CN113218937A - 一种黄曲霉毒素磁性多重增敏传感器及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种黄曲霉毒素磁性多重增敏传感器及其制备与应用。由组氨酸修饰四氧化三铁形成的纳米酶(A)；纳米酶偶连黄曲霉毒素B1(AFB1)的单克隆抗体形成的捕获探针(B),纳米酶偶连AFB1的抗原形成的检测探针(C)；捕获探针和检测探针通过抗原抗体之间的特异性结合形成二维网状结构(D)。先制备磁性纳米酶备用；捕获探针的修饰；检测探针的修饰；二维网状结构的形成。检测过程中，构建形成的二维网络结构磁分离富集后加入3,3',5,5'‑四甲基联苯胺(TMB)显色试剂，二维网络结构催化底物显色。本发明所建立磁性多重增敏检测方法具有富集程度高、灵敏度高、快速等优点，适合于食品中AFB1的大规模筛查检测。
Description
技术领域
本发明涉及纳米酶催化紫外信号检测技术，适用于粮油食品安全等领域，具体涉及一种黄曲霉毒素磁性多重增敏传感器及其制备与应用。
背景技术
黄曲霉毒素是一类化学结构类似的化合物，主要产毒真菌包括黄曲霉(Aspergillus flavus)与寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)。在已知的真菌毒素中，黄曲霉毒素的毒性最大，对人类健康危害最突出，是世界上毒性最强的物质之一，其中毒性最强、分布最广的一类黄曲霉毒素是黄曲霉毒素B1(AFB1)。由于具有极强的致癌、致畸和致突变的作用，AFB1在1988年被国际癌症研究机构(International Agency of Research onCancer，IARC)归为第一类致癌物质。
黄曲霉毒素B1会对农副产品造成广泛的污染，包括谷物、油籽、香料、坚果乃至于乳制品、肉制品及干果，产毒真菌可以在粮食的生长、收获、储存、加工乃至运输流程中进行侵染，产生真菌毒素，更可以经过动物体内代谢作用进一步扩大污染范围，从而对粮食、蔬果和动物性食品造成不可避免的广泛污染。此外，大部分真菌毒素还具有较高的化学稳定性和热稳定性，难以在一般的生产加工过程中去除。因此世界各国均为此制订了严格的限量标准。我国对AFB1的最低限量为5μg/kg，而欧盟对AFB1的最低限量为0.1μg/kg(婴幼儿食品中)。对黄曲霉毒素的仪器检测方法以液相为主，与荧光(FLD)、质谱(MS)等检测器进行联用，各种传感器也被用于黄曲霉毒素的检测。仪器检测方法其稳定性好、灵敏度高，是世界各国真菌毒素检测的标准仲裁方法。但仪器检测方法耗时长、操作复杂、设备昂贵、需要专业人才，不利于现场操作使用，不能满足快速、便捷、低成本的检测要求。免疫学检测方法包括酶联免疫ELISA、胶体金试纸条以及免疫亲和柱主要应用于大量样品中AFB1的筛查检测，具有快速、廉价、低成本和特异性好的特点，十分适合大量样品的初筛和现场检测，但是在检测灵敏度上与仪器检测方法具有一定的差距。
Fe3O4纳米材料不仅具有超顺磁性，还拥有快速的磁响应特性和较好的生物相容性，在临床诊断、靶向传送和安全检测等领域得到广泛地运用。在食品安全检测中，通常通过抗体偶联制备免疫磁珠材料，从而实现样品基质中目标物质的富集净化与分离。同时Fe3O4纳米颗粒还可以作为一种人工酶，具有类过氧化物酶的催化性质，不仅可以适应极端pH值和温度条件，同时具有成本低、使用寿命长等优点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种黄曲霉毒素磁性多重增敏传感器及其制备与应用。该传感器为同时具有磁性和过氧化氢催化作用的磁性纳米酶的制备，分别制备捕获探针与检测探针，构建具有空间结构的食品中黄曲霉毒素B1 多重增敏检测传感器的制备及其对黄曲霉毒素B1的高灵敏检测方法
