CN107881229A - 一种线粒体相关药物性耳聋基因突变检测的引物和方法 - Google Patents

一种线粒体相关药物性耳聋基因突变检测的引物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测线粒体相关的药物性耳聋基因突变的引物和方法，其包括(i)扩增线粒体mtDNA 12S rRNA基因序列的引物；采用Sanger测序技术和测序引物。本发明可快速地将患者体内A1555G、C1494T突变检测出来。利用本发明完成的检测结果准确，可以作为辅助新生儿诊断遗传性耳聋的有效方法，对该病的早发现早治疗、婴幼儿时期合理用药和个性化治疗有重要的参考意义，避免了“一针致聋”的悲剧。

Description

一种线粒体相关药物性耳聋基因突变检测的引物和方法
技术领域
本发明属于医学及生物技术领域，具体涉及检测线粒体mtDNA 12S rRNA基因突变情况的引物和方法，所述基因为线粒体相关药物性耳聋基因。
背景技术
耳聋是导致言语交流障碍最常见的疾病。在中国，听障人群超过2千万，儿童患者约80万，且每年新发耳聋患儿8万名。这些患者大都患有严重影响交流且治疗困难的感音神经性耳聋，其中遗传因素所致耳聋占50％以上。有遗传因素引起的耳聋包括综合征型耳聋(占30％)和非综合征型耳聋(占70％)其突变主要包括GJB2、GJB3、SLC26A4和线粒体12SrRNA。调查显示耳聋患者中3.4％是由个体体质敏感使用了耳毒性药物而引起，药物性耳聋，是药物使用不当产生的毒副作用所造成，又称为药物中毒性耳聋，是药物中毒比较严重和常见的一种。耳毒性药物如氨基糖苷类抗生素等。目前研究已证实，线粒体12s rRNA中A1555G和C1494T是氨基糖苷类抗生素致聋基因突变。Lu等通过对1642例氨基糖苷类诱导性耳聋和非综合征耳聋的儿童进行调查研究，发现A1555G和C1494T的突变频率分别为3.96％和0.18％，此外还发现一部分A1555G突变患者即使不接触氨基糖苷类药物，同样会产生感音神经性耳聋。
在我国，氨基糖苷类抗生素使用不当，是最常见的药物致聋的原因。氨基糖甙类药物包括庆大霉素、链霉素、卡那霉素、妥布霉素、新霉素和巴龙霉素等等，主要由链霉素和小单孢菌产生，在临床上用于治疗革兰氏阴性菌引起的感染和结核杆菌感染，其药物作用机理是直接与细菌的16S rRNA结合，导致细菌蛋白翻译错误或者蛋白质合成提前终止而达到抗菌效果。分析显示，人类12S rRNA如果携带有A1555G和C1494T突变，会使12S rRNA的二级结构发生与细菌16S rRNA相同的变化，致使氨基糖甙类抗生素与12S rRNA结合导致人体耳细胞线粒体蛋白质合成异常，使得氧化磷酸化过程受阻而影响ATP的合成；由于内耳的离子梯度是依靠消耗ATP的离子泵来维持，所以耳蜗内ATP的减少会导致血管纹、内淋巴液、毛细胞内的离子浓度不平衡，最终导致毛细胞的死亡，诱导耳聋的发生，造成听力受损。A1555G和C1494T突变位点对氨基糖苷类药物的毒副作用极其敏感，可以引起耳蜗、前庭等关键性听力器官发生严重“病变”，导致不可挽回的损害。
由于携带与未携带此类药物致聋基因的孩子在表型上并无区别，想要孩子避免不当使用氨基糖苷类抗生素，避免“一针致聋”，唯一的途径就是做基因检测，并且越早做越好。2015年10月23日，国家卫生计生委卫生发展研究中心专门就“新生儿安全用药基因筛查”项目下达文件，指出“于2015年9月～2017年9月期间，组建研究团队，在国家卫生计生委相关部门的指导支持下，开展基因筛查技术的评估，为国家应用和推广有关技术提供相关证据支持。”而药物性致聋基因检测在产前诊断和新生儿疾病筛查中具有举足轻重的作用，在临床上普及线粒体基因12S rRNA的A1555G和C1494T突变的筛查尤为重要。
由单基因纯合突变导致的耳聋在遗传性耳聋中尤为常见，临床分子诊断可以提供准确的表型预测，在国际上诸多实验室已建立了常见耳聋基因筛查方法，Sanger测序技术是临床分子诊断的金标准，相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计多个探针，成本高，检测难度大。限制性片段长度多态性技术只能对单一突变位点进行检测，如需检测多个位点，则需多次PCR，操作复杂，工作量大。变性高效液相色谱法能精准定量mtDNA 1555A＞G突变负荷，但该方法自动化程度高，设备昂贵，对技术人员要求高，使得在临床应用中受到限制，因此多用于科学研究。基因芯片同样由于试剂成本高，设备昂贵等原因，不适用与在临床广泛推广。
本发明开发的诊断方法可以广泛地应用于临床针对线粒体mtDNA 12S rRNA突变引发的耳聋的诊断和预防。从长远角度看，可以为有效减少氨基糖苷类抗生素敏感人群发生药物性耳聋的状况提供可靠、简便的检测方法，同时，也适用于全国范围内特别是欠发达地区实行母系遗传性耳聋线粒体mtDNA 12S rRNA A1555G和C1494T突变的大规模筛查和预防性检查。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测线粒体相关药物性耳聋基因突变热点的引物，采用PCR技术，可用于快速检测非综合性耳聋患者体内线粒体mtDNA 12S rRNA基因多态位点的突变情况。所述检测线粒体mtDNA 12S rRNA基因多态位点突变情况的引物，其碱基序列为：
XLT–F：GGTGCTTTGTGTTAAGCTAC
XLT–R：ATGAAACTTAAGGGTCGAAG
进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：
XLT–F：GGTGCTTTGTGTTAAGCTAC
XLT–R：ATGAAACTTAAGGGTCGAAG
进一步地，引物序列XLT-F和XLT-R是扩增线粒体mtDNA 12S rRNA基因序列的引物。
本发明还提供了检测线粒体mtDNA 12S rRNA基因突变情况的方法，包括以下步骤：
(1)抽提血液/中的DNA；
(2)用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；
(4)对测序结果进行判断，确定线粒体mtDNA 12S rRNA基因是否发生突变；
其中PCR扩增引物包括扩增线粒体mtDNA 12S rRNA基因的引物，其碱基序列为：
XLT–F：GGTGCTTTGTGTTAAGCTAC
XLT–R：ATGAAACTTAAGGGTCGAAG
进一步地，测序引物碱基序列包括检测线粒体mtDNA 12S rRNA基因的测序引物碱基序列为：
XLT–F：GGTGCTTTGTGTTAAGCTAC
XLT–R：ATGAAACTTAAGGGTCGAAG
