CN103468812A - 一种检测糖皮质激素治疗sle疗效的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒，包括：检测GR基因序列的引物；PCR扩增酶，纯化PCR产物的纯化酶及相应缓冲液；dNTP；单碱基延伸反应酶及相应的缓冲液。GR基因分型结果中rs10482672多态性位点为T（CT+TT）的患者疗效差，rs4912905多态性位点为C（GC+CC）的患者疗效好，rs17100234多态性位点为A（CA+AA）的患者疗好，rs7701443多态性位点为A（AA）的患者疗效差。本发明提供了一种基于GR基因多态性检测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒和方法，为实现SLE患者的个体化治疗提供新的思路和方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒，具体涉及一种基于GR基因多态性检测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒和方法，属于医药卫生技术领域。
背景技术
系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）是一种常见的自身免疫性疾病，世界范围内SLE的发病率约为50/10万，我国约为70/10万。该病多见于女性，男女发病率比约为1:9。近年来，SLE发病率和患病率不断升高，对青中年女性的身心健康造成了很大危害，已经成为一个重要的公共卫生问题。SLE的药物治疗主要以糖皮质激素（glucocorticoids，GC）为主。GC具有强大的抗炎和免疫抑制作用，其主要作用机制是基因调控途径，即与细胞浆内的糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）相结合，形成GC-GR复合物，转移入细胞核内，通过基因调控机制发挥作用。可见，GR 是GC发挥生理和药理作用的重要环节。
制定个体化治疗方案是 SLE 治疗的基本原则。临床实践表明GC的临床疗效存在极大的个体化差异，有相当一部分患者病情不能迅速得到缓解。同时，GC的应用结果像一把双刃剑，在取得疗效的同时也会导致许多不良反应，有的不良反应甚至会直接导致患者死亡。这给SLE患者的临床合理用药带来严重困难。目前, 临床医生对SLE患者是否应该给予GC治疗，治疗后在病程不同阶段应该使用何种剂量，病情稳定后应该如何调整剂量等都还主要依靠临床经验进行尝试性治疗，导致相当一部分病人不能适时的得到最佳治疗。
药物基因组学是继人类基因组计划完成之后出现的功能基因组学研究的一个分支，它的出现对于提高药物疗效，减轻不良反应具有重要的意义。药物基因组学介导的个体化用药就是药物治疗在充分考虑每个病人的遗传因素基础上制定安全、合理、有效、经济的药物治疗方案。近年，国际权威杂志《N Engl J Med》、《Science》等刊登的研究证据表明药物基因组学研究在转化应用中能够迅速获得回报。药物基因组学的主要手段是检测相关基因的单核苷酸多态性（single neucleotide polymorphism, SNP）。这种SNP可能会影响到其所表达的蛋白质的功能，或者影响蛋白质的表达水平，进而影响与其相互作用的外源性分子的效应，即药物疗效。不久的将来，患者基因型将成为确定患者个体化治疗的重要依据。
当前，迫切需要风湿科医生治疗SLE病人时能够在充分考虑每个病人的遗传因素基础上制定安全、合理、有效、经济的药物治疗方案。GR 是GC发挥生理和药理作用的重要环节，目前本领域缺乏基于GR基因（NR3C1）多态性检测糖皮质激素治疗SLE疗效的方法和试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于GR基因多态性检测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒和方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于GR基因多态性检测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒，包括以下试剂，保存温度为-20℃：
（1）检测GR基因序列的引物；
（2）PCR扩增酶，纯化PCR产物的纯化酶及相应缓冲液；
（3）dNTP；
（4）单碱基延伸反应酶及相应的缓冲液。
所述的检测GR基因序列的引物包括扩增基因序列多态性位点的引物以及单碱基延伸基因序列多态性位点的延伸引物。
所述的GR基因序列的分子标记为rs10482672，rs4912905，rs17100234和rs7701443。
所述的扩增rs10482672多态性位点的引物：
