CN106755498B

CN106755498B - 一种与奶山羊产奶量性状相关的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN106755498B
Application number: CN201710059163.0A
Authority: CN
Inventors: 李和刚; 程明; 宋晓娜; 杨峰; 郝小静; 张宝珣; 李培培; 杨培培; 包汉勋; 刘开东; 苗刚; 张明; 郭成玉
Original assignee: QINGDAO INSTITUTE OF ANIMAL HUSBANDRY VETERINARY MEDICINE
Current assignee: QINGDAO INSTITUTE OF ANIMAL HUSBANDRY VETERINARY MEDICINE
Priority date: 2017-01-24
Filing date: 2017-01-24
Publication date: 2020-06-30
Anticipated expiration: 2037-01-24
Also published as: CN106755498A

Abstract

本发明属于动物分子标记制备技术领域，具体涉及一种与奶山羊产奶量性状相关的分子标记的制备与应用。所述的分子标记由山羊H‑FABP基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，在序列表SEQ ID NO.1所示的第124位碱基处有一个A/C突变，该突变导致Sma Ⅰ‑PFLP多态性。本发明还公开了获得分子标记的制备方法及多态性检测方法的应用，为奶山羊的标记辅助选育提供了一个新的分子标记。

Description

一种与奶山羊产奶量性状相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于动物分子标记制备技术领域，具体涉及一种与奶山羊产奶量性状相关的分子标记的制备与应用。

背景技术

我国是奶山羊饲养量较多、分布范围较广的国家，奶山羊养殖业在20世纪60-80年代曾经是我国奶业的主导产业，90年代以后受到饲养规模小、乳品工业迅速膨胀等因素的影响，奶山羊生产发展迟缓。近十多年来，随着人民生活水平的不断提高和膳食结构改善的需求，人们对山羊奶营养价值和安全性的认同度有所改变，尤其是机器挤奶解决了规模化饲养的瓶颈问题，促进了全国奶山羊产业的复兴和发展。我国奶山羊品种是在二十世纪初由国外传教士带入的奶山羊品种与本地山羊杂交改良，又经过生态适应和系统选育而形成的，已经列入国家品种志或名录的有雅安奶山羊、崂山奶山羊、关中奶山羊和西农萨能奶山羊等。但由于饲养分散、规模较小等原因，我国奶山羊的遗传改良主要采用常规的育种手段，其泌乳性能遗传进展较为缓慢。

随着分子生物学技术的快速发展，分子标记辅助育种已成为动物遗传育种研究的热点和必然趋势。应用分子技术阐明奶山羊泌乳性状的调控机制，结合泌乳性状加强奶山羊的选育，必将大大加快奶山羊育种的进程。分子标记辅助育种技术的核心是寻找决定泌乳性状的主效基因及其分子标记。近年来，国内外学者对奶山羊产奶性状相关基因进行了一些研究，找到了一些功能基因和分子标记，但是有关产奶量性状的研究报道较少。

H-FABP基因与脂肪代谢相关。孙杰(2009)通过差异消减法鉴定到H-FABP基因在西农萨能奶山羊泌乳初期和盛期乳腺组织之间存在差异表达(孙杰，奶山羊乳腺消减文库构建及差异表达基因的研究，石河子大学2009年博士学位论文)，提示该基因可能在奶山羊泌乳过程中发挥重要的调控作用,可作为开发奶山羊分子育种标记的候选基因。本发明申请中克隆与奶山羊产奶量性状相关的H-FABP基因片段，并找到一个与奶山羊产奶量性状相关的突变位点，为奶山羊育种提供新的分子标记。

发明内容

本发明克隆了与奶山羊产奶量性状相关的H-FABP基因片段(该基因片段就是本发明制备的与奶山羊产奶量性状相关的分子标记)，并提供了与奶山羊产奶量性状相关的H-FABP基因片段的制备方法，该基因片段是通过设计特异性的引物，利用PCR扩增得到包括一个突变位点的H-FABP基因的片段，并且根据SmaⅠ-RFLP方法得到的不同酶切图谱确定不同的基因型。

本发明还提供了一种与奶山羊产奶量性状相关的H-FABP基因片段在奶山羊分子标记辅助选育中的应用。

具体地，本发明采用以下技术方案：

一、发明人通过基因克隆方法得到了一种与奶山羊产奶量性状相关的H-FABP基因单碱基突变片段(该基因片段就是本发明制备的与奶山羊产奶量性状相关的分子标记)，其核苷酸序列如下所示：

GGGACCAGGGGACGGATGTCGGTGGCCTGCGCCCCAGCTCGCGGGCACCGTGCCCCCAAC

TGCTTCCTTCTCAGATTCCGAAGAGCGCCTTGAGGCCAGGGAAGGGAGCAGGGCTTACCA

GCCMGGGGCAGGGACTCGGAGCCCGTGACCCGCGCTGACGTAGGCAAACTGGGTGC

上述序列124位突变位点的M是A或C，该突变导致SmaⅠ-RFLP多态性。

二、发明人设计了一种检测与奶山羊产奶量性状相关的基因片段突变的引物对，其DNA序列如下所示：

正向引物Sma1F:GGGACCAGGGGACGGATGTCG

反向引物Sma1R1:GCACCCAGTTTGCCTACGTCAGCGCGGGTACCGGGCTCCGAGTCCCTGC。

三、一种与奶山羊产奶量性状相关的H-FABP基因片段的制备方法，其包括如下步骤步骤：

1、引物设计

利用引物设计软件以山羊H-FABP基因序列为模板设计出包含部分序列的扩增引物对H-FABPF5、H-FABPR5，其DNA序列如SEQ ID NO.4-5所示：

H-FABPF5:TGTTCTGACCCCAAACTCGG

H-FABPR5:AGGGCTAGAGAACTGCTCCG。

2、PCR产物的纯化和测序

构建PCR反应体系，以奶山羊基因组DNA为模板，利用步骤1所得引物进行PCR扩增，所得PCR产物测序，测序序列与山羊H-FABP基因比对，获得奶山羊H-FABP基因部分序列589bp的片段，序列如SEQ ID NO.6所示，具体地：

在崂山奶山羊群体中随机选取3个及以上个体的基因组DNA，等量混合，以此为模板进行PCR扩增，将所得PCR产物送公司测序。测序序列与山羊H-FABP基因比对，成功获得崂山奶山羊H-FABP基因部分序列589bp的片段，序列如下：

TGTTCTGACCCCAAACTCGGAGAGGGACCAGGGGACGGATGTCGGTGGCCTGCGCCCCAG

CTCGCGGGCACCGTGCCCCCAACTGCTTCCTTCTCAGATTCCGAAGAGCGCCTTGAGGCC

AGGGAAGGGAGCAGGGCTTACCAGCCMGGGGCAGGGACTCGGAGCCCGGGACCCGCGCTG

ACGTAGGCAAACTGGGTGCCACCGGCTGCCACTTCACCCCTGGGAGCATTGGGGGATGGG

CGACCAGCCCCCGGCGAGAGAGGGCCTGCTTGGGGCTTCCTATCTCGGGCCCGGGGGTGT

GGGCCACGCCCCGTCACGTGTGACACTGGGGCCTTTTAAAGCGGCAGCGCGGGCTGGGAG

CTGCTGGTCCCAGAGTCCTTGTACGCGTTCTCTGTCGTCTCTTTCCCAACCTAGCCCAGC

TTCACCATGGTGGACGCCTTCGTGGGTACTTGGAAGTTAGTGGACAGCAAGAATTTCGAT

GACTACATGAAGTCACTCGGTGAGGACGGCTCGGGATGCTGGGCTGGGGATGGATGCTGT

GCTGGGGAGGGGCTGGCCGCGTGCCCGATCGGAGCAGTTCTCTAGCCCT

上述序列147位突变位点的M是A或C，该突变导致SmaⅠ-RFLP多态性。但是此序列147位突变位点附近也含有一个SmaⅠ酶切位点(CCCGGG，165-170位)，导致酶切分型存在困难，为解决此问题，需要再设计一对引物Sma1F、Sma1R1。

3、以步骤2所得589bp序列为模板，设计一对引物(其中一条为突变引物)，其DNA序列如SEQ ID NO.2-3所示：

Sma1F:GGGACCAGGGGACGGATGTCG

Sma1R1:GCACCCAGTTTGCCTACGTCAGCGCGGGTACCGGGCTCCGAGTCCCTGC。

4、构建PCR反应体系，以奶山羊基因组DNA为模板，使用引物对Sma1F、Sma1R1进行PCR扩增，所得PCR产物测序，获得与奶山羊产奶量性状相关的分子标记，其DNA序列如SEQID NO.1所示，具体地：

在崂山奶山羊群体中随机选取3个及以上个体的基因组DNA，等量混合，以此为模板，使用引物对Sma1F、Sma1R1扩增所得176bpPCR产物，该产物就是本发明制备的与奶山羊产奶量性状相关的分子标记，其DNA序列如下：

GGGACCAGGGGACGGATGTCGGTGGCCTGCGCCCCAGCTCGCGGGCACCGTGCCCCCAAC

TGCTTCCTTCTCAGATTCCGAAGAGCGCCTTGAGGCCAGGGAAGGGAGCAGGGCTTACCA

GCCMGGGGCAGGGACTCGGAGCCCGTGACCCGCGCTGACGTAGGCAAACTGGGTGC

176bp的PCR产物经SmaⅠ酶切后产生124bp和52bp两条带，说明该个体H-FABP两个等位基因124位突变位点均为C，判定为CC基因型；PCR产物经SmaⅠ酶切后产生176bp、124bp和52bp三条带，说明该个体H-FABP两个等位基因124位突变位点分别为A和C，判定为AC基因型；PCR产物经SmaⅠ酶切后产生176bp一条带(未切开)，说明该个体H-FABP两个等位基因124位突变位点均为A，判定为AA基因型。

四、一种与奶山羊产奶量性状相关的H-FABP基因片段在奶山羊分子标记辅助选育中的应用

选取处于泌乳期的崂山奶山羊种母羊200只，采取颈静脉全血，提取基因组DNA，使用引物对Sma1F、Sma1R1，对奶山羊群体DNA进行PCR扩增，使用SmaⅠ酶切检测每个个体的基因型，发现CC基因型的产奶量性状显著优于AC基因型(P<0.05)，选择CC基因型个体留种(由于AA基因型个体数量太少，未进行统计分析)。

五、本发明制备的引物对Sma1F、Sma1R1可用于奶山羊分子标记辅助选育中。

更详细的技术方案见具体实施方式。

有益效果：奶山羊产奶性状属于数量性状，传统表型选择的准确性较低，且受奶山羊生长及繁殖周期的限制，产奶性状需要等到母羊分娩泌乳后才能表现出来，无法进行超早期选择，从而导致育种进展缓慢。本发明采用PCR-RFLP方法检测H-FABP基因第一内含子SmaⅠ酶切位点多态性，将其多态性与崂山奶山羊产奶性状进行关联分析，发现该多态性与崂山奶山羊产奶量性状显著关联。此多态位点可用于崂山奶山羊产奶性状的辅助选择，提高种羊选留的准确性，加快奶山羊育种进程。本方法在山羊刚出生时就可以检测基因型，选择准确性提高，缩短世代间隔，育种成本显著降低；本方法实验操作简单，需要的仪器设备少，成本低，普通实验室均可进行；基因分型效率高，不同基因型之间区别显著。本发明发现了一个与奶山羊产奶量性状相关联的分子标记，丰富了奶山羊育种的分子标记资源库。

附图说明

序列表SEQ ID NO.1是本发明制备的与奶山羊产奶量性状相关的分子标记，序列长度为176bp，在该序列的124bp处是等位基因突变，即A/C突变；

序列表SEQ ID NO.6是本发明制备的崂山奶山羊H-FABP基因部分序列的片段,序列长度为589bp,在该序列的147bp处是等位基因突变，即A/C突变；

图1是崂山奶山羊H-FABP基因部分序列扩增(单碱基突变)的电泳图。片段大小为176bp,最右侧泳道为分子质量标准；

图2是崂山奶山羊H-FABP基因部分序列扩增片段(单碱基突变)经内切酶SmaⅠ酶切后的电泳图；最右侧泳道为分子质量标准。

具体实施方式

实施例1崂山奶山羊H-FABP基因部分序列的扩增

1、引物设计

利用在线引物设计软件Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)以山羊H-FABP基因序列(GeneBank登录号：NC_030809.1，序列区间13664760-13673332)为模板设计出包含部分序列的扩增引物，引物由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成，引物对的DNA序列如下：

H-FABPF5:TGTTCTGACCCCAAACTCGG

H-FABPR5:AGGGCTAGAGAACTGCTCCG

2、PCR产物的纯化和测序

PCR扩增反应体系25μL，包括1μL的奶山羊外周血基因组DNA(50ng/μL)，12.5μL的2×PCR Mix(上海生工生物工程有限公司)，0.75μL的正向引物H-FABPF4(10mM),0.75μL的反向引物H-FABPR4(10mM),10μL的ddH₂O。PCR的反应程序为：95℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min。

随机选取崂山奶山羊群体10个个体基因组DNA，等量混合，以此为模板进行PCR扩增，将PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序。测序序列与山羊H-FABP基因(GeneBank登录号：NC_030809.1，序列区间13664760-13673332)比对，成功获得崂山奶山羊H-FABP基因部分序列589bp的片段，序列如下：

TGTTCTGACCCCAAACTCGGAGAGGGACCAGGGGACGGATGTCGGTGGCCTGCGCCCCAG

CTCGCGGGCACCGTGCCCCCAACTGCTTCCTTCTCAGATTCCGAAGAGCGCCTTGAGGCC

AGGGAAGGGAGCAGGGCTTACCAGCCMGGGGCAGGGACTCGGAGCCCGGGACCCGCGCTG

ACGTAGGCAAACTGGGTGCCACCGGCTGCCACTTCACCCCTGGGAGCATTGGGGGATGGG

CGACCAGCCCCCGGCGAGAGAGGGCCTGCTTGGGGCTTCCTATCTCGGGCCCGGGGGTGT

GGGCCACGCCCCGTCACGTGTGACACTGGGGCCTTTTAAAGCGGCAGCGCGGGCTGGGAG

CTGCTGGTCCCAGAGTCCTTGTACGCGTTCTCTGTCGTCTCTTTCCCAACCTAGCCCAGC

TTCACCATGGTGGACGCCTTCGTGGGTACTTGGAAGTTAGTGGACAGCAAGAATTTCGAT

GACTACATGAAGTCACTCGGTGAGGACGGCTCGGGATGCTGGGCTGGGGATGGATGCTGT

GCTGGGGAGGGGCTGGCCGCGTGCCCGATCGGAGCAGTTCTCTAGCCCT

实施例2基因分型

上述序列147位突变位点的M是A或C，该突变导致SmaⅠ-RFLP多态性。但是此序列147位突变位点附近也含有一个SmaⅠ酶切位点(CCCGGG，165-170位)，导致酶切分型存在困难，因此另外设计了一对引物(其中一条为突变引物)来解决这一困难，序列如下：

Sma1F:GGGACCAGGGGACGGATGTCG

Sma1R1:GCACCCAGTTTGCCTACGTCAGCGCGGGTACCGGGCTCCGAGTCCCTGC

使用引物对Sma1F、Sma1R1扩增所得176bpPCR产物序列如下(产物用2％琼脂糖凝胶进行电泳检测,结果见图1)：

GGGACCAGGGGACGGATGTCGGTGGCCTGCGCCCCAGCTCGCGGGCACCGTGCCCCCAAC

TGCTTCCTTCTCAGATTCCGAAGAGCGCCTTGAGGCCAGGGAAGGGAGCAGGGCTTACCA

GCCMGGGGCAGGGACTCGGAGCCCGGTACCCGCGCTGACGTAGGCAAACTGGGTGC

176bp的PCR产物经SmaⅠ酶切后产生124bp和52bp两条带，说明该个体H-FABP两个等位基因124位突变位点均为C，判定为CC基因型；PCR产物经SmaⅠ酶切后产生176bp、124bp和52bp三条带，说明该个体H-FABP两个等位基因124位突变位点分别为A和C，判定为AC基因型；PCR产物经SmaⅠ酶切后产生176bp一条带(未切开)，说明该个体H-FABP两个等位基因124位突变位点均为A，判定为AA基因型，基因分型示意图如图2所示。

实施例3崂山奶山羊群体基因型与性状关联分析

选取青岛奥特种羊场处于泌乳期的崂山奶山羊种母羊200只，采取颈静脉全血，提取基因组DNA，使用引物对Sma1F、Sma1R1，对奶山羊群体DNA进行PCR扩增，使用SmaⅠ酶切检测每个个体的基因型，发现CC基因型个体为117只(组1)，所测得的日产奶量平均值为2.32±0.68kg；AC基因型个体为80只(组2)，日产奶量平均值为2.17±0.53kg；AA基因型个体为3只，由于AA基因型个体数量太少，不具有统计学意义，因此未进行统计分析。使用单因素方差分析对组1和组2两组数据进行统计分析，所得P值为0.029(<0.05)，判定CC基因型与AC基因型的产奶量存在显著差异，该SmaⅠ-RFLP多态位点可作为奶山羊育种的分子标记使用。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛市畜牧兽医研究所

<120> 一种与奶山羊产奶量性状相关的分子标记及其应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 176

<212> DNA

<213> 山羊（Capra hircus)

<220>

<221>mutation

<222>(124)..(124)

<223>

<400> 1

gggaccaggg gacggatgtc ggtggcctgc gccccagctc gcgggcaccg tgcccccaac 60

tgcttccttc tcagattccg aagagcgcct tgaggccagg gaagggagca gggcttacca 120

gcccggggca gggactcgga gcccgtgacc cgcgctgacg taggcaaact gggtgc 176

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gggaccaggg gacggatgtc g 21

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcacccagtt tgcctacgtc agcgcgggta ccgggctccg agtccctgc 49

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgttctgacc ccaaactcgg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agggctagag aactgctccg 20

<210> 6

<211> 589

<212> DNA

<213> 山羊（Capra hircus)

<220>

<221>mutation

<222>(147)..(147)

<223>

<400> 6

tgttctgacc ccaaactcgg agagggacca ggggacggat gtcggtggcc tgcgccccag 60

ctcgcgggca ccgtgccccc aactgcttcc ttctcagatt ccgaagagcg ccttgaggcc 120

agggaaggga gcagggctta ccagccaggg gcagggactc ggagcccggg acccgcgctg 180

acgtaggcaa actgggtgcc accggctgcc acttcacccc tgggagcatt gggggatggg 240

cgaccagccc ccggcgagag agggcctgct tggggcttcc tatctcgggc ccgggggtgt 300

gggccacgcc ccgtcacgtg tgacactggg gccttttaaa gcggcagcgc gggctgggag 360

ctgctggtcc cagagtcctt gtacgcgttc tctgtcgtct ctttcccaac ctagcccagc 420

ttcaccatgg tggacgcctt cgtgggtact tggaagttag tggacagcaa gaatttcgat 480

gactacatga agtcactcgg tgaggacggc tcgggatgct gggctgggga tggatgctgt 540

gctggggagg ggctggccgc gtgcccgatc ggagcagttc tctagccct 589

Claims

1.一种与奶山羊产奶量性状相关的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如下所示：

GGGACCAGGGGACGGATGTCGGTGGCCTGCGCCCCAGCTCGCGGGCACCGTGCCCCCAAC

TGCTTCCTTCTCAGATTCCGAAGAGCGCCTTGAGGCCAGGGAAGGGAGCAGGGCTTACCA

GCCMGGGGCAGGGACTCGGAGCCCGTGACCCGCGCTGACGTAGGCAAACTGGGTGC

2.一种检测与奶山羊产奶量性状相关的基因片段突变的引物对，其特征在于，其DNA序列如下所示：

Sma1F:GGGACCAGGGGACGGATGTCG

Sma1R1:GCACCCAGTTTGCCTACGTCAGCGCGGGTACCGGGCTCCGAGTCCCTGC。

3.权利要求1所述的与奶山羊产奶量性状相关的分子标记的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.以山羊H-FABP基因序列为模板，设计引物对H-FABPF5、H-FABPR5，其DNA序列如SEQID NO.4-5所示；

S2.构建PCR反应体系，以奶山羊基因组DNA为模板利用S1所得引物进行PCR扩增；

S3.步骤S2所得PCR产物测序，测序序列与山羊H-FABP基因比对，获得奶山羊H-FABP基因部分序列589bp的片段，其序列如SEQ ID NO.6所示；

S4.以步骤S3测序的589bp序列为模板设计一对引物Sma1F、Sma1R1，其DNA序列如SEQID NO.2-3所示；

S5.构建PCR反应体系，以奶山羊基因组DNA为模板利用S4所得引物进行PCR扩增；所得PCR产物测序，获得与奶山羊产奶量性状相关的分子标记，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述序列124位突变位点的M是A或C，该突变导致SmaⅠ-RFLP多态性。

4.如权利要求3所述的与奶山羊产奶量性状相关的分子标记的制备方法，其特征在于，步骤S2和S5中所述PCR反应体系为：1μL的50ng/μL的奶山羊外周血基因组DNA，12.5μL的2×PCR Mix，0.75μL10mM的正向引物,0.75μL10mM的反向引物,10μL的ddH₂O。

5.如权利要求3或4所述的与奶山羊产奶量性状相关的分子标记的制备方法，其特征在于，步骤S2和S5中所述PCR扩增条件为：95℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环，72℃延伸10min。

6.如权利要求3所述的与奶山羊产奶量性状相关的分子标记的制备方法，其特征在于，步骤S2和S5中所述基因组DNA为随机选取崂山奶山羊群体3个及以上个体基因组DNA，等量混合所得。

7.如权利要求3或6所述的与奶山羊产奶量性状相关的分子标记的制备方法，其特征在于，步骤S5中PCR扩增产物经SmaⅠ酶切后产生124bp和52bp两条带，说明该个体H-FABP两个等位基因124位突变位点均为C，判定为CC基因型；PCR产物经SmaⅠ酶切后产生176bp、124bp和52bp三条带，说明该个体H-FABP两个等位基因124位突变位点分别为A和C，判定为AC基因型；PCR产物经SmaⅠ酶切后产生176bp一条带，说明该个体H-FABP两个等位基因124位突变位点均为A，判定为AA基因型。

8.权利要求1所述的与奶山羊产奶量性状相关的分子标记在奶山羊产奶量分子标记辅助选育中的应用，其特征在于，序列124位是CC基因型的产奶量高于AC基因型。

9.权利要求2所述的引物对在奶山羊产奶量分子标记辅助选育中的应用。