为解决现有技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种黄曲霉毒素磁性多重增敏传感器，由组氨酸修饰Fe3O4形成的纳米酶 His-Fe3O4(A)；再将纳米酶His-Fe3O4偶连可以特异性识别AFB1的单克隆抗体形成的捕获探针His-Fe3O4@Ab(B),纳米酶偶连AFB1的抗原形成的检测探针 His-Fe3O4@Ag(C)；捕获探针His-Fe3O4@Ab(B)和检测探针His-Fe3O4@Ag(C)通过抗原抗体之间的特异性结合形成二维网状结构(D)。
上述一种黄曲霉毒素磁性多重增敏传感器的制备，包括以下步骤：
(1)His-Fe3O4纳米酶的制备
首先将FeCl3·6H2O溶解在乙二醇溶液中，搅拌至溶液透明，加入CH3COONa 和组氨酸，800～1200rpm转速下搅拌，30min后将混合物进行超声10min，后转移到聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中200～240℃下反应12～16h，反应完成后，高压釜冷却至室温，再用乙醇清洗数次并在60℃下干燥得尺寸在400～500 nm的纳米粒子His-Fe3O4，即His-Fe3O4纳米酶；
(2)捕获探针His-Fe3O4@Ab的制备
抗体与His-Fe3O4纳米酶表面的组氨酸通过活化酯法偶连，将所使用单克隆抗体溶于磷酸盐缓冲溶液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化反应，然后超滤去除未反应物质，加入超声分散的His-Fe3O4纳米酶，透析纯化溶解于0.01M磷酸盐缓冲溶液中，获得的捕获探针His-Fe3O4@Ab，并保存在4℃冰箱中备用；
(3)检测探针His-Fe3O4@Ag的制备
抗原与His-Fe3O4纳米酶表面的组氨酸通过活化酯法偶连，将所使用AFB1抗原溶于磷酸盐缓冲溶液中，加入EDC与NHS在4℃反应30min进行活化反应，超滤去除未反应物质，加入超声分散的His-Fe3O4纳米酶，透析纯化溶解于0.01 M磷酸盐缓冲溶液中，获得的检测探针His-Fe3O4@Ag，并保存在4℃冰箱中备用；
(4)二维网状结构的形成
将捕获探针His-Fe3O4@Ab加入含有目标物的溶液中反应10～20min后，进行磁分离，再加入检测探针His-Fe3O4@Ag反应10～20min，再次磁分离即可获得与目标物浓度相反程度的二维网状结构。
作为改进的是，步骤1中FeCl3·6H2O、CH3COONa和组氨酸的物质的量分别为1mmol、18～26mmol和4～8mmol，反应体系为40mL乙二醇溶液。
作为改进的是，步骤2中所使用单克隆抗体、NHS和EDC物质的量比例为1: 38～42:38～42，分别为28.3μmol、1.075～1.188mmol和1.075～1.188mmol，室温孵育，反应时间为30min，超滤后抗体活化液中所加入His-Fe3O4纳米酶与单克隆抗体物质的量比例为1：8～12，分别为2.83μmol与22.64～33.96μmol，偶联温度为4℃，反应时间为6～8h。
作为改进的是，步骤3中所使用AFB1抗原、NHS和EDC物质的量比例为1： 18～22：18～22，分别为28.3μmol、509.6～622.6μmol和509.6～622.6 μmol，室温孵育，反应时间为30min，超滤后抗体活化液中所加入His-Fe3O4纳米酶与单克隆抗体物质的量比例为1：8～12，分别为2.83μmol与22.64～ 33.96μmol，偶联温度为4℃，反应时间为6～8h。
作为改进的是，步骤4中所使用的捕获探针His-Fe3O4@Ab与检测探针His-Fe3O4@Ag的体积比为1：1～1.5mL，含有目标物的溶液体积为1.5mL，反应温度为25℃。
