CN101760530B

CN101760530B - 一种脑中风相关位点检测方法

Info

Publication number: CN101760530B
Application number: CN2008102082212A
Authority: CN
Inventors: 陈奕雄; 赵翊均
Original assignee: Shanghai Genecore Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Genecore Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2008-12-26
Filing date: 2008-12-26
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2028-12-26
Also published as: CN101760530A

Abstract

本发明涉及一种脑中风相关位点检测方法，包括步骤：提取来自人的样本的基因组DNA；根据至少2个脑中风相关基因分别设计一对Taqman探针对和一对引物对，所述Taqman探针对的5’端和3’端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团，分别对所述基因组DNA进行荧光定量PCR扩增；根据荧光定量PCR扩增结果来判断所述脑中风相关基因是否发生突变，较佳的，所述脑中风相关基因的数目是4个，是MTHFR基因、ENOS基因、PDE4D基因和PON1基因，本发明的检测方法设计巧妙、操作简单、检测结果准确可靠，为是否进一步采取有针对性的健康管理以及后续的检测手段提供参考依据。

Description

一种脑中风相关位点检测方法

技术领域

本发明涉及疾病相关位点检测技术领域，更具体地，涉及脑中风相关位点检测方法技术领域，特别是指一种脑中风相关位点检测方法。

背景技术

脑中风(Stroke)主要是指供应脑的动脉发生粥样硬化，引起血管堵塞、狭窄或破裂，造成部分脑组织的损害。它是由脑血管病变引起的脑部疾病的总称，故又称为“脑血管病”、“脑血管意外”或“脑卒中”。主要分为出血性脑中风(脑出血或蛛网膜下腔出血)和缺血性脑卒中(脑梗塞、脑血栓形成)二大类，以脑梗塞最为常见。脑中风具有发病急、来势凶的特点，具有极高的病死率(急性期30％)和致残率(76％)，是世界上最重要的致死性疾病之一，在我国每年脑中风的发病人数约有200万人以上。由于一直缺乏有效的治疗措施，目前认为预防是最好的措施。

脑中风是多基因、多因素的疾病。到目前为止的人类基因组学研究结果显示，多个基因中的变异位点，导致了人与人之间罹患脑中风遗传风险性的不同。已知的基因包括strok-1，strok-2等。strok-1是同型半胱氨酸代谢中的关键酶之一，strok-1基因的变异会引起高半胱氨酸血症，而高半胱氨酸血症在动脉粥样硬化和脑血管病的发病机制中起重要作用。strok-2基因的表达产物具有舒张血管、抑制血小板的黏附和聚集和抑制血管平滑肌细胞增殖等功能。这些基因中的特定变异位点均构成脑血管病的危险遗传因素。通过检测个体该类变异位点的基因型，即可预测脑中风发病风险。

中风是完全能够预防的。只要饮食合理，注意控制血压，多参加有利于身体健康的活动，加强对相关疾病的防治，可以将中风的发生率降低到最低限度，这就是一级预防。尽管我们目前还不能全面说出死亡率下降的所有原因，但毫无疑问中风病人死亡率下降与近年来重视中风的预防有关。因此，为了更早地预防脑中风的发生，需要在脑中风发生前就提前通过基因检测准确筛查出高风险人群，并对这一人群进行有针对性的健康管理，才能做到真正的早预防，再结合其它手段定期检测，真正实现脑中风的早发现、早治疗，以达到提前进行个性化预防的目的。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种脑中风相关位点检测方法，该检测方法设计巧妙、操作简单、检测结果准确可靠，为是否进一步采取有针对性的健康管理以及后续的检测手段提供参考依据。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

该脑中风相关位点检测方法，其特点是，包括步骤：

a.提取来自人的样本的基因组DNA；

b.根据至少2个脑中风相关基因分别设计一对Taqman探针对和一对引物对，所述Taqman探针对的5’端和3’端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团，分别对所述基因组DNA进行荧光定量PCR扩增；

c.根据荧光定量PCR扩增结果来判断所述脑中风相关基因是否发生突变。

较佳的，所述脑中风相关基因的数目是4个。

更佳的，所述脑中风相关基因是MTHFR基因、ENOS基因、PDE4D基因和PON1基因。

更进一步地，所述Taqman探针对和所述引物对用于检测MTHFR基因的rs1801133位点，ENOS基因的rs1799983位点，PDE4D基因的rs702553位点，PON1基因的rs622位点。

较佳的，所述Taqman探针对是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述Taqman探针对的5’端分别标记FAM标记和HEX标记，3’端均标记TAMRA标记，所述引物对是SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

较佳的，所述Taqman探针对是SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，所述Taqman探针对的5’端分别标记FAM标记和VIC标记，3’端均标记TAMRA标记，所述引物对是SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

