, вторую ITR последовательность и экзополинуклеотид. Полинуклеотид, кодирующий целевой белок, может быть расположен между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью.

Экзополинуклеотид может быть вставлен в геном животного в клетке с применением инструмента при проведении сайт-специфической трансформации. Дополнительно, только экзополинуклеотид может быть удален транспосазой при сохранении сайт-специфической трансформации в геноме животного в клетке.

3. Функции инструмента

Инструмент может применяться для экспрессии белка или нуклеиновой кислоты, необходимых для трансформации генома животного в клетке. Например, инструмент может включать полинуклеотид, кодирующий Cas9. Когда нРНК, которая имеет часть нуклеотидной последовательности в геноме животного, включающего инструмент в качестве целевого сайта, вводят в клетку, нРНК может образовывать комплекс с Cas9, которая экспрессируется в клетке, и тем самым вызывать сайт-специфическую трансформацию в целевом сайте в геноме животного.

Инструмент может применяться для нокина гена в геном животного в клетке. Например, инструмент может включать полинуклеотид, кодирующий человеческий интерлейкин. Инструмент может быть вставлен в бычий геном в клетке так, чтобы клетка экспрессировала человеческий интерлейкин.

Инструмент может применяться для нокаута гена, присутствующего в геноме животного в клетке. Например, инструмент может быть вставлен в середину полинуклеотида, кодирующего экзон бычьего альбумина в бычьем геноме в клетке и тем самым предотвратить экспрессию клеткой бычьего альбумина.

Инструмент может представлять сайт, способный к трансформации в геноме животного в клетке. Например, инструмент может включать нуклеотидную последовательность, которая может быть целевым сайтом сконструированной нуклеазы. Например, инструмент может включать полинуклеотид, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP). Когда бычий геном в клетке включает инструмент, нРНК, которая нацелена на часть нуклеотидной последовательности полинуклеотида, кодирующего зеленый флуоресцентный белок (GFP) и Cas9, может быть введена в клетку, и тем самым сайт-специфическая трансформация может быть вызвана в части нуклеотидной последовательности полинуклеотида, кодирующего зеленый флуоресцентный белок (GFP) в инструменте, но не в нуклеотидной последовательности вне инструмента.

[Честь II] Вставка инструмента

1. Вектор доставки инструмента

Инструмент может быть доставлен для вставки инструмента в геном животного в клетке. Вектор доставки нуклеиновой кислоты, включающей инструмент, может быть вектор депротеинизированной нуклеиновой кислоты, не вирусный вектор или вирусный вектор.

2. Способ вставки инструмента

2-1. Применение гомологической рекомбинации

Первое плечо гомологии может быть расположено на 5' конце первой концевой области инструмента. Второе плечо гомологии может быть расположено на 3' конце второй концевой области. Первое плечо гомологии может иметь такую же нуклеотидную последовательность, как и часть генома животного в клетке. Второе плечо гомологии иметь такую же нуклеотидную последовательность, как и часть генома животного в клетке.

Первое плечо гомологии и второе плечо гомологии могут взаимодействовать с частью генома в клетке. Инструмент может быть вставлен в геном через взаимодействие.

2-2. Применение сайт-специфической рекомбинации

Первая концевая область инструмента может включать RRS1. Вторая концевая область инструмента может включать RRS2.

По меньшей мере, одна рекомбиназа может быть представлена для введения инструмента в клетку. Рекомбиназа может включать первую рекомбиназу, которая может взаимодействовать с RRS1. Рекомбиназа может включать вторую рекомбиназу, которая может взаимодействовать с RRS2. Первая рекомбиназа и вторая рекомбиназа могут быть одинковыми. Например, если RRS1 является loxp и RRS2 является loxp мутантом, первая рекомбиназа и вторая рекомбиназа может быть Cre.

Для введения, по меньшей мере, одной рекомбиназы в клетку, может применяться вектор депротеинизированной нуклеиновой кислоты, не вирусный вектор, вирусный вектор, каждый из которых включает полинуклеотид, кодирующий рекомбиназау или полипептид рекомбиназы.

Для введения инструмента в клетку, нуклеиновая кислота, включающая инструмент и, по меньшей мере, одна рекомбиназа, может быть представлена в индивидуальной форме. Например, нуклеиновая кислота, включающая инструмент может быть доставлена ДНК плазмидным вектором, и рекомбиназа может быть доставлена полипептидом рекомбиназы.

Для введения инструмента в клетку, нуклеиновая кислота, включающая инструмент и, по меньшей мере, одна рекомбиназа, могут быть представлены одним вектором доставки. Например, нуклеиновая кислота, включающая инструмент, и полинуклеотид, кодирующий рекомбиназу, могут быть представлены одним ДНК плазмидным вектором.

2-3. Применение транспозонной системы

Первая концевая область и вторая концевая область инструмента может включать ITR последовательность.

Для введения инструмента в клетку, может быть представлена транспосаза. Транспосаза может взаимодействовать с ITR последовательностью.

Для введения транспосазы в клетку, может применяться вектор депротеинизированной нуклеиновой кислоты, не вирусный вектор, вирусный вектор, каждый из которых включает полинуклеотид, кодирующий транспосазу, или полипептид транспосазы.

Нуклеиновая кислота, включающая инструмент, и транспосаза могут быть представлены в индивидуальной форме. Например, нуклеиновая кислота, включающая инструмент, может быть доставлена ДНК плазмидным вектором, и транспосаза может быть доставлена полипептидом.

Нуклеиновая кислота, включающая инструмент, и транспосаза могут быть представлены в индивидуальной форме. Например, нуклеиновая кислота, включающая инструмент, может быть доставлена ДНК плазмидным вектором, и транспосаза может быть доставлена отдельным ДНК плазмидным вектором, который включает полинуклеотид, кодирующий транспосазу.

Нуклеиновая кислота, включающая инструмент, и транспосаза могут быть введены в клетку одним вектором доставки. Например, нуклеиновая кислота, включающая инструмент, и полинуклеотид, кодирующий транспосазу, могут быть представлены одним ДНК плазмидным вектором.

2-4. Применение сконструированной нуклеазы

2-4-1. Применение репарации, направляемой гомологией (HDR)

Первое плечо гомологии может быть расположено на 5' конце первой концевой области инструмента. Второе плечо гомологии может быть расположено на 3' конце второй концевой области инструмента. Первое плечо гомологии может иметь такую же нуклеотидную последовательность, как и часть генома животного в клетке. Второе плечо гомологии может иметь такую же нуклеотидную последовательность, как и часть генома животного в клетке.

Для введения инструмента в клетку может применяться любой из векторов доставки нуклеиновой кислоты, включая инструмент.

Для введения инструмента в клетку, может быть представлена сконструированная нуклеаза. Сконструированная нуклеаза может специфически действовать на целевой сайт сконструированной нуклеазы, присутствующий в геноме животного. Целевой сайт сконструированной нуклеазы, присутствующий в геноме животного, может быть расположен на нуклеотидной последовательности, которая является такой же или комплементарна первому плечу гомологии; может быть расположен на нуклеотидной последовательности, которая является такой же или комплементарна второму плечу гомологии; или может быть расположен между нуклеотидной последовательностью, которая является такой же или комплементарна первому плечу гомологии, и нуклеотидной последовательностью, которая является такой же или комплементарна второму плечу гомологии.

По меньшей мере, одна сконструированная нуклеаза может быть представлена в любом из выбранных из вектора депротеинизированной нуклеиновой кислоты, не вирусного вектора, вирусного вектора, каждый из которых включает полинуклеотид, кодирующий каждый компонент сконструированной нуклеазы, белок сконструированной нуклеазаы, комплекс, включающий белок сконструированной нуклеазы и их сочетание.

Например, может быть представлен комплекс, включающий белок Cas9 и нРНК. В другом примере, может быть представлен вектор депротеинизированной нуклеиновой кислоты, который включает полинуклеотид, кодирующий Cas9, и полинуклеотид, кодирующий нРНК.

Для введения инструмента в клетку, нуклеиновая кислота, включающая инструмент, и, по меньшей мере, одна сконструированная нуклеаза может быть представлена в отдельной форме. Например, нуклеиновая кислота, включающая инструмент, может быть представлена ДНК плазмидным вектором, и сконструированная нуклеаза может быть представлена в виде комплекса, включающего белок Cas9 и нРНК. В другом примере, нуклеиновая кислота, включающая инструмент, может быть представлена ДНК плазмидным вектором, и сконструированная нуклеаза может быть представлена вектором депротеинизированной нуклеиновой кислоты, который включает полинуклеотид, кодирующий Cas9, и полинуклеотид, кодирующий нРНК.

Для введения инструмента в клетку, нуклеиновая кислота, включающая инструмент, и сконструированная нуклеаза может быть представлена одним вектором. Например, нуклеиновая кислота, включающая инструмент, полинуклеотид, кодирующий Cas9, и полинуклеотид, включающий нРНК, может быть представлен одним ДНК плазмидным вектором.

2-4-2. Применение независимой от морфологии целевой вставки (HITI)

Первая концевая область инструмента может включать первый целевой сайт сконструированной нуклеазы. Вторая концевая область инструмента может включать второй целевой сайт сконструированной нуклеазы. Первый целевой сайт сконструированной нуклеазы и второй целевой сайт сконструированной нуклеазы может включать одинаковую нуклеотидную последовательность.

Для введения инструмента в клетку, может быть представлена, по меньшей мере, одна сконструированная нуклеаза. Сконструированная нуклеаза может включать первую сконструированную нуклеазу, которая может специфически действовать на первый целевой сайт сконструированной нуклеазы. Сконструированная нуклеаза может включать вторую сконструированную нуклеазу, которая может специфически действовать на второй целевой сайт сконструированной нуклеазы. Первая сконструированная нуклеаза и вторая сконструированная нуклеаза могут быть одинаковыми.

По меньшей мере, одна сконструированная нуклеаза может быть представлена в одном из выбранных из вектора депротеинизированной нуклеиновой кислоты, не вирусного вектора, вирусного вектора, каждый из которых включает полинуклеотид, кодирующий каждый компонент сконструированной нуклеазы, белок сконструированной нуклеазы, комплекс, включающий белок сконструированной нуклеазы и их сочетание.

Для введения инструмента в клетку, нуклеиновая кислота, включающая инструмент, и, по меньшей мере, одна сконструированная нуклеаза может быть представлена одним вектором. Например, нуклеиновая кислота, включающая инструмент, полинуклеотид, кодирующий Cas9, и полинуклеотид, включающий нРНК может быть представлен одним ДНК плазмидным вектором.

3. Локус вставки инструмента

3-1. Вставка одного инструмента

Геном животного в клетке может включать один инструмент.

Один инструмент может быть включен в любую из эухромосом в геноме животного.

Инструмент может быть включен в любую из половых хромосом в геноме животного. Инструмент может быть включен в X хромосому генома животного. Инструмент может быть включен в Y хромосому генома животного.

3-2. Вставка множества инструментов

Геном животного в клетке может включать два или более инструментов.

Все из двух или более инструментов могут быть идентичны друг другу.

Один из двух или более инструментов может отличаться от остальных.

Разница между инструментами может относиться к разнице последовательностей между этими инструментами.

Например, первый инструмент, который включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и второй инструмент, который включает полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, способную связываться с целевым сайтом, могут считаться двумя разными инструментами.

Все из двух или более полинуклеотидов могут быть включены в одну хромосому. Хромосомой может быть эухромосома или половая хромосома.

Два или более инструментов могут включать, по меньшей мере, первый инструмент и второй инструмент. В этом случае, первый инструмент может быть расположен на первой хромосоме, и второй инструмент может быть расположен на второй хромосоме, которая отличается от первой хромосомы.

Первой хромосомой может быть эухромосома.

Первой хромосомой может быть половая хромосома.

Второй хромосомой может быть эухромосома.

Второй хромосомой может быть половая хромосома.

3-3. Характеристики локуса вставки

Инструмент может быть расположен между нуклеотидными последовательностями, которые могут взаимодействовать с транспосазой. Нуклеотидные последовательности, которые могут взаимодействовать с транспосазой, могут включать TA и TTAA, но не ограничены ими.

Инструмент может быть расположен на полинуклеотиде, который может быть вовлечен в экспрессию любого белка или РНК в геноме животного в клетке.

Например, инструмент может быть расположен на любом, выбранном из полинуклеотида, кодирующего белок или РНК, промотора полинуклеотида, кодирующего белок или РНК, 5' UTR, интрона, экзона и 3' UTR. Инструмент может нокаутировать белок или РНК в геноме животного в клетке. Например, когда инструмент расположен на экзоне гена бета-лактоглобулина в бычьем геноме, возможно предотвратить экспрессию бета-лактоглобулина в клетке, включающей бычий геном.

A инструмент может быть расположен на полинуклеотиде в геноме животного в клетке, который не вовлечен в экспрессию любого белка или РНК.

Дополнительно, инструмент может быть расположен в убежище в геноме животного в клетке.

Если геномом животного является мышиный геном, убежище мышиного генома может включать rosa26 локус, который уже хорошо известен.

Если геномом животного является бычий геном, убежище бычьего генома может включать место, которое уже хорошо известно в бычьем геноме. Убежище бычьего генома может включать локусы, показанные в таблице 1 ниже, но не ограничен ими. Каждый из локусов, описанных в таблице 1 ниже, может быть расположен между геном, расположенным максимально близко к 5' концу (5' геном) и геном, расположенным максимально близко к 3' концу (3' геном).

[Таблица 1]

Хромосома бычьего генома	Локус №	5' ген	3' ген
1	1-1	MIS184	HUNK
1	1-2	ENSBTAG00000025847.3	ENSBTAG00000011051.5
2	2-1	SLC38A11	COBLL1
3	3-1	GBP5	GBP4
	3-2	PEX19	PEA15
	3-3	PDE4B	OB-R
	3-4	PDE4B	LEPR
4	4-1	GNAT3	PHTF2
	4-2	TSGA13	MKLN1
	4-3	NPVF	C7orf31
	4-4	ENSBTAG00000001198.5	ENSBTAG00000046257.1
5	5-1	ATXN7L3B	CAPS2
	5-2	TMEM5	AVPR1A
	5-3	XRCC6BP1	CTDSP2
	5-4	MPST	KCTD17
6	6-1	DKK2	GIMD1
	6-2	PLAC8	COQ2
	6-3	LCORL	SLIT2
7	7-1	ERAP2	LNPEP
7	7-2	C7H5orf30	NUDT12
9	9-1	STXBP5	SAMD5
10	10-1	ALDH6A1	VSX2
11	11-1	PTP	LRRTM4
11	11-2	PSMD13	-
12	12-1	ENSBTAG00000010680.5	U2
14	14-1	CSMD3	CSMD3
15	15-1	SMAP	INSC
17	17-1	ORAI1	RNF34
18	18-1	HSD17B2	CDH13
21	21-1	TRPM1	APBA2
22	22-1	bta-mir-2370	DENND6A
25	25-1	AUTS2	ENSBTAG00000047342
26	26-1	MKI67	EBF3
26	26-2	EMX2	RAB11FIP2
X	X-1	WWC3	DDX3Y
	X-2	ARAF	SYN1
	X-3	PBDC1	MAGEE2

Если инструмент расположен на полинуклеотиде, который не вовлечен в экспрессию белков или РНК в геноме животного в клетке, или расположен в убежище в геноме животного в клетке, инструмент может быть использован в качестве искусственного убежища для дополнительной трансформации. Например, если инструмент, расположенный в убежище в бычьем геноме, включает loxp, экзополинуклеотид может быть вставлен в инструмент доставкой экзополинуклеотида, включающего loxp и Cre рекомбиназу, без влияния на экспрессию любого белка или РНК в геноме животного в клетке.

4. Трансформированная клетка, в которую вставлен инструмент

4-1. Одна клетка

4-1-1. Плоидность

Трансформированной клеткой, включающей, по меньшей мере, один инструмент, может быть диплоидная клетка. Диплоидная клетка может включать стволовую клетку, соматическую клетку, оогониальную стволовую клетку, оогоний, первичный ооцит, сперматогониальную стволовую клетку, сперматогоний, первичный степматоцит и зиготу. Трансформированной клеткой, включающей, по меньшей мере, один инструмент, может быть гаплоидная клетка. Гаплоидная клетка может включать вторичный ооцит, яйцеклетку, вторичный сперматоцит и сперматозоид.

4-1-2. Зиготность

Трансформированная клетка может включать, по меньшей мере, одну пару гомологичных хромосом. По меньшей мере, одна пара гомологичных хромосом может включать первую хромосому и вторую хромосому, которые находятся во взаимоотношении гомологичных хромосом.

Трансформированная клетка, включающая два или более инструментов, может быть гомозиготой.

В трансформированной клетке, которая является гомозиготой, все типы, количества и расположение инструментов, включенных в первую хромосому и вторую хромосому, могут быть одинаковыми.

В трансформированной клетке, которая является гомозиготой, и тип и количество инструментов, включенных в первую хромосому и вторую хромосому, могут быть одинаковыми.

В трансформированной клетке, которая является гомозиготой, типы инструментов, включенных в первую хромосому и вторую хромосому, могут быть одинаковыми.

В трансформированной клетке, которая является гомозиготой, и первая хромосома и вторая хромосома может не включать никакой инструмент.

Трансформированная клетка, включающая два или более инструментов, может быть гетерозиготой.

В трансформированной клетке, которая является гетерозиготой первая хромосома может не включать инструмент, и вторая хромосома может включать, по меньшей мере, один инструмент.

Альтернативно, в трансформированной клетке, которая является гетерозиготой, вторая хромосома может не включать инструмент, который является таким же, как включен в первую хромосому.

4-2. Колония клеток

Трансформированная клетка, включающая, по меньшей мере, один инструмент, может образовывать колонию клеток. Колонией клеток может быть популяция клеток, которую культивируют из одной клетки.

4-2-1. Гомологичная колония клеток

Каждая клетка, включенная в гомологичную колонию клеток, может включать один инструмент. Одинарные инструменты, которые имеет каждая клетка, могут быть одинаковыми. В каждой клетке, один инструмент может быть расположен в одном и том же положении.

Каждая клетка, включенная в гомологичную колонию клеток, может включать два или более инструментов. Два или более инструментов может включать n-ный инструмент (n≥1, n является целым числом). В каждой клетке и тип и расположение n-ного инструмента могут быть одинаковыми.

Два или более инструментов могут быть одинаковыми. Альтернативно, один из двух или более инструментов может отличаться от других из оставшихся инструментов.

Далее, если не указано иное, выражение “инструмент, включенный в первую клетку является таким же, как инструмент, включенный во вторую клетку” означает, что тип, количество и расположение инструментов, включенных в первую клетку, совершенно такие же, как тип, количество и расположение инструментов, включенных во вторую клетку.

4-2-2. Химерная колония клеток

Химерная колония клеток относится к колонии клеток, отличной от гомологичной колонии клеток.

Химерная колония клеток может включать и клетку, которая имеет геном, в который не включен инструмент, и клетку, которая имеет геном, в который включен, по меньшей мере, один инструмент.

Химерная колония клеток может включать первую клетку и вторую клетку, каждая из которых имеет геном, в который включен, по меньшей мере, один инструмент. В этом случае, по меньшей мере, один из типа, количества и локуса инструментов, включенных в геном первой клетки, может быть не таким же, как тип, количество и локус инструментов, включенных в геном второй клетки.

Например, в случае колонии клеток, в которой первый инструмент включен в геном первой клетки, и первый инструмент того же типа включен в геном второй клетки, колония клеток может быть химерной колонией клеток, когда i) количество первых инструментов, включенных в геном первой клетки, отличается от количества первых инструментов, включенных в геном второй клетки, или ii) локус инструмента, включенного в геном первой клетки, отличается от локуса первого инструмента, включенного в геном второй клетки.

В другом примере, в случае колонии клеток, где первый инструмент включен в геном первой клетки, и второй инструмент другого типа включен в геном второй клетки, колония клеток также может быть химерной колонией клеток, когда i) количество первого инструмента, включенного в геном первой клетки, такое же, как и количество второго инструмента, включенного в геном второй клетки, и ii) все локусы первого инструмента, включенного в геном первой клетки, такие же, как и локусы второго инструмента, включенного в геном второй клетки.

Кроме того, в случае колонии клеток, где первый инструмент включен в геном первой клетки, а второй инструмент другого типа включен в геном второй клетки, колония клеток также может быть химерной колонией клеток, когда i) количество первых инструментов, включенных в геном первой клетки, отличается от количества вторых инструментов, включенных в геном второй клетки, или ii) локус первого инструмента, включенного в геном первой клетки, отличается от локуса второго инструмента, включенного в геном второй клетки.

В настоящем документе термин “локус” может быть определен одним или более эндогенными генами, ближайшими к 5' концу, и эндогенными генами, ближайшими к 3'-концу, относительно инструмента.

В настоящем документе термин “локус инструмента” может быть определен одним или более эндогенными генами, ближайшими к 5' концу, и эндогенными генами, ближайшими к 3' концу относительно инструмента.

То есть, когда эндогенный ген, ближайший к 5 'концу первого инструмента, отличается от гена, ближайшего к 5' концу второго инструмента, локус первого инструмента отличается от локуса второго инструмента. Кроме того, когда эндогенный ген, ближайший к 3 'концу второго инструмента, отличается от гена, ближайшего к 3' концу второго инструмента, локус первого инструмента отличается от локуса второго инструмента.

5. Выбор трансформированной клетки, в которую вставляют инструмент

5-1. Выбор трансформированной клетки с применением гена устойчивости к антибиотикам

Коровый домен инструмента может включать ген устойчивости к антибиотикам. Животные клетки, включающие инструмент, могут выживать при обработке клетки антибиотиком. Следовательно, животные клетки, включающие инструмент, могут быть отделены от тех, которые не включают инструмент.

5-2. Выбор трансформированной клетки с применением ответа антиген-антитело

Коровый домен инструмента может включать полинуклеотид, который кодирует антиген, или нуклеотид, который может действовать как антиген. Животные клетки, включающие инструмент, могут взаимодействовать с антителами, специфическими к антигену. Следовательно, животные клетки, включающие инструмент, могут быть отделены от тех, которые не включают инструмент.

5-3. Выбор трансформированной клетки с применением флуоресцентного белка

Коровый домен инструмента может включать полинуклеотид, кодирующий флуоресцентный белок. Животные клетки, включающие инструмент, могут быть измерены сигналом флуоресценции. Следовательно, животные клетки, включающие инструмент, могут быть отделены от клеток, не включающих инструмент.

5-4. Выбор трансформированной клетки с применением поверхностного маркерного гена

Коровый домен инструмента может включать полинуклеотид, кодирующий поверхностный маркер. Животные клетки, включающие инструмент, могут взаимодействовать с антителами, специфическими к поверхностному маркеру. Антитела могут взаимодействовать с магнитными частицами или флуорофорами. Следовательно, животные клетки, включающие инструмент, могут быть отделены от клеток, не включающих инструмент, через магнитные свойства или сигнал флуоресценции.

6. Трансгенные животные, в которых вставлен инструмент

6-1. Отдельные трансгенные животные, в которых вставлен инструмент

Трансгенное животное может включать одну или более трансформированных клеток, где каждая трансформированная клетка включает, по меньшей мере, один инструмент.

6-1-1. Гомологичное

Каждая из клеток, включенных в гомологичное трансгенное животное, может индивидуально включать один инструмент. Отдельные инструменты, который имеет каждая клетка, могут быть одинаковыми. В каждой клетке один инструмент может находиться на одинаковых хромосомах.

Каждая из клеток, включенных в гомологичное трансгенное животное, может включать два или более инструментов. Два или более инструментов могут включать n-ный инструмент (n≥1, n является целым числом). В каждой клетке все хромосомы, на которых расположен n-ный инструмент, могут быть одинаковыми.

Два или более инструментов могут быть одинаковыми. Альтернативно, один из двух или более инструментов может отличаться от другого из оставшихся инструментов.

Гомологичное трансгенное животное может включать трансформированную клетку, которая является гомозиготой.

Гомологичное трансгенное животное может включать трансформированную клетку, которая является гетерозиготой.

6-1-2. Химерное

Химерное трансгенное животное относится к трансгенному животному, отличному от гомологичного трансгенного животного.

Химерное трансгенное животное может включать гомозиготные трансформированные клетки.

Химерное трансгенное животное может включать гетерозиготные трансформированные клетки.

Химерное трансгенное животное может включать и клетку, которая имеет геном, в который не включен инструмент, и клетку, которая имеет геном, в который включен, по меньшей мере, один инструмент.

Химерное трансгенное животное может включать первую клетку и вторую клетку, каждая из которых имеет геном, который включает, по меньшей мере, один инструмент. В этом случае, в химерном трансгенном животном, по меньшей мере, один из типа, количества и локуса инструментов, включенных в геном первой клетки, может не быть тем же типом, количеством и локусом инструментов, включенных в геном второй клетки.

Например, в случае трансгенного животного, которое включает первую клетку, имеющую геном, который включает первый инструмент, и вторую клетку, имеющий геном, который включает первый инструмент, трансгенным животным может быть химерное трансгенное животное, если i) количество первых инструментов, включенных в геном первой клетки, отличается от количества первых инструментов, включенных в геном второй клетки, или ii) по меньшей мере, один из локусов первого инструмента, включенного в геном первой клетки, отличается от локуса первого инструмента, включенного в геном второй клетки.

В другом примере, в случае трансгенного животного, которое включает первую клетку, имеющую геном, который включает первый инструмент, и вторую клетку, имеющую геном, который включает второй инструмент, тип которого отличается от первого инструмента, трансгенным животным может быть химерное трансгенное животное, если i) количество первых инструментов, включенных в геном первой клетки, является таким же, как количество вторых инструментов, включенных в геном второй клетки, и ii) все локусы первого инструмента, включенные в геном первой клетки, являются такими же, как локусы второго инструмента, включенные в геном второй клетки.

Дополнительно, в случае трансгенного животного, которое включает первую клетку, имеющую геном, который включает первый инструмент, и вторую клетку, имеющую геном, который включает второй инструмент, тип которого отличается от первого инструмента, трансгенным животным может быть химерное трансгенное животное, если i) количество первых инструментов, включенных в геном первой клетки, отличается от количества вторых инструментов, включенных в геном второй клетки, или ii) по меньшей мере, один из локусов первого инструмента, включенного в геном первой клетки, отличается от локуса второго инструмента, включенного в геном второй клетки.

6-2. Способ получения отдельного трансгенного животного, в которое вставлен инструмент

Способ получения трансгенного животного, в которое вставлен инструмент, включает способ получения трансгенного животного из животной клетки, способ получения трансгенного животного через доставку инструмента в ткань или орган животного, и способ получения трансгенного животного скрещивания между трансгенными животными. Способ получения трансгенного животного из животной клетки включает способ получения трансгенного животного из дикой животной клетки и способ получения трансгенного животного из клетки трансгенного животного.

Трансгенным животным, получаемым любым из вышеуказанных способов, может быть любое из химерного трансгенного животного или гомологичного трансгенного животного.

6-2-1. Способ получения трансгенного животного из животной клетки

Трансгенное животное может быть получено, включая способ доставки инструмента в дикую животную клетку.

Например, трансгенное животное может быть получено инъекцией полинуклеотида в дикую соматическую клетку микроинъекцией соматической клетки после ядерного транспорта соматической клетки (далее, SCNT). Трансгенным животным может быть гомологичное трансгенное животное.

Например, трансгенное животное может быть получено микроинъекцией гаметы в дикую гамету. Трансгенным животным может быть химерное трансгенное животное.

Например, трагсгенное животное может быть получено микроинъекцией зиготы в дикую зиготу. Трансгенным животным может быть химерное трансгенное животное.

Например, трагсгенное животное может быть получено микроинъекцией эмбриона в дикий эмбрион. Трансгенным животным может быть химерное трансгенное животное.

Трансгенное животное может быть получено с применением трансгенной животной клетки.

Например, трагсгенное животное может быть получено через SCNT с применением трансгенной соматической клетки. Трансгенным животным может быть гомологичное трансгенное животное.

Например, трагсгенное животное может быть получено через SCNT после микроинъекции соматической клетки в трансгенную соматическую клетку. Трансгенным животным может быть гомологичное трансгенное животное.

Например, трагсгенное животное может быть получено микроинъекцией гаметы в трансгенную гамету. Трансгенным животным может быть химерное трансгенное животное.

Например, трагсгенное животное может быть получено микроинъекцией зиготы в трансгенную зиготу. Трансгенным животным может быть химерное трансгенное животное.

Например, трагсгенное животное может быть получено микроинъекцией эмбриона в трансгенный эмбрион. Трансгенным животным может быть химерное трансгенное животное.

6-2-2. Способ получения трансгенного животного через доставку инструмента в ткань или орган животного

Трансгенное животное может быть получено доставкой инструмента в ткань или орган животного.

Например, трагсгенное животное может быть получено микроинъекцией в ткань молочной железы животного. Трансгенным животным может быть химерное трансгенное животное.

Например, трагсгенное животное может быть получено микроинъекцией в репродуктивный орган животного. Потомство, полученное из гаметы трансгенного животного также может быть трансгенным животным. Трансгенным животным может быть химерное трансгенное животное.

6-2-3. Скрещивание трансгенных животных

Трансгенное животное может быть получено скрещиванием между трансгенным животным и диким животным.

Альтернативно, трагсгенное животное может быть получено скрещиванием между первым трансгенным животным и вторым трансгенным животным.

Вторым трансгенным животным может быть потомство первого трансгенного животного или может быть родственным по крови первому трансгенному животному. Альтернативно, второе трансгенное животное может не быть родственным по крови первому трансгенному животному.

Трансгенное животное, полученное скрещиванием, может включать инструмент, который является таким же, как часть инструментов, включенных в геном животного первого трансгенного животного, в том же месте.

Трансгенное животное, полученное скрещиванием, может включать инструмент, который является таким же, как часть инструментов, включенных в геном животного второго трансгенного животного, в том же месте.

Трансгенное животное, полученное скрещиванием, может быть гомологичным трансгенным животным.

Трансгенное животное, полученное скрещиванием, может, включать трансформированную клетку, которая является гомозиготой. Трансгенное животное, полученное скрещиванием, может включать трансформированную клетку, которая является гетерозиготой.

7. Применение трансгенного животного, в которое вставлен инструмент

7-1. Животные с улучшенными свойствами

Трансгенное животное, в которое вставлен инструмент, может применяться в качестве животного с улучшенными свойствами. Животное с улучшенными свойствами может включать корову, у которой нокаутирован полинуклеотид, кодирующий бета-лактоглобулин, и корову, у которой нокинирован полинуклеотид, кодирующий омега-3, но не ограничено ими.

7-2. Животная модель заболевания

Трансгенное животное, в которое вставлен инструмент, может применяться в качестве животной модели заболевания. Животная модель заболевания может включать корову, у которой нокаутирован полинуклеотид, кодирующий белок-суппрессор опухоли, но не ограничена ими.

7-3. Резистентные к заболеванию животные

Трансгенное животное, в которое вставлен инструмент, может применяться в качестве резистентного к заболеванию животного. Резистентное к заболеванию животное может включать корову, у которой нокаутирован полинуклеотид, кодирующий прионный белок, но не ограничено ими.

7-4. Применение побочных продуктов

Могут применяться органы, мясо, кожа, шерсть и жидкости тела трансгенного животного, в которое вставлен инструмент, но применяемые части трансгенного животного ими не ограничены.

7-5. Биореактор

Трансгенное животное, в которое вставлен инструмент, может применяться в качестве биореактора. Могут быть получены жидкости тела трансгенного животного. Жидкости тела могут включать молоко, кровь или мочу. Биомолекулы могут быть получены из жидкости тела трансгенного животного. Биомолекула может включать белок. Белок может включать целевой белок.

[Часть III] Трансформация с применением RRS в инструменте

1. Структура для вставки RRS в инструмент

Трансформированная клетка может включать, по меньшей мере, один инструмент в геноме животного. Любой из инструментов может включать, по меньшей мере, один RRS.

1-1. Случай, когда включен один RRS

Инструмент может включать один RRS.

Например, первая концевая область инструмента может включать один RRS. В другом примере, вторая концевая область инструмента может включать один RRS. В еще одном примере, коровый домен инструмента может включать один RRS.

1-2. Случай, когда включены два или более RRS

Инструмент может включать два или более RRS. Два или более RRS могут включать RRS1 и RRS2. RRS1 может быть расположен в любой из первой концевой области, второй концевой области и корового домена инструмента. RRS2 может быть расположен в любой из первой концевой области, второй концевой области и корового домена инструмента.

Например, оба RRS1 и оба RRS2 может быть расположен в коровом домене. В другом примере, RRS1 может быть расположен в первой концевой области и RRS2 может быть расположен во второй концевой области.

RRS1 и RRS2 могут быть одинаковыми. RRS1 и RRS2 могут быть расположены в одном направлении относительно друг друга. Альтернативно, RRS1 и RRS2 могут быть расположены в противоположных направлениях относительно друг друга.

RRS1 и RRS2 могут отличаться друг от друга. RRS1 и RRS2 могут быть расположены в одном направлении относительно друг друга. Альтернативно, RRS1 и RRS2 могут быть расположены в противоположных направлениях относительно друг друга.

RRS1 и RRS2 могут отличаться друг от друга. SSR 1, которая может специфически взаимодействовать с RRS1, и SSR 2, которая может специфически взаимодействовать с RRS2, могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга.

RRS1 и RRS2 могут отличаться друг от друга. RRS1 и RRS2 могут образовывать пару и, тем самым обеспечивать взаимный обмен. Альтернативно, RRS1 и RRS2 могут не образовывать пару, и тем самым взаимный обмен не обеспечивать.

2. SSR для применения RRS в инструменте

2-1. SSR, полученная из генома животного

Геном животного в клетке может включать полинуклеотид, кодирующий SSR, которая является специфической к любому из RRS, включенных в инструмент. Полинуклеотид, кодирующий SSR, может быть включен в инструмент, включающий RRS. Полинуклеотид, кодирующий SSR, может быть включен в другой инструмент.

2-2. SSR полученная из источника, отличного от генома животного

Если полинуклеотид, кодирующий SSR, которая может взаимодействовать с любым из RRS, включенных в инструмент, не присутствует в геноме животного в клетке, SSR может быть доставлен. Формой доставки SSR может быть вектор депротеинизированной нуклеиновой кислоты, не вирусный вектор, вирусный вектор, каждый из которых включает полинуклеотид, кодирующий SSR, или полипептид рекомбиназы.

3. Сайт-специфическая рекомбинация с применением RRS в инструменте

3-1. Полинуклеотидная вставка с применением RRS

Инструмент может включать, по меньшей мере, один RRS.

Экзополинуклеотид, который включает RRS, который образует пару с любым из RRS, включенных в инструмент, может быть доставлен в клетку, включающую инструмент.

В этом случае, вставка экзополинуклеотида в инструмент может происходить через взаимодействие с SSR, которая является специфической к паре RRS.

3-2. Делеция полинуклеотида с применением RRS

Инструмент может включать два или более RRS. Два или более RRS могут включать RRS1 и RRS2.

RRS1 и RRS2 могут образовывать пару, и могут быть расположены в одном направлении. Например, в коровом домене инструмента, два loxps могут быть расположены в одном направлении.

В этом случае, полинуклеотид расположенный между парой RRS может быть удален через взаимодействие с SSR, которая является специфической к пате RRS. Например, если коровый домен инструмента включает полинуклеотид, кодирующий нРНК, между двумя loxps, полинуклеотид, кодирующий нРНК, может быть удален из инструмента предоставлением Cre рекомбиназы.

3-3. Инверсия полинуклеотида с применением RRS

RRS1 и RRS2 могут образовывать пару и могут быть расположены в противоположном направлении.

В этом случае, полинуклеотид, расположенный между парой RRS, может быть инвертирован через взаимодействие с SSR, которая является специфической к паре RRS.

3-4. Обмен полинуклеотидов с применением RRS

RRS1 и RRS2 могут не формировать пару. Например, коровый домен инструмента может включать loxp (RRS1) и loxp2722 (RRS2). loxp может быть расположен выше loxp2722.

Экзополинуклеотиды, каждый из которых включает RRS3, который образует пару с RRS1, и RRS4, который образует пару с RRS2, может быть доставлен в клетку, включающую инструмент. Например, экзополинуклеотиды могут включать loxp (RRS3) и loxp2722 (RRS4). loxp может быть расположен выше loxp2722.

В этом случае, может происходить взаимодействие с SSR, которая является специфической к RRS1 и RRS3, и взаимодействие с SSR, которая является специфической к RRS2 и RRS4. Дополнительно, обмен может происходить между полинуклеотидом, расположенным между RRS1 и RRS2, и полинуклеотидом, расположенным между RRS3 и RRS4.

Например, если нетранскрибируемый полинуклеотид расположен между loxp и loxp2722 инструмента, и полинуклеотид, кодирующий нРНК, расположен между loxp и loxp2722 экзополинуклеотида, нетранскрибируемый полинуклеотид в инструменте и полинуклеотид, кодирующий нРНК экзополинуклеотида могут быть обменены доставкой Cre рекомбиназы.

3-5. Сайт-специфическая рекомбинация с применением двух или более RRS, присутствующих в одном инструменте

RRS1 и RRS2 могут не образовывать пару. Например, коровый домен инструмента может включать loxp (RRS1) и loxp2722 (RRS2). loxp может быть расположен выше loxp2722.

Первый экзополинуклеотид, который включает RRS3, который образует пару с RRS1, и второй экзополинуклеотид, который включает RRS4, который образует пару с RRS2, может быть доставлен в клетку, включающую инструмент.

Например, первый экзополинуклеотид может включать loxp (RRS3), и второй экзополинуклеотид может включать loxp2722 (RRS4).

В этом случае, может происходить взаимодействие с SSR, которая является специфической к RRS1 и RRS3, и взаимодействие с SSR, которая является специфической к RRS2 и RRS4. Дополнительно, первый экзополинуклеотид может быть вставлен в локацию RRS1, и второй экзополинуклеотид может быть вставлен в локацию RRS2. То есть, все из двух или более типов экзополинуклеотидов могут быть вставлены в клетку, которая имеет геном животного, включающий инструмент, который включает два или более RRS.

Как описано выше, не только два или более типов экзополинуклеотидов могут быть соответственно вставлены в инструмент в желаемое время, но также два или более типов экзополинуклеотидов уже присутствуют в инструмент и могут быть удалены или обменены.

В варианте осуществления, инструмент может включать loxp, loxp мутант, rox и attP.

Например, первый экзополинуклеотид, который состоит из rox варианта (который образует пару с rox, включенным в инструмент) и Cas9 может быть доставлен в клетку, включающую инструмент. В этом случае, вставка первого экзополинуклеотида в инструмент может происходить через взаимодействие с Dre, которая является специфической к rox и rox варианту.

В другом примере, первый экзополинуклеотид, который состоит из rox варианта (который образует пару с rox, включенным в инструмент) и Cas9; и второй экзополинуклеотид, который состоит из attB (который образует пару с attP, включенным в инструмент) и нРНК, может быть доставлен в клетку, включающую инструмент. В этом случае, вставка первого экзополинуклеотида и второго экзополинуклеотида в инструмент может происходить через взаимодействие с Dre (которая является специфической к rox и rox варианту), и взаимодействие с PhiC31 (которая является специфической к attP и attB). В этом случае, так как Cas9 и нРНК могут одновременно экспрессироваться в клетке, включающей инструмент, система CRISPR/фермент может работать даже если Cas9 или нРНК не доставляются отдельно.

Дополнительно, в другом примере, первый экзополинуклеотид, который состоит из rox варианта (который образует пару с rox, включенным в инструмент) и Cas9; и второй экзополинуклеотид, который присутствует между loxp или loxp мутантом, который образует пару с loxp и loxp вариантом, включенными в инструмент, могут быть доставлены в клетку, включающую инструмент. В этом случае, вставка первого экзополинуклеотида в инструмент может происходить через взаимодействие с Dre, которая является специфической к rox и rox варианту; и обмен второго экзополинуклеотида может происходить через взаимодействие с Cre, которая является специфической к loxp и loxp варианту.

3-6. Сайт-специфическая рекомбинация в желаемом инструменте среди множества инструментов

Как описано выше, если RRS включенный в любой из инструментов, присутствующих в геноме животного, имеет последовательность, которая отличается от RRS, включенного в другой инструмент в том же геноме животного, сайт-специфическая рекомбинация может происходить в инструменте, расположенном в желаемом локусе.

Например, экзополинуклеотид, который включает RRS1, который образует пару с RRS1 первого инструмента, или RRS1 вариант, может быть доставлен в трансформированную клетку, включающую геном животного, в который включены первый инструмент, который включает RRS1, и второй инструмент, который включает RRS2. В этом случае, вставка экзополинуклеотида в первый инструмент может происходить через взаимодействие с SSR1, которая является специфической к RRS1 или RRS1 варианту.

В другом примере, экзополинуклеотид, который расположен между RRS1, который образует пару с RRS1 инструмента, или RRS1 вариантом, и RRS2, который образует пару с RRS2 первого инструмента, или RRS2 вариантом, может быть доставлен в трансформированную клетку, имеющую геном животного, в который включен первый инструмент, который включает RRS1 и RRS2, и второй инструмент, который включает RRS1 и RRS3. В этом случае, обмен между полинуклеотидом, который расположен между RRS1 и RRS2 первого инструмента, и экзополинуклеотидом, который расположен между RRS1 или RRS1 вариантом и RRS2 или RRS2 вариантом, может происходить через взаимодействие с SSR1, которая является специфической к RRS1 или RRS1 варианту, и взаимодействие с SSR2, которая является специфической к RRS2 или RRS2 варианту.

Дополнительно, в другом примере, экзополинуклеотид, который включает RRS1 который образует пару с RRS1 первого инструмента, или RRS1 вариант, может доставлен в трансформированную клетку, имеющую геном животного, в которую включены первый инструмент, который включает два или более RRS1, и второй инструмент, который включает RRS2.

В этом случае, RRS1 или RRS1 вариант может взаимодействовать с SSR1, которая является специфической к RRS1 или RRS1 варианту. Дополнительно, после делеции полинуклеотида, расположенного между двумя RRS1 в первом инструменте, может происходить вставка экзополинуклеотида, который включает RRS1 или RRS1 вариант в первом инструменте.

4. Трансформированная клетка с отредактированным инструментом

Трансформированная клетка может включать, по меньшей мере, один инструмент. Любой из, по меньшей мере, одного инструмента может включать, по меньшей мере, одну RRS. Трансформация через сайт-специфическую рекомбинацию может быть возможной с применением, по меньшей мере, одного RRS.

Трансформированная клетка может включать отредактированный инструмент. Отредактированный инструмент относится к инструменту, в котором произошла сайт-специфическая рекомбинация.

4-1. Одна клетка

4-1-1. Плоидность

Трансформированная клетка, включающая, по меньшей мере, один отредактированный инструмент, может быть диплоидной клеткой. Диплоидная клетка такая, как описано выше.

Трансформированная клетка, включающая, по меньшей мере, один отредактированный инструмент, может быть гаплоидной клеткой. Гаплоидная клетка такая, как описано выше.

4-1-2. Зиготность

Трансформированная клетка, включающая два или более отредактированных инструментов, может быть гомозиготой.

Трансформированная клетка, включающая два или более отредактированных инструментов, может быть гетерозиготой.

4-2. Колония клеток

Трансформированная клетка, включающая, по меньшей мере, один отредактированный инструмент, может образовывать колонию клеток.

4-2-1. Гомологичная колония клеток

Гомологичная колония клеток характеризуется тем, что инструменты, включенные в каждую клетку, являются одинаковыми, и отредактированные инструменты, включенные в каждую клетку, также являются одинаковыми.

4-2-2. Химерная колония клеток

5. Выбор трансформированной клетки, в которую вставлен отредактированный инструмент

5-1. Выбор трансформированной клетки с применением флуоресцентного белка

Отредактированный инструмент может включать полинуклеотид, который кодирует флуоресцентный белок.

Например, экзополинуклеотид, кодирующий флуоресцентный белок, может быть вставлен в инструмент, включающий, по меньшей мере, один RRS, с применением сайт-специфической рекомбинации.

Следовательно, животные клетки, которые включают отредактированный инструмент, могут быть отделены от животных клеток, которые не включают отредактированный инструмент.

5-2. Выбор трансформированной клетки с применением гена устойчивости к антибиотикам

Отредактированный инструмент может включать ген устойчивости к антибиотикам. Геном животного может включать отредактированный инструмент.

Например, экзополинуклеотид, кодирующий ген устойчивости к антибиотикам, может быть вставлен в инструмент, включающий, по меньшей мере, один RRS, с применением сайт-специфической рекомбинации.

Животные клетки, включающие отредактированный инструмент, могут выживать при обработке животных клеток антибиотиком. Следовательно, животные клетки, которые включают отредактированный инструмент, могут быть отделены от животных клеток, которые не включают отредактированный инструмент.

5-3. Выбор трансформированной клетки с применением ответа антиген-антитело

Отредактированный инструмент может включать полинуклеотид, кодирующий антиген или нуклеотид, способный действовать как антиген. Геном животного может включать отредактированный инструмент.

Например, экзополинуклеотид, который включает нуклеотид, способный действовать как антиген, может быть вставлен в инструмент, включающий, по меньшей мере, один RRS, с применением сайт-специфической рекомбинации.

Животная клетка, включающая отредактированный инструмент, может взаимодействовать с антителом, специфическим к антигену. Следовательно, животные клетки, которые включают отредактированный инструмент, могут быть отделены от животных клеток, которые не включают отредактированный инструмент.

Отредактированный инструмент может включать полинуклеотид, кодирующий поверхностный маркер. Животная клетка может включать отредактированный инструмент.

Например, полинуклеотид, кодирующий поверхностный маркер, может быть вставлен в инструмент, включающий, по меньшей мере, один RRS, с применением сайт-специфической рекомбинации.

Животная клетка, включающая отредактированный инструмент, может взаимодействовать с антителом, специфическим к поверхностному маркеру. Антитело может взаимодействовать с магнитной частицей или флуорофором. Следовательно, животные клетки, которые включают отредактированный инструмент, могут быть отделены от животных клеток, которые не включают отредактированный инструмент, через магнитное свойство или сигнал флуоресценции.

5-5. Выбор трансформированной клетки с применением суицидального гена

Инструмент может включать полинуклеотид, кодирующий суицидальный ген. Отредактированный инструмент может не включать полинуклеотид, кодирующий суицидальный ген.

Например, коровый домен инструмента может последовательно включать loxp, суицидальный ген и loxp вариант. В этом случае, экзополинуклеотид, который включает loxp на 5' конце, и включает loxp вариант на 3’ конце может быть обменен с суицидальным геном через сайт-специфическую рекомбинацию.

Так как животные клетки, включающие отредактированный инструмент, не включают суицидальный ген, апоптоз не происходит в этих животных клетках, даже если в них доставлено пролекарство. Следовательно, животные клетки, которые включают отредактированный инструмент, могут быть отделены от животных клеток, которые не включают отредактированный инструмент.

6. Трансгенные животные, в которых вставлен отредактированный инструмент

6-1. Отдельные трансгенные животные, в которых вставлен отредактированный инструмент

6-1-1. Гомологичные

Каждая клетка, включенная в гомологичное трансгенное животное, может включать, по меньшей мере, один инструмент. По меньшей мере, один инструмент может включать, по меньшей мере, один отредактированный инструмент.

6-1-2. Химерные

6-2. Способ получения трансгенного животного, в которое вставлен отредактированный инструмент

Способ получения трансгенного животного, в которое вставлен отредактированный инструмент, может включать способ получения трансгенного животного из животной клетки, способ получения трансгенного животного доставкой экзополинуклеотида или введением SSR в ткань или орган животного, и способ получения трансгенного животного скрещиванием между трансгенными животными. Способ получения трансгенного животного из животной клетки может включать способ получения трансгенного животного из клетки трансгенного животного, в которое вставлен инструмент, включающий, по меньшей мере, один RRS.

Трансгенным животным, полученным любым из вышеуказанных способов, может быть любое из химерного трансгенного животного или гомологичного трансгенного животного.

Трансгенное животное, в которое вставлен отредактированный инструмент, может быть получено из клетки трансгенного животного, в которую вставлен инструмент, включающий, по меньшей мере, один RRS.

Например, трагсгенное животное может быть получено введением SSR в соматическую клетку, в которую вставлен инструмент, включающий, по меньшей мере, один RRS, с последующим SCNT. В другом примере, трагсгенное животное может быть получено введением SSR и полинуклеотида, который включает, по меньшей мере, один RRS, в соматическую клетку, в которую вставлен инструмент, включающий, по меньшей мере, один RRS, микроинъекцией соматической клетки, с последующим SCNT. Трансгенным животным может быть гомологичное трансгенное животное.

Например, трагсгенное животное может быть получено введением, через микроинъекцию гаметы, полинуклеотида, включающего SSR, в гамете, в которую вставлен инструмент, включающий, по меньшей мере, один RRS. В другом примере, трагсгенное животное может быть получено введением, через микроинъекцию гаметы, полинуклеотида, включающего SSR, и полинуклеотида, включающего, по меньшей мере, один RRS, в гамете, в которую вставлен инструмент, включающий, по меньшей мере, один RRS. Трансгенным животным может быть химерное трансгенное животное.

Например, трагсгенное животное может быть получено введением SSR в зиготу, в которую вставляется инструмент, включающий, по меньшей мере, один RRS. В другом примере, трагсгенное животное может быть получено введением полинуклеотида, включающего, по меньшей мере, один RRS, через микроинъекцию зиготы, в зиготе, в которую вставлен инструмент, включающий, по меньшей мере, один RRS, при обработке зиготы SSR. Трансгенным животным может быть химерное трансгенное животное.

Например, трагсгенное животное может быть получено введением SSR в эмбрион, в который вставлен инструмент, включающий, по меньшей мере, один RRS. В другом примере, трагсгенное животное может быть получено введением полинуклеотида, кодирующего SSR, и полинуклеотида, включающего, по меньшей мере, один RRS, через микроинъекцию эмбриона, в эмбрион, в который вставлен инструмент, включающий, по меньшей мере, один RRS. Трансгенным животным может быть химерное трансгенное животное.

6-2-2. Способ получения трансгенного животного доставкой экзополинуклеотида или введением SSR в ткань или орган животного

Ткань или орган животного может включать клетки, в которые вставлен инструмент, включающий, по меньшей мере, один RRS. Трансгенное животное, включающее отредактированный инструмент, может быть получено введением SSR или доставкой экзополинуклеотида в ткань или орган животного.

Например, трансгенное животное, включающее отредактированный инструмент, может быть получено микроинъекцией полинуклеотида, кодирующего SSR, и полинуклеотида, включающего, по меньшей мере, один RRS, в ткань молочной железы животного. Трансгенным животным может быть химерное трансгенное животное.

Например, трансгенное животное, включающее отредактированный инструмент, может быть получено микроинъекцией SSR в репродуктивный орган животного. Потомство, полученное из гаметы трансгенного животного, может быть трансгенным животным. Трансгенным животным может быть химерное трансгенное животное.

6-2-3. Скрещивание трансгенных животных

Трансгенное животное может быть получено скрещиванием между первым трансгенным животным и вторым трансгенным животным.

Например, трансгенное животное, включающее отредактированный инструмент, может быть получено скрещиванием между первым трансгенным животным, в которое вставлен инструмент, включающий, по меньшей мере, один RRS, и вторым трансгенным животным, в которое вставлен инструмент, включающий полинуклеотид, кодирующий SSR.

Трансгенное животное, полученное скрещиванием, может включать инструмент, который является таким же, как часть инструмента, включенного в геном животного первого трансгенного животного, в том же месте.

Трансгенное животное, полученное скрещиванием, может включать инструмент, который является таким же, как часть инструмента, включенного в геном животного второго трансгенного животного, в том же месте.

7. Применение трансгенного животного, в которой вставлен отредактированный инструмент

7-1. Животные с улучшенными свойствами

Трансгенное животное, в которое вставлен отредактированный инструмент, может применяться в качестве животного с улучшенными свойствами.

7-2. Животная модель заболевания

Трансгенное животное, в которое вставлен отредактированный инструмент, может применяться в качестве животной модели заболевания.

7-3. Резистентные к заболеванию животные

Трансгенное животное, в которое вставлен отредактированный инструмент, может применяться в качестве резистентного к заболеванию животного.

7-4. Применение побочных продуктов

Могут применяться органы, мясо, кожа, шерсть и жидкости тела трансгенного животного, в которое вставлен отредактированный инструмент, но применяемые части трансгенного животного ими не ограничены.

7-5. Биореактор

Трансгенное животное, в которое вставлен отредактированный инструмент, может применяться в качестве биореактора.

[Часть IV] Трансформация с применением компонента системы CRISPR/фермент

1. Введение РНК-направляемой эндонуклеазы и направляющей нуклеиновой кислоты в клетки, включающие инструмент

РНК-направляемая эндонуклеаза и направляющая нуклеиновая кислота может быть вставлена в геном животного в клетке, которая включает инструмент для сайт-специфической трансформации.

РНК-направляемая эндонуклеаза может включать Cas9, но не ограничена ими. Направляющая нуклеиновая кислота может включать нРНК, но не ограничена ими.

1-1. Введение в отдельной форме

Cas9 и нРНК могут быть введены в клетку, включающую инструмент, в отдельной форме.

Форма, в которой представлена Cas9, может включать плазмид ДНК, линейный фрагмент ДНК, линейный фрагмент и белок РНК. Линейный фрагмент РНК может включать мРНК Cas9.

Форма, в которой представлена нРНК, может включать плазмид ДНК, линейный фрагмент ДНК и линейный фрагмент РНК.

Форма, в которой Cas9 и нРНК представлены вместе, может включать рибонуклеопротеин (RNP).

1-2. Один вектор доставки

Cas9 и нРНК могут быть представлены в виде одного вектора доставки в клетку, которая включает инструмент.

Форма, в которой представлены Cas9 и нРНК, может включать линейный фрагмент ДНК и линейный фрагмент РНК.

2. Компоненты системы CRISPR/фермент в инструменте

Инструмент, который включен в геном животного в клетке, может включать, по меньшей мере, одну из РНК-направляемой эндонуклеазы и направляющей нуклеиновой кислоты.

Клетка, в которой происходит сайт-специфическая трансформация, может экспрессировать все или часть компонентов системы CRISPR/фермент и, таким образом, может быть легко проведена сайт-специфическая трансформация.

2-1. РНК-направляемая эндонуклеаза в инструменте

Инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу. РНК-направляемая эндонуклеаза может включать Cas9 или Cas9 мутант, но не ограничена ими.

2-1-1. Сочетание Cas9 и промотора

Инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий Cas9.

Инструмент может включать промотор, который может инициировать транскрипцию Cas9. Промотором может быть любой из конститутивного промотора, ткань-специфического промотора и индуцируемого промотора.

2-1-2. Сочетание Cas9, промотора и RRS

Инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий Cas9. Инструмент может включать промотор, который может инициировать транскрипцию Cas9. Инструмент может включать, по меньшей мере, один RRS.

Инструмент может включать, по меньшей мере, один RRS на 5’ конце промотора, способного инициировать транскрипцию Cas9.

Инструмент может включать, по меньшей мере, один RRS между промотором, который способен инициировать транскрипцию Cas9, и полинуклеотидом, кодирующим Cas9.

Инструмент может включать RRS на 3’ конце полинуклеотида, кодирующего Cas9.

Инструмент может включать, по меньшей мере, один RRS на 5’ конце полинуклеотида, кодирующего Cas9, и может включать, по меньшей мере, один RRS на 3’ конце полинуклеотида, кодирующего Cas9. В этом случае, любой из RRS на 5’ конце и любой из RRS на 3’ конце может взаимодействовать с одной и той же SSR. В этом случае, любой из RRS на 5’ конце и любой из RRS на 3’ конце могут быть одинаковыми.

2-2. Направляющая нуклеиновая кислота в инструменте

Инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту. Направляющая нуклеиновая кислота может включать нРНК, но не ограничена ими.

2-2-1. Сочетание нРНК и промотора

Инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий нРНК.

Инструмент может включать промотор, способный инициировать транскрипцию нРНК. Промотором может быть любой из конститутивного промотора, ткань-специфического промотора и индуцируемого промотора. Конститутивный промотор, способный инициировать транскрипцию нРНК, может включать U6 промотор, но не ограничен ими.

2-2-2. Сочетание нРНК, промотора и RRS

Инструмент может включать промотор, способный инициировать транскрипцию нРНК. Инструмент может включать, по меньшей мере, один RRS.

Инструмент может включать, по меньшей мере, один RRS на 5’ конце промотора, способного инициировать транскрипцию нРНК.

Инструмент может включать, по меньшей мере, один RRS между промотором, который способен инициировать транскрипцию нРНК, и полинуклеотидом, кодирующим нРНК.

Инструмент может включать RRS на 3’ конце полинуклеотида, кодирующего нРНК.

Инструмент может включать, по меньшей мере, один RRS на 5’ конце полинуклеотида, кодирующего нРНК, и может включать, по меньшей мере, один RRS на 3’ конце полинуклеотида, кодирующего нРНК. В этом случае, любой из RRS на 5’ конце и любой из RRS на 3’ конце может взаимодействовать с одной и той же SSR. В этом случае, любой из RRS на 5’ конце и любой из RRS на 3’ конце могут быть одинаковыми.

2-3. РНК-направляемая эндонуклеаза и направляющая нуклеиновая кислота в инструменте

Инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту. РНК-направляемая эндонуклеаза может включать Cas9, но не ограничена ими. Направляющая нуклеиновая кислота может включать нРНК, но не ограничена ими.

2-3-1. Сочетание Cas9, нРНК и промотора

Инструмент может включать промотор, способный инициировать транскрипцию Cas9. Промотором может быть любой, выбранный из конститутивного промотора, ткань-специфического промотора и индуцируемого промотора.

Инструмент может включать промотор, способный инициировать транскрипцию нРНК. Промотором может быть любой, выбранный из конститутивного промотора, ткань-специфического промотора и индуцируемого промотора. Конститутивный промотор, способный инициировать транскрипцию нРНК, может включать U6 промотор, но не ограничен ими.

2-3-2. Сочетание Cas9, нРНК, промотора и RRS

Инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий Cas9. Инструмент может включать промотор, способный инициировать транскрипцию Cas9. Инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий нРНК. Инструмент может включать промотор, способный инициировать транскрипцию нРНК. Инструмент может включать, по меньшей мере, один RRS.

Инструмент может включать, по меньшей мере, один RRS между промотором, способным инициировать транскрипцию Cas9, и полинуклеотидом, кодирующим Cas9.

Инструмент может включать, по меньшей мере, один RRS между промотором, способным инициировать транскрипцию нРНК, и полинуклеотидом, кодирующим нРНК.

3. Контроль работы системы CRISPR/фермент

3-1. Контроль экспрессии РНК-направляемой эндонуклеазы

Инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу. РНК-направляемая эндонуклеаза может включать Cas9, но не ограничена ими.

3-1-1. Контроль транскрипции Cas9 с применением промотора

Инструмент может включать полинуклеотид, кодирующий Cas9.

Инструмент может включать промотор, который инициирует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего Cas9. Промотор может включать ткань-специфический промотор или индуцируемый промотор.

В случае, когда промотором является ткань-специфический промотор, транскрипция полинуклеотида, кодирующего Cas9, включенного в инструмент, может быть инициирована, когда инструмент включен в клетку конкретной ткани.