上述黄曲霉毒素磁性多重增敏传感器的检测方法，在不同浓度的AFB1标准液中加入0.2～0.4mL捕获探针His-Fe3O4@Ab，震荡孵育，磁分离所构建复合物，再加入0.2～0.6mL检测探针His-Fe3O4@Ag，震荡孵育，磁分离所构建空间结构，加入显色试剂0.4mL，反应3～8min后磁分离空间结构，测定上清液650nm处吸光值，建立吸光值与AFB1的标准曲线。
作为改进的是，加入捕获探针His-Fe3O4@Ab后，25℃下震荡孵育10～20min；加入检测探针His-Fe3O4@Ag后，25℃下震荡孵育10～20min。
作为改进的是，所述显色液体系为0.05M柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，其中包含5μL的0.1M TMB溶液与10μL的5.0M H2O2溶液。
有益效果：
与现有技术相比，本发明一种黄曲霉毒素磁性多重增敏传感器及其制备与应用，具有如下优势：
选择Fe3O4纳米酶材料分别修饰特异性抗体与抗原制备出捕获探针 His-Fe3O4@Ab与检测探针His-Fe3O4@Ag，通过目标检测物质AFB1与检测探针之间对捕获探针的结合作用，依据目标物质AFB1的浓度构建出不同组装程度的空间结构，催化TMB底物产生不同程度的颜色变化，实现紫外信号的检测与AFB1的多重增敏快速检测。Fe3O4纳米材料与抗原、抗体偶联后相互亲和构建出与目标物浓度相关联的空间结构，利用材料粒子之间的空间协同效应实现对类过氧化物酶催化性能的提升从而放大检测信号。在不同目标物含量下形成的二维网络结构组装程度之间的差异，构建具有不同催化效率的二维网络结构，AFB1含量的升高可降低空间结构的组装程度，而引起催化性能下降，导致紫外信号降低，实现对AFB1的多重增敏快速检测。
与其他检测方法相比，该方法所使用Fe3O4纳米酶结构与尺寸可以可控制备、成本低、毒性弱，磁性能优异、催化活性强、对极端条件适应能力高，制备方法成熟稳定；Fe3O4纳米酶修饰抗体后用于目标物质AFB1的富集捕获，运用成熟，稳定性强；AFB1与检测探针竞争性结合捕获探针，减弱空间结构组装程度，降低酶活性能，进而引起紫外信号强度的减弱，实现对AFB1的检测，理论基础成熟，可靠性好。
该方法操作简单便捷，检测迅速，运用适用于高灵敏快速检测分析，本发明采用的超微量UV-vis分光光度法，检测限低至0.036pg/mL,线性范围为0.0001 ng/mL-1ng/mL,所建立的方法能够应用于测定实际样品如玉米样本中的AFB1。
附图说明
图1为本发明磁性空间纳米酶传感器结构示意图，其中(A)为纳米粒子 His-Fe3O4，(B)为捕获探针His-Fe3O4@Ab，(C)为检测探针His-Fe3O4@Ab，(D) 为形成的二维网状结构；
图2为His-Fe3O4纳米酶的TEM电镜图；
图3(a)为捕获探针His-Fe3O4@Ab的TEM电镜图；
图3(b)为检测探针His-Fe3O4@Ab的TEM电镜图；
图4为不同尺度下磁性纳米酶二维网络结构的TEM电镜图；
图5为二维网络结构的XRD图；
图6为二维网络结构的红外光谱图；
图7为多重增敏检测传感器的检测原理示意图；
图8为不同AFB1浓度下的UV-vis吸收光谱图以及标准曲线图，(a)为光谱图，(b)为标准曲线图。
具体实施方式
本发明结合附图与具体实施例作进一步说明，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改和替换，均属于本发明的范围。
一种黄曲霉毒素磁性多重增敏传感器，由组氨酸修饰形成的Fe3O4纳米粒子 His-Fe3O4(A)尺寸为400～500nm；再将纳米粒子His-Fe3O4纳米酶偶连可以特异性识别AFB1的单克隆抗体形成的捕获探针His-Fe3O4@Ab(B),纳米酶偶连 AFB1的抗原形成的检测探针His-Fe3O4@Ag(C)；捕获探针His-Fe3O4@Ab(B)和检测探针His-Fe3O4@Ag(C)通过抗原抗体之间的特异性结合形成二维网状结构 (D)。
上述一种黄曲霉毒素磁性多重增敏传感器的制备，包括以下步骤：
(1)His-Fe3O4纳米酶的制备
首先将FeCl3·6H2O溶解在乙二醇溶液中，搅拌至溶液透明，加入CH3COONa 和组氨酸，在800～1200rpm转速下搅拌，30min后将混合物进行超声10min，后转移到聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中200～240℃下反应12～16h，反应完成后，高压釜冷却至室温，再用乙醇清洗数次并在60℃下干燥得尺寸在400～500 nm的纳米粒子His-Fe3O4，即His-Fe3O4纳米酶；
(2)捕获探针His-Fe3O4@Ab的制备
抗体与His-Fe3O4纳米酶表面的组氨酸通过活化酯法偶连，将所使用单克隆抗体溶于磷酸盐缓冲溶液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化反应，然后超滤去除未反应物质，加入超声分散的His-Fe3O4纳米酶，透析纯化溶解于0.01M磷酸盐缓冲溶液中，获得的捕获探针His-Fe3O4@Ab，并保存在4℃冰箱中备用；
(3)检测探针His-Fe3O4@Ag的制备
抗原与His-Fe3O4纳米酶表面的组氨酸通过活化酯法偶连，将所使用AFB1抗原溶于磷酸盐缓冲溶液中，加入EDC与NHS在4℃反应30min进行活化反应，超滤去除未反应物质，加入超声分散的His-Fe3O4纳米酶，透析纯化溶解于0.01 M磷酸盐缓冲溶液中，获得的检测探针His-Fe3O4@Ag，并保存在4℃冰箱中备用；
(4)二维网状结构的形成
将捕获探针His-Fe3O4@Ab加入含有目标物的溶液中反应10～20min后，进行磁分离，再加入检测探针His-Fe3O4@Ag反应10～20min，再次磁分离即可获得与目标物浓度相反程度的二维网状结构。
作为改进的是，步骤1中FeCl3·6H2O、CH3COONa和组氨酸的物质的量分别为1mmol、18～26mmol和4～8mmol，反应体系为40mL乙二醇溶液。
作为改进的是，步骤2中所使用单克隆抗体、NHS和EDC物质的量比例为1: 38～42:38～42，分别为28.3μmol、1.075～1.188mmol和1.075～1.188mmol，室温孵育，反应时间为30min，超滤后抗体活化液中所加入His-Fe3O4纳米酶与单克隆抗体物质的量比例为1：8～12，分别为2.83μmol与22.64～33.96μmol，偶联温度为4℃，反应时间为6～8h。
作为改进的是，步骤3中所使用AFB1抗原、NHS和EDC物质的量比例为1： 18～22：18～22，分别为28.3μmol、509.6～622.6μmol和509.6～622.6 μmol，室温孵育，反应时间为30min，超滤后抗体活化液中所加入His-Fe3O4纳米酶与单克隆抗体物质的量比例为1：8～12，分别为2.83μmol与22.64～ 33.96μmol，偶联温度为4℃，反应时间为6～8h。
作为改进的是，步骤4中所使用的捕获探针His-Fe3O4@Ab与检测探针 His-Fe3O4@Ag的体积比为1：1～1.5mL，含有目标物的溶液体积为1.5mL，反应温度为25℃。
上述黄曲霉毒素磁性多重增敏传感器的检测方法，在不同浓度的AFB1标准液中加入0.2～0.4mL捕获探针His-Fe3O4@Ab，震荡孵育，磁分离所构建复合物，再加入0.2～0.6mL检测探针His-Fe3O4@Ag，震荡孵育，磁分离所构建空间结构，加入显色试剂0.4mL，反应后磁分离空间结构，测定650nm处吸光值，建立吸光值与AFB1的标准曲线。
