CN114181280B - 一种放射性核素标记的天冬酰胺酶靶向诊疗一体化药物 - Google Patents

一种放射性核素标记的天冬酰胺酶靶向诊疗一体化药物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种放射性核素标记的天冬酰胺酶靶向诊疗一体化药物，属于化学技术领域。本发明提供了Legumain靶向的药物[131I]Mor‑AAN‑CBT和[131I]HE‑AAN‑CBT，所述药物具有稳定性高，在PBS缓冲液中孵育24h未见降解，可在Legumain的诱导下完成还原缩合自组装，在Legumain高表达的阳性肿瘤细胞中摄取率高，在Legumain低表达的阴性肿瘤细胞中摄取率低，前体生物相容性好，且所述药物对Legumain高表达的阳性肿瘤细胞细胞毒性高，对Legumain低表达的阴性肿瘤细胞细胞毒性低，对肿瘤具有诊断和治疗作用，以及，安全性高的优势，极具应用前景。

Description

一种放射性核素标记的天冬酰胺酶靶向诊疗一体化药物
技术领域
本发明涉及一种放射性核素标记的天冬酰胺酶靶向诊疗一体化药物，属于化学技术领域。
背景技术
迄今为止，癌症仍是人类死亡的最常见原因，其有效治疗是目前临床面临的最大挑战之一。核素靶向治疗(TRT)是最近出现的一种肿瘤治疗方法，它利用带有放射性核素的放射性药物经靶向传递汇集在病变组织中，通过放射性核素衰变发出的射线抑制或杀伤病变细胞。目前，TRT在临床实践中已有成功案例，一些放射性药物如[131I]tositumomab和[177Lu]DOTA-TATE已被FDA批准用于TRT的临床应用。与外束放射治疗不同，TRT是将放射性标记的载体分子精确定向地传递到病变区域，将致死剂量的放射性核素辐射暴露于肿瘤部位，从而降低对肿瘤组织的损伤。在TRT过程中，可以借助核医学成像技术，利用核素产生的辐射来监测放射性药物在体内的生物分布。在所有临床放射性核素中，131I因其安全、成本低而被广泛应用于肿瘤核素靶向治疗。它也是一种具有诊断和治疗功能的放射性同位素，可用于SPECT和切伦科夫成像。
延长药物的胞内滞留时间是改善药物治疗效果的关键。但是，许多抗癌药物受细胞膜蛋白介导的单向外排作用影响，使其容易被泵出细胞，很快被肝肾代谢，从而导致药物对肿瘤的治疗效果极其有限。纳米药物的出现解决了这个问题，其EPR效应使药物在肿瘤中具有一个缓慢的清除速度，但纳米药物在肝、脾等器官中非特异性摄取严重，引发较为严重的肝毒性。此外，纳米药物传输效率低，统计发现只有不到～1％的注射剂量到达实体肿瘤。因此，开发一种兼具小分子药物(代谢迅速、输送效率高)和纳米药物(保留时间长)优点的放射性核素标记的天冬酰胺酶靶向治疗药物，对实现癌症的精准治疗具有重要意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种Legumain靶向的药物，所述药物具有如下所示结构：
在本发明的一种实施方式中，所述药物([131I]Mor-AAN-CBT)具有如下所示结构：
在本发明的一种实施方式中，所述药物([131I]HE-AAN-CBT)具有如下所示结构：
本发明还提供了一种制备上述药物([131I]Mor-AAN-CBT)的方法，所述方法为：将前体Mor-AAN-CBT进行[131I]的放射性标记，得到药物；
所述前体Mor-AAN-CBT的具有如下所示结构：
在本发明的一种实施方式中，所述前体Mor-AAN-CBT的制备方法为：在化合物Compound J-1中加入DCM、TFA和TIPS后进行反应，得到前体Mor-AAN-CBT；
所述化合物Compound J-1具有如下所示结构：
在本发明的一种实施方式中，所述化合物Compound J-1的制备方法为：在化合物Compound I-1中加入HBTU、对羟基苯乙酸、THF和DIPEA后进行反应，得到化合物CompoundJ-1；
所述化合物Compound I-1具有如下所示结构：
在本发明的一种实施方式中，所述化合物Compound I-1的制备方法为：在化合物CompoundH-1中加入含哌啶的DMF溶液后进行反应，得到化合物Compound I-1；
所述化合物CompoundH-1具有如下所示结构：
在本发明的一种实施方式中，所述化合物Compound H-1的制备方法为：在化合物Compound G-1中加入HBTU、底物Mor-AAN-OH、THF和DIPEA后进行反应，得到化合物CompoundH-1；
所述化合物Compound G-1具有如下所示结构：
所述底物Mor-AAN-OH具有如下所示结构：
在本发明的一种实施方式中，所述化合物Compound G-1的制备方法为：在化合物Compound F-1中加入DCM、2-(ethyldisulfanyl)pyridine和TIPS后进行反应，得到化合物Compound G-1；
所述化合物CompoundF-1具有如下所示结构：
在本发明的一种实施方式中，所述化合物Compound F-1的制备方法为：在化合物Compound E中加入TFA和TIPS后进行反应，得到化合物Compound F-1；
所述化合物Compound E具有如下所示结构：
在本发明的一种实施方式中，所述化合物Compound E的制备方法为：在化合物CompoundD中加入HBTU、N-Boc-S-Trt-D-半胱氨酸、THF和DIPEA后进行反应，得到化合物Compound E；
所述化合物CompoundD具有如下所示结构：
在本发明的一种实施方式中，所述化合物Compound D的制备方法为：在化合物Compound C中加入DCM和TFA后进行反应，得到化合物CompoundD；
所述化合物Compound C具有如下所示结构：
在本发明的一种实施方式中，所述化合物Compound C的制备方法为：在化合物CompoundB中加入HBTU、Boc-甘氨酸、THF和DIPEA后进行反应，得到化合物Compound C；
所述化合物CompoundB具有如下所示结构：
本发明还提供了一种制备上述药物([131I]HE-AAN-CBT)的方法，所述方法为：将前体HE-AAN-CBT进行[131I]的放射性标记，得到药物；
所述前体HE-AAN-CBT的具有如下所示结构：
在本发明的一种实施方式中，所述前体HE-AAN-CBT的制备方法为：在化合物Compound J-2中加入DCM、TFA和TIPS后进行反应，得到前体HE-AAN-CBT；
所述化合物Compound J-2具有如下所示结构：
在本发明的一种实施方式中，所述化合物Compound J-2的制备方法为：在化合物Compound I-2中加入HBTU、底物HE-AAN-OH、THF和DIPEA后进行反应，得到化合物CompoundJ-2；
所述化合物Compound I-2具有如下所示结构：
在本发明的一种实施方式中，所述化合物Compound I-2的制备方法为：在化合物CompoundH-2中加入甲醇、Set和TIPS后进行反应，得到化合物Compound I-2；
所述化合物CompoundH-2具有如下所示结构：
在本发明的一种实施方式中，所述化合物Compound H-2的制备方法为：在化合物Compound G-2中加入DCM、TFA和TIPS后进行反应，得到化合物Compound H-2；
所述化合物Compound G-2具有如下所示结构：
所述底物HE-AAN-OH具有如下所示结构：
在本发明的一种实施方式中，所述化合物Compound G-2的制备方法为：在化合物Compound F-2中加入HBTU、对羟基苯乙酸、THF和DIPEA后进行反应，得到化合物CompoundG-2；
所述化合物CompoundF-2具有如下所示结构：
在本发明的一种实施方式中，所述化合物Compound F-2的制备方法为：在化合物Compound E中加入含哌啶的DMF溶液后进行反应，得到化合物CompoundF-2；
所述化合物Compound E具有如下所示结构：
在本发明的一种实施方式中，所述化合物Compound E的制备方法为：在化合物CompoundD中加入HBTU、N-Boc-S-Trt-D-半胱氨酸、THF和DIPEA后进行反应，得到化合物Compound E；
