CN106591484A

CN106591484A - 一种基于hsp90b1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗sle疗效的用途和试剂盒

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Publication number: CN106591484A
Application number: CN201710085985.6A
Authority: CN
Inventors: 邹延峰; 叶冬青; 徐建华; 孙秀秀; 谷园园; 李苏苏
Original assignee: Anhui Medical University
Current assignee: Anhui Medical University
Priority date: 2017-02-17
Filing date: 2017-02-17
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2037-02-17
Also published as: CN106591484B

Abstract

本发明涉及一种基于HSP90B1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮疗效的用途和试剂盒，所述的HSP90B1基因多态性位点为rs12426382和/或rs10778306，试剂盒的成分包括：检测HSP90B1基因多态性位点基因型的引物，PCR扩增酶及相应缓冲液，PCR产物纯化酶，dNTP，单碱基延伸反应酶及相应缓冲液，单碱基延伸产物纯化酶。当HSP90B1基因rs12426382多态性位点基因型为CT和/或TT时，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好；HSP90B1基因rs10778306多态性位点基因型为AG和/或GG时，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好。本发明为指导系统性红斑狼疮患者的合理用药及个体化治疗提供了新的思路和方法。

Description

一种基于HSP90B1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗SLE疗效的用途和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种基于HSP90B1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗SLE疗效的用途和试剂盒，属于医药卫生技术领域。

背景技术

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种累及多系统、多器官、临床表现复杂、病程迁延反复的自身免疫性疾病。证据显示SLE好发于女性(男女患病率比约为1:9)，尤其是15～45岁中青年女性，且妊娠会诱发或加重狼疮。SLE的发生发展与遗传因素、环境因素以及机体免疫系统紊乱有关，其中遗传因素扮演着至关重要的角色。受种族、人群、地区、时间、诊断标准等因素的影响，SLE在世界不同地区的流行情况报道结果存在较大差异，多数证据显示我国SLE患病率高于西方发达国家和亚洲其它国家，约为70/10万人，妇女的患病率高达113/10万人。近年随着医疗水平的不断提升，SLE患者生存率也不断提高，我国SLE患者5年生存率约为95％，10年生存率约为90％。SLE是最主要的致残性和致死性自身免疫性疾病，给患者本人和其家庭及社会造成了极大的经济负担，已经成为危害人民生命健康尤其是青中年女性生命健康的重要公共卫生学问题之一。

糖皮质激素(glucocorticoids，GC)是治疗SLE的基础药物，但其治疗疗效存在极大的个体化差异。规范GC在SLE患者中的应用，实现SLE患者的个体化用药，使患者获益最大，仍是当前SLE治疗中的最大挑战。大量研究证据显示GC治疗SLE就像一把“双刃剑”，一方面GC有快速抗炎和免疫抑制作用，另一方面GC也会导致很多的副作用，包括诱发或加重感染、引起物质代谢和水盐代谢紊乱、心血管和消化系统并发症、白内障和青光眼、骨质疏松以及神经精神异常等；同时，临床实践中一部分SLE患者对GC治疗反应敏感，而另一部分患者对治疗反应不敏感，使得患者病情反复，影响预后。因此，SLE治疗必须遵循个体化用药原则。目前，临床上缺乏能够真正指导SLE患者个体化治疗的具体方法，风湿科医生只能凭借的个人经验进行尝试性治疗，这严重阻碍了SLE患者的个体化治疗的实现。

