CN104774950B - 一种基于hsp90aa1基因型预测糖皮质激素治疗sle疗效的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于HSP90AA1基因型预测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒，其包含有下述组分：检测HSP90AA1基因多态性位点基因型的引物，PCR扩增酶及相应缓冲液，PCR产物纯化酶，dNTP，单碱基延伸反应酶及相应缓冲液，单碱基延伸产物纯化酶。本发明提供了一种基于HSP90AA1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒和方法，本发明所述rs7160651，rs10873531和rs2298877多态性位点基因型能够预测糖皮质激素治疗SLE的疗效，为指导SLE患者的个体化治疗提供了新的思路和方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于HSP90AA1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒和方法，属于医药卫生技术领域。
背景技术
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种较为常见的自身免疫性疾病，其病因和发病机制尚未完全清楚，目前认为是遗传和环境因素共同作用的结果。该病多发于青中年女性，男女之比约为1：7～9，发病年龄多见于15～45岁，临床表现多样化，可出现多系统和脏器损伤。SLE广泛分布于世界各地，不同国家和地区的流行情况差异明显，我国的调查显示患病率约为40/10万～70/10万，据此推断，我国约有52～91万SLE患者。近年来，随着医疗水平的不断提升，SLE患者的预后和生存质量都取得了一定的改善。但SLE的发病率和患病率也在不断上升，极大危害了青中年女性的身心健康，已经成为一个重要的公共卫生问题。
糖皮质激素(glucocorticoids，GC)由于其强大的抗炎和免疫抑制作用而成为治疗SLE的首选药物，但SLE病情复杂多变，个体间差异较大，不同患者对GC反应也存在较大差异，有的起效快，有的起效慢，甚至无效，目前仍缺乏行之有效的GC治疗SLE的规范化指南，临床医生只能凭借临床经验来决定每个SLE患者的是否应该使用GC以及GC的治疗剂量和疗程。GC治疗SLE是一把双刃剑，在取得疗效的同时，也带来了很多不良反应，包括皮肤(萎缩、痤疮、多毛等)、肌肉骨骼(肌痛、骨质疏松、无菌性骨坏死等)、胃肠道(消化性溃疡、胃出血等)、心血管(高血压、加速动脉硬化等)、神经系统(精神失常、性格改变、睡眠障碍等)、眼睛(白内障、青光眼等)、内分泌(柯兴综合征、生长延迟、糖尿病等)、生殖系统(月经不调、阳痿等)、代谢(水钠潴留、高脂血症、低血钾等)和其它(继发感染、外周白细胞升高等)，其中一些不良反应可能导致病人死亡。SLE患者对GC反应的个体化差异及不良反应给SLE的临床合理用药带来了严重困难。
规范化、个体化地应用GC是SLE治疗中急需解决的问题。药物基因组学(Pharmacogenomics)是研究药物如何受遗传变异影响而产生不同的药物效应，是继人类基因组计划完成之后出现的功能基因组学研究的一个分支，它通过检测相关基因的单核苷酸多态性(single neucleotide polymorphism，SNP)来预测药物的疗效和毒性。药物基因组学的目的是依据患者的基因型来保证最大疗效的同时将毒性降到最低，用于探索合理的方法来优化药物治疗方案，它的出现对于提高药物疗效，降低药物不良反应具有重要的意义。发表在《Science》、《N Engl J Med》等国际知名杂志上的研究证据显示药物基因组学的研究成果能够迅速应用到临床治疗中，患者基因型即将成为确定患者个体化治疗的一个重要依据。目前我国在药物基因组方面的研究远远落后于发达国家，并未意识到其真正的价值。近年，发达国家在这个领域已经投入了巨大的人力和物力，并将研究结果专利化，开发新药及相关产品。
