CN114062287A - 一种尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法 - Google Patents
一种尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114062287A CN114062287A CN202111324058.8A CN202111324058A CN114062287A CN 114062287 A CN114062287 A CN 114062287A CN 202111324058 A CN202111324058 A CN 202111324058A CN 114062287 A CN114062287 A CN 114062287A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- uric acid
- hemin
- ferroferric oxide
- weight
- mul
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 76
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 71
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 title claims abstract description 71
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N ferrosoferric oxide Chemical compound O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 108010092464 Urate Oxidase Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 239000002131 composite material Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 229940005267 urate oxidase Drugs 0.000 title claims abstract description 10
- 229940025294 hemin Drugs 0.000 claims abstract description 46
- RQFCJASXJCIDSX-UHFFFAOYSA-N 14C-Guanosin-5'-monophosphat Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O RQFCJASXJCIDSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 40
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims abstract description 40
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims abstract description 16
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 15
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 229910021389 graphene Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 claims description 41
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 27
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 16
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 14
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 12
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 11
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Substances OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 11
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 10
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 6
- 229910021592 Copper(II) chloride Inorganic materials 0.000 claims description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 5
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 5
- BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K hemin Chemical compound CC1=C(CCC(O)=O)C(C=C2C(CCC(O)=O)=C(C)\C(N2[Fe](Cl)N23)=C\4)=N\C1=C/C2=C(C)C(C=C)=C3\C=C/1C(C)=C(C=C)C/4=N\1 BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K 0.000 claims description 5
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 claims description 3
- BHZOKUMUHVTPBX-UHFFFAOYSA-M sodium acetic acid acetate Chemical compound [Na+].CC(O)=O.CC([O-])=O BHZOKUMUHVTPBX-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 claims description 3
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 3
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 abstract description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract description 3
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 229960004106 citric acid Drugs 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229960004249 sodium acetate Drugs 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- PVPAMMQRQRLZBS-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-7,9-dihydro-3h-purine-2,6,8-trione Chemical compound O=C1N(O)C(=O)NC2=C1NC(=O)N2 PVPAMMQRQRLZBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 1
- 241000152447 Hades Species 0.000 description 1
- 201000001431 Hyperuricemia Diseases 0.000 description 1
- 208000000913 Kidney Calculi Diseases 0.000 description 1
- 206010029148 Nephrolithiasis Diseases 0.000 description 1
- 241000519999 Stachys Species 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxotungsten Chemical compound O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.OP(O)(O)=O IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 235000014102 seafood Nutrition 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
- G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
- G01N21/3103—Atomic absorption analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/38—Diluting, dispersing or mixing samples
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法，该方法是采用氧化石墨烯修饰四氧化三铁与血红素、鸟苷‑5'‑单磷酸形成复合纳米酶，尿酸氧化酶通过物理吸附固定于四氧化三铁复合纳米酶上，尿酸酶催化氧化尿酸产生H2O2，Fe3O4‑GO‑Hemin/GMP催化氧化3,3',5,5'‑四甲基联苯胺(TMB)，产生蓝色化合物（o‑TMB），其吸光度与尿酸浓度呈线性关系，构建了尿酸的比色探针，可用于样品中尿酸的检测；本发明方法用于血液、尿液及唾液中尿酸检测，回收率在96.3‑102.9%间，与尿酸酶‑辣根过氧化酶两步法结果一致，且方法具有操作简单、灵敏度高、快速等特点。
Description
技术领域
本发明属于化学分析检测技术领域，具体为一种尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法。
背景技术