作为改进的是，加入捕获探针His-Fe3O4@Ab后，25℃下震荡孵育10～20min；加入检测探针His-Fe3O4@Ag后，25℃下震荡孵育10～20min。
作为改进的是，所述显色液体系为0.05M柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液,其中包含5μL的0.1M TMB溶液与10μL的5.0M H2O2溶液。
作为改进的是，加入的显色液后反应3～8min，磁分离沉淀空间结构后测定上清650nm处吸光值。
本发明是一种黄曲霉毒素磁性多重增敏传感器及其制备与应用。在制备 Fe3O4纳米酶时修饰组氨酸合成尺寸在400～500nm的His-Fe3O4纳米酶，利用组氨酸在纳米酶表面偶联AFB1特异性抗体制备捕获探针His-Fe3O4@Ab，偶联AFB1抗原制备检测探针His-Fe3O4@Ag；没有目标物质存在的条件下，捕获探针和检测探针之间通过免疫亲和作用杂交进行空间结构组装，形成的空间结构可以高效催化TMB底物线显色，从而产生高强度紫外信号，放大检测信号，当目标物质 AFB1存在时，捕获探针首先捕获目标物质AFB1并进行磁分离富集，进而引起捕获探针与检测探针之间组装程度下降，相应催化效率降低，紫外信号减弱，通过紫外信号强度减弱水平可以测定目标物质AFB1的浓度，以此构建多重增敏检测传感器。
需要说明的是，本发明实施例中所用的材料均为市售产品。
实施例1
一种黄曲霉毒素磁性多重增敏传感器的制备，包括以下步骤：
1)His-Fe3O4纳米酶的制备：
0.27g FeCl3·6H2O溶解于10mL乙二醇溶液中，溶液澄清后加入1.8g CH3COONa和0.5g组氨酸混匀，持续搅拌30min后超声10min，聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中200℃下16小时高温反应，冷却至室温，乙醇洗涤3～5次， 60℃下干燥12h，可合成尺寸为400～500nm的His-Fe3O4纳米酶；
2)捕获探针His-Fe3O4@Ab的制备：
将所使用单克隆抗体溶于磷酸盐缓冲溶液中，加入EDC与NHS进行活化反应，三者比例为1:40:40，分别为28.3μmol、1.132mmol和1.132mmol，室温孵育反应30min，超滤去除未反应物质，将His-Fe3O4纳米酶超声分散加入活化后的单克隆抗体溶液内，两者比例为1：10，分别为2.83μmol与28.3μmol，偶联温度为4℃，反应时间为6h，使用0.01M磷酸盐缓冲液透析纯化；
3)检测探针His-Fe3O4@Ag的制备：
将所使用AFB1抗原溶于磷酸盐缓冲溶液中，加入EDC与NHS进行活化反应，三者比例为1:40:40，分别为28.3μmol、1.132mmol和1.132mmol，室温孵育，反应时间为30min，超滤去除未反应物质，将His-Fe3O4纳米酶超声分散加入活化后的单克隆抗体溶液内，两者比例为1：10，分别为2.83μmol与28.3μmol，偶联温度为4℃，反应时间为6h；使用0.01M磷酸盐缓冲液透析纯化；
4)二维网状结构的形成：
将捕获探针His-Fe3O4@Ab加入含有目标物的溶液中反应15min，进行磁分离，再加入检测探针His-Fe3O4@Ag反应15min，再次磁分离即可获得与目标物浓度相反程度的二维网状结构，使用的捕获探针His-Fe3O4@Ab与检测探针 His-Fe3O4@Ag的体积比为1：1，含有目标物的溶液体积为1.5mL，反应温度为 25℃；
实施例2
基于实施例1制备的传感器在食品中黄曲霉毒素B1(AFB1)上的应用，具体的检测方法如下：