基因调控途径是GC的主要作用机制，即与胞浆内的糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor，GR)相结合，形成GC-GR复合物，转移入细胞核内，通过调控相关靶基因从而发挥药物作用。热休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)是热休克蛋白家族中的重要成员之一，它在体内普遍存在，是高度保守的一类分子伴侣蛋白，参与众多的细胞生理过程，对维持生命具有重要意义。HSP90是GC-GR效应中的重要伴侣蛋白和关键环节，它的变化将会影响GC生物效应的发挥。正常情况下HSP90与GR相结合形成多聚体，使受体形成适合配体结合的活性结构，当配体进入细胞内和受体特异结合，热休克蛋白就会脱离GC-GR复合物，复合物便进入核内发挥其生物效应。
HSP90基因变异可能是GC疗效和毒性存在个体化差异的重要原因之一。HSP90AA1基因是HSP90家族基因之一，目前已经发现多个HSP90AA1基因多态性位点。当前本领域缺乏基于HSP90AA1基因多态性位点基因型预测GC治疗SLE疗效的方法和试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于HSP90AA1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒和方法，为实现SLE患者的个体化治疗提供新的思路和方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种基于HSP90AA1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒，包括以下试剂组分：
(1)检测HSP90AA1基因多态性位点基因型的引物；
(2)PCR扩增酶及相应缓冲液；
(3)PCR产物纯化酶；
(4)dNTP；
(5)单碱基延伸反应酶及相应缓冲液；
(6)单碱基延伸产物纯化酶。
所述的HSP90AA1基因多态性位点为rs7160651，rs10873531和rs2298877。其中，多态性位点rs7160651的基因序列SEQ ID No1，多态性位点rs10873531的基因序列SEQ IDNo2，多态性位点rs2298877的基因序列SEQ ID No3。
所述的检测HSP90AA1基因多态性位点基因型的引物包括扩增多态性位点的引物和单碱基延伸多态性位点的引物。
所述的扩增rs7160651多态性位点的引物：
5’-TGGCTGTCAGGAATTGCCTATGT-3’
5’-GATGAGGGCAGAAGCTGACAGG-3’
所述的扩增rs10873531多态性位点的引物：
5’-CCCTGCACCTTGGCTCTGTCT-3’
5’-TTCATCCTCTGCCGCCCTATCT-3’
所述的扩增rs2298877多态性位点的引物：
5’-TTCAAGGGGTGGCATTTCTTCA-3’
5’-TCCTGCTTGCTGCTTGGAGGTA-3’
所述的单碱基延伸rs7160651多态性位点的引物：
5’-TTTTGATCAGGCCACCTTGTCAC-3’
所述的单碱基延伸rs10873531多态性位点的引物：
5’-TTTTTTTTTTTTTCGTCTCTGCATTCCCTGTCAC-3’
所述的单碱基延伸rs2298877多态性位点的引物：
5’-TTTTTTTTTTTTTTGTCTTGAAAGCAGATAGAAACCA-3’。
本发明还提供了一种基于HSP90AA1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗SLE疗效的方法，具体步骤包括：
(1)提取基因组DNA；
(2)PCR扩增反应；
(3)PCR产物纯化；
(4)单碱基延伸反应；
(5)延伸产物纯化；
(6)HSP90AA1基因分型；
(7)预测糖皮质激素治疗SLE疗效。
所述PCR扩增反应包含rs7160651，rs10873531和rs2298877三对扩增多态性位点的引物。
所述单碱基延伸反应包含rs7160651，rs10873531和rs2298877三条单碱基延伸多态性位点的引物。
所述的HSP90AA1基因分型包含rs7160651，rs10873531和rs2298877多态性位点基因型。
所述的糖皮质激素包括(但不限于)泼尼松、泼尼松龙、氢化可的松、可的松、曲安西龙、甲泼尼龙、强的松、强的松龙、地塞米松、倍他米松、甲强龙、甲基泼尼松等。
所述的疗效为SLE患者经糖皮质激素治疗后临床症状是否缓解，临床症状得到缓解为疗效好，没有缓解为疗效差。