所述化合物CompoundD具有如下所示结构：
在本发明的一种实施方式中，所述化合物Compound D的制备方法为：在化合物Compound C中加入DCM和TFA后进行反应，得到化合物CompoundD；
所述化合物Compound C具有如下所示结构：
在本发明的一种实施方式中，所述化合物Compound C的制备方法为：在化合物CompoundB中加入HBTU、Boc-甘氨酸、THF和DIPEA后进行反应，得到化合物Compound C；
所述化合物CompoundB具有如下所示结构：
本发明还提供了上述药物作为肿瘤诊断或治疗药物的应用。
本发明还提供了一种Legumain靶向的肿瘤显像剂，所述肿瘤显像剂含有上述药物。
本发明还提供了一种Legumain靶向的抗肿瘤药，所述抗肿瘤药含有上述药物。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了Legumain靶向的药物[131I]Mor-AAN-CBT和[131I]HE-AAN-CBT，所述药物具有以下优势：
第一，所述药物稳定性高，在PBS缓冲液中孵育24h未见降解；
第二，所述药物可在Legumain的诱导下完成还原缩合自组装；
第三，所述药物在Legumain高表达的阳性肿瘤细胞中摄取率高，在Legumain低表达的阴性肿瘤细胞中摄取率低；
第四，所述药物的前体生物相容性好，且所述药物对Legumain高表达的阳性肿瘤细胞细胞毒性高，对Legumain低表达的阴性肿瘤细胞细胞毒性低；
第五，所述药物对肿瘤具有诊断作用，体内动物实验表明，注射所述药物的溶液后，荷瘤小鼠的肿瘤中发现了明亮的切伦科夫辐射信号，且肿瘤摄取明显高于心脏、脾脏、肺、骨和肌肉；
第六，所述药物对肿瘤具有治疗作用，体内动物实验表明，注射所述药物的溶液后，荷瘤小鼠的肿瘤生长受到了显著的抑制；
第七，所述药物的安全性高，体内动物实验表明，注射所述药物的溶液后，荷瘤小鼠的体重不会发生明显变化，且未在荷瘤小鼠的主要脏器中发现毒性，
综上，所述药物兼具小分子药物(代谢迅速、输送效率高)和纳米药物(保留时间长)的优点，在开发针对肿瘤的诊疗一体型药物中具有极高的应用前景。
附图说明
图1：底物Mor-AAN-OH的合成路线。
图2：前体Mor-AAN-CBT的合成路线。
图3：药物[131I]Mor-AAN-CBT的合成路线。
图4：底物Mor-AAN-OH的HPLC谱图。
图5：底物Mor-AAN-OH的ESI-MS分析结果。
图6：化合物Compound E的HPLC谱图。
图7：化合物Compound E的ESI-MS分析结果。
图8：前体Mor-AAN-CBT的HPLC谱图。
图9：前体Mor-AAN-CBT的ESI-MS分析结果。
图10：前体Mor-AAN-CBT的核磁共振氢谱图。
图11：前体Mor-AAN-CBT的核磁共振碳谱图。
图12：纯化后(上)和纯化前(下)药物[131I]Mor-AAN-CBT的放射性HPLC谱图。
图13：药物[131I]Mor-AAN-CBT与PBS缓冲液共孵育不同时间后的HPLC谱图。
图14：前体Mor-AAN-CBT与legumain溶液或含有TCEP的legumain溶液共孵育不同时间后的HPLC谱图。
图15：纳米粒子的DLS表征结果。
图16：纳米粒子的TEM表征结果。
图17：不同浓度前体Mor-AAN-CBT与legumain溶液共孵育1h后的HPLC谱图。
图18：Legumain切割前体Mor-AAN-CBT的Michaelis-Mentonnih图。
图19：药物[131I]Mor-AAN-CBT与HCT116细胞或SKOV3细胞共孵育不同时间后的摄取情况。
图20：药物[131I]Mor-AAN-CBT或前体Mor-AAN-CBT对不同细胞的影响。图中，(a)为HCT116细胞与不同浓度前体Mor-AAN-CBT共孵育不同时间后的细胞活性；(b)为SKOV3细胞与不同浓度前体Mor-AAN-CBT共孵育不同时间后的细胞活性；(c)为HCT116细胞与不同浓度药物[131I]Mor-AAN-CBT共孵育不同时间后的细胞活性；(d)为不同细胞与药物[131I]Mor-AAN-CBT共孵育72h后的细胞活性。
图21：荷瘤小鼠在通过尾静脉注射药物[131I]Mor-AAN-CBT后的荧光成像结果。图中，(a)为荷瘤小鼠在通过尾静脉注射药物[131I]Mor-AAN-CBT不同时间后的切伦科夫图像；(b)为荷瘤小鼠在通过尾静脉注射药物[131I]Mor-AAN-CBT 3h后各器官或组织的体外切伦科夫成像；(c)为荷瘤小鼠在通过尾静脉注射药物[131I]Mor-AAN-CBT 3h后各器官或组织的切伦科夫信号定量。
图22：药物[131I]Mor-AAN-CBT对荷瘤小鼠肿瘤的影响。图中，(a)为不同组荷瘤小鼠的治疗方案；(b)为荷瘤小鼠在不同方案治疗期间的肿瘤生长速率曲线；(c)为荷瘤小鼠在不同方案治疗期间的体重监测情况；(d)为荷瘤小鼠经不同方案治疗后的肿瘤重量。
图23：荷瘤小鼠经不同方案治疗后的肿瘤病理学切片。
图24：底物HE-AAN-OH的合成路线。
图25：前体HE-AAN-CBT的合成路线。
图26：底物HE-AAN-OH的HPLC谱图。
图27：底物HE-AAN-OH的ESI-MS分析结果。
图28：纯化后(上)和纯化前(下)药物[131I]HE-AAN-CBT的放射性HPLC谱图。
图29：药物[131I]HE-AAN-CBT与PBS缓冲液共孵育不同时间后的HPLC谱图。
图30：前体HE-AAN-CBT与legumain溶液或含有TCEP的legumain溶液共孵育不同时间后的HPLC谱图。
图31：Legumain切割前体HE-AAN-CBT的Michaelis-Mentonnih图。
图32：药物[131I]HE-AAN-CBT与HCT116细胞或SKOV3细胞共孵育不同时间后的摄取情况。
图33：药物[131I]HE-AAN-CBT或前体HE-AAN-CBT对不同细胞的影响。图中，(a)为HCT116细胞与不同浓度前体HE-AAN-CBT共孵育不同时间后的细胞活性；(b)为SKOV3细胞与不同浓度前体HE-AAN-CBT共孵育不同时间后的细胞活性；(c)为HCT116细胞与不同浓度药物[131I]HE-AAN-CBT共孵育不同时间后的细胞活性；(d)为不同细胞与药物[131I]HE-AAN-CBT共孵育72h后的细胞活性。
图34：荷瘤小鼠在通过尾静脉注射药物[131I]HE-AAN-CBT不同时间后的切伦科夫图像。
图35：药物[131I]HE-AAN-CBT对荷瘤小鼠肿瘤的影响。图中，(a)为荷瘤小鼠在不同方案治疗期间的肿瘤生长速率曲线；(b)为荷瘤小鼠在不同方案治疗期间的体重监测情况；(c)为荷瘤小鼠经不同方案治疗后的肿瘤重量；(d)为荷瘤小鼠经不同方案治疗后的肿瘤。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1-1：一种Legumain靶向的药物
本实施例提供了一种Legumain靶向的药物[131I]Mor-AAN-CBT，所述Legumain靶向的药物[131I]Mor-AAN-CBT具有如下所示结构：
实施例1-2：一种制备Legumain靶向的药物的方法
本实施例提供了制备实施例1所述Legumain靶向的药物[131I]Mor-AAN-CBT的方法，方法如下：
1、底物Mor-AAN-OH的合成
步骤一：用超干二氯甲烷(DCM)冲洗砂芯漏斗两次，抽干，在抽干的砂芯漏斗中加入2-氯三苯甲基氯树脂(362mg，0.4mmol)后，继续加入10mL超干二氯甲烷以浸泡溶胀2-氯三苯甲基氯树脂，浸泡溶胀10min后，抽干，得到经预处理的砂芯漏斗；
步骤二：向步骤一获得的砂芯漏斗中加入Fmoc-N-三苯甲基-L-天冬酰胺(298mg，0.5mmol)，用10mL超干N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，得到溶解液；在溶解液中加入227μLN，N-二异丙基乙胺(DIPEA)调节溶解液的pH至8后，将溶解液在室温(25℃)下振荡3h，振荡完成后，抽干溶剂；加入10mL DMF/MeOH/DIPEA的混合溶液(DMF/MeOH/DIPEA＝17：2：1，v/v/v)清洗滤饼，振荡10min后抽滤，重复操作两次，以除去未反应的氨基酸；再用10mL DMF(HPLC型)清洗滤饼三次，以洗去多余的DMF/MeOH/DIPEA；洗涤结束后，抽干溶剂，取样进行Kaiser测试，试剂颜色显示为淡黄色，说明没有裸露的氨基，证明缩合反应完成；