较佳的，所述Taqman探针对是SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列，所述Taqman探针对的5’端分别标记FAM标记和TET标记，3’端均标记TAMRA标记，所述引物对是SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。

较佳的，所述Taqman探针对是SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列，所述Taqman探针对的5’端分别标记FAM标记和TET标记，3’端均标记TAMRA标记，所述引物对是SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列。

本发明的创新点在于几个脑中风有关的侯检位点的整合，通过选取多个脑中风的侯检位点，根据MTHFR基因、ENOS基因、PDE4D基因和PON1基因设计特异性引物和Taqman探针对来自人的样本的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增，根据产生的荧光的量和荧光的种类可以知道侯检位点的基因型，设计巧妙、操作简单、检测结果准确可靠，将基因体检的结果作为脑中风健康管理的主线，监控疾病的发生发展。如果是脑中风遗传风险度高的人群，建议减少一切脑中风的外在致病因素，并每半年进行一次检查，做到早预防，早发现，早治疗，延缓甚至避免疾病的发生。

具体实施方式

为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。

1.基因组DNA提取：

1.1试剂和仪器：

1.1.1试剂和耗材：基因组DNA抽提试剂盒(TIANamp BLOOD DNA kit，DP318-03；TIANamp Micro微量样品基因组DNA提取试剂盒，DP316；TIANamp口腔拭子基因组DNA提取试剂盒，DP322-03)含：细胞裂解液CL；缓冲液GA；缓冲液GS；缓冲液GB；缓冲液GD；漂洗液PW；洗脱缓冲液TB；Carrier RNA；RNase-free ddH2O；蛋白酶K(20mg/ml)；吸附柱；收集管(2ML)；1.5ML无菌收集管；无水乙醇。

1.1.2仪器：DENVILLE260离心机，XW-80A旋涡混合器，H.H.S指针式电热恒温水浴锅。

1.2提取步骤

从全血中提取基因组DNA

1.2.1取200μl的抗凝全血至1.5ml的Eppendorf管中，如果样本的量少于200μl，则加入缓冲液GS补充至200μl。如果样本量多于200μl，需要用细胞裂解液CL处理，具体步骤如下：在样品中加入1-2.5倍体积的细胞裂解液CL，颠倒混匀，10,000rpm离心1分钟，吸取上清，留下细胞核沉淀(如果裂解不彻底，可重复以上步骤一次)，向离心收集到的细胞核沉淀中加200μl缓冲液GS，振荡至彻底混匀。

1.2.2加入20μl的蛋白酶K溶液，混匀，再加入200μl的缓冲液GB，立刻充分颠倒混匀。56℃水浴样本10分钟，水浴过程中请每隔3分钟上下轻柔颠倒混匀样本，溶液应变清亮。(如溶液未彻底变清亮，可延长裂解时间至溶液变清亮为止)。

1.2.3加入200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，这时可能会出现絮状沉淀。

1.2.4将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

1.2.5向吸附柱中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

1.2.6向吸附柱中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

1.2.7向吸附柱中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液。

1.2.8将吸附柱放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

1.2.9将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5分钟，12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收效率。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟。洗脱液的pH对于洗脱效率有很大影响。

若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

2.Taqman探针法检测侯检位点：

2.1实验试剂及仪器

2.1.1实验试剂

荧光定量试剂：ABI TaqMan 2×PCR Master mix(P/N：4326614，Lot：G15502)。

普通PCR试剂：宝生物工程(大连)有限公司的Ex Taq DNA聚合酶(P/N：DRR100B，Lot：CKA1801A)。

2.1.2实验仪器：ABI 9700型PCR仪和ABI 7900HT型荧光定量PCR仪。

2.1.3检测位点探针及引物表

2.2实验步骤

2.2.1将所有样本DNA的浓度调整到20ng/ul～50ng/ul。

2.2.2位点检测

a.PCR反应体系：

b.PCR循环条件：

2.2.3根据反应过程中释放的荧光的量和荧光的种类来判断对应候选位点的基因型。

3.结果分析：

根据最终终点读板结果分型图进行分析，结果如下：

反应1：用于检测MTHFR基因的rs1801133位点，该候检位点在人群中有三种基因型：CC，TT和CT，其中携带CC基因型为正常人群，携带TT和CT基因型的人群较携带CC基因型的人群有较高的风险罹患脑中风，患病风险几率大小TT型＞CT型＞CC型，分型图分析结果表明rs1801133位点为CT，非正常基因型；

反应2：用于检测ENOS基因的rs1799983位点，该候检位点在人群中也有三种基因型：GG，TT和GT，其中携带GG基因型为正常人群，携带TT和GT基因型的人群较携带GG基因型的人群有较高的风险罹患脑中风，患病风险几率大小TT型＞GT型＞GG型，分型图分析结果表明rs1799983位点为GG，正常基因型；