本发明还提供了一种检测线粒体mtDNA 12S rRNA基因多态突变位点的试剂盒，包括：
(i)血液DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR扩增反应液；
(iii)测序体系试剂；
其中PCR扩增反应液引物为：
(ⅰ)扩增线粒体mtDNA 12S rRNA基因的引物，其碱基序列为：
XLT–F：GGTGCTTTGTGTTAAGCTAC
XLT–R：ATGAAACTTAAGGGTCGAAG
进一步地，测序引物碱基序列为：
XLT–F：GGTGCTTTGTGTTAAGCTAC
XLT–R：ATGAAACTTAAGGGTCGAAG
有益效果：本发明设计了扩增线粒体mtDNA 12S rRNA的引物。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。可以为有效减少氨基糖苷类抗生素敏感人群发生药物性耳聋的状况提供可靠、简便的检测方法，也适用于全国范围内特别是欠发达地区实行母系遗传性耳聋线粒体mtDNA 12S rRNAA1555G和C1494T突变的大规模筛查和预防性检查。
附图说明
图1为A1555G、C1494T位点在线粒体基因上定位图。
图2为该对引物扩增PCR产物电泳图，M为Marker DL 2000，1-16为送检的血液样本1-16号，如图2所示，引物扩增有效，且条带单一。
图3为样本1的线粒体mtDNA 12S rRNA基因野生型测序截图(含1555位点)。
图4为样本1的线粒体mtDNA 12S rRNA基因野生型测序截图(含1494位点)。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
一种检测线粒体mtDNA 12S rRNA多态突变位点的引物，该引物的设计是针对线粒体mtDNA 12S rRNA设计的扩增引物，包括：
扩增线粒体mtDNA 12S rRNA基因的引物，其碱基序列为：
XLT–F：GGTGCTTTGTGTTAAGCTAC
XLT–R：ATGAAACTTAAGGGTCGAAG
一种检测线粒体mtDNA 12S rRNA多态突变位点的试剂盒，包括
(i)血液DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR反应液；
(iii)测序体系试剂；
其中，组织DNA抽提试剂可购自天根DNA抽提试剂盒等商品化试剂。
检测体系PCR扩增反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNAPolymerase(1U/μl)；线粒体mtDNA 12S rRNA基因序列的上、下游引物XLT-F/R引物浓度均为10μM。
测序体系试剂包括：测序纯化液(ExoI:0.6U，CIP:1.2U)、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：检测线粒体mtDNA12S rRNA基因的上、下游引物分别为XLT-F(3.2μm)、XLT-R(3.2μm),以及Bigdye Terminator V3.1(购买自美国Applied Biosystems公司)。
实施例2
血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
(1)抽提血液中的组织DNA：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份19μl分装：
X＝19μl反应液×(n份标本+1份空白对照)
n为检测标本数。
(3)加样：加入检测体系PCR反应液中1μl DNA；空白对照加1μl生理盐水或不加任何物质。
(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：
PCR扩增体系试剂配制方法如下：
其中，引物序列为：
(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110V，25min，凝胶成像系统观察。
如图2所示，即为16例血液样本以XLT-F/R引物扩增后所得产物的电泳图谱。本发明扩增的片段长度分别为229bp，通过电泳图的分析表明本发明所述XLT-F/R扩增有效，且条带单一。
(6)Sanger测序：
取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：
测序反应程序：
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50μl 70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl Hi-Di后进行变性试验。变性程序：
变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。
(7)结果判断：分别将测序结果与线粒体mtDNA 12S rRNA野生型参考序列(Genbank：NC_012920.1)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
取16例的临床样本(样本编号为1-16)按实施例1和2的试剂和方法提取基因组、配制试剂、扩增和测序。每份样本加入检测体系PCR反应液中1μl。电泳结果如图2所示，表明本发明所述引物XLT-F/R对血液样本能有效扩增，且条带单一。
样本1的部分测序检测结果如图3、4所示。图3显示是样本1的线粒体mtDNA 12SrRNA基因A1555G位点野生型测序截图，图4显示是样本1的线粒体mtDNA 12S rRNA基因C1494T位点野生型测序截图。
从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把A1555G、C1494T包括在内了，能够扩展出线粒体mtDNA 12S rRNA基因A1555G、C1494T所在DNA片段，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确的扩展出线粒体mtDNA12S rRNA基因片段，无论是野生型还是突变型。
序列表
<110> 武汉艾迪康医学检验所有限公司
<120> 一种线粒体相关药物性耳聋基因突变检测的引物和方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtgctttgt gttaagctac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaaactta agggtcgaag 20