В случае, когда ткань-специфическим промотором является ткань-специфический промотор молочной железы, транскрипция полинуклеотида, кодирующего Cas9, включенного в инструмент, может быть инициирована, когда инструмент включен в клетку или ткани молочной железы. Ткань-специфическ промотор молочной железы может включать альфа-казеиновый промотор, бета-казеиновый промотор, каппа-казеиновый промотор, мю-казеиновый промотор и бета-лактоглобулиновый промотор, но не ограничен ими.

В случае, когда ткань-специфическим промотор является специфический к репродуктивному органу промотор, транскрипция полинуклеотида, кодирующего Cas9, включенного в инструмент, может быть инициирована, когда инструмент включен в гамету. Специфический к репродуктивному органу промотор может включать специфический к яичнику промотор и специфический к яичку промотор, но не ограничен ими.

В случае, когда промотор, который инициирует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего Cas9, является ткань-специфическим промотором, сайт, где происходит сайт-специфическая трансформация, в трансгенном животном, включающем инструмент, может быть ограничен. Дополнительно, может быть предотвращено возникновение ненужной сайт-специфической трансформации в других тканях трансгенных животных.

В случае, когда промотором является индуцируемый промотор, транскрипция может быть инициирована, когда удовлетворено определенное условие. Индуцируемый промотор может включать химически индуцируемый промотор, индуцируемый температурой промотор и индуцируемый светом промотор, но не ограничен ими.

Химически индуцируемый промотор может инициировать транскрипцию, когда присутствует определенное химическое соединение. Химически индуцируемый промотор может включать индуцируемый антибиотиком промотор, индуцируемый спиртом промотор, индуцируемый стероидом промотор и индуцируемый металлом промотор, но не ограничен ими. Индуцируемый антибиотиком промотор может включать Tet-on промотор и Tet-off промотор, но не ограничен ими. Индуцируемый стероидом промотор может включать индуцируемый эстрогеном промотор, но не ограничен ими. Индуцируемый металлом промотор может включать индуцируемый медью промотор, но не ограничен ими.

Индуцируемый температурой промотор может инициировать транскрипцию, когда удовлетворены температурные условия. Индуцируемый температурой промотор может включать индуцируемый тепловым шоком промотор и индуцируемый холодовым шоком промотор, но не ограничен ими. Индуцируемый тепловым шоком промотор может включать Hsp промотор, но не ограничен ими.

Индуцируемый светом промотор может инициировать транскрипцию, когда удовлетворено условие длины волны света.

В случае, когда промотор, который инициирует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего Cas9, является индуцируемым промотором, возможно контролировать время, в течение которого происходит сайт-специфическая трансформация в трансформированной клетке или животном, которые включают инструмент.

3-1-2. Вставка промотора с применением RRS

Инструмент может включать RRS на 5’ конце полинуклеотида, кодирующего Cas9.

Нуклеиновая кислота может включать полинуклеотид, кодирующий промотор. Промотор может включать конститутивный промотор, ткань-специфический промотор или индуцируемый промотор. Нуклеиновая кислота может включать RRS на одном конце или обоих концах полинуклеотида, кодирующего промотор. RRS может образовывать пару с RRS, включенным в инструмент.

SSR, которая может взаимодействовать с нуклеиновой кислотой и RRS, может быть доставлена в инструмент. Полинуклеотид, кодирующий промотор, может быть вставлен в инструмент. В этом случае, транскрипция полинуклеотида, кодирующего Cas9, может не быть инициирована до того, как полинуклеотид, кодирующий промотор, будет вставлен, и может быть инициирована после вставки полинуклеотида, кодирующего промотор.

3-1-3. Контроль транскрипции Cas9 с применением стоп-кодона транскрипции

Инструмент может включать промотор, который инициирует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего Cas9. Промотор может быть конститутивным промотором, ткань-специфическим промотором или индуцируемым промотором.

Инструмент может включать RRS1, стоп-кодон транскрипции и RRS2. RRS1, стоп-кодон транскрипции и RRS2 могут быть последовательно расположены между полинуклеотидом, кодирующим Cas9, и промотором, который инициирует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего Cas9. RRS1 и RRS2 могут быть одинаковыми. RRS1 и RRS2 могут включать loxp, но не ограничены ими.

SSR, которая может взаимодействовать с RRS1 и RRS2, может быть доставлена в инструмент. SSR может включать Cre, но не ограничена ими. В инструменте, полинуклеотид, включающий стоп-кодон транскрипции, расположенный между RRS1 и RRS2, может быть удален. В этом случае, мРНК, транскрибированная из полинуклеотида, кодирующего Cas9, может не быть транскрибирована до делеции стоп-кодона транскрипции, и может быть транскрибирована после делеции стоп-кодона транскрипции.

3-1-4. Контроль трансляции Cas9 с применением стоп-кодона

Инструмент может включать промотор, который инициирует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего Cas9. Промотором может быть конститутивный промотор, ткань-специфический промотор или индуцируемый промотор.

Инструмент может включать RRS1, стоп-кодон и RRS2. RRS1, стоп-кодон транскрипции и RRS2 могут быть последовательно расположены между промотором, который инициирует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего Cas9, и полинуклеотидом, кодирующим Cas9. RRS1 и RRS2 могут быть одинаковыми. RRS1 и RRS2 могут включать loxp, но не ограничены ими.

SSR, которая может взаимодействовать с RRS1 и RRS2, может быть доставлена в инструмент. SSR может включать Cre рекомбиназу, но не ограничена ими. В инструменте, полинуклеотид, включающий стоп-кодон, расположенный между RRS1 и RRS2, может быть удален. В этом случае, мРНК, транскрибированная из полинуклеотида, кодирующего Cas9, может не быть транскрибирована до делеции стоп-кодона, и может быть транскрибирована после делеции стоп-кодона.

3-2. Контроль экспрессии направляющей нуклеиновой кислоты

3-2-1. Вставка промотора с применением RRS

Инструмент может включать полинуклеотид, кодирующий нРНК.

Инструмент может включать RRS на 5’ конце полинуклеотида, кодирующего нРНК.

Нуклеиновая кислота может включать полинуклеотид, кодирующий промотор. Промотор может включать конститутивный промотор, ткань-специфический промотор или индуцируемый промотор. Конститутивный промотор может включать U6 промотор. Нуклеиновая кислота может включать RRS на одном конце или обоих концах полинуклеотида, кодирующего промотор. RRS может образовывать пару с RRS, включенным в инструмент.

SSR, которая может взаимодействовать с нуклеиновой кислотой и RRS, может быть доставлена в инструмент. Полинуклеотид, кодирующий промотор, может быть вставлен в инструмент. В этом случае, транскрипция полинуклеотида, кодирующего нРНК, может не быть инициирована до вставки промотора, и может быть инициирована после вставки промотора.

3-2-2. Контроль транскрипции нРНК

Инструмент может включать промотор, который инициирует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего нРНК. Промотором может быть конститутивный промотор, ткань-специфический промотор или индуцируемый промотор. Конститутивный промотор может включать U6 промотор.

Инструмент может включать RRS1, стоп-кодон транскрипции и RRS2. Стоп-кодон транскрипции может включать поли T последовательность. Стоп-кодон транскрипции может включать AATAAA последовательность. RRS1, стоп-кодон транскрипции и RRS2 могут быть последовательно расположены между промотором, который инициирует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего нРНК, и полинуклеотидом, кодирующим нРНК. RRS1 и RRS2 могут быть одинаковыми. RRS1 и RRS2 могут включать loxp, но не ограничены ими.

SSR, которая может взаимодействовать с RRS1 и RRS2, может быть доставлена в инструмент. SSR может включать Cre рекомбиназу, но не ограничен ими. В инструменте, полинуклеотид, включающий стоп-кодон транскрипции, расположенный между RRS1 и RRS2, может быть удален.

В этом случае, полинуклеотид, кодирующий нРНК, может не экспрессироваться до делеции стоп-кодона транскрипции, и может экспрессироваться после делеции стоп-кодона транскрипции.

4. Целевой сайт системы CRISPR/фермент

Геном животного в клетке может включать, по меньшей мере, один инструмент.

По меньшей мере, один инструмент может включать первый инструмент. Первый инструмент может включать полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту.

Альтернативно, первый инструмент может включать полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, но может не включать полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту. В этом случае, направляющая нуклеиновая кислота или полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, может быть введен в клетку отдельным вектором доставки.

Направляющая нуклеиновая кислота может включать протоспейсерный домен. Протоспейсерный домен может включать нуклеотидную последовательность, которая является такой же или может иметь комплементарное связывание с целевым сайтом, расположенным в геноме животного в клетке, или экзополинуклеотид.

РНК-направляемая эндонуклеаза может включать Cas9, но не ограничена ими. Направляющая нуклеинов кислот может включать нРНК, но не ограничена ими.

4-1. Геном животного

Геном животного в клетке может включать целевой сайт для нРНК. Целевым сайтом может быть нуклеотидная последовательность, соседняя к 5' концу или 3' концу PAM последовательности. PAM последовательность может включать NGG, но не ограничена ими.

Целевой сайт может быть расположен на полинуклеотиде, который может быть вовлечен в экспрессию полипептида или РНК в геноме животного в клетке.

Целевой сайт может быть расположен на любом из промотора, 5' UTR, экзона, интрона и 3' UTR полинуклеотида, который кодирует полипептид или РНК в геноме животного в клетке.

В этом случае, на уровень экспрессии полипептида или РНК в клетке может влиять система CRISPR/фермент.

Целевой сайт может быть расположен в убежище генома животного в клетке.

В случае, когда геномом животного является мышиный геном, убежище мышиного генома может включать rosa26 локус, который уже хорошо известен.

В случае, когда геномом животного является бычий геном, убежище бычьего генома может включать локусы в таблице 1, но не ограничен ими.

В этом случае, возможно проводить сайт-специфическую трансформацию, которая не оказывает фатальное действие на вышеуказанные клетки и трансгенное животное, включающее эти клетки, через систему CRISPR/фермент.

4-2. Экзополинуклеотид

По меньшей мере, один инструмент, который включен в геном животного, может включать целевой инструмент.

В настоящем документе термин “целевой инструмент” может относиться к инструменту, включающему целевой сайт, который может быть распознан компонентом сконструированной нуклеазы, в качестве компонента.

Целевой инструмент может включать, по меньшей мере, один целевой сайт для нРНК. Целевым сайтом может быть нуклеотидная последовательность, соседняя к 5' концу или 3' концу PAM последовательности. PAM последовательность может включать NGG, но не ограничена ими.

Целевым инструментом может быть инструмент, такой же, как первый инструмент.

Целевым инструментом может быть инструмент, отличающийся от первого инструмента.

Целевой сайт может быть расположен на любом из промотора, 5' UTR, экзона, интрона и 3' UTR полинуклеотида, который кодирует полипептид или РНК в целевом инструменте.

Полипептид может включать часть целевого белка. В этом случае, на уровень экспрессии целевого белка в клетках, включающих целевой инструмент, и трансгенном животном, включающем эти клетки, можно влиять через систему CRISPR/фермент.

Полипептид может включать полипептид, который экспрессируется маркерным геном. В этом случае, маркерный ген может быть нокаутирован через систему CRISPR/фермент, поэтому может применяться для выбора трансформированных клеток. Например, если целевой инструмент, который включен в геном животного в клетке, включает полинуклеотид, который кодирует тимидинкиназу, тимидинкиназа может быть нокаутирована через сайт-специфическую трансформацию системой CRISPR/фермент, которая нацелена на часть экзонов тимидинкиназы в качестве целевого сайта. Клетки, в которых происходит сайт-специфическая трансформация, могут быть выбраны обработкой клеток, включающих целевой инструмент, ганцикловиром.

Полипептид может включать часть рекомбиназы. В этом случае, сайт-специфическая рекомбинация в клетке может быть ингибирована нокаутом полинуклеотида, кодирующего рекомбиназу через систему CRISPR/фермент.

Полипептид может включать транспосазу. В этом случае, вставка транспозона в клетку или делеция транспозона из клетки может быть ингибирована нокаутом полинуклеотида, кодирующего транспосазу, через систему CRISPR/фермент.

Полипептид может включать часть РНК-направляемой эндонуклеазы. В этом случае, сайт-специфическая трансформация в клетке может быть предотвращена нокаутом РНК-направляемой эндонуклеазы через систему CRISPR/фермент. Например, когда целевой инструмент, который включен в геном животного в клетке, включает полинуклеотид, кодирующий Cas9, Cas9 может быть нокаутирована через сайт-специфическую трансформацию системой CRISPR/фермент, которая нацелена на часть экзонов Cas9 в качестве целевого сайта. В клетке, включающей инструмент, возможно предотвращать возникновение сайт-специфической трансформации (нецелевой активности) в месте, отличном от целевого сайта, восстановлением экспрессии Cas9 в клетке при одновременном проведении сайт-специфической трансформации в целевом инструменте.

РНК может включать часть направляющей нуклеиновой кислоты. В этом случае, сайт-специфическая трансформация в клетке может быть предотвращена нокаутом направляющей нуклеиновой кислоты через систему CRISPR/фермент. Например, если целевой инструмент, который включен в геном животного в клетке, включает полинуклеотид, кодирующий нРНК, нРНК может быть нокаутирован через сайт-специфическую трансформацию системой CRISPR/фермент, которая нацелена на протоспейсерный домен нРНК в качестве целевого сайта. В клетке, включающей инструмент, возможно предотвращать возникновение сайт-специфической трансформации (нецелевой активности) в месте, отличном от целевого сайта, восстановлением экспрессии нРНК в клетке при одновременном проведении сайт-специфической трансформации в целевом инструменте. Дополнительно, когда клетка, включающая целевой инструмент, может экспрессировать РНК-направляемую эндонуклеазу, возможно предотвращать нецелевую активность, при этом не влияя на экспрессию РНК-направляемой эндонуклеазы.

Целевой сайт может быть расположен на полинуклеотиде, который кодирует не функциональный полипептид в целевом инструменте. Альтернативно, целевой сайт может быть расположен на полинуклеотиде, который кодирует нетранслированную РНК в целевом инструменте. Альтернативно, целевой сайт может быть расположен на нетранскрибируемом полинуклеотиде в целевом инструменте.

Если геном животного в клетке включает два или более целевых инструментов, которые являются одинаковыми, возможно проводить множество идентичных сайт-специфических трансформаций через одну систему CRISPR/фермент. Например, если целевой инструмент, который включен в бычий геном в клетке, включает нетранскрибируемый полинуклеотид, возможно проводить сайт-специфическую вставку полинуклеотида, кодирующего омега-3 через систему CRISPR/фермент, которая нацелена на часть нетранскрибируемого полинуклеотида в качестве целевого сайта. Если бычий геном включает два или более целевых инструментов, полинуклеотид, кодирующий омега-3, может быть вставлен в каждый целевой инструмент и, следовательно, возможно получить клетку или трансгенную корову, которая имеет высокий уровень экспрессии омега-3.

Если геном животного в клетке включает два или более целевых инструментов, которые отличаются друг от друга, возможно провести множество разных сайт-специфических трансформаций через систему CRISPR/фермент, в которой направляющие нуклеиновые кислоты варьируются. Например, бычий геном в клетке может включать первый целевой инструмент и второй целевой инструмент. Первый целевой инструмент может включать первый целевой сайт, и второй целевой инструмент может включать второй целевой сайт. Нуклеотидная последовательность первого целевого сайта может отличаться от последовательности второго целевого сайта. Полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь человеческого иммуноглобулина, может быть нокинирован в первом инструменте через систему CRISPR/фермент, которая включает первую нРНК, которая является такой же или может иметь комплементарное связывание с первым целевым сайтом. Полинуклеотид, кодирующий легкую цепь человеческого иммуноглобулина, может быть нокинирован во втором инструменте через систему CRISPR/фермент, которая включает вторую нРНК, которая является такой же или может иметь комплементарное связывание со вторым целевым сайтом. Клетки или трансгенная корова, включающая такие клетки, которые включают и первый целевой инструмент и второй целевой инструмент, могут продуцировать человеческие антитела через экспрессирование и тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, и легкой цепи человеческого иммуноглобулина.

5. Сайт-специфическая трансформация с применением системы CRISPR/фермент

Геном животного в клетке может включать, по меньшей мере, один инструмент. По меньшей мере, один инструмент может включать по меньшей мере, любой из первого инструмента, второго инструмента и третьего инструмента.

Первый инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу. В этом случае, возможно проводить сайт-специфическую трансформацию системой CRISPR/фермент через доставку направляющей нуклеиновой кислоты или полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту в клетку, включающую инструмент.

Второй инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту. В этом случае, возможно проводить сайт-специфическую трансформацию через систему CRISPR/фермент введением РНК-направляемой эндонуклеазы или доставкой полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, в клетку, включающую инструмент.

Третий инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту. В этом случае возможно проводить сайт-специфическую трансформацию через систему CRISPR/фермент в клетке.

Геном животного в клетке, которая включает, по меньшей мере, один инструмент, может включать целевой сайт для направляющей нуклеиновой кислоты. Целевым сайтом может быть нуклеотидная последовательность, соседняя к 5' концу или 3' концу PAM последовательности.

По меньшей мере, один инструмент может включать целевой инструмент. Целевой инструмент может включать целевой сайт для направляющей нуклеиновой кислоты. Целевым сайтом может быть нуклеотидная последовательность, соседняя к 5’ концу или 3’ концу PAM последовательности. Целевым инструментом может быть инструмент, такой же как для первого инструмента. Альтернативно, целевым инструментом может быть инструмент, который отличается от первого инструмента.

5-1. Негомологичное соединение концов (NHEJ)

В случае, когда обе двойные нити ДНК расщеплены, то есть возникает двойной разрыв нити, обратное связывание расщепленных нитей ДНК ДНК-лигазой называется негомологичным соединением концов (NHEJ).

Геном животного в клетке может включать по меньшей мере, любой из первого инструмента, второго инструмента и третьего инструмента. Cas9 может быть экспрессирована в клетке или может быть доставлена в клетку. нРНК может быть экспрессирована в клетке или доставлена в клетку.

нРНК может иметь комплементарное связывание с целевым сайтом геном животного в клетке или целевым инструментом. Cas9 может взаимодействовать с нРНК, тем самым вызывая разрыв двойной нити в целевом сайте.

В этом случае, нуклеотид или полинуклеотид может быть вставлен во время процесса негомологичного соединения концов (NHEJ). Альтернативно, нуклеотид или полинуклеотид может быть удален во время процесса негомологичного соединения концов (NHEJ). Благодаря вставке или делеции, модификация может происходить в нуклеотидной последовательности на целевом сайте.

5-2. Гомологическая рекомбинация

Геном животного в клетке может включать, по меньшей мере, любой из первого инструмента, второго инструмента и третьего инструмента. Cas9 может быть экспрессирована в клетке или может быть доставлена в клетку. нРНК может быть экспрессирована в клетке или доставлена в клетку.

Донорный полинуклеотид или донор может быть доставлен в клетку. Первое плечо гомологии может быть расположено на 5’ конце донора. Второе плечо гомологии может быть расположено на 3' конце донора.

Первое плечо гомологии может иметь такую же нуклеотидную последовательность, как часть генома животного в клетке, и второе плечо гомологии может иметь такую же нуклеотидную последовательность, как часть генома животного в клетке. В этом случае, донорный полинуклеотид может быть вставлен между такой же нуклеотидной последовательностью, как для первого плеча гомологии, и такой же нуклеотидной последовательностью, как для второго плеча гомологии, в геноме животного в клетке.

Альтернативно, первое плечо гомологии может иметь такую же нуклеотидную последовательность, как часть целевого инструмента в клетке, и второе плечо гомологии может иметь такую же нуклеотидную последовательность, как часть целевого инструмента в клетке. В этом случае, донорный полинуклеотид может быть вставлен между такой же нуклеотидной последовательностью, как для первого плеча гомологии, и такой же нуклеотидной последовательностью, как для второго плеча гомологии, в целевом инструменте в клетке.

Донор может включать инструмент.

5-3. Независимая от гомологии целевая интеграция (HITI)

Донор может быть доставлен в клетку.

Целевой сайт, имеющий такую же нуклеотидную последовательность, как расположена в целевом сайте в геноме животного в клетке, может быть расположен на 5' конце и 3' конце донора. В этом случае, двухнитевой разрыв может проводиться системой CRISPR/фермент на целевом сайте, расположенном на геноме животного в клетке, целевом сайте на 5’ конце донора, и целевом сайте на 3’ конце донора. Донор может быть вставлен между двухнитевыми разрывами генома животного через негомологичное соединение концов (NHEJ).

Альтернативно, целевой сайт, имеющий такую же нуклеотидную последовательность, как расположена в целевом сайте в целевом инструменте в клетке, может быть расположен на 5' конце и 3' конце донора. В этом случае, двухнитевой разрыв может проводиться системой CRISPR/фермент на целевом сайте, расположенном на целевом инструменте в клетке, целевом сайте на 5’ конце донора, и целевом сайте на 3’ конце донора. Донор может быть вставлен между двухнитевыми разрывами целевого инструмента через негомологичное соединение концов (NHEJ).

Донор может включать инструмент.

5-4. Нокин (Нок-ин)

Донорный может полинуклеотид быть доставлен в клетку. В этом случае, донор может быть вставлен в геном животного в клетке или вовнутрь целевого инструмента через гомологическую рекомбинацию. Альтернативно, донор может быть вставлен в геном животного в клетке или вовнутрь целевого инструмента через HITI.

Например, по меньшей мере, одна нуклеотидная последовательность, присутствующая в целевом сайте в геноме животного или целевом сайте внутри целевого инструмента в клетке, может быть удалена, и донорный полинуклеотид может быть добавлен.

В другом примере, донорный полинуклеотид может быть добавлен в последовательность, присутствующую в целевом сайте в геноме животного или целевом сайте внутри целевого инструмента в клетке.

В случае, когда донор включает полинуклеотид, кодирующий белок или РНК, в клетке, в которую вставлен донор, полинуклеотид, кодирующий белок или РНК, может быть нокинирован и, следовательно, может быть экспрессирован белок или РНК.

5-5. Нокаут (Нок-аут)

Донорный может полинуклеотид быть доставлен в клетку. В этом случае, донор может быть вставлен в целевой сайт в геноме животного или в целевой сайт внутри целевого инструмента в клетке через гомологическую рекомбинацию. Альтернативно, донор может быть вставлен в целевой сайт в геноме животного или в целевой сайт внутри целевого инструмента в клетке через HITI.

Донорный полинуклеотид может не быть доставлен в клетку. В этом случае, нуклеотидная вставка, полинуклеотидная вставка, нуклеотидная делеция или полинуклеотидная делеция могут происходить на целевом сайте в геноме животного или на целевом сайте внутри целевого инструмента в клетке.

Например, может быть удален, по меньшей мере, один нуклеотид, присутствующий в целевом сайте в геноме животного или в целевом сайте внутри целевого инструмента в клетке.

В другом примере, может быть удален, по меньшей мере, один нуклеотид, присутствующий в целевом сайте в геноме животного или в целевом сайте внутри целевого инструмента в клетке, и, по меньшей мере, один нуклеотид может быть дополнительно добавлен туда.

В случае, когда целевой сайт в геноме животного или целевой сайт внутри целевого инструмента в клетке расположен на полинуклеотиде, кодирующем белок или РНК, белок или РНК может быть нокаутирована, тем самым может быть снижен уровень экспрессии.

6. Сайт-специфическая трансформация клетки системой CRISPR/фермент

Геном животного трансформированной клетки может включать, по меньшей мере, один инструмент. По меньшей мере, один инструмент может включать любой из первого инструмента, второго инструмента и третьего инструмента. Первый инструмент может включать по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу. Второй инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту. Третий инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу и может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту.

Сайт-специфически трансформированная клетка может включать клетки, в которых сайт-специфическая трансформация произошла на целевом сайте в геноме животного в клетке.

Сайт-специфически трансформированная клетка может включать клетки, в которых сайт-специфическая трансформация произошла на целевом сайте внутри целевого инструмента в клетке.

6-1. Одна клетка

6-1-1. Плоидность

Сайт-специфически трансформированной клеткой может быть диплоидная клетка. Диплоидная клетка такая, как описано выше.

Сайт-специфически трансформированной клеткой может быть гаплоидная клетка. Гаплоидная клетка такая, как описано выше.

6-1-2. Зиготность

Сайт-специфически трансформированная клетка может включать, по меньшей мере, одну пару гомологичных хромосом. По меньшей мере, одна пара гомологичных хромосом может включать первую хромосому и вторую хромосому, которые находятся в отношениях гомологичных хромосом.

Сайт-специфически трансформированной клеткой может быть гомозигота.

В сайт-специфически трансформированной клетке, которая является гомозиготой, все из типа, количества и локации сайт-специфических трансформаций, включенных в первую хромосому и вторую хромосому, могут быть одинаковыми.

В сайт-специфически трансформированной клетке, которая является гомозиготой, и тип и количество сайт-специфических трансформаций, включенных в первую хромосому и вторую хромосому, могут быть одинаковыми.

В сайт-специфически трансформированной клетке, которая является гомозиготой, тип сайт-специфической трансформации, включенной в первую хромосому и вторую хромосому, может быть одинаковым.

В сайт-специфически трансформированной клетке, которая является гомозиготой, все из типа, количества и локации инструментов и сайт-специфической трансформации, включенных в первую хромосому и вторую хромосому, могут быть одинаковыми.

В сайт-специфически трансформированной клетке, которая является гомозиготой, и тип и количество инструментов и сайт-специфической трансформации, включенных в первую хромосому и вторую хромосому, могут быть одинаковыми.

В сайт-специфически трансформированной клетке, которая является гомозиготой, тип инструментов и сайт-специфической трансформации, включенных в первую хромосому и вторую хромосому, могут быть одинаковыми.

Альтернативно, в сайт-специфически трансформированной клетке, которая является гомозиготой, и первая хромосома и вторая хромосом могут не включать любой инструмент, и первая хромосома и вторая хромосома могут не включать какую-либо сайт-специфическую трансформацию.

Сайт-специфически трансформированная клетка может быть гетерозиготой.

В сайт-специфически трансформированной клетке, которая является гетерозиготой, первая хромосома может не включать какой-либо инструмент, и вторая хромосома может включать, по меньшей мере, один инструмент.

В сайт-специфически трансформированной клетке, которая является гетерозиготой, первая хромосома может не включать сайт-специфическую трансформацию, и вторая хромосома может включать, по меньшей мере, одну сайт-специфическую трансформацию.

В сайт-специфически трансформированной клетке, которая является гетерозиготой, вторая хромосома может не включать инструмент такой же, который включен в первую хромосому.

В сайт-специфически трансформированной клетке, которая является гетерозиготой, вторая хромосома может не включать сайт-специфическую трансформацию, такую же как включена в первую хромосому.

6-2. Колония клеток

Сайт-специфически трансформированная клетка может образовывать колонию клеток.

6-2-1. Гомологичная колония клеток

Гомологичная колония клеток характеризуется тем, что инструменты, которыми обладает каждая клетка, являются одинаковыми, и все типы, количества и локации сайт-специфических трансформаций, включенных в каждую клетку, также одинаковы.

6-2-2. Химерная колония клеток

Например, химерная колония клеток может включать первую клетку, которая имеет геном, в котором происходит сайт-специфическая трансформация в первом целевом сайт посредством системы CRISPR/фермент, и вторую клетку, которая не имеет геном, в котором происходит сайт-специфическая трансформация в первом целевом сайт посредством системы CRISPR/фермент.

7. Выбор сайт-специфически трансформированной клетки с применением системы CRISPR/фермент

7-1. Выбор трансформированной клетки с применением флуоресцентного белка

Трансформированная клетка может включать, по меньшей мере, один целевой инструмент. Трансформированная клетка может включать, по меньшей мере, один инструмент. Любой из, по меньшей мере, одного инструмента может быть целевым инструментом, который включает полинуклеотид, который кодирует флуоресцентный белок. Например, полинуклеотид, кодирующий целевой белок, может быть вставлен в трансформированную клетку через сайт-специфическую трансформацию, которая применяет экзоны полинуклеотида, который кодирует флуоресцентный белок, в качестве целевого сайта.

Сайт-специфически трансформированные клетки могут отличаться от клеток, в которых сайт-специфическая трансформация не происходит в отношении сигнала флуоресценции. Следовательно, сайт-специфически трансформированные клетки могут быть выделены.

Сайт-специфически трансформированная клетка может включать полинуклеотид, кодирующий флуоресцентный белок. Например, донор, включающий полинуклеотид, кодирующий флуоресцентный белок, может быть вставлен в трансформированную клетку, включающую, по меньшей мере, один целевой инструмент, через сайт-специфическую трансформацию. Донор может включать полинуклеотид, кодирующий целевой белок.

Сайт-специфически трансформированная клетка экспрессирует флуоресцентные белки и, таким образом, могут быть измерены сигналы флуоресценции. Следовательно, сайт-специфически трансформированные клетки могут быть отделены от животных клеток, в которых произошла сайт-специфическая трансформация.

7-2. Выбор трансформированной клетки с применением гена устойчивости к антибиотикам

Сайт-специфически трансформированная клетка может включать ген устойчивости к антибиотикам.

Например, донор, который включает полинуклеотид, кодирующий ген устойчивости к антибиотикам, может быть вставлен в трансформированную клетку, включающую, по меньшей мере, один целевой инструмент, через сайт-специфическую трансформацию. Донор может включать полинуклеотид, кодирующий целевой белок.

Сайт-специфически трансформированная клетка может экспрессировать ген устойчивости к антибиотикам, и поэтому клетки могут выживать даже при обработке антибиотиком. Следовательно, сайт-специфически трансформированные клетки могут быть отделены от животных клеток, в которых не произошла сайт-специфическая трансформация.

7-3. Выбор трансформированной клетки с применением реакции антиген-антитело

Сайт-специфически трансформированная клетка может включать, по меньшей мере, один целевой инструмент. Сайт-специфически трансформированная клетка может включать, по меньшей мере, один инструмент. Любой из, по меньшей мере, одного инструмента может быть целевым инструментом, который включает полинуклеотид, кодирующий антиген, или нуклеотид, способный действовать как антиген. Например, полинуклеотид, кодирующий целевой белок, может быть вставлен в трансформированную клетку, которая включает целевой инструмент, который включает полинуклеотид, кодирующий антиген, через сайт-специфическую трансформацию, в которой экзоны полинуклеотида, кодирующего антиген, применяются в качестве целевого сайта.

Сайт-специфически трансформированные клетки могут отличаться от клеток, в которых не произошла сайт-специфическая трансформация, в отношении уровня экспрессии антигена. Следовательно, сайт-специфически трансформированные клетки могут быть выделены через реакцию антиген-антитело.

Сайт-специфически трансформированная клетка может включать полинуклеотид, кодирующий антиген, или нуклеотид, способный действовать как антиген. Например, донор, который включает нуклеотид, способный действовать как антиген, может быть вставлен в трансформированную клетку, которая включает целевой сайт, в геноме животного через сайт-специфическую трансформацию. Донор может включать полинуклеотид, кодирующий целевой белок.

Нуклеотид, способный действовать как антиген, вставленный в сайт-специфически трансформированную клетку, может взаимодействовать с определенным антителом. Следовательно, сайт-специфически трансформированные клетки могут быть отделены от животных клеток, в которых сайт-специфическая трансформация не произошла.

7-4. Выбор трансформированной клетки с применением поверхностного маркерного гена

Сайт-специфически трансформированная клетка может включать, по меньшей мере, один целевой инструмент. Сайт-специфически трансформированная клетка может включать, по меньшей мере, один инструмент. Любой из, по меньшей мере, одного инструмента может быть целевым инструментом, который включает полинуклеотид, кодирующий поверхностный маркерный ген. Например, полинуклеотид, кодирующий целевой белок, может быть вставлен в трансформированную клетку через сайт-специфическую трансформацию, в которой экзоны полинуклеотида, кодирующего поверхностный маркерный ген, применяют в качестве целевого сайта.

Сайт-специфически трансформированные клетки могут отличаться от клеток, в которых сайт-специфическая трансформация не произошла, в отношении уровня поверхностного маркера, экспрессированного на поверхности. Поверхностный маркер может взаимодействовать с определенным антителом. Антитело может взаимодействовать с магнитными частицами или флуорофорами. Следовательно, сайт-специфически трансформированные клетки могут быть отделены от клеток, в которых сайт-специфическая трансформация не произошла, на основе магнитных свойств или сигнала флуоресценции.

Сайт-специфически трансформированная клетка может включать полинуклеотид, кодирующий поверхностный маркер. Например, донор, который включает полинуклеотид, кодирующий поверхностный маркер, может быть вставлен в трансформированную клетку, которая включает, по меньшей мере, один целевой инструмент, через сайт-специфическую трансформацию. Донор может включать полинуклеотид, кодирующий целевой белок.

Сайт-специфически трансформированная клетка может экспрессировать поверхностный маркер на поверхности клетки. Поверхностный маркер может взаимодействовать с определенным антителом. Антитело может взаимодействовать с магнитными частицами или флуорофорами. Следовательно, сайт-специфически трансформированные клетки могут быть отделены от клеток, в которых сайт-специфическая трансформация не произошла, на основе магнитных свойств или сигнала флуоресценции.

7-5. Выбор трансформированной клетки с применением суицидального гена

Сайт-специфически трансформированная клетка может включать полинуклеотид, кодирующий суицидальный ген в геноме животного или в инструменте. Может быть получена сайт-специфически трансформированная клетка, в которой суицидальный ген нокаутирован через сайт-специфическую трансформацию.

Например, если трансформированная клетка включает, инструмент, который включает полинуклеотид, кодирующий тимидинкиназу, донор может быть вставлен через сайт-специфическую трансформацию, в которой часть нуклеотидных последовательностей экзонов полинуклеотида, кодирующего тимидинкиназу, применяют в качестве целевого сайта.

Сайт-специфически трансформированная клетка характеризуется тем, что суицидальный ген нокаутирован и, таким образом, даже при обработке пролекарством, апоптоз не происходит. Следовательно, сайт-специфически трансформированные клетки могут быть отделены от животных клеток, в которых сайт-специфическая трансформация не произошла.

8. Сайт-специфическое трансгенное животное с применением системы CRISPR/фермент

8-1. Отдельное сайт-специфическое трансгенное животное с применением системы CRISPR/фермент

8-1-1. Гомология

Каждая клетка включенная в гомологичное сайт-специфическое трансгенное животное может включать, по меньшей мере, один инструмент. По меньшей мере, один инструмент может включать, по меньшей мере, один из первого инструмента, второго инструмента и третьего инструмента. Первый инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу. Второй инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту. Третий инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту.

Каждая клетка, которая включена в гомологичное сайт-специфическое трансгенное животное, может включать, по меньшей мере, одну сайт-специфическую трансформацию в целевом сайте генома животного.

Каждая клетка, которая включена в гомологичное сайт-специфическое трансгенное животное, может включать, по меньшей мере, одну сайт-специфическую трансформацию в целевом сайте внутри инструмента.

8-1-2. Химерное

Химерное сайт-специфическое трансгенное животное относится к трансгенному животному, отличному от гомологичного трансгенного животного.

Например, химерное сайт-специфическое трансгенное животное может включать и первую клетку, которая имеет геном, в котором сайт-специфическая трансформация произошла в первом целевом сайте через систему CRISPR/фермент; и вторую клетку, которая не имеет геном, в котором сайт-специфическая трансформация произошла в первом целевом сайте через систему CRISPR/фермент.

8-2. Способ получения сайт-специфического трансгенного животного с применением системы CRISPR/фермент

Способы получения сайт-специфического трансгенного животного включает способ получения сайт-специфического трансгенного животного из животной клетки, способ получения сайт-специфического трансгенного животного доставкой экзополинуклеотида в ткань или орган животного, и способ получения сайт-специфического трансгенного животного скрещиванием трансгенных животных. Способ получения сайт-специфического трансгенного животного из животной клетки включает способ получения сайт-специфического трансгенного животного из клетки трансгенного животного, в которое вставлен, по меньшей мере, один инструмент.

Сайт-специфическим трансгенным животным, полученным любым из вышеуказанных способов, может быть любое из химерного сайт-специфического трансгенного животного или гомологичного сайт-специфического трансгенного животного.

8-2-1. Способ получения сайт-специфического трансгенного животного из животной клетки

Сайт-специфическое трансгенное животное может быть получено из трансформированной клетки, включающей, по меньшей мере, один инструмент.

Например, сайт-специфическое трагсгенное животное может быть получено проведением сайт-специфической трансформации в целевом сайте, присутствующем в геноме животного или внутри целевого инструмента в соматической клетке, через микроинъекцию нРНК соматической клетки в соматическую клетку, в которую вставлен первый инструмент, затем SCNT. Сайт-специфическим трансгенным животным может быть гомологичное сайт-специфическое трансгенное животное.

Например, сайт-специфическое трансгенное животное, в которое вставлен донорный полинуклеотид в целевой сайт, присутствующий в геноме животного или внутри целевого инструмента гаметы, включающей третий инструмент, может быть получено через микроинъекцию донорного полинуклеотида гаметы в гамету. Сайт-специфическим трансгенным животным может быть химерное сайт-специфическое трансгенное животное.

Например, сайт-специфическое трансгенное животное, в котором NHEJ произошло в целевом сайте, присутствующем в геноме животного или внутри целевого инструмента зиготы, включающей второй инструмент, может быть получено через микроинъекцию полинуклеотида зиготы, кодирующего Cas9, в зиготе. Сайт-специфическим трансгенным животным может быть химерное сайт-специфическое трансгенное животное.

Например, сайт-специфическое трагсгенное животное может быть получено вызовом NHEJ в целевом сайте, присутствующем внутри целевого инструмента через микроинъекцию полинуклеотида эмбриона, кодирующего Cas9, и полинуклеотида, кодирующего нРНК в эмбрионе, включающем целевой инструмент. Сайт-специфическим трансгенным животным может быть химерное сайт-специфическое трансгенное животное.

8-2-2. Способ получения сайт-специфического трансгенного животного доставкой экзополинуклеотида в ткань или орган животного

Ткань или орган животного может включать клетку, включающую, по меньшей мере, один инструмент. Сайт-специфическое трагсгенное животное может быть получено введением Cas9, нРНК или донорного полинуклеотида в ткань или орган животного.

Например, Если ткань молочной железы животного включает клетку, в которую вставлен первый инструмент, может быть получено сайт-специфическое трансгенное животное, в котором белок, который специфически экспрессируется в молочной железе, нокаутирован микроинъекцией нРНК, которая нацелена, в качестве целевого сайта, на часть нуклеотидной последовательности полинуклеотида, кодирующего белок, специфически экспрессированный в молочной железе в геноме животного, в ткань молочной железы. Сайт-специфическим трансгенным животным может быть химерное сайт-специфическое трансгенное животное.

Например, если ткань молочной железы животного включает клетку, в которую вставлен целевой инструмент, сайт-специфическое трансгенное животное, в котором донор вставлен в целевой инструмент, может быть получен микроинъекцией полинуклеотида, кодирующего Cas9, полинуклеотида, кодирующего нРНК и донорного полинуклеотид в ткань молочной железы. Сайт-специфическим трансгенным животным может быть химерное сайт-специфическое трансгенное животное.

Например, когда репродуктивный орган животного включает клетку, в которую вставлен второй инструмент, сайт-специфическая трансформация может быть вызвана в целевом сайте, присутствующем в геноме животного или внутри целевого инструмента в клетке репродуктивного органа через микроинъекцию полинуклеотида, кодирующего Cas9, в репродуктивный орган животного. Потомство, полученное из гаметы сайт-специфического трансгенного животного также может быть сайт-специфическим трансгенным животным. Сайт-специфическим трансгенным животным может быть химерное сайт-специфическое трансгенное животное.

8-2-3. Способ получения трансгенного животного скрещиванием

Сайт-специфическое трансгенное животное может быть получено скрещиванием между первым трансгенным животным и вторым трансгенным животным.

Например, потомство, в котором сайт-специфическая трансформация происходит в целевом сайте, присутствующем в геноме животного или внутри целевого инструмента, может быть получено скрещиванием между первым трансгенным животным, включающим первый инструмент, и вторым трансгенным животным, включающим второй инструмент.

Второе трансгенное животное может быть потомством первого трансгенного животного или может быть родственным по крови первому трансгенному животному. Альтернативно, второе трансгенное животное может не быть родственным по крови первому трансгенному животному.

Сайт-специфическое трансгенное животное, полученное скрещиванием, может включать инструмент, который является таким же, как часть инструментов, включенных в геном животного первого трансгенного животного, в том же месте.

Сайт-специфическое трансгенное животное, полученное скрещиванием, может включать инструмент, который является таким же, как часть инструментов, включенных в геном животного второго трансгенного животного, в том же месте.

Сайт-специфическое трансгенное животное, полученное скрещиванием, может быть гомологичным сайт-специфическим трансгенным животным.

Сайт-специфическое трансгенное животное, полученное скрещиванием, может включать гомозиготу сайт-специфически трансформированной клетки. Трансгенное животное, полученное скрещиванием, может включать гетерозиготу сайт-специфически трансформированной клетки.

9. Применение сайт-специфического трансгенного животного с применением системы CRISPR/фермент

9-1. Животные с улучшенными свойствами

Сайт-специфическое трансгенное животное может применяться в качестве животного с улучшенными свойствами.

9-2. Животная модель заболевания

Сайт-специфическое трансгенное животное может применяться в качестве животной модели заболевания.

9-3. Резистентное к заболеванию животное

Сайт-специфическое трансгенное животное может применяться в качестве резистентного к заболеванию животного.

9-4. Применение побочных продуктов

Могут применяться органы, мясо, кожа, шерсть и жидкости тела сайт-специфического трансгенного животного, но применяемые части трансгенного животного ими не ограничены.

9-5. Биореактор

Сайт-специфическое трансгенное животное может применяться в качестве биореактора.

[ЧАСТЬ V] Исключение инструмента

1. Исключение инструмента транспосазой

Геном животного в клетке может включать, по меньшей мере, один инструмент. Транспозонный инструмент из, по меньшей мере, одного инструмента, может включать ITR полинуклеотид в первой концевой области и второй концевой области.

1-1. Применение транспосазы в геноме животного

1-1-1. Конструкция для исключения инструмента

Геном животного может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий транспосазу, который может взаимодействовать с ITR полинуклеотидом. Транспосаза может включать только эксцизионную транспосазу.

Полинуклеотид, кодирующий транспосазу, может быть расположен в транспозонном инструменте.

В настоящем документе термин “транспозонный инструмент” может относиться к инструменту, который включает полинуклеотид, кодирующий транспозон в качестве компонента.

Полинуклеотид, кодирующий транспосазу, может быть расположен в инструменте, отличном от транспозоного инструмента.

Полинуклеотид, кодирующий транспосазу, может быть расположен вне инструмента.

Промотор, контролирующий транскрипцию полинуклеотида, кодирующего транспосазу, может быть расположен выше полинуклеотида, кодирующего транспосаз. Промотором может быть любой из конститутивного промотора, ткань-специфического промотора и индуцируемого промотора.

LSL может быть расположен между промотором, контролирующим транскрипцию транспосазы, и полинуклеотидом, кодирующим транспосазу.

1-1-2. Механизм исключения инструмента

Транспосаза, экспрессированная в клетке, может удалять транспозонный инструмент, присутствующий в клетке, из генома животного.

В случае, когда промотор, контролирующий транскрипцию полинуклеотида, кодирующего транспосазу, является ткань-специфическим промотором, транспосаза может экспрессироваться в клетке определенной ткани трансгенного животного, включающего геном животного. В этом случае транспозонный инструмент в геноме животного в клетке, включенный в определенную ткань, может быть удален посредством взаимодействия с ITR полинуклеотидом транспозоного инструмента.

В случае, когда промотор, контролирующий транскрипцию полинуклеотида, кодирующего транспосазу, является индуцируемым промотором, транспосаза может экспрессироваться только при соблюдении определенных условий. В этом случае, транспозонный инструмент в геноме животного в клетке, который удовлетворяет определенным условиям, может быть удален через взаимодействие с ITR полинуклеотидом транспозонного инструмента.

В случае, когда LSL расположен между промотором, контролирующим транскрипцию транспосазы, и полинуклеотидом, кодирующим транспосазу, транспосаза может экспрессироваться только тогда, когда стоп-кодон, присутствующий в LSL, удален через сайт-специфическую рекомбинацию путем введения Cre рекомбиназы в клетку. В этом случае, транспозонный инструмент в геноме животного в клетке, включающий Cre рекомбиназу, может быть удален взаимодействием с ITR полинуклеотидом транспозонного инструмента.

1-2. Применение транспосазы вне генома животного

1-2-1. Конструкция для исключения инструмента

Геном животного может не включать полинуклеотид, кодирующий транспосазу, которая может взаимодействовать с ITR полинуклеотидом.

В этом случае, полинуклеотид, кодирующий транспосазу, может быть доставлен в клетку. Промотор, контролирующий транскрипцию полинуклеотида, кодирующего транспосазу, может быть расположен выше полинуклеотида, кодирующего транспосазу. Промотором может быть любой из конститутивного промотора, ткань-специфического промотора и индуцируемого промотора. LSL может быть расположен между промотором, контролирующим транскрипцию транспосазы, и полинуклеотидом, кодирующим транспосазу.

Сама транспосаза может быть введена в клетку.

Транспосаза может включать только эксцизионную транспосазу.

1-2-2. Механизм исключения инструмента

Транспосаза, введенная в клетку, может удалять транспозонный инструмент, присутствующий в клетке, из генома животного.

В случае, когда промотор, контролирующий транскрипцию полинуклеотида, кодирующего транспосазу, является ткань-специфическим промотором, может быть экспрессирована транспосаза, введенная в определенные ткани трансгенного животного, включая геном животного. В этом случае транспозонный инструмент в геноме животного в клетке, куда введена транспосаза, может быть удален взаимодействием с ITR полинуклеотидом транспозонного инструмента.

В случае, когда промотор, контролирующий транскрипцию полинуклеотида, индуцирующего транспосазу, является индуцируемым промотором, транспосаза, введенная в клетку, может экспрессироваться только при соблюдении определенных условий. В этом случае транспозонный инструмент в геноме животного в клетке, который удовлетворяет определенным условиям, может быть удален взаимодействием с ITR полинуклеотидом транспозонного инструмента.

2. Исключение инструмента сайт-специфической рекомбиназой

Геном животного в клетке может включать, по меньшей мере, один инструмент. Из, по меньшей мере, одного инструмента, первая концевая область RRS инструмента может включать RRS1 и вторая концевая область может включать RRS2.

В настоящем документе термин “RRS инструмент” может относиться к инструменту, который включает RRS в качестве компонента.

RRS1 и RRS2 могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга.

RRS1 и RRS2 может образовывать пару друг с другом.

SSR 1, которая может взаимодействовать с RRS1, и SSR 2, которая может взаимодействовать с RRS2, могут быть одинаковыми SSR.

2-1. Применение сайт-специфической рекомбиназы в геноме животного

2-1-1. Конструкция для исключения инструмента

Геном животного в клетке может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий SSR.

Полинуклеотид, кодирующий SSR, может быть расположен в SSR инструменте.

Полинуклеотид, кодирующий SSR, может быть расположен в инструменте, отличном от SSR инструмента.

Полинуклеотид, кодирующий SSR, может быть расположен вне инструмента.

Промотор, контролирующий транскрипцию полинуклеотида, кодирующего SSR, может быть расположен выше полинуклеотида, кодирующего SSR. Промотором может быть любой из конститутивного промотора, ткань-специфического промотора и индуцируемого промотора. LSL может быть расположен между промотором, контролирующим транскрипцию полинуклеотида, кодирующего SSR, и полинуклеотидом, кодирующим SSR.

2-1-2. Механизм исключения инструмента

SSR, экспрессируемая в клетке, может удалять инструмент RRS из генома животного взаимодействием с RRS1 и RRS2.

В случае, когда промотор, контролирующий транскрипцию полинуклеотида, кодирующего SSR, является ткань-специфическим промотором, SSR может быть экспрессирована в определенных тканях трансгенного животного, включая геном животного. В этом случае RRS инструмент в геноме животного в клетке, куда введена SSR, может быть удален взаимодействием с RRS1 и RRS2 на обоих концах RRS инструмента.

В случае, когда промотор, контролирующий транскрипцию полинуклеотида, кодирующего SSR, является индуцируемым промотором, SSR может экспрессироваться только при соблюдении определенных условий. В этом случае RRS инструмент в геноме животного в клетке, который удовлетворяет определенным условиям, может быть удален взаимодействием с RRS1 и RRS2 на обоих концах RRS инструмента.

В случае, когда LSL расположен между промотором, контролирующим транскрипцию SSR, и полинуклеотидом, кодирующим SSR, SSR может экспрессироваться только тогда, когда стоп-кодон, присутствующий в LSL, удален через сайт-специфическую рекомбинацию путем введения Cre рекомбиназы в клетку. В этом случае, RRS инструмент в геноме животного в клетке, включающий Cre рекомбиназу, может быть удален взаимодействием с RRS1 и RRS2 на обоих концах RRS инструмента.

2-2. Применение сайт-специфической рекомбиназы вне генома животного

2-2-1. Конструкция для исключения инструмента

Геном животного может не включать полинуклеотид, кодирующий SSR.

В этом случае, полинуклеотид, кодирующий SSR может быть доставлен в клетку. Промотор, контролирующий транскрипцию полинуклеотида, кодирующего SSR, может быть расположен выше полинуклеотида, кодирующего SSR. Промотором может быть любой из конститутивного промотора, ткань-специфического промотора и индуцируемого промотора. LSL может быть расположен выше полинуклеотида, кодирующего SSR.

Альтернативно, сама SSR может быть введена в клетку.

2-2-2. Механизм исключения инструмента

SSR, введенная в клетку, может удалять RRS инструмент из генома животного взаимодействием с RRS1 и RRS2.

В случае, когда промотор, контролирующий транскрипцию полинуклеотида, кодирующего SSR, является ткань-специфическим промотором, SSR, введенная в клетку, может экспрессироваться в определенной ткани трансгенного животного, включая геном животного. В этом случае RRS инструмент в геноме животного в клетке, куда введена SSR, может быть удален взаимодействием с RRS1 и RRS2 на обоих концах RRS инструмента.

В случае, когда промотор, контролирующий транскрипцию полинуклеотида, кодирующего SSR, является индуцируемым промотором, SSR, введенная в клетку, может экспрессироваться только при соблюдении определенных условий. В этом случае RRS инструмент в геноме животного в клетке, который удовлетворяет определенным условиям, может быть удален взаимодействием с RRS1 и RRS2 на обоих концах RRS инструмента.

В случае, когда LSL расположен между промотором, контролирующим транскрипцию SSR, и полинуклеотидом, кодирующим SSR, SSR может экспрессироваться только тогда, когда стоп-кодон, присутствующий в LSL, удален через сайт-специфическую рекомбинацию путем введения вместе с Cre рекомбиназой. В этом случае, RRS инструмент в геноме животного в клетке, включающий Cre рекомбиназу, может быть удален взаимодействием с RRS1 и RRS2 на обоих концах RRS инструмента.

Далее будут описаны конкретные варианты осуществления согласно подробностям, раскрытым в настоящем раскрытии.

[Инструмент, включающий, по меньшей мере, одну из РНК-направляемой эндонуклеазы и направляющей нуклеиновой кислоты]

1. Конструирование инструмента

Инструменты, раскрытые некоторыми вариантами осуществления по настоящему раскрытию, могут включать первую ITR последовательность, по меньшей мере, одну из полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту, и вторую ITR последовательность.

Так как первая ITR последовательность, полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту и вторая ITR последовательность были описаны выше, подробное объяснение опущено.

Конструирование инструмента будет подробно описано со ссылкой на ФИГ. 1.

Инструмент (100) может включать полинуклеотид, кодирующий компонент сконструированной нуклеазы (110) между первой ITR последовательностью (101) и второй ITR последовательностью (107).

ФИГ. 2 иллюстрирует разные варианты осуществления полинуклеотида, кодирующего компонент сконструированной нуклеазы (110).

Полинуклеотид, кодирующий компонент сконструированной нуклеазы (110) может включать, по меньшей мере, один из полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу (102), и полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту (104).

РНК-направляемой эндонуклеазой может быть белок Cas9 или белок Cpf1, который составляет комплекс сконструированной нуклеазы; и направляющей нуклеиновой кислотой может быть нРНК, которая составляет комплекс сконструированной нуклеазы.

Дополнительно, полинуклеотид, кодирующий компонент сконструированной нуклеазы (110), может дополнительно включать полинуклеотид, кодирующий промотор (106), для экспрессии РНК-направляемой эндонуклеазы и/или направляющей нуклеиновой кислоты.

Инструмент (100) может дополнительно включать сайт распознавания рекомбиназы (RRS).

Типом и количеством сайтов распознавания рекомбиназы (RRS) может быть один или более.

Места, в которых сайт распознавания рекомбиназы (RRS) может присутствовать в инструменте (100), могут быть разными. Например, сайт распознавания рекомбиназы (RRS) может быть расположен в одном или более местах из 1-24, указанных на ФИГ. 2.

Тип, количество и/или место сайта распознавания рекомбиназы (RRS) может быть разработан с учетом изменений в конструкции инструмента.

Изменения в конструкции могут включать обмен или делецию полинуклеотида, включенного в инструмент, и может включать вставку полинуклеотида, который не включен в инструмент, в инструмент.

Используя ФИГ. 2, некоторые варианты осуществления, в которых конструирование инструмента изменено согласно конструкции инструмента, который включает сайт распознавания рекомбиназы (RRS), описаны ниже.

Например, в случае, когда инструмент сконструирован так, чтобы включать сайт распознавания рекомбиназы (RRS) в 5’ направлении и 3’ направлении относительно полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу (102), полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, включенный в инструмент, может быть обменен на другой тип полинуклеотида через сайт-специфическую рекомбинацию. Более конкретно, если разные типы сайтов распознавания рекомбиназы (RRS) включены в локации 4 и 5 на ФИГ. 2, полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, включенный в инструмент, может быть обменен на другой тип полинуклеотида через сайт-специфическую рекомбинацию.

В другом примере, в случае, если инструмент сконструирован так, чтобы включать сайт распознавания рекомбиназы (RRS), который может образовывать пару в 5’ направлении и 3’ направлении относительно полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу (102), полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, включенный в инструмент, может быть удален через сайт-специфическую рекомбинацию. Более конкретно, в случае, где полинуклеотид, кодирующий loxp, включен в локациях 4 и 5 с ФИГ. 2, полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, включенный в инструмент, может быть удален через сайт-специфическую рекомбинацию.

В еще одном примере, в случае, где инструмент сконструирован так, чтобы включать сайт распознавания рекомбиназы (RRS) в 5’ направлении и/или 3’ направлении относительно полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу (102), полинуклеотид, который не включен в инструмент, может быть вставлен в инструмент через сайт-специфическую рекомбинацию. Более конкретно, в случае, где сайт распознавания рекомбиназы (RRS) включен в локации 5 на ФИГ. 2, полинуклеотид, который не включен в инструмент, может быть вставлен в инструмент через сайт-специфическую рекомбинацию.

Дополнительно, тип, количество и/или локация сайта распознавания рекомбиназы (RRS) может быть сконструирована с учетом контроля экспрессии РНК или белка, которые кодированы полинуклеотидом, который составляет инструмент.

Используя ФИГ. 2, некоторые варианты осуществления, в которых экспрессия РНК или белка контролируется согласно конструкции инструмента, который включает сайт распознавания рекомбиназы (RRS), описаны ниже.

Контроль экспрессии РНК или белка, кодированного полинуклеотидом, который составляет инструмент, может включать вставку полинуклеотида, кодирующего промотор на поздней стадии с применением сайта распознавания рекомбиназы (RRS).

Например, в случае, где сайт распознавания рекомбиназы (RRS) включен в 5’ направлении полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазуу, возможно контролировать экспрессию РНК-направляемой эндонуклеазы вставкой промотора для транскрипции и/или трансляции полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, через сайт-специфическую рекомбинацию.

Более конкретно, в случае, где сайт распознавания рекомбиназы (RRS) включен в 17 на ФИГ. 2, возможно контролировать экспрессию РНК-направляемой эндонуклеазы вставкой промотора для транскрипции и/или трансляции полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, через сайт-специфическую рекомбинацию.

Контроль экспрессии РНК или белка, кодированного полинуклеотидом, который составляет инструмент, может включать временную остановку экспрессии полинуклеотидом, кодирующим промотор, уже присутствующим в инструменте с применением сайта распознавания рекомбиназы (RRS).

Например, в случае, где полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1)-стоп-кодон-полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1) (далее, RSR1); или первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1)-стоп-кодон транскрипции-полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1) (далее, RTR1) включен между полинуклеотидом, кодирующим РНК-направляемую эндонуклеазу (102) и промотором (106) для транскрипции и/или трансляции полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазуу, РНК-направляемая эндонуклеаза не может быть экспрессирована, пока полинуклеотид, кодирующий RSR1 и/или RTR1, не будет удален через сайт-специфическую рекомбинацию и, в конечном итоге, не может быть образован комплекс сконструированной нуклеазы.

Более конкретно, в случае, где полинуклеотид, кодирующий RSR1 или RTR1, включен в 21 на ФИГ. 2, РНК-направляемая эндонуклеаза не может быть экспрессирована, пока полинуклеотид, кодирующий RSR1 и/или RTR1, не будет удален через сайт-специфическую рекомбинацию и, в конечном итоге, не может быть образован комплекс сконструированной нуклеазы.

Как описано выше, инструмент может иметь различные конструкции, и действия, которые могут оказываться в клетках или животных, имеющих геном, в который вставлен инструмент, также могут варьироваться в соответствии с конструкцией инструмента.

Далее будут описаны клетки и оплодотворенные яйцеклетки, имеющие геном, в который вставлен инструмент.

2. Клетки и оплодотворенные яйцеклетки, включающие геном, в который вставлен инструмент

2-1. Строение клетки и оплодотворенной яйцеклетки, включающей геном, в который вставлен инструмент

2-1-1. Геном или хромосома, в которую вставлен инструмент

Инструмент, представленные в данном раскрытии, может быть вставлен в геном клетки.

Локация генома, в который может быть вставлен инструмент, может быть произвольной.

Количество инструментов, которые могут быть вставлены в геном, может составлять единицу.

Количество инструментов, которые могут быть вставлены в геном, может составлять два или более.

Тип инструмента, который может быть вставлен в геном, может быть один или более.

Например, первый инструмент и второй инструмент может быть вставлен в геном. В этом случае, последовательность первого инструмента может быть такой же или отличаться от последовательности второго инструмента.

Если клеткой является эукариотическая клетка, инструмент, представленный в данном раскрытии, может быть вставлен в хромосому.

Локация хромосомы, в который может быть вставлен инструмент, может быть произвольной.

Количество инструментов, которые могут быть вставлены в хромосому, может составлять единицу.

Количество инструментов, которые могут быть вставлены в хромосому, может составлять два или более.

Тип инструмента, который может быть вставлен в хромосому, может быть один или более.

Например, первый инструмент и второй инструмент может быть вставлен в хромосому. В этом случае, последовательность первого инструмента может быть такой же или отличаться от последовательности второго инструмента.

Далее, если предположить, что один из типов инструмента вставлен в хромосому, будут подробно описаны местоположения хромосом, в который вставлен инструмент.

Для удобства объяснения в нижеследующем описании предполагается, что существует четыре хромосома, которые образуются из генома, присутствующего в одной клетке. ФИГ. 3 иллюстрирует 4 хромосомы, образованные из генома, присутствующего в одной клетке.

Как показано в ФИГ. 3, первая хромосома (210) и вторая хромосома (220), изображенные на ФИГ. 3, находятся в отношениях гомологичных хромосом, и третья хромосома (230) и четвертая хромосома (240) также находятся в отношениях гомологичных хромосом.

