CN104531888A - 一种引物对及其用于检测Apom基因启动子区-724位点的方法 - Google Patents

一种引物对及其用于检测Apom基因启动子区-724位点的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种引物对及其用于检测Apom基因启动子区-724位点的方法，所述引物对是根据一个2型糖尿病ApoM基因的序列设计的，所述引物对用于检测Apom基因启动子区-724位点的方法包括如下步骤：提取样品的全基因组DNA；根据所述引物对对提取的基因组DNA进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行确定检测目的片段并回收纯化；对纯化后的检测目的片段进行测序，并分析测序结果来判断所述的ApoM基因启动子区-724位点是否发生突变。本发明为后续的检测手段以及进一步采取有针对性的健康管理、疾病预防提供参考依据。

Description

一种引物对及其用于检测Apom基因启动子区-724位点的方法
技术领域
本发明涉及疾病相关位点检测领域，具体的说，涉及一种引物对及其用于检测Apom基因启动子区-724位点的方法。
背景技术
目前全世界糖尿病患者的数量已达3.66亿，全球每7秒种就有一人死于糖尿病。糖尿病是指以血糖增高为主要临床表现的慢性代谢性疾病，主要分为1型糖尿病和2型糖尿病，2型糖尿病占糖尿病患者90％以上。1型糖尿病是一种自体免疫疾病，是由于免疫系统对分泌胰岛素的胰腺β细胞作出攻击导致胰腺不能分泌足够的胰岛素。而2型糖尿病是由于各种致病因素导致组织器官产生胰岛素抵抗，即胰岛素相对缺乏，故通常临床上用胰岛素释放实验来区别糖尿病的类型。患者试验空腹及进食75克葡萄糖后30分钟、60分钟、120分钟和180分钟分别抽血测定胰岛素及C肽水平。若空腹胰岛素及C肽低于正常，且进食后不增高考虑为1型糖尿病；若空腹胰岛素及C肽低于正常、增高或降低，且进食后增高，则考虑为2型糖尿病。
2型糖尿病具体的致病原因仍然未知，现在的研究发现其是由遗传因素和环境因素共同作用导致的，其中遗传因素约占30％,环境因素约占70％。2型糖尿病的遗传风险是由多个基因共同决定的，目前为止,公认的2型糖尿病易感基因已经增至20个,同时还发现了13个影响空腹血糖的基因以及5个影响餐后血糖的基因。临床常规检查例如空腹及餐后血糖、糖化血红蛋白、C肽水平只能判断2型糖尿病的发生发展情况，但无法找到致病根源，无法根据这些指标做出及时的预防。
发明内容
针对现在临床常规检查存在的问题与不足，本发明提供一种引物对及其用于检测Apom基因启动子区-724位点的方法，克服了无法根据临床常规指标做出及时预防的难题。本发明根据检测Apom基因启动子区-724位点的具体状况作为2型糖尿病健康管理的主线，监控疾病的发生发展，该检测方法操作简单、检测结果可靠准确，进而做到及早预防，早发现，早治疗甚至避免疾病的发生。
为了实现上述目的，本发明提供一种引物对，所述引物对是根据一个2型糖尿病相关基因的序列设计的，所述的2型糖尿病相关基因为ApoM基因，所述的引物对用于检测ApoM基因启动子区-724位点。
较佳的，所述引物对是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
所述引物对用于检测Apom基因启动子区-724位点的方法包括如下步骤：
a.提取样品的全基因组DNA；
b.根据所述引物对对提取的基因组DNA进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，以2000bp mark为标尺，根据扩增片段大小,确定检测目的片段并回收纯化；
c.对纯化后的检测目的片段进行测序，分析测序结果检测ApoM基因启动子区-724位点的状况，判断所述ApoM基因启动子区-724位点正常与否。
其中步骤b中回收纯化包括制胶、上样、电泳、割胶、溶胶、柱平衡、转移、漂洗、洗脱回收、浓度与纯度检验的步骤。
较佳的，所述柱平衡的步骤之前有一个柱预处理的步骤。
较佳的，所述洗脱回收的步骤中洗脱体积不小于30μ1,这样做对回收效率有较好的影响。
所述洗脱回收的步骤中洗脱液为ddH2O，为了得到较好的洗脱效率，PH值控制在7.0-8.5之间。
所述洗脱回收的步骤得到的产物保存在-20℃，以防止其分解。
有益效果：本发明首次发现了ApoM基因的启动子区-724位点是2型糖尿病易感位点，并根据ApoM基因设计特异性的引物，以来自人的组织、全血样本提取全基因组DNA模板进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序，设计巧妙、操作简单、检测结果可靠准确，根据该易感位点的具体状况作为2型糖尿病健康管理的主线，监控疾病的发生发展。如果是2型糖尿病遗传倾向较高的人群，及时预防2型糖尿病的外在致病因素，并按时完善预防性的相关的检查，例如空腹、餐后血糖，做到及早预防，早发现，早治疗甚至避免疾病的发生。