尿酸（UA, C5H4N4O3）是人体嘌呤的最终代谢产物，已被认为是一种重要的健康生物标志物，其在健康人血清和尿液中的为0.2-0.5mM。当尿酸浓度增加时，由于其溶解度低，将以晶体形式存在，尿酸与痛风、关节炎、肾结石、高尿酸血症等多种疾病密切相关。随着啤酒、肉类、海鲜和其他嘌呤含量高的食物的过量摄入，这些疾病的风险显著增加。因此，快速、准确地测定血清或尿液中尿酸的浓度对这些疾病的早期诊断和治疗具有重要意义。目前，检测尿酸的方法主要有磷钨酸还原法、高效液相色谱法、尿酸酶还原法等。尿酸酶还原法是基于尿酸氧化酶(UOx)从尿酸中产生H2O2，被辣根过氧化物酶(HRP)等过氧化物酶消耗。HRP是一种天然酶，由于其简单、灵敏和选择性，已广泛应用于生物催化和生物传感领域。然而，天然酶的固有缺陷，如在极端条件下稳定性差、制备和纯化过程复杂、回收率低等，严重阻碍了其实际应用。
2007年阎锡蕴等首次发现Fe3O4 纳米颗粒具有过氧化物酶催化活性，此后纳米材料的酶活性研究发展迅速。具有天然酶催化活性的纳米材料被统称为纳米酶。纳米酶具有制备成本低、易于批量生产、稳定性高和活性可调节等优点，在替代天然酶用于生物传感、疾病诊断及治疗、食品安全防控等领域具有巨大潜力。但纳米酶也存在酶活低、选择性差等难题。天然酶与纳米酶的结合可以提高反应的整体效率，克服纳米酶的中等活性和低选择性的问题，另一方面，集成催化剂可以提高生物催化级联的多样性/复杂性和多酶体系的稳定性，但如何实现酶和纳米酶之间的协同效应来构建集成催化剂仍然是一个挑战。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法，该方法利用了天然尿酸氧化酶的特异性及纳米酶的强拟过氧化酶活性，一步完成尿酸的检测。
本发明采用氧化石墨烯修饰四氧化三铁与血红素、鸟苷-5'-单磷酸形成复合纳米酶（Fe3O4-GO-Hemin/GMP），尿酸氧化酶通过物理吸附固定于四氧化三铁复合纳米酶（UOx@Fe3O4-GO-Hemin/GMP），利用尿酸氧化酶的特异性，催化氧化尿酸产生H2O2，利用Fe3O4-GO-Hemin/GMP的强拟过氧化酶活性，催化氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，产生蓝色化合物（o-TMB），一步完成尿酸检测。本发明方法既保证检测的特异性，又达到操作简单、快速的目的，同时复合酶材料稳定、制备方法易控制。本发明方法用于血液、尿液及唾液中尿酸检测，回收率在96.3-102.9%之间，与尿酸酶-辣根过氧化酶两步法结果一致。
本发明尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法如下：
（1）尿酸工作曲线制作
溶液A：一定浓度范围的尿酸100µL；溶液B：1mg/mL UOx@Fe3O4-GO-Hemin/GMP纳米材料100µL；溶液C：10mmol/L的TMB100µL；将A、B及C三种溶液混合，加入50mmol/L、pH 4.0的PBS缓冲液1.5mL，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，其中尿酸在具塞比色管中的浓度范围在10~800µmol/L，以尿酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程；
（2）实际样品测定
血液中尿酸测定：取新鲜血液5mL，放入离心机离心处理，取上清液，加入重量体积浓度10%的氢氧化钠溶液0.1mL和重量体积浓度5%的硫酸锌溶液1mL，混匀，离心分离，取上清液100µL，加入1mg/mL UOx@Fe3O4-GO-Hemin/GMP纳米材料100µL，10mmol/L的TMB 100µL，50mmol/L、pH 4.0的PBS缓冲液1.5mL，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，代入回归方程，测得尿酸含量；
所述离心是在4000-6000r/min 下处理10-15min；
尿液中尿酸测定：取新鲜尿样，用活性炭脱色，过滤，用pH5醋酸-醋酸钠缓冲液稀释5倍，取稀释后的尿液 100µL，加入1mg/mL UOx@Fe3O4-GO-Hemin/GMP纳米材料100µL，10mmol/L的TMB 100µL，50mmol/L、pH 4.0的PBS缓冲液1.5mL，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，代入回归方程，测得尿酸含量；
所述活性炭添加量为尿液重量的0.5-1%；
唾液中尿酸测定：取唾液2mL，加入质量浓度10%的三氯乙酸2mL，混合均匀，8000r/min下离心10min，上清液用 0.22μm滤膜过滤，取滤液100µL，加入1mg/mL UOx@Fe3O4-GO-Hemin/GMP纳米材料100µL，10mmol/L的TMB 100µL，50mmol/L、pH 4.0的PBS缓冲液1.5mL，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，代入回归方程，测得尿酸含量。
所述UOx@Fe3O4-GO-Hemin/GMP纳米材料制备如下：
（1）四氧化三铁-石墨烯-血红素纳米材料制备
将1重量份氧化石墨烯、3-5重量份谷氨酸、6-8重量份FeCl3·6H2O、300-500重量份乙二醇混合，然后加入0.1mol/L的NaOH调节pH至10，超声处理2-3h，加入0.05-0.1重量份氯化血红素，超声处理10-15min后，置于马弗炉中，200℃下反应10-12h，反应结束冷却至室温，用纯水洗涤数次，冷冻干燥，得四氧化三铁-石墨烯-血红素纳米材料Fe3O4-GO-Hemin；