药物基因组学(pharmacogenomics)是功能基因组学研究的一个分支，它是研究基因遗传变异(如单核苷酸多态性single neucleotide polymorphism，SNP)如何影响药物在人体内的吸收、代谢、疗效及不良反应发生，从而指导合理用药的一门学科。已有证据表明它是研究高效、靶向药物的重要途径，通过它为患者或者特定患者寻找最合适的药物。药物基因组学强调用药个体化，它的出现对于实现个体化用药具有重要的理论意义和广阔的应用前景。近年来，多篇有关药物基因组学的研究已经在国际权威杂志上发表的，表明药物基因组学的研究成果能够迅速应用到临床治疗中，尤其是在肿瘤药物研发和应用中。虽然目前仍缺乏指导SLE个体化治疗行之有效的方法，但随着药物基因组学的不断发展，我们有理由相信，在不久的将来，能指导SLE治疗临床实践而又实用的个体化治疗基因芯片检测盒将进入实用阶段。到那时，临床医师就能够依据个体化基因芯片检测盒结果，对SLE患者进行最优化的治疗。这对SLE个体化治疗来说是一个很远大的前景，具有极其积极而深远的意义。

基因调控途径是GC发挥效应的主要作用机制，GC与细胞浆内的GR相结合，形成GC-GR复合物，随后转入细胞核，从而通过直接和间接基因调控机制发挥效应。热休克蛋白是一类高度保守蛋白质，广泛存在于微生物和动植物体内，对维持生命正常体征具有重要意义。它们作为许多结构和功能蛋白质的“分子伴侣”蛋白，能够促进新生多肽链的正确折叠、运转和组装，以及变性蛋白质的修复和清除；同时它们在基因转录、细胞生长发育、代谢分化、维持组织细胞的稳定以及环境适应性方面也起着重要的作用。热休克蛋白90(heat shockprotein 90，HSP90)是热休克蛋白家族中重要一员，它是GC-GR效应中的重要“分子伴侣”蛋白，大量证据显示它在决定GR与GC结合力上发挥着重要作用，其结构和功能的任何变化都会影响GC正常发挥其生物学效应。

大量证据表明HSP90的异常表达在SLE的发生发展中具有重要作用，而且HSP90在GC-GR信号通路中发挥着重要作用，其表达异常也可影响GC的疗效。HSP90表达受基因调控，HSP90B1基因变异可能是GC治疗SLE疗效和不良反应存在个体化差异的重要原因之一，到目前为止，多个HSP90B1基因多态性位点已被发现。当前本领域缺乏基于HSP90B1基因多态性位点基因型预测GC治疗SLE疗效的方法和试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于HSP90B1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗SLE疗效的用途和试剂盒，为实现SLE患者的个体化治疗提供新的思路和方法。

本发明技术方案是通过以下实现的：

一种基于HSP90B1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮疗效的用途，所述的HSP90B1基因多态性位点为rs12426382和/或rs10778306。

优选地，所述的糖皮质激素包括泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、强的松、强的松龙、氢化可的松、可的松、曲安西龙、地塞米松、倍他米松、甲强龙、甲基泼尼松中的至少一种。

一种基于HSP90B1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮疗效的试剂盒，包含有下述试剂成分：

(1)检测HSP90B1基因多态性位点基因型的引物；

(2)PCR扩增酶及相应缓冲液；

(3)PCR产物纯化酶；

(4)dNTP；

(5)单碱基延伸反应酶及相应缓冲液；

(6)单碱基延伸产物纯化酶。

优选地，所述的检测HSP90B1基因多态性位点基因型的引物包括扩增多态性位点的引物和单碱基延伸多态性位点的引物，

所述的扩增rs12426382多态性位点的引物：

5’-TTGGTTTCCAGAACACACCATTTTT-3’

5’-TTTCATGTTTTACGGGTTTTGTGGT-3’。

优选地，所述的扩增rs10778306多态性位点的引物：

5’-TGTTGAAGAGTTTGCCCGTGTT-3’

5’-TGCTCCACAGTGAGGACTTCAAAA-3’。

优选地，所述的单碱基延伸rs12426382多态性位点的引物：

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGGCTGTTTAAACACAATTGGTTTC-3’。

优选地，所述的单碱基延伸rs10778306多态性位点的引物：

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAATGGGATTTCTGTCAGTTGAACA-3’。

本发明还提供了一种基于HSP90B1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗SLE疗效的方法，具体步骤包括：