Claims (7)

1.检测线粒体相关药物性耳聋基因突变情况的引物，其特征在于，包括：
XLT–F：GGTGCTTTGTGTTAAGCTAC
XLT–R：ATGAAACTTAAGGGTCGAAG。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括测序引物，其碱基序列为：
XLT–F：GGTGCTTTGTGTTAAGCTAC
XLT–R：ATGAAACTTAAGGGTCGAAG。
3.如权利要求1-2之一所述的引物，其特征在于，所述线粒体相关药物性耳聋基因为线粒体mtDNA 12S rRNA基因。
4.检测线粒体相关药物性耳聋基因突变情况的引物的方法，包括以下步骤：
(1)抽提血液中的组织DNA；
(2)用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；
(4)对测序结果进行判断，确定线粒体相关药物性耳聋基因是否发生突变；其中PCR扩增引物为：
XLT–F：GGTGCTTTGTGTTAAGCTAC
XLT–R：ATGAAACTTAAGGGTCGAAG。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，测序引物碱基序列为：
XLT–F：GGTGCTTTGTGTTAAGCTAC
XLT–R：ATGAAACTTAAGGGTCGAAG。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述测序的反应程序为，预变性：94℃，4min；95℃，15sec，50℃，20sec，60℃2min，25个循环，4℃保持。
7.如权利要求4至6之一所述的方法，其特征在于，所述线粒体相关药物性耳聋基因为线粒体mtDNA 12S rRNA基因。
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