所述冷冻干燥是在-20～-40℃下干燥12-24h；
（2）四氧化三铁-石墨烯-血红素/尿酸酶纳米材料制备
将1-2重量份Fe3O4-GO-Hemin纳米材料、8-10重量份的CuCl2、20-25重量份的鸟苷-5'-单磷酸（GMP）、3-5重量份的尿酸酶（UOx）加入到200体积份的10mmol/L、pH 6.8的HEPES缓冲液中，室温下搅拌2-3h，外加磁铁或离心分离，用HEPES缓冲液洗涤3次，冷冻干燥，得四氧化三铁-石墨烯-血红素/尿酸酶纳米材料UOx@Fe3O4-GO-Hemin/GMP；
所述冷冻干燥是在-20～-40℃下干燥12-24h。
本发明的优点在于：
1、本发明将氧化石墨烯修饰四氧化三铁与血红素、鸟苷-5'-单磷酸制备形成复合纳米酶（Fe3O4-GO-Hemin/GMP），具有强拟过氧化酶活性，利用天然尿酸氧化酶与纳米酶的物理吸附作用制备的UOx@Fe3O4-GO-Hemin/GMP纳米材料能够快速、特性氧化尿酸及TMB，从而建立了尿酸的一步检测法，方法具有操作简单、快速及特异性强等特点；
2、将建立的方法用于血液、尿液及唾液中尿酸检测，回收率在96.3-102.9%间，与尿酸酶-辣根过氧化酶两步法结果一致；
3、本发明制备的复合纳米材料稳定、制备方法易控制、回收率高、易于批量生产。
附图说明
图1为复合纳米材料氧化尿酸及TMB的紫外可见吸收光谱图；
图2为标准品尿酸的标准曲线及线性方程；
图3为不同物质对本发明检测体系的干扰实验结果示意图。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步详细地描述说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：血液中尿酸的测定
1、四氧化三铁-石墨烯-血红素（Fe3O4-GO-Hemin）纳米材料制备
将0.1g氧化石墨烯、0.35g谷氨酸、0.8g FeCl3·6H2O与50g乙二醇混合，用0.1mol/L的NaOH调节pH至10，超声处理3h，加入0.01g氯化血红素，超声处理15min后，置于马弗炉中，200℃下反应12h，反应结束冷却至室温后用纯水洗涤数次，-40℃下冷冻干燥12h，得Fe3O4-GO-Hemin纳米材料；
2、四氧化三铁-石墨烯-血红素/尿酸酶（UOx@Fe3O4-GO-Hemin/GMP）纳米材料制备
将0.2g Fe3O4-GO-Hemin、0.8g的CuCl2、2g的鸟苷-5'-单磷酸（GMP）、0.3g的尿酸酶（UOx）加入到20mL的HEPES缓冲液（10mM，pH 6.8）中，室温下搅拌3h，外加磁铁分离，用HEPES缓冲液洗涤3次，-40℃下冷冻干燥12h，得UOx@Fe3O4-GO-Hemin/GMP纳米材料；
3、尿酸工作曲线制作：溶液A：分别取10、50、100、200、500、800µmol/L的尿酸100µL；溶液B：1mg/mL UOx@Fe3O4-GO-Hemin/GMP纳米材料100µL；溶液C：10mmol/L的TMB100µL；将A、B及C三种溶液混合，加入1.5mL的PBS (50mmol/L、pH4.0)，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，以尿酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程（图2）、相关系数、相对标准偏差、线性范围等见表1，紫外吸收光谱见图1；
表1线性方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围
4、血液中尿酸的测定
（1）血液中尿酸测定：取新鲜血液5mL，放入离心机离心（4000r/min下处理15min）处理，取上清液，加入重量体积浓度10%的氢氧化钠溶液0.1mL和重量体积浓度5%的硫酸锌溶液1mL，混匀，6000r/min下离心分离，取上清液100µL，加入1mg/mL UOx@Fe3O4-GO-Hemin/GMP纳米材料100µL，10mmol/L的TMB 100µL，50mmol/L、pH 4.0的PBS缓冲液1.5mL，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，代入回归方程，测得尿酸含量为432 µmol/L；
（2）回收率与精密度实验：在血样中分别添加2个不同浓度的尿酸标准溶液；每个浓度平行测定3次，计算加标回收率，并计算出相对标准偏差RSD，结果见表2；测得尿酸的加标回收率在96.3%-102.9%，RSD在2.12％～4.34％，本方法有好的的准确性和精密度；
表2 样品尿酸加标回收率及RSD（n = 3）
（3）方法特异性考察：将尿酸替换为其他物质（浓度为600µmol/L的尿素、甘氨酸、缓冲溶液、柠檬酸、葡萄糖、抗坏血酸、多巴胺和乙酸钠）用于验证本发明检测体系的特异性，尿酸浓度为300µmol/L，图3为本发明检测体系检测尿素、甘氨酸、缓冲溶液、柠檬酸、葡萄糖、抗坏血酸、多巴胺、乙酸钠、尿酸的结果，从图中可以看出，本发明检测体系对尿酸具有较好的选择特异性。
实施例2：尿液中尿酸的测定
1、四氧化三铁-石墨烯-血红素（Fe3O4-GO-Hemin）纳米材料制备