步骤三：向步骤二获得的砂芯漏斗中加入10mL含20％(v/v)哌啶的DMF溶液，振荡10min后抽滤，重复操作三次，以脱掉氨基酸上的FMOC保护基团；再用10mL DMF(HPLC型)清洗滤饼五次，以洗去多余的哌啶；洗涤结束后，抽干溶剂，取样进行Kaiser测试，试剂颜色显示为深紫色，说明此时FOMC基团已脱除，裸露出氨基，可连接下一个氨基酸；
步骤四：向步骤三获得的砂芯漏斗中加入N-芴甲氧羰基-L-丙氨酸(156mg，0.5mmol)和苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，228mg，0.6mmol)，用10mL超干DMF溶解，得到溶解液；在溶解液中加入227μL DIPEA调节溶解液的pH至8后，将溶解液在室温(25℃)下振荡3h，振荡完成后，抽干溶剂；加入10mLDMF/MeOH/DIPEA的混合溶液(DMF/MeOH/DIPEA＝17：2：1，v/v/v)清洗滤饼，振荡10min后抽滤，重复操作两次，以除去未反应的氨基酸；再用10mL DMF(HPLC型)清洗滤饼三次，以洗去多余的DMF/MeOH/DIPEA；洗涤结束后，抽干溶剂，取样进行Kaiser测试，试剂颜色显示为淡黄色，说明没有裸露的氨基，证明缩合反应完成；
步骤五：向步骤四获得的砂芯漏斗中加入10mL含20％(v/v)哌啶的DMF溶液，振荡10min后抽滤，重复操作三次，以脱掉氨基酸上的FMOC保护基团；再用10mL DMF(HPLC型)清洗滤饼五次，以洗去多余的哌啶；洗涤结束后，抽干溶剂，取样进行Kaiser测试，试剂颜色显示为深紫色，说明此时FOMC基团已脱除，裸露出氨基，可连接下一个氨基酸；
步骤六：重复步骤四和步骤五的操作一次后，在砂芯漏斗中加入吗啉-4-基乙酸(91mg，0.62mmol)和HBTU(228mg，0.6mmol)，用10mL超干DMF超声溶解，得到溶解液；在溶解液中加入227μL DIPEA调节溶解液的pH至8后，将溶解液在室温(25℃)下振荡3h，振荡完成后，抽干溶剂；加入10mL DMF/MeOH/DIPEA的混合溶液(DMF/MeOH/DIPEA＝17：2：1，v/v/v)清洗滤饼，振荡10min后抽滤，重复操作两次，以除去未反应的氨基酸；再用10mL DMF(HPLC型)清洗滤饼三次，以洗去多余的DMF/MeOH/DIPEA；洗涤结束后，抽干溶剂，取样进行Kaiser测试，试剂颜色显示为淡黄色，说明没有裸露的氨基，证明缩合反应完成；
步骤七：向步骤六获得的砂芯漏斗中加入10mL含1％(v/v)三氟乙酸(TFA)的DCM溶液，得到混合液；将混合液在室温(25℃)下振荡10min，振荡完成后，滤出带有底物Mor-AAN-OH的滤液，重复该操作，直至2-氯三苯甲基氯树脂出现红褐色且不褪色；将收集到的滤液用旋转蒸发仪除去溶剂，用冷乙醚(4℃)沉淀后，转移至50mL离心管，离心吸除上清液；取沉淀真空冷冻干燥，得到底物Mor-AAN-OH(200mg，产率62％)(底物Mor-AAN-OH的合成路线见图1)。
2、前体Mor-AAN-CBT的合成
步骤一：参照文献“Tumor Microenvironment Responsive"Head-to-Foot"Self-Assembly Nanoplatform for Positron Emission Tomography Imaging in LivingSubjects”合成化合物CompoundB(418mg，0.80mmol，产率为93.5％)；
步骤二：向反应瓶中加入化合物CompoundB(418mg，0.80mmol)、HBTU(348mg，0.92mmol)和Boc-甘氨酸(154mg，0.88mmol)后，用5mL超干四氢呋喃(THF)溶解，得到溶解液；在氮气的保护下，在溶解液中加入DIPEA(395μL，2.4mmol)调节溶解液的pH至8后，将溶解液在室温(25℃)下搅拌1h；反应结束后，将反应液用旋转蒸发仪除去溶剂，得到粗产物；将粗产物用硅胶层析柱进行纯化后，用Hex:EA＝50:1、5:1、2:1与1:1(v/v)的洗脱液洗脱，得到纯化产物；将纯化产物用旋转蒸发仪除去溶剂，得到棕黄色油状液体；将棕黄色油状液体真空冷冻干燥，得到化合物Compound C(460mg，0.68mmol，产率80％)；
步骤三：向反应瓶中加入化合物Compound C(460mg，0.68mmol)后，用3mL DCM溶解，得到溶解液；在溶解液中加入3mLTFA后，将溶解液在室温(25℃)下反应0.5h；反应结束后，将反应液用旋转蒸发仪除去溶剂和TFA，得到粗产物；在粗产物中加入30mL乙醚超声2min后转移至离心管中，放入冰箱(4℃)冷却5min后离心取沉淀；将沉淀真空冷冻干燥，得到化合物CompoundD(433mg，0.75mmol，产率>95％)；
步骤四：向反应瓶中加入化合物Compound D(433mg，0.75mmol)、HBTU(321mg，0.85mmol)和N-Boc-S-Trt-D-半胱氨酸(378mg，0.81mmol)后，用5mL超干THF溶解，得到溶解液；在氮气的保护下，在溶解液中加入DIPEA(306μL，1.9mmol)调节溶解液的pH至8后，将溶解液在室温(25℃)下搅拌1h；反应结束后，将反应液用旋转蒸发仪除去溶剂，得到粗产物；将粗产物用硅胶层析柱进行纯化后，用Hex:EA＝15:1、5:1、2:1、1:1、1:2与1:3(v/v)的洗脱液洗脱，得到纯化产物；将纯化产物用旋转蒸发仪除去溶剂，得到淡黄色油状液体；将淡黄色油状液体真空冷冻干燥，得到化合物Compound E(产量639mg，0.23mmol，产率为83.8％)；
步骤五：向反应瓶中加入化合物Compound E(产量639mg，0.23mmol)后，用3mL DCM溶解，得到溶解液；在溶解液中加入3mLTFA和150μL的三异丙基硅烷(TIPS)后，将溶解液在室温(25℃)下反应0.5h；反应结束后，将反应液先用旋转蒸发仪除去溶剂和大部分TFA，再用10mLDCM清洗两次进一步除去TFA，得到粗产物；在粗产物中加入30mL乙醚超声2min后转移至离心管中，放入冰箱(4℃)冷却5min后离心取沉淀；将沉淀用氮气吹干，得到化合物CompoundF-1；
步骤六：向反应瓶中加入化合物CompoundF-1后，用3mL DCM溶解，得到溶解液；在溶解液中加入2-(ethyldisulfanyl)pyridine(Set，48μL，0.28mmol)和150μLTIPS后，在氮气的保护下，将溶解液在室温(25℃)下反应1h；反应结束后，将反应液用旋转蒸发仪除去溶剂，得到粗产物；在粗产物中加入30mL乙醚超声2min后转移至离心管中，放入冰箱(4℃)冷却5min后离心取沉淀；将沉淀真空冷冻干燥，得到化合物Compound G-1(150mg，0.21mmol，产率>95％)；
步骤七：向反应瓶中加入化合物Compound G-1(150mg，0.21mmol)、HBTU(88mg，0.24mmol)和底物Mor-AAN-OH(143mg，0.23mmol)后，用5mL超干THF溶解，得到溶解液；在氮气的保护下，在溶解液中加入DIPEA(100μL，0.63mmol)调节溶解液的pH至8后，将溶解液在室温(25℃)下搅拌3h；反应结束后，将反应液用旋转蒸发仪除去溶剂，得到粗产物；在粗产物中加入30mL乙醚超声2min后转移至离心管中，放入冰箱(4℃)冷却5min后离心取沉淀；将沉淀真空冷冻干燥，得到化合物CompoundH-1(240mg，0.18mmol，产率为83.5％)；
步骤八：向反应瓶中加入化合物CompoundH-1(240mg，0.18mmol)和3mL预冷的含5％(v/v)哌啶(pip)的DMF溶液(0℃)，得到混合液；在氮气的保护下，将混合液在冰浴(0℃)下搅拌10min；搅拌结束后，将盐酸(1mol/L)使用注射器加入反应液中淬灭反应，直至反应液的pH为2，得到粗产物；使用半制备型HPLC对粗产物进行纯化，得到纯化产物(半制备型HPLC条件见表1)；将纯化产物真空冷冻干燥，得到化合物Compound I-1(57mg，0.05mmol，产率为28.2％)；