本发明提供了一种基于HSP90AA1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒和方法，为实现SLE患者的个体化治疗提供了新的思路和方法。所述的预测为HSP90AA1基因的rs7160651多态性位点基因型为GA和/或AA时，预测糖皮质激素治疗SLE的疗效好，rs10873531多态性位点基因型为GA和/或GG时，预测糖皮质激素治疗SLE的疗效好，rs2298877多态性位点基因型为CT和/或TT时，预测糖皮质激素治疗SLE的疗效好。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。应理解为，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。
实施例1：一种基于HSP90AA1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒和方法
(一)试剂盒的组成成分
(1)检测HSP90AA1基因多态性位点基因型的引物；
扩增多态性位点的引物：
延伸多态性位点的引物：
(2)PCR扩增酶及相应缓冲液；
(3)PCR产物纯化酶；
(4)dNTP；
(5)单碱基延伸反应酶及相应缓冲液；
(6)单碱基延伸产物纯化酶。
(二)基因型检测及疗效预测
1采集血标本
患者为符合国际系统性红斑狼疮分类标准(ACR，1997年修订)的中国SLE患者，从患者外周静脉抽取全血5ml，放置于0.5M EDTA抗凝管中。
2提取基因组DNA
DNA的提取使用基因组DNA抽提试剂盒，具体方法如下：
(1)在1.5ml离心管中加入20μl QIAGEN蛋白酶，再加入200μl血样至离心管中，充分混匀。
(2)离心管中加入200μl Buffer AL，涡旋振荡15s充分混匀，56℃孵育10min，快速离心，去除残留在离心管盖子中的液滴。
(3)离心管中加入200μl的96-100％乙醇，涡旋振荡15s充分混匀，快速离心，去除残留在离心管盖子中的液滴。
(4)将样品移至QIAamp Mini离心柱，6000g(8000rpm)离心1min，将离心柱放入一个新的2ml收集管中。
(5)在离心柱加入500μl Buffer AW1，6000g(8000rpm)离心1min，将离心柱放入一个新的2ml收集管中。
(6)在离心柱加入500μl Buffer AW2，20000g(14000rpm)离心3min，再将离心柱转移到一个新的2ml收集管，20000g(14000rpm)离心1min。
(7)将离心柱转移到一个新的1.5ml收集管中，加入200μl Buffer AE，室温孵育1min，再6000g(8000rpm)离心1min，洗提DNA。
3基因型检测实验
(1)提取1μlDNA样本，采用1％agarose电泳对样本进行质量检查，并估计浓度。
(2)根据估计的浓度将样本稀释至5-10ng/μl的工作浓度。
(3)PCR扩增反应
扩增多态性位点引物：
扩增rs7160651多态性位点的引物：
5’-TGGCTGTCAGGAATTGCCTATGT-3’
5’-GATGAGGGCAGAAGCTGACAGG-3’
扩增rs10873531多态性位点的引物：
5’-CCCTGCACCTTGGCTCTGTCT-3’
5’-TTCATCCTCTGCCGCCCTATCT-3’
扩增rs2298877多态性位点的引物：
5’-TTCAAGGGGTGGCATTTCTTCA-3’
5’-TCCTGCTTGCTGCTTGGAGGTA-3’。
PCR反应体系：
反应体系包含1μl样本DNA，1x HotStarTaq buffer，0.3mM dNTP，3.0mM Mg2+，1UHotStarTaq polymerase(Qiagen Inc.)和1μl多重PCR引物。
PCR循环程序：
(4)PCR产物纯化
添加5U SAP酶和2U Exonuclease I酶至10μl PCR产物中，37℃温浴60分钟，再75℃下灭活15分钟。
(5)单碱基延伸反应
延伸引物：
单碱基延伸rs7160651多态性位点的引物：
5’-TTTTGATCAGGCCACCTTGTCAC-3’
单碱基延伸rs10873531多态性位点的引物：
5’-TTTTTTTTTTTTTCGTCTCTGCATTCCCTGTCAC-3’
单碱基延伸rs2298877多态性位点的引物：
5’-TTTTTTTTTTTTTTGTCTTGAAAGCAGATAGAAACCA-3’。
延伸反应条件：