将0.1g氧化石墨烯、0.5g谷氨酸、0.6g FeCl3·6H2O与30g乙二醇混合，用 0.1mol/L的NaOH调节pH至10，超声处理2h，加入0.005g氯化血红素，超声处理10min，置于马弗炉中，200℃下反应10h，反应结束冷却至室温后用纯水洗涤数次，-20℃冷冻干燥24h，得Fe3O4-GO-Hemin纳米材料；
2、四氧化三铁-石墨烯-血红素/尿酸酶（UOx@Fe3O4-GO-Hemin/GMP）纳米材料制备
将0.1g的Fe3O4-GO-Hemin、1g的CuCl2、2.5g的鸟苷-5'-单磷酸（GMP）、0.5g的尿酸酶（UOx）加入到20mL的HEPES缓冲液（10mmol/L、pH 6.8）中，室温下搅拌2h，6000r/min离心10min，固体用HEPES缓冲液洗涤3次，-20℃冷冻干燥24h，得UOx@Fe3O4-GO-Hemin/GMP纳米材料；
3、尿酸工作曲线制作：同实施例1；
4、尿液样品中尿酸含量的测定
取新鲜尿样，用活性炭脱色（活性炭添加量为尿液重量的1%），过滤，用pH5醋酸-醋酸钠缓冲液稀释5倍，取稀释后的尿液 100µL，加入1mg/mL UOx@Fe3O4-GO-Hemin/GMP纳米材料100µL，10mmol/L的TMB 100µL，50mmol/L、pH 4.0的PBS缓冲液1.5mL，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，代入回归方程，测得尿酸含量为1200µmol/L。
实施例3：唾液中尿酸含量的测定
1、四氧化三铁-石墨烯-血红素（Fe3O4-GO-Hemin）纳米材料制备
将0.1g氧化石墨烯、0.4g谷氨酸、0.7g FeCl3·6H2O与40g乙二醇混合，用 0.1mol/L的NaOH调节pH至10，超声处理2.5h，加入0.008g氯化血红素，超声处理12min，置于马弗炉中，200℃下反应11h，反应结束冷却至室温后用纯水洗涤数次，-30℃冷冻干燥15h，得Fe3O4-GO-Hemin纳米材料；
2、四氧化三铁-石墨烯-血红素/尿酸酶（UOx@Fe3O4-GO-Hemin/GMP）纳米材料制备
将0.15g的Fe3O4-GO-Hemin、0.9g的CuCl2、2.3g的鸟苷-5'-单磷酸（GMP）、0.4g的尿酸酶（UOx）加入到20mL的HEPES缓冲液（10mmol/L、pH 6.8）中，室温下搅拌2.5h，外加磁铁分离，固体用HEPES缓冲液洗涤3次，-30℃冷冻干燥15h，得UOx@Fe3O4-GO-Hemin/GMP纳米材料；
3、尿酸工作曲线制作：同实施例1；
4、唾液样品中尿酸含量的测定
取唾液2mL，加入质量浓度10%的三氯乙酸2mL，混合均匀，以8000 r/ min离心10min，上清液用0. 22μm滤膜过滤，取滤液100µL，加入1mg/mL UOx@Fe3O4-GO-Hemin/GMP纳米材料100µL，10mmol/L的TMB 100µL，50mmol/L、pH 4.0的PBS缓冲液1.5mL，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，代入回归方程，测得尿酸含量为412µmol/L。
Claims (5)
1.一种尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）尿酸工作曲线制作
溶液A：一定浓度范围的尿酸100µL；溶液B：1mg/mL UOx@Fe3O4-GO-Hemin/GMP纳米材料100µL；溶液C：10mmol/L的TMB100µL；将A、B及C三种溶液混合，加入50mmol/L、pH 4.0的PBS缓冲液1.5mL，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，其中尿酸在具塞比色管中的浓度范围在10~800µmol/L，以尿酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程；
实际样品测定
血液中尿酸测定：取新鲜血液5mL，放入离心机离心处理，取上清液，加入重量体积浓度10%的氢氧化钠溶液0.1mL和重量体积浓度5%的硫酸锌溶液1mL，混匀，离心分离，取上清液100µL，加入1mg/mL UOx@Fe3O4-GO-Hemin/GMP纳米材料100µL，10mmol/L的TMB 100µL，50mmol/L、pH 4.0的PBS缓冲液1.5mL，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，代入回归方程，测得尿酸含量；
尿液中尿酸测定：取新鲜尿样，用活性炭脱色，过滤，用pH5醋酸-醋酸钠缓冲液稀释5倍，取稀释后的尿液 100µL，加入1mg/mL UOx@Fe3O4-GO-Hemin/GMP纳米材料100µL，10mmol/L的TMB 100µL，50mmol/L、pH 4.0的PBS缓冲液1.5mL，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，代入回归方程，测得尿酸含量；
唾液中尿酸测定：取唾液2mL，加入质量浓度10%的三氯乙酸2mL，混合均匀，8000r/min下离心10min，上清液用 0.22μm滤膜过滤，取滤液100µL，加入1mg/mL UOx@Fe3O4-GO-Hemin/GMP纳米材料100µL，10mmol/L的TMB 100µL，50mmol/L、pH 4.0的PBS缓冲液1.5mL，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，代入回归方程，测得尿酸含量。