步骤九：向反应瓶中加入化合物Compound I-1(57mg，0.05mmol)、HBTU(23mg，0.06mmol)和对羟基苯乙酸(17mg，0.11mmol)后，用2mL超干THF溶解，得到溶解液；在氮气的保护下，在溶解液中加入DIPEA(25μL，0.16mmol)调节溶解液的pH至8后，将溶解液在室温(25℃)下搅拌3h；反应结束后，将反应液用旋转蒸发仪除去溶剂，得到粗产物；在粗产物中加入30mL乙醚超声2min后转移至离心管中，放入冰箱(4℃)冷却5min后离心取沉淀；将沉淀真空冷冻干燥，得到化合物Compound J-1(50mg，0.036mmol，产率为78.6％)；
步骤十：向反应瓶中加入化合物Compound J-1(50mg，0.036mmol)后，用1mL无水DCM溶解，得到溶解液；在溶解液中加入1mL TFA和50μL的TIPS后，将溶解液在室温(25℃)下反应0.5h；反应结束后，将反应液先用旋转蒸发仪除去溶剂和大部分TFA，再用10mLDCM清洗两次进一步除去TFA，得到粗产物；在粗产物中加入20mL乙醚超声2min后转移至离心管中，放入冰箱(4℃)冷却5min后离心取沉淀；将沉淀真空冷冻干燥，得到干燥产物(33mg)；将干燥产物用20mL乙腈溶解后，使用半制备型HPLC进行纯化，得到纯化产物(半制备型HPLC条件见表2)；将纯化产物真空冷冻干燥，得到前体Mor-AAN-CBT(28mg，69％)(前体Mor-AAN-CBT的合成路线见图2)。
表1化合物Compound I-1的半制备高效液相色谱纯化条件
表2前体Mor-AAN-CBT的半制备高效液相色谱纯化条件
3、[131I]Mor-AAN-CBT的放射合成
步骤一：向内壁涂有Iodogen(100μg)的离心管中加入[131I]NaI(370MBq)后，继续加入[131I]Mor-AAN-CBT(200μg)混匀，得到反应体系(反应体系总体积80μL)；将反应体系在20℃下振荡反应2.5min后，将反应液转移到另一离心管终止反应；用5mL水稀释反应液后，使用Sep-Pak C18柱对反应液进行纯化，得到[131I]Mor-AAN-CBT([131I]Mor-AAN-CBT的合成路线见图3)。
采用Waters1525对底物Mor-AAN-OH进行HPLC检测，检测结果见图4。
采用电喷雾电离源对底物Mor-AAN-OH进行ESI-MS分析，分析结果见图5。
采用Waters1525对化合物Compound E进行HPLC检测，检测结果见图6。
采用电喷雾电离源对化合物Compound E进行ESI-MS分析，分析结果见图7。
采用Waters1525对前体Mor-AAN-CBT进行HPLC检测，检测结果见图4。
采用电喷雾电离源对前体Mor-AAN-CBT进行ESI-MS分析，分析结果见图5。
通过核磁共振对前体Mor-AAN-CBT进行氢谱、碳谱表征，表征结果见图10～11。氢谱：1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)10.51(s,1H),8.79(d,J＝7.1Hz,1H),8.74(d,J＝2.0Hz,1H),8.31(t,J＝3.0Hz,1H),8.29(s,1H),8.20(d,J＝8.9Hz,2H),8.13(d,J＝7.6Hz,1H),8.09(d,J＝7.5Hz,1H),7.93(t,J＝5.6Hz,1H),7.80(dd,J＝9.1,2.2Hz,1H),7.49–7.43(m,1H),7.03(d,J＝2.3Hz,1H),7.02–6.98(m,2H),6.70–6.61(m,2H),4.59–4.21(m,6H),4.03–3.87(m,4H),3.77(d,J＝5.7Hz,4H),3.23(s,2H),3.15(dd,J＝13.5,4.2Hz,2H),3.08–2.83(m,4H),2.68(q,J＝7.3Hz,2H),2.62–2.52(m,2H),1.84–1.60(m,2H),1.48–1.16(m,14H).碳谱：13C NMR ofMor-AAN-CBT(101MHz,DMSO-d6):δ(ppm)＝172.54,172.03,171.78,171.75,170.98,169.13,163.99,156.27,148.18,139.76,137.12,135.56,130.28,127.04,125.26,121.37,115.40,114.02,111.94,63.50,56.97,54.08,52.85,52.30,50.22,48.82,42.67,42.03,40.76,38.91,37.49,32.05,31.90,29.28,23.33,18.55,18.37,14.71.)
采用Waters1525对纯化前后的药物[131I]Mor-AAN-CBT进行放射性HPLC检测，检测结果见图12。HPLC表征其出峰时间在18.1min，放射化学产率为57.8±5.3％。经纯化后，去除未反应的碘离子，得到放射化学纯度大于95％的药物[131I]Mor-AAN-CBT，其比活度测量为51.36MBq/nmol。
实验例1-1：Legumain靶向的药物的体外稳定性实验
本实验例提供了实施例1-2制得的药物[131I]Mor-AAN-CBT的体外稳定性实验，具体过程如下：
将药物[131I]Mor-AAN-CBT(20μL，3.7MBq)溶于200μL PBS缓冲液，得到混合液；将混合液在37℃下孵育6、12或24h；孵育结束后，取10μL孵育液使用radio-HPLC进行放射性分析。分析结果见图13。
由图13可知，药物[131I]Mor-AAN-CBT与PBS缓冲液在37℃下共孵育表现出高稳定性，孵育24h未见降解。
实验例1-2：Legumain靶向的药物的脂水分配系数实验
本实验例提供了实施例1-2制得的药物[131I]Mor-AAN-CBT的脂水分配系数实验，具体过程如下：
取两支5mL的离心管，分别加入1mL正辛醇、900μL纯水、100μL药物[131I]Mor-AAN-CBT(3.7MBq/mL)与1mL正辛醇、950μL纯水、50μL药物[131I]Mor-AAN-CBT(3.7MBq/mL)，得到混合液；将混合液分别震荡混匀后再离心分离使脂水相分层；从两相中分别取出100μL的有机相和水相置于两只放免管中，然后使用γ计数仪分别测量两相中的放射性以检测药物的分布情况。然后通过公式：logP(logP＝logC正辛醇/C水)计算出药物[131I]Mor-AAN-CBT的脂水分配系数(logP)来反应它的亲水性与亲脂性。C水和C正辛醇分别近似代表药物[131I]Mor-AAN-CBT在水相和有机相中的浓度。回收水相，添加纯水使总体积回到1mL，再加入1mL正辛醇，得到混合液；将混合液分别震荡混匀后再离心分离使脂水相分层；从两相中分别取出100μL的水相和有机相置于两只放免管中，并使用γ计数仪分别测量两相中的放射性，再通过公式计算出logP。重复上述过程，直到连续测出三组logP值接近，取三组数据平均值为脂水分配系数值，结果表示为平均数±标准差。
测得药物[131I]Mor-AAN-CBT的log P＝1.023±0.002，表明药物[131I]Mor-AAN-CBT是亲脂性的。
实验例1-3：Legumain靶向的药物的Legumain体外诱导实验
本实验例提供了实施例1-2制得的前体Mor-AAN-CBT的Legumain体外诱导实验，具体过程如下：
实验一：称取97.6mg的MES以及146.2mg的NaCl加入蒸馏水配制成10mL的缓冲液，用1M的HCl调节pH至5.0，得到Legumain工作液；称取41mg的醋酸钠以及58.5mg的NaCl加入蒸馏水配制成10mL的缓冲液，用1M的HCl调节pH至4.0，得到Legumain活化液；取1μgLegumain用Legumain活化液稀释至10μL，然后在37℃下孵育2h，得到活化的Legumain；用Legumain工作液溶解前体Mor-AAN-CBT(25μM)，得到溶解液；在溶解液中加入活化的Legumain(1μL，1ng/μL)后，于37℃孵育2h，得到孵育液1；对孵育液1进行HPLC及质谱分析后，在孵育液1中加入20eq的三(2-氯乙基)磷酸酯(TCEP)，于37℃孵育0.5h，得到孵育液2；对孵育液2进行HPLC及质谱分析后，将孵育液2于37℃继续孵育6h，得到孵育液3；对孵育液3进行HPLC及质谱分析后，在孵育液3中加入饱和NaHCO3溶液调节pH至7.4，形成纳米粒子；通过动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)分析纳米粒子在孵育液3中的分布状况以及粒径。分析结果见图14～16。