具体实施方式
为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。
1.基因组DNA提取:
1.1试剂和仪器:
1.1.1试剂和耗材：基因组DNA抽提试剂盒(TIANamp BLOODDNA kit,DP318-03；TIANamp口腔拭子基因组DNA提取试剂盒，DP322-03)含:细胞裂解液CL；缓冲液GA；缓冲液GS；缓冲液GB；缓冲液GD；漂洗液PW；洗脱缓冲液TB；Carrier RNA；RNase-freeddH2O；蛋白酶K(20mg/ml)；吸附柱；收集管(2ML)；1.5ML无菌收集管；无水乙醇。
1.1.2仪器:BECKMAN COULTER20R离心机；Qilinbeier VORTEX-5旋涡混合器；HH-W600电热恒温水浴锅。
1.2提取步骤
从全血中提取基因组DNA
1.2.1取200μ1的抗凝全血至1.5m1的Eppendorf管中，如果样本的量少于200μ1，则加入缓冲液GS补充至200μ1。如果样本量多于200μ1，需要用细胞裂解液CL处理，具体步骤如下：在样品中加入1-2.5倍体积的细胞裂解液CL,颠倒混匀，10000rpm离心1分钟，吸取上清，留下细胞核沉淀(如果裂解不彻底，可重复以上步骤一次)，向离心收集到的细胞核沉淀中加200μ1缓冲液GS，振荡至彻底混匀。
1.2.2加入20μ1的蛋白酶K溶液，混匀，再加入200μl的缓冲液GB，立刻充分颠倒混匀。56℃水浴样本10分钟，水浴过程中请每隔3分钟上下轻柔颠倒混匀样本，溶液应变清亮。(如溶液未彻底变清亮，可延长裂解时间至溶液变清亮为止)。
1.2.3加入200μ1无水乙醇，充分颠倒混匀，这时可能会出现絮状沉淀。
1.2.4将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
1.2.5向吸附柱中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
1.2.6向吸附柱中加入700μl漂洗液PW使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
1.2.7向吸附柱中加入500μl漂洗液PW,12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液。
1.2.8将吸附柱放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
1.2.9将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200μ1洗脱缓冲液TB，室温放置2-5分钟，12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
注意:洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收效率。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm～13,400×g)离心2分钟。洗脱液的pH对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
2.基因目的片段扩增:
1.1试剂和仪器:
2.1.1试剂和耗材：PCR反应试剂盒(TIANamp Taq PCRMastermix(KT201)；TIANamp Marker I(MD101)。
2.1.2仪器:Applied Biosystems 2720Thermal cycler PCR仪；天能Tanon–4100凝胶成像系统。
2.2进行PCR反应，详见下表:
PCR反应体系如下：
PCR反应循环条件的设置：
PCR扩增后产物进行琼脂糖凝胶电泳，以2000bp mark为标尺，根据扩增片段大小，确定是否为检测目的片段，如是将目的片段的胶块割下，进行胶回收纯化。
3.胶回收纯化
3.1PCR扩增产物纯化试剂盒：大量琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANamp DP209-03)。
3.2.1Kit的组成：
3.2.2储存条件：该试剂盒置于室温(15-25℃)干燥条件下，可保存12个月，更长时间的保存可置于2-8℃保存条件下，若溶液产生沉淀，使用前应将试剂盒内的溶液在室温放置一段时间，必要时可在37℃水浴中预热10min，以溶解沉淀。
3.3.1制胶：用100m1TAE溶液溶解1.5g的琼脂糖粉，终浓度为1.5(质量体积比，1.5g琼脂糖粉/100m1TAE)。用微波炉加热溶解琼脂糖粉(可加热两次，每次一分钟，防止爆沸)。室温冷却至60℃。加入18μ1的浓度为l0mg/ml的EB，混匀后，将胶倒入一茬好梳子的胶槽中。待胶彻底凝固，取出梳齿，切下取所需胶孔量用铲子将胶移至胶槽里后再放到电泳槽中，加入1X TAE电泳液。