10μl的延伸反应体系仲包括2μl纯化后的多重PCR产物，5μl SNaPshot MultiplexKit(ABI)，1μl延伸引物混合物和超纯水2μl。
延伸反应程序：
(6)延伸产物纯化
添加1U SAP酶至10μl延伸产物中，37℃温浴60分钟，再75℃灭活15分钟。
(7)延伸产物上ABI3730XL测序仪
把9μl Hi-Di，0.5μl Liz120SIZE STANDARD与0.5μl纯化后的延伸产物混匀，95℃变性5分钟后，上ABI3730XL测序仪收集数据。
(8)基因分型
采用GeneMapper 4.1(AppliedBiosystems Co.，Ltd.，USA)分析ABI3730XL测序仪上收集的数据，判定rs7160651，rs10873531和rs2298877多态性位点基因型。
4判定疗效标准
使用糖皮质激素泼尼松治疗SLE患者三个月，观察患者疗效，疗效评定使用系统性红斑狼疮活动指数(SLEDAI)评分。治疗后SLEDAI评分下降为0～4分为缓解，疗效好；治疗后SLEDAI评分仍大于4分为没有缓解，疗效差。
5预测疗效
233例SLE病人完成了三个月的治疗，其中，128例患者疗效好，105例患者疗效差。对233例患者的rs7160651，rs10873531和rs2298877多态性位点基因型分析显示三个多态性位点基因型分布均符合Hardy-Weinburg平衡，结果见表1。经回归分析发现校正混杂因素前后rs7160651，rs10873531和rs2298877多态性位点基因型均和糖皮质激素治疗SLE的疗效之间存在统计学关联，rs7160651，rs10873531和rs2298877多态性位点基因型能够预测糖皮质激素治疗SLE的疗效。rs7160651多态性位点基因型为GA和/或AA时，预测糖皮质激素治疗SLE的疗效好，rs10873531多态性位点基因型为GA和/或GG时，预测糖皮质激素治疗SLE的疗效好，rs2298877多态性位点基因型为CT和/或TT时，预测糖皮质激素治疗SLE的疗效好，结果见表2。
(三)结论
从上述结果可以得出：rs7160651，rs10873531和rs2298877多态性位点基因型能够预测糖皮质激素治疗SLE的疗效。rs7160651多态性位点基因型为GA和/或AA时，预测糖皮质激素治疗SLE的疗效好，rs10873531多态性位点基因型为GA和/或GG时，预测糖皮质激素治疗SLE的疗效好，rs2298877多态性位点基因型为CT和/或TT时，预测糖皮质激素治疗SLE的疗效好。
Claims (1)
1.一种基于HSP90AA1基因型预测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒，其特征在于包含有下述试剂组分：
(1)检测HSP90AA1基因多态性位点基因型的引物；
(2)PCR扩增酶及相应缓冲液；
(3)PCR产物纯化酶；
(4)dNTP；
(5)单碱基延伸反应酶及相应缓冲液；
(6)单碱基延伸产物纯化酶；
所述的HSP90AA1基因多态性位点为rs7160651，rs10873531和rs2298877；
所述的检测HSP90AA1基因多态性位点基因型的引物包括扩增多态性位点的引物和单碱基延伸多态性位点的引物；
所述的扩增rs7160651多态性位点的引物：
5’-TGGCTGTCAGGAATTGCCTATGT-3’
5’-GATGAGGGCAGAAGCTGACAGG-3’
所述的扩增rs10873531多态性位点的引物：
5’-CCCTGCACCTTGGCTCTGTCT-3’
5’-TTCATCCTCTGCCGCCCTATCT-3’
所述的扩增rs2298877多态性位点的引物：
5’-TTCAAGGGGTGGCATTTCTTCA-3’
5’-TCCTGCTTGCTGCTTGGAGGTA-3’
所述的单碱基延伸rs7160651多态性位点的引物：
5’-TTTTGATCAGGCCACCTTGTCAC-3’
所述的单碱基延伸rs10873531多态性位点的引物：
5’-TTTTTTTTTTTTTCGTCTCTGCATTCCCTGTCAC-3’
所述的单碱基延伸rs2298877多态性位点的引物：
5’-TTTTTTTTTTTTTTGTCTTGAAAGCAGATAGAAACCA-3’。
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