第一步、DNA提取；

第二步、PCR扩增反应；

第三步、PCR产物纯化；

第四步、单碱基延伸反应；

第五步、延伸产物纯化；

第六步、对HSP90B1基因多态性位点进行分型；

第七步、预测糖皮质激素治疗SLE疗效。

所述PCR扩增反应包含rs12426382和rs10778306两对扩增多态性位点的引物。

所述单碱基延伸反应包含rs12426382和rs10778306两条单碱基延伸多态性位点的引物。

所述的HSP90B1基因多态性位点分型包含rs12426382和rs10778306多态性位点基因型。

所述的糖皮质激素包括(但不限于)泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、强的松、强的松龙、氢化可的松、可的松、曲安西龙、地塞米松、倍他米松、甲强龙、甲基泼尼松等。

所述的预测为HSP90B1基因rs12426382多态性位点基因型为CT和/或TT时，预测糖皮质激素治疗SLE的疗效好；HSP90B1基因rs10778306多态性位点基因型为AG和/或GG时，预测糖皮质激素治疗SLE的疗效好。

所述的疗效为经过糖皮质激素治疗后SLE患者临床症状是否得到缓解，临床症状得到缓解则疗效好，没有得到缓解则疗效差。

本发明的有益效果在于：

本发明对HSP90B1上的12个标签多态性位点基因型进行分型，最终发现rs12426382和rs10778306两个多态性位点预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好，该试剂盒预测糖皮质激素治疗SLE疗效的方法快速、简便、有效、准确度高，为指导系统性红斑狼疮患者的合理用药及个体化治疗提供了新的思路和方法。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步说明。应该理解为，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。

实施例1：一种基于HSP90B1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒和方法

(一)试剂盒的组成成分

(1)检测HSP90B1基因多态性位点基因型的引物；

扩增多态性位点的引物：

延伸多态性位点的引物：

(2)PCR扩增酶及相应缓冲液；

(3)PCR产物纯化酶；

(4)dNTP；

(5)单碱基延伸反应酶及相应缓冲液；

(6)单碱基延伸产物纯化酶。

(二)标本收集准备和基因型检测

1血标本采集

找寻符合1997年美国风湿病学会(ACR)的SLE分类标准确诊的中国SLE患者，由专业医护人员从患者前臂采取静脉血5毫升，并将采取血样放置于EDTA抗凝管中。

2基因组DNA提取

使用基因组DNA抽提试剂盒进行DNA的提取，具体方法如下：

(1)取20微升QIAGEN蛋白酶，加入1.5毫升离心管内，再取200微升血样加至离心管中，使两者充分混匀。

(2)取200微升Buffer AL加至离心管中，然后进行涡旋振荡15秒使其充分混匀，在56℃条件下孵育10分钟，随后进行快速离心处理，且保证离心管盖子中无液滴残留。

(3)取200微升的96-100％乙醇加至离心管中，进行涡旋振荡15秒使其充分混匀，随后进行快速离心处理，并保证离心管盖子中无液滴残留。

(4)将样品小心移至QIAamp Mini离心柱内，6000g(8000rpm)离心1分钟处理，并将离心柱放入一个新的2毫升收集管中。

(5)取500微升Buffer AW1加到离心柱中，6000g(8000rpm)离心1分钟处理，除去收集管，然后将离心柱放入一个新的2毫升收集管中。

(6)取500微升Buffer AW2加到离心柱中，20000g(14000rpm)离心3分钟处理，除去收集管，再将离心柱转移到一个新的2毫升收集管内，20000g(14000rpm)离心1分钟处理，除去收集管。

(7)将离心柱转移到一个1.5毫升收集管中，取200微升Buffer AE加至离心柱中，在室温下孵育1分钟，再6000g(8000rpm)离心1分钟，并且洗涤DNA。