实验二：称取97.6mg的MES以及146.2mg的NaCl加入蒸馏水配制成10mL的缓冲液，用1M的HCl调节pH至5.0，得到Legumain工作液；称取41mg的醋酸钠以及58.5mg的NaCl加入蒸馏水配制成10mL的缓冲液，用1M的HCl调节pH至4.0，得到Legumain活化液；取1μgLegumain用Legumain活化液稀释至10μL，然后在37℃下孵育2h，得到活化的Legumain；用Legumain工作液溶解前体Mor-AAN-CBT至浓度分别为0.02、0.05、0.1、0.15和0.2mM，得到溶解液；在溶解液中分别加入活化的Legumain(1μL，1ng/μL)后，于37℃孵育1h，得到孵育液；分别对孵育液进行HPLC分析，得到Legumain对前体Mor-AAN-CBT的水解效率。分析结果见图17～18。
由图14～16可知，前体Mor-AAN-CBT与活性Legumain在37℃共孵育1h后，形成裂解产物Mor-Cleaved；用TCEP还原前体Mor-AAN-CBT的二硫键后，通过HPLC以及质谱表征检测到15.3min的化合物Mor-Core，此外，在16.3min检测到化合物Mor-Core的缩合产物Mor-Dimer；将孵育液3的pH值调整到7.4后，Mor-Dimer迅速自组装成纳米粒子Mor-NPs，透射电镜观察发现，形成的纳米粒子Mor-NPs呈球形，平均粒径为132±26nm，DLS测量显示纳米粒子Mor-NPs直径为158±31nm。
由图17～18可知，前体Mor-AAN-CBT的Michaelis常数(Km)为72.5μM，低于之前报道的Legumain响应化合物2的Km值(参见文献“Radiofluorinated Smart Probes forNoninvasive PET Imaging ofLegumainActivity in Living Subjects”)，说明前体Mor-AAN-CBT对豆科基质的敏感性较高。然而，较高kcat＝6.86s-1限制了酶的催化速率，这可能是反应溶液中存在少量有机溶剂导致酶活性降低所致。
实验例1-4：Legumain靶向的药物的细胞摄取实验
本实验例提供了实施例1-2制得的药物[131I]Mor-AAN-CBT的细胞摄取实验，具体过程如下：
将1×106个HCT 116细胞或SKOV3细胞(购自中科院上海细胞库)分别分散在200μL的DMEM高糖培养基(购自BI公司)中后加入到放免管中；在放免管中加入100μL药物[131I]Mor-AAN-CBT(0.037MBq)混匀，得到混合液；将混合液于37℃下孵育0.5、1、3、6h。每当设定的孵育时间结束，立即加入500μLPBS缓冲液(4℃)洗涤细胞两次以去除细胞表面残余的放射性剂量，得到孵育液；将孵育液离心取沉淀，用γ计数仪测量细胞摄取的药物量，结果以HCT 116细胞和SKOV3细胞内现有的药物量占孵育前总输入剂量的百分比表示(AD％值)。每组实验至少重复三次，结果以平均值与标准误差来表示。实验结果见图19。
由图19可知，在孵育时间为0.5、1、3、6h时，药物[131I]Mor-AAN-CBT在Legumain高表达的阳性肿瘤细胞HCT116中的摄取分别达到12.19±0.45％、12.37±0.48％、13.20±0.48％和14.12±0.07％；Legumain低表达的阴性肿瘤细胞SKOV3对药物[131I]Mor-AAN-CBT的摄取值明显低于HCT116细胞，其在孵育时间为0.5、1、3、6h时摄取率分别为6.58±0.27％、6.99±0.16％、7.06±0.25％、6.75±0.52％。HCT116细胞与SKOV3细胞摄取差异有统计学意义。
实验例1-5：Legumain靶向的药物的细胞毒性实验
本实验例提供了实施例1-2制得的前体Mor-AAN-CBT和药物[131I]Mor-AAN-CBT的细胞毒性实验，前体Mor-AAN-CBT和药物[131I]Mor-AAN-CBT对HCT 116细胞系和SKOV3细胞系的毒性通过3-(4，5--二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT法)来测定，具体过程如下：
实验一：先将1×104个HCT 116细胞或SKOV3细胞(购自中科院上海细胞库)接种到分别添加有100μL DMEM高糖培养基(购自BI公司)的96孔板中(1个空白对照组和5个实验组，每个实验组设置为3加药孔)，于37℃、5％(v/v)CO2培养箱中培养24h至细胞贴壁后，去除原培养基，加入200μL含不同浓度的(0、2.5、5、10、20、40μM)前体Mor-AAN-CBT(溶剂为购自BI公司的完全培养基)加到各实验孔中，继续在相同的条件下培养24、48、72h。孵育结束后，每个孔添加20μLMTT(5mg/mL)，再于37℃下孵育4h。除去孔内上清液后，加入150μL的DMSO溶解甲瓒，用酶标仪记录490nm波长下的吸光度值，并根据公式：细胞存活率％＝(加药组的平均吸光度值/空白组的平均吸光度值)×100％，对细胞毒性进行评估。评估结果见图20。
实验二：先将1×104个HCT 116细胞或SKOV3细胞(购自中科院上海细胞库)接种到分别添加有100μL DMEM高糖培养基(购自BI公司)的96孔板中(1个空白对照组和5个实验组，每个实验组设置为3加药孔)，于37℃、5％(v/v)CO2培养箱中培养24h至细胞贴壁后，去除原培养基，加入100μL含不同浓度的(0.037、0.37、1.85、3.7MBq)药物[131I]Mor-AAN-CBT(溶剂为购自BI公司的完全培养基)加到各实验孔中，于37℃下孵育3h后，去除原培养基，加入100μLDMEM高糖培养基继续在相同的条件下培养24、48、72h。孵育结束后，每个孔添加20μLMTT(5mg/mL)，再于37℃下孵育4h。除去孔内上清液后，加入150μL的DMSO溶解甲瓒，用酶标仪记录490nm波长下的吸光度值，并根据公式：细胞存活率％＝(加药组的平均吸光度值/空白组的平均吸光度值)×100％，对细胞毒性进行评估。评估结果见图20。
由图20可知，经不同浓度的前体Mor-AAN-CBT处理后超过90％的细胞仍然存活，这表明前体Mor-AAN-CBT具有良好的生物相容性；经不同浓度的药物[131I]Mor-AAN-CBT处理后HCT116细胞的活性显著下降，这表明药物[131I]Mor-AAN-CBT对Legumain高表达的阳性肿瘤细胞HCT116具有细胞毒性，并且，在72h时，0.037MBq、0.37MBq、1.85MBq、3.7MBq的药物[131I]Mor-AAN-CBT处理的HCT116细胞的细胞活力分别为78.196±4.832％、72.878±1.259％、66.732±0.806％、49.557±0.008％，这表明药物[131I]Mor-AAN-CBT对HCT116细胞的细胞毒性呈剂量依赖性，此外，HCT116的细胞活力随着与药物[131I]Mor-AAN-CBT功夫鱼时间的增加而逐渐降低，尤其是在72h时达到最低，这表明药物[131I]Mor-AAN-CBT对HCT116细胞的细胞毒性也具有时间依赖性；HCT116细胞同[131I]Mor-AAN-CBT孵育72h后，细胞活力明显低于SKOV3细胞，并且，放射性碘-131在HCT116细胞中的积累量高于SKOV3细胞，这表明药物[131I]Mor-AAN-CBT对HCT116细胞的杀伤作用更强。根据上述体外实验结果，可以认为药物[131I]Mor-AAN-CBT可以作为一种有效的肿瘤放疗药物。
实验例1-6：Legumain靶向的药物的切伦科夫成像实验
本实验例提供了实施例1-2制得的药物[131I]Mor-AAN-CBT的切伦科夫成像实验，具体过程如下：
选取肿瘤体积达到7～8mm的HCT116荷瘤小鼠(购自常州卡文斯实验动物公司)用含有2vt％异氟烷的氧气以1.5L/min的流速麻醉。小鼠的四肢与尾巴固定后，将溶解在200μL生理盐水中的药物[131I]Mor-AAN-CBT(37MBq)通过尾静脉注射。在注射后不同时间点(0、1、3、6、9、12h)，通过IVIS Spectrum荧光成像系统获取HCT116荷瘤小鼠的切伦科夫图像，成像时间设置为5min，成像核素选择131I。实验结果见图21。
由图21可知，将药物[131I]Mor-AAN-CBT尾静脉注射到小鼠体内后，可以明显看到药物[131I]Mor-AAN-CBT在肿瘤中的存在；考虑到切伦科夫成像的穿透能力有限，在注射3h后切除肿瘤和正常器官或组织进行成像，显然，在肿瘤中观察到药物[131I]Mor-AAN-CBT的切伦科夫信号高于心脏、脾脏、肺、骨或肌肉，然而，在肝脏和肾脏中也监测到[131I]Mor-AAN-CBT的强切伦科夫信号，特别是肝脏，其信号值是肿瘤的2.47倍，推测造成这种情况的主要原因是：第一，肝脏和肾脏是药物[131I]Mor-AAN-CBT的主要代谢器官，第二，药物[131I]Mor-AAN-CBT的亲脂性结构，会导致其在肝脏中积累。
实验例1-7：Legumain靶向的药物的抗肿瘤实验
本实验例提供了实施例1-2制得的药物[131I]Mor-AAN-CBT的抗肿瘤实验，具体过程如下：
选取肿瘤体积达到50～100mm3的HCT116荷瘤小鼠(购自常州卡文斯实验动物公司)随机分为5个治疗组：尾静脉注射生理盐水组(GroupA)、尾静脉注射[131I]NaI组(18.5MBq)组(Group B)、尾静脉注射药物[131I]Mor-AAN-CBT(18.5MBq)组(Group C)、瘤内注射[131I]NaI(3.7MBq)组(Group D)和瘤内注射药物[131I]Mor-AAN-CBT(3.7MBq)组(GroupE)。在种植肿瘤细胞后的第14d开始进行给药治疗，每组每隔五天给药一次，共给药4次。治疗期间，通过口服0.5g/100mL的碘化钠溶液对甲状腺阻断，每两天监测小鼠的体积大小和体重，并且，采用Cerenkov成像观察药物[131I]Mor-AAN-CBT在HCT116荷瘤小鼠中的分布。实验结果见图22。
由图22可知，与尾静脉给药生理盐水相比，尾静脉给药药物[131I]Mor-AAN-CBT对肿瘤生长的抑制效果更好，而尾静脉给药[131I]NaI的肿瘤生长速度与尾静脉给药生理盐水相当，说明了靶向治疗在放疗中的重要性；为了进一步比较[131I]Mor-AAN-CBT和[131I]NaI对肿瘤的治疗效果，采用瘤内注射上述两种药物对荷瘤小鼠进行治疗，结果表明，瘤内注射药物[131I]Mor-AAN-CBT在减缓肿瘤生长方面比瘤内注射[131I]NaI更有效；在治疗结束时，对荷瘤小鼠实施安乐死，并摘取肿瘤和主要器官，然后测量各组肿瘤重量，结果表明，经尾静脉或瘤内注射药物[131I]Mor-AAN-CBT的荷瘤小鼠的肿瘤重量均小于经尾静脉或瘤内注射[131I]NaI的荷瘤小鼠，并且，经尾静脉或瘤内注射生理盐水的荷瘤小鼠肿瘤重量最大；与此同时，在整个治疗期间，任何组的体重均未出现明显的下降，这意味着在使用适当剂量的放射性药物后，没有显著的全身毒性。
实验例1-8：Legumain靶向的药物的病理学实验
本实验例提供了实施例1-2制得的药物[131I]Mor-AAN-CBT的病理学实验，具体过程如下：
选取肿瘤体积达到50～100mm3的HCT116荷瘤小鼠(购自常州卡文斯实验动物公司)随机分为5个治疗组：尾静脉注射生理盐水组(GroupA)、尾静脉注射[131I]NaI组(18.5MBq)组(Group B)、尾静脉注射药物[131I]Mor-AAN-CBT(18.5MBq)组(Group C)、瘤内注射[131I]NaI(3.7MBq)组(Group D)和瘤内注射药物[131I]Mor-AAN-CBT(3.7MBq)组(GroupE)。在种植肿瘤细胞后的第14d开始进行给药治疗，每组每隔五天给药一次，共给4四次。治疗结束后，处死小鼠，离心管中收集HCT116肿瘤及主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)，4％(4g/100mL)多聚甲醛浸泡4h后，分别用15％和30％蔗糖脱水，随后，使用冷冻切片机(ThermoScientific,HM 525)制备HCT116肿瘤及主要脏器的片状样品(6μm)，37℃焙烧过夜后，用4％多聚甲醛固定10min，然后按说明书进行苏木精、伊红染色，染色结束后，进行组织病理学检查。检查结果见图23。
由图23可知，尾静脉注射药物[131I]Mor-AAN-CBT对荷瘤小鼠肿瘤组织造成严重损伤，表现为细胞萎缩、细胞质空泡化、染色质凝集、染色质不完全、和核分裂，而尾静脉注射生理盐水和[131I]NaI均未出现上述现象；当给药方式是瘤内注射时，与预期一样，药物[131I]Mor-AAN-CBT对荷瘤小鼠肿瘤的损伤程度大于[131I]NaI；与此同时，对各组主荷瘤小鼠要脏器(心、肝、脾、肺、肾))进行了病理检查，未发现毒性，再次表明药物的安全性。
实施例2-1：一种Legumain靶向的药物
本实施例提供了一种Legumain靶向的药物[131I]HE-AAN-CBT，所述Legumain靶向的药物[131I]HE-AAN-CBT具有如下所示结构：
实施例2-2：一种制备Legumain靶向的药物的方法
本实施例提供了制备实施例1所述Legumain靶向的药物[131I]HE-AAN-CBT的方法，方法如下：
1、底物HE-AAN-OH的合成
步骤一：用超干二氯甲烷(DCM)冲洗砂芯漏斗两次，抽干，在抽干的砂芯漏斗中加入2-氯三苯甲基氯树脂(362mg，0.4mmol)后，继续加入10mL超干二氯甲烷以浸泡溶胀2-氯三苯甲基氯树脂，浸泡溶胀10min后，抽干，得到经预处理的砂芯漏斗；
步骤二：向步骤一获得的砂芯漏斗中加入Fmoc-N-三苯甲基-L-天冬酰胺(298mg，0.5mmol)，用10mL超干N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，得到溶解液；在溶解液中加入227μLN，N-二异丙基乙胺(DIPEA)调节溶解液的pH至8后，将溶解液在室温(25℃)下振荡3h，振荡完成后，抽干溶剂；加入10mL DMF/MeOH/DIPEA的混合溶液(DMF/MeOH/DIPEA＝17：2：1，v/v/v)清洗滤饼，振荡10min后抽滤，重复操作两次，以除去未反应的氨基酸；再用10mL DMF(HPLC型)清洗滤饼三次，以洗去多余的DMF/MeOH/DIPEA；洗涤结束后，抽干溶剂，取样进行Kaiser测试，试剂颜色显示为淡黄色，说明没有裸露的氨基，证明缩合反应完成；
步骤三：向步骤二获得的砂芯漏斗中加入10mL含20％(v/v)哌啶的DMF溶液，振荡10min后抽滤，重复操作三次，以脱掉氨基酸上的FMOC保护基团；再用10mL DMF(HPLC型)清洗滤饼五次，以洗去多余的哌啶；洗涤结束后，抽干溶剂，取样进行Kaiser测试，试剂颜色显示为深紫色，说明此时FOMC基团已脱除，裸露出氨基，可连接下一个氨基酸；
步骤四：向步骤三获得的砂芯漏斗中加入N-芴甲氧羰基-L-丙氨酸(156mg，0.5mmol)和苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，228mg，0.6mmol)，用10mL超干DMF溶解，得到溶解液；在溶解液中加入227μL DIPEA调节溶解液的pH至8后，将溶解液在室温(25℃)下振荡3h，振荡完成后，抽干溶剂；加入10mLDMF/MeOH/DIPEA的混合溶液(DMF/MeOH/DIPEA＝17：2：1，v/v/v)清洗滤饼，振荡10min后抽滤，重复操作两次，以除去未反应的氨基酸；再用10mL DMF(HPLC型)清洗滤饼三次，以洗去多余的DMF/MeOH/DIPEA；洗涤结束后，抽干溶剂，取样进行Kaiser测试，试剂颜色显示为淡黄色，说明没有裸露的氨基，证明缩合反应完成；
步骤五：向步骤四获得的砂芯漏斗中加入10mL含20％(v/v)哌啶的DMF溶液，振荡10min后抽滤，重复操作三次，以脱掉氨基酸上的FMOC保护基团；再用10mL DMF(HPLC型)清洗滤饼五次，以洗去多余的哌啶；洗涤结束后，抽干溶剂，取样进行Kaiser测试，试剂颜色显示为深紫色，说明此时FOMC基团已脱除，裸露出氨基，可连接下一个氨基酸；
步骤六：重复步骤四和步骤五的操作一次；
步骤七：向步骤六获得的砂芯漏斗中加入Fmoc-L-谷氨酸-5-叔丁酯水合物(213mg，0.5mmol)和HBTU(228mg，0.6mmol)，用10mL超干DMF溶解，得到溶解液；在溶解液中加入227μL DIPEA调节溶解液的pH至8后，将溶解液在室温(25℃)下振荡3h，振荡完成后，抽干溶剂；加入10mL DMF/MeOH/DIPEA的混合溶液(DMF/MeOH/DIPEA＝17：2：1，v/v/v)清洗滤饼，振荡10min后抽滤，重复操作两次，以除去未反应的氨基酸；再用10mL DMF(HPLC型)清洗滤饼三次，以洗去多余的DMF/MeOH/DIPEA；洗涤结束后，抽干溶剂，取样进行Kaiser测试，试剂颜色显示为淡黄色，说明没有裸露的氨基，证明缩合反应完成；
步骤八：向步骤七获得的砂芯漏斗中加入10mL含20％(v/v)哌啶的DMF溶液，振荡10min后抽滤，重复操作三次，以脱掉氨基酸上的FMOC保护基团；再用10mL DMF(HPLC型)清洗滤饼五次，以洗去多余的哌啶；洗涤结束后，抽干溶剂，取样进行Kaiser测试，试剂颜色显示为深紫色，说明此时FOMC基团已脱除，裸露出氨基，可连接下一个氨基酸；
步骤九：向步骤八获得的砂芯漏斗中加入Fmoc-三苯甲基-L-组氨酸(310mg，0.5mmol)和HBTU(228mg，0.6mmol)，用10mL超干DMF溶解，得到溶解液；在溶解液中加入227μL DIPEA调节溶解液的pH至8后，将溶解液在室温(25℃)下振荡3h，振荡完成后，抽干溶剂；加入10mLDMF/MeOH/DIPEA的混合溶液(DMF/MeOH/DIPEA＝17：2：1，v/v/v)清洗滤饼，振荡10min后抽滤，重复操作两次，以除去未反应的氨基酸；再用10mL DMF(HPLC型)清洗滤饼三次，以洗去多余的DMF/MeOH/DIPEA；洗涤结束后，抽干溶剂，取样进行Kaiser测试，试剂颜色显示为淡黄色，说明没有裸露的氨基，证明缩合反应完成；
步骤十：向步骤九获得的砂芯漏斗中加入10mL含20％(v/v)哌啶的DMF溶液，振荡10min后抽滤，重复操作三次，以脱掉氨基酸上的FMOC保护基团；再用10mL DMF(HPLC型)清洗滤饼五次，以洗去多余的哌啶；洗涤结束后，抽干溶剂，取样进行Kaiser测试，试剂颜色显示为深紫色，说明此时FOMC基团已脱除，裸露出氨基，可连接下一个氨基酸；
步骤十一：重复步骤七～十两次；
步骤十二：向步骤十一获得的砂芯漏斗中加入吗啉-4-基乙酸(73mg，0.5mmol)和HBTU(228mg，0.6mmol)，用10mL超干DMF超声溶解，得到溶解液；在溶解液中加入227μLDIPEA调节溶解液的pH至8后，将溶解液在室温(25℃)下振荡3h，振荡完成后，抽干溶剂；加入10mLDMF/MeOH/DIPEA的混合溶液(DMF/MeOH/DIPEA＝17：2：1，v/v/v)清洗滤饼，振荡10min后抽滤，重复操作两次，以除去未反应的氨基酸；再用10mLDMF(HPLC型)清洗滤饼三次，以洗去多余的DMF/MeOH/DIPEA；洗涤结束后，抽干溶剂，取样进行Kaiser测试，试剂颜色显示为淡黄色，说明没有裸露的氨基，证明缩合反应完成；
步骤十三：向步骤十二获得的砂芯漏斗中加入10mL含1％(v/v)三氟乙酸(TFA)的DCM溶液，得到混合液；将混合液在室温(25℃)下振荡10min，振荡完成后，滤出带有底物Mor-AAN-OH的滤液，重复该操作，直至2-氯三苯甲基氯树脂出现红褐色且不褪色；将收集到的滤液用旋转蒸发仪除去溶剂，用冷乙醚(4℃)沉淀后，转移至50mL离心管，离心吸除上清液；取沉淀真空冷冻干燥，得到底物HE-AAN-OH(205mg，产率39％)(底物HE-AAN-OH的合成路线见图24)。
2、前体Mor-AAN-CBT的合成
步骤一：向反应瓶中加入实施例1-2制得的化合物Compound E和2mL预冷的含5％(v/v)哌啶(pip)的DMF溶液(0℃)，得到混合液；在氮气的保护下，将混合液在冰浴(0℃)下搅拌10min；搅拌结束后，将盐酸(1mol/L)使用注射器加入反应液中淬灭反应，直至反应液的pH为2，得到粗产物；使用半制备型HPLC对粗产物进行纯化，得到纯化产物；将纯化产物真空冷冻干燥，得到化合物CompoundF-2(47mg，0.06mmol，产率为30％)；
步骤二：向反应瓶中加入化合物CompoundF-2(47mg，0.06mmol)、HBTU(27mg，0.07mmol)和对羟基苯乙酸(11mg，0.0.07mmol)后，用5mL超干THF溶解，得到溶解液；在氮气的保护下，在溶解液中加入DIPEA(26μL，0.15mmol)调节溶解液的pH至8后，将溶解液在室温(25℃)下搅拌3h；反应结束后，将反应液用旋转蒸发仪除去溶剂，得到粗产物；在粗产物中加入30mL乙醚超声2min后转移至离心管中，放入冰箱(4℃)冷却5min后离心取沉淀；将沉淀真空冷冻干燥，得到化合物Compound G-2(45mg，0.05mmol，产率为82％)；
步骤三：向反应瓶中加入化合物Compound G-2(45mg，0.05mmol)后，用2mL DCM溶解，得到溶解液；在溶解液中加入2mL TFA和100μL的TIPS后，将溶解液在室温(25℃)下反应0.5h；反应结束后，将反应液先用旋转蒸发仪除去溶剂和大部分TFA，再用10mLDCM清洗两次进一步除去TFA，得到粗产物；在粗产物中加入20mL乙醚超声2min后转移至离心管中，放入冰箱(4℃)冷却5min后离心取沉淀；将沉淀用氮气吹干，得到化合物Compound H-2；
步骤四：向反应瓶中加入化合物CompoundH-2后，用2mL甲醇溶解，得到溶解液；在溶解液中加入Set(10μL，0.06mmol)和150μL TIPS后，在氮气的保护下，将溶解液在室温(25℃)下反应1h；反应结束后，将反应液用旋转蒸发仪除去溶剂，得到粗产物；在粗产物中加入30mL乙醚超声2min后转移至离心管中，放入冰箱(4℃)冷却5min后离心取沉淀；将沉淀真空冷冻干燥，得到化合物Compound I-2(22mg，0.03mmol，步骤三和四的总产率为67％)；
步骤五：向反应瓶中加入化合物Compound I-2(22mg，0.03mmol)、HBTU(15mg，0.04mmol)和底物HE-AAN-OH(94mg，0.04mmol)后，用3mL超干THF溶解，得到溶解液；在氮气的保护下，在溶解液中加入DIPEA(14μL，0.08mmol)调节溶解液的pH至8后，将溶解液在室温(25℃)下搅拌3h；反应结束后，将反应液用旋转蒸发仪除去溶剂，得到粗产物；在粗产物中加入30mL乙醚超声2min后转移至离心管中，放入冰箱(4℃)冷却5min后离心取沉淀；将沉淀真空冷冻干燥，得到化合物Compound J-2(67mg，0.02mmol，产率为75％)；
步骤六：向反应瓶中加入化合物Compound J-2(67mg，0.02mmol)后，用2mL DCM溶解，得到溶解液；在溶解液中加入2mL TFA和100μL的TIPS后，将溶解液在室温(25℃)下反应0.5h；反应结束后，将反应液先用旋转蒸发仪除去溶剂和大部分TFA，再用10mLDCM清洗两次进一步除去TFA，得到粗产物；在粗产物中加入30mL乙醚超声2min后转移至离心管中，放入冰箱(4℃)冷却5min后离心取沉淀；将沉淀用氮气吹干，得到吹干产物；使用半制备型HPLC对吹干产物进行纯化，得到前体HE-AAN-CBT(20mg，54％)(前体HE-AAN-CBT的合成路线见图25)。
3、[131I]HE-AAN-CBT的放射合成
步骤一：向内壁涂有Iodogen(100μg)的离心管中加入[131I]NaI(370MBq)后，继续加入[131I]HE-AAN-CBT(200μg)混匀，得到反应体系(反应体系总体积80μL)；将反应体系在20℃下振荡反应2.5min后，将反应液转移到另一离心管终止反应；用5mL水稀释反应液后，使用Sep-Pak C18柱对反应液进行纯化，得到[131I]HE-AAN-CBT。