Первая хромосома (210) состоит из первой хроматиды (CT1) и второй хроматиды (CT2), и вторая хромосома (220) состоит из третье хроматиды (CT3) и четвертой хроматиды (CT4). Дополнительно, третья хромосома (230) состоит из пятой хроматиды (CT5) и шестой хроматиды (CT6), и четвертая хромосома (240) состоит из седьмой хроматиды (CT7) и восьмой хроматиды (CT8).

ФИГ. 4 иллюстрирует некоторые варианты осуществления инструмента, в которых инструмент (100) вставлен в одну из первой хроматиды - восьмой хроматиды (CT1-CT8).

Инструмент (100) может быть вставлен в только одну из первой хроматиды - восьмой хроматиды (CT1-CT8).

Инструмент (100) может быть вставлен в две или более из первой хроматиды - восьмой хроматиды (CT1-CT8).

Например, инструмент (100) может быть вставлен только в первую хроматиду (CT1) из хромосом клетки (см. ФИГ. 4(a)).

В другом примере, инструмент (100) может быть вставлен в первую хроматиду (CT1) и вторую хроматиду (CT2) первой хромосомы (210) из хромосом клетки (см. ФИГ. 4(b)).

В еще одном примере, инструмент (100) может быть вставлен в первую хроматиду (CT1) первой хромосомы (210) и в третью хроматиду (CT3) второй хромосомы (220) из хромосом клетки (см. ФИГ. 4(c)). В этом случае, первая хромосома (210) и вторая хромосома (220) могут быть в отношениях гомологичных хромосом.

В еще одном примере, инструмент (100) может быть вставлен в первую хроматиду (CT1) первой хромосомы (210) и в пятую хроматиду (CT5) третьей хромосомы (230) из хромосом клетки (см. ФИГ. 4(d)). В этом случае, первая хромосома (210) и третья хромосома (230) могут быть в отношениях гомологичных хромосом.

2-1-2. Тип клеток, имеющих геном или хромосому, в которую вставлен инструмент

Инструмент может быть вставлен в геном и/или хромосому соматической клетки, гаметы или стволовой клетки.

Для удобства объяснения в нижеследующем описании предполагается, что тип инструмента, вставленного в геном и/или хромосому соматической клетки, гаметы или стволовой клетки, является одним типом, и инструмент является инструментом (100), описанным выше.

ФИГ. 5 иллюстрирует соматические клетки (301) и гамету, которые, соответственно, имеют геном, в который вставлен инструмент (100). Гамета может яйцеклеткой (303) и сперматозоидом (305).

Геном и/или хромосома, в которую вставлен инструмент (100), может быть включен в ядро (302) соматической клетки, ядро (304) яйцеклетки и ядро (306) сперматозоида.

Инструмент (100), который вставлен в геном клетки, может быть транскрибирован и/или транслирован согласно механизму экспрессии каждой клетки. В этом случае, экспрессия эндополинуклеотида, который уже присутствует в геноме клетки, не может быть затронута.

2-1-3. Оплодотворенная яйцеклетка, включающая геном, в который вставлен инструмент

Инструмент может быть вставлен в геном или хромосому оплодотворенной яйцеклетки (оплодотворенного яйца) или эмбриона.

Согласно варианту осуществления настоящего описания, могут быть представлены оплодотворенная яйцеклетка или трансгенный эмбрион, который имеет геном, включающий полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, который включен между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью. Более конкретно, эмбрионом может быть эмбрион парнокопытного животного.

Дополнительно, могут быть представлены трансформированная оплодотворенная яйцеклетка или трансгенный эмбрион, которые дополнительно включают полинуклеотиды, кодирующие направляющую нуклеиновую кислоту, которые способы специфически связываться с целевым сайтом, присутствующем в геноме оплодотворенной яйцеклетки или эмбриона, между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью. В частности, элемент контроля экспрессии может быть включен в, по меньшей мере, один из 5' конца полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и 5' конца полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту.

ФИГ. 6 иллюстрирует оплодотворенную яйцеклетку, которая имеет геном, в который вставлен инструмент (100); и эмбрион на стадии 2 клеток, эмбрион на стадии 4 клеток, эмбрион на стадии 8 клеток и эмбрион на стадии 16 клеток, полученный цитокенезом из оплодотворенной яйцеклетки, в которую вставлен инструмент (100).

В случае, когда стадией, на которой инструмент (100) начинают вставлять в геном оплодотворенной яйцеклетки, является 1-клеточная стадия оплодотворенной яйцеклетки, 1-клеточная стадия оплодотворенной яйцеклетки (401), в которую вставлен инструмент (100), может быть гомологичной (см. ФИГ. 6).

Если 1-клеточная стадия оплодотворенной яйцеклетки (401), имеющей геном, в который вставлен инструмент (100), претерпевает цитокенез, оплодотворенная яйцеклетка (401) может развиться в эмбрион на стадии 2 клеток (403), эмбрион на стадии 4 клеток (405), эмбрион на стадии 8 клеток (407), эмбрион на стадии 16 клеток (409), морулу, бластулу (зародышевый пузырь) или гаструлу, каждая из которых состоит из клеток, имеющих геном, в который вставлен инструмент (100).

Однако количество и локация инструмента (100), который вставлен в геном эмбриона на 2ⁿ стадии, может отличаться от количества и локации инструмента (100), который вставлен в геном эмбриона на стадии 2ⁿ⁺¹ клеток (n является целым числом 0 или более). Дополнительно, локация и количество инструмента (100), который вставлен в геномы 2ⁿ⁺¹клеток, которые составляют эмбрион на стадии 2ⁿ⁺¹ клеток, могут отличаться друг от друга.

Это связано с тем, что, хотя локация и количество инструмента, который вставлен в ядро 1-клеточной стадии оплодотворенной яйцеклетки (401), могут сохраняться в эмбрионе на стадии 2 клеток (403), большее количество инструментов может быть дополнительно вставлено из-за взаимодействия между первым плазмидным вектором, транспосазой и геномами эмбриона на стадии 2 клеток (403), как описано выше, даже в состоянии эмбриона на стадии 2 клеток 403. Кроме того, это происходит потому, что часть инструмента (100), уже вставленного в геном, может быть удалена из-за взаимодействия между геномами эмбриона на стадии 2 клеток (403) и транспосазы.

То есть согласно варианту осуществления, представленному в настоящем описании, может быть представлен трансгенный эмбрион, который включает первую клетку, имеющую геном, который включает первый инструмент, и вторую клетку, имеющую геном, который включает второй инструмент, где в трансгенном эмбрионе, первый инструмент может присутствовать в первом локусе, и второй инструмент может присутствовать во втором локусе, отличающемся от первого локуса. Каждый из первого инструмента и второго инструмента может включать, по меньшей мере, один из полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту, который может специфически связываться с целевым сайтом. Целевым сайтом является эндополинуклеотид эмбриона или экзополинуклеотид, включенный в геном эмбриона, и может быть включен между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью. В частности, последовательность первого инструмента может быть такой же или отличаться от последовательности второго инструмента.

Согласно другому варианту осуществления, представленному в настоящем описании, может быть представлен трансгенный эмбрион, который включает первую клетку, имеющую геном, который включает первый инструмент, и вторую клетку, имеющую геном, который включает второй инструмент, где в трансгенном эмбрионе, первый инструмент может присутствовать в первом локусе, и второй инструмент может присутствовать во втором локусе, где первый локус и второй локус являются одинаковыми. Каждый из первого инструмента и второго инструмента может включать, по меньшей мере, один из полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту, который может специфически связываться с целевым сайтом. Целевым сайтом является эндополинуклеотид эмбриона или экзополинуклеотид, включенный в геном эмбриона, и может быть включен между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью. В частности, последовательность первого инструмента отличается от последовательности второго инструмента.

Например, геном первой клетки может дополнительно включать третий инструмент, где последовательность третьего инструмента является такой же, как для первого инструмента.

В другом примере, геном второй клетки может дополнительно включать четвертый инструмент, где последовательность четвертого инструмента является такой же, как для второго инструмента.

Трансгенный эмбрион может дополнительно включать третью клетку, имеющую геном, который не включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту.

ФИГ. 7 иллюстрирует эмбрион на стадии 2 клеток, эмбрион на стадии 4 клеток, эмбрион на стадии 8 клеток и эмбрион на стадии 16 клеток, в который вставлен инструмент (100) в каждый геном некоторых клеток. На ФИГ. 7, первое ядро (501) представляет ядро, которое имеет геном, в который вставлен инструмент (100), и второе ядро (503) представляет ядро, которое имеет геном, в который инструмент (100) не вставлен.

В случае, когда стадией, на которой инструмент (100) начинают вставлять в геном, является 2^m клеточная стадия эмбриона, инструмент (100) может быть вставлен только в геном некоторых клеток из клеток, которые составляет эмбрионы после стадии 2^mклеток (m является натуральным числом 1 или более). В этом случае также инструмент может быть вставлен в геномы всех клеток, которые составляют эмбрионы. Однако это может объясняться описанным выше, и поэтому представленные здесь объяснения ограничены только теми случаями, где инструмент вставлен в геномы некоторых клеток из клеток, составляющих эмбрионы.

Например, в случае, когда стадией, на которой инструмент (100) начинают вставлять в геном оплодотворенной яйцеклетки, является 2-клетоячная стадия эмбриона, инструмент (100) может быть вставлен только в геном первой клетки, из клеток, которые составляют эмбрион на стадии 2 клеток (411).

Если эмбрион на стадии 2 клеток (411), в котором инструмент (100) вставлен в геном одной клетки, претерпевает цитокенез, эмбрион на стадии 2 клеток (411) может развиться в эмбрион на стадии 4 клеток (413), эмбрион на стадии 8 клеток (415), эмбрион на стадии 16 клеток (417), морулу, бластулу или гаструлу, в которых инструмент вставлен только в геномы некоторых клеток.

То есть, согласно некоторым вариантам осуществления, представленным настоящим описанием, может быть представлен химерный трансгенный эмбрион, где химерный трансгенный эмбрион может быть первой клеткой, имеющей геном, включающий инструмент, и второй клеткой, имеющей геном, не включающий инструмент.

Более конкретно, может быть представлен трансгенный эмбрион, где трансгенный эмбрион включает первую клетку, имеющую геном, который включает первый инструмент и целевой сайт; и вторую клетку, имеющую геном, который включает целевой сайт.

Первый инструмент может включать, по меньшей мере, один из полинуклеотида, кодирующего первую РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотид, кодирующий первую направляющую нуклеиновую кислоту, которая может связываться с целевым сайтом; и генома второй клетки, который может не включать полинуклеотид, кодирующий вторую РНК-направляемую эндонуклеазу и полинуклеотид, кодирующий вторую направляющую нуклеиновую кислоту, которая может специфически связываться с целевым сайтом. Дополнительно, ITR последовательность может быть дополнительно включена на 5’ конце и 3' конце первого инструмента.

В частности, последовательность полинуклеотида, кодирующего первую РНК-направляемую эндонуклеазу, и последовательность полинуклеотида, кодирующего вторую РНК-направляемую эндонуклеазу, могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга; и последовательность полинуклеотида, кодирующего первую направляющую нуклеиновую кислоту, и последовательность полинуклеотида, кодирующего вторую направляющую нуклеиновую кислоту, могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга.

Целевым сайтом может быть эндополинуклеотид.

Более конкретно, целевым сайтом может быть нуклеотидная последовательность от 18 п.о. до 25 п.о., присутствующая в геноме трансгенного эмбриона.

Целевым сайтом может быть экзополинуклеотид.

Например, целевым сайтом может быть последовательность, соседняя к 5’ концу или 3’ концу PAM последовательности; и целевой сайт и PAM последовательность могут быть включены между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью.

Однако, в этом случае, а так же по некоторым причинам, как описано выше, количество и локация инструмента (100), вставленного в геном эмбриона на стадии 2^mклеток, может отличаться от количества и локации инструмента (100), вставленного в геном эмбриона на стадии 2^m+1 клеток. Дополнительно, локация и количество инструмента 100, который вставлен в геномы 2^m+1клеток, которые составляет эмбрион на стадии 2^m+1 клеток, могут отличаться друг от друга.

В случае, когда стадией, на которой инструмент (100) начинают вставлять в геном, является эмбрион на стадии 2^mклеток, инструмент (100) может быть вставлен в разные локусы каждого генома клеток, которые составляют эмбрион после стадии 2^mклеток (m является натуральным числом 1 или более).

2-2. Способ получения клеток и/или оплодотворенных яйцеклеток, включающих геном, в который вставлен инструмент

Далее описаны несколько способов получения клеток, имеющих геном, в который вставлен инструмент (100). Для удобства объяснения предполагается, что существует один тип инструмента, который может быть вставлен в геном.

Один способ получения клетки, в которую вставлен инструмент (100), может включать доставку инструмента (100) в клетку. В частности, инструмент (100) может включать транспозонный ген и полинуклеотид, который кодирует компонент сконструированной нуклеазы.

Может существовать множество способов доставки инструмента (100) в клетку.

Например, инструмент может быть доставлен в клетку введением полинуклеотида, кодирующего инструмент, в клетку. Введение полинуклеотида, кодирующего инструмент, в клетку может включать способ, в котором полинуклеотид, кодирующий инструмент, вводят в плазмидный вектор и затем вводят в клетку. Дополнительно, введение полинуклеотида, кодирующего инструмент, в клетку, может включать способ, в котором полинуклеотид, кодирующий инструмент, вводят в вирусный вектор, затем трансдуцируют в клетку.

Один способ получения клетки, в которую вставлен инструмент (100), может включать доставку транспосазы в клетку.

Может существовать множество способов доставки транспосазы в клетку.

Например, транспосаза может быть доставлена в клетку введением транспосазы в форме белка или полипептида.

В другом примере, транспосаза может быть доставлен в клетку введением полинуклеотида, кодирующего транспосазу, в клетку.

Введение полинуклеотида, кодирующего транспосазу, в клетку может включать введение полинуклеотида, кодирующего транспосазу, в плазмидный вектор с последующим введением результанта в клетку. Дополнительно, введение полинуклеотида, кодирующего транспосазу, в клетку может включать введение полинуклеотида, кодирующего транспосазу, в вирусный вектор, с последующей трансдукцией результанта в клетку.

Полинуклеотид, кодирующий транспосазу, может быть введен вместе в вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий инструмент, и затем доставлен в клетку. Дополнительно, полинуклеотид, кодирующий транспосазу, может быть введен в вектор, который отличается от вектора, в который включен полинуклеотид, кодирующий инструмент, и затем доставлен в клетку. В частности, вектором может быть не вирусный вектор или вирусный вектор.

В случае, когда полинуклеотид, кодирующий транспосаз, вводят в плазмидный вектор и затем вводят в клетку, плазмид может быть транспортирован вовнутрь ядра, и затем кодирующая мРНК транспосаза может быть продуцирована в ядре через транскрипцию. Продуцированная мРНК может быть транспортирована в цитоплазму и взаимодействовать с рибосомой и тРНК в цитоплазме, и транспосаза может быть экспрессирована в цитоплазме через взаимодействие. Транспосаза, экспрессированная вышеуказанным механизмом, может быть введена вовнутрь ядра.

Далее описан механизм, которым инструмент вставляют в геном клетки через инструмент и транспосазу, доставленные в клетку. Инструмент (100) и транспосаза, доставленные в клетку описанным выше способом, могут быть введены в цитоплазму клетки. Инструмент (100) и транспосаза, введенные в цитоплазму, могут быть транспортированы вовнутрь ядра через ядерные поры.

Внутри ядра, транспосаза может взаимодействовать с первой ITR последовательностью (101) и второй ITR последовательностью (107), которые являются компонентами инструмента (100), инструмент (100) может быть вставлен в геном взаимодействием. Составляющие инструмента (100) можно увидеть на ФИГ. 1.

В случае, когда инструмент (100) введен в плазмидный вектор и затем доставлен в клетку, инструмент (100) может быть удален из плазмидного вектора, и удаленный инструмент (100) может быть вставлен в геном клетки.

Клеткой может быть изолированная клетка или не изолированная клетка, включенная в орган или ткань животного.

Один способ получения не изолированной клетки, имеющей геном, в который вставлен инструмент (100), может включать доставку инструмента (100) и транспосазы способом прямой инъекции в ткань или орган индивида.

Даже в этом случае, инструмент (100) может быть вставлен в геном не изолированной клетки методом, аналогичным механизму, которым инструмент (100) вставляется в геном изолированной клетки.

В случае, когда тканью или органом является репродуктивная ткань или репродуктивный орган, преимущество заключается в том, что трансформированные гаметы могут быть получены непрерывно.

Далее описано несколько способов получения оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона, имеющих геном, в который вставлен инструмент (100). Как описано выше, для удобства объяснения, принимается, что один тип инструмента может быть вставлен в геном оплодотворенной яйцеклетки.

Один способ получения оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона, имеющего геном, в который вставлен инструмент (100), может включать микроинъекцию инструмента (100) в оплодотворенную яйцеклетку и/или эмбрион.

Один способ получения оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона, имеющих геном, в который вставлен инструмент (100), может включать микроинъекцию транспосазы в оплодотворенную яйцеклетку и/или эмбрион.

Способ доставки инструмента и транспосазы в клетку описан выше, поэтому конкретные детали здесь опущены.

Один типовой способ получения трансгенного эмбриона, представленный в настоящем описании, может включать микроинъекцию вектора, который включает транспозонный ген и полинуклеотид, кодирующий компонент сконструированной нуклеазы, в оплодотворенную яйцеклетку или эмбрион. Дополнительно, способ может включать микроинъекцию транспосазы, которая может взаимодействовать с транспозонным геном, в оплодотворенную яйцеклетку или эмбрион.

Транспосаза может быть белком, полипептидом или полинуклеотидом, кодирующим транспосазу. Полинуклеотид может быть вставлен в плазмидный вектор или вирусный вектор. Кроме того, полинуклеотид, кодирующий транспосазу, может быть вставлен в один вектор, вместе с полинуклеотидом, кодирующим транспозонный ген и компонент сконструированной нуклеазы, и затем введен микроинъекцией в оплодотворенную яйцеклетку или эмбрион.

В типовом варианте осуществления трансгенного эмбриона, который может быть получен вышеуказанным способом, трансгенный эмбрион может включать первую клетку, в которой полинуклеотид, кодирующий компоненты первой сконструированной нуклеазы, имеет геном, включенный в первый локус, и вторую клетку, в которой полинуклеотид, кодирующий компоненты второй сконструированной нуклеазы, имеет геном, включенный во второй локус, который отличается от первого локуса. В частности, последовательность полинуклеотида, кодирующего компоненты первой сконструированной нуклеазы, и последовательность полинуклеотида, кодирующего компоненты второй сконструированной нуклеазы, могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга.

В другом типовом варианте осуществления трансгенного эмбриона, который может быть получен вышеуказанным способом, трансгенный эмбрион может включать первую клетку, в которой полинуклеотид, кодирующий компоненты первой сконструированной нуклеазы, имеет геном, включенный в первый локус, и вторую клетку, в которой полинуклеотид, кодирующий компоненты второй сконструированной нуклеазы, имеет геном, включенный в первый локус. В частности, последовательность полинуклеотида, кодирующего компоненты первой сконструированной нуклеазы, и последовательность полинуклеотида, кодирующего компоненты второй сконструированной нуклеазы, могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга.

Один способ получения оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона, который имеет геном, в который вставлен инструмент (100), может включать проведение ядерного транспорта соматической клетки (SCNT) с применением генома, в который вставлен инструмент (100).

Типовой способ получения трансгенного эмбриона, представленный в настоящем описании, может включать способ получения трансгенной донорной клетки, в которой экспрессируется компонент сконструированной нуклеазы, и способ трансплантации ядра трансгенной донорной клетки в энуклеированную яйцеклетку.

Получение трансгенной донорной клетки может включать трансформацию клетки вектором, который включает полинуклеотид, кодирующий транспозонный ген и компонент сконструированной нуклеазы. Дополнительно, получение трансгенной донорной клетки может дополнительно включать трансформацию клетки транспосазой, которая может взаимодействовать с транспозонным геном.

Транспосаза может быть белком, полипептидом или полинуклеотидом, кодирующим транспосазу. Полинуклеотид может быть введен в плазмидный вектор или вирусный вектор. Кроме того, полинуклеотид, кодирующий транспосазу, может быть введен в один вектор вместе с полинуклеотидом, кодирующим транспозонный ген и компонент сконструированной нуклеазы, и затем введен микроинъекцией в оплодотворенную яйцеклетку или эмбрион.

Механизм, с помощью которого инструмент (100) вставляют в геном клетки, которая составляет оплодотворенную яйцеклетку, аналогичен механизму, с помощью которого инструмент (100) вставляют в геном изолированной клетки.

3. Трансгенное животное, которое включает геном, в который вставлен инструмент

3-1. Трансгенное животное, которое включает геном, в который вставлен инструмент

Согласно некоторым вариантам осуществления, представленным в настоящем описании, может быть представлено трансгенное животное, включающее геном, в который вставлен инструмент.

Согласно типовому варианту осуществления, представленному в настоящем описании, может быть представлено трансгенное животное, имеющее геном, который включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, который включен между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью. Более конкретно, животным может быть парнокопытное животное.

Дополнительно, может быть представлено трансгенное животное, в котором полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, которая может специфически связываться с целевым сайтом, присутствующим в животном, дополнительно включен между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью. В частности, элемент контроля экспрессии может быть включен в один или более из 5' конца полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и 5' конца полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту.

В настоящем раскрытии, трансгенное животное, имеющее геном, в который вставлен инструмент, относится к животному, имеющему, по меньшей мере, одну клетку, имеющую геном, в который вставлен инструмент. Трансформация может включать и временную трансформацию, и постоянную трансформацию.

Кроме того, далее, из клеток, которые имеет трансгенное животное, клетку, в которую вставлен инструмент, называют “клетка, сконструированная с инструментом”, и клетку, в которую не вставлен инструмент, называют “клетка, сконструированная без инструмента”.

Однако, в настоящем раскрытии, термин “клетка, сконструированная без инструмента” относится только к клетке, которая имеет геном в состоянии, в котором в него не вставлен инструмент, и термин не должен пониматься как термин для клетки, в которой геном генетически сконструирован для других целей. То есть, клетка, которая имеет другой генетически измененный геном, хотя в него не вставлен инструмент, также может быть так называемой “клеткой, сконструированной без инструмента” по настоящему раскрытию.

Трансгенное животное, в которое вставлен инструмент, может быть химерным или гомологичным животным.

Например, химерное животное может относиться к животному, которое имеет “клетку, сконструированную без инструмента” в дополнение к “клетке, сконструированной с инструментом”.

То есть, согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем описании, может быть представлено химерное трансгенное животное, которое включает первую клетку, имеющую геном, который включает инструмент, и вторую клетку, имеющую геном, который не включает инструмент.

Более конкретно, может быть представлено трансгенное животное, которое включает первую клетку, имеющую геном, который включает первый инструмент и целевой сайт; и вторую клетку, имеющую геном, который включает целевой сайт.

Первый инструмент может включать, по меньшей мере, один полинуклеотид между полинуклеотидом, кодирующим первую РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотидом, кодирующим первую направляющую нуклеиновую кислоту, которая может связываться с целевым сайтом; и геном второй клетки может не включать полинуклеотид, кодирующий вторую РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотид, кодирующий вторую направляющую нуклеиновую кислоту, которая может специфически связываться с целевым сайтом. Дополнительно, ITR последовательность может быть дополнительно включена на 5' конце и 3' конце первого инструмента.

В частности, последовательность полинуклеотида, кодирующего первую РНК-направляемую эндонуклеазу, и последовательность полинуклеотида, кодирующего вторую РНК-направляемую эндонуклеазу могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга; и последовательность полинуклеотида, кодирующего первую направляющую нуклеиновую кислоту, и последовательность полинуклеотида, кодирующего вторую направляющую нуклеиновую кислоту, могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга.

Более конкретно, целевым сайтом может быть нуклеотидная последовательность от 18 п.о. до 25 п.о., присутствующая в геноме трансгенного животного.

Например, целевым сайтом может быть последовательность, соседняя к 5’ концу или 3’ концу PAM последовательности, и целевой сайт и PAM последовательность может быть включена между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью.

В другом примере, химерное животное может относиться к животному, которое имеет только “клетку, сконструированная с инструментом”, но в котором локус, в котором инструмент вставлен в геном каждой “клетки, сконструированной с инструментом”, которая составляет животное, отличается.

То есть, согласно типовому варианту осуществления, представленному в настоящем описании, может быть представлено трансгенное животное, которое включает первую клетку, которая имеет геном, включающий первый инструмент, и вторую клетку, которая имеет геном, включающий второй инструмент, где первый инструмент присутствует на первом локусе, второй инструмент присутствует на втором локусе и первый локус и второй локус являются разными. Первый инструмент и второй инструмент может включать, по меньшей мере, один из полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту, которая может специфически связываться с целевым сайтом. Целевым сайтом может быть эндополинуклеотид или экзополинуклеотид животного, который расположен между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью, включенными в геном животного. В частности, последовательность первого инструмента и последовательность второго инструмента могут быть одинаковыми или разными.

Согласно другому типовому варианту осуществления, представленному в настоящем описании, может быть представлено трансгенное животное, которое включает первую клетку, которая имеет геном, включающий первый инструмент, и вторую клетку, которая имеет геном, включающий второй инструмент, где первый инструмент присутствует на первом локусе, второй инструмент присутствует на втором локусе и первый локус и второй локус являются одинаковыми. Первый инструмент и второй инструмент может включать, по меньшей мере, один из полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту, которая может специфически связываться с целевым сайтом. Целевым сайтом может быть эндополинуклеотид или экзополинуклеотид животного, который расположен между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью, включенными в геном животного. В частности, последовательность первого инструмента и последовательность второго инструмента являются разными.

Например, геном первой клетки может дополнительно включать третий инструмент, последовательность которого такая же, как для первого инструмента.

В другом примере, геном второй клетки может дополнительно включать четвертый инструмент, последовательность которого такая же, как для второго инструмента.

Трансгенное животное может дополнительно включать третью клетку, которая имеет геном, который не включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту.

Гомологичное животное может относиться к животным, в которых локус, в котором инструмент вставлен в геном каждой “клетки, сконструированной с инструментом”, которая составляет животное, является одинаковым.

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем описании, гамета или оплодотворенная яйцеклетка (и/или эмбрион), которая имеет геном, в который вставлен инструмент, может быть получена из животного, включающего клетку, которая имеет геном, в который вставлен инструмент, и гаметой может быть сперматозоид или яйцеклетка.

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем описании, потомство, включающее клетку, имеющую геном, в который вставлен инструмент, может быть получено от животного, включающего клетку, которая имеет геном, в который вставлен инструмент.

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем описании, дополнительное редактирование генома может происходить в геноме животного, включающего клетку, которая имеет геном, в который вставлен инструмент.

3-2. Способ получения трансгенного животного, включающего геном, в который вставлен инструмент

Один способ получения животного, включающего “клетку, сконструированную с инструментом”, некоторыми типовыми вариантами осуществления, представленными в настоящем раскрытии, может включать трансплантацию оплодотворенной яйцеклетки или эмбриона, который имеет геном, в который вставлен инструмент, в матку суррогатной матери. После трансплантации оплодотворенной яйцеклетки или эмбриона в матку суррогатной матери и последующего периода беременности может быть получено животное, имеющее геном, в который вставлен инструмент.

Один способ получения оплодотворенной яйцеклетки или эмбриона, имеющего геном, в который вставлен инструмент, может включать микроинъекцию (MI) инструмента и/или транспосазы.

Оплодотворенная яйцеклетка и/или эмбрион, полученный микроинъекцией (MI), может быть химерным или гомологичным. Дополнительно, животное, полученное трансплантацией оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона в матку суррогатной матери, может быть химерным или гомологичным.

После способа получения оплодотворенной яйцеклетки или эмбриона, имеющего геном, в который вставлен инструмент, может быть проведен ядерный транспорт соматической клетки (SCNT).

Ядерный транспорт соматической клетки может включать трансплантацию ядра соматической клетки (301), имеющей геном, в который вставлен инструмент (100) на ФИГ. 5, в энуклеированный ооцит. Животное, включающее “клетку, сконструированную с инструментом” может быть получено трансплантацией оплодотворенной яйцеклетки или эмбриона, полученного ядерным транспортом соматической клетки (SCNT), в матку суррогатной матери.

Оплодотворенная яйцеклетка и/или эмбрион, полученный ядерным транспортом соматической клетки (SCNT), может быть гомологичным. Дополнительно, животное, полученное с применением оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона, также может быть гомологичным. В этом случае, геном оплодотворенной яйцеклетки, эмбриона, и/или животного, полученного ядерным транспортом соматической клетки (SCNT), которое является гомологичным, может иметь последовательность, такую же как геном соматической клетки (301).

Другой способ получения оплодотворенной яйцеклетки или эмбриона, имеющего геном, в которое вставлен инструмент, может включать способ in vitro оплодотворения яйцеклетки (303) сперматозоидом (305), имеющим геном, в который вставлен инструмент (100); или способ in vitro оплодотворения яйцеклетки (303) сперматозоидом (305) и диким типом (WT) сперматозоида или яйцеклетки.

Оплодотворенная яйцеклетка и/или эмбрион, полученный in vitro оплодотворением, может быть химерным или гомологичным. Дополнительно, животное, полученное имплантацией оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона в матку суррогатной матери, может быть химерным или гомологичным.

Еще более конкретно, один типовой способ получения трансгенного животного, представленный в настоящем описании, может включать получение трансгенного эмбриона, в котором экспрессируются компоненты сконструированной нуклеазы, и трансплантацию трансгенного эмбриона в матку суррогатной матери.

Один типовой способ получения трансгенного эмбриона может включать микроинъекцию вектора, который включает транспозонный ген и полинуклеотид, кодирующий компоненты сконструированной нуклеазы, в оплодотворенную яйцеклетку или эмбрион. Дополнительно, получение трансгенного эмбриона может дополнительно включать микроинъекцию транспосазы, которая может взаимодействовать с транспозонным геном, в оплодотворенную яйцеклетку или эмбрион.

Другой типовой способ получения трансгенного эмбриона может включать получение трансгенной донорной клетки, в которой экспрессируются компоненты сконструированной нуклеазы, и трансплантацию ядра трансгенной донорной клетки в энуклеированную яйцеклетку животного.

Получение трансгенной донорной клетки может включать трансформацию клетки вектором, который включает транспозонный ген и полинуклеотид, кодирующий компоненты сконструированной нуклеазы. Дополнительно, получение трансгенной донорной клетки может дополнительно включать трансформацию клетки транспосазой, которая может взаимодействовать с транспозонным геном.

Транспосаза может быть белком, полипептидом или полинуклеотидом, кодирующим транспосазу. Полинуклеотид может быть включен в плазмидный вектор или вирусный вектор. Кроме того, полинуклеотид, кодирующий транспосазу, может быть в форме, где полинуклеотид включен в вектор вместе с транспозонным геном и полинуклеотидом, кодирующим компоненты сконструированной нуклеазы.

Один способ получения животного, включающего “клетку, сконструированную с инструментом”, некоторыми типовыми вариантами осуществления, представленными в настоящем раскрытии, может включать инъекцию инструмента и транспосазы в ткань животного. В этом случае, только часть инъецированной ткани может стать “клеткой, сконструированной с инструментом”. Животное, полученное вышеуказанным способом инъекции в ткань, может быть химерным животным.

Один способ получения животного, включающего “клетку, сконструированную с инструментом”, некоторыми типовыми вариантами осуществления, представленными в настоящем раскрытии, может включать естественное скрещивание с самцом, который имеет яички, включающие “клетку, сконструированную с инструментом” или самкой, которая имеет яичники, включающие “клетку, сконструированную с инструментом”.

Например, способ может включать естественное скрещивание между самцом, который имеет яички, включающие “клетку, сконструированную с инструментом” и самкой, которая имеет яичники, включающие “клетку, сконструированную с инструментом”.

В другом примере, способ может включать естественное скрещивание между самцом, который имеет яички, включающие “клетку, сконструированную с инструментом” и самкой дикого типа (WT); или естественное скрещивание между самкой, которая имеет яичники, включающие “клетку, сконструированную с инструментом”, и самцом дикого типа (WT).

Животное, полученное естественным скрещиванием, описанным выше, может быть химерным или гомологичным животным.

[Второе редактирование генома с применением инструмента]

В настоящем раскрытии, если инструмент вставлен в геном и трансформирован, как описано выше, это называют первое редактирование генома.

Дополнительное второе редактирование генома может происходить с применением инструмента, который вставлен в геном посредством первого редактирования генома. Дополнительно, (n+1) редактирование генома может происходить с применением генома, в котором произошло n-ное редактирование генома (n является натуральным числом 2 или выше). n-ное редактирование генома и (n+1) редактирование генома может происходить в геноме одной клетки или в геноме другой клетки.

“n-ное редактирование генома” может быть редактированием генома с применением сайта распознавания рекомбиназы (RRS), который включен в качестве компонента инструмента.

Дополнительно, “n-ное редактирование генома” может быть редактированием генома с применением компонентов сконструированной нуклеазы, экспрессированной из инструмента.

Кроме того, “n-ное редактирование генома” может быть редактированием генома с применением полинуклеотида, который имеет PAM последовательность, включенную в качестве компонента инструмента.

Для удобства объяснения, далее описано второе редактирование генома с применением сайта распознавания рекомбиназы (RRS), который включен в качестве компонента инструмента, и/или полинуклеотида, который кодирует компоненты сконструированной нуклеазы.

1. Второе редактирование генома с применением сайта распознавания рекомбиназы (RRS), который включен в инструмент

Далее описано второе редактирование генома с применением сайта распознавания рекомбиназы (RRS), присутствующего в инструменте.

Второе редактирование генома с применением сайта распознавания рекомбиназы (RRS) может происходить в инструменте.

1-1. Вторичное редактирование обменом генами с применением сайта распознавания рекомбиназы (RRS)

1-1-1. Инструмент для вторичного редактирования обменом генами с применением сайта распознавания рекомбиназы (RRS)

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления по настоящему раскрытию, может быть представлен инструмент для редактирования обменом.

Инструмент для редактирования обменом может включать первую ITR последовательность, полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), полинуклеотид, кодирующий второй сайт распознавания рекомбиназы (RRS2) и вторую ITR последовательность.

Первый полинуклеотид может быть включен между полинуклеотидом, кодирующим первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), и полинуклеотидом, кодирующим второй сайт распознавания рекомбиназы (RRS2). Первым полинуклеотидом может быть один или более, выбранных из полинуклеотида, кодирующего белок или РНК, нетранскрибируемого полинуклеотида, полинуклеотида, кодирующего нетранслированную РНК и не функционального полинуклеотида, но не ограничен ими.

Далее описаны некоторые типовые варианты осуществления инструмента для редактирования обменом.

Например, инструментом для редактирования обменом может быть инструмент, который включает первую ITR последовательность, полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), полинуклеотид, кодирующий первую РНК-направляемую эндонуклеазу, полинуклеотид, кодирующий второй сайт распознавания рекомбиназы (RRS2) и вторую ITR последовательность.

В другом примере, инструментом для редактирования обменом может быть инструмент, который включает первую ITR последовательность, полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), полинуклеотид, кодирующий первую направляющую нуклеиновую кислоту, полинуклеотид, кодирующий второй сайт распознавания рекомбиназы (RRS2) и вторую ITR последовательность.

В еще одном примере, инструментом для редактирования обменом может быть инструмент, который включает первую ITR последовательность, полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), ген флуоресцентного белка, полинуклеотид, кодирующий второй сайт распознавания рекомбиназы (RRS2) и вторую ITR последовательность.

В еще одном примере, инструментом для редактирования обменом может быть инструмент, который включает первую ITR последовательность, полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), полинуклеотид, кодирующий первый целевой белок, полинуклеотид, кодирующий второй сайт распознавания рекомбиназы (RRS2) и вторую ITR последовательность.

Далее будет описан способ вторичного редактирования обменом генами с применением инструмента для редактирования обменом, описанного выше. То есть, будет описан способ обмена конкретным полинуклеотидом.

1-1-2. Способ вторичного редактирования обменом генами с применением сайта распознавания рекомбиназы (RRS)

В геноме, в который вставлен инструмент для редактирования обменом, первый полинуклеотид, который присутствует между полинуклеотидом, кодирующим первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), и полинуклеотидом, кодирующим второй сайт распознавания рекомбиназы (RRS2), может быть заменен на второй полинуклеотид.

Один способ обмены первого полинуклеотида на второй полинуклеотид может включать доставку второго полинуклеотида в клетку, в которую вставлен инструмент для редактирования обменом.

Могут существовать разные способы доставки второго полинуклеотида в клетку.

Например, второй полинуклеотид может быть доставлен в клетку введением второго полинуклеотида в клетку. Введение полинуклеотида, кодирующего второй полинуклеотид, в клетку может включать способ введения второго полинуклеотида в плазмидный вектор с последующим введением результанта в клетку. Дополнительно, введение второго полинуклеотид в клетку может включать введение второго полинуклеотида в вирусный вектор с последующей трансдукцией результанта в клетку.

Второй полинуклеотид расположен между полинуклеотидом, кодирующим третий сайт распознавания рекомбиназы (RRS3), и полинуклеотидом, кодирующим четвертый сайт распознавания рекомбиназы (RRS4). В этом случае, трети сайтом распознавания рекомбиназы (RRS3) может быть такой, который образует пару с первым сайтом распознавания рекомбиназы (RRS1); и четвертым сайтом распознавания рекомбиназы (RRS4) может быть такой, который образует пару со вторым сайтом распознавания рекомбиназы (RRS2).

Дополнительно, один способ обмена первого полинуклеотида на второй полинуклеотид может включать доставку первой рекомбиназы и второй рекомбиназы в клетку.

В этом случае, первая рекомбиназа может взаимодействовать с первым сайтом распознавания рекомбиназы (RRS1) и/или третьим сайтом распознавания рекомбиназы (RRS3); и вторая рекомбиназа может взаимодействовать со вторым сайтом распознавания рекомбиназы (RRS2) и/или четвертым сайтом распознавания рекомбиназы (RRS4).

Существует множество способов доставки рекомбиназы в клетку.

Например, рекомбиназа может быть доставлена в клетку введением рекомбиназы в виде белка в клетку.

В другом примере, рекомбиназа может быть доставлена в клетку введением полинуклеотида, кодирующего рекомбиназу, в клетку. Введение полинуклеотида, кодирующего рекомбиназу, в клетку может включать способ вставки полинуклеотида, кодирующего рекомбиназу, в плазмидный вектор с последующим введением результанта в клетку. Дополнительно, введение полинуклеотида, кодирующего рекомбиназу, в клетку может включать вставку полинуклеотида, кодирующего рекомбиназу, в вирусный вектор с последующей трансдукцией результанта в клетку.

Первая рекомбиназа, доставленная в клетку вышеописанным способом, может взаимодействовать с полинуклеотидом, кодирующим первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), и полинуклеотидом, кодирующим третий сайт распознавания рекомбиназы (RRS3).

Дополнительно, вторая рекомбиназа, доставленная в клетку, может взаимодействовать с полинуклеотидом, кодирующим второй сайт распознавания рекомбиназы (RRS2), и полинуклеотидом, кодирующий четвертый сайт распознавания рекомбиназы (RRS4).

Путем взаимодействия, первый полинуклеотид может быть удален из инструмента и второй полинуклеотид может быть вставлен в инструмент.

Далее описаны разные типовые варианты осуществления для редактирования обменом с применением вышеуказанного способа, и эффект редактирования обменом. Они могут варьироваться в зависимости от типов первого полинуклеотида и/или второго полинуклеотида.

Полинуклеотид, кодирующий первую РНК-направляемую эндонуклеазу, которая включена в инструменты для редактирования обменом, согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, может претерпевать редактирование обменом на полинуклеотид, кодирующий вторую РНК-направляемую эндонуклеазу и вторую направляющую нуклеиновую кислоту.

В этом случае, даже без добавления дополнительной обработки клетки, имеющей геном, в который вставлен отредактированный обменом инструмент, экспрессируется вторая РНК-направляемая эндонуклеаза и вторая направляющая нуклеиновая кислота, следовательно, может быть образован комплекс сконструированной нуклеазы, и а геноме может происходить третье редактирование генома.

Полинуклеотид, кодирующий первую направляющую нуклеиновую кислоту, который включен в инструменты для редактирования обменом согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, может претерпевать редактирование обменом на полинуклеотид, кодирующий вторую направляющую нуклеиновую кислоту. Последовательность первой направляющей нуклеиновой кислоты и последовательность второй направляющей нуклеиновой кислоты могут отличаться друг от друга.

В этом случае, целевой сайт редактирования генома с применением сконструированной нуклеазы может быть изменен путем редактирования обменом.

Ген флуоресцентного белка, который включен в инструменты для редактирования обменом согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, может претерпевать редактирование обменом на ген, кодирующий целевой белок (ген целевого белка).

В этом случае, флуоресцентный белок не экспрессируется в клетке, отредактированной обменом. С применением такой характеристики, возможно выбирать, вставлен ли ген целевого белка в геном клетки.

Первый ген целевого белка, который включен в инструменты для редактирования обменом согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, может претерпевать редактирование обменом на второй ген целевого белка.

Благодаря такому второму редактированию генома, целевой белок может быть экспрессирован в клетке в желаемое время.

Первый ген целевого белка, который включен в инструменты для редактирования обменом согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, может претерпевать редактирование обменом на полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту.

Благодаря такому второму редактированию генома, РНК-направляемая эндонуклеаза и направляющая нуклеиновая кислота могут экспрессироваться в клетке. РНК-направляемая эндонуклеаза и направляющая нуклеиновая кислота могут образовывать комплекс сконструированной нуклеазы, и дополнительное третье редактирование генома может происходить в геноме клетки сформированным комплексом сконструированной нуклеазы.

1-2. Вторичное редактирование вставкой гена с применением сайта распознавания рекомбиназы (RRS)

1-2-1. Инструмент для редактирования вставкой с применением сайта распознавания рекомбиназы (RRS)

Инструмент для редактирования вставкой может быть представлен согласно некоторым типовым вариантам осуществления по настоящему раскрытию.

Инструмент для редактирования вставкой может включать первую ITR последовательность, полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1) и вторую ITR последовательность.

Далее описаны некоторые типовые варианты осуществления инструмента для редактирования вставкой.

Например, инструментом для редактирования вставкой может быть инструмент, который включает первую ITR последовательность, полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), полинуклеотид, кодирующий первую РНК-направляемую эндонуклеазу и вторую ITR последовательность.

В другом примере, инструментом для редактирования вставкой может быть инструмент, который включает первую ITR последовательность, полинуклеотид, кодирующий первую РНК-направляемую эндонуклеазу, полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), полинуклеотид, кодирующий первую направляющую нуклеиновую кислоту и вторую ITR последовательность.

В еще одном примере, инструментом для редактирования вставкой может быть инструмент, который включает первую ITR последовательность, полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), полинуклеотид, кодирующий первую РНК-направляемую эндонуклеазу, полинуклеотид, кодирующий первую направляющую нуклеиновую кислоту и вторую ITR последовательность.

В еще одном примере, инструментом для редактирования вставкой может быть инструмент, который включает первую ITR последовательность, полинуклеотид, кодирующий первую РНК-направляемую эндонуклеазу, полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1) и вторую ITR последовательность.

В еще одном примере, инструментом для редактирования вставкой может быть инструмент, который включает первую ITR последовательность, полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), полинуклеотид, кодирующий первую направляющую нуклеиновую кислоту и вторую ITR последовательность.

Далее описан способ вторичного редактирования вставкой гена с применением инструмента для редактирования вставкой, описанного выше. То есть, описан способ вставки конкретного полинуклеотида.

1-2-2. Способ вторичного редактирования вставкой гена с применением сайта распознавания рекомбиназы (RRS)

В геноме, в который вставлен инструмент для редактирования вставкой, первый полинуклеотид может быть вставлен в место, где расположен полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1).

Один способ вставки первого полинуклеотида может включать доставку первого полинуклеотида в клетку, в которую вставлен инструмент для редактирования вставкой.

Существует множество способов доставки первого полинуклеотида в клетку.

Например, первый полинуклеотид может быть доставлен в клетку введением первого полинуклеотида в клетку. Введение полинуклеотида, кодирующего первый полинуклеотид, в клетку, может включать способ введения первого полинуклеотида в плазмидный вектор с последующим введением результанта в клетку. Дополнительно, введение первого полинуклеотида в клетку может включать введение первого полинуклеотида в вирусный вектор с последующей трансдукцией результанта в клетку.

Полинуклеотид, кодирующий второй сайт распознавания рекомбиназы (RRS2) дополнительно включен в вектор, который включает первый полинуклеотид. В этом случае, второй сайт распознавания рекомбиназы (RRS2) может образовывать пару с первым сайтом распознавания рекомбиназы (RRS1).

Дополнительно, один способ вставки первого полинуклеотида может включать доставку первой рекомбиназы в клетку.

В этом случае, первая рекомбиназа может взаимодействовать с первым сайтом распознавания рекомбиназы (RRS1) и/или вторым сайтом распознавания рекомбиназы (RRS2).

Способ доставки рекомбиназы в клетку описан выше, и поэтому подробное описание здесь опущено.

Рекомбиназа, которая доставлена в клетку способом, описанным выше, может взаимодействовать с полинуклеотидом, кодирующим первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), и полинуклеотидом, кодирующим второй сайт распознавания рекомбиназы (RRS2).

Путем взаимодействия, первый полинуклеотид может быть вставлен в инструмент.

Далее описаны разные типовые варианты осуществления для редактирования вставкой вышеуказанным способом и эффект редактирования вставкой. Они могут варьироваться в зависимости от типов инструмента для редактирования вставкой и/или первого полинуклеотида.

В случае, где полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), и полинуклеотид, кодирующий первую РНК-направляемую эндонуклеазу, включены в инструмент для редактирования вставкой, согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, может быть вставлен в инструмент.

В этом случае, комплекс сконструированной нуклеазы может сформироваться в клетке транскрипцией и/или трансляцией полинуклеотида, кодирующего первую РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотид, кодирующего вставленную направляющую нуклеиновую кислоту. Дополнительное третье редактирование генома может происходить после второго редактирования генома (редактирования вставкой), даже без дополнительной обработки, через комплекс сконструированной нуклеазы, образовавшийся в клетке.

В случае, где полинуклеотид, кодирующий первую РНК-направляемую эндонуклеазу, полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1) и полинуклеотид, кодирующий первую направляющую нуклеиновую кислоту включены в инструменты для редактирования вставкой, согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, полинуклеотид, кодирующий промотор для транскрипции полинуклеотида, кодирующего первую направляющую нуклеиновую кислоту, может быть вставлен в инструмент.

В этом случае, первая направляющая нуклеиновая кислота может быть экспрессирована в то же время, когда вставлен полинуклеотид, кодирующий промотор, и через экспрессию, комплекс сконструированной нуклеазы может образоваться в клетке. То есть, первая направляющая нуклеиновая кислота может быть экспрессирована в желаемый момент времени через контроль момента вставки полинуклеотида, кодирующего промотор. Иногда, момент для третьего редактирования генома может контролироваться через второе редактирование генома (редактирование вставкой).

В случае, где полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), полинуклеотид, кодирующий первую РНК-направляемую эндонуклеазу и полинуклеотид, кодирующий первую направляющую нуклеиновую кислоту включены в инструменты для редактирования вставкой, согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, полинуклеотид, кодирующий промотор для транскрипции и/или трансляции полинуклеотида, кодирующего первую РНК-направляемую эндонуклеазу, может быть вставлен в инструмент.

В этом случае РНК-направляемая эндонуклеаза может быть экспрессирована в момент времени, когда вставлен полинуклеотид, кодирующий промотор, и благодаря экспрессии внутри клетки может образоваться комплекс сконструированной нуклеазы. То есть, первая РНК-направляемая эндонуклеаза может быть экспрессирована в желаемый момент времени, через контроль момента времени вставки полинуклеотида, кодирующего промотор. Иногда момент для третьего редактирования генома можно контролировать через второе редактирование генома (редактирование вставкой).

В случае, где полинуклеотид, кодирующий первую РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1) включены в инструменты для редактирования вставкой, согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, ген флуоресцентного белка может быть вставлен в инструмент.

В этом случае, возможно выбирать, вставлен ли полинуклеотид, кодирующий первую РНК-направляемую эндонуклеазу, который является компонентом инструмента, в геном посредством вставки гена флуоресцентного белка.

В случае, где полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), и полинуклеотид, кодирующий первую направляющую нуклеиновую кислоту включены в инструменты для редактирования вставкой, согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, полинуклеотид, кодирующий вторую направляющую нуклеиновую кислоту может быть вставлен в инструмент. В частности, последовательность второй направляющей нуклеиновой кислоты может быть одинаковой или отличаться от последовательности первой направляющей нуклеиновой кислоты.

Если последовательность второй направляющей нуклеиновой кислоты является такой же, как для первой направляющей нуклеиновой кислоты, большее количество направляющих нуклеиновых кислот может быть экспрессировано в клетке, и эффективность редактирования генома с применением инструмента может быть повышена.

Если последовательность второй направляющей нуклеиновой кислоты отличается от первой направляющей нуклеиновой кислоты, целевые сайты для редактирования генома с применением инструмента могут быть изменчивыми.

1-3. Вторичное редактирование делецией гена с применением сайта распознавания рекомбиназы (RRS)

1-3-1. Инструмент для редактирования делецией с применением сайта распознавания рекомбиназы (RRS)

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления по настоящему раскрытию, может быть представлен инструмент для редактирования делецией.

Инструмент для редактирования делецией может включать первую ITR последовательность, полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), первый полинуклеотид, полинуклеотид, кодирующий второй сайт распознавания рекомбиназы (RRS2) и вторую ITR последовательность.

Первый полинуклеотид может включать один или более, выбранных из полинуклеотида, кодирующего белок или РНК, нетранскрибируемого полинуклеотида, полинуклеотида, кодирующего нетранслированную РНК и не функционального полинуклеотида, но не ограничен ими.

Первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1) и второй сайт распознавания рекомбиназы (RRS2) могут образовывать пару. Для удобства объяснения, далее принято, что последовательность первого сайта распознавания рекомбиназы (RRS1) является такой же, как для второго сайта распознавания рекомбиназы (RRS2).

Далее описаны некоторые типовые варианты осуществления инструмента для редактирования делецией.

Например, инструментом для редактирования делецией может быть инструмент, который включает первую ITR последовательность, полинуклеотид, кодирующий конститутивный промотор, полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), стоп-кодон, полинуклеотид, кодирующий второй сайт распознавания рекомбиназы (RRS2), полинуклеотид, кодирующий первую РНК-направляемую эндонуклеазу и вторую ITR последовательность.

В другом примере, инструментом для редактирования делецией может быть инструмент, который включает первую ITR последовательность, полинуклеотид, кодирующий конститутивный промотор, полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), стоп-кодон транскрипции, полинуклеотид, кодирующий второй сайт распознавания рекомбиназы (RRS2), полинуклеотид, кодирующий первую направляющую нуклеиновую кислоту и вторую ITR последовательность.

Далее описан способ вторичного редактирования делецией гена с применением инструмента для редактирования делецией, описанного выше. То есть описан способ делеции конкретного полинуклеотида.

1-3-2. Способ вторичного редактирования делецией гена с применением сайта распознавания рекомбиназы (RRS)

В геноме, в который вставлен инструмент для редактирования делецией, первый полинуклеотид, присутствующий между полинуклеотидом, кодирующим первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), и полинуклеотидом, кодирующим второй сайт распознавания рекомбиназы (RRS2), может быть удален.

Один способ делеции первого полинуклеотида может включать доставку первой рекомбиназы в клетку, в которую вставлен инструмент для редактирования делецией.

Первая рекомбиназа может взаимодействовать с первым сайтом распознавания рекомбиназы (RRS1) и вторым сайтом распознавания рекомбиназы (RRS2).

Способ доставки рекомбиназы в клетку описан выше, и поэтому подробности способа здесь опущены.

Первая рекомбиназа, которая доставлена в клетку способом, описанным выше, может взаимодействовать с полинуклеотидом, кодирующим первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), и полинуклеотидом, кодирующим второй сайт распознавания рекомбиназы (RRS2).

Первый полинуклеотид может быть удален из инструмента взаимодействием.

Далее описаны различные типовые варианты осуществления редактирования вышеупомянутым методом и эффект редактирования делецией. Они могут различаться в зависимости от типа первого полинуклеотида и/или инструмента для редактирования делецией.

В случае, где полинуклеотид, кодирующий конститутивный промотор, полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), стоп-кодон, полинуклеотид, кодирующий второй сайт распознавания рекомбиназы (RRS2) и полинуклеотид, кодирующий первую РНК-направляемую эндонуклеазу включены в инструменты для редактирования делецией согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, возможно удалять стоп-кодон из инструментов.

В этом случае, первая РНК-направляемая эндонуклеаза может быть экспрессирована делецией стоп-кодона. То есть, момент транскрипции и/или трансляции конкретного полинуклеотида, включенного в инструмент, можно контролировать с помощью делеции частичного компонента инструмента.

В случае, где полинуклеотид, кодирующий конститутивный промотор, полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), стоп-кодон транскрипции (poly T), полинуклеотид, кодирующий второй сайт распознавания рекомбиназы (RRS2) и полинуклеотид, кодирующий первую направляющую нуклеиновую кислоту включены в инструменты для редактирования делецией согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, возможно удалить стоп-кодон транскрипции (poly T) из инструментов.

В этом случае, первая направляющая нуклеиновая кислота может быть экспрессирована делецией стоп-кодона транскрипции (poly T). То есть момент времени транскрипции и/или трансляции конкретного полинуклеотида, включенного в инструмент, можно контролировать делецией частичного компонента инструмента.

2. Второе редактирование генома с применением компонента сконструированной нуклеазы, которая экспрессируется из инструмента

Далее описано второе редактирование генома с применением компонентов сконструированной нуклеазы, которые экспрессируется из полинуклеотида, который включен в инструмент, вставленный в геном.

Второе редактирование генома с применением компонентов сконструированной нуклеазы может происходить вне инструмента или внутри инструмента.

2-1. Второе редактирование генома с применением компонентов сконструированной нуклеазы, которая экспрессируется из инструмента, который не включает элемент контроля экспрессии

2-1-1. Инструмент, который не включает элемент контроля экспрессии

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления по настоящему раскрытию, может быть представлен инструмент, который не включает элемент контроля экспрессии.

Инструмент, который не включает элемент контроля экспрессии, может включать первую ITR последовательность, полинуклеотид, кодирующий компоненты сконструированной нуклеазы и вторую ITR последовательность.

Далее описаны некоторые типовые варианты осуществления инструмента, который не включает элемент контроля экспрессии.

Например, инструментом может быть инструмент, который включает один полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу.

В другом примере, инструментом может быть инструмент, который включает два или более полинуклеотидов, кодирующих РНК-направляемую эндонуклеазу. В этом случае, последовательности из двух или более полинуклеотидов, кодирующих РНК-направляемую эндонуклеазу, могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга.

Если последовательности из двух или более полинуклеотидов, кодирующих РНК-направляемую эндонуклеазу, включенную в инструмент, являются одинаковыми, уровень экспрессии одинаковых РНК-направляемых эндонуклеаз повышается в клетке и, следовательно, может быть повышена эффективность второго редактирования генома.

В еще одном примере, инструментом может быть инструмент, который включает один полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту.

В еще одном примере, инструментом может быть инструмент, который включает два или более полинуклеотидов, кодирующих направляющую нуклеиновую кислоту. В этом случае, последовательности из двух или более полинуклеотидов, кодирующих направляющую нуклеиновую кислоту, могут быть одинаковыми или разными.

Если, по меньшей мере, одна последовательность из двух или более полинуклеотидов, кодирующих направляющую нуклеиновую кислоту, включенную инструмент, является такой же, уровень экспрессии направляющей нуклеиновой кислоты, которая имеет такую же последовательность, может быть повышена в клетке, тем самым может быть повышена эффективность второго редактирования генома.

Если, по меньшей мере, одна последовательность из двух или более полинуклеотидов, кодирующих направляющую нуклеиновую кислоту, включенную инструмент, отличается, разные типы направляющей нуклеиновой кислоты могут быть экспрессированы в клетке. В этом случае, второе редактирование генома может происходить при большем количестве целевых сайтов.

В еще одном примере, инструментом может быть инструмент, который включает один или более типов полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и один или более типов полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту.

В этом случае, второе редактирование генома может происходить в целевом сайте, присутствующем в геноме клетки после вставки инструмента в геном клетки, без дополнительной обработки, через первое редактирование генома. Одна или более направляющих нуклеиновых кислот, экспрессированных из инструмента, может быть комплементарно связана с целевым сайтом.

То есть, если инструмент, который включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, без включения элемента контроля экспрессии, вставлен в геном, n-ное (n является натуральным числом 2 или более) редактирование генома может происходить в геноме без дополнительной обработки.

Вышеописанный инструмент, который не включает элемент контроля экспрессии, может быть вставлен в геном и/или хромосому клетки.

Каждый инструмент, имеющий разные составляющие, описанные выше, может быть вставлен в геном и/или хромосому клетки через разные комбинации.

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, первый инструмент и второй инструмент может быть вставлен в геном одной клетки.

Например, первый инструмент может включать первую ITR последовательность, один или более типов полинуклеотидов, кодирующих РНК-направляемую эндонуклеазу, и вторую ITR последовательность. Второй инструмент может включать третью ITR последовательность, один или более типов полинуклеотидов, кодирующих направляющую нуклеиновую кислоту, и четвертую ITR последовательность.

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, каждый первый инструмент и второй инструмент могут быть независимо вставлены в геном (и/или хромосому) разных клеток.

Например, первый инструмент может быть вставлен в геном первой клетки, присутствующей в одном субъекте, и второй инструмент может быть вставлен в геном второй клетки, присутствующей в субъекте. Первый инструмент может включать один или более типов полинуклеотидов, кодирующих РНК-направляемую эндонуклеазу. Второй инструмент может включать один или более типов полинуклеотидов, кодирующих направляющую нуклеиновую кислоту.

Каждая другая клетка может быть не изолированной клеткой, которая включена в одного субъекта.

Каждая другая клетка может быть не изолированной клеткой, которая включена в оплодотворенную яйцеклетку и/или эмбрион.

Далее описан способ второго редактирования генома с применением вышеописанного инструмента, кодирующего компоненты сконструированной нуклеазы без включения элемента контроля экспрессии.

2-1-2. Способ второго редактирования генома

В настоящем раскрытии представлен способ второго редактирования генома в клетке, в который вставлен инструмент, который включает полинуклеотид, кодирующий компоненты сконструированной нуклеазы, без включения элемента контроля экспрессии. Согласно конструкции инструмента, вставленного в геном клетки, представлены разные способы второго редактирования генома.

Например, один способ второго редактирования генома в клетке, имеющей геном, в который вставлен полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, может включать доставку направляющей нуклеиновой кислоты в клетку.

Дополнительно, один способ второго редактирования генома в клетке, имеющей геном, в который вставлен инструмент, включающий полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, может включать доставку донорного полинуклеотида в клетку.

Доставка направляющей нуклеиновой кислоты в клетку включает введение полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту, в клетку. Более конкретно, полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, может быть введен в клетку в форме РНК или полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту, может быть введен в вектор, и затем результант может быть введен в клетку.