反应3：用于检测PDE4D基因的rs702553位点，该候检位点在人群中也有三种基因型：TT，AA和TA，其中携带TT，TA基因型为正常人群，携带AA基因型的人群较携带TT和TA基因型的人群有较高的风险罹患脑中风，患病风险几率大小AA型＞TA型和TT型，分型图分析结果表明rs702553位点为AA，非正常基因型；

反应4：用于检测PON1基因的rs622位点，该候检位点在人群中也有三种基因型：AA，GG和GA，其中携带AA基因型为正常人群，携带GG和GA基因型的人群较携带AA基因型的人群有较高的风险罹患脑中风，患病风险几率大小GG型＞GA型＞AA型，分型图分析结果表明rs622位点为GG，非正常基因型；

根据上述检测结果，可以判断上述受检的MTHFR基因、PDE4D基因和PON1基因异常，仅ENOS基因正常，受检者较正常人患脑中风的几率要高不少，其患脑中风的遗传倾向属于中度风险人群，需要进行专门的针对性的健康管理，但是是否已经患有脑中风，还需要进行进一步的检查，因为其与多种因素有关。如果其中没有基因异常，则基本无需进行专门的针对性的健康管理，但是如果其中更多个基因异常，那么就更需要进行进一步的脑中风检查以确定是否已经患有脑中风，并进行专门的针对性的健康管理。

综上所述，本发明的脑中风相关位点检测方法设计巧妙、操作简单、检测结果准确可靠，为是否进一步采取有针对性的健康管理以及后续的检测手段提供参考依据。

需要说明的是，在本发明中提及的所有文献在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，以上所述的是本发明的具体实施例及所运用的技术原理，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改而不背离本发明的精神与范围，这些等价形式同样落在本发明的范围内。

序列表

<110>上海基康生物技术有限公司

<120>一种脑中风相关位点检测方法

<160>16

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)…(22)

<223>根据人MTHFR基因序列设计的Taqman探针

<400>1

gtctgcggga gccgatttca tc 22

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)…(24)

<223>根据人MTHFR基因序列设计的Taqman探针

<400>2

tgtctgcggg agtcgatttc atca 24

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)…(21)

<223>根据人MTHFR基因序列设计的上游引物

<400>3

ggctgacctg aagcacttga a 21

<210>4

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)…(17)

<223>根据人MTHFR基因序列设计的下游引物

<400>4

tgcccatgtc ggtgcat 17

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)…(25)

<223>根据人ENOS基因序列设计的Taqman探针

<400>5

ccagatgatc ccccagaact cttcc 25

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)…(24)

<223>根据人ENOS基因序列设计的Taqman探针

<400>6

ccagatgagc ccccagaact cttc 24

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)…(19)

<223>根据人ENOS基因序列设计的上游引物

<400>7

aggaaacggt cgcttcgac 19

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)…(21)

<223>根据人ENOS基因序列设计的下游引物

<400>8

ccttcttgag aggctcaggg a 21

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)…(21)

<223>根据人PDE4D基因序列设计的Taqman探针

<400>9

ttcctacatg tttaacatgt a 21

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)…(21)

<223>根据人PDE4D基因序列设计的Taqman探针

<400>10

ttcctacatg attaacatgt a 21

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)…(24)

<223>根据人PDE4D基因序列设计的上游引物

<400>11

attatgccac attcttgctc aaag 24

<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)…(23)

<223>根据人PDE4D基因序列设计的下游引物

<400>12

gaagtagtgg gaccaggatc aaa 23

<210>13

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)…(19)

<223>根据人PON1基因序列设计的Taqman探针

<400>13

ctacttacaa tcctgggag 19

<210>14

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)…(16)

<223>根据人PON1基因序列设计的Taqman探针

<400>14

cctacttacg atcctg 16

<210>15

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)…(25)

<223>根据人PON1基因序列设计的上游引物

<400>15

cacttttatg gcacaaatga tcact 25

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)…(20)

<223>根据人PON1基因序列设计的下游引物

<400>16

tgccaccact cgaacttcac 20

Claims

1.用于脑中风相关位点检测的Taqman探针对，其特征在于，所述Taqman探针对根据脑中风相关基因MTHFR基因设计的，所述Taqman探针对用于检测MTHFR基因的rs1801133位点，Taqman探针对是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，Taqman探针对的5’端分别标记FAM标记和HEX标记，3’端均标记TAMRA标记。

2.用于脑中风相关位点检测的引物对，其特征在于，所述引物对根据脑中风相关基因MTHFR基因设计的，所述引物对用于检测MTHFR基因的rs1801133位点，引物对是SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。