3.3.2上样：l0μL样品；6u1DNA Marker。
3.3.3电泳：接通恒直流电源，110伏特电压电泳，电泳30分钟。
3.3.4割胶：在凝胶成像系统下，割下含DNA的琼脂糖胶块，使它尽可能小，尽可能薄的胶片，放入1.5m1离心管，称取重量。尽量去掉不含DNA的琼脂糖，这样对提高质量、简化操作均有利。(备注：将胶槽从电泳槽里拿出，放在吸水纸上将缓冲液吸干，在紫外台上垫上保鲜膜，用镊子固定胶块进行割胶，割胶完成后，用镊子将割好的胶转移到离心管中，注意:每转移一个胶块，镊子都要放到酒精溶液中清洗，以防污染。)
3.3.5溶胶：向胶块中加入等倍体积溶液PN(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μ1，则加入100μ1PN溶液)，50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解。(备注：若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块。)
3.3.6柱平衡步骤：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μ1平衡液BL,12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(备注：请使用当天处理过的柱子。)
3.3.7将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min,12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。(备注：吸附柱容积为800μ1，若样品体积大于800μ1可分批加入。)
3.3.8向吸附柱CA2中加入600μ1漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。(备注：如果回收的DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议PW加入后静置2-5min再离心。)
3.3.9重复操作步骤3.3.8。
3.3.10将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。(注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。)
将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12,000rpm(～13,400×g)离心2min收集DNA溶液。(注意:洗脱体积不应小于30μl，体积过少影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。DNA也可以用缓冲液(10mM Tris-Cl，pH8.0)洗脱。为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将DNA溶液收集到离心管中。
3.3.11回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50μg/ml双链DNA、40μg/ml单链DNA。OD260/OD280比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用ddH2O，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。
4.测序反应
4.1.1试剂：BigDye测序反应试剂盒(主要试剂是BigDyeMix，内含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaqDNA polymerase FS，反应缓冲液等)。醋酸钠/乙醇溶液(3NNaAC 2.5m1+ROH 37.5m1)。pGEM-3Zf(+)双链DNA对照模板0.2g/L，试剂盒配套试剂。POP 6测序胶ABI产品。模板抑制试剂(TSR)ABI产品。
4.1.2仪器：ABI PRISM 3730xl型全自动DNA测序仪。
4.2反应操作流程：
4.2.1引物用去离子水或ddH2O配成3.2pmol/μl。
4.2.2加样。按先加ddH2O，再加引物，最后加模板的顺序按体积从大到小将所有样品加好(引物lμl，总体积4μl)。应分别将试剂加在反应管不同方向的管壁上(水加于下方，引物加在左边，模板加在上方)。
4.2.3加完后，盖上封口膜，4℃离心，速度到4000rpm即可。将所有液体收集到管底。
4.2.4将96孔板的缺口置于左下角，加入1μ1BDT，BDT要加在管壁的左边，加完并检查无遗漏后，盖上封口膜，离心，盖上盖子，振荡，再离心。