Дополнительно, доставка донорного полинуклеотида в клетку включает введение вектора, включающего донорный полинуклеотид, в клетку.

В случае, когда направляющую нуклеиновую кислоту доставляют в клетку, направляющая нуклеиновая кислота может связываться с целевым сайтом.

Дополнительно, РНК-направляемая эндонуклеаза может экспрессироваться в клетке из полинуклеотида который был вставлен в инструмент системой экспрессии клетки, и РНК-направляемая эндонуклеаза может расщеплять целевой сайт, присутствующий в геноме, в состоянии, когда РНК-направляемая эндонуклеаза образует комплекс с направляющей нуклеиновой кислотой.

После того, как целевой сайт расщеплен, в целевом сайте может возникать вставка/делеция за счет повторяющихся взаимодействий системы репарации посредством негомологичного соединения концов (NHEJ) и РНК-направляемая эндонуклеаза, и, следовательно, конкретная последовательность рядом с целевым сайтом может быть нарушена. В результате ген, включающий конкретную последовательность, может достичь состояния, когда ген больше не может выполнять нормальную функцию, то есть состояния нокаута.

Дополнительно, если донорный полинуклеотид предоставлен в клетку вместе с направляющей нуклеиновой кислотой, донорный полинуклеотид может быть нокинирован в целевом сайте, который отщеплен РНК-направляемой эндонуклеазой.

В другом примере, один способ второго редактирования генома в клетке, имеющей геном, в который вставлен инструмент, включающий полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, может включать доставку РНК-направляемой эндонуклеазы в клетку.

Дополнительно, один способ второго редактирования генома в клетке, имеющей геном, в который вставлен инструмент, который включает полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, может включать доставку донорного полинуклеотида в клетку.

Доставка РНК-направляемой эндонуклеазы в клетку включает доставку РНК-направляемой эндонуклеазы в клетку в форме белка и/или полипептида. Дополнительно, доставка РНК-направляемой эндонуклеазы в клетку может включать введение полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, в клетку. Полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, может быть введен в клетку в состоянии, где полинуклеотид введен в вектор.

В другом примере, в клетке, имеющей геном, в который вставлен инструмент (см. ФИГ. 8(a)), который включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу (103), и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту (105), даже без дополнительной обработки, целевой ген, с которым может связываться направляющая нуклеиновая кислота, может быть нокаутирован.

ФИГ. 8(a) иллюстрирует инструмент, в котором полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу (103), и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту (105), включены между первой ITR последовательностью (101) и второй ITR последовательностью (107).

Более конкретно, если инструмент вставлен в геном клетки, РНК-направляемая эндонуклеаза и направляющая нуклеиновая кислота может быть экспрессирована через механизм экспрессии в клетке. Направляющая нуклеиновая кислота может связываться с целевым сайтом (231), который присутствует в геноме клетки, и РНК-направляемая эндонуклеаза, в состоянии, образующем комплекс сконструированной нуклеазы с направляющей нуклеиновой кислотой, может расщеплять целевой сайт (231).

ФИГ. 8(b) иллюстрирует форму, в которой расщепляется целевой сайт (231) в геноме, в который вставлен инструмент (см. ФИГ. 8(a)), который включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу (103), и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту (105). Целевой сайт (231) может быть разделен на первую область (231(a)) и вторую область (231(b)) комплексом полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу (103), и полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту (105).

То есть, в клетке, имеющей геном, в который вставлен инструмент, даже без дополнительной дальнейшей обработки, целевой ген, включающий целевой сайт, имеющий последовательность, такую же или комплементарную части последовательности направляющей нуклеиновой кислоты, может быть нокаутирован (см. ФИГ. 8(b)).

Однако если донорный полинуклеотид предоставлен в клетку, также возможно нокинировать донорный полинуклеотид до гена, включающего конкретную последовательность, нокаутированную описанным выше механизмом.

Дополнительно, в другом примере, в клетке, имеющей геном, в который вставлен первый инструмент, включающий полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и второй инструмент, включающий полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, даже без дополнительной обработки, целевой ген, включающий целевой сайт, который имеет такую же или комплементарную последовательность с частью последовательности направляющей нуклеиновой кислоты, может быть нокаутирован.

Более конкретно, когда первый инструмент и второй инструмент вставлены в геном клетки, РНК-направляемая эндонуклеаза и направляющая нуклеиновая кислота, которая экспрессируется механизмом экспрессии в клетке, может образовывать комплекс сконструированной нуклеазы, и комплекс сконструированной нуклеазы может расщеплять целевой сайт, с которым направляющая нуклеиновая кислота может иметь комплементарное связывание.

То есть, в клетке, имеющей геном, в который вставлен и первый инструмент, и второй инструмент, целевой ген, который включает целевой сайт, с которым направляющая нуклеиновая кислота может иметь комплементарное связывание даже без дополнительной обработки, может быть нокаутирован.

Однако, если клетка предоставлена с донорным полинуклеотидом, также возможно, что донорный полинуклеотид может быть нокинирован до целевого гена, имеющего целевой сайт, нокаутированного вышеописанным механизмом.

Вопреки описанию выше, первый инструмент может быть вставлен в геном первой клетки одной особи, а второй инструмент может быть вставлен в геном второй клетки особи.

В этом случае РНК-направляемая эндонуклеаза может экспрессироваться в первой клетке с помощью механизма экспрессии в клетке, и направляющая нуклеиновая кислота может экспрессироваться во второй клетке.

РНК-направляемая эндонуклеаза, экспрессируемая в первой клетке, может транспортироваться из первой клетки системой межклеточной доставки. Дополнительно, направляющая нуклеиновая кислота, экспрессированная во второй клетке, может быть транспортирована из второй клетки внутриклеточной системой доставки. То есть РНК-направляемая эндонуклеаза, экспрессированная в первой клетке, и направляющая нуклеиновая кислота, экспрессированная во второй клетке индивида, может присутствовать в той же самой клетке, через транспорт с помощью системы межклеточной доставки. В частности, РНК-направляемая эндонуклеаза и направляющая нуклеиновая кислота может образовывать комплекс, и редактирование генома может происходить в геноме клетки.

Например, РНК-направляемая эндонуклеаза, экспрессируемая в первой клетке, может мигрировать во вторую клетку, тем самым образуя комплекс с направляющей нуклеиновой кислотой, экспрессируемой во второй клетке, и в этом случае, второе редактирование генома может происходить во второй клетке.

В другом примере, направляющая нуклеиновая кислота, экспрессируемая во второй клетке, может мигрировать в первую клетку, тем самым образуя комплекс с РНК-направляемой эндонуклеазой, экспрессируемой в первой клетке, и в этом случае второе редактирование генома может происходить в первой клетке.

Дополнительно, в еще одном примере, РНК-направляемая эндонуклеаза, экспрессируемая в первой клетке, и направляющая нуклеиновая кислота, экспрессируемая во второй клетке, может мигрировать в третью клетку, которая присутствует у индивида. В этом случае, РНК-направляемая эндонуклеаза и направляющая нуклеиновая кислота может образовывать комплекс в третьей клетке, и второе редактирование генома может происходить в третьей клетке.

Механизм второго редактирования генома был описан выше, поэтому подробное описание здесь опущено.

Описанный выше способ второго редактирования генома может быть способом редактирования генома в изолированной клетке.

Один способ второго редактирования генома в не изолированной клетке может включить способ инъекции вышеописанной РНК, плазмидного вектора, полипептида и/или белка в ткань или орган индивида.

Кроме того, один способ второго редактирования генома в оплодотворенной яйцеклетке и/или эмбрионе может включать способ микроинъекци вышеописанной РНК, плазмидного вектора, полипептида и/или белка в оплодотворенную яйцеклетку.

Далее будет описан целевой сайт, где может произойти описанное выше второе редактирование генома.

Целевой сайт, где может происходить редактирование генома, зависит от типа направляющей нуклеиновой кислоты, предоставленной в клетку.

Предоставление направляющей нуклеиновой кислоты может относиться к доставке направляющей нуклеиновой кислоты извне клетки в клетку.

Кроме того, предоставление направляющей нуклеиновой кислоты может относиться к предоставлению направляющей нуклеиновой кислоты экспрессией полинуклеотида, который вставлен в геном клетки. В этом случае полинуклеотидом, вставленным в геном клетки, может быть такой, который включен в качестве компонента инструмента.

Например, когда один тип направляющей клеточной нуклеиновой кислоты предоставляется в клетку, редактирование генома может происходить в целевом сайте, с которым может связываться направляющая нуклеиновая кислота.

В другом примере, когда в клетку предоставлены два разных типа первой направляющей нуклеиновой кислоты и второй направляющей нуклеиновой кислоты, редактирование генома может происходить в первом целевом сайте, с которым может связываться первая направляющая нуклеиновая кислота, и во втором целевом сайте, с которым может связываться вторая направляющая нуклеиновая кислота.

2-2. Второе редактирование генома с применением компонента сконструированной нуклеазы, которая экспрессируется из инструмента, который включает элемент контроля экспрессии

2-2-1. Инструмент, который включает элемент контроля экспрессии

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления по настоящему раскрытию, может быть представлен инструмент, включающий элемент контроля экспрессии.

Элемент контроля экспрессии может относиться к элементу для контроля времени и/или места экспрессии конкретного полинуклеотида.

В случае инструмента, в который включен элемент контроля экспрессии, транскрипция и/или трансляция части полинуклеотида, включенного во внутреннюю часть инструмента, могут быть ингибированы, если не обрабатываются материалы и/или условия, влияющие на элемент контроля экспрессии.

В настоящем документе термин «материал и/или условия, влияющие на элемент контроля экспрессии» может относиться к материалам и/или условиям, которые могут индуцировать или вызывать увеличение транскрипции и/или трансляции полинуклеотида, где транскрипция и/или трансляция полинуклеотида ингибируется элементом контроля экспрессии.

Инструмент, включающий элемент контроля экспрессии, может включать первую ITR последовательность, элемент контроля экспрессии, полинуклеотид, который кодирует компонентов сконструированной нуклеазы и вторую ITR последовательность.

Элемент контроля экспрессии может быть элементом, который контролирует транскрипции и/или трансляцию полинуклеотида, который кодирует компоненты сконструированной нуклеазы.

В частности, транскрипция и/или трансляция полинуклеотида, который кодирует компонентов сконструированной нуклеазы, может быть ингибирована, если не обработать материал и/или условия, которые влияют на элемент контроля экспрессии.

В случае вставки клетки, имеющей геном, в который вставлен инструмент, включающий элемент контроля экспрессии, компоненты сконструированной нуклеазы не могут быть экспрессированы без обработки материала и/или условий, которые влияют на элемент контроля экспрессии. В этом случае второе редактирование генома не может произойти, если сконструированная нуклеаза дополнительно не будет доставлена внутрь клетки извне.

Далее будут описаны некоторые типовые варианты осуществления инструмента, включающего элемент контроля экспрессии. ФИГ. 9 иллюстрирует некоторые типовые варианты осуществления инструмента, включающего элемент контроля экспрессии (130).

Например, инструмент может включать полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу (132) и элемент контроля экспрессии (130) (см. ФИГ. 9 (a)).

В другом примере, инструмент может включать полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту (134), и элемент контроля экспрессии (130) (см. ФИГ. 9(b)).

В еще одном примере, инструмент может включать полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, и может включать элемент контроля экспрессии в одном или более из 5' конца полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и 5' конца полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту.

Более конкретно, инструмент может включать полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу (132), и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту (134), и может включать элемент контроля экспрессии (130) на 5' конце полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу. Дополнительно, полинуклеотид, кодирующий промотор (131), может быть включен в 5' конец полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту (134) (см. ФИГ. 9(c)).

Более конкретно, инструмент может включать полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу (132), и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту (134), и может включать элемент контроля экспрессии (130) на 5’ конце полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту (134). Дополнительно, полинуклеотид, кодирующий промотор (131), может быть включен на 5’ конце полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу (132) (см. ФИГ. 9(d)).

Более конкретно, инструмент может включать полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу (132), и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту (134) и может включать элемент контроля экспрессии (130(a)) на 5’ конце полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу (132) и может включать элемент контроля экспрессии (130(b)) на 5’ конце полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту (см. ФИГ. 9(e)).

Даже в случае, где оба, полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, включены в геном, где элемент контроля экспрессии дополнительно включен в, по меньшей мере, один из 5' конца полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и 5’ конца полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту, невозможно сделать заключение, что второе редактирование генома может происходить без определенной обработки.

Далее представлены конкретные варианты осуществления элемента контроля экспрессии (130). ФИГ. 10 иллюстрирует некоторые варианты осуществления элемента контроля экспрессии.

Например, элемент контроля экспрессии (130) может включать полинуклеотид, кодирующий индуцируемый промотор (151) (см. ФИГ. 10 (a)).

В случае, когда полинуклеотид, кодирующий индуцируемый промотор (151), вставлен в геном клетки, индуцируемый промотор не может работать без обработки материала и условий, которые влияют на элемент контроля экспрессии. В этом случае, транскрипция и/или трансляция полинуклеотида, присутствующего в 3’ направлении индуцируемого промотора, может не происходить. Более конкретно, если индуцируемым промотором является Tet-on промотор, если материал, который влияет на Tet-on промотор (например, тетрациклин) не обработан, транскрипция и/или трансляция полинуклеотида, присутствующего на 3’ направлении Tet-on промотора, может не происходить.

В другом примере, элемент контроля экспрессии (130) может включать полинуклеотид, который кодирует [сайт распознавания рекомбиназы (RRS) (153)-стоп-кодон транскрипции (154)-сайт распознавания рекомбиназы (RRS) (155)] (далее, RTR). Экзополинуклеотид может быть дополнительно включен между сайтом распознавания рекомбиназы (RRS) (153) и стоп-кодоном транскрипции (154).

То есть, в настоящем раскрытии, RTR может означать, что экзополинуклеотид дополнительно включен между сайтом распознавания рекомбиназы (RRS) (153) и стоп-кодоном транскрипции (154).

RTR может быть включен между полинуклеотидом, кодирующим промотор (152), и транскрибируемым и/или транслируемым полинуклеотидом (см. ФИГ. 10(b)).

В случае, когда RTR вставлен в геном клетки, стоп-кодон транскрипции не может быть удален без обработки материала и/или условий, которые влияют на элемент контроля экспрессии, и в этом случае, транскрипция и/или трансляция полинуклеотида, присутствующего в 3’ направлении RTR, может не происходить. Более конкретно, когда клетка не обработана рекомбиназой (например, Cre рекомбиназой, Dre рекомбиназой и т.д.), которая является материалом, который влияет на RTR, транскрипция полинуклеотида, присутствующего в 3’ направлении RTR, может не происходить.

В еще одном примере, элемент контроля экспрессии (130) может включать полинуклеотид, который кодирует [сайт распознавания рекомбиназы (RRS) (153)-стоп-кодон (156)-сайт распознавания рекомбиназы (RRS) (155)] (далее, RSR). Экзополинуклеотид дополнительно может быть включен между сайтом распознавания рекомбиназы (RRS) (153) и стоп-кодоном (156).

То есть, в настоящем раскрытии, RSR может означать, что экзополинуклеотид может быть дополнительно включен между сайтом распознавания рекомбиназы (RRS) (153) и стоп-кодоном (156).

RSR может быть включен между полинуклеотидом, кодирующим промотор (152), и транскрибируемом и/или транслируемом полинуклеотидом (см. ФИГ. 10(c)).

В случае, когда RSR вставлен в геном клетки, стоп-кодон не может быть удален без обработки материала и/или условий, которые влияют на элемент контроля экспрессии, и в этом случае, транскрипция и/или трансляция полинуклеотида, присутствующего в 3’ направлении RSR, может не происходить. Более конкретно, если клетка не обработана рекомбиназой (например, Cre рекомбиназой, Dre рекомбиназой, и т.д.), которая является материалом, который влияет на RSR, транскрипция полинуклеотида, присутствующего в 3’ направлении RSR, может не происходить.

В еще одном примере, может быть вариант, в котором элемент контроля экспрессии (130) не включает полинуклеотид, кодирующий промотор, но включает сайт распознавания рекомбиназы (RRS) (157) (см. ФИГ. 10(d)).

В этом случае, транскрипция и/или трансляция полинуклеотида, присутствующего в 3’ направлении RRS может не происходить, если только i) сайт распознавания рекомбиназы (RRS) или его мутант и полинуклеотид, кодирующий промотор и ii) рекомбиназа, которая может взаимодействовать с сайтом распознавания рекомбиназы (RRS), не обработаны в клетке.

Каждый инструмент, включающий элемент контроля экспрессии (130), представленный в настоящем раскрытии, может образовывать комбинацию и, таким образом, может быть вставлен в геном (и/или хромосому) клетки.

То есть, первый инструмент и второй инструмент может быть вставлен в геном одной клетки, и в этом случае, любой или более первых инструментов и вторых инструментов могут включать элемент контроля экспрессии (130).

Например, первый инструмент может включать элемент контроля экспрессии (130) и полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу. Второй инструмент может включать полинуклеотид, кодирующий промотор, и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту.

В другом примере, первый инструмент может включать элемент контроля экспрессии (130) и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту. Второй инструмент может включать полинуклеотид, кодирующий промотор, и полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу.

В еще одном примере, первый инструмент может включать элемент контроля экспрессии (130) и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту. Второй инструмент может включать элемент контроля экспрессии (130) и полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу.

Даже в этом случае, экспрессия компонентов сконструированной нуклеазы может ингибироваться элементом контроля экспрессии (130), и таким образом, невозможно сделать заключение, что второе редактирование генома может происходить без дополнительной обработки материала и/или условий, которые влияют на элемент контроля экспрессии, даже если инструмент вставлен в геном первым редактированием генома.

2-2-2. Способ второго редактирования генома

В данном раскрытии представлен способ второго редактирования генома через экспрессирование компонентов сконструированной нуклеазы из инструмента, который включает элемент контроля экспрессии и полинуклеотид, кодирующий компоненты сконструированной нуклеазы.

Разные способы второго редактирования генома могут быть представлены в соответствии с конструкцией инструмента, вставленного в геном.

Для удобства объяснения, далее принимается и будет описан случай, когда полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, включен в 3' конец элемента контроля экспрессии, в качестве конструкции инструмента.

Например, один способ второго редактирования генома в клетке, имеющей геном, в который вставлен инструмент, включающий полинуклеотид, кодирующий индуцируемый промотор, и полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, может включать обработку материала и/или условий, при которых может действовать индуцируемый промотор; и доставку направляющей нуклеиновой кислоты. Кроме того, один способ второго редактирования генома в клетке может включать дополнительную доставку донорного полинуклеотида в клетку.

Обработка материала и/или условий, которые влияют на элемент контроля экспрессии, предоставление направляющей нуклеиновой кислоты и предоставление донорного полинуклеотида в клетке могут быть проведены одновременно, и это может применяться в другим типовым вариантам осуществления ниже.

Материал или условие, при которых может действовать индуцируемый промотор, описаны выше, поэтому подробное объяснение опущено. Дополнительно, способ доставки направляющей нуклеиновой кислоты и/или донорного полинуклеотида в клетку также был описан выше, поэтому подробное объяснение опущено.

Если материал и/или условие, при которых может действовать индуцируемый промотор, обрабатываются в клетке, индуцируемый промотор может быть активирован, и в этом случае полинуклеотид, присутствующий на 3' конце индуцируемого промотора, транскрибирован и/или транслирован, таким образом РНК-направляемая эндонуклеаза может экспрессироваться.

Направляющая нуклеиновая кислота, предоставленная в клетку, может связываться с целевым сайтом, присутствующим в геноме клетки. Дополнительно, РНК-направляемая эндонуклеаза, экспрессированная вышеописанным механизмом, может расщеплять целевой сайт, одновременно формируя комплекс с направляющей нуклеиновой кислотой, и в этом случае, целевой ген, включающий целевой сайт, может быть нокаутирован.

Кроме того, когда донорный полинуклеотид предоставлен в клетку, донорный полинуклеотид может быть нокинирован в месте, где расщеплен целевой сайт.

То есть, обработкой материала и/или условий, при которых может действовать индуцируемый промотор на клетку, транскрипцию и/или трансляцию полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, расположенного на 3' конце индуцируемого промотора, можно своевременно контролировать, и благодаря этому редактирование генома также может своевременно контролироваться.

В другом примере, один способ второго редактирования генома в клетке, имеющей геном, в который вставлен инструмент, включающий RSR, вставленный между полинуклеотидом, кодирующим промотор, и полинуклеотидом, кодирующим РНК-направляемую эндонуклеазу, может включать предоставление сайт-специфической рекомбиназы (SSR) и направляющей нуклеиновой кислоты в клетку. Кроме того, один способ второго редактирования генома в клетке может включать дополнительно предоставление донорного полинуклеотида в клетку.

Предоставление сайт-специфической рекомбиназы (SSR) в клетку может включать предоставление сайт-специфической рекомбиназы (SSR), белка или полинуклеотида, кодирующего сайт-специфическую рекомбиназу (SSR), в клетку. Полинуклеотид, кодирующий сайт-специфическую рекомбиназу (SSR), может быть введен в клетку введением в плазмидный вектор или вирусный вектор.

Способ получения направляющей нуклеиновой кислоты и/или донорного полинуклеотида в клетке описан выше, поэтому подробное объяснение здесь опущено.

Когда сайт-специфическая рекомбиназа (SSR) доставлена в клетку, сайт-специфическая рекомбиназа (SSR) и сайт распознавания рекомбиназы (RRS) могут взаимодействовать друг с другом, и стоп-кодон может быть удален взаимодействием. В этом случае, может экспрессироваться РНК-направляемая эндонуклеаза, присутствующая на 3' конце RSR.

Направляющая нуклеиновая кислота, предоставленная в клетку, может связываться с целевым сайтом, присутствующем в геноме клетки. Дополнительно, экспрессированная РНК-направляемая эндонуклеаза может расщеплять целевой сайт при формировании комплекса с направляющей нуклеиновой кислотой, и в этом случае, целевой ген, включающий целевой сайт, может быть нокаутирован.

Кроме того, когда донорный полинуклеотид предоставлен в клетку, донорный полинуклеотид может быть нокинирован на месте, где расщеплен целевой сайт.

То есть, транскрипция и/или трансляция полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, расположенного на 3' конце полинуклеотида, кодирующего RSR, может своевременно контролироваться доставкой рекомбиназы (SSR) и через нее, может своевременно контролироваться редактирование генома.

В еще одном примере, один способ второго редактирования генома в клетке, имеющей геном, в который вставлен инструмент, включающий RTR, вставленный между полинуклеотидом, кодирующим промотор, и полинуклеотидом, кодирующим направляющую нуклеиновую кислоту, может включать предоставление сайт-специфической рекомбиназы (SSR) и РНК-направляемой эндонуклеазы в клетку. Кроме того, один способ второго редактирования генома в клетке может включать дополнительное предоставление донорного полинуклеотида в клетку.

Способ предоставления сайт-специфической рекомбиназы (SSR), РНК-направляемой эндонуклеазы и/или донорного полинуклеотида в клетку описан выше, и поэтому подробное объяснение опущено.

Когда сайт-специфическая рекомбиназа (SSR) предоставлена в клетку, стоп-кодон транскрипции может быть удален через взаимодействие между сайт-специфической рекомбиназой (SSR) и сайтом распознавания рекомбиназы (RRS). В этом случае, может экспрессироваться направляющая нуклеиновая кислота, присутствующая на 3' конце RSR. Направляющая нуклеиновая кислота может связываться с целевым сайтом, который присутствует в геноме клетки.

РНК-направляемая эндонуклеаза, предоставленная в клетку, может расщеплять целевой сайт с образованием комплекса с направляющей нуклеиновой кислотой, и в этом случае, целевой ген, включающий целевой сайт, может быть нокаутирован.

То есть, предоставлением рекомбиназы (SSR), транскрипцию и/или трансляцию полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту, расположенного на 3’ конце полинуклеотида, кодирующего RTR, можно своевременно контролировать, и благодаря этому редактирование генома также может своевременно контролироваться.

В еще одном примере, один способ второго редактирования генома в клетке, имеющей геном, в который вставлен инструмент, включающий полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), и полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, без включения полинуклеотида, кодирующего промотор, может включать предоставление первой сайт-специфической рекомбиназы (SSR1) и полинуклеотида, кодирующего промотор, в клетку. Первая сайт-специфическая рекомбиназа (SSR1) может взаимодействовать с первым сайтом распознавания рекомбиназы (RRS1). Кроме того, один способ второго редактирование генома в клетке может включать дополнительное предоставление донорного полинуклеотида в клетку.

Способ предоставления первой сайт-специфической рекомбиназы (SSR1) и донорного полинуклеотида в клетку описан выше, и поэтому подробное объяснение опущено.

Полинуклеотид, кодирующий промотор, может быть введен в плазмидный вектор вместе с сайтом распознавания рекомбиназы (RRS), который образует пару с первым сайтом распознавания рекомбиназы (RRS1) и затем предоставлен в клетку.

Когда первая сайт-специфическая рекомбиназа (SSR1) предоставлена в клетку, кодирующий промотор предоставлен в клетку, первая сайт-специфическая рекомбиназа (SSR1) и первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1) могут взаимодействовать друг с другом, и тем самым полинуклеотид, кодирующий промотор, может быть вставлен в инструмент, который присутствует в геноме клетки. В этом случае, РНК-направляемая эндонуклеаза, присутствующая на 3' конце первого сайта распознавания рекомбиназы (RRS1), может быть транскрибирован и/или транслирован.

Направляющая нуклеиновая кислота, предоставленная в клетку, может связываться с целевым сайтом, присутствующем в геноме клетки. Дополнительно, экспрессированная РНК-направляемая эндонуклеаза может расщеплять целевой сайт с образованием комплекса с направляющей нуклеиновой кислотой, и в этом случае, целевой ген, включающий целевой сайт, может быть нокаутирован.

То есть, предоставлением первой сайт-специфической рекомбиназы (SSR1) и полинуклеотида, кодирующего промотор рекомбиназы (SSR), транскрипцию и/или трансляцию полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, расположенного на 3’ конце полинуклеотида, кодирующего первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), можно своевременно контролировать, и благодаря этому редактирование генома также может своевременно контролироваться.

Далее описан способ второго редактирования генома с применением инструмента, в котором полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, включен на 3' конце элемента контроля экспрессии. Однако способ второго редактирования генома с применением инструмента, в котором полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, включен на 3' конце элемента контроля экспрессии, и его механизм описан подробно выше, и поэтому конкретные детали механизма редактирования генома опущены.

Например, один способ второго редактирование генома, в клетке, имеющей геном, в который вставлен инструмент, включающий полинуклеотид, кодирующий индуцируемый промотор, и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, может включать обработку материала и/или условий, при которых может действовать индуцируемый промотор, и предоставление РНК-направляемой эндонуклеазы в клетку. Кроме того, один способ второго редактирование генома в клетке может включать дополнительное предоставление донорного полинуклеотида в клетку.

Обработка материала и/или условий, которые влияют на элемент контроля экспрессии в клетке, предоставление РНК-направляемой эндонуклеазы и предоставление донорного полинуклеотида может быть проведено одновременно, и эти способы также могут применяться к другим типовым вариантам осуществления ниже.

В другом примере, один способ второго редактирования генома, в клетке, имеющей геном, в который вставлен инструмент, включающий RTR между полинуклеотидом, кодирующим промотор, и полинуклеотидом, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, может включать предоставление сайт-специфической рекомбиназы (SSR) и РНК-направляемой эндонуклеазы в клетку. Кроме того, один способ второго редактирование генома в клетке может включать дополнительное предоставление донорного полинуклеотида в клетку.

В еще одном примере, один способ второго редактирования генома, в клетке, имеющей геном, в который вставлен инструмент, включающий полинуклеотид, кодирующий первый сайт распознавания рекомбиназы (RRS1), и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, без полинуклеотида, кодирующего промотор, может включать предоставление первой сайт-специфической рекомбиназы (SSR1) и полинуклеотида, кодирующего промотор в клетку. Кроме того, один способ второго редактирование генома в клетке может включать дополнительное предоставление донорного полинуклеотида в клетку.

Как описано выше, один способ второго редактирования генома в изолированной клетке может включать прямую доставку в клетку разных типов материалов (например, материалов, которые влияют на элемент контроля экспрессии), РНК, плазмидного вектора, вирусного вектора, полипептида и/или белка, описанных выше.

Дополнительно, один способ второго редактирование генома в не изолированной клетке может включать инъекцию в ткани или органы индивида разных типов материалов (например, материалов, которые влияют на элемент контроля экспрессии), РНК, плазмидного вектора, вирусного вектора, полипептида и/или белка, описанных выше.

Кроме того, один способ второго редактирования генома в оплодотворенной яйцеклетке и/или эмбрионе может включать микроинъекцию (MI) в оплодотворенную яйцеклетку животного в состоянии пронуклеуса в стадии 1 клетки, разных типов материалов (например, материалов, которые влияют на элемент контроля экспрессии), РНК, плазмидного вектора, вирусного вектора, полипептида и/или белка, описанных выше.

Дополнительно, один способ второго редактирования генома в оплодотворенной яйцеклетке и/или эмбрионе может включать микроинъекцию в оплодотворенную яйцеклетку животного в состоянии после стадии 2 клеток, разных типов материалов (например, материалов, которые влияют на элемент контроля экспрессии), РНК, плазмидного вектора, вирусного вектора, полипептида и/или белка, описанных выше.

Как описано выше, в случае клетки, оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона, имеющего геном, в который вставлен инструмент, включающий полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, нет необходимости предоставлять РНК-направляемую эндонуклеазу для редактирования генома. В этом случае, возможно решить проблемы из-за большого размера полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу (например, низкую эффективность доставки).

2-3. Трансгенный эмбрион и трансгенное животное, в котором проходит второе редактирование генома с применением компонента сконструированной нуклеазы, экспрессированной из инструмента

2-3-1. Трансгенный эмбрион, в котором происходит второе редактирование генома с применением компонентов сконструированной нуклеазы

2-3-1-1. Конструирование трансгенного эмбриона, в котором происходит второе редактирование генома с применением компонентов сконструированной нуклеазы

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления по настоящему раскрытию, представлен трансгенный эмбрион, где эмбрион включает одну или более клеток (далее, “клетка второго редактирования генома”), имеющих геном, в котором происходит второе редактирование генома с применением компонентов сконструированной нуклеазы, экспрессированной из инструмента.

Согласно типовому варианту осуществления, представленному в настоящем описании, может быть представлен трансгенный эмбрион, где эмбрион имеет геном, который включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью; и где эндополинуклеотид нокаутирован. В частности, направляющая нуклеиновая кислота может специфически связывать эндополинуклеотид.

Форма, в которой эндополинуклеотид нокаутирован, может быть в любой форме, выбранной из i) формы, в которую не включен, по меньшей мере, один нуклеотид в последовательности эндополинуклеотида, ii) формы, в которой, по меньшей мере, один нуклеотид дополнительно добавлен к последовательности эндополинуклеотида, и iii) формы, в которой исключен, по меньшей мере, один нуклеотид в последовательности эндополинуклеотида и, по меньшей мере, туда дополнительно добавлен один нуклеотид.

В настоящем документе термин “клетка второго редактирования генома” относится к клетке, имеющей геном, в которой происходит второе редактирование генома, и термин “второе редактирование генома” может включать редактирование генома с применением вышеописанного сайта распознавания рекомбиназы (RRS); редактирование генома с применением инструмента, который не включает элемент контроля экспрессии; и редактирование генома с применением инструмента, который включает элемент контроля экспрессии.

Однако в настоящем раскрытии термин “клетка второго редактирования генома” просто относится к клетке, имеющей геном, в которой происходит второе редактирование генома, но не имеет значения, включен ли инструмент в геном клетки или нет. То есть, клеткой, в которой происходит второе редактирование генома в геноме может быть “клетка второго редактирования генома”, описанная в настоящем раскрытии, даже если инструмент вставлен в геном; или может быть “клетка второго редактирования генома”, описанная в настоящем раскрытии, даже если инструмент не вставлен в геном.

Дополнительно, в настоящем документе термин “клетка без второго редактирования генома” относится к клетке, которая имеет геном, в котором второе редактирование генома не происходит. Однако в настоящем раскрытии, термин “клетка без второго редактирования генома” просто относится к клетке, имеющей геном, в котором второе редактирование генома не происходит, клетка, которая имеет геном, в который вставлен инструмент (100) и где вышеописанное второе редактирование генома не происходит, также может принадлежать клетке. То есть, пока второе редактирование генома не происходит, любая клетка, которая имеет геном, в котором происходит другая манипуляция с генами, может быть “клеткой без второго редактирования генома”, описанной в настоящем раскрытии.

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления по настоящему раскрытию, трансгенный эмбрион, в котором происходит второе редактирование генома с применением компонентов сконструированной нуклеазы, то есть экспрессированной из инструмента, может быть химерным или гомологичным.

Гомологичный эмбрион может относиться к трансгенному эмбриону, который имеет только “клетку второго редактирования генома”.

Химерный эмбрион может относиться к трансгенному эмбриону, который дополнительно имеет “клетку без второго редактирования генома”, в дополнение к “клетке второго редактирования генома”.

Одним примером химерного трансгенного эмбриона, который может быть представлен в настоящем раскрытии, может быть трансгенный эмбрион, который включает первую клетку, имеющую геном, который включает первый инструмент и целевой сайт, и вторую клетку, имеющую геном, который включает второй инструмент и модифицированный сайт. Последовательность первого инструмента может быть такой же или отличаться от второго инструмента.

В частности, первый инструмент и/или второй инструмент может включать один или более, выбранных из полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту. Дополнительно, первый инструмент и/или второй инструмент может дополнительно включать элемент контроля экспрессии на любом или более, выбранных из 5' конца полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и 5' конца полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту. В этом случае, направляющая нуклеиновая кислота может специфически связывать целевой сайт.

Целевым сайтом может быть экзополинуклеотид. Модифицированным сайтом может быть такой, в котором последовательность целевого сайта была изменена редактированием генома.

Более конкретно, целевой сайт может включать первую область, вторую область и третью область, и модифицированный сайт может включать четвертую область, пятую область и шестую область. В частности, последовательность первой области такая же, как для четвертой области, последовательность третьей области такая же, как для шестой области и последовательность второй области отличается от пятой области.

Вторая область и пятая область могут включать PAM последовательность. Третья область и шестая область могут включать PAM последовательность.

Последовательность пятой области может быть в любой форме, выбранной из i) формы, в которой не включен, по меньшей мере, один нуклеотид в последовательности второй области, ii) формы, в которой, по меньшей мере, один нуклеотид дополнительно добавлен к последовательности второй области, и iii) формы, в которой удален, по меньшей мере, один нуклеотид в последовательности второй области и, по меньшей мере, один нуклеотид дополнительно туда добавлен. В случаях ii) и iii), по меньшей мере, один нуклеотид, который дополнительно туда добавлен, может включать один или более, выбранных из редактирующего разрешающего компонента, полинуклеотида, кодирующего белок или РНК, полинуклеотида, кодирующего не функциональный полипептид, полинуклеотида, кодирующего нетранслированную РНК, нетранскрибируемого полинуклеотида, искусственного интрона и элемента контроля экспрессии.

Целевым сайтом может быть эндополинуклеотид оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона.

Каждый из целевого сайта и модифицированного сайта может быть последовательностью, соседней PAM последовательности.

Каждый из целевого сайта и модифицированного сайта может включать первую ITR последовательность в направлении 5', и каждый может включать вторую ITR последовательность в направлении 3’.

Другим примером химерного трансгенного эмбриона, который может быть представлен в настоящем раскрытии, может быть трансгенный эмбрион, который включает первую клетку, которая включает первый инструмент и целевой сайт, и вторую клетку, которая не включает инструмент, но имеет геном, включающий модифицированный ген.

В частности, первый инструмент может включать один или более, выбранных из полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту. Дополнительно, первый инструмент может дополнительно включать элемент контроля экспрессии на любом, выбранном из 5' конца полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу и 5' конца полинуклеотида, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту. В этом случае, направляющая нуклеиновая кислота может специфически связывать целевой сайт.

Модифицированный сайт может быть таким, в котором последовательность целевого сайта была изменена редактированием генома.

Более конкретно, целевой сайт может включать первую область, вторую область и третью область; и модифицированный сайт может включать четвертую область, пятую область и шестую область. В частности, последовательность первой области такая же, как для четвертой области, последовательность третьей области такая же, как для шестой области и последовательность второй области отличается от пятой области.

Последовательность пятой области может быть в любой форме, выбранной из i) формы, в которой не включен, по меньшей мере, один нуклеотид в последовательности второй области, ii) формы, в которой, по меньшей мере, один нуклеотид дополнительно добавлен к последовательности второй области, и iii) формы, в которой удален, по меньшей мере, один нуклеотид в последовательности второй области и, по меньшей мере, один нуклеотид дополнительно туда добавлен.

Целевой сайт и модифицированный сайт может быть последовательностью, соседней PAM последовательности.

Более конкретно, каждый из целевого сайта и PAM последовательности может быть включен между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью, и каждый из модифицированного сайта и PAM последовательности может быть включен между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью.

Далее описан способ получения трансгенного эмбриона, который включает одну или более клеток, в которых второе редактирование генома происходит через сконструированную нуклеазу, которая экспрессируется из инструменте, вставленном в геном.

2-3-1-2. Способ получения трансгенного эмбриона, в котором второе редактирование генома происходит с применением компонентов сконструированной нуклеазы

Один способ получения оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона, которые имеют геном, в котором происходит второе редактирование генома с применением компонентов сконструированной нуклеазы, то есть, экспрессированной из инструмента, может включать микроинъекцию (MI) “элемент для второго редактирования генома” в оплодотворенную яйцеклетку.

В частности, оплодотворенная яйцеклетка и/или эмбрион может быть получен естественным скрещиванием или in vitro оплодотворением. Естественное скрещивание и/или in vitro оплодотворение может проводиться между гаметой, которая продуцируется животным, который имеет геном, в который вставлен инструмент, включающий полинуклеотид, кодирующий компоненты сконструированной нуклеазы, и гаметой, которая продуцирована животным пола, отличающегося от вышеуказанного животного.

В настоящем документе термин “элемент для второго редактирования генома” относится к элементу, который предоставлен в клетку, эмбрион или животное так, чтобы обеспечить второе редактирование генома в геноме.

Например, “элементом для второго редактирования генома” может быть любой или более, выбранных из материала и/или условий, которые влияют на элемент контроля экспрессии, полинуклеотида, включающего сайт распознавания рекомбиназы (RRS), сайт-специфической рекомбиназы (SSR), РНК-направляемой эндонуклеазы, направляющей нуклеиновую кислоту и донорного полинуклеотида, но не ограничен ими.

Более конкретно, один типовой способ получения трансгенного эмбриона, в котором происходит редактирование генома, представленное в настоящем описании, может включать предоставление направляющей нуклеиновой кислоты, которая может связываться с целевым сайтом, в оплодотворенную яйцеклетку или эмбрион, имеющий геном, который включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу. Дополнительно, один типовой способ получения трансгенного эмбриона, в котором происходит редактирование генома, может дополнительно предоставлять донорный полинуклеотид в оплодотворенную яйцеклетку или эмбрион. В частности, донорный полинуклеотид может быть предоставлен одновременно с направляющей нуклеиновой кислотой. Например, донорный полинуклеотид и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, могут быть введены в один вектор и предоставлены как таковые.

Оплодотворенной яйцеклеткой или эмбрионом может быть такой, который получают in vitro оплодотворением между гаметой, которая продуцируется животным, который имеет геном, в который вставлен инструмент, включающий полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и гаметой, которая продуцирована животным пола, отличающегося от вышеуказанного животного.

Более конкретно, другой типовой способ получения трансгенного эмбриона, в котором происходит редактирование генома, представленный в настоящем описании, может включать предоставление любого из материалов и условий, которые влияют на элемент контроля экспрессии, в оплодотворенную яйцеклетку или эмбрион, имеющий геном, который включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, которая может специфически связываться с целевым сайтом, и который включает элемент контроля экспрессии в любом или более, выбранных из 5' конца полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и 5' конца полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту.

Дополнительно, один типовой способ получения трансгенного эмбриона, в котором происходит редактирование генома, может дополнительно представлять предоставление донорного полинуклеотида в оплодотворенную яйцеклетку или эмбрион.

Донорный полинуклеотид может быть одновременно представлен вместе с любым или более материалами или условиями, которые влияют на элемент контроля экспрессии.

Другой способ получения оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона, имеющего геном, в котором происходит второе редактирование генома с применением компонентов сконструированной нуклеазы, экспрессированной из инструмента, может включать проведение ядерного транспорта соматической клетки (SCNT).

В частности, соматическая клетка, применяемая в ядерном транспорте соматической клетки, может иметь геном, в который вставлен инструмент, включающий полинуклеотид, кодирующий компоненты сконструированной нуклеазы.

Ядерный транспорт соматической клетки (SCNT) может включать трансплантацию ядра “клетки второго редактирования генома”, полученного способом, описанным выше, в энуклеированную яйцеклетку. В частности, “клетка второго редактирования генома” может считаться трансгенной донорной клеткой.

Более конкретно, один типовой способ получения трансгенного эмбриона, в котором происходит редактирование генома, представленный в настоящем описании, может включать i) способ получения трансгенной донорной клетки, имеющей геном, который включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и в котором происходит редактирование генома, на целевом сайте и ii) способ трансплантации ядра трансгенной донорной клетки в энуклеированную яйцеклетку.

Способ получения трансгенной донорной клетки может включать предоставление направляющей нуклеиновой кислоты, которая может связываться с целевым сайтом, в клетку, имеющую геном, который включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу. Способ получения трансгенной донорной клетки может дополнительно включать предоставление донорного полинуклеотида в клетку, имеющую геном, который включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу.

В частности, донорный полинуклеотид может быть предоставлен одновременно с направляющей нуклеиновой кислотой. Например, донорный полинуклеотид и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, может быть введен в один вектор и предоставлен как таковой.

Более конкретно, другой типовой способ получения трансгенного эмбриона, в котором происходит редактирование генома, представленный в настоящем описании, может включать i) способ получения трансгенной донорной клетки, имеющей геном, который включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, которая может специфически связываться с целевым сайтом, который включает элемент контроля экспрессии в одном или более, выбранных из 5' конца полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и 5' конца полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту, и в котором происходит редактирование генома, на целевом сайте, и ii) способ трансплантации ядра трансгенной донорной клетки в энуклеированную яйцеклетку.

Способ получения трансгенной донорной клетки может включать предоставление одного или более, выбранных из материалов и условий, которые влияют на элемент контроля экспрессии, в клетку, имеющую геном, который включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, которая может специфически связываться с целевым сайтом, и которая включает элемент контроля экспрессии в одном или более, выбранных из 5' конца полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и 5' конца полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту. Дополнительно, способ получения трансгенной донорной клетки может дополнительно включать предоставление донорного полинуклеотида в клетку.

Донорный полинуклеотид может быть представлен одновременно вместе с, по меньшей мере, одним из материалов или условий, которые влияют на элемент контроля экспрессии.

2-3-2. Трансгенное животное, в котором происходит второе редактирование генома с применением сконструированной нуклеазы

2-3-2-1. Конструирование трансгенного животного, в котором происходит второе редактирование генома с применением сконструированной нуклеазы

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления по настоящему раскрытию, может быть представлено трансгенное животное, где трансгенное животное включает одну или более клеток, имеющих геном, в котором происходит второе редактирование генома с применением компонентов сконструированной нуклеазы, экспрессированной из инструмента (далее, “клетка второго редактирования генома”).

Согласно типовому варианту осуществления, представленному в настоящем описании, может быть представлено трансгенное животное, где трансгенное животное имеет геном, который включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью, и где эндополинуклеотид нокаутирован. В частности, направляющая нуклеиновая кислота может специфически связывать эндополинуклеотид.

Трансгенное животное, в котором происходит второе редактирование генома с применением компонентов сконструированной нуклеазы, то есть экспрессированной из инструмента, может быть химерным животным или гомологичным животным.

Гомологичное животное может относиться к трансгенному животному, которое имеет только “клетку второго редактирования генома”.

Химерное животное может относиться к трансгенному животному, которое дополнительно имеет “клетку без второго редактирования генома”, в дополнение к “клетке второго редактирования генома”.

Пример химерного трансгенного животного, которое может быть представлено в настоящем раскрытии, может быть трансгенным животным, которое включает первую клетку, имеющую геном, который включает первый инструмент и целевой сайт, и вторую клетку, имеющую геном, который включает второй инструмент, и модифицированный сайт. Последовательность первого инструмента могут быть одинаковой или отличаться от второго инструмента.

В частности, первый инструмент и/или второй инструмент может включать один или более, выбранных из полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту. Дополнительно, первый инструмент и/или второй инструмент может дополнительно включать элемент контроля экспрессии, в любом или более, выбранных из 5' конца полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и 5' конца полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту. В этом случае, направляющая нуклеиновая кислота может специфически связывать целевой сайт.

Модифицированным сайтом может быть такой, в котором последовательность целевого сайта была изменена редактированием генома.

Более конкретно, целевая последовательность может включать первую область, вторую область и третью область и модифицированная последовательность может включать четвертую область, пятую область и шестую область. В этом случае, последовательность первой области такая же, как для четвертой области, последовательность третьей области такая же, как для шестой области и последовательность второй области отличается от пятой области.

Каждая из второй области и пятой области может включать РАМ последовательность. Каждая из третьей области и шестой области может включать РАМ последовательность.

Другим примером химерного трансгенного эмбриона, который может быть представлен в настоящем раскрытии, может быть трансгенное животное, которое включает первую клетку имеющую геном, который включает первый инструмент и целевой сайт, и вторую клетку, которая не включает инструмент, но имеет геном, включающий модифицированный ген.

В частности, первый инструмент может включать один или более, выбранных из полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту. Дополнительно, первый инструмент может дополнительно включать элемент контроля экспрессии в любом или более, выбранных из 5' конца полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и 5' конца полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту. В этом случае, направляющая нуклеиновая кислота может специфически связывать целевой сайт.

Более конкретно, целевая последовательность может включать первую область, вторую область и третью область, и модифицированная последовательность может включать четвертую область, пятую область и шестую область. В этом случае, последовательность первой области такая же, как для четвертой области, последовательность третьей области такая же, как для шестой области и последовательность второй области отличается от пятой области.

Целевым сайтом может быть эндополинуклеотид животного.

Далее описан способ получения трансгенного животного, где трансгенное животное включает одну или более клеток, имеющих геном, в котором происходит второе редактирование генома через сконструированную нуклеазу, то есть экспрессированную из инструмента, вставленного в геном.

2-3-2-2. Способ получения трансгенного животного, в котором происходит второе редактирование генома с применением сконструированной нуклеазы

Один способ получения животного, которое включает “клетку второго редактирования генома” согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, может включать трансплантацию в матку суррогатной матери оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона, имеющего геном, в котором происходит второе редактирование генома через компоненты сконструированной нуклеазы.

Например, как описано выше, животное, включающее “клетку второго редактирования генома” может быть получено имплантацией оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона, микроинъекцией (MI) “элемента для второго редактирования генома” в матку суррогатной матери. В этом случае, полученное животное может быть химерным или гомологичным.

В другом примере, животное, включающее “клетку второго редактирования генома” может быть получено имплантацией, в матку суррогатной матери, оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона, полученного ядерным транспортом соматической клетки (SCNT), с применением клетки, которая имеет геном, в котором происходит второе редактирование генома, как описано выше. В этом случае, полученное животное может быть гомологичным.

Более конкретно, один типовой способ получения трансгенного животного, в котором происходит второе редактирование генома, представленный в настоящем описании может включать i) способ получения эмбриона, имеющего геном, который включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и в котором происходит второе редактирование генома на целевом сайте и ii) способ имплантации эмбриона суррогатной матери.

Способ получения эмбриона может включать предоставление направляющей нуклеиновой кислоты, которая может связываться с целевым сайтом, в оплодотворенную яйцеклетку или эмбрион, который имеет геном, включающий полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу. Дополнительно, способ получения эмбриона может дополнительно включать предоставление донорного полинуклеотида в оплодотворенную яйцеклетку или эмбрион.

В частности, донорный полинуклеотид может быть представлен одновременно вместе с направляющей нуклеиновой кислотой. Например, донорный полинуклеотид и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, могут быть введены в один вектор и предоставлены как таковые.

Получение эмбриона может включать i) получение трансгенной донорной клетки, имеющей геном, который включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и в котором происходит второе редактирование генома, на целевом сайте и ii) трансплантацию ядра трансгенной донорной клетки в энуклеированную яйцеклетку.

Получение трансгенной донорной клетки может включать предоставление направляющей нуклеиновой кислоты, которая может связываться с целевым сайтом, в клетку, имеющую геном, который включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу. Дополнительно, получение трансгенной донорной клетки может дополнительно включать предоставление донорного полинуклеотида в клетку, имеющую геном, который включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу.

В частности, донорный полинуклеотид может быть представлен одновременно вместе с направляющей нуклеиновой кислотой. Например, донорный полинуклеотид и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту могут быть введены в один вектор и предоставлены как таковые.

Более конкретно, другой способ получения трансгенного животного, в котором происходит редактирование генома, представленный в настоящем раскрытии, может включать i) получение эмбриона, имеющего геном, который включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, которая может специфически связываться с целевым сайтом, который включает элемент контроля экспрессии в одном или более, выбранных из 5' конца полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и 5' конца полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту, и в котором происходит редактирование генома, на целевом сайте и ii) имплантацию эмбриона суррогатной матери.

Типовой способ получения эмбриона может включать предоставление одного или более, выбранных из материалов и условий, которые влияют на элемент контроля экспрессии, в оплодотворенную яйцеклетку или эмбрион, имеющий геном, который включает целевой сайт, полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, которая может специфически связываться с целевым сайтом, и который включает элемент контроля экспрессии в одном или более, выбранных из 5' конца полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и 5' конца полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту. Дополнительно, получение эмбриона может дополнительно включать предоставление донорного полинуклеотида в клетку.

Донорный полинуклеотид может быть представлен одновременно с одним или более, выбранными из материалов и условий, которые влияют на элемент контроля экспрессии.

Другой типовой способ получения эмбриона может включать i) получение трансгенной донорной клетки, имеющей геном который включает целевой сайт, полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, которая может специфически связываться с целевым сайтом и который включает элемент контроля экспрессии в одном или более, выбранных из 5' конца полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и 5' конца полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту; и ii) имплантацию ядра трансгенной донорной клетки в энуклеированный ооцит.

Получение трансгенной донорной клетки может включать предоставление одного или более, выбранных из материалов и условий, которые влияют на элемент контроля экспрессии, в клетку, имеющую геном, который включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, которая может специфически связываться с целевым сайтом и который включает элемент контроля экспрессии в одном или более, выбранных из 5' конца полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и 5' конца полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту. Дополнительно, получение трансгенной донорной клетки может дополнительно включать предоставление донорного полинуклеотида в клетку.

Один способ получения животного, которое имеет геном, в котором происходит второе редактирование генома согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, может включать инъекцию “элемента для второго редактирования генома”, описанного выше, в ткань животного. Животное, полученное способом инъекции в ткань, описанным выше, может быть химерным животным.

Один способ получения животного, которое имеет геном, в котором происходит второе редактирование генома согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, может включать естественное скрещивание самца, который имеет яички, включающие “клетку второго редактирования генома”, или самки, которая имеет яичники, включающие “клетку второго редактирования генома”.

Например, естественное скрещивание может быть проведено между самцом, который имеет яички, включающие “клетку второго редактирования генома” и самки, которая имеет яичники, включающие “клетку второго редактирования генома”.

В другом примере, естественное скрещивание может быть проведено между самцом, который имеет яички, включающие “клетку второго редактирования генома” и самкой дикого типа (WT), или между самцом дикого типа (WT) и самкой, которая имеет яичники, включающие “клетку второго редактирования генома”.

3. Второе редактирование генома с применением инструмента, который включает полинуклеотид, имеющий PAM последовательность

Далее описано второе редактирование генома в полинуклеотиде, имеющем PAM последовательность, включенного в инструмент, вставленный в геном. Второе редактирование генома может быть нокином донорного полинуклеотида.

То есть, инструмент, включающий полинуклеотид, имеющий PAM последовательность, искусственно вставленную в геном, может функционировать в качестве целевого сайта, который позволяет редактирование генома.

Как описано выше, инструмент может быть расположен в убежище и таким образом, проведение редактирования генома в инструменте может не влиять на экспрессию белка или РНК в геноме в клетке.

3-1. Инструмент, включающий полинуклеотид, имеющий PAM последовательность

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления по настоящему раскрытию, может быть представлен инструмент, включающий первую ITR последовательность, полинуклеотид, имеющий PAM последовательность, и вторую ITR последовательность.

Инструмент может дополнительно включать полинуклеотид, кодирующий компоненты сконструированной нуклеазы. Например, инструмент может дополнительно включать один или более, выбранных из полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту.

Далее описаны некоторые типовые варианты осуществления полинуклеотида, имеющие PAM последовательность.

Например, полинуклеотид, имеющий PAM последовательность, может включать маркерный ген, подробности маркерного гена описаны выше и здесь опущены.

В другом примере, полинуклеотид, имеющий PAM последовательность, может включать полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу и/или полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту.

В еще одном примере, полинуклеотид, имеющий PAM последовательность, может включать полинуклеотид, который не включает инициирующий кодон (AUG). Когда полинуклеотид, имеющий PAM последовательность, не включает инициирующий кодон (AUG), РНК или белок, которые транскрибированы и/или транслированы полинуклеотидом, искусственно вставленным в геном, могут отсутствовать.

То есть, когда полинуклеотид, вставленный извне, не включает инициирующий кодон (AUG), РНК или белок не экспрессируются, и поэтому возникает преимущество в том, что полинуклеотид, вставленный извне, может применяться в качестве сайта, расщепляемого сконструированной нуклеазой, сохраняя внутриклеточную стабильность.

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления по настоящему раскрытию, множество полинуклеотидов, имеющих PAM последовательность (далее, искусственный сайт редактирования) могут быть включены в один инструмент.

В настоящем документе термин “искусственный сайт редактирования” относится к полинуклеотиду, имеющему PAM последовательность, присутствующему в инструменте, и искусственный сайт редактирования может быть включен в геном и функционировать в качестве целевого сайта, на котором может происходить редактирование генома.

Например, два искусственных сайта редактирования могут быть включены в один инструмент. То есть, первый искусственный сайт редактирования и второй искусственный сайт редактирования могут быть включены в один инструмент.

Последовательность первого искусственного сайта редактирования может быть такая же, как для второго искусственного сайта редактирования.

Последовательность первого искусственного сайта редактирования может отличаться от второго искусственного сайта редактирования.

В другом примере, три или более искусственных сайтов редактирования могут быть включены в один инструмент. Однако для удобства объяснения, объяснение будет представлено для варианта, где два искусственных сайта редактирования могут быть включены в один инструмент.

Объяснения ниже (объяснения для варианта, где количество искусственных сайтов редактирования равно двум) могут применяться для взаимоотношений между двумя искусственными сайтами редактирования, произвольно выбранными из n искусственных сайтов редактирования, даже если чисто искусственных сайтов редактирования равно n (n является натуральным числом 3 или более).

ФИГ. 11 иллюстрирует некоторые варианты осуществления инструмента, который включает полинуклеотид, имеющий PAM последовательность.

ФИГ. 11(a) иллюстрирует инструмент (140(a)), в котором один полинуклеотид, имеющий PAM последовательность (203), включен между первой ITR последовательностью (201) и второй ITR последовательностью (207).

ФИГ. 11(b) иллюстрирует инструмент (140(b)), в котором первый искусственный сайт редактирования (205) и второй искусственный сайт редактирования (206) включены между первой ITR последовательностью (201) и второй ITR последовательностью (207). В частности, последовательность первого искусственного сайта редактирования (205) может быть такая же, как для второго искусственного сайта редактирования (206).

ФИГ. 11(c) иллюстрирует инструмент (140(c)), в котором первый искусственный сайт редактирования (202) и второй искусственный сайт редактирования (204) включены между первой ITR последовательностью (201) и второй ITR последовательностью (207). В частности, последовательность первого искусственного сайта редактирования (202) отличается от второго искусственного сайта редактирования (204).

Инструмент может быть вставлен геном или хромосому, и форма и способ вставки инструмента в геном или хромосому описаны выше, поэтому подробное объяснение опущено.

Далее описан способ второго редактирования генома в клетке, оплодотворенной яйцеклетке, эмбрионе или животном, имеющем геном, в который вставлен инструмент, включающий полинуклеотид, имеющий PAM последовательность, как описано выше, и форма генома, в котором происходит второе редактирование генома.

3-2. Способ второго редактирования генома в инструменте, включающем полинуклеотид, имеющий PAM последовательность

Далее описан способ второго редактирование генома в клетке, в которую вставлен инструмент, который включает полинуклеотид, имеющий PAM последовательность. Способ вставки инструмента, который включает полинуклеотид, имеющий PAM последовательность, в клетку может быть в достаточной степени объяснен способом вставки инструмента, описанным ранее, и его подробные детали здесь опущены.

Разные способы второго редактирования генома могут быть представлены согласно конструкции инструмента, вставленного в геном клетки.

Для удобства объяснения, далее, предполагается, что полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу в геноме, описан в нем.

Например, полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, может быть включен в инструмент, такой же, как инструмент, который включает полинуклеотид, имеющий PAM последовательность, или включен в инструмент, который отличается от инструмента, который включает полинуклеотид, имеющий PAM последовательность, и затем вставлен в геном. В другом примере, полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, может быть вставлен в геном не будучи включенным в компонент инструмента.

Далее, способ второго редактирования генома будет объяснен с применением инструмент а, иллюстрированного на ФИГ. 11(a).

ФИГ. 12 иллюстрирует способ второго редактирования генома с применением инструмента, иллюстрированного на ФИГ. 11(a).

Один способ второго редактирование генома в клетке, имеющей геном, в который вставлен инструмент (140(a)), включающий один полинуклеотид (203), имеющий PAM последовательность, может включать предоставление направляющей нуклеиновой кислоты и донорного полинуклеотида (232) в клетку.

Часть последовательности направляющей нуклеиновой кислоты могут быть такой же или комплементарной части последовательности полинуклеотида, имеющей PAM последовательность (203).

Существует множество способов предоставления направляющей нуклеиновой кислоты в клетку.

Например, направляющая нуклеиновая кислота может быть предоставлена в клетку введением полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту, в клетку. Полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, может быть введен в форме РНК, или может быть введен в плазмидный вектор или вирусный вектор и затем введен в клетку.

В другом примере, направляющая нуклеиновая кислота может быть предоставлена в клетку через экспрессию направляющей нуклеиновой кислоты из полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту, который включен в инструмент (140(a)) или инструмента, отличного от инструмента (140(a)). Дополнительно, направляющая нуклеиновая кислота может быть предоставлена в клетку через экспрессию направляющей нуклеиновой кислоты из полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту, который вставлен в геном.

В еще одном примере, в случае, когда направляющая нуклеиновая кислота включена в инструмент (140(a)) или инструмент, отличный от инструмента (140(a)), но обычно не экпрессируется вышеописанным элементом контроля экспрессии, направляющая нуклеиновая кислота может быть предоставлена в клетку обработкой материала и/или условий, которые влияют на элемент контроля экспрессии. Материал и/или условия, которые влияют на элемент контроля экспрессии, описаны выше, поэтому конкретные детали здесь опущены.