采用Waters1525对前体HE-AAN-CBT进行HPLC检测，检测结果见图26。
采用电喷雾电离源对前体HE-AAN-CBT进行ESI-MS分析，分析结果见图27。
采用Waters1525对纯化前后的药物[131I]HE-AAN-CBT进行放射性HPLC检测，检测结果见图28。HPLC表征其出峰时间在14.7min，放射化学产率为61.43±6.31％。经纯化后，去除未反应的碘离子，得到放射化学纯度大于95％的药物[131I]HE-AAN-CBT。
实验例2-1：Legumain靶向的药物的体外稳定性实验
参照实验例1-1对药物[131I]HE-AAN-CBT进行体外稳定性实验。实验结果见图29。
由图29可知，药物[131I]HE-AAN-CBT与PBS缓冲液在37℃下共孵育表现出高稳定性，孵育24h未见降解。
实验例2-2：Legumain靶向的药物的脂水分配系数实验
参照实验例1-2对药物[131I]HE-AAN-CBT进行脂水分配系数实验。
测得药物[131I]HE-AAN-CBT的logP＝-1.5654±0.0097，表明药物[131I]HE-AAN-CBT是亲水性的。
实验例2-3：Legumain靶向的药物的Legumain体外诱导实验
参照实验例1-3对药物[131I]HE-AAN-CBT进行Legumain体外诱导实验，实验结果见图30～31。
由图30可知，前体HE-AAN-CBT与活性Legumain在37℃共孵育1h后，形成裂解产物HE-Cleaved；用TCEP还原前体HE-AAN-CBT的二硫键后，通过HPLC以及质谱表征检测到15.3min的化合物HE-Core，此外，在16.3min检测到化合物HE-Core的缩合产物HE-Dimer。
由图31可知，前体HE-AAN-CBT的Michaelis常数(Km)为105.81μM，稍高于Legumain切割前体Mor-AAN-CBT的Km值，推测HEHEHE多肽序列的加入使底物与酶的亲和力降低；而前体HE-AAN-CBT的酶转换数Kcat＝7.84s-1高于前体Mor-AAN-CBT，推测是HE-AAN-CBT的水溶性更好，更易于在缓冲液中与Legumain反应。
实验例2-4：Legumain靶向的药物的细胞摄取实验
参照实验例1-4对药物[131I]HE-AAN-CBT进行细胞摄取实验，实验结果见图32。
由图32可知，在孵育时间为0.5、1、3、6h时，药物[131I]HE-AAN-CBT在Legumain高表达的阳性肿瘤细胞HCT116中的摄取分别达到2.73±0.12％、3.02±0.41％、4.43±0.35％和5.18±0.23％，在Legumain低表达的阴性肿瘤细胞SKOV3中的摄取分别达到2.94±0.43％、3.08±0.12％、3.04±0.21％、2.79±0.18％，可以发现，前两个时间点时药物[131I]HE-AAN-CBT在阴阳两种细胞中的摄取无明显差异，在6h时，药物[131I]HE-AAN-CBT在阳性细胞中的摄取值约是SKOV3细胞中的1.9倍，表明了药物[131I]HE-AAN-CBT的靶向特异性，并且，与药物[131I]Mor-AAN-CBT相比，药物[131I]HE-AAN-CBT的细胞摄取值较低，其原因可能是药物[131I]HE-AAN-CBT的水溶性得到改善，其非特异性摄取减少。
实验例2-5：Legumain靶向的药物的细胞毒性实验
参照实验例1-5对药物[131I]HE-AAN-CBT进行细胞毒性实验，实验结果见图33。
由图33可知，经不同浓度的前体HE-AAN-CBT处理后超过90％的细胞仍然存活，这表明前体HE-AAN-CBT具有良好的生物相容性；经不同浓度的药物[131I]HE-AAN-CBT处理后HCT116细胞的活性显著下降，这表明药物[131I]HE-AAN-CBT对Legumain高表达的阳性肿瘤细胞HCT116具有细胞毒性，并且，在72h时，0.037MBq、0.37MBq、1.85MBq、3.7MBq的药物[131I]HE-AAN-CBT处理的HCT116细胞的细胞活力分别为78.196±4.832％、72.878±1.259％、66.732±0.806％、49.557±0.008％，这表明药物[131I]HE-AAN-CBT对HCT116细胞的细胞毒性呈剂量依赖性，此外，HCT116的细胞活力随着与药物[131I]HE-AAN-CBT功夫鱼时间的增加而逐渐降低，尤其是在72h时达到最低，这表明药物[131I]HE-AAN-CBT对HCT116细胞的细胞毒性也具有时间依赖性；HCT116细胞同[131I]HE-AAN-CBT孵育72h后，细胞活力明显低于SKOV3细胞，并且，放射性碘-131在HCT116细胞中的积累量高于SKOV3细胞，这表明药物[131I]HE-AAN-CBT对HCT116细胞的杀伤作用更强。根据上述体外实验结果，可以认为药物[131I]HE-AAN-CBT可以作为一种有效的肿瘤放疗药物。
实验例2-6：Legumain靶向的药物的切伦科夫成像实验
参照实验例1-6对药物[131I]HE-AAN-CBT进行切伦科夫成像实验，实验结果见图34。
由图34可知，将药物[131I]HE-AAN-CBT尾静脉注射到小鼠体内后，可以明显看到药物[131I]HE-AAN-CBT在肿瘤中的存在，且其在肿瘤中的滞留时间能长达72h。
实验例2-7：Legumain靶向的药物的抗肿瘤实验
参照实验例1-7对药物[131I]HE-AAN-CBT进行抗肿瘤实验，实验结果见图35。
由图35可知，与尾静脉给药生理盐水和[131I]NaI相比，尾静脉给药药物[131I]HE-AAN-CBT对肿瘤生长的抑制效果更好，说明了药物[131I]HE-AAN-CBT具有良好的靶向治疗效果；在治疗结束时，对荷瘤小鼠实施安乐死，并摘取肿瘤和主要器官，然后测量各组肿瘤重量，结果与上述瘤径测量结果一致，尾静脉给药药物[131I]HE-AAN-CBT的荷瘤小鼠的肿瘤重量小于尾静脉给药生理盐水和[131I]NaI的荷瘤小鼠；与此同时，在整个治疗期间，任何组的体重均未出现明显的下降，这意味着在使用适当剂量的放射性药物后，没有显著的全身毒性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种Legumain靶向的药物，其特征在于，所述药物的结构如下所示：
2.一种Legumain靶向的药物，其特征在于，所述药物的结构如下所示：
3.一种制备权利要求1所述药物的方法，其特征在于，所述方法为：将前体Mor-AAN-CBT进行[131I]的放射性标记，得到药物；
所述前体Mor-AAN-CBT的结构如下所示：
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述前体Mor-AAN-CBT的制备方法为：在化合物Compound J-1中加入二氯甲烷、三氟乙酸和三异丙基硅烷后进行反应，得到前体Mor-AAN-CBT；
所述化合物Compound J-1的结构如下所示：
5.一种制备权利要求2所述药物的方法，其特征在于，所述方法为：将前体HE-AAN-CBT进行[131I]的放射性标记，得到药物；
所述前体HE-AAN-CBT的结构如下所示：
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述前体HE-AAN-CBT的制备方法为：在化合物Compound J-2中加入二氯甲烷、三氟乙酸和三异丙基硅烷后进行反应，得到前体HE-AAN-CBT；
所述化合物Compound J-2的结构如下所示：
7.权利要求1或2所述的药物在制备肿瘤诊断或治疗药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为结肠癌。
8.一种Legumain靶向的肿瘤显像剂，其特征在于，所述肿瘤显像剂含有权利要求1或2所述的药物。
9.一种Legumain靶向的抗肿瘤药，其特征在于，所述抗肿瘤药含有权利要求1或2所述的药物。
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