4.2.5放入PCR仪中，进行扩增反应(96℃2min：96℃30s，50℃30s，60℃4min，25cycles；40℃∞)。
4.2.6PCR反应结束后离心(速度达到4000rpm即可)，揭开盖子(注意勿将管底液体振起，同时按顺序将盖子排好)，加入20μ1的乙醇和NaAc的混合溶液，盖上盖子，振荡后再低温(4℃)高速离心(4000rpm)30分钟。
4.2.7揭开盖子，盖上吸水纸，反向离心(小心速度决不能超过600rpm，严格控制离心时间，当速度达到600rpm即停止离心)。
4.2.8向上步得到沉淀中加入冷冻(-20℃)的70％乙醇100μ1，盖上盖子，充分振荡后，离心(4000rpm)15分钟。
4.2.9倒去上清液，盖上吸水纸，反向离心(同4.2.7)。
4.2.10将洗涤好的沉淀在室温下放置10分钟左右，让残留乙醇全部挥发。
4.2.11加入20μ1ddH20，将反应管移至ABI PRISM 3730xl上样底座，离心(速度达到4000rpm即停止)抽检反应管，看是否样品溶液已经离心至管底。最后将上样底座小心放入3730xl仪器的上样平台上，开动仪器电泳。
5.结果分析:
将测序导出的ab1格式的测序文件导出后，使用ClustalX2软件进行分析。检测ApoM基因启动子区-724位点，该ApoM基因的候检位点在人群中有三种基因型:C/C，C/del和del/del，其中携带C/del和del/del基因型的人群较携带C/C基因型的人患2型糖尿病的风险增加，患病风险几率大小del/del型>C/del型>C/C型。测序结果表明ApoM基因启动子区-724位点为del/del型，异常。根据上述检测结果，可以判断上述受检的ApoM基因异常，受检者较正常人患2型糖尿病的几率要高，但是是否已经患有2型糖尿病，还需要进行进一步的2型糖尿病检查，并进行专门的针对性的健康管理。
综上所述，本发明的2型糖尿病易感位点检测方法设计巧妙、操作简单、检测结果准确可靠，为是否进一步采取有针对性的健康管理以及后续的检测手段提供参考依据。
需要说明的是，在本发明中提及的所有文献在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，以上所述的是本发明的具体实施例及所运用的技术原理，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改而不背离本发明的精神与范围，这些等价形式同样落在本发明的范围内。

Claims (8)

1.一种引物对，所述引物对是根据一个2型糖尿病相关基因的序列设计的，其特征在于：所述的2型糖尿病相关基因为ApoM基因，所述的引物对用于检测ApoM基因启动子区-724位点。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于：所述引物对是SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2任一项所述一种引物对用于检测Apom基因启动子区-724位点的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.提取样品的全基因组DNA；
b.根据所述引物对对提取的基因组DNA进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，以2000bp mark为标尺，根据扩增片段大小,确定检测目的片段并回收纯化；
c.对纯化后的检测目的片段进行测序。
4.根据权利要求3所述引物对用于检测Apom基因启动子区-724位点的方法，其特征在于：所述步骤b中回收纯化包括制胶、上样、电泳、割胶、溶胶、柱平衡、转移、漂洗、洗脱回收、浓度与纯度检验的步骤。
5.根据权利要求4所述引物对用于检测Apom基因启动子区-724位点的方法，其特征在于：所述柱平衡的步骤之前有一个柱预处理的步骤。
6.根据权利要求4所述引物对用于检测Apom基因启动子区-724位点的方法，其特征在于：所述洗脱回收的步骤中洗脱体积不小于30μ1。
7.根据权利要求4所述引物对用于检测Apom基因启动子区-724位点的方法，其特征在于：所述洗脱回收的步骤中洗脱液为ddH2O，pH值控制在7.0-8.5之间。
8.根据权利要求4所述引物对用于检测Apom基因启动子区-724位点的方法，其特征在于：所述洗脱回收的步骤得到的产物保存在-20℃。
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CN106884013A (zh) * 2017-04-21 2017-06-23 皖南医学院 一种用于检测ApoM启动子基因序列的引物对及其检测方法和试剂盒

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