3基因型检测

(1)基因组DNA质量和浓度评估：取1微升DNA样本1％agarose电泳对其进行质量以及浓度评估，然后根据估计的浓度将样本稀释到工作浓度5-10ng/μl。

(2)进行PCR扩增反应

a)扩增rs12426382和rs10778306多态性位点引物：

扩增rs12426382多态性位点的引物：

5’-TTGGTTTCCAGAACACACCATTTTT-3’

5’-TTTCATGTTTTACGGGTTTTGTGGT-3’

扩增rs10778306多态性位点的引物：

5’-TGTTGAAGAGTTTGCCCGTGTT-3’

5’-TGCTCCACAGTGAGGACTTCAAAA-3’

b)PCR反应体系：

反应体系10微升，具体包括：1x HotStarTaq buffer,3.0mM Mg2+,0.3mM dNTP,1UHotStarTaq polymerase(Qiagen Inc.)，1微升样本DNA和1微升多重PCR引物。

c)PCR循环程序包括4步，如下：

(3)纯化PCR产物

在10微升的PCR产物中添加5U SAP酶和2U Exonuclease I酶，水浴60分钟(37℃)，然后灭活处理15分钟(75℃)。

(4)单碱基延伸反应

a)延伸rs12426382和rs10778306多态性位点引物：

单碱基延伸rs12426382多态性位点的引物：

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGGCTGTTTAAACACAATTGGTTTC-3’

单碱基延伸rs10778306多态性位点的引物：

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAATGGGATTTCTGTCAGTTGAACA-3’

b)延伸反应条件：

延伸反应体系10微升，包含有5微升SNaPshot Multiplex Kit(ABI)，2微升纯化后多重PCR产物，1微升延伸引物混合物，2微升超纯水。

c)延伸反应程序包括3步，如下：

(5)纯化延伸产物

在10微升的延伸产物中添加1U SAP酶，温浴1小时(37℃),然后灭活处理15分钟(75℃)。

(6)延伸产物上ABI3730XL测序仪

采用ABI3730XL测序仪收集原始数据。取10微升的反应体系(0.5微升纯化后的延伸产物和9微升Hi-Di及0.5微升Liz120SIZE STANDARD混匀)，在95℃变性5分钟后，上ABI3730XL测序仪。

(7)基因分型

基于ABI3730XL测序仪上收集的原始数据，采用GeneMapper 4.1(AppliedBiosystems Co.,Ltd.,USA)来进行分析得出rs12426382和rs10778306多态性位点基因型。

(三)预测疗效

1判定疗效标准

采用糖皮质激素治疗处于活动期SLE患者三个月，使用系统性红斑狼疮活动指数(SLEDAI)评分来判定糖皮质激素治疗SLE疗效。治疗三个月后患者SLEDAI评分为0～4分或者治疗前后患者SLEDAI评分下降≥5分判定为病情缓解，疗效好；治疗三个月后患者SLEDAI评分仍大于4分并且治疗前后患者SLEDAI评分下降值<5分判定为病情没有缓解，疗效差。

2预测糖皮质激素疗效

采用糖皮质激素治疗了291例SLE患者三个月，同时对291例患者的rs12426382和rs10778306多态性位点基因型进行分型，基因型频率见表1。三个月治疗结束后，160例患者疗效好，131例患者疗效差。Hardy-Weinburg平衡检验分析显示两个多态性位点基因型分布均符合Hardy-Weinburg平衡，结果见表1。经回归分析发现rs12426382和rs10778306多态性位点和糖皮质激素治疗SLE的疗效之间存在关联(Y：0＝疗效好；1＝疗效差)，能够预测糖皮质激素治疗SLE的疗效。HSP90B1基因rs12426382多态性位点基因型为CT和/或TT时，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好；HSP90B1基因rs10778306多态性位点基因型为AG和/或GG时，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好；结果见表2。

表1 HSP90B1基因rs12426382和rs10778306多态性位点基因型频率分布及Hardy-Weinburg平衡结果

表2 HSP90B1基因rs12426382和rs10778306多态性位点与糖皮质激素治疗SLE疗效的关联(显性模型)

(四)得出结论

从上述结果可以得出：HSP90B1基因rs12426382和rs10778306多态性位点基因型能够预测糖皮质激素治疗SLE的疗效，rs12426382多态性位点基因型为CT和/或TT时，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好；rs10778306多态性位点基因型为AG和/或GG时，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好。

以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽医科大学

<120> 一种基于HSP90B1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗SLE疗效的用途和试剂盒

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 252

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

tatactcatc actacttcaa aattgcagca gttattaaaa ttagtcctag ctcttagtga 60

atagtgaaac tacaaaatca agaatgtttg aaacagtttt atggctgttt aaacacaatt 120

ggtttctttt ttattcctgt gtattttgta atatgtgatt tttttaaaaa aattattttg 180

agaaggcatc tgtagccttc accagcttgc caagggtttt gtgtgacaaa aaaagattaa 240

gaaccaccta ca 252

<210> 2

<211> 252

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

ctatattgca gaatactagc accataaact ttgtaagact ttatagaaga tactttcagt 60

tggatttgta ttcattaact gtgtacaccg agtaagttta aaaatgggat ttctgtcagt 120

tgaacagtat tttaaaattt ggcctcttgg gacttattga cagttttgaa gtcctcactg 180

tggagcataa atgagtatga ctttgctttt tagtagagga aagttgggat tttttttttt 240

ctggcaattt ta 252

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ttggtttcca gaacacacca ttttt 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tttcatgttt tacgggtttt gtggt 25

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

tgttgaagag tttgcccgtg tt 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tgctccacag tgaggacttc aaaa 24

<210> 7

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttatggctg tttaaacaca 60

attggtttc 69

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

tttttttttt tttttttttt tttaaaaatg ggatttctgt cagttgaaca 50

Claims

1.一种基于HSP90B1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮疗效的用途，其特征在于：所述的HSP90B1基因多态性位点为rs12426382和/或rs10778306。

2.根据权利要求1所述的一种基于HSP90B1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮疗效的用途，其特征在于：所述的糖皮质激素包括泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、强的松、强的松龙、氢化可的松、可的松、曲安西龙、地塞米松、倍他米松、甲强龙、甲基泼尼松中的至少一种。

3.一种权利要求1或2所述的基于HSP90B1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮疗效的试剂盒，其特征在于，包含有下述试剂成分：

(1)检测HSP90B1基因多态性位点基因型的引物；

(2)PCR扩增酶及相应缓冲液；

(3)PCR产物纯化酶；

(4)dNTP；

(5)单碱基延伸反应酶及相应缓冲液；

(6)单碱基延伸产物纯化酶。

4.根据权利要求3所述的一种基于HSP90B1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮疗效的试剂盒，其特征在于，所述的检测HSP90B1基因多态性位点基因型的引物包括扩增多态性位点的引物和单碱基延伸多态性位点的引物，

所述的扩增rs12426382多态性位点的引物：

5’-TTGGTTTCCAGAACACACCATTTTT-3’

5’-TTTCATGTTTTACGGGTTTTGTGGT-3’。

5.根据权利要求3所述的一种基于HSP90B1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮疗效的试剂盒，其特征在于，所述的检测HSP90B1基因多态性位点基因型的引物包括扩增多态性位点的引物和单碱基延伸多态性位点的引物，

所述的扩增rs10778306多态性位点的引物：

5’-TGTTGAAGAGTTTGCCCGTGTT-3’

5’-TGCTCCACAGTGAGGACTTCAAAA-3’。

6.根据权利要求4所述的一种基于HSP90B1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮疗效的试剂盒，其特征在于，

所述的单碱基延伸rs12426382多态性位点的引物：

7.根据权利要求5所述的一种基于HSP90B1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮疗效的试剂盒，其特征在于，

所述的单碱基延伸rs10778306多态性位点的引物：

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAATGGGATTTCTGTCAGTTGAACA-3’。