Существует множество способов доставки донорного полинуклеотида в клетку.

Например, донорный полинуклеотид может быть доставлен в клетку введением плазмидного вектора или вирусного вектора, который включает донорный полинуклеотид, в клетку.

Если направляющая нуклеиновая кислота предоставлена в клетку описанным выше способом, направляющая нуклеиновая кислота может взаимодействовать с РНК-направляемой эндонуклеазой, и направляющая нуклеиновая кислота и РНК-направляемая эндонуклеаза может образовывать комплекс в клетке.

Дополнительно, направляющая нуклеиновая кислота, доставленная в клетку, может специфически связывать полинуклеотид (203). РНК-направляемая эндонуклеаза может расщеплять полинуклеотид (203) в состоянии образования комплекса с направляющей нуклеиновой кислотой. В этом случае, донорный полинуклеотид (232), доставленный в клетку, может быть нокинирован в полинуклеотиде (203), и в результате, полинуклеотид (203) может быть разделен на две части (203(a) и 203(b)) (см. ФИГ. 12).

Далее будет объяснен способ второго редактирования генома с применением инструмента, иллюстрированного на ФИГ. 11(b).

ФИГ. 13 иллюстрирует способ второго редактирование генома с применением инструмента, иллюстрированного на ФИГ. 11(b).

Один способ второго редактирование генома в клетке, имеющей геном, в который вставлен инструмент (140(b)), включающий первый искусственный сайт редактирования (205) и второй искусственный сайт редактирования (206), может включать предоставление направляющей нуклеиновой кислоты и донорного полинуклеотида в клетку.

Как описано выше, первый искусственный сайт редактирования (205) и второй искусственный сайт редактирования (206) может включать одинаковую последовательность.

Часть последовательности направляющей нуклеиновой кислоты может быть такой же или комплементарной к последовательности первого искусственного сайта редактирования (205) и/или второго искусственного сайта редактирования (206).

Например, направляющая нуклеиновая кислота может быть предоставлена в клетку введением полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту, в клетку.

В другом примере, направляющая нуклеиновая кислота может быть предоставлена в клетку экспрессией направляющей нуклеиновой кислоты из полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту, которая включена в инструмент (140(b)) или инструмент, отличный от инструмента (140(b)).

В еще одном примере, в случае, когда направляющая нуклеиновая кислота включена в инструмент (140(b)) или инструмент, отличный от инструмента (140(b)), но обычно не экспрессируется вышеописанным элементом контроля экспрессии, направляющая нуклеиновая кислота может быть предоставлена в клетку обработкой материала и/или условий, которые влияют на элемент контроля экспрессии.

Существует множество способов доставки донорного полинуклеотида в клетку и эти способы описаны выше, и поэтому их конкретное объяснение здесь опущено.

Если направляющая нуклеиновая кислота предоставлена в клетку описанным выше способом, направляющая нуклеиновая кислота может взаимодействовать с РНК-направляемой эндонуклеазой и направляющей нуклеиновой кислотой, и РНК-направляемая эндонуклеаза может образовывать комплекс в клетке.

Дополнительно, направляющая нуклеиновая кислота, предоставленная в клетку, может специфически связывать первый искусственный сайт редактирования (205) и/или второй искусственный сайт редактирования (206). РНК-направляемая эндонуклеаза может расщеплять первый искусственный сайт редактирования (205) и/или второй искусственный сайт редактирования (206) в состоянии образования комплекса с направляющей нуклеиновой кислотой.

В этом случае, донорный полинуклеотид (232), введенный в клетку, может быть нокинирован в первом искусственном сайте редактирования (205) и/или второй искусственный сайт редактирования (206).

В результате, первый искусственный сайт редактирования (205) может быть разделен на первую область (205(a)) и вторую область (205(b)). Дополнительно, второй искусственный сайт редактирования (206) может быть разделен на первую область (206(a)) и вторую область (206(b)) (см. ФИГ. 13(b) - ФИГ. 13(d)).

В случае, когда донорный полинуклеотид (232) нокинирован и в первый искусственный сайт редактирования (205), и во второй искусственный сайт редактирования (206), боле высокий уровень полипептида может экспрессироваться в клетке, где нокинирован донорный полинуклеотид (232). Полипептидом может быть такой, который кодирован донорным полинуклеотидом (232) (см. ФИГ. 13).

Кроме того, способ второго редактирования генома будет объяснен с применением инструмент иллюстрирован на ФИГ. 11(c).

ФИГ. 14 иллюстрирует способ второго редактирования генома с применением инструмента, иллюстрированного на ФИГ. 11(c).

Один способ второго редактирование генома в клетке, имеющей геном, в который вставлен инструмент (140(c)), включающий первый искусственный сайт редактирования (202) и второй искусственный сайт редактирования (204), может включать предоставление первой направляющей нуклеиновой кислоты, второй направляющей нуклеиновой кислоты, первого донорного полинуклеотида (232(a)) и второго донорного полинуклеотида (232(b)) в клетку. Как описано выше, последовательность первого искусственного сайта редактирования (202) отличается от второго искусственного сайта редактирования (204).

В этом случае, часть последовательности первой направляющей нуклеиновой кислоты может быть такой же или комплементарной к части последовательности первого искусственного сайта редактирования (202). Часть последовательности второй направляющей нуклеиновой кислоты может быть такой же или комплементарной к части последовательности второго искусственного сайта редактирования (204).

Дополнительно, 5' конец и 3' конец первого донорного полинуклеотида (232(a)) может включать последовательность, такую же как часть последовательности первого искусственного сайта редактирования (202). Дополнительно, 5' конец и 3' конец второго донорного полинуклеотида (232(b)) может включать последовательность такую же, как часть последовательности второго искусственного сайта редактирования (204). То есть, 5' конец и 3' конец первого донорного полинуклеотида (232(a)) и второго донорного полинуклеотида (232(b)) может включать последовательность для гомологической рекомбинации.

Существует множество способов предоставления первой направляющей нуклеиновой кислоты и второй направляющей нуклеиновой кислоты в клетку.

Например, первая направляющая нуклеиновая кислота и вторая направляющая нуклеиновая кислота может быть предоставлена в клетку введением полинуклеотида, кодирующего первую направляющую нуклеиновую кислоту и/или вторую направляющую нуклеиновую кислоту в клетку.

В другом примере, первая направляющая нуклеиновая кислота и/или вторая направляющая нуклеиновая кислота может быть предоставлена в клетку экспрессией первой направляющей нуклеиновой кислоты и второй направляющей нуклеиновой кислоты из полинуклеотида, кодирующего первую направляющую нуклеиновую кислоту и/или вторую направляющую нуклеиновую кислоту, который включен в инструмент 140(c) или инструмент, отличный от инструмента 140(c). В этом случае, полинуклеотид, кодирующий первую направляющую нуклеиновую кислоту, и полинуклеотид, кодирующий вторую направляющую нуклеиновую кислоту, может быть включен в один и тот же или другой инструмент и затем предоставлен в клетку.

В еще одном примере, в случае, когда первая направляющая нуклеиновая кислота и/или вторая направляющая нуклеиновая кислота включена в инструмент 140(c) или инструмент, отличный от инструмента 140(c), но обычно не экспрессируется вышеописанным элементом контроля экспрессии, первая направляющая нуклеиновая кислота и/или вторая направляющая нуклеиновая кислота может быть предоставлена в клетку обработкой материала и/или условий, которые влияют на элемент контроля экспрессии. В этом случае, так же, полинуклеотид, кодирующий первую направляющую нуклеиновую кислоту, и полинуклеотид, кодирующий вторую направляющую нуклеиновую кислоту, может быть включен в один и тот же или другой инструмент и затем предоставлен в клетку.

Существует множество способов доставки первого донорного полинуклеотида и второго донорного полинуклеотида в клетку.

Например, первый донорный полинуклеотид и второй донорный полинуклеотид может быть доставлен в клетку введением вектора, включающего первый донорный полинуклеотид и второй донорный полинуклеотид, в клетку. В этом случае, первый и второй донорный полинуклеотид может быть включен в один и тот же вектор, и затем доставлен в клетку. Альтернативно, первый и второй донорный полинуклеотид может быть включен в разные векторы и затем доставлен в клетку. Вектором может быть плазмидный вектор или вирусный вектор.

Если первая направляющая нуклеиновая кислота и/или вторая направляющая нуклеиновая кислота предоставлены в клетку описанным выше способом, первая направляющая нуклеиновая кислота и/или вторая направляющая нуклеиновая кислота может взаимодействовать с РНК-направляемой эндонуклеазой, и первая направляющая нуклеиновая кислота и/или вторая направляющая нуклеиновая кислота может образовывать комплекс с РНК-направляемой эндонуклеазой в клетке.

Первая направляющая нуклеиновая кислота, предоставленная в клетку, может специфически связывать первый искусственный сайт редактирования (202). РНК-направляемая эндонуклеаза может расщеплять первый искусственный сайт редактирования (202) в состоянии образования комплекса с первой направляющей нуклеиновой кислотой. В этом случае, первый донорный полинуклеотид (232(a)), предоставленный в клетку, может быть нокинирован в первом искусственном сайте редактирования (202).

Дополнительно, вторая направляющая нуклеиновая кислота, предоставленная в клетку, может специфически связывать второй искусственный сайт редактирования (204). РНК-направляемая эндонуклеаза может расщеплять второй искусственный сайт редактирования (204) в состоянии образования комплекса со второй направляющей нуклеиновой кислотой. В этом случае, второй донорный полинуклеотид (232(b)), предоставленный в клетку, может быть нокинирован во втором искусственном сайте редактирования (204).

В результате, первый искусственный сайт редактирования (202) может быть разделен на первую область (202(a)) и вторую область (202(b)). Дополнительно, второй искусственный сайт редактирования (204) может быть разделен на первую область (204(a)) и вторую область (204(b)) (см. ФИГ. 14 (b) - ФИГ. 14(d)).

Форма инструмента (140(c)), в котором происходит второе редактирование генома, может быть такой, где первый донорный полинуклеотид (232(a)) нокинирован в первом искусственном сайте редактирования (202) (см. ФИГ. 14(b)).

Дополнительно, другая форма инструмента (140(c)), в котором происходит второе редактирование генома, может быть такой, где второй донорный полинуклеотид (232(b)) нокинирован во втором искусственном сайте редактирования (204) (см. ФИГ. 14(c)).

Кроме того, форма инструмента (140(c)), в котором происходит второе редактирование генома, может быть такой, где первый донорный полинуклеотид (232(a)) нокинирован в первом искусственном сайте редактирования (202), и второй донорный полинуклеотид (232(b)) нокинирован во втором искусственном сайте редактирования (204) (см. ФИГ. 14(d)).

То есть, если второе редактирование генома происходит в инструменте (140(c)), первый донорный полинуклеотид (232(a)) и второй донорный полинуклеотид (232(b)), которые имеют последовательности, отличные друг от друга, могут быть нокинированы в первый искусственный сайт редактирования (202) и второй искусственный сайт редактирования (204), соответственно. В этом случае, первый полипептид и второй полипептид могут быть экспрессированы в клетке, где нокинированы первый и второй донорный полинуклеотид (232). Первым полипептидом может быть такой, который кодирован первым донорным полинуклеотидом (232(a)), и вторым полипептидом может быть такой, который кодирован вторым донорным полинуклеотидом (232(b)).

В отличие от примеров, описанных выше, если полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, не вставлен в геном клетки, второе редактирование генома может проводиться дополнительным предоставлением РНК-направляемой эндонуклеазы в клетку.

Существует множество способов доставки РНК-направляемой эндонуклеазы в клетку.

Например, РНК-направляемая эндонуклеаза может быть доставлена в клетку введением РНК-направляемой эндонуклеазы в виде белка в клетку. Дополнительно, РНК-направляемая эндонуклеаза может быть доставлена в клетку введением полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, в клетку. Введение полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, в клетку может включать введение полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, в плазмидный вектор или вирусный вектор и затем введение в клетку.

Как описано выше, один способ второго редактирования генома в изолированной клетке может включать способ прямой доставки РНК, плазмидного вектора, полипептида и/или белка, описанного выше, в изолированную клетку.

Кроме того, один способ второго редактирование генома в не изолированной клетке может включать способ инъекции РНК, плазмидного вектора, полипептида и/или белка, описанных выше, в ткань или орган индивида.

Кроме того, один способ второго редактирование генома в оплодотворенной яйцеклетке и/или эмбрионе может включать способ микроинъекции РНК, плазмидного вектора, полипептида и/или белка в оплодотворенную яйцеклетку животного пронуклеар в состоянии 1-клеточной стадии.

Далее описан эффект проведения второго редактирования генома в инструменте, который включает полинуклеотид, имеющий PAM последовательность.

Эффекты второго редактирования генома могут варьироваться в соответствии с типами полинуклеотида, включающего PAM последовательность, включенную в инструмент, представленными в некоторых типовых вариантах осуществления, раскрытых в настоящем раскрытии.

Например, если полинуклеотидом, включающим PAM последовательность, является маркерный ген, если донорный полинуклеотид нокинирован в полинуклеотиде, который включает PAM последовательность в качестве целевого сайта, полинуклеотид, кодированный маркерным геном, не может быть экспрессирован в клетке. Благодаря такой характеристике может быть выбрана клетка, в которой донорный полинуклеотид нокинирован в геноме. Подробности выбора клеток, в которых происходит редактирование генома, с применением маркерного гена, будут описаны ниже.

В другом примере, если полинуклеотидом, включающим PAM последовательность, является полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, если донорный полинуклеотид нокинирован в полинуклеотиде, который включает PAM последовательность в качестве целевого сайта, полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу не может быть экспрессирован в клетке.

В этом случае, целевым сайтом может быть такой, который расщепляется с применением РНК-направляемой эндонуклеазы, которая экспрессируется транскрипцией и трансляцией полинуклеотида, который включает PAM последовательность, и такой, в котором нокинирован донорный полинуклеотид. Преимущество заключается в том, что нежелательное дополнительное редактирование генома не происходит после нокина донорного полинуклеотида, потому что РНК-направляемая эндонуклеаза больше не экспрессируется в клетке.

Далее будет описано конструирование эмбриона или животного, в котором происходит второе редактирование генома, и которое получают с применением клетки, оплодотворенной яйцеклетки, эмбриона или животного, где вышеописанный инструмент, включающий полинуклеотид, имеющий PAM последовательность, вставлен в геном, и способ его получения.

3-3. Трансгенный эмбрион и животное, в котором происходит второе редактирование генома, в инструменте, включающем полинуклеотид, имеющий PAM последовательность

3-3-1. Трансгенный эмбрион, в котором происходит второе редактирование генома в инструменте, включающем полинуклеотид, имеющий PAM последовательность

3-3-1-1. Конструирование трансгенного эмбриона, в котором происходит второе редактирование генома в инструменте, включающем полинуклеотид, имеющий PAM последовательность

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления по настоящему раскрытию, может быть представлен трансгенный эмбрион, где трансгенный эмбрион включает один или более из клеток второго редактирования генома (далее, “PAM клетки второго редактирования генома”), имеющих геном, в котором происходит второе редактирование генома, в полинуклеотиде, имеющем PAM последовательность, включенном в инструмент.

Дополнительно, в настоящем документе термин “PAM клетка без второго редактирования генома” относится к клетке, которая включает геном, в котором второе редактирование генома не происходит в полинуклеотиде, имеющем PAM последовательность,.

Однако в настоящем раскрытии, термин “PAM клетка без второго редактирования генома” просто относится к клетке, имеющей геном, в котором второе редактирование генома не происходит, и также может соответствовать любой клетке, имеющей геном, в котором вышеописанное второе редактирование генома не происходит, и в которую вставлен инструмент (100). То есть, за исключением случая, когда второе редактирование генома не происходит в полинуклеотиде, имеющем PAM последовательность, любая клетка, имеющая геном с другой манипуляцией с генами, также может стать «PAM клеткой без второго редактирования генома» в соответствии с настоящим раскрытием.

Трансгенный эмбрион, включающий “PAM клетку второго редактирования генома”, может быть химерным или гомологичным.

Гомологичный эмбрион может относиться к трансгенному эмбриону, который имеет только “PAM клетку второго редактирования генома”.

Химерный эмбрион может относиться к трансгенному эмбриону, который имеет “PAM клетку без второго редактирования генома”, в дополнение к “PAM клетке второго редактирования генома”.

Далее будет описан способ получения трансгенного эмбриона, который включает одну или более клеток, которые имеют геном, в котором происходит второе редактирование генома, в полинуклеотиде, имеющем PAM последовательность, который вставлен в геном.

3-3-1-2. Способ получения трансгенного эмбриона, в котором происходит второе редактирование генома в инструменте, включающем полинуклеотид, имеющий PAM последовательность

Один способ получения оплодотворенной яйцеклетки или эмбриона, имеющего геном, в котором происходит второе редактирование генома, в полинуклеотиде, имеющем PAM последовательность, включенном в инструмент, может включать микроинъекцию (MI) “элемента для второго редактирования генома” в оплодотворенную яйцеклетку или эмбрион, имеющей геном, в который вставлен полинуклеотид, имеющий PAM последовательность.

В настоящем документе термин “элемент для второго редактирования генома” относится к элементу, предоставляемому в клетку, эмбрион или животное для проведения второго редактирования генома в геноме. Например, “элементом для второго редактирования генома” может быть любой, выбранный из материала и/или условий, которые влияют на элемент контроля экспрессии, полинуклеотида, включающего сайт распознавания рекомбиназы (RRS), сайт-специфической рекомбиназы (SSR), РНК-направляемой эндонуклеазы, направляющей нуклеиновой кислоты и донорного полинуклеотида, но не ограничен ими.

Один способ получения оплодотворенной яйцеклетки или эмбриона, имеющего геном, в котором происходит второе редактирование генома в полинуклеотиде, имеющем PAM последовательность, включенном в инструмент, может включать ядерный транспорт соматической клетки (SCNT). Ядерный транспорт соматической клетки (SCNT) может включать трансплантацию ядра клетки в полинуклеотид, имеющий PAM последовательность, полученный вышеописанным способом, в котором происходит второе редактирование генома, в энуклеированную яйцеклетку.

3-3-2. Трансгенный эмбрион, в котором происходит второе редактирование генома в инструменте, включающем полинуклеотид, имеющий PAM последовательность

3-3-2-1. Конструирование трансгенного эмбриона, в котором происходит второе редактирование генома в инструменте, включающем полинуклеотид, имеющий PAM последовательность

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления по настоящему раскрытию, может быть представлено трансгенное животное, где трансгенное животное включает одну или более PAM клеток второго редактирования генома, которые имеют геном, в котором происходит второе редактирование генома, в полинуклеотиде, имеющем PAM последовательность, включенном в инструмент.

Трансгенное животное, включающее “PAM клетку второго редактирования генома”, может быть химерным животным или гомологичным животным.

Гомологичное животное может относиться к трансгенному животному, которое имеет только “PAM клетку второго редактирования генома”.

Химерное животное может относиться к трансгенному животному, которое имеет “PAM клетку без второго редактирования генома” в дополнение к “PAM клетке второго редактирования генома”.

Далее будет описан способ получения трансгенного животного, которое включает одну или более клеток, имеющих геном, в которых происходи второе редактирование генома в полинуклеотиде, имеющем PAM последовательность, включенном в инструмент, который вставлен в геном.

3-3-2-2. Способ получения трансгенного животного, в котором происходит второе редактирование генома в инструменте, включающем полинуклеотид, имеющий PAM последовательность

Один способ получения животного, включающего “PAM клетку второго редактирования генома” согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, может включать трансплантацию оплодотворенной яйцеклетки или эмбриона, имеющего геном в котором происходит второе редактирование генома в полинуклеотиде, имеющем PAM последовательность, полученном вышеописанным способом, в матку суррогатной матери.

Например, как описано выше, животное которое включает “PAM клетку второго редактирования генома”, может быть получено имплантацией оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона, полученного микроинъекцией (MI) “элемента для второго редактирования генома”, в матку суррогатной матери. В этом случае, полученное животное может быть химерным или гомологичным.

В другом примере, как описано выше, животное, включающее “PAM клетку второго редактирования генома”, может быть получено имплантацией оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона, полученного ядерным транспортом соматической клетки (SCNT) с применением “PAM клетки второго редактирования генома”, в матку суррогатной матери. В этом случае, полученное животное может быть гомологичным.

Один способ получения животного, включающего “PAM клетку второго редактирования генома”, согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, может включать инъекцию вышеописанного “элемента для второго редактирования генома” в ткань животного, имеющего геном, в который вставлен полинуклеотид, имеющий PAM последовательность. Животное, полученное способом инъекции в ткань, может быть химерным животным.

Один способ получения животного, включающего “PAM клетку второго редактирования генома”, согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, может включать естественное скрещивание между самцом, который имеет яички, включающие “PAM клетку второго редактирования генома” и/или самкой, которая имеет яичники, включающие “PAM клетку второго редактирования генома”.

Например, естественное скрещивание может проводиться между самцом, который имеет яички, включающие “PAM клетку второго редактирования генома” и самкой, которая имеет яичники, включающие “PAM клетку второго редактирования генома”.

В другом примере, естественное скрещивание может проводиться между самцом, который имеет яички, включающие “PAM клетку второго редактирования генома” и самкой дикого типа; или между самцом дикого типа и самкой, которая имеет яичники, включающие “PAM клетку второго редактирования генома”.

4. Аспекты применения трансгенного животного, включающего клетку, имеющую геном, в котором произошло второе редактирование генома

Далее описаны аспекты применения трансгенного животного, включающего одну или более из вышеописанных “клеток второго редактирования генома” и/или “PAM клеток второго редактирования генома”.

“Вторым редактированием генома” может быть любое или более, выбранных из редактирования генома с применением сайта распознавания рекомбиназы (RRS), редактирования генома с применением сконструированной нуклеазы, которая экспрессируется из инструмента, который не включает элемент контроля экспрессии, редактирования генома с применением сконструированной нуклеазы, которая экспрессируется из инструмента, который включает элемент контроля экспрессии, и редактирования генома в инструменте, который включает полинуклеотид, имеющий PAM последовательность, которые описаны выше, но не ограничено ими.

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, один аспект применения трансгенного животного может включать биореакторы, животных с улучшенными свойствами, резистентных к заболеванию животных и животные модели заболевания.

Например, в случае, когда “клетка второго редактирования генома” и/или “PAM клетка второго редактирования генома” является клеткой, где донорный полинуклеотид нокинирован геном, трансгенное животное может применяться в качестве биореактора.

В случае, когда трансгенным животным является большое животное, полипептид, который может экспрессироваться нокинированным донорным полинуклеотидом, может быть получен в большем масштабе.

Донорным полинуклеотидом может быть полинуклеотид, кодирующий человеческий альбумин, полинуклеотид, кодирующий человеческий интерлейкин-2, полинуклеотид, кодирующий человеческий эритропоэтин, полинуклеотид, кодирующий человеческий инсулин и полинуклеотид, кодирующий омега-3, но не ограничен ими.

Донорный полинуклеотид может быть в форме куда включены полинуклеотид, кодирующий целевой белок, и полинуклеотид, кодирующий линкер. В этом случае слитый белок, в который включены целевой белок и линкер, может экспрессироваться в клетке, имеющей геном, где донорный полинуклеотид нокинирован. Линкер в экспрессируемом слитом белке может быть расщеплен с получением целевого белка. Линкер был описан выше, поэтому его конкретные подробности здесь опущены.

Далее описан способ получения целевого белка из трансгенного животного, включающего клетку, которая имеет геном, в котором полинуклеотид, кодирующий целевой белок, и полинуклеотид, кодирующий линкер, нокинирован донорном полинуклеотиде.

ФИГ. 15 иллюстрирует способ, в котором полинуклеотид, кодирующий целевой белок, и полинуклеотид, кодирующий линкер, нокинированы в донорном полинуклеотиде, и целевой белок продуцируется из трансгенного животного, включающего клетку, в которой донорный полинуклеотид нокинирован.

ФИГ. 15(a) иллюстрирует вектор, включающий донорный полинуклеотид (150) и промотор (145) и целевой сайт (142), которые присутствуют в геноме животного.

ФИГ. 15(b) иллюстрирует форму, в которой донорный полинуклеотид (150) нокинирован в целевом сайте (142).

ФИГ. 15(c) иллюстрирует слитый белок (160), который экспрессируется в клетке, эмбрионе или животном, в котором донорный полинуклеотид (150) нокинирован.

ФИГ. 15(d) иллюстрирует форму, в которой инсулин (148) получают из слитого белка (160).

Далее, принимают, что донорный полинуклеотид (150) включает полинуклеотид (143), кодирующий человеческий инсулин, и полинуклеотид, кодирующий линкер (141).

Когда направляющая нуклеиновая кислота и РНК-направляемая эндонуклеаза предоставлены в клетку, направляющая нуклеиновая кислота и РНК-направляемая эндонуклеаза взаимодействуют с образованием комплекса в клетке, и комплекс сконструированной нуклеазы может расщеплять полинуклеотид (142), который имеет последовательность, такую же или комплементарную части направляющей нуклеиновой кислоты. Если донорный полинуклеотид (150) предоставлен в клетку, донорный полинуклеотид (150) может быть нокинирован в полинуклеотиде (142) (см. ФИГ. 15(a)). Формой, где донорный полинуклеотид (150) нокинирован, является форма, где донорный полинуклеотид (150) включен между первой областью (142(a)) и второй областью (142(b)), которые получены расщеплением полинуклеотида (142).

Способ получения направляющей нуклеиновой кислоты и РНК-направляемой эндонуклеазы в клетку описан выше, и поэтому конкретные подробности по этому поводу здесь опущены.

На основе описания выше, слитый белок (160) может быть экспрессирован из животного, которое включает одну или более клеток, имеющих геном, в котором донорный полинуклеотид (150) нокинирован. Слитый белок (160) может быть в форме, куда включены полипептид (144), кодированный первой областью (142(a)) полинуклеотида, линкер (146) и человеческий инсулин (148). Слитый белок (160) может быть получен из животного и очищен (см. ФИГ. 15(c)), и человеческий инсулин (148) может быть получен расщеплением линкера (146), присутствующего в полученном и/или очищенном слитом белке (160) (см. ФИГ. 15 (d)).

Как описано выше, слитый белок, включающий человеческий инсулин, может экспрессироваться в теле животного с применением донорного полинуклеотида, имеющего конструкцию, в которую включены полинуклеотид, кодирующий человеческий инсулин, и полинуклеотид, кодирующий линкер, и поэтому гипогликемический шок может не происходить в теле животного из-за маленького размера человеческого инсулина.

В другом примере, если “клеткой второго редактирования генома” и/или “PAM клеткой второго редактирования генома” является клетка, имеющая геном, в котором нокаутирован экзополинуклеотид и/или эндополинуклеотид, трансгенное животное может применяться в качестве животного с улучшенными свойствами, резистентного к заболеванию животного или животной модели заболевания, но не ограничено ими.

Животное с улучшенными свойствами может относиться к животному, где нокаутирован полинуклеотид, кодирующий сывороточный белок, или животному, где вставлен или нокинирован полинуклеотид, кодирующий целевой белок.

Более конкретно, животные с улучшенными свойствами могут относиться к животному, где нокаутирован полинуклеотид, кодирующий сывороточный белок. Сывороточным белком может быть бета-лактоглобулин, альфа-лактоглобулин и альбумин бычьей сыворотки, но не ограничен ими. Если сывороточным белком является бета-лактоглобулин, бета-лактоглобулин, который специалистам в данной области известен как основной фактор, вызывающий аллергию, может не содержаться в молоке животного.

Более конкретно, животные с улучшенными свойствами могут относиться к животному, где вставлен или нокинирован полинуклеотид, кодирующий целевой белок. Целевым белком может быть полинуклеотид, кодирующий человеческий альбумин, полинуклеотид, кодирующий человеческий интерлейкин-2, полинуклеотид, кодирующий человеческий эритропоэтин, полинуклеотид, кодирующий человеческий инсулин и полинуклеотид, кодирующий омега-3, но не ограничен ими.

Более конкретно, резистентное к заболеванию животное может относиться к резистентному к инфекционному заболеванию животному или корове с профилактикой синдрома коровьего бешенства (губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота). Инфекционным заболеванием может быть трипаносомоз, но не ограничено ими. Коровой с профилактикой синдрома коровьего бешенства (губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота) может быть корова, которая включает клетку, имеющую геном, в котором нокаутирован полинуклеотид, кодирующий прионный белок.

Более конкретно, животной моделью заболевания может быть животная модель опухоли. Животная модель опухоли может быть животным, которое включает клетку, имеющую геном, в котором нокаутирован ген-супрессор опухоли. Например, геном-супрессором опухоли может быть RB1 ген, p53 ген, pVHL ген, APC ген, ST5 ген, YPEL3 ген, ST7 ген и ST14 ген, но не ограничен ими.

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, один аспект применения трансгенного животного, которое включает одну или более из “клетки второго редактирования генома” и/или “PAM клетки второго редактирования генома”, может включать получение гаметы или оплодотворенной яйцеклетки (и/или эмбриона), имеющего геном, в котором происходит второе редактирование генома, из трансгенного животного. В этом случае, гаметой может быть сперматозоид или яйцеклетка.

Потомство, включающее “клетку второго редактирования генома” и/или ”PAM клетку второго редактирования генома” может быть получено оплодотворением гаметы, которая имеет геном, в котором происходит второе редактирование генома, другой гаметой, которая имеет дикий тип (WT) или имеет геном, в котором происходит второе редактирование генома.

В случае, когда оплодотворенную яйцеклетку (и/или эмбрион), который имеет геном, в котором происходит второе редактирование генома, имплантируют в матку суррогатной матери, может быть получен индивид и/или потомство, включающее “клетку второго редактирования генома”.

[Выбор трансформированной клетки с применением инструмента]

1. Выбор трансформированной клетки с применением инструмента, включающего ген флуоресцентного белка

1-1. Структура генома, в который вставлен инструмент, включающий ген флуоресцентного белка

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, может быть представлен инструмент, включающий ген флуоресцентного белка (далее, флуоресцентный инструмент).

Флуоресцентным инструментом может быть структура, в которой ген флуоресцентного белка включен между полинуклеотидом, кодирующим первую ITR последовательность, и полинуклеотидом, кодирующим вторую ITR последовательность.

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в данном раскрытии, может быть представлена клетка, включающая геном, в который вставлен флуоресцентный инструмент. В частности, место и количество флуоресцентных инструментов, вставленных в клетку, могут вариьроваться. Клеткой может быть соматическая клетка, гамета или стволовая клетка.

Дополнительно, согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в данном раскрытии, может быть представлена оплодотворенная яйцеклетка и/или эмбрион, включающий геном, в который вставлен флуоресцентный инструмент. В частности, по меньшей мере, одни клетки, которые составляют оплодотворенную яйцеклетку и/или эмбрион, должны включать флуоресцентный инструмент, и среди вышеперечисленных клеток, количество клеток, которые включают флуоресцентный инструмент, не ограничено.

Способ получения клетки, оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона, в который вставлен флуоресцентный инструмент, аналогичен описанному выше способу получения клетки, в которую вставлен инструмент, и поэтому конкретные объяснения по этому поводу здесь опущены.

Флуоресцентный белок может быть экспрессирован в клетке, оплодотворенной яйцеклетке и/или эмбрионе, имеющем геном, в который вставлен флуоресцентный инструмент в соответствии с механизмом экспрессии. Флуоресценция может развиваться из клетки через экспрессию флуоресцентного белка, и сигнал флуоресценции может быть обеспечен вне клетки в соответствии с развитием флуоресценции.

С применением сигнала флуоресценции, предоставленного вне клетки, клетка, оплодотворенная яйцеклетка и/или эмбрион, имеющей геном, в который вставлен флуоресцентный инструмент, могут быть отделены от эмбриона и/или оплодотворенной яйцеклетки, в которые флуоресцентный инструмент не вставлен.

Если клетка, в которую вставлен инструмент представленный в данном раскрытии, получена, и описанный выше флуоресцентный инструмент используется, когда клетка, эмбрион и/или оплодотворенная яйцеклетка, в которые вставлен инструмент, должны быть точно отобраны, клетку, эмбрион и/или оплодотворенную яйцеклетку, в которые вставлен инструмент, легко отличить.

Дополнительно, в клетке имеющей геном, в который вставлено ‘n+1’ (n является натуральным числом 1 или более) флуоресцентных инструментов, более высокий уровень флуоресцентного белка может экспрессироваться по сравнению с клеткой, имеющей геном, в который вставлено ‘n’ флуоресцентных инструментов. То есть, сигнал флуоресценции, предоставленный в клетке, имеющей геном, в который вставлено ‘n+1’ (n является натуральным числом 1 или более) флуоресцентных инструментов, может быть больше, чем сигнал флуоресценции, предоставленный в клетке, имеющей геном, в который вставлено ‘n’ флуоресцентных инструментов.

В этом случае, клетка, в которую вставлен флуоресцентный инструмент, может быть более точно выбрана выбором клетки, которая дает больший сигнал флуоресценции.

Кроме того, в случае первого эмбриона, где количество флуоресцентных инструментов, включенных в геном всей клетки, составляющей эмбрион, равно ‘n+1’, может экспрессироваться большее количество флуоресцентного белка по сравнению с тем, которое экспрессируется во втором эмбрионе, где количество флуоресцентных инструментов, включенных в геном всей клетки, составляющей эмбрион, равно ‘n’. То есть, визуальный сигнал, предоставляемый первым эмбрионом, может быть больше, чем визуальный сигнал, предоставляемый вторым эмбрионом.

В этом случае эмбрион, в который вставлен флуоресцентный инструмент, можно более точно выбрать, выбрав первый эмбрион, который предоставляет больший сигнал флуоресценции.

Далее будет описан способ выбора клетки, эмбриона и/или оплодотворенной яйцеклетки, в которой обычно происходит второе редактирование генома, после второго редактирования генома с применением такого флуоресцентного инструмента.

1-2. Выбор трансформированной клетки с применением инструмента, включающего ген флуоресцентного белка

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в данном раскрытии, может быть представлен способ выбора трансформированной клетки, оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона, в котором происходит второе редактирование генома, после второго редактирования генома с применением флуоресцентного инструмента. Второе редактирование генома с применением флуоресцентного инструмента может включать нокинирование в донорный полинуклеотид, имея одну область гена флуоресцентного белка, включенного во флуоресцентный инструмент в качестве целевого сайта.

Например, второе редактирование генома, который имеет одну область гена флуоресцентного белка в качестве целевого сайта, может происходить в клетке, имеющей геном, в который вставлен один флуоресцентный инструмент. В этом случае, флуоресцентный белок не может быть экспрессирован в клетке. То есть, флуоресценция не может развиваться в клетке, где произошло второе редактирование генома, и в результате, никакой визуальный сигнал не может предоставляться вне клетки.

Поэтому, в соответствии с присутствием/отсутствием визуального сигнала, предоставляемого вне клетки, клетка, в которой происходит второе редактирование генома, может быть отделена от клетки, имеющей геном, в котором второе редактирование генома не происходит.

В другом примере, второе редактирование генома может происходить только в первом флуоресцентном инструменте в клетке имеющей геном, в который вставлен первый флуоресцентный инструмент и второй флуоресцентный инструмент. В этом случае, уровень флуоресцентного белка, экспрессированного в клетке, в которой происходит второе редактирование генома только в первом флуоресцентном инструменте (далее, первая клетка), может быть меньше по сравнению с клеткой, в которой не происходит второе редактирование генома, и в которую вставлен первый флуоресцентный инструмент и второй флуоресцентный инструмент. То есть, меньшее количество флуоресценции может развиться в первой клетке по сравнению с клеткой, в которой второе редактирование генома не происходит, и в результате, визуальный сигнал, предоставляемый вне первой клетки, может быть слабее.

Поэтому согласно интенсивности визуального сигнала, предоставляемого вне клетки, первая клетка, в которой происходит второе редактирование генома, может быть отделена от клетки, которая имеет геном, в которой второе редактирование генома не происходит.

Способ и механизм второго редактирования генома с применением флуоресцентного инструмента может быть объяснен через вышеописанный способ и механизм второго редактирования генома с применением инструмента, таким образом, его конкретные детали здесь опущены.

Вышеописанный способ выбора клетки, в которой происходит второе редактирование генома, может быть использован не только в изолированной клетке, но также и в не изолированной клетке, оплодотворенной яйцеклетке и/или эмбрионе.

Например, в случае эмбриона, где количество флуоресцентных инструментов, вставленных в геном всей клетки, которая составляет эмбрион, равно ‘n+2’ (n является натуральным числом 1 или более), второе редактирование генома может происходить только в ‘n’ флуоресцентных инструментах (далее, эмбрион, в котором второе редактирование генома происходит только в ‘n’ флуоресцентных инструментах, называют “первый эмбрион”).

Уровень флуоресцентного белка, экспрессированного в первом эмбрионе, может быть меньше по сравнению с эмбрион, который находится в состоянии, в котором второе редактирование генома не происходит, и в который вставлено ‘n+2’ флуоресцентных инструментов. То есть, меньшее количество флуоресценции может быть развито в первом эмбрионе по сравнению с эмбрионом, в котором второе редактирование генома не происходит, и в результате, визуальный сигнал, предоставляемый вне первого эмбриона, может быть слабым.

Поэтому, согласно интенсивности визуального сигнала, предоставленного вне эмбриона, первый эмбрион в котором происходит второе редактирование генома, может быть отделен от эмбриона, который имеет геном, в котором второе редактирование генома не происходит.

В еще одном примере, второе редактирование генома может происходить только в ‘n+1’ флуоресцентных инструментах в эмбрионе, который имеет геном, в который вставлены ‘n+2’ флуоресцентных инструмента. Далее, эмбрион в котором происходит второе редактирование генома только в ‘n+1’ флуоресцентных инструментах, называют “второй эмбрион”.

По сравнению с описанным выше первым эмбрионом, количество флуоресцентного белка, экспрессированного во втором эмбрионе, может быть меньше. То есть, по сравнению с первым эмбрионом, меньшее количество флуоресценции может развиться во втором эмбрионе, где второе редактирование генома произошло в большем количестве целевых сайтов, и в результате визуальный сигнал, предоставляемый вне второго эмбриона, может быть слабее.

В этом случае эмбрион, в котором происходит второе редактирование генома, можно более точно выбрать, выбрав второй эмбрион, который предоставляет более слабый сигнал флуоресценции.

2. Выбор трансформированной клетки с применением инструмента, включающего ген поверхностного белка

2-1. Структура генома, в который вставлен инструмент, включающий ген поверхностного белка

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления представленным в данном раскрытии, может быть представлен инструмент, включающий ген поверхностного белка (далее, поверхностный инструмент).

Поверхностный инструмент может иметь структуру, в которой ген поверхностного белка включен между полинуклеотидом, кодирующим первую ITR последовательность, и полинуклеотидом, кодирующим вторую ITR последовательность. Для удобства объяснения, далее принимается, что один поверхностный инструмент включает один ген поверхностного белка.

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в данном раскрытии, может быть представлена клетка, включающая геном, в который вставлен поверхностный инструмент. В частности, клеткой может быть соматическая клетка, гамета или стволовая клетка.

Дополнительно, согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в данном раскрытии, может быть представлена оплодотворенная яйцеклетка и/или эмбрион, включающий геном, в который вставлен поверхностный инструмент.

Поверхностный белок может быть экспрессирован в клетке, оплодотворенной яйцеклетке и/или эмбрионе, имеющем геном, в который вставлен поверхностный инструмент, согласно механизму внутриклеточной экспрессии. В этом случае, поверхностный белок может появляться на поверхности клетки, оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона.

С применением антител, которые могут взаимодействовать с поверхностным белком, клетка, оплодотворенная яйцеклетка и/или эмбрион, имеющие геном, в который вставлен поверхностный инструмент, могут быть отделены от клетки, оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона, имеющих геном, в который не вставлен поверхностный инструмент. В этом случае, антитела могут взаимодействовать с магнитными частицами или флуорофорами.

Следовательно, с применением магнитного свойства или сигнала флуоресценции, клетка, эмбрион и/или оплодотворенная яйцеклетка, имеющие геном, в который вставлен поверхностный инструмент, могут быть отделены от клетки, эмбриона и/или оплодотворенной яйцеклетки, имеющих геном, в который не вставлен поверхностный инструмент.

Если после получения клетки, в которую вставлен инструмент, представленный в данном раскрытии, описанный выше поверхностный инструмент используют, когда необходимо точно выбрать клетку, эмбрион и/или оплодотворенную яйцеклетку в которые вставлен инструмент, возможно легко выбрать клетку, эмбрион и/или оплодотворенную яйцеклетку с применением антител, которые могут взаимодействовать с поверхностным белком.

ФИГ. 16 иллюстрирует типовой вариант осуществления для выбора клетки, имеющей геном, в который вставлен поверхностный инструмент (320). Для удобства объяснения, клеткой считается изолированная клетка.

ФИГ. 16(a) иллюстрирует геном (310), в который не вставлен поверхностный инструмент. Поверхностный белок не экспрессируется на поверхности клетки (311), имеющей такой геном (310).

ФИГ. 16(b) иллюстрирует часть генома, в который вставлен поверхностный инструмент (320). Поверхностный инструмент (320) может иметь структуру, в которой ген поверхностного белка (325) включен между первой ITR последовательностью (322) и второй ITR последовательностью (329). Поверхностный белок (323) может экспрессироваться на поверхности клетки (321), имеющей такой геном.

ФИГ. 16(c) иллюстрирует способ с применением хроматографии для выбора клетки, в которой экспрессируется поверхностный белок, среди клеток, в которых экспрессируется поверхностный белок и клеток, в которых не экспрессируется поверхностный белок.

Когда клетки (311 и 321) переносятся для хроматографии, включающей антитело (324), чтобы выбрать клетку, имеющую геном, в который вставлен поверхностный инструмент, клетка (321), имеющая геном, в который вставлен поверхностный инструмент (320), может связываться с хроматографической колонкой за счет взаимодействия между антителом (324) и поверхностным белком (323). То есть, клетку (321), которая связана с хроматографической колонкой за счет взаимодействия между поверхностным белком (323) и антителом (324) (см. ФИГ. 16 (c)).

Далее описан способ выбора клетки, эмбриона и/или оплодотворенной яйцеклетки, в которых второе редактирование генома обычно проходит после второго редактирования генома с применением поверхностного инструмента.

2-2. Выбор трансформированной клетки с применением инструмента, включающего ген поверхностного белка

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в данном раскрытии, может быть представлен способ выбора трансформированной клетки, оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона, в которых происходит второе редактирование генома после второго редактирования генома с применением поверхностного инструмента. Второе редактирование генома с применением поверхностного инструмента может включать нокин в донорном полинуклеотиде гена поверхностного белка, который включен в поверхностный инструмент. Как описано выше, описание будет дано при условии, что один ген поверхностного белка включен в один поверхностный инструмент.

Например, второе редактирование генома, который имеет ген поверхностного белка в качестве целевого, может происходить в клетке, имеющей геном, в который вставлен один поверхностный инструмент.

В этом случае, поверхностный белок не может быть экспрессирован в клетке. То есть, поверхностный белок не может появляться на поверхности клетки, в которой происходит второе редактирование генома, и в результате, клетка, в которой происходит второе редактирование генома, не может взаимодействовать с антителом, которое может взаимодействовать с поверхностным белком.

Следовательно, в соответствии с присутствием/отсутствием взаимодействия между антителом и клеткой, клетка, имеющая геном, в котором происходит второе редактирование генома, может быть отделена от клетки, в которой второе редактирование генома не происходит.

Даже в случае клетки, имеющей геном, в который вставлены два или более поверхностных инструментов, как описано выше, клетка, в которой происходит второе редактирование генома, может быть отделена от клетки, в которой второе редактирование генома не происходит, в соответствии с присутствием/отсутствием взаимодействия между антителом и клеткой.

В этом случае, клетка, в которой происходит второе редактирование генома, может быть выбрана во всех поверхностных инструментах, вставленных в геном.

Способ и механизм второго редактирования генома с применением поверхностного инструмента могут быть объяснены описанными выше способом и механизмом редактирования второго генома с применением инструмента и, таким образом, конкретное объяснение по ним будет опущено.

Вышеописанный способ выбора клетки, в которой происходит редактирование генома, может быть использован не только в изолированной клетке, но также в не изолированной клетке, оплодотворенной яйцеклетке и/или эмбрионе.

Например, в случае, когда количество поверхностных инструментов, вставленных в геном всей клетки, составляющей эмбрион, равно ‘n’ или более (n является натуральным числом 2 или более), второе редактирование генома может происходить во всех ‘n’ поверхностных инструментах. В этом случае, поверхностный белок не может быть экспрессирован в эмбрионе, в котором происходит второе редактирование генома. То есть, поверхностный белок не может появляться на поверхности эмбриона в котором происходит второе редактирование генома, и в результате, эмбрион, в котором происходит второе редактирование генома, не может взаимодействовать с антителом, которое может взаимодействовать с поверхностным белком.

То есть, эмбрион, в котором происходит второе редактирование генома, может быть отделен от эмбриона, в котором второе редактирование генома не происходит, в соответствии с присутствием/отсутствием взаимодействия между антителом и клеткой. В этом случае, выбранный эмбрион может быть клеткой, в которой происходит второе редактирование генома во всех поверхностных инструментах, вставленных в геном всей клетки, которая составляет эмбрион.

ФИГ. 17 иллюстрирует типовой вариант осуществления выбора клетки, в которой происходит второе редактирование генома, в клетке имеющей геном, в который вставлен поверхностный инструмент (320). Для удобства объяснения, описание представлено на основе допущения, что клеткой является изолированная клетка.

ФИГ. 17(a) иллюстрирует геном и клетку (321) в случае, где второе редактирование генома не происходит в клетке, имеющей геном, в который вставлен поверхностный инструмент (320).

ФИГ. 17(b) иллюстрирует геном и клетку в случае, где второе редактирование генома происходит в клетке, имеющей геном, в который вставлен поверхностный инструмент (320).

В случае, где донорный полинуклеотид (232) нокинирован в поверхностном инструменте, который вставлен в геном клетки имеющей геном, в который вставлен поверхностный инструмент (320), и ген поверхностного белка (325) разделен на первую область (325(a)) и вторую область (325(b)), поверхностный белок (323) не экспрессируется на поверхности клетки (331).

ФИГ. 17(c) иллюстрирует способ с применением хроматографии так, чтобы выбрать клетку, в которой донорный полинуклеотид (232) нокинирован в поверхностном инструменте.

Когда клетка (331), где нокинирован донорный полинуклеотид (232) и клетка (321), где донорный полинуклеотид (232) не нокинирован, проходят хроматографию, в которую включено антитело (324), клетка (331), в которой нокинирован донорный полинуклеотид (232), не может быть связана с хроматографической колонкой. С применением этого свойства, возможно выбрать клетку, в которой происходит второе редактирование генома, через получение клетки (331), которая не связана с хроматографической колонкой (см. ФИГ. 17(c)).

3. Выбор трансформированной клетки с применением инструмента, включающего суицидальный ген

3-1. Структура генома, в который вставлен инструмент, включающий суицидальный ген

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в данном раскрытии, может быть представлен инструмент, включающий суицидальный ген (далее, суицидальный инструмент).

ФИГ. 18(a) иллюстрирует типовой вариант осуществления суицидального инструмента.

Согласно ФИГ. 18(a), суицидальный инструмент (340) может иметь структуру, в которой суицидальный ген (347) и элемент контроля экспрессии (345), способный контролировать экспрессию суицидального гена, включен между первой ITR последовательностью (343) и второй ITR последовательностью (349).

Для удобства объяснения, далее, описание представлено на основе допущения, что один суицидальный ген включен в один суицидальный инструмент. Дополнительно, описание представлено на основе допущения, что элементом контроля экспрессии (345) является Tet-on промотор, и суицидальным геном (347) ген тимидинкиназы.

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в данном раскрытии, может быть представлена клетка, включающая геном, в который вставлен суицидальный инструмент. В частности, клеткой может быть соматическая клетка, гамета или стволовая клетка.

Дополнительно, согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в данном раскрытии, может быть представлена оплодотворенная яйцеклетка и/или эмбрион, включающие геном, в который вставлен суицидальный инструмент.

Когда тетрациклином обрабатывают клетку (341), оплодотворенную яйцеклетку и/или эмбрион, имеющие геном, в который вставлен суицидальный инструмент (340), тимидинкиназа может быть экспрессирована в клетке, оплодотворенной яйцеклетке и/или эмбрионе, согласно механизму внутриклеточной экспрессии.

Когда пролекарство (например, ганцикловир) предоставляют в клетку, оплодотворенную яйцеклетку и/или эмбрион, а которых экспрессируется тимидинкиназа, часть клетки, оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона может быть апоптотизирована. Пролекарство может взаимодействовать с тимидинкиназой, и в результате, клетка, в которой экспрессируется тимидинкиназа, может быть апоптотизирована.

То есть, клетка, имеющая геном, в который вставлен суицидальный инструмент, может быть апоптотизирована обработкой материала и/или условий, которые влияют на элемент контроля экспрессии, и пролекарством.

Далее описан способ выбора клетки, эмбриона и/или оплодотворенной яйцеклетки, в которых второе редактирование генома обычно происходит после второго редактирования генома с применением суицидального инструмента.

3-2. Выбор трансформированной клетки с применением инструмента, включающего суицидальный ген

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в данном раскрытии, может быть представлен способ выбора трансформированной клетки, оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона, в котором происходит второе редактирование генома после второго редактирование генома, с применением суицидального инструмента. Второе редактирование генома с применением суицидального инструмента может включать нокин в донорном полинуклеотиде суицидального гена, который включен в суицидальный инструмент. Как описано выше, описание будет представлено на основе допущения, что один суицидальный ген включен в один суицидальный инструмент.

Второе редактирование генома может происходить в одной клетке, имеющей геном, в который вставлен суицидальный инструмент, имея часть суицидального гена в качестве целевого сайта. В частности, даже если полекарство предоставлено в клетку, в которой происходит редактирование генома, имея часть суицидального гена в качестве целевого сайта, клетка не апоптотизирована.

Поэтому, согласно присутствию/отсутствию апоптоза после обработки клетки тетрациклином и пролекарством, клетка, имеющая геном, в котором происходит второе редактирование генома, может быть отделена от клетки, имеющей геном, в котором второе редактирование генома не происходит.

То есть, клеткой, которая может выживать даже после обработки тетрациклином и пролекарством, может быть клеткой, имеющей геном, в котором происходит второе редактирование генома.

Даже в случае, клетки, имеющей геном, в который вставлены два или более суицидальных инструмента, как описано выше, клетка, имеющая геном, в котором происходит второе редактирование генома, может быть отделена от клетки, имеющей геном, в котором второе редактирование генома не происходит, в соответствии с присутствием/отсутствием апоптоза. В этом случае выбранная клетка может быть клеткой, в которой происходит второе редактирование генома во всех суицидальных инструментах, вставленных в геном.

Далее, согласно ФИГ. 18, будет представлено более конкретное описание в отношении присутствия/отсутствия апоптоза, когда донорный полинуклеотид нокинирован или не нокинирован в суицидальный ген, который включен в суицидальный инструмент.

ФИГ. 18 иллюстрирует типовой вариант осуществления относительно выбора клетки, в которой происходит второе редактирование генома, в клетке, имеющей геном, в который вставлен суицидальный инструмент (340). Для удобства объяснения, клетка принимается как изолированная клетка.

В случае, когда донорный полинуклеотид (232) нокинирован в суицидальном инструменте (340), который вставлен в геном клетки, суицидальный ген (347) может быть разделен на первую область (347(a)) и вторую область (347(b)). В частности, даже когда Tet-on промотор (345) действует через обработку тетрациклина на клетке (351), в которой нокинирован донорный полинуклеотид (232), тимидинкиназа не может быть экспрессирована в клетке. В этом случае, даже когда клетка снабжена пролекарством, клетка (351) не апоптотизируется (см. ФИГ. 18 (b)).

Между тем, в случае, когда донорный полинуклеотид не нокинирован в суицидальном инструменте (340), который вставлен в геном клетки, Tet-on промотор (345) может действовать через обработку клетки тетрациклином. Транскрипция и/или трансляция суицидального гена (347) может быть инициирована действием Tet-on промотора (345), и поэтому тимидинкиназа может экспрессироваться. Как только клетка, в которой экспрессируется тимидинкиназа, снабжается пролекарством, клетка может быть апоптотизирована.

В этом случае может быть получена клетка (351), которая не апоптотизирована, и в этом случае может быть выбрана клетка, в которой произошло второе редактирование генома (см. ФИГ. 18 (a)).

Вышеописанный способ выбора клетки, в которой происходит редактирование генома, может применяться не только к изолированной клетке, но также к неизолированной клетке, оплодотворенной яйцеклетке и/или эмбриону.

Например, когда количество суицидальных инструментов, вставленных в геном всей клетки, которая составляет эмбрион, равно ‘n’ или более (n является натуральным числом 2 или более), второе редактирование генома может происходить во всех ‘n’ суицидальных инструментах. В этом случае, даже если эмбрион обеспечен тетрациклином, тимидинкиназа не может быть экспрессирована в вышеописанном эмбрионе, в котором происходит второе редактирование генома. В частности, даже если эмбрион обеспечен пролекарством, клетка, которая составляет эмбрион, не апоптотизирована.

То есть, согласно присутствию/отсутствию апоптоза клетки, которая составляет эмбрион, эмбрион, в котором происходит второе редактирование генома, может быть отделен от эмбриона, в котором второе редактирование генома не происходит. В этом случае, могут быть выбраны эмбрионы, в которых происходит второе редактирование генома во всех поверхностных инструментах, вставленных в геном.

[Выбор пола с применением инструмента]

1. Выбор пола вставкой SRY гена и/или нокаутом SRY гена

Один способ выбора пола согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в данном раскрытии, может включать вставку SRY гена в геном или нокаут SRY гена из генома.

Далее описываются особи мужского пола, у которых SRY ген вставлен в геном, и способ получения особи мужского пола. Кроме того, описаны особи женского пола, у которых SRY ген нокаутирован из генома, и способ получения особи женского пола.

1-1. Получение особи мужского пола вставкой SRY гена

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, может быть представлен самец животного, имеющий XX хромосому, в которую вставлен SRY ген.

Например, может быть представлен самец животного, имеющий геном, в котором SRY ген вставлен в эндополинуклеотид.

В другом примере, может быть представлен самец животного, имеющий геном, в котором SRY ген вставлен в экзополинуклеотид. Экзополинуклеотид может присутствовать в инструменте или может присутствовать вне инструмента.

SRY ген может быть вставлен в геном разными механизмами.

Например, SRY ген может быть вставлен в геном в качестве компонента инструмента. Способ вставки SRY гена в качестве компонента инструмента, в геном клетки, оплодотворенной яйцеклетки (и/или эмбриона) и/или ткань может быть успешно объяснен вышеописанным способом вставки инструмента, поэтому его конкретное объяснение здесь опущено.

В другом примере, SRY ген может быть нокинирован в геном через комплекс сконструированной нуклеазы, которая экспрессируется из полинуклеотида, кодирующего сконструированную нуклеазу, вставленную в геном.

Один способ вставки SRY гена в геном клетки, оплодотворенной яйцеклетки (и/или эмбриона) и/или ткань через комплекс сконструированной нуклеазы включает предоставление донорного полинуклеотида, включающего SRY ген, в клетку, оплодотворенную яйцеклетку (и/или эмбрион) и/или ткань.

В еще одном примере, SRY ген может быть вставлен в геном с применением сайта распознавания рекомбиназы (RRS).

Один способ вставки SRY ген в геном клетки, оплодотворенной яйцеклетки (и/или эмбриона) и/или ткань через сайт распознавания рекомбиназы (RRS) включает предоставление SRY гена, сайта распознавания рекомбиназы (RRS) и сайт-специфической рекомбиназы (SSR) в клетку, оплодотворенную яйцеклетку (и/или эмбрион) и/или ткань. В этом случае, сайт-специфическая рекомбиназа (SSR) может взаимодействовать с сайтом распознавания рекомбиназы (RRS).

Способ получения инструмента, транспосазы, донорного полинуклеотида, сайта распознавания рекомбиназы (RRS), сайт-специфической рекомбиназы и т.д. в клетку, оплодотворенную яйцеклетку (и/или эмбрион) и/или ткань описан выше, поэтому его конкретное объяснение здесь опущено.

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, может быть представлен способ получения самца животного, имеющего XX хромосому, в которую вставлен SRY ген.

Например, один способ получения самца животного, имеющего XX хромосому, в которую вставлен SRY ген, может включать оплодотворением сперматозоида, имеющего X хромосому, в которую вставлен SRY ген, и яйцеклетки дикого типа.

Сперматозоид, имеющий X хромосому, в которую вставлен SRY ген, может быть получен от животного, имеющего репродуктивный орган (или репродуктивную ткань), имеющую геном, в который вставлен SRY ген.

В другом примере, один способ получения самца животного, имеющего XX хромосому, в которую вставлен SRY ген, может включать оплодотворение яйцеклетки, имеющей X хромосому, в которую вставлен SRY ген, и сперматозоида дикого типа.

Яйцеклетка, имеющая X хромосому, в которую вставлен SRY ген, может быть получена от животного, имеющего репродуктивный орган (или репродуктивную ткань), имеющей геном, в который вставлен SRY ген.

Дополнительно, в другом примере, один способ получения самца животного, имеющего XX хромосому, в которую вставлен SRY ген, может включать имплантацию оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона, имеющего XX хромосому, в которую вставлен SRY ген, в матку суррогатной матери.

Оплодотворенная яйцеклетка и/или эмбрион, имеющий XX хромосому, в которую вставлен SRY ген, может быть получена вышеописанным ядерным транспортом соматической клетки (SCNT) или микроинъекцией (MI).

Дополнительно, в другом примере, один способ получения самца животного, имеющего XX хромосому, в которую вставлен SRY ген, может включать инъекцию вышеописанного SRY инструмента, транспосазы, донорного полинуклеотида, сайта распознавания рекомбиназы (RRS) и/или сайт-специфической рекомбиназы (SSR), и т.д. в репродуктивный орган или репродуктивную ткань животного.

Сперматозоиды могут быть получены от самца животного, имеющего XX хромосому, полученную вышеописанным способом.

1-2. Получение особи женского пола нокаутом SRY гена

1-2-1. Получение особи женского пола нокаутом SRY гена

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, может быть представлена самка животного, имеющая XY хромосому, в которой нокаутирован SRY ген.

Далее будет описан инструмент для нокаута SRY ген и способ получения животного, имеющего геном, в котором нокаутирован SRY ген.

1-2-1-1. Инструмент для нокаута SRY ген

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, может быть представлен инструмент для нокаута SRY гена, присутствующего на Y хромосоме (далее, инструмент SRY нокаута).

Инструмент SRY нокаута может иметь состав, в котором полинуклеотид, кодирующий компонент сконструированной нуклеазы, включен между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью. Инструмент SRY нокаута может дополнительно включать элемент контроля экспрессии.

Например, инструмент SRY нокаута может иметь состав, в котором полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, включен между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью. В этом случае, часть последовательности направляющей нуклеиновой кислоты такая же или комплементарна части последовательности SRY гена.

В другом примере, инструмент SRY нокаута может иметь состав, в котором полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту включены между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью. Дополнительно, инструмент SRY нокаута может иметь состав, в котором дополнительно включен элемент контроля экспрессии, который контролирует транскрипцию и/или трансляцию полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и/или полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту. В этом случае, часть последовательности направляющей нуклеиновой кислоты является такой же или комплементарной к части последовательности SRY гена.