5’- CAAAGCAGGGCTGGGCTTTACT -3’
5’- TGTTGTGTTTGCATATCCATGAGAGTT -3’
所述的扩增rs4912905多态性位点的引物：
5’- GAAGAACTTGCCAAGAGGCTAGAGAA -3’
5’- CAATTCATTGACCTTACAGAATCACTGG -3’
所述的扩增rs17100234多态性位点的引物：
5’- GCATAAAGCCAAAACCTGAAAAGAAGA -3’
5’- AAATGGGGCCAGCCTACAACTG -3’
所述的扩增rs7701443多态性位点的引物：
5’- GCTACCAATGACTAACACTTTGAGGATTCA -3’
5’- CCGTATCTGTCTCCATTTCCTCCA -3’。
所述的单碱基延伸rs10482672多态性位点的引物：
5’- TTTTTTTTTTTTTTGCCATCCTTGTAATCTTTGTGGT -3’
所述的单碱基延伸rs4912905多态性位点的引物：
5’- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
GGTTTCTGTGACACAATTCTGTTT -3’
所述的单碱基延伸rs17100234多态性位点的引物：
5’- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
AATAGCGTCAACCAGTCATTTCA -3’
所述的单碱基延伸rs7701443多态性位点的引物：
5’- TTTCCCAGTATAAGGCTGCAGGG -3’。
本发明还提供了一种基于GR基因多态性检测糖皮质激素治疗SLE疗效的方法，包括以下步骤：
（1）DNA的提取；
（2）PCR扩增反应；
（3）纯化反应；
（4）单碱基延伸反应；
（5）基因分型；
（6）疗效判断：GR基因分型结果中rs10482672多态性位点为T（CT+TT）的患者疗效差， rs4912905多态性位点为C（GC+CC）的患者疗效好，rs17100234多态性位点为A（CA+AA）的患者疗好，rs7701443多态性位点为A（AA）的患者疗效差。
所述PCR扩增反应中包括有rs10482672，rs4912905，rs17100234，rs7701443四对扩增多态性位点的引物。
所述单碱基延伸反应中包括有rs10482672，rs4912905，rs17100234，rs7701443四条单碱基延伸多态性位点的引物。
所述的糖皮质激素包括但不限于泼尼松、氢化可的松、可的松、强的松、强的松龙、甲强龙、甲基泼尼松、对氟米松、氟泼尼松龙、氯地米松、地塞米松、倍他米松等。
所述的疗效为患者治疗后临床症状是否缓解，缓解为疗效好，没有缓解为疗效差。
本发明通过前瞻性的队列研究提出了基于GR基因rs10482672，rs4912905，rs17100234和rs7701443多态性位点检测糖皮质激素治疗SLE疗效的方法和试剂盒。根据rs10482672，rs4912905，rs17100234和rs7701443多态性位点不同基因型的患者临床疗效的差异，进行了卡方检验和回归分析。结果发现，rs10482672，rs4912905，rs17100234和rs7701443多态性位点基因型分布均符合Hardy-Weinburg平衡；rs10482672，rs4912905，rs17100234和rs7701443多态性位点和糖皮质激素治疗SLE的疗效之间存在显著关联，rs10482672，rs4912905，rs17100234和rs7701443多态性位点能够用来检测糖皮质激素治疗SLE的疗效，其中，rs10482672多态性位点为T（CT+TT）的患者疗效差， rs4912905多态性位点为C（GC+CC）的患者疗效好，rs17100234多态性位点为A（CA+AA）的患者疗好，rs7701443多态性位点为A（AA）的患者疗效差。
本发明提供了一种基于GR基因多态性检测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒和方法，为实现SLE患者的个体化治疗提供了新的思路和方法，有利于风湿科医生治疗SLE病人时，能够在充分考虑每个病人的遗传因素基础上制定安全、合理、有效、经济的药物治疗方案。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解为，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。
本发明的基于GR基因多态性检测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒由以下试剂组成：
（1）扩增多态性位点的引物；
（2）PCR扩增酶，纯化PCR产物的纯化酶及相应缓冲液；
（3）dNTP；
（4）单碱基延伸rs10482672，rs4912905，rs17100234和rs7701443多态性位点的延伸引物；
（5）单碱基延伸反应酶及相应的缓冲液。
实施例1
1、研究对象
所有的研究对象均被2个以上的风湿科专家诊断的、符合国际系统性红斑狼疮分类标准（ACR，1997年修订）的中国患者。
方法
2.1 血液标本的采集
对所有患者抽取外周静脉血5ml，置于0.5M乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，用于提取基因组DNA。
DNA的提取
DNA的提取使用基因组DNA抽提纯化试剂盒，具体方法如下：
（1）将1.0ml细胞裂解液（FG1）加入2.0ml离心管中，再取400ul血样加入对应离心管中，颠倒混匀30次左右，直到无血凝块出现，16，000g离心4分钟；
（2）倾倒上清，吸水纸沥干30秒后，加入200ul变性缓冲液/蛋白酶K(FG2/PK)溶液，并震荡混匀直到无细胞团块出现；
（3）短暂离心后，65℃水浴20分钟，水浴时需要将管口1/3左右留在水面以上，以防水分等杂质进入管内；
（4）短暂离心后，在离心管中加入异丙醇200ul，并上下颠倒，可见离心管中有絮状DNA沉淀；
（5）16，000g离心4分钟，倾倒上清，吸水纸沥干30秒，可见管底有白色DNA沉淀；
（6）加入70%乙醇200ul，小心弹起DNA沉淀，再16，000g离心5分钟；
（7）倾倒上清，吸水纸沥干20分钟，加入110ul水合缓冲液，65℃水浴20分钟，摇床过夜；
（8）电泳和紫外分光光度计（Nanodrop Spectrophotometer，ND-1000）检测DNA质量，所有样本用FG1稀释以备用。
检测实验
（1）DNA样本取1μl，1% agarose电泳对其样本进行质量检查以及浓度估计，然后根据估计的浓度将样本稀释到工作浓度5-10ng/μl。
（2）PCR扩增反应
a）PCR扩增引物
扩增rs10482672多态性位点的引物：
5’- CAAAGCAGGGCTGGGCTTTACT -3’
5’- TGTTGTGTTTGCATATCCATGAGAGTT -3’
扩增rs4912905多态性位点的引物：
5’- GAAGAACTTGCCAAGAGGCTAGAGAA -3’
5’- CAATTCATTGACCTTACAGAATCACTGG -3’
扩增rs17100234多态性位点的引物：
5’- GCATAAAGCCAAAACCTGAAAAGAAGA -3’
5’- AAATGGGGCCAGCCTACAACTG -3’
扩增rs7701443多态性位点的引物：
5’- GCTACCAATGACTAACACTTTGAGGATTCA -3’
5’- CCGTATCTGTCTCCATTTCCTCCA -3’。
b）PCR扩增条件
反应体系（20μl）包含1x HotStarTaq buffer，3.0mM Mg2+，0.3mM dNTP，1U HotStarTaq polymerase（Qiagen Inc.），1μl样本DNA和2μl多重PCR引物。
PCR循环程序：95oC 2min；11 cycles x（94oC 20s, 65oC-0.5oC /cycle 40 s, 72oC 1min30s）；24cycles x（94oC 20s, 59oC 30s, 72oC 1.5min）；72oC 2 min；4oC for ever。
（3）PCR产物纯化
在15μl PCR产物中加入5U SAP酶和2U Exonuclease I酶，37oC温浴1小时，然后75oC灭活15分钟。
（4）单碱基延伸反应
a）延伸引物
单碱基延伸rs10482672多态性位点的引物：
5’- TTTTTTTTTTTTTTGCCATCCTTGTAATCTTTGTGGT -3’
单碱基延伸rs4912905多态性位点的引物：
5’- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
GGTTTCTGTGACACAATTCTGTTT -3’
单碱基延伸rs17100234多态性位点的引物：
5’- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
AATAGCGTCAACCAGTCATTTCA -3’
单碱基延伸rs7701443多态性位点的引物：
5’- TTTCCCAGTATAAGGCTGCAGGG -3’。
b）延伸反应条件
延伸反应体系（10μl）包括5μl SNaPshot Multiplex Kit（ABI），2μl纯化后多重PCR产物，1μl延伸引物混合物，2μl超纯水。
PCR循环程序：96oC 1min；28 x（96oC 10s, 55oC 5s, 60 oC 30s）；4oC for ever。
（5）延伸产物纯化
在10μl延伸产物中加入1U SAP酶，37 oC温浴1小时，然后75oC灭活15分钟。
（6）ABI3730XL测序仪收集数据
取0.5μl纯化后的延伸产物，与0.5μl Liz120 SIZE STANDARD，9μl Hi-Di混匀，95oC变性5分钟后上ABI3730XL测序仪。
（7）ABI3730XL测序仪上收集的数据用GeneMapper 4.1（AppliedBiosystems Co.，Ltd.，USA）来分析，判定rs10482672，rs4912905，rs17100234和rs7701443多态性位点基因型。
治疗及疗效的判定
对SLE患者使用常用糖皮质激素泼尼松（10mg/d-1mg/(kg·d)）治疗三个月，采用系统性红斑狼疮活动指数（SLEDAI）评价病人治疗后的疗效。疗效判定：治疗后SLEDAI评分0~4分为缓解，治疗后SLEDAI评分仍大于4分为没有缓解。
统计学分析和结果
经过基因分型和样本质控后，我们对212例SLE病人基因分型结果和临床疗效进行了卡方检验和回归分析。结果发现，rs10482672，rs4912905，rs17100234和rs7701443多态性位点基因型分布均符合Hardy-Weinburg平衡（表1）；rs10482672，rs4912905，rs17100234和rs7701443多态性位点和糖皮质激素治疗SLE的疗效之间存在显著关联，rs10482672，rs4912905，rs17100234和rs7701443多态性位点能够用来检测糖皮质激素治疗SLE的疗效，其中，rs10482672多态性位点为T（CT+TT）的患者疗效差， rs4912905多态性位点为C（GC+CC）的患者疗效好，rs17100234多态性位点为A（CA+AA）的患者疗好，rs7701443多态性位点为A（AA）的患者疗效差。（表2）。
结论
从上述结果可以得出：rs10482672，rs4912905，rs17100234和rs7701443多态性位点能够用来检测糖皮质激素治疗SLE的疗效，其中，rs10482672多态性位点为T（CT+TT）的患者疗效差， rs4912905多态性位点为C（GC+CC）的患者疗效好，rs17100234多态性位点为A（CA+AA）的患者疗好，rs7701443多态性位点为A（AA）的患者疗效差。
Claims (1)
1.一种检测糖皮质激素治疗SLE疗效的试剂盒，其特征在于，包括以下试剂，保存温度为-20℃：
（1）检测GR基因序列的引物，
（2）PCR扩增酶，纯化PCR产物的纯化酶及相应缓冲液，
（3）dNTP，
（4）单碱基延伸反应酶及相应的缓冲液；
所述的检测GR基因序列的引物包括扩增基因序列多态性位点的引物，以及单碱基延伸基因序列多态性位点的延伸引物；
所述的基因序列的分子标记为rs10482672，rs4912905，rs17100234和rs7701443；
所述的扩增rs10482672多态性位点的引物：
5’- CAAAGCAGGGCTGGGCTTTACT -3’
5’- TGTTGTGTTTGCATATCCATGAGAGTT -3’
所述的扩增rs4912905多态性位点的引物：
5’- GAAGAACTTGCCAAGAGGCTAGAGAA -3’
5’- CAATTCATTGACCTTACAGAATCACTGG -3’
所述的扩增rs17100234多态性位点的引物：
5’- GCATAAAGCCAAAACCTGAAAAGAAGA -3’
5’- AAATGGGGCCAGCCTACAACTG -3’
所述的扩增rs7701443多态性位点的引物：
5’- GCTACCAATGACTAACACTTTGAGGATTCA -3’
5’- CCGTATCTGTCTCCATTTCCTCCA -3’；
所述的单碱基延伸rs10482672多态性位点的引物：
5’- TTTTTTTTTTTTTTGCCATCCTTGTAATCTTTGTGGT -3’
所述的单碱基延伸rs4912905多态性位点的引物：
5’- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
GGTTTCTGTGACACAATTCTGTTT -3’
所述的单碱基延伸rs17100234多态性位点的引物：
5’- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
AATAGCGTCAACCAGTCATTTCA -3’
所述的单碱基延伸rs7701443多态性位点的引物：
5’- TTTCCCAGTATAAGGCTGCAGGG -3’。
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