不同浓度的AFB1标准液中共七组，体积均为1.5mL，浓度分别为0，0.0001，0.0005，0.001，0.005，0.01，0.05，0.1，0.5，1ng/mL，加入捕获探针0.4mL， 25℃恒温震荡孵育15min，磁分离所构建复合物，去除上清液，加入检测探针0.4mL，25℃恒温震荡孵育15min，磁分离所构建空间结构，去除上清液，加入显色试剂0.4mL，25℃恒温震荡孵育5min，磁分离沉淀空间结构，测定上清液紫外吸光值，建立吸光值与AFB1的标准曲线；
将制备的多重增敏检测传感器对含有黄曲霉毒素B1的实际样品进行检测。检测过程如下：将样品黄曲霉毒素AFB1提取液1.5mL加入0.4mL捕获探针溶液中，25℃恒温震荡孵育15min，磁分离沉淀所构建复合物，去除上清液，加入检测探针溶液0.4mL，25℃恒温震荡孵育15min，磁分离所构建空间结构，去除上清液，加入显色试剂0.4mL，25℃恒温震荡孵育5min，磁分离沉淀空间结构，测定上清液紫外吸光值，通过标准曲线计算实际样品中AFB1含量。
为了评估基质效应，向玉米样品中分别加入0.05ng/mL、0.1ng/mL和0.5 ng/mLAFB1标准溶液，利用超微量UV-vis分光光度计进行检测；结果分别如表 1所示，均获得了较好的相对回收率。
表1黄曲霉毒素磁性多重增敏传感器测定玉米样品中的AFB1
a相对回收率＝(总浓度-空白浓度)/掺入浓度
本发明方法操作简单便捷，检测迅速，运用适用于高灵敏快速检测分析，采用的超微量UV-vis分光光度法，检测限低至0.036pg/mL,线性范围为 0.0001ng/mL-1ng/mL,所建立的方法能够应用于测定实际样品如玉米样本中的 AFB1。与其他检测方法相比，该方法所使用Fe3O4纳米酶结构与尺寸可以可控制备、成本低、毒性弱，磁性能优异、催化活性强、对极端条件适应能力高，制备方法成熟稳定；Fe3O4纳米酶修饰抗体后用于目标物质AFB1的富集捕获，运用成熟，稳定性强；AFB1与检测探针竞争性结合捕获探针，减弱空间结构组装程度，降低酶活性能，进而引起紫外信号强度的减弱，实现对AFB1的检测，理论基础成熟，可靠性好。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种黄曲霉毒素磁性多重增敏传感器，其特征在于：由组氨酸修饰Fe3O4形成的纳米酶His-Fe3O4；再将纳米酶His-Fe3O4偶连可以特异性识别AFB1的单克隆抗体形成的捕获探针His-Fe3O4@Ab,纳米酶偶连AFB1的抗原形成的检测探针His-Fe3O4@Ag；捕获探针His-Fe3O4@Ab和检测探针His-Fe3O4@Ag通过抗原抗体之间的特异性结合形成二维网状结构，即黄曲霉毒素磁性多重增敏传感器。
2.基于权利要求1所述的一种黄曲霉毒素磁性多重增敏传感器的制备，其特征在于，包括以下步骤：
(1)His-Fe3O4纳米酶的制备
首先将FeCl3·6H2O溶解在乙二醇溶液中，搅拌至溶液透明，加入CH3COONa和组氨酸，800～1200rpm转速下搅拌，30min后将混合物进行超声10min，后转移到聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中200～240℃下反应12～16h，反应完成后，高压釜冷却至室温，再用乙醇清洗数次并在60℃下干燥得尺寸在400～500nm的纳米粒子His-Fe3O4，即His-Fe3O4纳米酶；
(2)捕获探针His-Fe3O4@Ab的制备
抗体与His-Fe3O4纳米酶表面的组氨酸通过活化酯法偶连，将所使用单克隆抗体溶于磷酸盐缓冲溶液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化反应，然后超滤去除未反应物质，加入超声分散的His-Fe3O4纳米酶，透析纯化溶解于0.01M磷酸盐缓冲溶液中，获得的捕获探针His-Fe3O4@Ab，并保存在4℃冰箱中备用；