2.根据权利要求1所述的尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法，其特征在于UOx@Fe3O4-GO-Hemin/GMP纳米材料制备如下：
（1）四氧化三铁-石墨烯-血红素纳米材料制备
将1重量份氧化石墨烯、3-5重量份谷氨酸、6-8重量份FeCl3·6H2O、300-500重量份乙二醇混合，然后加入0.1mol/L的NaOH调节pH至10，超声处理2-3h，加入0.05-0.1重量份氯化血红素，超声处理10-15min后，置于马弗炉中，200℃下反应10-12h，反应结束冷却至室温，用纯水洗涤数次，冷冻干燥，得四氧化三铁-石墨烯-血红素纳米材料Fe3O4-GO-Hemin；
（2）四氧化三铁-石墨烯-血红素/尿酸酶纳米材料制备
将1-2重量份Fe3O4-GO-Hemin纳米材料、8-10重量份的CuCl2、20-25重量份的鸟苷-5'-单磷酸、3-5重量份的尿酸酶加入到200体积份的10mmol/L、pH 6.8的HEPES缓冲液中，室温下搅拌2-3h，外加磁铁或离心分离，用HEPES缓冲液洗涤3次，冷冻干燥，得四氧化三铁-石墨烯-血红素/尿酸酶纳米材料，即UOx@Fe3O4-GO-Hemin/GMP。
3.根据权利要求1所述的尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法，其特征在于：步骤（2）中离心是在4000-6000r/min 下处理10-15min。
4.根据权利要求1所述的尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法，其特征在于：活性炭添加量为尿液重量的0.5-1%。
5.根据权利要求2所述的尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法，其特征在于：步骤（1）、（2）中冷冻干燥是在-20～-40℃下干燥12-24h。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111324058.8A CN114062287B (zh) | 2021-11-10 | 2021-11-10 | 一种尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111324058.8A CN114062287B (zh) | 2021-11-10 | 2021-11-10 | 一种尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114062287A true CN114062287A (zh) | 2022-02-18 |
| CN114062287B CN114062287B (zh) | 2024-01-12 |
Family
ID=80274580
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111324058.8A Active CN114062287B (zh) | 2021-11-10 | 2021-11-10 | 一种尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114062287B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114935572A (zh) * | 2022-07-25 | 2022-08-23 | 香港科技大学深圳研究院 | 一种基于纳米材料的可视化尿酸检测方法 |
| CN115444834A (zh) * | 2022-09-24 | 2022-12-09 | 重庆医科大学 | 一种融合细胞膜包裹尿酸酶和超顺磁性氧化铁纳米酶脂质纳米粒及其制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107515265A (zh) * | 2017-08-31 | 2017-12-26 | 未名生物医药有限公司 | 一种尿酸氧化酶活性的测定方法 |
| CN110308232A (zh) * | 2019-07-22 | 2019-10-08 | 武汉海谱生物医药科技有限公司 | 一种hplc法分析大鼠血浆中尿酸酶的方法 |
| CN113447453A (zh) * | 2021-07-15 | 2021-09-28 | 昆明理工大学 | 一种尿酸酶模拟酶的制备方法及应用 |
-
2021
- 2021-11-10 CN CN202111324058.8A patent/CN114062287B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107515265A (zh) * | 2017-08-31 | 2017-12-26 | 未名生物医药有限公司 | 一种尿酸氧化酶活性的测定方法 |
| CN110308232A (zh) * | 2019-07-22 | 2019-10-08 | 武汉海谱生物医药科技有限公司 | 一种hplc法分析大鼠血浆中尿酸酶的方法 |
| CN113447453A (zh) * | 2021-07-15 | 2021-09-28 | 昆明理工大学 | 一种尿酸酶模拟酶的制备方法及应用 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114935572A (zh) * | 2022-07-25 | 2022-08-23 | 香港科技大学深圳研究院 | 一种基于纳米材料的可视化尿酸检测方法 |
