CN111518885A - 一种检测系统性红斑狼疮基因突变位点的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，公开了一种检测系统性红斑狼疮基因突变位点的方法，包括：针对待测序样本，制备系统性红斑狼疮基因测序反应体系；利用单管多重PCR扩增反应得到测序引物片段，利用单碱基延伸技术进行双向延伸，得到待检测的系统性红斑狼疮基因位点；通过核酸质谱分析待检测基因位点，精确测定目标DNA测序引物序列；将目标DNA测序引物序列锚定在待测模板链上，对待测模板链上的系统性红斑狼疮基因突变位点进行检测。本发明通过对测序反应体系的制备能够获得均匀分布的待测模板链和测序引物链，能够提高后续测序过程中的测序引物序列的锚定效率，进而提高测序效率和准确性，为个人临床用药提供安全指导的作用。

Description

一种检测系统性红斑狼疮基因突变位点的方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种检测系统性红斑狼疮基因突变位点的方法。
背景技术
目前，系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种较为常见的自身免疫性疾病，其特征为多种自身抗体的产生及免疫复合物的形成，最终由于针对自身的免疫反应造成几乎全身各个系统的损害如循环系统、泌尿系统、消化系统以及中枢神经系统的病变。SLE的病因和发病机制尚未完全明了，目前认为该病属于多基因遗传病，遗传因素及环境因素共同参与本病的发生、发展过程。SLE好发于女性，特别是育龄期妇女，累及心、脑、肾等全身多个重要脏器。据估计，目前我国有SLE患者100多万人，平均患病率位居全球第二位。众多研究发现，该疾病具有较高的遗传倾向，通过分子诊断检测与SLE发生密切相关的基因位点就可以提前评估受检者患SLE的风险，提早预防和治疗。
目前常用的基于PCR的基因突变检测方法有ARMS-PCR和数字PCR两种。ARMS-PCR技术建立在等位基因特异性延伸反应基础上，只有当某个等位基因特异性引物的3’末端碱基与突变位点处碱基互补时，才能进行延伸反应，而与模板不完全匹配的上游引物将不能退火，不能生成PCR产物。ARMS-PCR临床应用的最大局限性在于灵敏度偏低，ARMS-PCR灵敏度一般在1％左右，对于低于1％的突变，尤其是血液样品的检测灵敏度不足，局限了临床医生对靶向药物疗效的判断。
微滴数字PCR技术是通过将一个标准PCR反应分配到大量微小的反应单元中，在每个反应单元中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，实现“单分子模板PCR扩增”。扩增结束后，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度，实现对核酸分子的绝对定量的技术。但是ddPCR用于基因突变常需要深度优化探针序列。由于要突出突变型和野生型探针在Tm上的差异，序列设计通常相对较短，一般要采用特殊修饰的探针，比如MGB或者锁核酸(LNA)。而且突变位点在探针序列中位置不固定，需要大量的实验优化，优化时间长，成本高，并且其检测的动态范围要小，容易产生假阳性。因此，将ARMS-PCR和数字PCR两种检测方法应用于系统性红斑狼疮基因突变位点的检测之中，均存在很大的局限性。
国内外的临床研究数据显示，CTLA-4基因-1722T/C位点多态性除了与SLE的发生密切相关外，还可以作为白癜风、乳腺癌等多种疾病发生的独立危险因素。同时，MTHFR基因677TT纯合变异与SLE的发病有关，是SLE的危险因素。CTLA4基因上A49G和T-1772C、MTHFR基因上C677T的3个SNPs可以作为SLE的独立危险因素进行基因检测。但现有技术中，利用CTLA4基因上A49G和T-1772C、MTHFR基因上C677T的3个SNPs可以作为SLE的独立危险因素进行基因检测的方法尚未见报道。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)ARMS-PCR临床应用的最大局限性在于灵敏度偏低，ARMS-PCR灵敏度一般在1％左右，对于低于1％的突变，尤其是血液样品的检测灵敏度不足，局限了临床医生对靶向药物疗效的判断。
(2)ddPCR用于基因突变常需要深度优化探针序列时，由于要突出突变型和野生型探针在Tm上的差异，序列设计通常相对较短，一般要采用特殊修饰的探针，比如MGB或者锁核酸(LNA)。而且突变位点在探针序列中位置不固定，需要大量的实验优化，优化时间长，成本高，并且其检测的动态范围要小，容易产生假阳性。
(3)现有技术中，利用CTLA4基因上A49G和T-1772C、MTHFR基因上C677T的3个SNPs可以作为SLE的独立危险因素进行基因检测的方法尚未见报道。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测系统性红斑狼疮基因突变位点的方法。
本发明是这样实现的，一种检测系统性红斑狼疮基因突变位点的方法，所述检测系统性红斑狼疮基因突变位点的方法包括以下步骤：
步骤一，提取待测序样本，针对提取的待测序样本，制备系统性红斑狼疮基因测序反应体系；所述测序反应体系包括一端连接在同一固相载体上的待测模板链和测序引物链。
步骤二，通过设计的测序引物链利用单管多重PCR扩增反应得到测序引物片段，利用单碱基延伸技术对所述测序引物片段进行双向延伸，按照一定比例范围向延伸产物中加入磁微粒混悬液，将延伸产物与磁微粒混悬液混匀，并第一次孵育；
步骤三，将第一次孵育的产物置于磁力架上待磁珠完全吸附后弃去上清液，并用HPLC-水清液清洗磁珠，磁珠重悬于生物素包被液中第二次孵育，后短暂离心后进行脱盐纯化，得到待检测的系统性红斑狼疮基因位点。
步骤四，通过核酸质谱分析待检测的系统性红斑狼疮基因位点，精确测定目标DNA测序引物序列。
步骤五，将所述目标DNA测序引物序列锚定在待测模板链上，对待测模板链上的待测序系统性红斑狼疮基因突变位点进行检测。
进一步，步骤一中，所述系统性红斑狼疮基因测序反应体系制备方法包括：
首先，在Genebank上查找系统性红斑狼疮基因外显子的DNA序列，查阅相关文献资料确定含有系统性红斑狼疮基因突变位点的序列位置；
其次，利用在线引物设计软件Primer ExplorerV4上传目的基因序列，设计系统性红斑狼疮基因测序引物链；
最后，针对突变位点设计可形成发卡结构的引物及封闭探针。
进一步，步骤一中，所述系统性红斑狼疮基因测序反应体系还包括探针；
所述测序引物链包括测序引物序列和测序连接序列；所述测序连接序列位于所述测序引物链的固定端，所述测序引物序列位于所述测序引物链的自由端，作为所述待测模板链的测序引物；所述测序引物包括野生型引物和突变引物，探针包括野生型探针和至少一种突变探针。
进一步，所述探针序列的5’端设有FAM荧光标记，3’端设有MGB或者BHQ荧光标记；野生型检测探针序列的5’端设有HEX荧光标记，3’端设有MGB或者BHQ荧光标记。
进一步，步骤二中，所述单管多重PCR扩增的反应程序为：90～95℃100～120秒，90～92℃30～35秒，50～56℃20～30秒，70～72℃60～65秒，45～50循环，70～72℃5～7分钟，2～4℃保存。
进一步，步骤二中，所述单碱基延伸技术是采用单碱基延伸引物组对所述目标片段进行双向延伸。
进一步，步骤三中，所述脱盐纯化方法包括：
1)向离心管中加入适量的Buffer DE-A溶液，上下颠倒混合均匀后放入80℃的水浴锅中加热使凝胶充分融化；
2)待凝胶完全融化后，加入Buffer DE-A溶液体积0.5倍的Buffer DE-B溶液，上下颠倒混匀令产生的絮状物消失，保证形成透亮的黄色溶液；
3)将步骤2)得到的黄色溶液用移液器转移至DNA制备管中，再放于提前备好的2m1离心管中，12000×g高速离心1分钟，弃滤液；
4)将DNA制备管放回2m1离心管中，然后加入500微升的BufferW1溶液，室温静置2分钟，12000×g高速离心1分钟并弃滤液；
5)将DNA制备管放回2m1离心管中，加入700微升的BufferW2溶液，12000×g高速离心1分钟，弃滤液；
6)再次重复步骤5)，确保完全脱盐；并12000×g高速空转离心2分钟；
7)将DNA制备管放于新的1.5m1离心管中，在制备管的滤过膜中央加入30微升的已提前水浴加热的Eluent洗脱液，室温静置10分钟，12000×g高速离心2分钟，洗脱DNA。
进一步，步骤四中，所述核酸质谱分析方法包括：
(1)在树脂板上铺好待用树脂，风干5-10分钟；
(2)向样本板的反应孔中加入待测的样本，补充25ul ddHO，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；
(3)除去封口膜，将样本板倒扣在步骤(1)的树脂板上固定，然后将样本板和树脂板一起翻转，使风干的树脂落入样本板的反应孔内，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；
(4)将样本板置于旋转器上慢速旋转20分钟，再3000转/分钟离心5分钟，然后点样上机，用核酸质谱仪进行检测。
进一步，步骤四中，所述目标DNA测序引物是指针对CTLA4基因上A49G和T-1772C、MTHFR基因上C677T的3个单核苷酸多态性(SNPs)位点，能特异性扩增出包含这3个SNPs位点的DNA片段的引物对。
进一步，步骤五中，所述待测模板链是针对CTLA4基因上A49G和T-1772C、MTHFR基因上C677T的3个SNPs位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述3个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明将待测模板链和测序引物序列固定在同一固相载体上，通过对测序反应体系的制备能够获得均匀分布的待测模板链和测序引物链，提高了后续测序过程中的测序引物序列的锚定效率，进而提高了测序效率。当在同一体系中对多个待测序样本进行测序时，无需在测序步骤中额外添加测序引物，避免了由于测序引物不同而产生的相互干扰，提高了测序效率和准确性。
本发明通过设计的测序引物链利用单管多重PCR扩增反应得到测序引物片段，然后利用单碱基延伸技术，通过双向延伸，得到等待检测基因位点，最后通过核酸质谱分析精确测定目标DNA序列；对目标DNA序列中的突变位点能够进行精确定位，为个人临床用药提供安全指导的作用。
附图说明
图1是本发明实施例提供的检测系统性红斑狼疮基因突变位点的方法流程图。
图2是本发明实施例提供的在不同浓度下进行PCR扩增的扩增曲线示意图。
图3是本发明实施例提供的通过核酸质谱分析得到的扩增产物的洗脱峰示意图。
图4是本发明实施例提供的系统性红斑狼疮基因测序反应体系制备方法流程图。
图5是本发明实施例提供的脱盐纯化方法流程图。
图6是本发明实施例提供的核酸质谱分析方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测系统性红斑狼疮基因突变位点的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的检测系统性红斑狼疮基因突变位点的方法包括以下步骤：
S101，提取待测序样本，针对提取的待测序样本，制备系统性红斑狼疮基因测序反应体系；所述测序反应体系包括一端连接在同一固相载体上的待测模板链和测序引物链。
S102，通过设计的测序引物链利用单管多重PCR扩增反应得到测序引物片段，利用单碱基延伸技术对所述测序引物片段进行双向延伸，按照一定比例范围向延伸产物中加入磁微粒混悬液，将延伸产物与磁微粒混悬液混匀，并第一次孵育。
S103，将第一次孵育的产物置于磁力架上待磁珠完全吸附后弃去上清液，并用HPLC-水清液清洗磁珠，磁珠重悬于生物素包被液中第二次孵育，后短暂离心后进行脱盐纯化，得到待检测的系统性红斑狼疮基因位点。
S104，通过核酸质谱分析待检测的系统性红斑狼疮基因位点，精确测定目标DNA测序引物序列。
S105，将所述目标DNA测序引物序列锚定在待测模板链上，对待测模板链上的待测序系统性红斑狼疮基因突变位点进行检测。
如图4所示，步骤S101中，本发明实施例提供的系统性红斑狼疮基因测序反应体系制备方法包括：
S201，在Genebank上查找系统性红斑狼疮基因外显子的DNA序列，查阅相关文献资料确定含有系统性红斑狼疮基因突变位点的序列位置；
S202，利用在线引物设计软件Primer ExplorerV4上传目的基因序列，设计系统性红斑狼疮基因测序引物链；
S203，针对突变位点设计可形成发卡结构的引物及封闭探针。
步骤S101中，本发明实施例提供的系统性红斑狼疮基因测序反应体系还包括探针；所述测序引物链包括测序引物序列和测序连接序列；所述测序连接序列位于所述测序引物链的固定端，所述测序引物序列位于所述测序引物链的自由端，作为所述待测模板链的测序引物；所述测序引物包括野生型引物和突变引物，探针包括野生型探针和至少一种突变探针。
本发明实施例提供的探针序列的5’端设有FAM荧光标记，3’端设有MGB或者BHQ荧光标记；野生型检测探针序列的5’端设有HEX荧光标记，3’端设有MGB或者BHQ荧光标记。
步骤S102中，本发明实施例提供的单管多重PCR扩增的反应程序为：90～95℃100～120秒，90～92℃30～35秒，50～56℃20～30秒，70～72℃60～65秒，45～50循环，70～72℃5～7分钟，2～4℃保存。
步骤S102中，本发明实施例提供的单碱基延伸技术是采用单碱基延伸引物组对所述目标片段进行双向延伸。
如图5所示，步骤S103中，本发明实施例提供的脱盐纯化方法包括：
S301，向离心管中加入适量的Buffer DE-A溶液，上下颠倒混合均匀后放入80℃的水浴锅中加热使凝胶充分融化；
S302，待凝胶完全融化后，加入Buffer DE-A溶液体积0.5倍的Buffer DE-B溶液，上下颠倒混匀令产生的絮状物消失，保证形成透亮的黄色溶液；
S303，将步骤S302得到的黄色溶液用移液器转移至DNA制备管中，再放于提前备好的2m1离心管中，12000×g高速离心1分钟，弃滤液；
S304，将DNA制备管放回2m1离心管中，然后加入500微升的BufferW1溶液，室温静置2分钟，12000×g高速离心1分钟并弃滤液；
S305，将DNA制备管放回2m1离心管中，加入700微升的BufferW2溶液，12000×g高速离心1分钟，弃滤液；
S306，再次重复步骤S305，确保完全脱盐；并12000×g高速空转离心2分钟；
S307，将DNA制备管放于新的1.5m1离心管中，在制备管的滤过膜中央加入30微升的已提前水浴加热的Eluent洗脱液，室温静置10分钟，12000×g高速离心2分钟，洗脱DNA。
如图6所示，步骤S104中，本发明实施例提供的核酸质谱分析方法包括：
S401，在树脂板上铺好待用树脂，风干5-10分钟；
S402，向样本板的反应孔中加入待测的样本，补充25ul ddHO，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；
S403，除去封口膜，将样本板倒扣在步骤S401的树脂板上固定，然后将样本板和树脂板一起翻转，使风干的树脂落入样本板的反应孔内，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；
S404，将样本板置于旋转器上慢速旋转20分钟，再3000转/分钟离心5分钟，然后点样上机，用核酸质谱仪进行检测。
步骤S104中，本发明实施例提供的目标DNA测序引物是指针对CTLA4基因上A49G和T-1772C、MTHFR基因上C677T的3个单核苷酸多态性(SNPs)位点，能特异性扩增出包含这3个SNPs位点的DNA片段的引物对。
步骤S105中，本发明实施例提供的待测模板链是针对CTLA4基因上A49G和T-1772C、MTHFR基因上C677T的3个SNPs位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述3个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测系统性红斑狼疮基因突变位点的方法，其特征在于，所述检测系统性红斑狼疮基因突变位点的方法包括：
步骤一，提取待测序样本，针对提取的待测序样本，制备系统性红斑狼疮基因测序反应体系；所述测序反应体系包括一端连接在同一固相载体上的待测模板链和测序引物链；
步骤二，通过设计的测序引物链利用单管多重PCR扩增反应得到测序引物片段，利用单碱基延伸技术对所述测序引物片段进行双向延伸，按照一定比例范围向延伸产物中加入磁微粒混悬液，将延伸产物与磁微粒混悬液混匀，并第一次孵育；
步骤三，将第一次孵育的产物置于磁力架上待磁珠完全吸附后弃去上清液，并用HPLC-水清液清洗磁珠，磁珠重悬于生物素包被液中第二次孵育，后短暂离心后进行脱盐纯化，得到待检测的系统性红斑狼疮基因位点；
步骤四，通过核酸质谱分析待检测的系统性红斑狼疮基因位点，精确测定目标DNA测序引物序列；
步骤五，将所述目标DNA测序引物序列锚定在待测模板链上，对待测模板链上的待测序系统性红斑狼疮基因突变位点进行检测。
2.如权利要求1所述的检测系统性红斑狼疮基因突变位点的方法，其特征在于，步骤一中，所述系统性红斑狼疮基因测序反应体系制备方法包括：