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в данном раскрытии, может быть представлена клетка, включающая геном, в который вставлен инструмент SRY нокаута. Клеткой может быть соматическая клетка, гамета или стволовая клетка.

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в данном раскрытии, может быть представлена оплодотворенная яйцеклетка и/или эмбрион, включающие геном, в который вставлен инструмент SRY нокаута.

ФИГ. 19(a) иллюстрирует типовой вариант осуществления генома, в который вставлен инструмент SRY нокаута (360).

Инструмент SRY нокаута (360) может иметь состав, в котором полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу (363), и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту (365) включены между первой ITR последовательностью (361) и второй ITR последовательностью (367). Часть последовательности направляющей нуклеиновой кислоты может быть такой же или комплементарной к части последовательности SRY гена.

Инструмент SRY нокаута (360) может включать полинуклеотид, кодирующий индуцируемый промотор (362) так, чтобы контролировать транскрипцию и/или трансляцию полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу (363). Для удобства объяснения, принято, что индуцируемым промотором является Tet-on промотор.

Дополнительно, инструмент SRY нокаута (360) может включать полинуклеотид, кодирующий промотор (364), для транскрипции полинуклеотида, кодирующего направляющую нуклеиновую кислоту (365).

Далее описан способ нокаута SRY гена в геноме, в который вставлен инструмент SRY нокаута, и способ получения самки животного, имеющей геном, в которой нокаутирован SRY ген.

1-2-1-2. Нокаут SRY гена с применением инструмента и способ получения особи женского пола, имеющей геном, в котором нокаутирован SRY ген

Далее представлены несколько способов нокаутирования SRY гена в геноме клетки. Для удобства объяснения принимается, что клеткой является изолированная клетка. Разные способы нокаута SRY гена могут быть представлены в соответствии с конструкцией SRY инструмента, вставленного в геном клетки.

Например, один способ нокаута SRY гена в клетке, имеющей геном, в который вставлен инструмент SRY нокаута, включающий полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, которая может специфически связывать SRY ген, может включать предоставление РНК-направляемой эндонуклеазы в клетку.

В другом примере, один способ нокаута SRY гена в клетке, имеющей геном, в который вставлен инструмент SRY нокаута, включающий полинуклеотид, кодирующий элемент контроля экспрессии, полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, которая может специфически связывать SRY ген, может включать предоставление условий и/или материала, которые влияют на элемент контроля экспрессии, в клетку.

Способ предоставления РНК-направляемой эндонуклеазы и/или материала, который влияет на элемент контроля экспрессии, в клетку, был описан выше, и поэтому его определенные объяснения будут здесь опущены.

Согласно ФИГ. 19, механизм, которым нокаутирован SRY ген, будет описан более конкретно.

ФИГ. 19(b) иллюстрирует форму генома, в котором SRY ген (400) нокаутирован в геноме, в который вставлен инструмент SRY нокаута (360).

В клетке, имеющей геном, в который включен инструмент SRY нокаута (360), направляющая нуклеиновая кислота может экспрессироваться в клетке через полинуклеотид, кодирующий промотор (364), и экспрессированная направляющая нуклеиновая кислота может комплементарно связываться с SRY геном (400), который является эндогенным геном, присутствующим в геноме клетки.

В случае, когда клетка, имеющая геном, в который вставлен инструмент SRY нокаута (360), обеспечена тетрациклином, может действовать Tet-on промотор (362), и в этом случае, РНК-направляемая эндонуклеаза может экспрессироваться в клетке. РНК-направляемая эндонуклеаза может расщеплять SRY ген (400) при этом образовывая комплекс с направляющей нуклеиновой кислотой.

То есть, SRY ген (400) может быть нокаутирован в геноме самца. В этом случае, SRY ген (400) может быть разделен на первую область (400(a)) и вторую область (400(b)).

В настоящем раскрытии представлен способ получения самки животного, которая имеет геном, в котором нокаутирован SRY ген.

Например, один способ получения самки животного, имеющей геном, в котором нокаутирован SRY ген, может включать оплодотворение сперматозоида, имеющего Y хромосому, в которой нокаутирован SRY ген, и яйцеклетки.

Сперматозоид, имеющий Y хромосому, в которой нокаутирован SRY ген, может быть получен от животного, имеющего репродуктивный орган (или репродуктивную ткань), имеющей геном, в который вставлен SRY ген. Дополнительно, яйцеклеткой может быть яйцеклетка дикого типа.

В другом примере, один способ получения самки животного, имеющей геном, в который нокаутирован SRY ген, может включать имплантацию оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона, имеющего XY хромосому, в которой нокаутирован SRY ген, в матку суррогатной матери.

Оплодотворенная яйцеклетка и/или эмбрион, имеющий XY хромосому, в котором нокаутирован SRY ген, может быть получен вышеописанным ядерным транспортом соматической клетки (SCNT) или микроинъекция (MI).

В еще одном примере, один способ получения самки животного, имеющей геном, в котором нокаутирован SRY ген, может включать инъекцию вышеуказанного элемента контроля экспрессии и РНК-направляемой эндонуклеазы в репродуктивный орган или репродуктивную ткань животного.

Молоко или яйца могут быть получены от самки животного, имеющей XY хромосому, полученную вышеописанным способом.

1-2-2. Получение особи женского пола нокином гена, повреждающего подвижность

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, подвижность сперматозоида, имеющего Y хромосому, может быть повреждена через нокин гена, повреждающего подвижность, и в этом случае, самка животного, имеющая XX хромосому, может быть представлен в относительно высокой вероятностью.

Далее будет описан инструмент для нокина гена, повреждающего подвижность, и способ получения сперматозоидов, имеющих геном, в котором нокинирован ген, повреждающий подвижность.

1-2-2-1. Инструмент для нокина гена, повреждающего подвижность

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, инструмент, который может применяться для нокина гена, повреждающего подвижность (далее, “Целевой инструмент Y хромосомы”), может быть представлен для полинуклеотида, который может присутствовать только в Y хромосоме.

Например, инструмент может иметь состав, в котором полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, включен между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью. В этом случае, полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, имеет последовательность, такую же или комплементарную части полинуклеотида, который может присутствовать только в Y хромосоме.

В другом примере, инструмент может иметь состав, в котором полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту включены между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью. Дополнительно, инструмент может иметь состав, в котором дополнительно включен элемент контроля экспрессии, который контролирует транскрипцию и/или трансляцию полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и/или полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту. В этом случае, часть последовательности направляющей нуклеиновой кислоты может быть такой же или комплементарной к части последовательности полинуклеотида, которая может присутствовать только в Y хромосоме.

Полинуклеотидом, который может присутствовать только в Y хромосоме, описанным в вышеописанных типовых вариантах осуществления, может быть SRY ген.

Инструмент, который может применяться для нокина гена, повреждающего подвижность, может быть вышеописанный инструмент SRY нокаута.

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления представленным в данном раскрытии, может быть представлена клетка, включающая геном, в который вставлен “целевой инструмент Y хромосомы”. Клеткой может быть соматическая клетка, гамета или стволовая клетка.

Дополнительно, согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в данном раскрытии, может быть представлена оплодотворенная яйцеклетка и/или эмбрион, включающие геном, в который вставлен “целевой инструмент Y хромосомы”.

1-2-2-2. Нокин гена, повреждающего подвижность, с применением инструмента и способ получения сперматозоида, в котором нокинирован ген, повреждающий подвижность

Далее представлено несколько способов нокина гена, повреждающего подвижность, в геноме клетки. Для удобства объяснения принимают, что клеткой является изолированная клетка. Разные способы нокина гена, повреждающего подвижность, могут быть представлены в соответствии с конструкцией “целевого инструмента Y хромосомы”, вставленного в геном клетки.

Например, один способ нокина гена, повреждающего подвижность, в геноме клетки, имеющей геном, в который вставлен “целевой инструмент Y хромосомы”, включающий полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, может включать предоставление РНК-направляемой эндонуклеазы и гена, повреждающего подвижность, в клетку.

В другом примере, один способ нокина гена, повреждающего подвижность, в геноме, клетки, имеющей геном, в который вставлен “целевой инструмент Y хромосомы”, включающий полинуклеотид, кодирующий элемент контроля экспрессии, полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, может включать предоставление условий и/или материала, которые влияют на элемент контроля экспрессии, и гена, повреждающего подвижность, в клетку.

Предоставление гена, повреждающего подвижность, в клетку может включать введение плазмидного вектора, включающего ген, повреждающий подвижность, в клетку.

В случае, когда материал, который влияет на элемент контроля экспрессии, РНК-направляемая эндонуклеаза и/или ген, повреждающий подвижность, предоставлены в клетку, направляющая нуклеиновая кислота, экспрессированная в клетке, может комплементарно связываться с полинуклеотидом, который может присутствовать только в Y хромосоме, то есть присутствовать в геноме клетки. Дополнительно, РНК-направляемая эндонуклеаза, которая впрыснута инъекцией или экспрессирована системой экспрессии клетки, может расщеплять полинуклеотид, который может присутствовать только в Y хромосоме, при этом образуя комплекс с направляющей нуклеиновой кислотой. В этом случае, ген, повреждающий подвижность, может быть нокинирован в полинуклеотиде, который может присутствовать только в Y хромосоме.

В настоящем раскрытии, представлен способ получения сперматозоидов, имеющих Y хромосому, в которой ген, повреждающий подвижность, нокинирован в SRY ген.

Например, один способ получения сперматозоидов, имеющих Y хромосому, в которых нокинирован ген, повреждающий подвижность, может включать инъекцию материала, который влияет на элемент контроля экспрессии, РНК-направляемую эндонуклеазу и/или ген, повреждающий подвижность, в репродуктивный орган или репродуктивную ткань животного.

В репродуктивном органе или репродуктивной ткани самца животного, имеющего Y хромосому, в которой нокинирован ген, повреждающий подвижность, могут продуцироваться сперматозоиды, имеющие Y хромосому, в которой нокинирован ген, повреждающий подвижность.

В другом примере, один способ получения сперматозоидов, имеющих Y хромосому, в которой нокинирован ген, повреждающий подвижность, может включать прямое предоставление в сперматозоид материала, который влияет на элемент контроля экспрессии, РНК-направляемой эндонуклеазы и/или гена, повреждающего подвижность, описанных выше.

Сперматозоиды, имеющие Y хромосому, в которой нокинирован ген, повреждающий подвижность, полученные вышеуказанными способами, могут иметь сниженную подвижность, и в результате, эти сперматозоиды могут испытывать затруднения в оплодотворении яйцеклетки, по сравнению со сперматозоидами, имеющими X хромосому.

В этом случае, вероятность получения оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона с XX хромосомой выше, чем вероятность получения оплодотворенной яйцеклетки и/или эмбриона с XY хромосомой, и в результате, может быть получена особь женского пола, имеющая XX хромосому.

2. Выбор пола нокином гена флуоресцентного белка в X хромосоме и Y хромосоме

Один способ выбора пола согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, может включать проведение нокина каждого отдельного типа гена флуоресцентного белка, в месте, соседнем с геном, который присутствует специфически в X хромосоме и Y хромосоме индивида, соответственно.

Далее описано конструирование инструмента, который применяют для нокина гена флуоресцентного белка в месте, соседнем с геном, который присутствует специфически в X хромосоме и Y хромосоме, соответственно, и механизм действия инструмента в клетке, имеющей геном, в который вставлен инструмент.

2-1. Инструмент для нокин гена флуоресцентного белка в X хромосому и Y хромосому

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в настоящем раскрытии, представлен инструмент (далее, инструмент классификации XY хромосомы) для нокина каждого из разных генов флуоресцентного белка в первом целевом сайте, соседнем с геном, который присутствует специфически в X хромосоме животного, и во втором целевом сайте, соседнем с геном, который присутствует специфически в Y хромосоме.

Для удобства объяснения, далее, ген, который присутствует специфически в X хромосоме, называют DAX ген, и ген, который присутствует специфически в Y хромосоме, называют SRY ген.

Например, в инструменте классификации XY хромосомы, полинуклеотид, кодирующий первую направляющую нуклеиновую кислоту, и полинуклеотид, кодирующий вторую направляющую нуклеиновую кислоту, может быть включен между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью. Первая направляющая нуклеиновая кислота включает последовательность, такую же как или комплементарную части последовательности первого целевого сайта, и вторая направляющая нуклеиновая кислота включает последовательность, такую же как или комплементарную части последовательности второго целевого сайта.

Первым целевым сайтом является полинуклеотид, соседний DAX гену, и вторым целевым сайтом является полинуклеотид, соседний SRY ген.

В другом примере, в инструмент классификации XY хромосомы может быть включен полинуклеотид, кодирующий первую направляющую нуклеиновую кислоту, полинуклеотид, кодирующий вторую направляющую нуклеиновую кислоту и полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью. В этом случае, инструмент может включать элемент контроля экспрессии, который контролирует экспрессию РНК-направляемой эндонуклеазы.

Первая направляющая нуклеиновая кислота включает последовательность, такую же как или комплементарную части последовательности первого целевого сайта, и вторая направляющая нуклеиновая кислота включает последовательность, такую же как или комплементарную части последовательности второго целевого сайта.

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в данном раскрытии, может быть представлена клетка, включающая геном, а который вставлен инструмент классификации XY хромосомы. Клеткой может быть соматическая клетка, гамета или стволовая клетка.

Дополнительно, согласно некоторым типовым вариантам осуществления, представленным в данном раскрытии, может быть представлена оплодотворенная яйцеклетка и/или эмбрион, которые включают геном, в который вставлен инструмент классификации XY хромосомы.

ФИГ. 20(a) иллюстрирует форму, где инструмент классификации XY хромосомы вставлен в геном животного.

ФИГ. 20(b) иллюстрирует DAX ген (421) и SRY ген (431), которые являются эндогенными генами, присутствующими в геноме, в который вставлен инструмент классификации XY хромосомы, и целевой сайт (420), который находится рядом с целевым сайтом DAX гена (430), который находится рядом с SRY геном.

Инструмент классификации XY хромосомы (370) может включать полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу (373), полинуклеотид, кодирующий первую направляющую нуклеиновую кислоту (375) и полинуклеотид, кодирующий вторую направляющую нуклеиновую кислоту (377) между первой ITR последовательностью (371) и второй ITR последовательностью (379).

Инструмент (370) включает полинуклеотид (372), кодирующий индуцируемый промотор, который контролирует экспрессию РНК-направляемой эндонуклеазы. Для удобства объяснения, индуцируемым промотором считается Tet-on промотор. Дополнительно, инструмент (370) может дополнительно включать промотор (374), который контролирует экспрессию первой направляющей нуклеиновой кислоты, и промотор (376), который контролирует экспрессию второй направляющей нуклеиновой кислоты.

Полинуклеотид, кодирующий первую направляющую нуклеиновую кислоту (375), включает последовательность, такую же как или комплементарную части последовательности первого целевого сайта (420), который находится рядом с DAX геном (421), и полинуклеотид, кодирующий вторую направляющую нуклеиновую кислоту (377), включает последовательность, такую же как или комплементарную части последовательности второго целевого сайта (430), который находится рядом с SRY геном (431).

Далее описан способ нокина первого гена флуоресцентного белка в первый целевой сайт, который находится рядом с DAX геном, и нокин второго гена флуоресцентного белка во второй целевой сайт, который находится рядом с SRY геном, в геноме, в который вставлен инструмент классификации XY хромосомы, и способ выбора пола каждого индивида.

2-2. Способ нокина гена флуоресцентного белка в X хромосоме и Y хромосоме и способ выбора пола

Один способ нокина гена флуоресцентного белка в клетке, имеющей геном, в который вставлен инструмент, который включает полинуклеотид, кодирующий первую направляющую нуклеиновую кислоту, и полинуклеотид, кодирующий вторую направляющую нуклеиновую кислоту, может включать предоставление РНК-направляемой эндонуклеазы, первого гена флуоресцентного белка и второго гена флуоресцентного белка в клетку.

Один способ нокина гена флуоресцентного белка в клетке имеющей геном, в который вставлен инструмент, который включает полинуклеотид, кодирующий элемент контроля экспрессии, полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, полинуклеотид, кодирующий первую направляющую нуклеиновую кислоту и полинуклеотид, кодирующий вторую направляющую нуклеиновую кислоту, может включать предоставление материала и/или условий, которые влияют на элемент контроля экспрессии, первого гена флуоресцентного белка и второго гена флуоресцентного белка в клетку.

В этом случае, 5' конец и 3' конец первого гена флуоресцентного белка может включать последовательность, такую же как часть последовательности первого целевого сайта, и 5' конец и 3' конец второго ген флуоресцентного белка может включать последовательность, такую же как часть последовательности второго целевого сайта

Введение первого гена флуоресцентного белка и второго гена флуоресцентного белка в клетку может включать введение не вирусного вектора (например, плазмидного вектора) или вирусного вектора, который включает первый ген флуоресцентного белка и второй ген флуоресцентного белка, в клетку.

Далее, механизм нокина первого гена флуоресцентного белка в первый целевой сайт, присутствующий в геноме клетки, и механизм нокина второго гена флуоресцентного белка во второй целевой сайт, присутствующий в геноме клетки, будет более подробно описан со ссылкой на ФИГ. 20.

ФИГ. 20(c) иллюстрирует форму генома, в котором первый ген флуоресцентного белка (423) нокинирован в первом целевом сайте (420), и второй ген флуоресцентного белка (433) нокинирован во втором целевом сайте (430), и способ экспрессии флуоресценции через нокин.

Первая направляющая нуклеиновая кислота может экспрессироваться в клетке, имеющей геном, в который вставлен инструмент классификации XY хромосомы (370), через полинуклеотид (374), кодирующий промотор, который включен в инструмент классификации XY хромосомы (370). В этом случае, первая направляющая нуклеиновая кислота может специфически связывать первый целевой сайт (420). Дополнительно, РНК-направляемая эндонуклеаза, которая экспрессируется под воздействием Tet-on промотора благодаря обработке тетрациклином, может расщеплять первый целевой сайт (420), и первый ген флуоресцентного белка (423) может быть нокинирован в первый целевой сайт (420). В частности, первый целевой сайт (420) может быть разделен на первую область (420(a)) и вторую область (420(b)).

Дополнительно, вторая направляющая нуклеиновая кислота может экспрессироваться в клетке через полинуклеотид, кодирующий промотор (376), включенный в инструмент классификации XY хромосомы (370), и вторая направляющая нуклеиновая кислота может комплементарно связываться со вторым целевым сайтом (430). Дополнительно, РНК-направляемая эндонуклеаза, которая экспрессируется под воздействием Tet-on промотора благодаря обработке тетрациклином, может расщеплять второй целевой сайт (430), и второй ген флуоресцентного белка (433) может быть нокинирован во второй целевой сайт (430). В частности, второй целевой сайт (430) может быть разделен на первую область (430(a)) и вторую область (430(b)).

Далее, как описано выше, описан способ выбора пола эмбриона и/или индивида через нокин первого гена флуоресцентного белка и второго гена флуоресцентного белка.

Например, один способ выбора пола нокином первого гена флуоресцентного белка и второго гена флуоресцентного белка может включать инъекцию материала и/или условий, которые влияют на элемент контроля экспрессии, РНК-направляемой эндонуклеазы, первого гена флуоресцентного белка и/или второго гена флуоресцентного белка в репродуктивную ткань и/или репродуктивный орган самца, имеющего геном, в котором нокинирован вышеописанный инструмент (см. ФИГ. 20).

В случае, когда первый ген флуоресцентного белка (423) и/или второй ген флуоресцентного белка (433) нокинированы в репродуктивную ткань и/или репродуктивный орган самца, первый сперматозоид (520), имеющий X хромосому, в которой нокинирован первый ген флуоресцентного белка (423), и второй сперматозоид (530), имеющий Y хромосому, в которой нокинирован второй ген флуоресцентного белка (433), могут быть продуцированы в самце.

В случае, когда оплодотворяют первый сперматозоид (520) и яйцеклетку дикого типа (500), может быть получен первый эмбрион (521), имеющий геном, в котором нокинирован первый ген флуоресцентного белка. В первом эмбрионе (521) может экспрессироваться первый флуоресцентный белок. В этом случае, первая флуоресценция (523) может развиваться из первого эмбриона через экспрессию первого флуоресцентного белка, и сигнал флуоресценции может быть представлен вне клетки согласно развитию флуоресценции.

В случае, когда оплодотворяют второй сперматозоид (530) и яйцеклетка дикого типа (500), может быть получен второй эмбрион (531), имеющий геном, в котором нокинирован второй ген флуоресцентного белка. Во втором эмбрионе (531) может экспрессироваться второй флуоресцентный белок. В этом случае, вторая флуоресценция (533) может развиваться из второго эмбриона через экспрессию второго флуоресцентного белка, и сигнал флуоресценции может быть представлен вне клетки согласно развитию флуоресценции.

То есть, сигналы флуоресценции, отличный друг от друга, могут быть представлены из первого эмбриона, имеющего геном, в котором нокинирован первый ген флуоресцентного белка, и из второго эмбриона, имеющего геном, в котором нокинирован второй ген флуоресцентного белка, и в результате, эмбрион (521), имеющий XX хромосому, и эмбрион (531), имеющий XY хромосому, могут быть отделены друг от друга.

В другом примере, один способ выбора пола нокином первого гена флуоресцентного белка и второго гена флуоресцентного белка может включать микроинъекцию (MI) материала и/или условий, которые влияют на элемент контроля экспрессии, РНК-направляемой эндонуклеазы, первого гена флуоресцентного белка и/или второго гена флуоресцентного белка в оплодотворенную яйцеклетку во время оплодотворения гаметы, имеющей геном, в котором нокинирован вышеописанный инструмент.

В этом случае, может быть получен эмбрион, в котором нокинирован первый ген флуоресцентного белка (423) или второй ген флуоресцентного белка (433).

Как описано выше, взаимно разные флуоресцентные белки могут экспрессироваться в эмбрионе, имеющем геном, в котором нокинирован первый ген флуоресцентного белка, и в эмбрионе, имеющем геном, в котором нокинирован второй ген флуоресцентного белка. В этом случае эмбрион, имеющий ХХ хромосому, может быть отделен от эмбриона, имеющего ХY хромосому, с применением сигнала флуоресценции.

Когда эмбрионы, отобранные указанными выше способами, имплантируют в матку суррогатной матери, могут быть получены особи желаемого пола.

Использование вышеописанных способов имеет преимущества в том, что флуоресцентный белок может экспрессироваться в эмбрионе на относительно ранней стадии, что обеспечивает более быстрый отбор и более безопасную имплантацию быстро отобранного эмбриона в матку суррогатной матери.

[Система исключения инструмента]

1. Конструирование системы исключения инструмента

Исключающий инструмент может быть представлен согласно некоторым типовым вариантам осуществления по настоящему раскрытию. Исключающий инструмент включает “компонент для исключения инструмента”. “Компонент для исключения инструмента” относится к конструкции, включающей полинуклеотид, который обеспечивает экспрессирование элемента, который способен исключать инструмент из генома, в который вставлен инструмент.

Исключающий инструмент может включать полинуклеотид, который кодирует компоненты сконструированной нуклеазы. Для удобства объяснения, полагают, что полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, включен в исключающий инструмент.

Далее более конкретно раскрыты разные типы конструкции исключающего инструмента, способы получения исключающих инструментов и механизмы, которыми исключающие инструменты разного типа исключают из генома в определенных условиях.

1-1. Структура генома, в который вставлен инструмент, имеющий конструкцию, позволяющую экспрессию полинуклеотида, кодирующего транспосазу, при определенных условиях

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления по настоящему раскрытию, может быть представлен исключающий инструмент, в котором экспрессия транспосазы контролируется индуцируемым промотором и/или ткань-специфическим промотором. Исключающий инструмент может быть получен вставкой или исключением через сайт-специфическую рекомбинацию.

Если исключающий инструмент получают вставкой через сайт-специфическую рекомбинацию, далее будет описан способ конструирования и получения исключающего инструмента.

Например, исключающий инструмент может иметь состав, в котором полинуклеотид, кодирующий индуцируем промотор, и полинуклеотид, кодирующий транспосазу, включены между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью в 5' - 3’ направлении.

В другом примере, исключающий инструмент может иметь состав, в котором полинуклеотид, кодирующий ткань-специфический промотор, и полинуклеотид, кодирующий транспосазу, включены между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью в 5' - 3’ направлении.

В еще одном примере, исключающий инструмент может иметь состав, в котором полинуклеотид, кодирующий индуцируемый промотор, полинуклеотид, кодирующий первую транспосазу, полинуклеотид, кодирующий ткань-специфический промотор, и полинуклеотид, кодирующий вторую транспосазу включен между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью в 5' - 3’ направлении.

ФИГ. 21 иллюстрирует вариант осуществления исключающего инструмента, в котором экспрессия транспосазы может контролироваться индуцируемым промотором и ткань-специфическим промотором.

Исключающий инструмент (700(b)) может иметь состав, в котором компонент (700(c)) для исключение инструмента включен между первой ITR последовательностью (701) и второй ITR последовательностью (705). Дополнительно, исключающий инструмент (700(b)) может дополнительно включать один или более сайтов распознавания рекомбиназы.

Компонент (700(c)) для исключения инструмента может включать полинуклеотид, кодирующий индуцируемый промотор (707), полинуклеотид, кодирующий первую транспосазу (704), полинуклеотид, кодирующий ткань-специфический промотор (709) и полинуклеотид, кодирующий вторую транспосазу (706). В этом случае, полинуклеотид, кодирующий первую транспосазу (704), и полинуклеотид, кодирующий вторую транспосазу (706), могут иметь одинаковую последовательность. Первая транспосаза и вторая транспосаза может взаимодействовать с первой ITR последовательностью (701) и второй ITR последовательностью (705).

Далее описан способ получения исключающего инструмента (700(b)).

Один способ получения исключающего инструмента (700(b)) может включать предоставление рекомбиназы и компонента (700(c)) для исключения инструмента в клетку, имеющую геном, в который вставлен инструмент (700(a)).

Рекомбиназа может взаимодействовать с сайтом распознавания рекомбиназы (RRS) (703), который включен в инструмент (700(a)), и сайтом распознавания рекомбиназы (702), который включен в компонент (700(c)) для исключения инструмента.

Способ получения рекомбиназы был описан выше, и поэтому его конкретные подробности здесь опущены.

Существует множество способов предоставления компонента (700(c)) для исключения инструмента в клетку. Например, компонент для исключения инструмента может быть предоставлен в клетку введением плазмидного вектора, который включает компонент для исключения инструмента, в клетку.

Как описано выше, рекомбиназа, предоставленная в клетку, может взаимодействовать с сайтом распознавания рекомбиназы (RRS) (703), который включен в инструмент (700(a)), и сайтом распознавания рекомбиназы (702), который включен в компонент для исключения инструмента; и компонент для исключения инструмента может быть вставлен в локацию сайта распознавания рекомбиназы (RRS) (703) инструмента (700(a)). Основываясь на вышесказанном, может быть получен исключающий инструмент (700(b)), который позволяет экспрессию транспосазы в определенных условиях.

Далее будет описано конструирование исключающего инструмента, который получен исключением стоп-кодона через сайт-специфическую рекомбинацию, и способ его получения.

Например, исключающий инструмент может иметь состав, в котором полинуклеотид, кодирующий индуцируемый промотор, сайт распознавания рекомбиназы и полинуклеотид, кодирующий транспосазу, включены между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью в 5’ - 3’ направлении.

В другом примере, исключающий инструмент может иметь состав, в котором полинуклеотид, кодирующий ткань-специфический промотор, сайт распознавания рекомбиназы и полинуклеотид, кодирующий транспосазу, включены между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью в 5’ - 3’ направлении.

В еще одном примере, исключающий инструмент может иметь состав, в котором полинуклеотид, кодирующий индуцируемый промотор, сайт распознавания рекомбиназы, полинуклеотид, кодирующий первую транспосазу, полинуклеотид, кодирующий ткань-специфический промотор, сайт распознавания рекомбиназы и полинуклеотид, кодирующий вторую транспосазу включены между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью в 5’ - 3’ направлении.

ФИГ. 22 иллюстрирует другой вариант осуществления исключающего инструмента, в котором экспрессия транспосазы может контролироваться индуцируемым промотором и ткань-специфическим промотором.

Исключающий инструмент (800(b)) инструмент может иметь состав, в котором компонент для исключения инструмента включен между первой ITR последовательностью (801) и второй ITR последовательностью (808).

Компонент для исключения инструмента может включать полинуклеотид, кодирующий индуцируемый промотор (802), первый сайт распознавания рекомбиназы (803(b)), полинуклеотид, кодирующий первую транспосазу (804), полинуклеотид, кодирующий ткань-специфический промотор (805), второй сайт распознавания рекомбиназы (806(b)) и полинуклеотид, кодирующий вторую транспосазу (807). Полинуклеотид, кодирующий первую транспосазу (804), и полинуклеотид, кодирующий вторую транспосазу (807), могут быть одинаковыми последовательностями. Первая транспосаза и вторая транспосаза может взаимодействовать с первой ITR последовательностью (801) и второй ITR последовательностью (808).

Дополнительно, первый сайт распознавания рекомбиназы (803(b)) и второй сайт распознавания рекомбиназы (806(b)) могут быть одинаковыми последовательностями.

Далее описан способ получения исключающего инструмента (800(b)).

Один способ получения исключающего инструмента (800(b)) может включать предоставление рекомбиназы в клетку, имеющую геном, в который вставлен инструмент (800(a)).

Рекомбиназа, предоставленная в клетку, может взаимодействовать с сайтами распознавания рекомбиназы (RRS),который составляют первый RSR (803(a)) и второй RSR (806(a)), которые включены в инструмент (800(a)). Первый RSR (803(a)) и второй RSR (806(a)) могут быть одинаковыми последовательностями.

Как описано выше, стоп-кодон может быть удален, если рекомбиназа, предоставленная в клетку, взаимодействует с сайтом распознавания рекомбиназы (RRS), который составляет первый RSR (803(a)) и второй RSR (806(a)).

На основе вышесказанного, может быть получен исключающий инструмент 800(b), в котором транспосаза может экспрессироваться в определенных условиях.

1-2. Структура генома, в который вставлен инструмент, имеющий конструкцию, позволяющую экспрессию полинуклеотида, кодирующего рекомбиназу, в определенных условиях

Согласно некоторым типовым вариантам осуществления по настоящему раскрытию, может быть представлен исключающий инструмент, в котором экспрессия рекомбиназы контролируется индуцируемым промотором и/или ткань-специфическим промотором.

Например, исключающий инструмент может иметь состав, в котором полинуклеотид, кодирующий индуцируемый промотор, полинуклеотид, кодирующий рекомбиназу, полинуклеотид, кодирующий конститутивный промотор, и полинуклеотид, кодирующий RSR и полинуклеотид, кодирующий транспосазу, включены между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью в 5’ - 3’ направлении.

В другом примере, исключающий инструмент может иметь состав, в котором полинуклеотид, кодирующий ткань-специфический промотор, полинуклеотид, кодирующий рекомбиназу, полинуклеотид, кодирующий конститутивный промотор, полинуклеотид, кодирующий RSR и полинуклеотид, кодирующий транспосазу, включены между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью в 5’ - 3’ направлении.

В еще одном примере, исключающий инструмент может иметь состав, в котором полинуклеотид, кодирующий индуцируемый промотор; полинуклеотид, кодирующий рекомбиназу, полинуклеотид, кодирующий конститутивный промотор, полинуклеотид, кодирующий RSR и полинуклеотид, кодирующий первую транспосазу, полинуклеотид, кодирующий ткань-специфический промотор, полинуклеотид, кодирующий рекомбиназу, полинуклеотид, кодирующий конститутивный промотор, полинуклеотид, кодирующий RSR и полинуклеотид, кодирующий вторую транспосазу, включены между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью в 5’ - 3’ направлении.

ФИГ. 23 иллюстрирует вариант осуществления исключающего инструмента, в котором экспрессия рекомбиназы может контролироваться индуцируемым промотором и ткань-специфическим промотором.

Исключающий инструмент (900(b)) может иметь состав, в котором компонент для исключения инструмента включен между первой ITR последовательностью (901) и второй ITR последовательностью (906).

Компонент для исключения инструмента может включать полинуклеотид, кодирующий индуцируемый промотор (908), полинуклеотид, кодирующий первую рекомбиназу (909), полинуклеотид, кодирующий ткань-специфический промотор (910), полинуклеотид, кодирующий вторую рекомбиназу (911), полинуклеотид, кодирующий промотор (903), полинуклеотид, кодирующий RSR (904) и полинуклеотид, кодирующий транспосазу (905). Дополнительно, компонент для исключения инструмента может дополнительно включать один или более сайтов распознавания рекомбиназы (RRS).

Полинуклеотид, кодирующий первую рекомбиназу (909), и полинуклеотид, кодирующий вторую рекомбиназу (911), имеют одинаковую последовательность. Первая рекомбиназа и вторая рекомбиназа может взаимодействовать с сайтом распознавания рекомбиназы (RRS), который составляет полинуклеотид, кодирующий RSR (904).

Далее описан способ получения исключающего инструмента 900(b).

Один способ получения исключающего инструмента (900(b)) может включать предоставление третьей рекомбиназы и компонента (900(c)) для исключения инструмента в клетку, имеющую геном, в которую вставлен инструмент (900(a)).

Способ предоставления третьей рекомбиназы и компонента (900(c)) для исключения инструмента в клетку описан выше, и поэтому подробное объяснение опущено.

Третья рекомбиназа, предоставленная в клетку, может взаимодействовать с сайтом распознавания рекомбиназы (RRS) (902), который включен в инструмент (900(a)), и сайтом распознавания рекомбиназы (RRS) (907), который включен в компонент (900(c)) для исключения инструмента, который предоставлен в клетку.

Путем вышеописанных взаимодействий, компонент (900(c)) для исключения инструмента может быть вставлен в локацию сайта распознавания рекомбиназы (RRS) (902) инструмента (900(a)). На основе вышесказанного, может быть получен исключающий инструмент (900(b)), в котором транспосаза может экспрессироваться в определенных условиях.

2. Механизм исключения с применением исключающего инструмента

Далее описан механизм, которым исключающий инструмент, представленный в данном раскрытии, исключают в определенных условиях.

Дополнительно описан механизм, которым донорный полинуклеотид, который нокинирован в геном, исключают из генома материалом, который экспрессирован из исключающего инструмента, представленного в данном раскрытии,.

2-1. Механизм исключения исключающего инструмента

2-1-1. Механизм исключения исключающего инструмента, имеющего состав, в котором полинуклеотид, кодирующий транспосазу, может экспрессироваться в определенных условиях

В данном раскрытии представлено объяснение механизма исключения исключающего инструмента, в котором экспрессия транспосазы контролируется индуцируемым промотором и ткань-специфическим промотором, описанными выше.

Для удобства объяснения, за индуцируемый промотор принимают промотор, который может работать в условиях низкой температуры, что может происходить во время репликации клеток, и за ткань-специфический промотор принимают промотор, который может быть активирован в репродуктивной ткани. Репродуктивной тканью могут быть яички или яичники.

Далее, механизм, которым исключающий инструмент (700(b)) исключают из генома клетки во время стадии репликации клеток, описан со ссылкой на ФИГ. 21. Для удобства объяснения, клетку принимают как выделенную клетку.

Во время стадии репликации клеток, низкотемпературные условия могут приниматься для клетки, имеющей геном, в который вставлен вышеописанный исключающий инструмент (700(b)). В условиях низкой температуры, индуцируемый промотор (707) может действовать, и первая транспосаза может экспрессироваться в клетке под действием индуцируемого промотора (707).

Если первая транспосаза экспрессируется в клетке, первая транспосаза может взаимодействовать с первой ITR последовательностью (701) и второй ITR последовательностью (705), присутствующей в геноме клетки. В этом случае, исключающий инструмент (700(b)) может быть исключен из генома клетки.

Следовательно, во время стадии, на которой клетка, имеющая геном, в который вставлен исключающий инструмент (700(b)), реплицируется, исключающий инструмент (700(b)) может быть исключен из генома клетки. В этом случае, реплицированная клетка, имеющая геном, в который вставлен исключающий инструмент (700(b)), не может быть получена.

Далее описан механизм, которым исключающий инструмент (700(b)) исключают из генома в репродуктивной ткани.

В вышеописанной репродуктивной ткани, имеющей геном, в который вставлен исключающий инструмент (700(b)), может действовать ткань-специфический промотор (709) и вторая транспосаза может экспрессироваться в репродуктивную ткань через действие ткань-специфического промотора (709).

Если вторая транспосаза экспрессируется в репродуктивную ткань, вторая транспосаза может взаимодействовать с первой ITR последовательностью (701) и второй ITR последовательностью (705), которые присутствуют в геноме ткани. В этом случае, исключающий инструмент (700(b)) может быть исключен из генома репродуктивной ткани.

То есть, исключающий инструмент (700(b)) может быть исключен из генома репродуктивной ткани. Следовательно, гамета, имеющая геном, в который вставлен исключающий инструмент (700(b)), не может быть получена из клетки и/или животного, имеющего геном, в который вставлен исключающий инструмент (700(b)).

Механизм исключения исключающего инструмента (800(b)) представленный в настоящем раскрытии, по существу такой же, как для вышеописанного инструмента (700(b)), таким образом, подробное объяснение может быть опущено.

2-1-2. Механизм исключения исключающего инструмента, имеющего конструкцию, в которой полинуклеотид, кодирующий рекомбиназу, может экспрессироваться в определенных условиях

В данном раскрытии представлено объяснение механизма исключения исключающего инструмента, в котором экспрессия рекомбиназы контролируется индуцируемый промотором и ткань-специфическим промотором, описанными выше. Для удобства объяснения, далее, за индуцируемый промотор принимают промотор, который может действовать в условиях низкой температуры, которые могут возникать во время стадии репликации клеток, и за ткань-специфический промотор принимают промотор, который может действовать в репродуктивной ткани.

Далее описан механизм исключения исключающего инструмента (900(b)) из генома в клетке на стадии репликации.

Во время стадии репликации клеток, низкотемпературные условия могут приниматься в клетке, имеющей геном, в который вставлен вышеописанный исключающий инструмент (900(b)). В условиях низкой температуры, может действовать индуцируемый промотор (908), и первая рекомбиназа может экспрессироваться в клетке под действием индуцируемого промотора (908).

Первая рекомбиназа, экспрессированная в клетке, может взаимодействовать с сайтом распознавания рекомбиназы (RRS), который составляет полинуклеотид, кодирующий RSR (904), присутствующий в исключающем инструменте (900(b)). В этом случае, стоп-кодон может быть исключен из полинуклеотида, кодирующего RSR (904), и может происходить транскрипция и/или трансляция полинуклеотида, кодирующего транспосазу (905). То есть, транспосаза может экспрессироваться в клетке при исключении стоп-кодона.

Экспрессированная транспосаза может взаимодействовать с первой ITR последовательностью (901) и второй ITR последовательностью (906), которые присутствуют в геноме клетки. В этом случае, исключающий инструмент (900(b)) может быть исключен из генома клетки.

Следовательно, если репликацию клетки проводят с применением клетки, имеющей геном, в который вставлен исключающий инструмент (900(b)), исключающий инструмент (900(b)) может быть исключен из генома клетки. В этом случае, реплицированная клетка, имеющая геном, в который вставлен исключающий инструмент (900(b)), не может быть получена.

Далее описан механизм, которым исключающий инструмент (900(b)) исключают из генома в репродуктивной ткани.

В вышеописанной репродуктивной ткани, имеющей геном, в который вставлен исключающий инструмент (900(b)), может действовать ткань-специфический промотор (910), и вторая рекомбиназа может экспрессироваться в ткани под действием ткань-специфического промотора (910).

Вторая рекомбиназа, экспрессированная в репродуктивной ткани, может взаимодействовать с сайтом распознавания рекомбиназы, который составляет полинуклеотид, кодирующий RSR (904), присутствующий в исключающем инструменте (900(b)). В этом случае, стоп-кодон может быть исключен из полинуклеотида, кодирующего RSR (904). Транспосаза может экспрессироваться в клетке при исключении стоп-кодона.

Экспрессированная транспосаза может взаимодействовать с первой ITR последовательностью (901) и второй ITR последовательностью (906), которая присутствует в геноме клетки. В этом случае, исключающий инструмент (900(b)) может быть исключен из генома репродуктивной ткани.

То есть, исключающий инструмент (900(b)) может быть исключен в геноме репродуктивной ткани. Следовательно, гамета, имеющая геном, в который вставлен исключающий инструмент 900(b), не может быть получена из клетки и/или животного, имеющего геном, в который вставлен исключающий инструмент (900(b)).

2-2. Механизм исключения части, в которой происходит редактирование генома

Далее описан механизм, которым донорный полинуклеотид, который нокинирован на геноме, исключают из генома через транспосазу, экспрессированную из исключающего инструмента.

Согласно представленному выше раскрытию, полагают, что исключающий инструмент включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и нокин донорного полинуклеотида может происходить из-за редактирования генома с применением рНК-направляемой эндонуклеазы, экспрессированной из исключающего инструмента.

Механизм, которым транспосаза экспрессируется из исключающего инструмента в определенных условиях, описан выше, и поэтому конкретное объяснение механизма экспрессии транспосазы здесь опущено.

Донорный полинуклеотид, который нокинирован в геном через редактирование генома, может быть исключен из генома через транспосазу, экспрессированную из исключающего инструмента.

Например, если донорный полинуклеотид нокинирован вовнутрь исключающего инструмента, донорный полинуклеотид может быть исключен из генома через исключение исключающего инструмента через транспосазу, экспрессированную из исключающего инструмента.

В другом примере, если донорный полинуклеотид нокинирован вовнутрь инструмента, отличного от исключающего инструмента, донорный полинуклеотид может быть исключен из генома в случае, когда донорный полинуклеотид имеет ITR последовательность, которая может взаимодействовать с транспосазой, экспрессированной из исключающего инструмента, на 5' и 3' конце донорного полинуклеотида.

В еще одном примере, даже если донорный полинуклеотид нокинирован в эндополинуклеотид, который не является инструментом, донорный полинуклеотид может быть исключен из генома в случае, когда донорный полинуклеотид имеет ITR последовательность, которая может взаимодействовать с транспосазой, экспрессированной из исключающего инструмента, на 5' и 3' конце донорного полинуклеотида.

3. Применение исключающего инструмента

Далее описаны случаи, где конструкция инструмента необходимо изменить на исключающий инструмент. То есть, описан аспект применения исключающего инструмента.

Для удобства объяснения, далее предполагают, что полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, включен в инструмент.

В случае, когда квалифицированный специалист в данной области, который произвел клетки, имеющие геном, в который вставлен инструмент, продает клетки и/или животных, имеющих геном, в который вставлен инструмент, третьей стороне, третья сторона, которая приобрела клетки и/или животных от квалифицированного специалиста в данной области, может получить рНК-направляемую эндонуклеазу, экспрессируемую из клеток и/или животных. В этом случае приобретение РНК-направляемой эндонуклеазы, экспрессируемой из клеток и/или животных третьей стороной, можно рассматривать как законную выгоду.

Кроме того, когда специалист в данной области продает клетки и/или животных, имеющих геном, в котором донорный полинуклеотид нокинирован на геном клетки с применением инструмента, третья сторона, купившая клетки и/или животных, может получить донорную РНК и/или белок из клеток и/или животных. Донорной РНК и/или белком является один из белков, которые экспрессируются через транскрипцию и/или трансляцию донорного полинуклеотида. В этом случае получение донорной РНК и/или белка из клеток и/или животных, приобретенных третьей стороной, может рассматриваться как законная выгода.

В дополнение к приобретению РНК-направляемой эндонуклеазы, донорной РНК и/или донорного белка, экспрессируемый клетками и/или животными, любая третья сторона, которая приобрела клетки и/или животных, может получить незаконную выгоду от применения приобретенных клеток и/или животных.

Например, пример, когда любая третья сторона, которая приобрела клетки, имеющие геном, в который вставлен инструмент, может иметь незаконные дополнительные преимущества, может включать случаи, где третья сторона вовлечена в крупномасштабное производство или продажу клеток, имеющих геном, в который инструмент и/или донорный полинуклеотид вставлен путем репликации клеток.

В другом примере, пример, когда любая третья сторона, которая приобрела гаметы, имеющие геном, в который вставлен инструмент, может иметь незаконные дополнительные преимущества, может включать случаи, где третья сторона вовлечена в производство особей, имеющих геном, в который вставлен инструмент и/или донорный полинуклеотид, in vitro оплодотворением с применением гамет.

В еще одном примере, пример, когда любая третья сторона, которая приобрела животных, имеющих геном, в который вставлен инструмент, может иметь незаконные дополнительные преимущества, может включать случаи, где третья сторона вовлечена в производство или продажу гамет, имеющих геном, в который вставлен инструмент и/или донорный полинуклеотид, с применением животных.

В еще одном примере, пример, когда любая третья сторона, которая приобрела животных, имеющих геном, в который вставлен инструмент, может иметь незаконные дополнительные преимущества, может включать случаи, где третья сторона вовлечена в производство или продажу потомства, имеющего геном, в который вставлен инструмент и/или донорный полинуклеотид, с применением животных.

Как описано выше, в качестве меры предосторожности для предотвращения получения незаконной дополнительной выгоды любой третьей стороной, которая приобрела клетки и/или животных, квалифицированный специалист в данной области может продать третьей стороне клетки и/или животных, имеющих геном, в который вставлен полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, после изменения конструкции инструмента на конструкцию исключающего инструмента.

Далее описывается механизм и его действие в случаях, когда конструкция инструмента была изменена на конструкцию исключающего инструмента.

Для удобства объяснения, далее описаны только механизм исключения и действие исключающего инструмента, но это также может быть применено к донорному полинуклеотиду таким же образом.

В случае, когда квалифицированный специалист в данной области продает клетки и/или животных, имеющих геном, в который вставлен исключающий инструмент, если какая-либо третья сторона, которая приобрела клетки и/или животное, пытается получить незаконную дополнительную выгоду, как описано выше, исключающий инструмент может быть вырезан из генома клеток и/или животных.

Например, если какая-либо третья сторона, которая приобрела клетки, имеющие геном, в который вставлен исключающий инструмент, попытается воспроизвести эти клетки, может сработать индуцируемый промотор, включенный в исключающий инструмент, и затем может экспрессироваться транспосаза, и в результате, исключающий инструмент может быть исключен из генома клетки.

В другом примере, в случае, когда любая третья сторона, которая приобрела животных, имеющих геном, в который вставлен исключающий инструмент, пытается произвести гаметы с применением животных, транспосаз может экспрессироваться в ткани в результате активности ткань-специфического промотора, и в результате этого могут быть получены гаметы, из которых исключен исключающий инструмент.

В еще одном примере, в случае, когда любая третья сторона, которая приобрела животных, имеющих геном, в который вставлен исключающий инструмент, пытается произвести потомство с применением животных, транспосаза может экспрессироваться в репродуктивной ткани в результате активности ткань-специфического промотора, и в результате может быть произведено потомство, в котором исключен исключающий инструмент.

То есть, чтобы предотвратить получение любой третьей стороной, которая приобрела клетки и/или животных, имеющих геном, в который вставлен полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, незаконной дополнительной выгоды, квалифицированный специалист в данной области может изменить конструкцию инструмента на конструкцию исключающего инструмента.

[Экспериментальный пример 1] Получение трансгенного эмбриона, имеющего геном, в котором ген целевого белка вставлен с применением ядерного транспорта соматической клетки

Авторы данного изобретения провели данный эксперимент так, чтобы вставить ген целевого белка в бычий геном.

Для визуального подтверждения вставки гена целевого белка, авторы данного изобретения выбрали ген флуоресцентного белка в качестве целевого белка и провели эксперимент и получили инструмент, включающий ген флуоресцентного белка, и получили оплодотворенную яйцеклетку бычьих, включающую инструмент, полученный способом SCNT.

1. Получение вектора инструмента, включающего ген целевого белка

Для получения конечного вектора экспрессии, включающего инструмент, в который включены ген зеленого флуоресцентного белка и ген красного флуоресцентного белка, гены зеленого флуоресцентного белка и красного флуоресцентного белка амплифицируют с применением Gateway ПЦР клонирования (MultiSite Gateway ProPlus, Invitrogen, 12537100, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).

ПЦР праймеры, применяемый для амплификации гена зеленого флуоресцентного белка и гена красного флуоресцентного белка, показаны в таблице 2 ниже.

В настоящем описании, номер последовательности обозначен как SEQ ID №.

[Таблица 2]

Тип праймера	Наименование SEQ	SEQ ID №	Последовательность
GFP-прямой	pr_GFP_F_1	SEQ ID №:1	GgggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcACCATGGCCAGCAAAGGAGAAGAACTT
GFP-обратный	pr_GFP_R_1	SEQ ID №:2	GgggaccactttgtacaagaaagctgggtcTTATTTGTAGAGCTCATCCATGCC
RFP-прямой	pr_RFP_F_1	SEQ ID №:3	GgggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcACCATGGATAGCACTGAGAACGTCAT
RFP-обратный	pr_RFP_R_1	SEQ ID №:4	ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcCTACTGGAACAGGTGGTGGC

Авторы данного изобретения получили конечный вектор экспрессии с применением амплифицированного гена зеленого флуоресцентного белка и/или гена красного флуоресцентного белка.

ФИГ. 24(a) иллюстрирует часть конечного вектора экспрессии для экспрессии зеленого флуоресцентного белка, и ФИГ. 24(b) иллюстрирует часть конечного вектора экспрессии для экспрессии красного флуоресцентного белка.

Для получение конечного вектора экспрессии, применяют pDonor (Invitrogen) в качестве входящего вектора, и PB-CA вектор (с p-CCAGG промотором) и PB-TET вектор (с Tet-on промотором) применяют в качестве вектора доставки.

Последовательности piggyBac (PB), применяемые в экспериментальном примере, показаны в таблице 3 ниже.

[Таблица 3]

Тип транспозона	Наименование SEQ	SEQ ID №	Последовательность
5' PB	tp_PB_1	SEQ ID №:5	TTAACCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATGCATTCTTGAAATATTGCTCTCTCTTTCTAAATAGCGCGAATCCGTCGCTGTGCATTTAGGACATCTCAGTCGCCGCTTGGAGCTCCCGTGAGGCGTGCTTGTCAATGCGGTAAGTGTCACTGATTTTGAACTATAACGACCGCGTGAGTCAAAATGACGCATGATTATCTTTTACGTGACTTTTAAGATTTAACTCATACGATAATTATATTGTTATTTCATGTTCTACTTACGTGATAACTTATTATATATATATTTTCTTGTTATAGATATC
3' PB	tp_PB_2	SEQ ID №:6	TTTGTTACTTTATAGAAGAAATTTTGAGTTTTTGTTTTTTTTTAATAAATAAATAAACATAAATAAATTGTTTGTTGAATTTATTATTAGTATGTAAGTGTAAATATAATAAAACTTAATATCTATTCAAATTAATAAATAAACCTCGATATACAGACCGATAAAACACATGCGTCAATTTTACGCATGATTATCTTTAACGTACGTCACAATATGATTATCTTTCTAGGGTTAA

2. Получение клонированного эмбриона (SCNT)

2-1. Выделение клеток бычьих

Авторы настоящего изобретения выделили фибробласты из бычьего плода, чтобы вставить инструмент, включающий ген целевого белка, в геном.

Ткань бычего плода на 45 день беременности измельчают с применением хирургического скальпеля и диссоциируют при 37°C в течение 1 часа с применением среды Игла в модификации Дульбекко (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), к которой добавлено 25% (масс./об.) трипсина и 1 мМ ЭДТК (Invitrogen).

Обработанные трипсином клетки центрифугируют при 1500 об./мин в течение 2 мин, один раз промывают DPBS без Ca²⁺ и Mg²⁺ и высевают в 100-мм пластиковые чашки для культивирования.

Высеянные клетки культивируют в среде DMEM, в которую добавляют 10% (об./об.) ФТС, 1 мМ глутамина, 25 мМ NaHCO₃, 1% (об./об.) минимальной питательной среды (MEM) при 39°C в условиях увлажненной атмосферы 5% CO₂ и 95% воздухе в течение 6-8 дней.

После удаления неприкрепившихся клеток и кусков из высеянных клеток, прикрепившиеся клетки культивируют до конфлюэнтности в чашке для культивирования, и затем культивируют с интервалами 4-6 дней трипсинизацией в течение 5 мин с применением 0,1% трипсина и 0,02% ЭДТК. Культивированные клетки распределяют в 3 новые чашки для культивирования для дальнейшего субкультивирования, и затее хранят в среде для замораживания в жидком азоте при -196°C.

2-2. Трансфекция вектора инструмента

Авторы данного изобретения оттаивают клетки, которые хранили вышеуказанным способом, культивируют в течение 3-4 дней и выделяют фибробласты из одного слоя с применением трипсина, и получают донорные клетки для SCNT с применением выделенных фибробластов.

За 18-24 часа до трансфекции, выделенные фибробласты распределяют в 6-луночные планшеты. Когда клетки достигают 50-60% конфлюэнтности, проводят трансфекцию фибробластов в соответствии с известным способом производителя.

Плазмидный вектор (PB-CA-GFP), содержащий ген зеленого флуоресцентного белка, и pCy43 вектор (вектор экспрессии транспосазы, Sanger Institute, Hinxton, UK) трансфицируют в выделенные фибробласты, и затем получают донорные клетки, в которых экспрессируется зеленый флуоресцентный белок (далее, GFP донорные клетки).

Дополнительно, плазмидный вектор (PB-TET-RFP), содержащий ген красного флуоресцентного белка и pCy43 вектор (вектор экспрессии транспосазы, Sanger Institute, Hinxton, UK) трансфицируют в выделенные фибробласты, и затем получают донорные клетки, в которых экспрессируется красный флуоресцентный белок (далее, RFP донорные клетки).

pCy43 вектор применяют для транспозиции PB-CA-GFP или PB-TET-RFP.

Экспрессию зеленого флуоресцентного белка подтверждают в GFP донорных клетках, полученных вышеуказанным способом.

На ФИГ. 25(a) показана экспрессия зеленого флуоресцентного белка в GFP донорных клетках (см. ФИГ. 25(a), слева: условия видимого освещения, справа: условия флуоресцентного освещения).

Дополнительно, когда RFP донорные клетки, полученные вышеуказанным способом, обрабатывают доксициклином (2 мг/мл) и неомицином (1 мг/мл), подтверждают экспрессию красного флуоресцентного белка, и исчезновение RFP экспрессии подтверждают на 8 день после удаления доксициклина.

На ФИГ. 25(b) показана экспрессия красного флуоресцентного белка, если RFP донорные клетки обрабатывают доксициклином и неомицином (см. ФИГ. 25(b) (b-1), верх: условия видимого освещения, низ: условия флуоресцентного освещения) и показывают исчезновение экспрессии RFP на 8 день после удаления доксициклина (см. ФИГ. 25(b) (b-2), верх: условия видимого освещения, низ: условия флуоресцентного освещения).

Указанные выше результаты подтверждают, что время экспрессии красного флуоресцентного белка может контролироваться обработкой доксициклином при применении Tet-on промотора.

Другими словами, подтверждено, что если индуцируемый промотор (например, Tet-on промотор) применяют в качестве элемента контроля экспрессии, индуцируемый промотор может действовать через обработку в условиях или материалами, которые могут активировать индуцируемый промотор (например, доксициклин), и что транскрипция и/или трансляция целевого белка может контролироваться своевременным действием индуцируемого промотора.

Через подтверждение присутствия экспрессии флуоресцентного белка была выбрана донорная клетка, имеющая геном, в который вставлен ген целевого белка, и были получены трансгенные эмбрионы ядерным транспортом соматической клетки (SCNT) с применением выбранных донорных клеток.

2-3. Получение клонированного эмбриона с применением донорных клеток (SCNT)

Ядро каждой из GFP донорных клеток или RFP донорных клеток, полученных вышеуказанным способом, переносят в каждый энуклеированный ооцит (энуклеированную яйцеклетку), электрически сливают, активируют иономицином в течение 4 мин и затем культивируют в 6-ДМАП в течение 4 часов.

Клонированный эмбрион, который может экспрессировать зеленый флуоресцентный белок (далее, GFP клонированный эмбрион), или клонированный эмбрион, который может экспрессировать красный флуоресцентный белок (далее, RFP клонированный эмбрион), полученные электрическим слиянием, как описано выше, культивируют в инкубаторе (39°C, 5% CO₂) в 25 мкл микрокапель химически определенной среды, перекрытой минеральным маслом, в течение 7-8 дней. Химически определенную среду готовят общеизвестным способом.

2-4. Подтверждение вставки инструмента, включающего ген целевого белка

2-4-1. Результаты ПЦР, ОТ-ПЦР

Для подтверждения вставки гена зеленого флуоресцентного белка и гена красного флуоресцентного белка в геном бычьих трансгенных эмбрионов, полученных вышеуказанным способом (GFP клонированного эмбриона и RFP клонированного эмбриона), и для определения присутствия/отсутствия в них экспрессии мРНК, проводят ПЦР ДНК и ОТ-ПЦР (Eppendorf Vapo Protect Mastercycler, Eppendorf, Germany).

Для ПЦР ДНК, геном ДНК экстрагируют из крови или клеток трансгенной коровы с применением набора для экстракции ДНК (DNeasy Blood & Tissue kit 69506, Qiagen, Limburg, Netherlands).

Для ОТ-ПЦР, суммарную РНК экстрагируют с применением набора для экстракции РНК (Easy spin total RNA extraction kit, Cat. 17221, iNtRON, Sungnam, Korea) и кДНК синтезируют с применением набора для синтеза кДНК (RNA to cДНК EcoDry Premix Kit, PT5153-2, Clontech, California, US) для синтеза кДНК. Для синтеза кДНК применяют 1 мкг суммарной РНК.

Праймеры, применяемые для ПЦР, показаны в таблице 4 ниже.

[Таблица 4]

Тип праймера	Наименование SEQ	SEQ ID №	Последовательность
GFP-прямой	pr_GFP_F_2	SEQ ID №:7	CACATGAAGCAGCACGACTT
GFP-обратный	pr_GFP_R_2	SEQ ID №:8	AGTTCACCTTGATGCCGTTC
RFP-прямой	pr_RFP_F_2	SEQ ID №:9	CCCCGTAATGCAGAAGAAGA
RFP-обратный	pr_RFP_R_2	SEQ ID №:10	GGTGATGTCCAGCTTGGAGT
GAPDH-прямой	pr_GAPDH_F_1	SEQ ID №:11	GGCGTGAACCACGAGAAGTA
GAPDH-обратный	pr_GAPDH_R_1	SEQ ID №:12	CCCTCCACGATGCCAAAGT

На ФИГ. 26 показаны результаты ОТ-ПЦР и ПЦР ДНК трансгенных эмбрионов (GFP клонированного эмбриона и RFP клонированного эмбриона) (A: результат ПЦР с применением генома ДНК в качестве шаблона, B: результат ПЦР с применением кДНК в качестве шаблона, C: GAPDH мРНК экспрессия через ОТ-ПЦР, M: молекулярный маркер, контроль: не трансформированный эмбрион).

2-4-2. Подтверждение экспрессии флуоресцентного белка в эмбрионе

Экспрессию GFP или RFP без мозаицизма визуально подтверждают в трансгенном эмбрионе (GFP клонированном эмбрионе и RFP клонированном эмбрионе).

На ФИГ. 27(a) показана экспрессия зеленого флуоресцентного белка в GFP клонированном эмбрионе (слева: условия видимого освещения, справа: условия флуоресцентного освещения).