(3)检测探针His-Fe3O4@Ag的制备
抗原与His-Fe3O4纳米酶表面的组氨酸通过活化酯法偶连，将所使用AFB1抗原溶于磷酸盐缓冲溶液中，加入EDC与NHS在4℃反应30min进行活化反应，超滤去除未反应物质，加入超声分散的His-Fe3O4纳米酶，透析纯化溶解于0.01M磷酸盐缓冲溶液中，获得的检测探针His-Fe3O4@Ag，并保存在4℃冰箱中备用；
(4)二维网状结构的形成
将捕获探针His-Fe3O4@Ab加入含有目标物的溶液中反应10～20min后，进行磁分离，再加入检测探针His-Fe3O4@Ag反应10～20min，再次磁分离即可获得与目标物浓度相反程度的二维网状结构。
3.根据权利要求2所述的一种黄曲霉毒素磁性多重增敏传感器的制备，其特征在于，步骤1中FeCl3·6H2O、CH3COONa和组氨酸的物质的量分别为1mmol、18～26mmol和4～8mmol，反应体系为40mL乙二醇溶液。
4.根据权利要求2所述的一种黄曲霉毒素磁性多重增敏传感器的制备，其特征在于，步骤2中所使用单克隆抗体、NHS和EDC物质的量比例为1:38～42:38～42，分别为28.3μmol、1.075～1.188mmol和1.075～1.188mmol，室温孵育，反应时间为30min，超滤后抗体活化液中所加入His-Fe3O4纳米酶与单克隆抗体物质的量比例为1：8～12，分别为2.83μmol与22.64～33.96μmol，偶联温度为4℃，反应时间为6～8h。
5.根据权利要求2所述的一种黄曲霉毒素磁性多重增敏传感器的制备，其特征在于，步骤3中所使用AFB1抗原、NHS和EDC物质的量比例为1：18～22：18～22，分别为28.3μmol、509.6～622.6μmol和509.6～622.6μmol，室温孵育，反应时间为30min，超滤后抗体活化液中所加入His-Fe3O4纳米酶与单克隆抗体物质的量比例为1：8～12，分别为2.83μmol与22.64～33.96μmol，偶联温度为4℃，反应时间为6～8h。
6.根据权利要求2所述的一种黄曲霉毒素磁性多重增敏传感器的制备，其特征在于，步骤4中所使用的捕获探针His-Fe3O4@Ab与检测探针His-Fe3O4@Ag的体积比为1：1～1.5mL，含有目标物的溶液体积为1.5mL，反应温度为25℃。
7.基于权利要求1或2所述的一种黄曲霉毒素磁性多重增敏传感器的检测方法，其特征在于，在不同浓度的AFB1标准液中加入0.2～0.4mL捕获探针His-Fe3O4@Ab，震荡孵育，磁分离所构建复合物，再加入0.2～0.6mL检测探针His-Fe3O4@Ag，震荡孵育，磁分离所构建空间结构，加入显色试剂0.4mL，反应3～8min后磁分离空间结构，测定上清液650nm处吸光值，建立吸光值与AFB1的标准曲线。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，加入捕获探针His-Fe3O4@Ab后，25℃下震荡孵育10～20min；加入检测探针His-Fe3O4@Ag后，25℃下震荡孵育10～20min。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述显色液体系为0.05M柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，其中，包含5μL的0.1M TMB溶液与10μL的5.0M H2O2溶液。
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113218937B (zh) | 2022-12-02 |
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