首先，在Genebank上查找系统性红斑狼疮基因外显子的DNA序列，查阅相关文献资料确定含有系统性红斑狼疮基因突变位点的序列位置；
其次，利用在线引物设计软件Primer ExplorerV4上传目的基因序列，设计系统性红斑狼疮基因测序引物链；
最后，针对突变位点设计可形成发卡结构的引物及封闭探针。
3.如权利要求1所述的检测系统性红斑狼疮基因突变位点的方法，其特征在于，步骤一中，所述系统性红斑狼疮基因测序反应体系还包括探针；
所述测序引物链包括测序引物序列和测序连接序列；所述测序连接序列位于所述测序引物链的固定端，所述测序引物序列位于所述测序引物链的自由端，作为所述待测模板链的测序引物；所述测序引物包括野生型引物和突变引物，探针包括野生型探针和至少一种突变探针。
4.如权利要求3所述的检测系统性红斑狼疮基因突变位点的方法，其特征在于，所述探针序列的5’端设有FAM荧光标记，3’端设有MGB或者BHQ荧光标记；野生型检测探针序列的5’端设有HEX荧光标记，3’端设有MGB或者BHQ荧光标记。
5.如权利要求1所述的检测系统性红斑狼疮基因突变位点的方法，其特征在于，步骤二中，所述单管多重PCR扩增的反应程序为：90～95℃100～120秒，90～92℃30～35秒，50～56℃20～30秒，70～72℃60～65秒，45～50循环，70～72℃5～7分钟，2～4℃保存。
6.如权利要求1所述的检测系统性红斑狼疮基因突变位点的方法，其特征在于，步骤二中，所述单碱基延伸技术是采用单碱基延伸引物组对所述目标片段进行双向延伸。
7.如权利要求1所述的检测系统性红斑狼疮基因突变位点的方法，其特征在于，步骤三中，所述脱盐纯化方法包括：
1)向离心管中加入适量的Buffer DE-A溶液，上下颠倒混合均匀后放入80℃的水浴锅中加热使凝胶充分融化；
2)待凝胶完全融化后，加入Buffer DE-A溶液体积0.5倍的Buffer DE-B溶液，上下颠倒混匀令产生的絮状物消失，保证形成透亮的黄色溶液；
3)将步骤2)得到的黄色溶液用移液器转移至DNA制备管中，再放于提前备好的2m1离心管中，12000×g高速离心1分钟，弃滤液；
4)将DNA制备管放回2m1离心管中，然后加入500微升的BufferW1溶液，室温静置2分钟，12000×g高速离心1分钟并弃滤液；
5)将DNA制备管放回2m1离心管中，加入700微升的BufferW2溶液，12000×g高速离心1分钟，弃滤液；
6)再次重复步骤5)，确保完全脱盐；并12000×g高速空转离心2分钟；
7)将DNA制备管放于新的1.5m1离心管中，在制备管的滤过膜中央加入30微升的已提前水浴加热的Eluent洗脱液，室温静置10分钟，12000×g高速离心2分钟，洗脱DNA。
8.如权利要求1所述的检测系统性红斑狼疮基因突变位点的方法，其特征在于，步骤四中，所述核酸质谱分析方法包括：
(1)在树脂板上铺好待用树脂，风干5-10分钟；
(2)向样本板的反应孔中加入待测的样本，补充25ul ddHO，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；
(3)除去封口膜，将样本板倒扣在步骤(1)的树脂板上固定，然后将样本板和树脂板一起翻转，使风干的树脂落入样本板的反应孔内，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；
(4)将样本板置于旋转器上慢速旋转20分钟，再3000转/分钟离心5分钟，然后点样上机，用核酸质谱仪进行检测。
9.如权利要求1所述的检测系统性红斑狼疮基因突变位点的方法，其特征在于，步骤四中，所述目标DNA测序引物是指针对CTLA4基因上A49G和T-1772C、MTHFR基因上C677T的3个单核苷酸多态性(SNPs)位点，能特异性扩增出包含这3个SNPs位点的DNA片段的引物对。
10.如权利要求1所述的检测系统性红斑狼疮基因突变位点的方法，其特征在于，步骤五中，所述待测模板链是针对CTLA4基因上A49G和T-1772C、MTHFR基因上C677T的3个SNPs位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述3个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
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