На ФИГ. 27(b) показаны результаты 7-дневного RFP клонированного эмбриона, обработанного доксициклином с последующим культивированием в течение еще двух дней. После обработки трансформированного эмбриона доксициклином, подтверждают экспрессию красного флуоресцентного белка (см. ФИГ. 27(b); справа от пунктирной линии), при этом если не трансформированный эмбрион обрабатывали доксициклином, экспрессия красного флуоресцентного белка не подтверждалась (см. ФИГ. 27(b); слева от пунктирной линии).

Для этого эксперимента было подтверждено, что клетки и/или эмбрионы, имеющие геном, в который вставлен инструмент, включающий ген целевого белка для трансформации, могут выживать без какого-либо конкретного повреждения.

[Экспериментальный пример 2] Получение трансгенной коровы, имеющей геном, в который вставлен ген целевого белка, через микроинъекцию

Авторы данного изобретения провели следующий эксперимент для вставки гена целевого белка в бычий геном.

Как описано выше, для визуального подтверждения вставки гена целевого белка, авторы данного изобретения провели эксперимент выбором гена флуоресцентного белка в качестве целевого белка, и приготовили инструмент, включающий ген флуоресцентного белка и, следовательно, получили оплодотворенную яйцеклетку бычьих, которая включает инструмент, полученный способом микроинъекции (MI) и трансплантировали оплодотворенную яйцеклетку в матку суррогатной матери с получением трансгенной коровы, имеющей геном, в который вставлен ген флуоресцентного белка.

1. Получение вектора инструмента, включающего ген целевого белка

Для получения конечного вектора экспрессии, включающего инструмент, в который включены ген желтого флуоресцентного белка, ген зеленого флуоресцентного белка и ген красного флуоресцентного белка, ген желтого флуоресцентного белка, ген зеленого флуоресцентного белка и ген красного флуоресцентного белка амплифицируют с применением Gateway ПЦР клонирования (MultiSite Gateway ProPlus, Invitrogen, 12537100, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).

Праймеры, применяемые для амплификации гена желтого флуоресцентного белка, гена зеленого флуоресцентного белка и гена красного флуоресцентного белка покупают у Addgene (http://www.addgene.org, Плазмид # 34879).

Конечный вектор экспрессии, включающий инструмент, в который включен ген желтого флуоресцентного белка (далее, YFP вектор) готовят с применением амплифицированного гена. ФИГ. 28(a) иллюстрирует часть YFP вектора.

Дополнительно, кДНК β-казеинового промотора и человеческого интерлейкина 2 (hIL2) амплифицируют с применением Gateway ПЦР клонирования (MultiSite Gateway ProPlus, Invitrogen, 12537100, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Эти кДНК вставляют в PB-GFP путем инфузионного клонирования (In fusion HD cloning kit, lontech, 639644, California, USA), с получением конечного вектора экспрессии, включающего инструмент (5'PB-β-казеиновый промотор-hIL2-pA-pCAG-GFP-Pa-3'PB конструкцию), который включает GFP и hIL2 ген (далее, GFP-hIL2 вектор). ФИГ. 28(b) иллюстрирует часть GFP-hIL2 вектора.

Кроме того, Rox-GFP-polyA-rox и ген красного флуоресцентного белка амплифицируют Gateway ПЦР клонированием (MultiSite Gateway ProPlus, Invitrogen, 12537100, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) и конечный вектор экспрессии (далее, GFP-RFP вектор), включающий инструмент (5'PB-pCAG-rox-GFP-pA-rox-RFP-pA-3'PB конструкцию), который включает Rox-GFP-polyA-rox и ген зеленого флуоресцентного белка, получают с применением амплифицированного Rox-GFP-polyA-rox и гена красного флуоресцентного белка. ФИГ. 28(c) иллюстрирует часть GFP-RFP вектора.

Последовательности sleeping beauty (SB), применяемые в этом эксперименте, показаны в таблице 5 ниже.

[Таблица 5]

Тип транспозона	Наименование SEQ	SEQ ID №	Последовательност
5' SB	tp_SB_1	SEQ ID №:13	atacagttgaagtcggaagtttacatacacttaagttggagtcattaaaactcgtttttcaactactccacaaatttcttgttaacaaacaatagttttggcaagtcagttaggacatctactttgtgcatgacacaagtcatttttccaacaattgtttacagacagattatttcacttataattcactgtatcacaattccagtgggtcagaagtttacatacactaagttgactgtgcctttaaacagcttggaaaattccagaaaatgatgtcatggctttagaagct
3' SB	tp_SB_2	SEQ ID №:14	gtggaaggctactcgaaatgtttgacccaagttaaacaatttaaaggcaatgctaccaaatactaattgagtgtatgtaaacttctgacccactgggaatgtgatgaaagaaataaaagctgaaatgaatcattctctctactattattctgatatttcacattcttaaaataaagtggtgatcctaactgacctaagacagggaatttttactaggattaaatgtcaggaattgtgaaaaagtgagtttaaatgtatttggctaaggtgtatgtaaacttccgacttcaactgtatagggatcctctagctaga

2. Получение эмбриона (MI)

2-1. Сбор яйцеклеток и in vitro созревание (IVM)

Яичники бычьих, собранные в физиологическом растворе (35°C), перевозят из бойни в лабораторию в 2 часов. Комплексы «кумулюс-ооцит» (COC) отсасывают с применением иглы 18 калибра, присоединенной к одноразовому шприцу (10 мл) из 2-8 мм волосяных фолликулов.

COC, которые имеют равномерно гранулированную цитоплазму и окружены клетками яйценосных бугорков с 3 или более слоями, выбирают из отсосанных COC.

Выбранные COC промывают 3 раза HEPES-буферированной средой для культивирования ткани-199 (TCM-199; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) с добавлением 10% ФТС, 2 мМ NaHCO₃ (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) и 1% пенициллина-стрептомицина (об./об.).

Выбранные COC культивируют в 4-луночных чашках (30-40 ооцитов на лунку; Falcon, Becton-Dickinson Ltd., Plymouth, UK) при 39°C и 5% CO₂ в течение 22 часов, с применением среды TCM-199 (450 мкл) с добавлением 10% ФТС, 0,005 ЕОП/мл FSH (Antrin, Teikoku, Japan), 100 мкМ Цистеамина (Sigma-Aldrich) и 1 мкг/мл 17β-эстрадиола (Sigma-Aldrich).

2-2. Сбор сперматозоидов, in vitro оплодотворение (IVF) и in vitro культивирование эмбрионов (IVC)

Сперматозоиды выделяют из размороженной бычьей спермы центрифугированием, и центрифугирование проводят в ступенчатом градиенте Перколла (45-90%) при 1500 об./мин в течение 15 мин.

Раствор Перколла 45% готовят с применением 90% Percoll (Nutricell, Campinas, SP, Brazil) (1 мл) и капацитации-TALP (Nutricell) (1 мл).

Лепешку сперматозоидов, полученную центрифугированием, дважды промывают капацитацией-TALP (Nutricell) при 1500 об./мин в течение 5 мин.

Сперматозоиды с активной подвижностью получают из лепешки сперматозоидов и используют для оплодотворения зрелой яйцеклетки (24-часовое IVM).

Яйцеклетку и 1-2×10⁶ сперматозоидов/мл оплодотворяют в течение 18 часов в условиях 39°C и 5% CO₂влажности в 30 мкл микрокапель среды IVF-TALP (Nutricell), перекрытой минеральным маслом.

Презумптивные зиготы культивируют в культуральной среде, перекрытой минеральным маслом (Sigma-Aldrich), и условия культивирования включают атмосферу 5% O₂, 5% CO₂ и 90% N₂ при 39°C.

На второй день после инкубирования, скорость расщепления зиготы записывают, и развитие эмбриона отслеживают согласно стадиям, описанным International Embryo Transfer Society (IETS).

2-3. Микроинъекция (MI)

Вышеописанный YFP вектор, GFP-hIL2 вектор и GFP-RFP вектор (далее, вектор инструмента) и вектор транспосазы впрыскивают микроинъекцией в цитоплазму оплодотворенной яйцеклетки, в которой удалены клетки яйценосного бугорка, с применением микроинъектора (Femtojet, Eppendorf, Germany).

Соответствующее количество введенного микроинъекцией вектора в цитоплазме оплодотворенной яйцеклетки составляет 100 нг/мл (соотношение вектора инструмент и вектора транспосаз составляет 1:1).

Вектор транспосазы (pCMV (CAT) T7-SB100X) для sleeping beauty (SB) и вектор транспосазы (pCy43) для piggyBac (PB) покупают у Addgene (http://www.addgene.org, Плазмид # 34879) и предоставляются Sanger Institute (Hinxton, UK).

Через семь дней после микроинъекции вектора были выбраны эмбрионы, экспрессирующие флуоресцентный белок.

То есть, с применением вышеуказанного способа, получают эмбрион, имеющий геном, в который вставлен инструмент, включающий ген желтого флуоресцентного белка (далее, YFP эмбрион), эмбрион, имеющий геном, в который вставлен инструмент, включающий ген зеленого флуоресцентного белка и hIL2 ген (далее, GFP-hIL2 эмбрион) и эмбрион, имеющий геном, в который вставлен инструмент, включающий rox-GFP-polyA-rox и ген красного флуоресцентного белка (далее, GFP-RFP эмбрион).

3. Получение трансгенной коровы, имеющей геном, в который вставлен инструмент, включающий ген целевого белка

3-1. Получение трансгенной коровы

Авторы данного изобретения получают трансгенную корову трансплантацией бычьего эмбриона, полученного вышеописанной микроинъекцией, в матку суррогатной матери.

Эмбрион, который экспрессирует флуоресцентный белок, переносят в рог матки суррогатной матери трансцервикальным способом в ФРФБ с добавлением 20% ФТС.

На 45 день после эструса, выживание эмбриона и беременность подтверждают ректальной пальпацией и ультрасонографией.

3-2. Получение особи SNU-SB1 (самки) и подтверждение присутствия/отсутствия вставки инструмента, включающего ген целевого белка

SNU-SB1 (самка) рождается от суррогатной матери, в которую был трансплантирован YFP эмбрион вышеуказанным способом. На ФИГ. 29(a) показана SNU-SB1.

Экспрессия желтого флуоресцентного белка была подтверждена в носу SNU-SB1, и экспрессия желтого флуоресцентного белка была подтверждена в первичных клетках кожи.

На ФИГ. 29(b) показана экспрессия желтого флуоресцентного белка в носу SNU-SB1, и на ФИГ. 29(c) показана экспрессия желтого флуоресцентного белка в первичных клетках кожи SNU-SB1 (см. ФИГ. 29(c), левый ряд: клетки кожи коровы дикого типа, правый ряд: клетки кожи трансгенной коровы, верх: условия видимого освещения, низ: флуоресцентные условия).

Кроме того, вставка гена желтого флуоресцентного белка была подтверждена ПЦР ДНК. На ФИГ. 29(d) показаны результаты подтверждения вставки гена желтого флуоресцентного белка через ПЦР ДНК (см. ФИГ. 29(d), 1: молекулярный маркер, 2: корова дикого типа, 3: группа положительного контроля, 4: кровь трансгенной коровы, 5: ткань уха трансгенной коровы, 6: плацента трансгенной коровы, 7: группа отрицательного контроля).

Способ экстракции ДНК для ПЦР ДНК был описан выше, и поэтому подробное объяснение здесь опущено.

3-3. Получение особи SNU-PB2 (самки) и подтверждение присутствия/отсутствия вставки инструмента, включающего ген целевого белка

SNU-SB1 (самка) рождается от суррогатной матери, в которую был трансплантирован GFP-hIL2 эмбрион вышеуказанным способом.

Экспрессию зеленого флуоресцентного белка была подтверждена в глазах, носу и т.д. SNU-SB2, и экспрессия зеленого флуоресцентного белка была также подтверждена в первичных клетках кожи SNU-SB2.

На ФИГ. 30(а) показана экспрессия зеленого флуоресцентного белка в глазах и носу SNU-SB2, и на ФИГ. 30(b) показана экспрессия зеленого флуоресцентного белка в первичных клетках кожи SNU-SB2 (см. ФИГ. 30(b), слева: условия видимого освещения, справа: флуоресцентные условия).

Кроме того, вставка гена зеленого флуоресцентного белка, который является геном, включенным в GFP-hIL2 вектор, в геноме была подтверждена ПЦР ДНК (Eppendorf Vapo Protect Mastercycler, Eppendorf, Germany).

На ФИГ. 30(c) показаны результаты, подтверждающие вставку гена зеленого флуоресцентного белка через ПЦР ДНК (см. ФИГ. 30(c), 1: молекулярный маркер, 2: корова дикого типа, 3: кровь трансгенной коровы, 4: группа положительного контроля, 5: группа отрицательного контроля).

Дополнительно, вставка гена зеленого флуоресцентного белка в геном и экспрессия мРНК была подтверждена через ОТ-ПЦР (Eppendorf Vapo Protect Mastercycler, Eppendorf, Germany) с применением первичных клеток бычьих.

На ФИГ. 30(d) показаны результаты, подтверждающие вставку гена зеленого флуоресцентного белка через ОТ-ПЦР (см. ФИГ. 30(d), 1: кДНК коровы дикого типа, 2: кДНК трансгенной коровы, 3: группа отрицательного контроля).

Способ экстракции ДНК и РНК для ПЦР ДНК и ОТ-ПЦР описан выше, и поэтому его конкретные объяснения здесь опущены.

Указанные выше результаты подтверждают, что ген, включенный в GFP-hIL2 вектор, вставлен в геном SNU-PB2.

3-4. Получение особи SNU-PB1 (самца) и подтверждение присутствия/отсутствия вставки инструмента, включающего ген целевого белка

SNU-PB1 (самец) рождается от суррогатной матери, в которую был трансплантирован GFP-RFP эмбрион вышеуказанным способом. На ФИГ. 31(a) показана экспрессия зеленого флуоресцентного белка в SNU-PB1.

Экспрессию зеленого флуоресцентного белка наблюдают до трансфицирования Dre рекомбиназы в первичные клетки кожи, которые выделяют из SNU-PB1 и культивируют.

После трансфекции Dre рекомбиназы в форме мРНК в первичные клетки кожи, которые выделяют из SNU-PB1 и культивируют, экспрессию красного флуоресцентного белка наблюдают в клетке.

На ФИГ. 31(b) показаны результаты, подтверждающие экспрессию зеленого флуоресцентного белка и экспрессию красного флуоресцентного белка в первичных клетках кожи, которые выделяют из SNU-PB1 и культивируют (см. ФИГ. 31(b), верх: условия видимого освещения, низ: флуоресцентные условия, слева: до трансфекции Dre рекомбиназы, справа: после трансфекции Dre рекомбиназы).

Кроме того, до трансфекции Dre рекомбиназы, вставку гена зеленого флуоресцентного белка в геном и экспрессию мРНК подтверждают ПЦР ДНК и ОТ-ПЦР (см. ФИГ. 32(a) и ФИГ. 32(b)). На ФИГ. 32(a) показаны результаты ПЦР ДНК до трансфекции Dre рекомбиназы (см. ФИГ. 32(a), 1: молекулярный маркер, 2: корова дикого типа, 3: кровь трансгенной коровы, 4: группа положительного контроля (ген зеленого флуоресцентного белка), 5: отрицательная группа). На ФИГ. 32(b) показаны результаты ОТ-ПЦР до трансфекции Dre рекомбиназы (см. ФИГ. 32(b), 1: молекулярный маркер, 2: корова дикого типа, 3: трансгенная корова, 4: отрицательная группа).

Дополнительно, было подтверждено, что ген зеленого флуоресцентного белка был исключен из генома после трансфекции Dre рекомбиназы. На ФИГ. 32(c) показаны результаты ПЦР ДНК после трансфекции Dre рекомбиназы (см. ФИГ. 32(c), 1: молекулярный маркер, 2: до трансфекции Dre, 3: после трансфекции Dre, 4: отрицательная группа).

Из указанных выше результатов авторы данного изобретения подтверждают, что желаемый тип целевого белка может экспрессироваться при своевременном контроле предоставления рекомбиназы в клетку или животное имеющее геном, в который вставлен сайт распознавания рекомбиназы (RRS).

4. Получение трансгенного детеныша коровы, имеющего геном, в который вставлен инструмент, включающий ген целевого белка

4-1. Трансгенный детеныш коровы

4-1-1. SNU-F1-1 корова

Детеныш коровы (SNU-F1-1) был рожден естественным скрещиванием между коровой (SNU-SB1) быком (SNU-PB1).

На ФИГ. 33(a) показан SNU-F1-1, который является детенышем коровы, и SNU-SB1, которая является родительской коровой (см. ФИГ. 33(a), левая стрелка: SNU-F1-1, правая стрелка: SNU-SB1).

Авторы настоящего изобретения визуально подтвердили, что зеленый флуоресцентный белок экспрессируется в первичных клетках кожи SNU-F1-1, который является детенышем коровы, и визуально подтвердили, что красный флуоресцентный белок экспрессируется после обработки Dre рекомбиназой.

На ФИГ. 33(b) показано, что зеленый флуоресцентный белок экспрессируется в первичных клетках кожи SNU-F1-1 до обработки Dre рекомбиназой, и что красный флуоресцентный белок экспрессируется после обработки Dre рекомбиназой (верх: до обработки Dre, низ: после обработки Dre).

Кроме того, ПЦР ДНК анализ подтверждает, что PB-CAG промотор-Rox-GFP-Rox-RFP-PB, который является конструкцией GFP-RFP вектора, вставлен в геном SNU-F1-1.

На ФИГ. 34 показаны результаты анализа ПЦР ДНК для SNU-F1-1 (см. ФИГ. 34, 1: молекулярный маркер, 2: группа положительного контроля (GFP-RFP вектор), 3: ДНК, полученная от коровы дикого типа, 4: ДНК, полученная из крови SNU-PB1, 5: ДНК, полученная из крови SNU-F1-1, 6: ДНК, полученная обработкой клеток SNU-F1-1 Dre рекомбиназой, 7: группа отрицательного контроля (безнуклеазная вода)). Способ экстракции ДНК для ПЦР ДНК описан выше, и поэтому его конкретные объяснения здесь опущены.

Дополнительно, авторы данного изобретения проанализировали последовательность ДНК детеныша коровы (SNU-F1-1), и результаты анализа подтвердили, что инструмент, включающий PB-CAG промотор-Rox-GFP-Rox-RFP-PB, который вставлен в геном быка (SNU-PB1), вставлен в геном детеныша коровы (SNU-F1-1). Локус вставки инструмента описан ниже.

4-1-2. SNU-F1-2 корова

Корова (SNU-PB2) беременеет SNU-F1-2 путем естественного скрещивания коровы (SNU-PB2) и быка (SNU-PB1). Корова (SNU-PB2) во время беременности была атакована другой коровой и ранена, поэтому корова (SNU-PB2) была умерщвлена.

Авторы данного изобретения подтвердили, зеленый флуоресцентный белок экспрессируется в фетальных фибробластах, полученных из плода SNU-F1-2.

На ФИГ. 35 показано, что зеленый флуоресцентный белок экспрессируется в фибробластах плода SNU-F1-2 (см. ФИГ. 35 ниже, слева: условия видимого освещения, справа: флуоресцентные условия).

Дополнительно, через анализ последовательности ДНК плода SNU-F1-2, авторы данного изобретения подтвердили, что инструмент, включающий PB-beta-казеиновый промотор-hIL2-pA-CAG промотор-GFP-pA-PB, который вставлен в геном коровы (SNU-PB2), был также добавлен в геном плода SNU-F1-2. Локус вставки инструмента описан ниже.

В этом эксперименте было подтверждено, что животные имеющие геном, в который вставлен ген целевого белка для трансфекции, могут выживать без проблем со здоровьем и давать здоровое потомство.

Дополнительно, эти результаты подтверждают, что инструмент, включенный в трансгенный бычий геном F0 поколения, может быть перенесен в F1 поколение.

4-2. Коровье молоко

Для демонстрации того, что белок, экспрессируемый из гена, вставленного в геном, может быть включен в коровье молоко, авторы данного изобретения проанализировали молоко коровы, в которую вставлен инструмент с той же конструкцией, как и инструмент, вставленный в геном SNU-PB2 (инструмент с конструкцией 5'PB-β-казеиновый промотор-hIL2-pA-pCAG-GFP-Pa-3'PB).

В результате анализа молока коровы, имеющей геном, в который вставлен инструмент, включающий ген флуоресцентного белка, с применением конфокального микроскопа, было визуально подтверждено, что зеленый флуоресцентный белок экспрессируется в коровьем молоке.

На ФИГ. 36(a) показаны результаты, подтверждающие присутствие/отсутствие экспрессии флуоресцентного белка в коровьем молоке, полученные с применением конфокального микроскопа (см. ФИГ. 36(a), слева: молоко коровы дикого типа, справа: молоко трансгенной коровы со вставленным инструментом).

Дополнительно, было подтверждено ELISA, что человеческий интерлейкин (hIL), экспрессированный компонентом инструмента, включен в коровье молоко.

На ФИГ. 36(b) показаны результаты, подтверждающие через ELISA, что человеческий интерлейкин включен в молоко (см. ФИГ. 36(b), верх: ELISA контроль, низ: 1-3; молоко коровы дикого типа, 4-8; молоко трансгенной коровы со вставленным инструментом).

Было подтверждено, что даже когда детеныш коровы пьет молоко, в которое включены зеленый флуоресцентный белок и человеческий интерлейкин (hIL), детеныш коровы может выживать без проблем со здоровьем.

В этом эксперименте было подтверждено, что белки, экспрессированные через транскрипцию и трансляцию экзополинуклеотида, могут быть включены в молоко трансгенной коровы. То есть, было подтверждено, что трансгенная корова может применяться в качестве биореактора.

5. Локус вставки в геном, в который может быть вставлен ген целевого белка

Авторы настоящего изобретения подтвердили посредством анализа последовательности, локусы вставки, в которые может быть вставлен инструмент, включающий ген целевого белка (например, ген флуоресцентного белка) в геном F0 трансгенной коровы и детеныша коровы.

Образцы ДНК получают для анализа последовательности, и образцы ДНК экстрагируют из крови или первичных клеток согласно протоколу производителя с применением набора для экстракции ДНК. Качество геномной ДНК (O.D. 260/280 соотношение составляет 1,8-2,0 и O.D. 260/230 соотношение больше 1,6) и количество (1 мкг) для получения библиотеки подтверждают набора для анализа с применением флуорометрического набора для анализа днДНК Qubit (Invitrogen, CA) и Infinite F200 Pro NanoQuant (TECAN, Männedorf).

Для получения библиотеки для массового анализа последовательности, геном ДНК, очищенный из образцов F0 трансгенной коровы (SNU-SB1, SNU-PB1 и SNU-PB2) и детенышей коровы (SNU-F1-1 и SNU-F1-2) произвольно расщепляют с применением Covaris S2 Ultrasonicator с получением фрагментов ДНК со средним размером 350 п.о. Библиотеку для секвенирования ДНК получают с применением набора TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit (от Illumina (San Diego, CA, USA)), и библиотеку получают согласно протоколу производителя.

Размер и качество конечной библиотеки оценивают с применением набора Agilent High Sensitivity DNA kit (AgilentTechnologies, Santa Clara).

Секвенирование проводят в Illumina HiSeq 2500 с применением набора TruSeq Paired End Cluster Kit v3 и TruSeq SBS Kit v3-HS (FC-401-3001), и анализ изображения проводят с применением программы HiSeq control (ver. 2.2.58).

Оставшиеся прочтения проводят с применением BWA ver. 0.7.5a. и генома Bos taurus (UMD 3.1, http://asia.ensembl.org/Bos_taurus/Info/Annotation) и одновременно локализируют ген целевого белка последовательностей.

Локус вставки гена целевого белка анализируют с применением данных картирования BAM (форма выравнивания), полученных BWA.

BWA означает, что, как определено схемой подсчета, подобной Smith-Waterman, часть нуклеотидов можно опустить (далее, Soft-Clipped) в крайнем значении считывания.

Локус вставки выводят через подтверждение шаблона локализации последовательности Soft-Clipped.

Кроме того, параллельно применялись программы Delly для оценки изменений в структуре генома как показателя вставки гена целевого белка.

Наконец, кандидатный локус вставки проверяли вручную с применением программы IGV.

Вариацию числа копий (CNV) подтверждали программой Control-FREEC. Эту программу применяют для расчета кратных значений представляющей интерес области.

5-1. Локус вставки генома трансгенной коровы в родительском поколении, в который может быть вставлен ген целевого белка

Далее описаны места вставки в геном трансгенной коровы в родительском поколении, подтвержденные анализом последовательности, куда вставлен инструмент, включающий ген целевого белка.

В таблице 6 ниже описаны локусы вставки, в которых инструмент вставлен в геном SNU-SB-1.

В таблице 7 ниже описаны локусы вставки, в которых инструмент вставлен в геном SNU-PB-1.

В таблице 8 ниже описаны локусы вставки, в которых инструмент вставлен в геном SNU-PB-2.

Количества локусов, описанные в таблицах 6-10 ниже, показывают искусственно пронумерованные локации в хромосоме, в которую вставлены инструменты.

Как описано выше, локус инструмента может быть определен одним или более из следующих двух: эндогенным геном, расположенным максимально близко к 5' концу инструмента на основе инструмента (далее, 5' ген); и эндогенным геном, расположенным максимально близко к 3' концу инструмента на основе инструмента (далее, 3' ген).

Например, локусы с номерами 4-1 и 21-1 в таблице 6 ниже являются разными локусами, присутствующими в бычьем геноме.

В другом примере, локусы с номерами 6-1 и 6-2 в таблице 7 ниже являются разными локусами, присутствующими в бычьем геноме.

[Таблица 6]

Хромосома бычьего генома	Локус №	5' Ген	3' Ген
4	4-1	MIS184	HUNK
21	21-1	TRPM1	APBA2
26	26-1	MKI67	EBF3

[Таблица 7]

Хромосома бычьего генома	Локус №	5' Ген	3' Ген
1	1-1	MIS184	HUNK
2	2-1	SLC38A11	COBLL1
3	3-1	GBP5	GBP4
4	4-2	TSGA13	MKLN1
5	5-1	ATXN7L3B	CAPS2
6	6-1	DKK2	GIMD1
6	6-2	PLAC8	COQ2
7	7-1	ERAP2	LNPEP
14	14-1	CSMD3	CSMD3
17	17-1	ORAI1	RNF34
22	22-1	bta-mir-2370	DENND6A
25	25-1	AUTS2	ENSBTAG00000047342
26	26-2	EMX2	RAB11FIP2
X	X-1	WWC3	DDX3Y

[Таблица 8]

Хромосома бычьего генома	Локус №	5' Ген	3' Ген
3	3-2	PEX19	PEA15
3	3-3	PDE4B	OB-R
5	5-2	TMEM5	AVPR1A
	5-3	XRCC6BP1	CTDSP2
	5-4	MPST	KCTD17
6	6-3	LCORL	SLIT2
7	7-2	C7H5orf30	NUDT12
9	9-1	STXBP5	SAMD5
10	10-1	ALDH6A1	VSX2
11	11-1	PTP	LRRTM4
11	11-2	PSMD13	-
15	15-1	SMAP	INSC
18	18-1	HSD17B2	CDH13
X	X-2	ARAF	SYN1
X	X-3	PBDC1	MAGEE2

5-2. Локус вставки в геноме детеныша коровы, в который может быть вставлен ген целевого белка

5-2-1. Сравнение локусов вставки гена целевого белка, вставленного в геном родительского поколения трансгенной коровы и геном детеныша коровы

Далее сравнивают места вставки, куда вставлен инструмент, включающий ген целевого белка в геном родительского поколения трансгенной коровы, и места вставки, куда вставлен инструмент, включающий ген целевого белка, в геном детеныша коровы, подтвержденные анализом последовательности.

В таблице 9 описаны локусы вставки, в которых инструменты вставлены в геном SNU-F1-1.

[Таблица 9]

Хромосома бычьего генома	Локус №	5' Ген	3' Ген
4	4-2	TSGA13	MKLN1
4	4-4	ENSBTAG00000001198.5	ENSBTAG00000046257.1
6	6-1	DKK2	GIMD1

В результате анализа последовательности с применением фибробластов кожи детеныша коровы было подтверждено, что локус вставки, в который вставлен инструмент в геном SNU-F1-1, детеныша коровы, частично перекрывается с локусом вставки, в котором инструмент вставлен в геном родительского поколения коровы (SNU-PB1, самец) (см. таблицы 7 и 9).

В таблице 10 ниже описаны локусы вставки, в которых инструменты вставлены в геном SNU-F1-2.

[Таблица 10]

Хромосома бычьего генома	Локус №	5' Ген	3' Ген
1	1-2	ENSBTAG00000025847.3	ENSBTAG00000011051.5
3	3-4	PDE4B	LEPR
4	4-3	NPVF	C7orf31
10	10-1	ALDH6A1	VSX2
12	12-1	ENSBTAG00000010680.5	U2
X	X-3	PBDC1	MAGEE2

В результате анализа последовательности с применением фибробластов плода SNU-F1-2, детеныша коровы, было подтверждено, что локус вставки, в который вставлен инструмент в геном SNU-F1-2, детеныша коровы, частично перекрывается с локусом вставки, в котором инструмент вставлен в геном родительского поколения коровы (SNU-PB2, самка) (см. таблицы 8 и 10).

Как описано выше, посредством анализа последовательности, было подтверждено, что, по меньшей мере, один локус вставки, в который ген целевого белка вставлен в геном животного родительского поколения, может быть без изменений передан в геном животного потомства поколения и присутствует там.

5-2-2. Корреляция между количеством генов целевых белков, вставленных в геном, и уровнем экспрессии целевого белка

Авторы настоящего изобретения проанализировали SNU-F1-1 и SNU-F1-2, и тем самым изучили корреляцию между уровнями экспрессии целевых белков и количеством генов целевых белков, вставленных в геном клетки. Это было подтверждено измерением интенсивности флуоресценции в фибробластах кожи SNU-F1-1 и фибробластах, полученных из плода SNU-F1-2.

Изменением интенсивности флуоресценции было подтверждено, что уровень экспрессии флуоресцентного белка в фибробластах, полученных из плода SNU-F1-2, в около 2,2 раза выше, чем в фибробластах SNU-F1-1 (см. ФИГ. 35, верх: SNU-F1-1, низ: SNU-F1-2, слева: условия видимого освещения, справа: флуоресцентные условия).

Для количественной оценки интенсивности флуоресценции образцов SNU-F1-1 и SNU-F1-2 были получены изображения клеток одинакового размера и плотности с использованием ImageJ (v1.50, NIH).

Результаты подтверждают, что хотя ген целевого белка вставлен в 6 сайтов вставки в геноме SNU-F1-2, ген целевого белка вставлен в 3 сайта вставки в геноме SNU-F1-1, уровень экспрессии гена целевого белка (трансформированного белка, экспрессируемого геном, вставленным извне) в трансгенной клетке бычьих коррелирует с числом копий генов, вставленных извне.

[Экспериментальный пример 3] Редактирование генома, имеющего ген целевого белка, вставленный в геном в качестве целевого сайта

Авторы настоящего изобретения провели эксперименты, демонстрирующие, что редактирование генома может быть выполнено с целью искусственной вставки гена целевого белка в бычий геном в соответствии с указанным способом.

То есть, судя по результатам эксперимента, представленным ниже, подтверждается возможность редактирования генома даже в «искусственном сайте редактирования», искусственно вставленном в геном.

Для более эффективного подтверждения того, что редактирование генома может происходить в гене целевого белка, который искусственно вставлен в геном, авторы настоящего изобретения провели следующий эксперимент с применением клетки, имеющей геном, в который вставлен ген зеленого флуоресцентного белка вставлен в качестве гена целевого белка.

1. Нокаут гена целевого белка

1-1. Выделение фибробластов, имеющих геном, в который вставлен ген зеленого флуоресцентного белка

Для подтверждения того, что ген целевого белка, вставленный извне, может быть нокаутирован, авторы настоящего изобретения выделили фибробласты, имеющие геном, в который вставлен ген зеленого флуоресцентного белка (далее, GFP фибробласт) из ткани трансформированного эмбриона, имеющего геном, в который вставлен геном зеленого флуоресцентного белка.

Для выделения GFP фибробластов берут плод от суррогатной матери, в которую был трансплантирован GFP эмбрион, и забор плода продолжают на 40 день беременности суррогатной матери.

Кожу собранного плода подвергают ферментативному перевару коллагеназой, а затем первичные фибробласты прикрепляют к чашкам для культивирования.

Первичные фибробласты расширяли культуральной средой (DMEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA), 15% ФТС (Gibco), 100 мМ бета-маркаптоэтанола (Sigma), 1% NEAA (Sigma) и 1% пенициллина/стрептомицина (Gibco)) в чашках для культивирования.

Экспрессию зеленого флуоресцентного белка в выделенных фибробластах подтверждают флуоресцентным микроскопом (Nikon, Tokyo, Japan).

1-2. Трансфекция вектора CRISPR/Cas9, нацеленного на ген целевого белка

Для нокаута ген зеленого флуоресцентного белка, вставленного в геном GFP фибробласта, выделенного вышеописанным способом, применяют модифицированную систему CRISPR/Cas9 с применением одиночной направляющей РНК (енРНК).

Для нокаута ген зеленого флуоресцентного белка, получают вектор экспрессии енРНК, имеющий U6 промотор, и вектор экспрессии Cas9, имеющий CMV промотор.

ФИГ. 37(a) иллюстрирует созданную енРНК для специфического нацеливания на ген зеленого флуоресцентного белка.

ФИГ. 37(b) иллюстрирует вектор экспрессии енРНК и вектор экспрессии Cas9 (слева: вектор экспрессии енРНК, справа: вектор экспрессии Cas9).

Вектор экспрессии енРНК и вектор экспрессии Cas9 белка (всего 10 г, соотношение 1:3) трансфицируют на фибробласты, выделенные вышеуказанным способом. Трансфицированные фибробласты затем культивируют в инкубаторе (38°C, 5% CO₂) в течение 10 дней.

1-3. Подтверждение экспрессии флуоресцентного белка и вставка/делеция для подтверждения нокаута

Вектор экспрессии енРНК и вектор экспрессии Cas9 трансфицируют в фибробласты, выделенные вышеуказанным способом, и затем исключение экспрессии зеленого флуоресцентного белка подтверждают флуоресцентным микроскопом.

На ФИГ. 38(a) показаны результаты, подтверждающие, что зеленый флуоресцентный белок не экспрессировался после трансфицирования вектора экспрессии енРНК и вектора экспрессии Cas9 в фибробласты, имеющие геном, в который вставлен ген зеленого флуоресцентного белка (см. ФИГ. 38(a), a: условия видимого освещения, a': флуоресцентные условия).

То есть, было подтверждено, что ген зеленого флуоресцентного белка был нокаутирован после трансфекции вектора экспрессии енРНК и вектора экспрессии Cas9.

Дополнительно, авторы данного изобретения выделили полногеномную ДНК из фибробласта, включающего отрицательную колонию зеленого флуоресцентного белка и подтвердили вставку/делецию гена зеленого флуоресцентного белка в качестве целевого сайта ПЦР амплификацией.

Выделение полногеномной ДНК провели с применением набора G-spinTM Total DNA Extraction Mini Kit (iNtRON, Seoul, Republic of Korea).

Фрагмент 575 п.о., включающий целевой сайт, амплифицировали праймерами так, чтобы идентифицировать вставку/делецию целевого сайта ПЦР амплификацией. Праймеры показаны в таблице 11 ниже.

[Таблица 11]

ПЦР праймер	Наименование SEQ	SEQ ID №	Последовательность
Прямой	in_pr_GFP_F_1	SEQ ID №:15	GGACTTCCTTTGTCCCAAATCT
Обратный	in_pr_GFP_R_1	SEQ ID №:16	TAGCGGCTGAAGCACTGC

На ФИГ. 38(b) показана вставка/делеция, которая происходит в гене зеленого флуоресцентного белка.

Этим экспериментом было подтверждено, что направляющая нуклеиновая кислота, предоставленная извне, может вызвать нокаут определенного гена в бычьем геноме, и что корова может выжить даже если нокаут произошел в определенном гене в бычьем геноме.

2. Нокин донорного полинуклеотида

Авторы настоящего изобретения провели эксперимент, в котором донорный полинуклеотид был нокинирован с применением гена зеленого флуоресцентного белка, вставленного в трансгенный бычий геном, полученный вышеуказанным способом, в качестве целевого генома.

Первичные клетки получают из трансгенной коровы (например SNU-PB2), полученной вышеуказанным способом, плазмидные векторы трансфицируют в первичные клетки через технологию Nucleofactor (Neon, Invitrogen; программа #16).

В качестве плазмидного вектора применяют i) вектор экспрессии енРНК, имеющий U6 промотор (Toolgen, Seoul, Republic of Korea, нацеливание на GFP ген), ii) вектор экспрессии CRISPR/Cas9, имеющий CMV промотор, и iii) вектор экспрессии донорной ДНК (гена устойчивости к пуромицину).

Трансфицированные первичные клетки культивируют с 4 мкг/мл пуромицина (GIBCO) в течение 3 дней. После замены на свежую культуральную среду, первичные клетки культивируют в течение еще 10 дней.

В результате было подтверждено, что, в случае первичных клеток, трансфицированных вектором экспрессии енРНК (Toolgen, Seoul, Republic of Korea), вектором экспрессии CRISPR/Cas9 и вектор экспрессии донорной ДНК (ген устойчивости к пуромицину), колонии выживали, даже при обработке пуромицином.

На ФИГ. 39 показано, что когда первичные клетки, имеющее геном, в который вставлен ген зеленого флуоресцентного белка, трансфицированы нРНК, Cas9 и донорной ДНК (ген устойчивости к пуромицину), которые могут связываться с геном зеленого флуоресцентного белка, первичные клетки имеют резистентность к пуромицину.

Дополнительно, было подтверждено, что, в случае, когда первичные клетки трансфицированы вектором экспрессии енРНК (Toolgen, Seoul, Republic of Korea), вектором экспрессии CRISPR/Cas9 и вектором экспрессии донорной ДНК (ген устойчивости к пуромицину), которые нацелены на зеленый флуоресцентный белок, зеленый флуоресцентный белок больше не экспрессируется.

На ФИГ. 40 показано, что зеленый флуоресцентный белок не экспрессируется в первичных клетках, трансфицированных вектором экспрессии енРНК (Toolgen, Seoul, Republic of Korea), вектором экспрессии CRISPR/Cas9 и вектор экспрессии донорной ДНК (ген устойчивости к пуромицину), которые нацелены на зеленый флуоресцентный белок (см. ФИГ. 40, 1: до трансфекции, 2: после трансфекции).

Вышеуказанные результаты i) результаты выживания колоний и ii) отсутствие экспрессии зеленого флуоресцентного белка, подтвердили, что система CRISPR/Cas с применением енРНК и CRISPR/Cas9 работает в первичных клетках SNU-PB-2.

Кроме того, авторы данного изобретения провели эксперимент по нокину донорного полинуклеотида (включающего ген красного флуоресцентного белка) с применением гена зеленого флуоресцентного белка (GFP гена), который вставлен в геном вышеописанного детеныша коровы (SNU-F1-1) в качестве целевого гена.

Как и в вышеуказанном способе, получают первичные клетки SNU-F1-1 и i) вектор экспрессии енРНК, имеющий U6 промотор (Toolgen, Seoul, Republic of Korea, нацеливание на GFP ген), ii) вектор экспрессии CRISPR/Cas9, имеющий CMV промотор, и iii) вектор экспрессии донорной ДНК (включающий ген красного флуоресцентного белка) были трансфицированы в первичные клетки через технологию Nucleofactor (Neon, Invitrogen; программа #16).

ФИГ. 41 иллюстрирует способ, в котором донорный полинуклеотид (414) нокинирован в ген зеленого флуоресцентного белка, присутствующий в геноме первичных клеток.

В случае, когда первичные клетки трансфицированы вектором экспрессии енРНК (Toolgen, Seoul, Republic of Korea), вектором экспрессии CRISPR/Cas9 и вектором экспрессии донорной ДНК (включающей ген красного флуоресцентного белка), было подтверждено, что зеленый флуоресцентный белок больше не экспрессируется, и что красный флуоресцентный белок экспрессируется (см. ФИГ. 42).

На ФИГ. 42 показано, что ген зеленого флуоресцентного белка нокаутирован в первичных клетках, имеющих геном, в который вставлен ген зеленого флуоресцентного белка, и после нокина гена красного флуоресцентного белка, ген красного флуоресцентного белка экспрессиурется в них.

Из вышеуказанных результатов i) отсутствия экспрессии зеленого флуоресцентного белка и ii) экспрессии красного флуоресцентного белка, было подтверждено, что система CRISPR/Cas с применением енРНК и CRISPR/Cas9 может работать даже в первичных клетках детеныша коровы.

В этом эксперименте было подтверждено, что донорный полинуклеотид может быть нокинирован наличием искусственного сайта редактирования, вставленного извне в качестве целевого сайта.

Дополнительно, в этом эксперименте было подтверждено, что клетки могут выживать даже если донорный полинуклеотид нокинирован в целевом сайте, присутствующем в геноме клетки.

Кроме того, в этом эксперименте было подтверждено, что в случае, когда донорный полинуклеотид нокинирован с применением гена флуоресцентного белка в качестве целевого гена, клетки, в которых происходит (n+1) редактирование генома, могут быть выбраны с применением клетки, имеющей геном, в который вставлен ген флуоресцентного белка (клеток, в которых произошло n-ное редактирование генома; n является натуральным числом 1 или более), используя тот факт, что сигнал флуоресценции клеток, поступающий вовне, становится слабее из-за отсутствия экспрессии флуоресцентного белка.

[Экспериментальный пример 4] Трансгенная корова, в которой экспрессиурется РНК-направляемая эндонуклеаза

1. Получение трансгенной коровы, в которой экспрессируется РНК-направляемая эндонуклеаза

Авторы настоящего изобретения провели следующий эксперимент, чтобы получить трансгенную корову, в которой экспрессируется РНК-направляемая эндонуклеаза (далее, корову spCas9).

1-1. Получение вектора

spCas9 кДНК (предоставленную Toolgen), включающую ген устойчивости к пуромицину и ген красного флуоресцентного белка (RFP ген), клонируют ПЦР.

Дополнительно, Fat-1 ДНК на основе базы данных NCBI синтезируют, и Fat-1 ген клонируют вместе с EF1alpha промотором.

Cas9-Puro-RFP, EF1 альфа и fat-1 ДНК вставляют в piggyBac транспозонный вектор экспрессии (PB транспозонынй вектор экспрессии) с получением конечного вектора экспрессии (далее, spCas9 вектор; PB-CAG-Cas9-RFP-EF1-fat1).

ФИГ. 43(a) иллюстрирует часть spCas9 вектора.

Последовательности piggyBac (PB), применяемые в этом экспериментальном примере, такие же, как показаны в таблице 3 выше.

1-2. Получение эмбриона (MI)

Так как способ интеграции spCas9 гена в бычий геном и условия эксперимента являются такими же, как для вставки гена целевого белка и условий его эксперимента, способ получения эмбриона, имеющего геном, в который вставлен spCas9 ген, будет описан коротко.

Как описано выше, яйцеклетки бычьих собирали путем отделения COC от яичника с последующим промыванием, а сперматозоиды собирали путем отделения от спермы бычьих центрифугированием.

После удаления клетки яйценосного бугорка из оплодотворенной яйцеклетки, полученной in vitro оплодотворением собранных яйцеклеток и сперматозоидов, вектор spCas9 и вектор транспосазы вводят микроинъекцией в цитоплазму (каждая 50 нг/мл, соотношение 1:1) с применением микроинъектора (Femtojet, Eppendorf, Germany). Вектор транспосазы (pCy43) предоставлен Sanger Institute (Hinxton, UK).

Во впрыснутом микроинъекцией эмбрионе экспрессируется красный флуоресцентный белок.

На ФИГ. 43(b) показано, что красный флуоресцентный белок экпрессируется в эмбрионе, в который вектор spCas9 вставлен микроинъекцией.

Так как вектор spCas9 включает ген красного флуоресцентного белка (см. ФИГ. 43(a)), экспрессия красного флуоресцентного белка подтверждает, что spCas9 ген вставлен в геном эмбриона, в который вектор был введен микроинъекцией.

1-3. Получение трансгенной коровы

1-3-1. Трансгенная корова

Поскольку способ трансплантации трансформированного эмбриона в матку суррогатной матери и его экспериментальные условия описаны выше, способ получения коровы spCas9 (F0) кратко описан ниже.

Эмбрион, полученный вышеуказанным способом, трансплантируют в матку суррогатной матери, на 45 день после эструса было установлено, что 4 суррогатные матери беременны, что подтверждено ректальной пальпацией и ультрасонографией.

После периода беременности были рождены четыре spCas9 коровы (F0). На ФИГ. 43(c) показана SNU-Cas9-2 (F0).

В таблице 12 ниже описан пол и возраст трансгенных коров.

[Таблица 12]

Наименование	Отношение экспрессии RFP	Пол	Возраст
SNU-Cas9-1 (F0)	58,3%	Самка	5 месяцев
SNU-Cas9-2 (F0)	33,7%	Самец	23 месяцев
SNU-Cas9-3 (F0)	87,0%	Самец	6 месяцев
SNU-Cas9-4 (F0)	74,8%	Самка	24 месяцев

Для анализа крови коров spCas9 образцы цельной крови (5 мл) берут из яремной вены. Часть собранных образцов (1 мл) используют для общего анализа крови (CBC) (Hemavet 950, Drew Scientific, USA), а остальные образцы используют для химического анализа сыворотки (BS-400, Mindray, China). Все значения общего анализа крови и анализа сыворотки, подтвержденные анализом крови, находились в контрольном диапазоне, и было подтверждено, что не было никаких проблем со здоровьем коров spCas9 даже при экспрессии Cas9.

Авторы данного изобретения получили яйцеклетку от SNU-Cas9-4 (самка) и получают сперматозоиды от SNU-Cas9-2 (самец).

Для получения сперматозоидов, сперму собирают у самца трансгенного скота в возрасте 18 месяцев с применением искусственной вагины (Fujihira Industry, Tokyo, Japan), содержащей горячую воду при 50-55°C, и собранные сперматозоиды сразу же переносят и замораживают в морозильной камере.

Сперму разводят в соотношении 50%:50% с применением OPTIXcell (IVM technologies, France) и выдерживают при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем разведенную сперму снова разводят в соотношении 50%:50%, и концентрацию сперматозоидов поддерживают 5,0×10⁷/мл при 4°C в течение 2 часов.

Концентрированные сперматозоиды помещают в 500 мкл молок (IMV technologies, France) и герметично закрывают порошком молок (Fujihira Industry, Tokyo, Japan). Молоки замораживают на 5,0 см выше поверхности жидкого азота в течение 30 мин и затем помещают в резервуар с жидким азотом.

Потомство, имеющее геном, в который вставлен spCas9 ген, получают естественным скрещиванием между SNU-Cas9-2 (самцом) и SNU-Cas9-4 (самкой), при закреплении гамет из них.

1-3-2. Подтверждение полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, вставленную в геном трансгенной коровы

1-3-2-1. Подтверждение экспрессии флуоресцентного белка

Первичные клетки выделяют и культивируют из ткани кожи уха коровы spCas9, чтобы определить, экспрессируется ли флуоресцентный белок в клетках коровы spCas9.

Для выделения первичных клеток ткань кожи уха отделяют дерматомом до диаметра 0,5 мм. Ткани промывают 3 или более раз ФРФБ, содержащим 1% пенициллина/стрептомицина и разрезают на как можно меньшие куски скальпелем. Иссеченные ткани инкубируют с коллагеназой IV типа (Gibco) в HBSS при 37°C в течение 16 часов.

Через одну неделю наблюдают рост фибробластов кожи, и чашку для культивирования повторно заполняют свежей культуральной средой (DMEM с добавлением 10% ФТС, 1% NEAA, 100 мМ бета-меркаптоэтанола, 1% P/S).

После того, как первичные клетки станут конфлюэнтными, некоторые клетки хранят в морозильной камере, а некоторые клетки наблюдают под флуоресцентным микроскопом без криоконсервации.

На ФИГ. 44(a) показана экспрессия красного флуоресцентного белка в первичных клетках коровы spCas9.

Дополнительно, степень экспрессии красного флуоресцентного белка подтверждают у каждой spCas9 коровы и это делают путем трехкратного общего подсчета и расчета доли клеток, в которых экспрессируется красный флуоресцентный белок, в 100 клетках. Коэффициент экспрессии красного флуоресцентного белка каждой коровы spCas9 показан в Таблице 12 выше.

Так как вектор spCas9 сконструирован так, чтобы содержать ген красного флуоресцентного белка, из вышеуказанных результатов можно предсказать, что spCas9 ген был вставлен в spCas9 бычий геном.

Однако авторы данного изобретения провели ПЦР ДНК и ОТ-ПЦР для более точного подтверждения вставки гена spCas9 и Fat1 и экспрессии spCas9 и Fat1 в каждом из бычьих геномов spCas9.

1-3-2-2. Результаты ПЦР ДНК и ОТ-ПЦР

Геном ДНК экстрагируют из культивированных клеток с применением набора для экстракции ДНК (DNeasy Blood&Tissue kit 69506, Qiagen, Limburg, Netherlands) и ПЦР (Eppendorf Vapo Protect Mastercycler, Eppendorf, Germany) проводят с применением экстрагированной ДНК вместе с ПЦР праймерами, специфическими к spCas9 и Fat1.

Праймеры для ПЦР ДНК и ОТ-ПЦР показаны в таблице 13 ниже.

[Таблица 13]

Тип праймера	Наименование SEQ	SEQ ID №	Последовательность
spCas9-прямой	pr_spCas9_F_1	SEQ ID №:17	GACAAGAAGTACAGCATCGG
spCas9-обратный	pr_spCas9_R_1	SEQ ID №:18	CAACCAGCTGTTCGAGGAGA
Fat1-прямой	pr_Fat1_F_1	SEQ ID №:19	AAACACGAAACAGGCGACCA
Fat1-обратный	pr_Fat1_R_1	SEQ ID №:20	TTTGTCGTTGGCCACGATTG
GAPDH-прямой	pr_GAPDH_F_2	SEQ ID №:21	GGCGTGAACCACGAGAAGTA
GAPDH-обратный	pr_GAPDH_R_2	SEQ ID №:22	CCCTCCACGATGCCAAAGT

Продукт ПЦР загружают на 1% агарозный гель с ДНК маркером. В результате было подтверждено ПЦР ДНК и ОТ-ПЦР, что spCas9 ген был вставлен в spCas9 бычий геном.

На ФИГ. 44(b) показаны результаты ПЦР ДНК с применением коровы spCas9 (M: молекулярный маркер, 1: SNU-Cas9-1(F0), 2: SNU-Cas9-2(F0), 3: SNU-Cas9-3(F0), 4: SNU-Cas9-4(F0), 5: корова дикого типа, (+): положительный контроль (spCas9 ДНК), (-): ДНК группы отрицательного контроля).

На ФИГ. 44(c) показаны результаты ОТ-ПЦР с применением коровы spCas9 (M: молекулярный маркер, 1: SNU-Cas9-1(F0), 2: SNU-Cas9-2(F0), 3: SNU-Cas9-3(F0), 4: SNU-Cas9-4(F0), 5: корова дикого типа, (-): ДНК группы отрицательного контроля).

1-3-2-3. Анализ последовательности (локус, в который может быть вставлен полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу)

Кроме того, авторы данного изобретения подтвердили вставку spCas9 гена анализом последовательности коровы spCas9 (F0).

Результаты анализа последовательности показаны в таблице 14 ниже.

[Таблица 14]

Хромосома бычьего генома	Локус №	5' Ген	3' Ген
1	1-3	KCNAB1	GMPS
1	1-4	CHAF1B	PIGP
2	2-2	HNRNPR	LUZP1
7	7-3	MRPL22	HAVCR1
8	8-1	STMN4	CHРНК2
14	14-2	TGS1	LYN
16	16-1	H3F3C	TFB2M
18	18-2	CLIP3	OVOL3
X	X-4	MGC134232	PHKA2

Кроме того, было подтверждено, что spCas9 ген может быть вставлен в локацию SEQ ID GJ059944.1 в дополнение к локусу, описанному в таблице выше.

В этом эксперименте было подтверждено, что корова может выживать даже если spCas9 непрерывно экспрессируется в трансгенной корове и/или трансформированной клетке, имеющей геном, в который вставлен полинуклеотид, кодирующий spCas9.

1-3-3. Подтверждение изменений уровня экспрессии эссенциального гена трансгенной коровы

Анализ секвенирования РНК (РНК-сек) поводят для подтверждения того, влияет ли spCas9 и Fat1, которые экспрессируются в spCas9 трансгенной корове (F0), на экспрессию эссенциального гена.

Для анализа РНК-сек, РНК экстрагируют из первичных клеток spCas9 трансгенной коровы.

Качество РНК оценивают анализом целостности диска рРНК в наборе Agilent RNA 6000 nano kit (Agilent Technologies, CA, USA).

До конструкции библиотеки кДНК, 2 мкг суммарной РНК и магнитных сфер с олиго (dT) применяют для обогащения поли(A) мРНК.

Затем очищенную мРНК разрывают на короткие фрагменты и сразу же синтезируют двухнитевые кДНК.

Синтезированные кДНК добавляют к репарации конца и поли(A) и лигируют с адаптером секвенирования с применением набора для получения образца TruSeq Stranded mRNA (Illumina, CA, USA).

Подходящие фрагменты, которые были автоматически очищены кассетой с 2% агарозным гелем BluePippin (Sage Science, MA, USA), выбирают в качестве шаблонов для ПЦР амплификации.

Размер и качество конечной библиотеки оценивают эфектрофорезом с применением набора Agilent High Sensitivity DNA kit (Agilent Technologies, CA), и фрагменты были найдены в диапазоне 350-450 п.о.

Сконструированная библиотека была секвенирована на секвенаторе Illumina HiSeq2500 (Illumina, CA, USA).

Недостоверные считывания, выявленные по результатам секвенирования, были отфильтрованы скриптом производителя. Отфильтрованные считывания были сопоставлены со ссылочным геномом человека (Ensembl release 72, Flicek P. et al., 2013) с применением выравнивателя STAR v.2.3.0e (Dobin et al. 2013).

Уровни экспрессии гена измеряют с применением Cufflinks v2.1.1 (Trapnell C. et al, 2010) с применением базы данных аннотаций гена Ensembl, выпуск 72.

Некодирующая область генов удаляют с помощью опции маскировки. Для повышения точности измерений были применены параметры множественной коррекции показаний и коррекции fragBias, а для всех остальных параметров были установлены значения по умолчанию.

Для анализа дифференциальной экспрессии, данные подсчета уровня гена получают с применением инструмента HTSeq-count v0.5.4p3 (Anders S. et al. 2014) с “-m пересечения-непустого” опцией и -r опцией, принимая во внимание обе последовательности. На основе рассчитанных данных подсчета идентифицируют DEG с применением пакета R, названного TCC (Sun J. et al., 2013). Для сравнения данных количества меток, в пакете TCC применяют надежную стратегию нормализации, и коэффициент нормализации был рассчитан с использованием итеративного способа DEGES/edgeR. При использовании функции p.adjust пакета R с установленными параметрами по умолчанию, значение Q рассчитывали на основе значения p. Было обнаружено, что дифференциально экспрессируемые гены имеют порог значения q менее 0,05.

База данных Генной онтологии (GO) классифицирует гены согласно трем категориям биологических процессов (BP), клеточных компонентов (CC) и молекулярных функций (MF) и прогнозирует функции выбранных генов.

Для характеризации генов, идентифицированных в анализе DEG, проводят тест для обнаружения трендов на основе GO с применением точного критерия Фишера (Fisher R. A., 1922). P-значения <0,001 считали статистически значимыми.

Анализ РНК-сек вышеуказанным способом подтверждает, что эссенциальный ген не включен в список генов с измененными уровнями экспрессии. То есть было подтверждено, что на эссенциальный ген не влияет экспрессия spCas9.

В следующей таблице 15 раскрыты 10 генов со значительным изменением уровня экспрессии в клетках spCas9 трансгенной коровы (верхние 5 генов с повышенным уровнем экспрессии, и нижние 5 генов с пониженным уровнем экспрессии).

[Таблица 15]

Номер доступа гена	Ген	P значение	Кратность изменения
ENSBTAG00000021211	DPT	0,0009	5,42	↑
ENSBTAG00000000745	AQP1	0,0026	3,63	↑
ENSBTAG00000007740	BMK	0,0001	3,63	↑
ENSBTAG00000012623	NDP	0,0008	3,56	↑
ENSBTAG00000002123	MYO3A	0,0001	3,38	↑
ENSBTAG00000014132	SNED1	0,0009	-5,16	↓
ENSBTAG00000015441	ACTB	0,0001	-4,45	↓
ENSBTAG00000005353	DES	0,0001	-4,41	↓
ENSBTAG00000025210	COL4A2	0,0001	-4,39	↓
ENSBTAG00000012849	COL4A1	0,0001	-4,16	↓

1-4. Получение детеныша трансгенной коровы

1-4-1. Детеныш трансгенной коровы

1-4-1-1. Получение детеныша коровы in vitro оплодотворением (IVF)

Яйцеклетки получают из яичников со скотобойни или живых яичников бычьих, и яйцеклетки, к которым были хорошо прикреплены клетки яйценосного бугорка, отбирают с помощью микроскопического исследования.

Отобранные яйцеклетки созревали в течение 22 часов в среде для культивирования тканей (TCM199) (18-Nakseongdae R&D center). В среду для культивирования тканей добавляют 10% сыворотку и эстроген, фактор роста эпителия и 1% антибиотик для использования.

Созревшие в течение 22 часов яйцеклетки оплодотворяют сперматозоидами замороженно-размороженной коровы spCas9 (F0). Примерно через 16 часов после оплодотворения клетки яйценосного бугорка удаляют, а оплодотворенный эмбрион оценивают под микроскопом.

Из оцененных эмбрионов, жизнеспособные эмбрионы переносят в культуральную среду in vitro. Используемая культуральная среда не содержит сыворотки (Islam et al., Theriogenology, 2011).

Отобранные эмбрионы инкубируют в среде со стадии 1 в течение примерно 4 дней и в среде со стадии 2 в течение дополнительных 3 дней. Затем оценивают развитие зародышевых пузырьков.

Среди полученных эмбрионов идентифицируют эмбрионы, в которых экспрессируется красный флуоресцентный белок. Авторы настоящего изобретения подтвердили, что эмбрионы, в которых экспрессируется красный флуоресцентный белок, были эмбрионами, в которых экспрессируется Cas9, и эмбрионы, в которых экспрессировался красный флуоресцентный белок, отбирают и трансплантируют суррогатной матери. Это дает теленка (F1), экспрессирующего spCas9.

1-4-1-2. Получение детеныша коровы естественным скрещиванием и ядерным транспортом соматической клетки

Теленок (F1), экспрессирующий spCas9, родился в результате естественного скрещивания между коровой spCas9 (F0) и быком spCas9 (F0).

Для увеличения количества телят (F1), экспрессирующих spCas9, используют способ ядерного транспорта соматической клетки в дополнение к способам оплодотворения in vitro. Далее будет описан метод ядерного транспорта соматической клетки.

После культивирования яйцеклеток, полученных с бойни, в течение примерно 20-24 часов, клетки яйценосного бугорка физически удаляют с помощью фермента (гиалуронидазы) и первое полярное тельце, и ядро удаляют с помощью микропипетки.

Дополнительно, фибробласты кожи уха теленка (F1), экспрессирующие spCas9, культивируют вплоть до 100% в культуральной среде.

Энуклеированную яйцеклетку сливают фибробластом кожи уха культивированного теленка (F1) способом электрошока.

Слитые эмбрионы активируют через кальций и 6-ДМАП. После активации живые клонированные эмбрионы культивируют на бессывороточной среде, описанной выше.

1-4-2. Подтверждение изменений уровня экспрессии эссенциального гена трансгенного детеныша коровы

В результате РНК-сек анализа трансгенного детеныша коровы, полученного вышеописанным способом, было подтверждено, что эссенциальный ген не включен в список генов с измененными уровнями экспрессии. То есть, экспрессия spCas9 не влияет на эссенциальный ген даже в случае трансгенного детеныша коровы.

2. Второе редактирование генома с применением РНК-направляемой эндонуклеазы, экспрессированной в трансгенной корове - нокаут

Авторы настоящего изобретения провели эксперимент, чтобы подтвердить, может ли нокаут целевого гена эффективно индуцироваться в соматических клетках и оплодотворенных яйцеклетках, полученных из вышеописанной трансгенной коровы (коровы spCas9), которая экспрессирует рНК-направляемую эндонуклеазу. ФИГ. 45 иллюстрирует способ нокаута целевого гена в геноме клетки коровы spCas9.

Для подтверждения присутствия/отсутствия активности Cas9 в клетках трансгенной коровы spCas9 был синтезирован плазмидный вектор, способный экспрессировать енРНК для различных целевых генов с применением протокола веб-сайта (www.rgenome.net).

Способ получения плазмидного вектора, способного экспрессировать енРНК, был описан выше, и поэтому подробное объяснение опущено.

В таблице 16 ниже показаны енРНК последовательности для разных целевых генов (PRNP гена, гена бета-лактоглобулин(BLG), гена ретинобластомы 1 (Rb1), Nanog гена, TP53 гена, IFNT гена и гена бета-казеина (BCN)).

[Таблица 16]

Тип енРНК	Наименование SEQ	SEQ ID №	Последовательность
PRNP ген-таргентная енРНК	gn_PRNP_1	SEQ ID №:23	AAAAACCAACATGAAGCATGTGG
BLG ген-таргентная енРНК	gn_BLG_1	SEQ ID №:24	CCCCCTGAGAGTGTATGTGGAGG
Rb1 ген-таргентная енРНК	gn_Rb1_1	SEQ ID №:25	TGACCTCGCCTTGGTGTTCGAGG
Nanog ген-таргентная енРНК	gn_Nanog_1	SEQ ID №:26	ACCACTGTCCCCGTCTGTGGAGG
TP53 ген-таргентная енРНК	gn_TP53_1	SEQ ID №:27	GCGCGGACGCGGGTGCCGGGCGG
IFNT ген-таргентная енРНК	gn_IFNT_1	SEQ ID №:28	AGTGGAGAGTCTGTTCATTTGGG
BCN ген-таргентная енРНК	gn_BCN_1	SEQ ID №:29	TTGCAAGGGCCAGAGCCACCAGG

2-1. Нокаут в соматических клетках

Авторы настоящего изобретения провели анализ на T7 эндонуклеазу 1 (анализ T7E1) с применением ПЦР ДНК (Eppendorf Vapo Protect Mastercycler, Eppendorf, Germany), хорошо известный специалистам в данной области, чтобы подтвердить, что spCas9 может экспрессироваться в соматической клетке spCas9 коровы (F0) и может произойти нокаут целевого гена.

Плазмидный вектор, способный экспрессировать каждую из вышеописанных енРНК, трансфицируют в фибробласты, выделенные из spCas9 трансгенной коровы, и трансфицированные первичные клетки далее культивируют в течение 10 дней в инкубаторе при 38°C и 5% CO₂.

Через 48 часов культивированные клетки собирают, и из каждой трансфицированной клетки экстрагируют геномную ДНК каждой клетки с применением набора для экстрагирования ДНК (DNeasy Blood & Tissue kit 69506, Qiagen, Limburg, the Netherlands).

Каждую экстрагированную ДНК помещают в пробирку ПЦР и добавляют 10 мкл буфера с применением набора для прямого лизиса ПЦР, и туда дополнительно добавляют 0,5 мкл протеиназы К.

Пробирки ПЦР, включающие соответствующие ДНК, обрабатывают в аппарате ПЦР при 56°C в течение 180 минут, обрабатывают при 85°C в течение 15 минут и затем подвергают ПЦР после добавления к ним прямого праймера PRNP и обратного праймера PRNP. После ПЦР получают 10-15 мкл продукта ПЦР.

Продукт ПЦР смешивают с 0,2 мкл T7 эндонуклеазы I (фермент T7E1) и 2 мкл буфера (конечный объем 20 мкл) и оставляют взаимодействовать при 37°C в течение примерно 30 мин. Продукты реакции подвергают электрофорезу.

В результате электрофореза было подтверждено, что мутации произошли во всех из вышеописанных целевых генов (PRNP гене, гене бета-лактоглобулин (BLG), гене ретинобластом 1 (Rb1), гене Nanog, гене TP53 и гене бета-казеина (BCN)), присутствующих в первичной клетке.

На ФИГ. 46(a) показаны результаты электрофореза после обработки T7E1 на продукте ПЦР ДНК, в PRNP гене, гене бета-лактоглобулина (BLG), гене ретинобластомы 1 (Rb1), Nanog гене, TP53 гене и гене бета-казеина (BCN) в spCas9 бычьих фибробластах.

В таблице 17 ниже раскрыты праймеры для ПЦР ДНК для идентификации вставки/делеции каждого целевого гена.

[Таблица 17]

Целевой Ген	Тип праймера	Наименование SEQ	SEQ ID №	Последовательность
PRNP ген	Прямой	in_pr_PRNP_F_1	SEQ ID №:30	GCAAGAAGCGACCAAAACCT
PRNP ген	Обратный	in_pr_PRNP_R_1	SEQ ID №:31	GGTGCATGTTTTCACGATAG
BLG ген	Прямой	in_pr_BLG_F_1	SEQ ID №:32	TTAAAGGCCGTGTCTCCAGT
BLG ген	Обратный	in_pr_BLG_R_1	SEQ ID №:33	GAAAGCCCTGGATAAGCAGC
Rb1 ген	Прямой	in_pr_Rb1_F_1	SEQ ID №:34	CCCCCACCAACTGAGTAGAA
Rb1 ген	Обратный	in_pr_Rb1_R_1	SEQ ID №:35	GATTCCAGAATGAGGGAGCT
Nanog ген	Прямой	in_pr_Nanog_F_1	SEQ ID №:36	ACCTACCATCTCGCTCTGAG
Nanog ген	Обратный	in_pr_Nanog_R_1	SEQ ID №:37	ACCAAGAATCGAACCCAGGC
TP53 ген	Прямой	in_pr_TP53_F_1	SEQ ID №:38	CTTCAGCCTTTGCCTTTTTG
TP53 ген	Обратный	in_pr_TP53_R_1	SEQ ID №:39	TTCCGGTCGTCCAAATACTC
IFNT ген	Прямой	in_pr_IFNT_F_1	SEQ ID №:40	TCTTCCCCATGGCTTTTGTG
IFNT ген	Обратный	in_pr_IFNT_R_1	SEQ ID №:41	TGGAGATGATAAGAGCCCTC
BCN ген	Прямой	in_pr_BCN_F_1	SEQ ID №:42	CTTCAGCCTTTGCCTTTTTG
BCN ген	Обратный	in_pr_BCN_R_1	SEQ ID №:43	TTCCGGTCGTCCAAATACTC

Дополнительно, было подтверждено, что целевой ген, PRNP ген, был нокаутирован через анализ последовательности. На ФИГ. 46(b) показана вставка/делеция PRNP гена spCas9 коровы через анализ последовательности.

В этом эксперименте было подтверждено, что spCas9 может экспрессироваться в соматической клетке коровы spCas9, и нокаут целевого гена может быть вызван работой системы CRISPR/Cas9 в соматической клетке.

2-2. Нокаут в F1 оплодотворенной яйцеклетке, полученной in vitro оплодотворением

Авторы настоящего изобретения провели следующий эксперимент, чтобы подтвердить, что spCas9 может экспрессироваться в оплодотворенной яйцеклетке, которую получают оплодотворением in vitro с применением гаметы коровы spCas9, и нокаут целевого гена может происходить с помощью экспрессированной spCas9.

2-2-1. Получение оплодотворенной яйцеклетки, экспрессирующей РНК-направляемую эндонуклеазу

Сперматозоиды, полученные из SNU-Cas9-2, и яйцеклетку дикого типа оплодотворяли для получения оплодотворенных яйцеклеток (и/или эмбрионов). Способ получения гамет от коровы и способы оплодотворения in vitro описаны выше, поэтому подробное объяснение опущено.

In vitro оплодотворенную яйцеклетку (и/или эмбрион) культивируют в химически определенной культуральной среде в течение 7 дней. Через 7 дней наблюдали, что некоторые зародышевые пузыри экспрессируют красный флуоресцентный белок (без мозаицизма) под флуоресцентным микроскопом (Nikon, Tokyo, Japan)

На ФИГ. 47(a) показана экспрессия красного флуоресцентного белка в моруле эмбриона и зародышевых пузырях, которые получают с применением spCas9 коровы (см. ФИГ. 47(a), (a-1): морула эмбриона в условиях видимого освещения, (a-1'): морула эмбриона в флуоресцентных условиях, (a-2) зародышевые пузыри в условиях видимого освещения, (a-2') зародышевые пузыри в флуоресцентных условиях).

То есть, вставка spCas9 гена в геном spCas9 оплодотворенной яйцеклетки визуально подтверждена.

2-2-2. Результаты микроинъекции енРНК вектора в зародышевые пузыри

енРНК в форме мРНК, способной специфически связываться с PRNP геном, вводят микроинъекцией в зародышевые пузыри, полученные in vitro оплодотворением с применением сперматозоидов из вышеописанных SNU-Cas9-2. Так как способ микроинъекции описан выше, подробное объяснение опущено.

Вставку/делецию PRNP гена подтверждают ПЦР ДНК (Eppendorf Vapo Protect Mastercycler, Eppendorf, Germany).

PRNP праймеры, применяемые для ПЦР ДНК анализа (прямой праймер - SEQ ID №: 30, обратный праймер- SEQ ID №: 31) такие, как описаны в таблице 17.

Способ ПЦР ДНК анализа для подтверждения специфической вставки/делеции описан ниже.

енРНК вводят микроинъекцией в зародышевые пузыри, полученные in vitro оплодотворением, и ДНК, экстрагированную из 8 выбранных в итоге зародышевых пузырей, переносят в каждую ПЦР пробирку. С применением набора для прямого лизиса ПЦР, 10 мкл буфера добавляют, и дополнительно добавляют 0,5 мкл протеиназы K.

ПЦР пробирки обрабатывают в ПЦР машине при 56°C в течение 180 мин, обрабатывают при 85°C в течение 15 мин и затем подвергают ПЦР после добавления PRNP прямого праймера и PRNP обратного праймера. После ПЦР получают 10-15 мкл продукта ПЦР.

Продукт ПЦР смешивают с 0,2 мкл T7 эндонуклеазы I (T7E1 фермент) и 2 мкл буфера (конечный объем 20 мкл) и оставляют взаимодействовать при 37°C в течение около 30 мин. Продукты реакции подвергают электрофорезу.

В результате электрофореза подтверждают наличие вставки/делеции в PRNP гене ДНК, экстрагированной из зародышевого пузыря.

ФИГ. 47(b) подтверждает наличие вставки/делеции в PRNP гене при обработке T7E1, после микроинъекции енРНК (которая нацелена на PRNP ген) в зародышевые пузыри, полученные in vitro оплодотворением (см. ФИГ. 47(b), верх: (-)T7E1, низ: (+)T7E1, 1: маркерный ген, 2-9: зародышевые пузыри, в которые введена микроинъекцией енРНК, 10: оплодотворенная яйцеклетка дикого типа, 11: PRNP ген).

Дополнительно, вставку/делецию PRNP гена подтверждают анализом последовательности генома зародышевых пузырей.

На ФИГ. 47(c) показаны результаты вставки/делеции PRNP гена через анализ последовательности зародышевых пузырей, после микроинъекции енРНК (которая нацелена на PRNP ген) в зародышевые пузыри, полученные in vitro оплодотворением.

С помощью некоторых экспериментов, описанных выше, было подтверждено, что spCas9 может экспрессироваться в оплодотворенной яйцеклетке, полученной с применением гаметы коровы spCas9, и что нокаут целевого гена может быть вызван экспрессией spCas9.

2-3. Нокаут в клетке детеныша коровы, полученного естественным скрещиванием

Для подтверждения того, что Cas9 также экспрессируется в клетках теленка, рожденного естественным скрещиванием коров spCas9, авторы настоящего изобретения выделили первичные клетки теленка и провели следующий эксперимент.

Теленок (SNU-Cas9-F1) был рожден в результате естественного скрещивания между SNU-Cas9-4 (самкой) и SNU-Cas9-2 (самцом), и первичные клетки выделяют из теленка SNU-Cas9-F1. На ФИГ. 48(a) показано, что красный флуоресцентный белок однородно экспрессируется в первичных клетках.

ДНК экстрагируют из первичных клеток с помощью набора для экстракции ДНК (DNeasy Blood & Tissue kit 69506, Qiagen, Limburg, Netherlands), и ПЦР ДНК проводят с применением извлеченной ДНК, и результаты ПЦР ДНК в отношении Cas9 и Fat1 оказались положительными.

На ФИГ. 48(b) показаны результаты ПЦР ДНК, полученные с применением первичных клеток теленка SNU-Cas9-F1 (см. ФИГ. 48(b), 1: маркер размера, 2: spCas9 ген, 3: группа отрицательного контроля, 4: Fat1 ген, 4: группа отрицательного контроля).

Эти результаты подтверждают, что первичные клетки SNU-Cas9-F1 включают трансформированный ген поколения F0.

Кроме того, авторы настоящего изобретения провели эксперимент, в котором енРНК трансфицируют в первичные клетки теленка, чтобы подтвердить, что нокаут целевого гена также мог происходить в клетках теленка (F1), рожденного путем естественного скрещивания коров spCas9.

Более конкретно, ДНК извлекают из первичных клеток, трансфицированных енРНК, которые могут специфически связываться с геном PRNP, и извлеченную ДНК загружают в каждую пробирку ПЦР.

С применением набора для прямого лизиса ПЦР добавляют 10 мкл буфера и дополнительно добавляют 0,5 мкл протеиназы К.

Пробирки ПЦР обрабатывают в машине ПЦР при 56°C в течение 180 мин, обрабатывают при 85°C в течение 15 мин и затем подвергают ПЦР после добавления в них PRNP прямого праймера и PRNP обратного праймера. После ПЦР получают 10-15 мкл продукта ПЦР.

Продукт ПЦР смешивают с 0,5-1 мкл Т7эндонуклеазы I и 2 мкл буфера (конечный объем 20 мкл) и подвергают взаимодействию при 37°C в течение примерно 30 мин. Продукты реакции подвергают электрофорезу.

В результате электрофореза подтверждают наличие вставки/делеции в гене PRNP.

На ФИГ. 49 показаны результаты, подтверждающие вставку/делецию PRNP гена через ПЦР ДНК первичных клеток SNU-Cas9-F1, которые трансфицируют енРНК, которая нацелена на PRNP ген (см. ФИГ. 49, 1: маркер размера, 2: корова дикого типа, 3: SNU-Cas9-2 корова, 4: SNU-Cas9-F1, 5: группа отрицательного контроля, 6: группа положительного контроля (PRNP ген)).

PRNP праймеры, применяемые для ПЦР ДНК анализа для идентификации мутации в PRNP гене, описаны в таблице 17.

В этом эксперименте была подтверждена передача трансгена по зародышевой линии потомства и фертильность трансгенной коровы.

Кроме того, в ходе этого эксперимента было подтверждено, что spCas9 может экспрессироваться в трансгенное потомство, и что экспрессируемая spCas9 может образовывать комплекс с направляющей нуклеиновой кислотой, представленной в клетках или животном, тем самым нокаутируя целевой ген.

В зависимости от типа целевого гена можно увидеть различные эффекты. Например, когда ген PRNP используется как целевой ген, как в этом эксперименте, может быть получена корова, имеющая резистентность к коровьему бешенству.

В другом примере, когда ген β-лактоглобулина используется в качестве целевого гена, как в этом эксперименте, можно получить молоко, не содержащее аллергенов.

То есть, трансгенная корова, в которой может экспрессироваться spCas9, может использоваться для конструирования молочного белка.

3. Второе редактирование генома с применением РНК-направляемой эндонуклеазы, экспрессированной в трансгенной корове - нокин

Авторы настоящего изобретения получают первичные клетки из плода бычьих, имеющего spCas9-2A-GFP, чтобы подтвердить, что нокин может эффективно происходить в клетках, полученных из вышеописанной трансгенной коровы (spCas9 коровы) (F0), в которой экспрессируется рНК-направляемая эндонуклеаза.

Экспрессию GFP наблюдают в полученных клетках spCas9-2A-GFP и проводят эксперимент по нокину в гене mcherry с локацией GFP в качестве целевой.

Более конкретно, эксперимент с нокином проводят с применением двух разных способов, то есть, 1) HITI (3-2. инъекция вектора в клетку для HITI) и 2) HDR (3-3. инъекция вектора в клетку для HDR), в клетках, где экспрессируется Cas9.

3-1. Конструирование вектора

Для экспериментов с HDR нокином и HITI нокином были подготовлены два типа донорных векторов.

ФИГ. 50(a) иллюстрирует часть донорного вектора для HITI.

Донорный вектор для HITI может иметь состав, в котором первый целевой сайт включен на 5’ конце донорного полинуклеотида для нокина, и второй целевой сайт включен на 3’ конце донорного полинуклеотида. Последовательность донорного вектора для HITI такая же, как SEQ ID №: 44 (Наименование SEQ: HITI_RFP donor_1). Первый целевой сайт и второй целевой могут быть связаны с енРНК, которые могут специфически связывать GFP ген и могут быть расщеплены сконструированной нуклеазой.

ФИГ. 50(b) иллюстрирует часть донорного вектора для HDR.

Донорный вектор для HDR может иметь состав, в котором первая нуклеотидная последовательность гомологии (5'-HR, описанная на ФИГ. 50(b)) включена на 5’ конце донорного полинуклеотида для нокина, и вторая нуклеотидная последовательность гомологии (3'-HR, описанная на ФИГ. 50 (b)) включена на 3’ конце донорного полинуклеотида. Первая нуклеотидная последовательность гомологии и вторая нуклеотидная последовательность гомологии такие же, как часть последовательностей, включенных в ген бычьего альбумина.

Последовательность донорного вектора для HDR такая же как SEQ ID №: 45 (наименование SEQ: HDR_RFP donor_1).

Первая нуклеотидная последовательность гомологии в донорном векторе для HDR, применяемом в этом эксперименте, такая же, как нуклеотидная последовательность от 1 до 532 SEQ ID №: 45; и вторая нуклеотидная последовательность гомологии такая же, как нуклеотидная последовательность от 2585 до 3044 SEQ ID №: 45. ФИГ. 58 иллюстрирует последовательность донорного вектора для HDR (SEQ ID №: 45) и выделенные части всей последовательности представляют первую нуклеотидную последовательность гомологии и вторую нуклеотидную последовательность гомологии.

3-2. Инъекция вектора в клетку для HITI

Первичные клетки, полученные от коровы spCas9 (F0), выделяют и культивируют вышеописанным способом. Культивированные первичные клетки коровы spCas9 (F0) выделяют трипсином. Выделенные клетки (1×10⁵-3×10⁵) трансфицируют енРНК (1 мкг), которая может специфически связывать GFP, способом электропорации, и донорным вектором (1 мкг) для HITI. Трансфекцию индуцируют с применением прибора Neon, и программу 16 в приборе используют как условия трансфекции. Через 12 часов после трансфекции клетки заменяют на свежую среду и клетки, в которых нокин гена mcherry был подтвержден, с применением антибиотиков и маркеров селекции.

На ФИГ. 51(a) показаны результаты ПЦР ДНК, подтверждающие нокин гена mcherry; где линия 1 представляет маркерный ген; линия 2 представляет геномную ДНК spCas9 коровы (контрольная группа), линия 3 представляет клетки, трансфицированные донорным вектором для HITI; и линия 4 представляет группу отрицательного контроля. Последовательностью прямого праймера для ПЦР ДНК является SEQ ID №: 46 (наименование SEQ: HITI_pr_RFP_F_1) и последовательностью обратного праймера для ПЦР ДНК является SEQ ID №: 47 (наименование SEQ: HITI_pr_RFP_R_1).

На ФИГ. 51(b) показаны результаты, подтверждающие экспрессию mcherry в первичных клетках spCas9 коровы, где первичные клетки трансфицированы донорным вектором для HITI.

3-3. Инъекция вектора в клетку для HDR

Первичные клетки, полученные от коровы spCas9 (F0), выделяют и культивируют таким же образом, как в вышеописанном способе.

Выделенные клетки (1×10⁵-3×10⁵) трансфицируют с енРНК (1 мкг), которая может специфически связывать GFP ген, способом электропорации, и донорным вектором (1 мкг) для HDR. Трансфекцию вызывают с применением прибора Neon, и программу 16, включенную в инструмент, применяют в качестве условия трансфекции. Через двенадцать часов после трансфекции клетки меняют на свежую среду и клетки, в который подтвержден нокина гена mcherry, с применением антибиотиков и маркеров селекции.

На ФИГ. 52(a) показаны результаты ПЦР ДНК, подтверждающие нокин гена mcherry; где линия 1 представляет маркерный ген; линия 2 представляет геномную ДНК spCas9 коровы (контрольная группа), линия 3 представляет клетки, трансфицированные донорным вектором для HDR; и линия 4 представляет группу отрицательного контроля. Последовательностью прямого праймера для ПЦР ДНК является SEQ ID №: 48 (наименование SEQ: HDR_pr_RFP_F_1) и последовательностью обратного праймера для ПЦР ДНК является SEQ ID №: 49 (наименование SEQ: HDR_pr_RFP_R_1).

На ФИГ. 52(b) показаны результаты, подтверждающие экспрессию mcherry в первичных клетках spCas9 коровы, где первичные клетки трансфицированы донорным вектором для HDR.

В ходе этого эксперимента было подтверждено, что spCas9 может экспрессироваться в клетках трансгенной коровы, и что экспрессируемая spCas9 может образовывать комплекс с направляющей нуклеиновой кислотой, представленной в клетках, тем самым нокинирует донорный полинуклеотид в целевом гене.

В зависимости от типа целевого гена могут наблюдаться различные эффекты. Например, когда β-казеиновый ген используется как целевой ген, различные белки могут экспрессироваться в молоке трансгенной коровы в зависимости от типа донорного полинуклеотида.

3-4. Ядерный транспорт соматической клетки с применением spCas9 первичной клетки, в которой донор нокинирован

Авторы настоящего изобретения провели ядерный транспорт соматической клетки с применением первичных клеток, полученных вышеописанным способами HDR и HITI. Описание способа ядерного транспорта соматической клетки приведено выше, и поэтому подробное объяснение опущено.

Было подтверждено, что получены эмбрионы, в которых mcherry экспрессирован через ядерный транспорт соматической клетки.

На ФИГ. 53 показана экспрессия mcherry в эмбрионе, который получают ядерным транспортом соматической клетки с применением первичных клеток spCas9 коровы, имеющей геном, в котором нокинирован ген mcherry.

Поскольку эксперимент такой же, как вышеописанный экспериментальный способ, может быть выполнен с применением донорного вектора, который включает различные гены, можно точно получить различные типы клеток, в которых нокинирован ген, кодирующий целевой белок. Это можно использовать для крупномасштабного производства коров, которые выражают целевые белки.

[Экспериментальный пример 5] Трансгенная корова, которая экспрессирует РНК-направляемую эндонуклеазу и направляющую нуклеиновую кислоту

1. Получение вектора, который включает полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту

Конечный вектор экспрессии (далее, spCas9-енРНК вектор) получают с применением амплифицированного spCas9 гена, енРНК, которая нацелена на ген бета-лактоглобулина (BLG ген) и ген красного флуоресцентного белка.

ФИГ. 54 иллюстрирует часть конечного вектора экспрессии для экспрессии spCas9 и енРНК.

Последовательность енРНК, включенной в конечный вектор экспрессии, такая же, как SEQ ID №: 24, описанная в таблице 16.

2. Получение эмбриона (MI)

Поскольку способ интеграции инструмента в бычий геном и его экспериментальные условия такие же, как и для способа интеграции вышеописанного гена целевого белка и его экспериментальные условия, способ получения эмбриона, имеющего геном, в который вставлены spCas9 и енРНК, будет описан кратко.

Как описано выше, яйцеклетки бычьих собирают путем отделения COC от яичника с последующим промыванием, а сперматозоиды собирают путем отделения от бычьей спермы центрифугированием.

После удаления клеток яйценосного бугорка из оплодотворенной яйцеклетки, полученной in vitro оплодотворением собранных яйцеклеток и сперматозоидов, вышеописанный вектор spCas9-енРНК и вектор транспосазы были введены микроинъекцией в цитоплазму (spCas9-енРНК вектор и вектор транспосазы по 50 нг/мл каждый, соотношение 1:1) с применением микроинжектора (Femtojet, Eppendorf, Germany).

Экспрессию красного флуоресцентного белка визуально подтверждают в эмбрионе (spCas9-енРНК эмбрионе), полученном после микроинъекции, и трансгенную корову получают с применением эмбриона.

3. Получение трансгенной коровы

3-1. Трансгенная корова

Поскольку способ трансплантации трансформированного эмбриона в матку суррогатной матери и его экспериментальные условия описаны выше, далее будет кратко описан способ получения трансгенной коровы.

SpCas9-енРНК эмбрион, полученный вышеуказанным способом, трансплантируют в матку суррогатной матери, на 45-й день после течки выживаемость эмбриона и беременность суррогатной матери подтверждают ректальной пальпацией и ультрасонографией.

Трансгенный бык (SNU-Cas9-BLG-KO-1 (самец)) имеющей геном, в который вставлен ген spCas9 и енРНК, рождается от суррогатной матери, и сперматозоиды получают от SNU-Cas9-BLG-KO-1 (самца).

3-2. Подтверждение присутствия/отсутствия вставки полинуклеотида, кодирующего РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотида, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту, в трансгенный бычий геном

3-2-1. Подтверждение экспрессии флуоресцентного белка

Первичные клетки выделяют из ткани кожи SNU-Cas9-BLG-KO-1 (самца) вышеописанным способом выделения первичных клеток, и экспрессию красного флуоресцентного белка подтверждают из первичных клеток.

На ФИГ. 55(a) показана экспрессия красного флуоресцентного белка в первичных клетках SNU-Cas9-BLG-KO-1 (см. ФИГ. 55(a), слева: условия видимого освещения, справа: флуоресцентные условия).

Создают spCas9-енРНК вектор, включающий ген красного флуоресцентного белка, и из указанных выше результатов визуально подтверждают, что полинуклеотиды, кодирующие spCas9 ген и енРНК, вставлены в геном SNU-Cas9-BLG-KO-1 (самца).

3-2-2. Результаты ПЦР ДНК и ОТ-ПЦР

Присутствие/отсутствие вставки полинуклеотидов, кодирующих spCas9 ген и енРНК, в геном SNU-Cas9-BLG-KO-1 (самца) подтверждают с применением ПЦР ДНК и ОТ-ПЦР (Eppendorf Vapo Protect Mastercycler, Eppendorf, Germany). Праймеры, применяемые для проведения ПЦР ДНК и ОТ-ПЦР, такие, как показаны в таблице 18 ниже.

[Таблица 18]

Тип праймера	Наименование SEQ	SEQ ID №	Последовательность
spCas9-прямой	pr_spCas9_F_2	SEQ ID №:50	gacaagaagtacagcatcgg
spCas9-обратный	pr_spCas9_R_2	SEQ ID №:51	caaccagctgttcgaggaga
GAPDH-прямой	pr_GAPDH_F_3	SEQ ID №:52	GGCGTGAACCACGAGAAGTA
GAPDH-обратный	pr_GAPDH_R_3	SEQ ID №:53	CCCTCCACGATGCCAAAGT

Так как ПЦР ДНК и ОТ-ПЦР способы описаны выше, их подробное описание опущено.

3-2-3. Подтверждение вставки/делеции в бета-лактоглобулине

Полногеномную ДНК выделяют из фибробластов SNU-Cas9-BLG-KO-1 (самца) с применением набора G-spinTM Total DNA Extraction Mini Kit (iNtRON, Seoul, Republic of Korea).

Мутацию гена β-лактоглобулина подтверждают флуоресцентной ПЦР (фПЦР) с применением выделенной полногеномной ДНК.

На ФИГ. 55(b) показаны результаты, подтверждающие нокаут гена бета-лактоглобулина в фибробластах SNU-Cas9-BLG-KO-1 с применением фПЦР (см. ФИГ. 55(b), слева: бычий фибробласт дикого типа, справа: фибробласты, в которых BLG нокаутирован).

Праймеры для подтверждения мутации в гене бета-лактоглобулина такие, как описаны в таблице 19 ниже.

[Таблица 19]

Тип праймера	Наименование SEQ	SEQ ID №	Последовательность
Прямой праймер	in_pr_BLG_F_1	SEQ ID №:54	TTAAAGGCCGTGTCTCCAGT
Обратный праймер	in_pr_BLG_R_1	SEQ ID №:55	GAAAGCCCTGGATAAGCAGC

В ходе этого эксперимента было подтверждено, что в случае трансгенной коровы, в которой могут экспрессироваться как spCas9, так и направляющая нуклеиновая кислота, целевой ген, включающий последовательность, такую же как или комплементарную одной области направляющей нуклеиновой кислоты, может быть нокаутирован, хотя дополнительная обработка не применяется.

Дополнительно, было подтверждено, что трансформированная клетка, трансгенный эмбрион и/или трансгенное животное может выживать даже если целевой ген нокаутирован.

Различные эффекты могут проявляться в зависимости от типа целевого гена. В частности, в случае, где ген бета-лактоглобулина (BLG) используется как целевой ген, как в этом эксперименте, можно получить молоко, не содержащее аллергенов. То есть, трансгенная корова, в которой может экспрессироваться spCas9 и/или направляющая нуклеиновая кислота, может быть использована в конструировании молочного белка.

Кроме того, было подтверждено, что трансформированная клетка, трансгенный эмбрион и/или трансгенное животное может выживать, даже когда spCas9 и направляющая нуклеиновая кислота экспрессируются постоянно.

[Экспериментальный пример 6] Трансгенная корова в которой экспрессия РНК-направляемой эндонуклеазы контролируется элементом контроля экспрессии

Авторы настоящего изобретения подготовили первичную клетку бычьих, в которой можно контролировать экспрессию компонента сконструированной нуклеазы, и подтвердили, что редактирование генома можно контролировать в первичной клетке бычьих.

1. Получение вектора

Получают вектор получения первичных клеток коровы, в которых может контролироваться экспрессия компонента сконструированной нуклеазы.

Вектор, в котором может контролироваться экспрессия РНК-направляемой эндонуклеазы, описан согласно ФИГ. 56.

Вектор включает [loxP-ген зеленого флуоресцентного белка-polyA-loxP] в направлении 5’ конца ДНК spCas9 (представлен Toolgen). Экспрессия Cas9 не происходит до тех пор, пока не исключен [loxP-ген зеленого флуоресцентного белка-polyA-loxP].

енРНК, раскрытая на ФИГ. 56, имеет TP53 ген в качестве целевого гена, и последовательность енРНК такая же, как SEQ ID №: 27 (GCGCGGACGCGGGTGCCGGGCGG).

2. Получение клетки бычьих, в которой может контролироваться экспрессия РНК-направляемой эндонуклеазы

Авторы настоящего изобретения выделяют фибробласты из коровы дикого типа, чтобы получить клетку бычьих, в которой можно контролировать экспрессию РНК-направляемой эндонуклеазы.

Поскольку способ выделения фибробласта бычьих был описан выше, в экспериментальном примере 1, подробное объяснение опущено.

Выделенные фибробласты распределяют в 6-луночные планшеты. Когда клетки достигают примерно 50-60% конфлюэнтности, трансфицируют вышеописанный вектор, который может контролировать экспрессию РНК-направляемой эндонуклеазы (см. ФИГ. 56 (a)) (далее, вектор, контролируемый экспрессией).

Экспрессию зеленого флуоресцентного белка подтверждают в клетках бычьих, трансфицированных вектором, контролируемым экспрессией, и отбирают клетки бычьих, в которых была подтверждена экспрессия зеленого флуоресцентного белка.

Поскольку ген зеленого флуоресцентного белка включен в вектора, контролируемый экспрессией, клетки бычьих, в которых экспрессируется зеленый флуоресцентный белок, являются клетками бычьих, в которых может контролироваться экспрессия РНК-направляемой эндонуклеазы (далее, клетка, контролируемая экспрессией).

3. Результаты анализа T7E1 в трансформированной клетке

Что касается клетки, контролируемой экспрессией, полученной вышеописанным способом, для подтверждения того, что редактирование генома может происходить только тогда, когда Cre рекомбиназа (материал, который влияет на элемент экспрессии) обрабатывается на клетке, контролируемой экспрессией, авторы настоящего изобретения обрабатывают клетки, контролируемые экспрессией, Cre рекомбиназой. Затем проводят анализ ПЦР ДНК и T7E1 в отношении клеток, контролируемых экспрессией, обработанных Cre рекомбиназой, и клеток, контролируемых экспрессией, не обработанных Cre рекомбиназой.

ДНК экстрагируют из клеток, контролируемых экспрессией, не обработанных Cre рекомбиназой, и затем экстрагированную ДНК (образец 1) переносят в пробирку ПЦР. Дополнительно, ДНК экстрагируют из клеток, контролируемых экспрессией, обработанных Cre рекомбиназой, а затем экстрагированную ДНК (образец 2) переносят в пробирку ПЦР.

Кроме того, дистиллированную воду без ДНК, в качестве группы отрицательного контроля, загружают в ПЦР пробирку.

В качестве группы положительного контроля, ДНК экстрагируют из первичных клеток коровы, имеющей геном, в который вставлены полинуклеотиды, кодирующие spCas9 ДНК и енРНК, трансфицированные вектором, который не включает [loxP-ген зеленого флуоресцентного белка-polyA-loxP2772] (т.е., элемент контроля экспрессии) (см. ФИГ. 56(b)) и затем экстрагированную ДНК (группа положительного контроля) переносят в ПЦР пробирку.

С применением набора для прямого лизиса ПЦР, 10 мкл буфера добавляют в каждую из пробирок ПЦР, содержащих образец 1, образец 2, образец группы отрицательного контроля и образец группы положительного контроля, и затем 0,5 мкл протеиназы K дополнительно добавляют в каждую из ПЦР пробирок.

Каждую из пробирок ПЦР обрабатывают в аппарате для ПЦР при 56°C в течение 180 мин, обрабатывают при 85°C в течение 15 мин и затем подвергают ПЦР после добавления к ним PRNP прямого праймера и PRNP обратного праймера. После ПЦР получают по 10-15 мкл каждого из продуктов ПЦР.

Каждый из продуктов ПЦР смешивают с 0,5-1 мкл Т7 эндонуклеазы I и 2 мкл буфера (конечный объем 20 мкл) и подвергают взаимодействию при 37°C в течение примерно 30 мин. Продукты реакции подвергают электрофорезу.

В результате, было подтверждено, что вставка/делеция происходит в целевом гене, если клетки, контролируемые экспрессией, обрабатывают Cre рекомбиназой.

На ФИГ. 57 показаны результаты ПЦР ДНК, подтверждающие вставку/делецию целевого гена в клетках, контролируемых экспрессией, не обработанных Cre рекомбиназой, и клетках, контролируемых экспрессией, обработанных Cre рекомбиназой (см. ФИГ. 57, 1: маркер размера, 2: группа отрицательного контроля, 3: клетки, контролируемые экспрессией, не обработанные Cre рекомбиназой, 4: клетки, контролируемые экспрессией, обработанные Cre рекомбиназой, 5: группа положительного контроля).

Посредством этого эксперимента авторы настоящего изобретения подтвердили, что редактирование генома можно контролировать для достижения желаемого времени, когда используется корова или клетки коровы имеющей геном, в который вставлен элемент экспрессии, который может контролировать экспрессию компонентов сконструированной нуклеазы.

[Ссылочные цифровые обозначения]

100, 320, 340: инструмент

101, 107, 201, 207, 322, 329, 343, 349, 361, 367, 371, 379, 701, 705, 801, 808, 901, 906: ITR последовательность

102, 103, 132, 363, 373: полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу

104, 105, 134, 365, 375, 377: полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту

110: полинуклеотид, кодирующий компоненты сконструированной нуклеазы

130, 130(a), 130(b): элемент контроля экспрессии

202, 203, 204, 205, 206: полинуклеотид, имеющий PAM последовательность

210, 220, 230, 240: хромосома

231, 420, 430: целевой сайт

232, 232(a), 232(b), 423, 433: донорный полинуклеотид

401: оплодотворенная яйцеклетка

403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417: эмбрион

704, 706, 804, 807, 905: полинуклеотид, кодирующий транспосазу

700(b), 800(b): исключающий инструмент

909, 911: полинуклеотид, кодирующий рекомбиназу

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

Когда используется трансгенное животное, имеющее геном, в который вставлен ген, кодирующий средство генной инженерии, более эффективно могут быть получены животные, в которых гены нокинированы или нокаутированы.

Например, трансгенное животное, имеющее геном, в который вставлен ген, кодирующий целевой белок, может быть получено с применением средства генной инженерии, экспрессируемого в трансгенном животном. В этом случае трансгенное животное может использоваться как биореактор.

В другом примере, трансгенное животное, имеющее геном, в котором может быть нокаутирован конкретный ген, может быть получено с применением средства генной инженерии, экспрессируемого в трансгенном животном. В этом случае, трансгенное животное может использоваться животная модель заболевания или для улучшения породы животного, в частности, когда трансгенным животным является большое животное, трансгенное животное может иметь лучшую промышленную применимость в качестве биореактора для продуцирования целевого белка, или при применении в качестве животной модели заболевания.

Кроме того, трансгенная клетка, эмбрион и животное, в которые был внедрен геном, в который вставлен ген, кодирующий средство генной инженерии, могут использоваться в качестве платформенной технологии.

Например, поскольку трансгенную клетку, эмбрион и животное, в которые был вставлен геном, в который вставлен ген, кодирующий средство генной инженерии, можно использовать для подавления различных типов гена, трансгенную клетку, эмбрион и животное можно использовать для производства различных целевых белков.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ВИДЕ СВОБОДНОГО ТЕКСТА

SEQ ID №: 1 - SEQ ID №: 4, SEQ ID №: 7 - SEQ ID №: 12, SEQ ID №: 15, SEQ ID №: 16 - SEQ ID №: 22, SEQ ID №: 30 - SEQ ID №: 43, SEQ ID №: 47 - SEQ ID №: 56 показывают последовательности праймера.

SEQ ID №: 5, SEQ ID №: 6, SEQ ID №: 13 и SEQ ID №: 14 показывают последовательность транспозонного гена.

SEQ ID №: 23 - SEQ ID №: 29 показывают последовательность направляющей нуклеиновой кислоты.

SEQ ID №: 45 - SEQ ID №: 46 показывают последовательность донорного вектора.

--->

Перечень последовательностей

<110> LART Bio Co., Ltd

<120> Трансгенные животные и трансгенные эмбрионы, продуцирующие

сконструированную нуклеазу

<130> OPP18-027-PCT-RU

<150> US 62/764,905

<151> 2018-08-16

<150> KR 10-2019-0065613

<151> 2019-06-03

<160> 55

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pr_GFP_F_1 (праймер)

<400> 1

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt caccatggcc agcaaaggag aagaactt 58

<210> 2

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pr_GFP_R_1 (праймер)

<400> 2

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ttatttgtag agctcatcca tgcc 54

<210> 3

<211> 57

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pr_RFP_F_1 (праймер)

<400> 3

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt caccatggat agcactgaga acgtcat 57

<210> 4

<211> 50

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pr_RFP_R_1 (праймер)

<400> 4

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ctactggaac aggtggtggc 50

<210> 5

<211> 313

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> tp_PB_1 (последовательность транспозона)

<400> 5

ttaaccctag aaagatagtc tgcgtaaaat tgacgcatgc attcttgaaa tattgctctc 60

tctttctaaa tagcgcgaat ccgtcgctgt gcatttagga catctcagtc gccgcttgga 120

gctcccgtga ggcgtgcttg tcaatgcggt aagtgtcact gattttgaac tataacgacc 180

gcgtgagtca aaatgacgca tgattatctt ttacgtgact tttaagattt aactcatacg 240

ataattatat tgttatttca tgttctactt acgtgataac ttattatata tatattttct 300

tgttatagat atc 313

<210> 6

<211> 235

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> tp_PB_2 (последовательность транспозона)

<400> 6

tttgttactt tatagaagaa attttgagtt tttgtttttt tttaataaat aaataaacat 60

aaataaattg tttgttgaat ttattattag tatgtaagtg taaatataat aaaacttaat 120

atctattcaa attaataaat aaacctcgat atacagaccg ataaaacaca tgcgtcaatt 180

ttacgcatga ttatctttaa cgtacgtcac aatatgatta tctttctagg gttaa 235

<210> 7

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pr_GFP_F_2 (праймер)

<400> 7

cacatgaagc agcacgactt 20

<210> 8

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pr_GFP_R_2 (праймер)

<400> 8

agttcacctt gatgccgttc 20

<210> 9

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pr_RFP_F_2 (праймер)

<400> 9

ccccgtaatg cagaagaaga 20

<210> 10

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pr_RFP_R_2 (праймер)

<400> 10

ggtgatgtcc agcttggagt 20

<210> 11

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pr_GAPDH_F_1 (праймер)

<400> 11

ggcgtgaacc acgagaagta 20

<210> 12

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pr_GAPDH_R_1(праймер)

<400> 12

ccctccacga tgccaaagt 19

<210> 13

<211> 292

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> tp_SB_1

<400> 13

atacagttga agtcggaagt ttacatacac ttaagttgga gtcattaaaa ctcgtttttc 60

aactactcca caaatttctt gttaacaaac aatagttttg gcaagtcagt taggacatct 120

actttgtgca tgacacaagt catttttcca acaattgttt acagacagat tatttcactt 180

ataattcact gtatcacaat tccagtgggt cagaagttta catacactaa gttgactgtg 240

cctttaaaca gcttggaaaa ttccagaaaa tgatgtcatg gctttagaag ct 292

<210> 14

<211> 315

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> tp_SB_2 (последовательность транспозона)

<400> 14

gtggaaggct actcgaaatg tttgacccaa gttaaacaat ttaaaggcaa tgctaccaaa 60

tactaattga gtgtatgtaa acttctgacc cactgggaat gtgatgaaag aaataaaagc 120

tgaaatgaat cattctctct actattattc tgatatttca cattcttaaa ataaagtggt 180

gatcctaact gacctaagac agggaatttt tactaggatt aaatgtcagg aattgtgaaa 240

aagtgagttt aaatgtattt ggctaaggtg tatgtaaact tccgacttca actgtatagg 300

gatcctctag ctaga 315

<210> 15

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> in_pr_GFP_F_1 (праймер)

<400> 15

ggacttcctt tgtcccaaat ct 22

<210> 16

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> in_pr_GFP_R_1 (праймер)

<400> 16

tagcggctga agcactgc 18

<210> 17

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pr_spCas9_F_1 (праймер)

<400> 17

gacaagaagt acagcatcgg 20

<210> 18

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pr_spCas9_R_1 (праймер)

<400> 18

caaccagctg ttcgaggaga 20

<210> 19

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pr_Fat1_F_1 (праймер)

<400> 19

aaacacgaaa caggcgacca 20

<210> 20

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pr_Fat1_R_1 (праймер)

<400> 20

tttgtcgttg gccacgattg 20

<210> 21

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pr_GAPDH_F_2 (праймер)

<400> 21

ggcgtgaacc acgagaagta 20

<210> 22

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pr_GAPDH_R_2 (праймер)

<400> 22

ccctccacga tgccaaagt 19

<210> 23

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> gn_PRNP_1 (онРНК)

<400> 23

aaaaaccaac atgaagcatg tgg 23

<210> 24

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> gn_BLG_1 (онРНК)

<400> 24

ccccctgaga gtgtatgtgg agg 23

<210> 25

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> gn_Rb1_1 (онРНК)

<400> 25

tgacctcgcc ttggtgttcg agg 23

<210> 26

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> gn_Nanog_1 (онРНК)

<400> 26

accactgtcc ccgtctgtgg agg 23

<210> 27

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> gn_TP53_1 (онРНК)

<400> 27

gcgcggacgc gggtgccggg cgg 23

<210> 28

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> gn_IFNT_1 (онРНК)

<400> 28

agtggagagt ctgttcattt ggg 23

<210> 29

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> gn_BCN_1 (онРНК)

<400> 29

ttgcaagggc cagagccacc agg 23

<210> 30

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> in_pr_PRNP_F_1 (праймер)

<400> 30

gcaagaagcg accaaaacct 20

<210> 31

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> in_pr_PRNP_R_1 (праймер)

<400> 31

ggtgcatgtt ttcacgatag 20

<210> 32

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> in_pr_BLG_F_1 (праймер)

<400> 32

ttaaaggccg tgtctccagt 20

<210> 33

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> in_pr_BLG_R_1 (праймер)

<400> 33

gaaagccctg gataagcagc 20

<210> 34

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> in_pr_Rb1_F_1 (праймер)

<400> 34

cccccaccaa ctgagtagaa 20

<210> 35

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> in_pr_Rb1_R_1 (праймер)

<400> 35

gattccagaa tgagggagct 20

<210> 36

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> in_pr_Nanog_F_1 (праймер)

<400> 36

acctaccatc tcgctctgag 20

<210> 37

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> in_pr_Nanog_R_1 (праймер)

<400> 37

accaagaatc gaacccaggc 20

<210> 38

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> in_pr_TP53_F_1 (праймер)

<400> 38

cttcagcctt tgcctttttg 20

<210> 39

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> in_pr_TP53_R_1 (праймер)

<400> 39

ttccggtcgt ccaaatactc 20

<210> 40

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> in_pr_IFNT_F_1 (праймер)

<400> 40

tcttccccat ggcttttgtg 20

<210> 41

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> in_pr_IFNT_R_1 (праймер)

<400> 41

tggagatgat aagagccctc 20

<210> 42

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> in_pr_BCN_F_1 (праймер)

<400> 42

tggctggcag tgaaacatta 20

<210> 43

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> in_pr_BCN_R_1 (праймер)

<400> 43

agggattgat ggtacagatg g 21

<210> 44

<211> 1996

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HITI_RFP donor_1

<400> 44

cgtcgccgtc cagctcgacc aggcatatgt ggcgaattcg gaagcgggca gtgcaccaac 60

tacgccctgc tgaagctggc cggcgacgtg gagagcaacc ccggccccgg atccatggtg 120

tctaagggcg aagagctgat taaggagaac atgcacatga agctgtacat ggagggcacc 180

gtgaacaacc accacttcaa gtgcacatcc gagggcgaag gcaagcccta cgagggcacc 240

cagaccatga gaatcaaggt ggtcgagggc ggccctctcc ccttcgcctt cgacatcctg 300

gctaccagct tcatgtacgg cagcagaacc ttcatcaacc acacccaggg catccccgac 360

ttctttaagc agtccttccc tgagggcttc acatgggaga gagtcaccac atacgaggac 420

gggggcgtgc tgaccgctac ccaggacacc agcctccagg acggctgcct catctacaac 480

gtcaagatca gaggggtgaa cttcccatcc aacggccctg tgatgcagaa gaaaacactc 540

ggctgggagg ccaacaccga gatgctgtac cccgctgacg gcggcctgga aggcagaagc 600

gacatggccc tgaagctcgt gggcgggggc cacctgatct gcaacttcaa gaccacatac 660

agatccaaga aacccgctaa gaacctcaag atgcccggcg tctactatgt ggaccacaga 720

ctggaaagaa tcaaggaggc cgacaaagag acctacgtcg agcagcacga ggtggctgtg 780

gccagatact gcgacctccc tagcaaactg gggcacaaac ttaatggctc cgagggcaga 840

ggaagccttc taacatgcgg tgacgtggag gagaatcccg gcccttccgg gatgaccgag 900

tacaagccca cggtgcgcct cgccacccgc gacgacgtcc ccagggccgt acgcaccctc 960

gccgccgcgt tcgccgacta ccccgccacg cgccacaccg tcgatccaga ccgccacatc 1020

gagcgggtca ccgagctgca agaactcttc ctcacgcgcg tcgggctcga catcggcaag 1080

gtgtgggtcg cggacgacgg cgccgcggtg gcggtctgga ccacgccgga gagcgtcgaa 1140

gcgggggcgg tgttcgccga gatcggcccg cgcatggccg agttgagcgg ttcccggctg 1200

gccgcgcagc aacagatgga aggtctcctg gcgccgcacc ggcccaagga gcccgcgtgg 1260

ttcctggcca ccgtcggcgt ctcgcccgac caccagggca agggtctggg cagcgccgtc 1320

gtgctccccg gagtggaggc ggccgagcgc gccggggtgc ccgccttcct ggagacctcc 1380

gcgccccgca acctcccctt ctacgagcgg ctcggcttca ccgtcaccgc cgacgtcgag 1440

gtgcccgaag gaccgcgcac ctggtgcatg acccgcaagc ccggtgcctg aagatctttt 1500

tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt gagcatctga cttctggcta 1560

ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg 1620

aaggacatat gggagggcaa atcatttaaa acatcagaat gagtatttgg tttagagttt 1680

ggcaacatat gccatatgct ggctgccatg aacaaaggtg gctataaaga ggtcatcagt 1740

atatgaaaca gccccctgct gtccattcct tattccatag aaaagccttg acttgaggtt 1800

agattttttt tatattttgt tttgtgttat ttttttcttt aacatcccta aaattttcct 1860

tacatgtttt actagccaga tttttcctcc tctcctgact actcccagtc atagctgtcc 1920

ctcttctctt atgaagatcc ctcgacctgc agcccaagct tggatccctc gagcgtcgcc 1980

gtccagctcg accagg 1996

<210> 45

<211> 3984

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HDR_RFP donor_1

<400> 45

cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt tgtcccaaat 60

ctggcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct ctagcgggcg cgggcgaagc 120

ggtgcggcgc cggcaggaag gaaatgggcg gggagggcct tcgtgcgtcg ccgcgccgcc 180

gtccccttct ccatctccag cctcggggct gccgcagggg gacggctgcc ttcggggggg 240

acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc ggctctagag cctctgctaa 300

ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg ttgttgtgct 360

gtctcatcat tttggcaaag aattcgccac catggtgagc aagggcgagg agctgttcac 420

cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgtg aacggccaca agttcagcgt 480

gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcactatagg 540

gcgaattggg cccgacgtcg catgcgtgaa acagactttg aattttgacc ttctcaagtt 600

ggcgggagac gtggagtcca acccagggcc cataacttcg tataatgtat gctatacgaa 660

gttattaccc gggatggtga gcaagggcga ggaggataac atggccatca tcaaggagtt 720

catgcgcttc aaggtgcaca tggagggctc cgtgaacggc cacgagttcg agatcgaggg 780

cgagggcgag ggccgcccct acgagggcac ccagaccgcc aagctgaagg tgaccaaggg 840

tggccccctg cccttcgcct gggacatcct gtcccctcag ttcatgtacg gctccaaggc 900

ctacgtgaag caccccgccg acatccccga ctacttgaag ctgtccttcc ccgagggctt 960

caagtgggag cgcgtgatga acttcgagga cggcggcgtg gtgaccgtga cccaggactc 1020

ctccctgcag gacggcgagt tcatctacaa ggtgaagctg cgcggcacca acttcccctc 1080

cgacggcccc gtaatgcaga agaagaccat gggctgggag gcctcctccg agcggatgta 1140

ccccgaggac ggcgccctga agggcgagat caagcagagg ctgaagctga aggacggcgg 1200

ccactacgac gctgaggtca agaccaccta caaggccaag aagcccgtgc agctgcccgg 1260

cgcctacaac gtcaacatca agttggacat cacctcccac aacgaggact acaccatcgt 1320

ggaacagtac gaacgcgccg agggccgcca ctccaccggc ggcatggacg agctgtacaa 1380

ggctagcgag ggcagaggaa gccttctaac atgcggtgac gtggaggaga atcccggccc 1440

ttccgggatg accgagtaca agcccacggt gcgcctcgcc acccgcgacg acgtccccag 1500

ggccgtacgc accctcgccg ccgcgttcgc cgactacccc gccacgcgcc acaccgtcga 1560

tccagaccgc cacatcgagc gggtcaccga gctgcaagaa ctcttcctca cgcgcgtcgg 1620

gctcgacatc ggcaaggtgt gggtcgcgga cgacggcgcc gcggtggcgg tctggaccac 1680

gccggagagc gtcgaagcgg gggcggtgtt cgccgagatc ggcccgcgca tggccgagtt 1740

gagcggttcc cggctggccg cgcagcaaca gatggaaggt ctcctggcgc cgcaccggcc 1800

caaggagccc gcgtggttcc tggccaccgt cggcgtctcg cccgaccacc agggcaaggg 1860

tctgggcagc gccgtcgtgc tccccggagt ggaggcggcc gagcgcgccg gggtgcccgc 1920

cttcctggag acctccgcgc cccgcaacct ccccttctac gagcggctcg gcttcaccgt 1980

caccgccgac gtcgaggtgc ccgaaggacc gcgcacctgg tgcatgaccc gcaagcccgg 2040

tgcctgagat ctttttccct ctgccaaaaa ttatggggac atcatgaagc cccttgagca 2100

tctgacttct ggctaataaa ggaaatttat tttcattgca atagtgtgtt ggaatttttt 2160

gtgtctctca ctcggaagga catatgggag ggcaaatcat ttaaaacatc agaatgagta 2220

tttggtttag agtttggcaa catatgccat atgctggctg ccatgaacaa aggtggctat 2280

aaagaggtca tcagtatatg aaacagcccc ctgctgtcca ttccttattc catagaaaag 2340

ccttgacttg aggttagatt ttttttatat tttgttttgt gttatttttt tctttaacat 2400

ccctaaaatt ttccttacat gttttactag ccagattttt cctcctctcc tgactactcc 2460

cagtcatagc tgtccctctt ctcttatgaa gatccctcga cctgcagccc aagcttggat 2520

ccctcgagtt ataacttcgt ataggatact ttatacgaag ttatcatatg ggagagctcc 2580

caaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga 2640

gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga 2700

gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa 2760

catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata tcatggccga 2820

caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag 2880

cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct 2940

gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg 3000

cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactcacg gcatggacga 3060

gctgtacaag taagaattca ctcctcaggt gcaggctgcc tatcagaagg tggtggctgg 3120

tgtggccaat gccctggctc acaaatacca ctgagatctt tttccctctg ccaaaaatta 3180

tggggacatc atgaagcccc ttgagcatct gacttctggc taataaagga aatttatttt 3240

cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg tctctcactc ggaaggacat atgggagggc 3300

aaatcattta aaacatcaga atgagtattt ggtttagagt ttggcaacat atgccatatg 3360

ctggctgcca tgaacaaagg tggctataaa gaggtcatca gtatatgaaa cagccccctg 3420

ctgtccattc cttattccat agaaaagcct tgacttgagg ttagattttt tttatatttt 3480

gttttgtgtt atttttttct ttaacatccc taaaattttc cttacatgtt ttactagcca 3540

gatttttcct cctctcctga ctactcccag tcatagctgt ccctcttctc ttatgaagat 3600

ccctcgacct gcagcccaag cttggatccc tcgagttaat taacgagagc ataatattga 3660

tatgtgccaa agttgtttct gactgactaa taagtataat ttgtttctat tatgtatagg 3720

ttaagctaat tacttatttt ataatacaac atgactgttt ttaaagtaca aaataagttt 3780

atttttgtaa aagagagaat gtttaaaagt tttgttactt tatagaagaa attttgagtt 3840

tttgtttttt tttaataaat aaataaacat aaataaattg tttgttgaat ttattattag 3900

tatgtaagtg taaatataat aaaacttaat atctattcaa attaataaat aaacctcgat 3960

atacagaccg ataaaacaca tgcg 3984

<210> 46

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HITI_pr_RFP_F_1(праймер)

<400> 46

tctgctaacc atgttcatgc 20

<210> 47

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HITI_pr_RFP_R_1(праймер)

<400> 47

cagggaagga ctgcttaaag 20

<210> 48

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HDR_pr_RFP_F_1(праймер)

<400> 48

tctgctaacc atgttcatgc 20

<210> 49

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HDR_pr_RFP_R_1(праймер)

<400> 49

ttcacgtagg ccttggagc 19

<210> 50

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pr_spCas9_F_2 (праймер)

<400> 50

gacaagaagt acagcatcgg 20

<210> 51

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pr_spCas9_R_2 (праймер)

<400> 51

caaccagctg ttcgaggaga 20

<210> 52

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pr_GAPDH_F_3 (праймер)

<400> 52

ggcgtgaacc acgagaagta 20

<210> 53

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pr_GAPDH_R_3 (праймер)

<400> 53

ccctccacga tgccaaagt 19

<210> 54

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> in_pr_BLG_F_1 (праймер)

<400> 54

ttaaaggccg tgtctccagt 20

<210> 55

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> in_pr_BLG_R_1 (праймер)

<400> 55

gaaagccctg gataagcagc 20

<---

Claims

1. Трансгенное животное бычьих, содержащее:

первую клетку, имеющую геном, содержащий первый инструмент, который содержит полинуклеотид, кодирующий белок Cas9, и последовательность инвертированного концевого повтора (ITR) на 5’-конце и 3’-конце указанного первого инструмента; и

вторую клетку, имеющую геном, содержащий второй инструмент, который содержит полинуклеотид, кодирующий направляющую РНК, способную к специфическому связыванию с целевым сайтом, и ITR последовательность на 5’-конце и 3’-конце указанного второго инструмента,

где целевым сайтом является эндополинуклеотид указанного животного, или

экзополинуклеотид, включенный в геном указанного животного и расположенный между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью,

где первый инструмент присутствует в первом локусе генома первой клетки,

где второй инструмент присутствует во втором локусе генома второй клетки,

где первый локус отличается от второго локуса,

где указанная первая клетка постоянно экспрессирует указанный белок Cas9 и указанная вторая клетка постоянно экспрессирует указанную направляющую РНК, так что указанное трансгенное животное бычьих постоянно экспрессирует указанный белок Cas9 и указанную направляющую РНК.

2. Трансгенное животное бычьих по п. 1, где трансгенное животное дополнительно включает третью клетку, имеющую геном, не включающий полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту.

3. Трансгенный бычий эмбрион, содержащий:

где целевым сайтом является эндополинуклеотид указанного эмбриона, или

экзополинуклеотид, включенный в геном указанного эмбриона и расположенный между первой ITR последовательностью и второй ITR последовательностью,

где указанная первая клетка постоянно экспрессирует указанный белок Cas9 и указанная вторая клетка постоянно экспрессирует указанную направляющую РНК, так что указанный трансгенный бычий эмбрион постоянно экспрессирует указанный белок Cas9 и указанную направляющую РНК.

4. Трансгенный бычий эмбрион по п. 3, где трансгенный эмбрион дополнительно содержит третью клетку, имеющую геном, не включающий полинуклеотид, кодирующий РНК-направляемую эндонуклеазу, и полинуклеотид, кодирующий направляющую нуклеиновую кислоту.