| CN115444834A (zh) * | 2022-09-24 | 2022-12-09 | 重庆医科大学 | 一种融合细胞膜包裹尿酸酶和超顺磁性氧化铁纳米酶脂质纳米粒及其制备方法 |
| CN115444834B (zh) * | 2022-09-24 | 2023-07-14 | 重庆医科大学 | 一种融合细胞膜包裹尿酸酶和超顺磁性氧化铁纳米酶脂质纳米粒及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114062287B (zh) | 2024-01-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114062287B (zh) | 一种尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法 | |
| CN107478621B (zh) | 定量检测血清中可代谢产生h2o2的生物分子的方法 | |
| CN102998413B (zh) | 金核/铂壳纳米棒模拟酶溶液的用途及检测过氧化氢、葡萄糖和胆固醇的方法 | |
| CN107462531B (zh) | 一种尿酸的无酶比色检测方法 | |
| CN111879741B (zh) | 一种检测α-葡萄糖苷酶活性的方法 | |
| Liang et al. | Urate oxidase loaded in PCN-222 (Fe) with peroxidase-like activity for colorimetric detection of uric acid | |
| Chen et al. | Pt–DNA complexes as peroxidase mimetics and their applications in colorimetric detection of H 2 O 2 and glucose | |
| CN112763484A (zh) | 一种基于比色生物传感器检测谷胱甘肽和/或过氧化氢的方法 | |
| Wang et al. | Catalase active metal-organic framework synthesized by ligand regulation for the dual detection of glucose and cysteine | |
| CN110296982B (zh) | 基于G4-Cu2+仿酶体系的硫化氢比色传感器 | |
| Slama et al. | Semisynthetic enzymes: Synthesis of a new flavopapain with high catalytic efficiency | |
| CN112126672A (zh) | α-L-岩藻糖苷酶活性测定方法、α-L-岩藻糖苷酶诊断试剂及应用 | |
| Yu et al. | Simulated enzyme inhibition-based strategy for ultrasensitive colorimetric biothiol detection based on nanoperoxidases | |
| CN114152757B (zh) | 一种β银环蛇毒检测用生物材料、一种非诊断目的检测β银环蛇毒的方法 | |
| CN116359200A (zh) | 一种双金属纳米硅藻壳的拉曼传感器的构建方法及肌氨酸检测方法 | |
| CN115656072A (zh) | 一种基于模拟漆酶纳米酶快速检测食品中亚硝酸盐的方法 | |
| CN109187389A (zh) | 一种海洋低温尿酸氧化酶测定尿酸的检测试剂盒 | |
| CN110699422B (zh) | 一种基于金纳米簇荧光增强的乳酸检测方法 | |
| CN102495011B (zh) | 一种细菌亚硝酸盐还原酶活性测定方法 | |
| Ronzhin et al. | Modified nanodiamonds as a new carrier for developing reusable enzymatic test-systems for determination of physiologically important substances | |
| Zhang et al. | Two-dimensional metal-organic framework catalyzed chemiluminescent reaction for alpha-glucosidase inhibitor screening | |
| CN114990197A (zh) | 一种用于检测卡那霉素的比色传感体系 | |
| CN110804044B (zh) | 一种荧光探针及其制备方法和在可逆检测活体内亚硫酸氢盐/过氧化氢中的应用 | |
| CN112179875B (zh) | 一种一型透明质酸酶荧光纳米传感器的制备及应用 | |
| CN114002213A (zh) | Cu/Au/Pt-MOFs及其可视化试纸在检测H2O2、Cys或葡萄糖中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |