CN104379585B - 18f-标记的叶酸/抗叶酸剂类似物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的18F‑叶酸/抗叶酸剂类似物放射药剂，其中叶酸结构中的苯基已用18F‑杂环替换，它们的前体，它们的制备方法，以及它们在诊断表达叶酸受体的细胞或细胞群体和监测癌症和炎性和自身免疫性疾病及其治疗中的用途。

Description

18F-标记的叶酸/抗叶酸剂类似物
技术领域
本发明涉及新的18F-叶酸(folate)/抗叶酸剂(antifolate)类似物放射药剂，其中叶酸结构中的苯基已用18F-杂环替换，它们的前体，它们的制备方法，以及它们在诊断表达叶酸受体的细胞或细胞群体和监测癌症和炎性疾病和自身免疫性疾病及其治疗中的用途。
背景技术
用于递送效应物部分比如诊断或治疗试剂的细胞特异性靶向是广泛研究的领域并且引起非侵入性诊断和/或治疗的医学应用的发展。尤其是，在应用发射电磁辐射的放射性物质比如γ射线或发出辐射的粒子的核医学过程和治疗领域中，需要将这些放射性物质选择性地区域化在靶向细胞或组织中以实现用于造影特定组织的高信号强度，用其评价疾病和/或监测治疗效果，或者实现用于递送适当剂量的离子化辐射至指定患病场所的高辐射剂量，而不在其它组织例如健康的组织中构成辐射伤害/ 辐射毒性风险。因此，关键是测定和评价细胞特异性结构，尤其是在癌症(也即肿瘤)或炎性疾病和自身免疫病情况下的结构，比如受体、抗原、半抗原等，其能够通过各自的生物学媒介物特定靶向。
叶酸受体(FR)已确认为这些结构之一(Low,Acc Chem Res.2008； 41:120-9)。FR是高-亲和力(KD<10-9M)膜结合蛋白质。在一般组织和器官中FR-表达高度受限于仅一些器官(例如肾、肺、脉络丛和胎盘)，其中它大致在上皮细胞的腔表面发生并因此循环中的叶酸无法接触。FR- α频繁地过度表达在各式各样的特定细胞类型上，比如上皮肿瘤(例如卵巢，子宫颈，子宫内膜，乳腺，结直肠，肾，肺，参见例如Parker et al., Anal.Biochem.2005；2:284-293)，而FR-β频繁地过度表达在白血病细胞中(大约70％急性髓性白血病(AML)都为FR-β阳性)。因此，两者都可以用作用于选择性肿瘤-靶向的有价值肿瘤标记物(Elnakatand Ratnam，Adv.Drug Deliv.Rev.2004；56:1067-84)。此外，最近已发现诊断为类风湿性关节炎的患者中的激活(但不静息)的滑膜巨噬细胞具有功能活性的FR-β(Nakashima-Matsushita et al,Arthritis&Rheumatism, 1999,42(8):1609-16)。因此，激活的巨噬细胞能够选择性地被关节炎性关节中的叶酸缀合物靶向，该能力提供诊断和治疗类风湿性关节炎的可能性(Paulos et al,Adv.Drug Deliv.Rev.2004；56:1205-17)。一般富集叶酸受体阳性巨噬细胞的其它炎性病理学状况包括类风湿性关节炎，克罗恩病，动脉粥样硬化，肉瘤样病，肾小球肾炎，骨关节炎，器官移植排斥，溃疡性结肠炎，斯耶格伦氏综合征，糖尿病，缺血/再灌注损伤，冲击创伤，微生物感染，假体骨质溶解，肝皮脂腺病，和多发性硬化(Piscaer et al.2011,Arthritis&Rheumatism 63,1898；Henne et al.2012,Mol Pharm,9:1435-40；Ayala-Lopez et al.2010,J Nucl Med 51,768)。叶酸靶向治疗剂为开发上述疾病的高度有效、无毒治疗形式提供很大希望 (Hansen M.J et al.,Targeted DrugStrategies for Cancer and Inflammation,Springer Science+Business Media,2011,181-193)。FR-β也在肿瘤相关的巨噬细胞(TAMs)中过表达。TAMs最主要显示促瘤样功能，促进肿瘤细胞存活、增殖和散布。临床研究已显示在TAMs数量与不良预后之间的关联，尤其是对乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，宫颈癌，子宫内膜癌，食管癌，胰癌，成胶质细胞瘤和膀胱癌(Kurahara H.et al., Ann Surg Oncol.,2012 Feb 16,Nagai T.et al.,Cancer ImmunolImmunother(2009)581577-1586,Puig-Kroeger A.et al.Cancer Res 2009； 69(24).December 15,2009,Turk M.J.et al.,Cancer Letters 213(2004) 165-172)。因此，肿瘤相关的巨噬细胞能够选择性地被叶酸缀合物靶向。这提供诊断和治疗癌症的可能性。
又一所述细胞特定结构是质子偶联的叶酸转运蛋白(PCFT)。PCFT 在近端小肠表达，其在酸性pH介导叶酸吸收(Qiu et al,Cell.2006Dec 1；127(5):917-28)和在组织比如肝和肾表达，其不经历低pH条件(Zhao et al., Expert Rev Mol Med.2009 Jan 28；11:e4)。固体肿瘤的间质pH常常为酸性(Helmlinger et al.,Nat Med.1997 Feb；3(2):177-82；Raghunand et al., Biochem Pharmacol.1999 Feb 1；57(3):309-12)，其促进PCFT运输。显著的低pH运输途径在32种实体人类肿瘤细胞系中的29种中得以鉴定 (Zhao et al.,Clin Cancer Res.2004 Jan 15；10(2):718-27)，并且高水平的人类PCFT(hPCFT)转录在宽范围的人类肿瘤中有所报告(Kugel Desmoulin et al.,Am Assoc Cancer Res 51:1103)。hPCFT在抗叶酸剂活性和肿瘤选择性中的作用仍在发展当中。经典抗叶酸剂的PCFT运输已预先描述(Zhao et al.,Mol Pharmacol.2008 Sep；74(3):854-62.Epub 2008 Jun 4)。质子偶联的叶酸转运蛋白的靶向试剂提供诊断和治疗肿瘤的可能性。
从而，在过去15年中叶酸及其衍生物，作为向带有叶酸受体的细胞群体递送治疗和/或诊断试剂的靶向试剂，得以大量研究，以实现治疗和/或诊断试剂在所述细胞中相对普通细胞的选择性蓄积。
各种探针已缀合至叶酸并进行(预)临床评价，包括叶酸放射药剂 (Leamon andLow,Drug Discov.Today 2001；6:44-51and Jammaz et al, J.LabelCompd.Radiopharm.2006；49:125-137；Müller&Schibli,2011 J.Nucl.Med.52,1；Müller,Current Pharm Design,2012)，化疗药剂的叶酸缀合物(Leamon and Reddy,Adv.DrugDeliv.Rev.2004；56:1127-41； Leamon et al,Bioconjugate Chem.2005；16:803-11)，蛋白和蛋白毒素 (Ward et al,J.Drug Target.2000；8:119-23；Leamon et al,J.Biol.Chem. 1993；268:24847-54；Leamon and Low,J.Drug Target.1994；2:101-12)，反义寡核苷酸(Li et al,Pharm.Res.1998；15:1540-45；Zhao and Lee,Adv. DrugDeliv.Rev.2004；56:1193-204)，脂质体(Lee and Low,Biochim. Biophys.Acta-Biomembr.1995；1233:134-44；Gabizon et al,Adv.Drug Deliv.Rev.2004；56:1177-92)，半抗原分子(Paulos et al,Adv.Drug Deliv. Rev.2004；56:1205-17)，MRI造影剂(Kondaet al,Magn.Reson.Mat. Phys.Biol.Med.2001；12:104-13)等。
尤其是，叶酸放射药剂能够非常适用于改善的诊断和评价癌症疗法有效性。其可以包括治疗反应的评价和/或预测并因此包括辐射剂量测定法的改善。典型的造影技术是正电子发射断层摄影(PET)，其中将发射正电子的放射性核素给予受试者，并且由于其发生放射性衰变，正电子湮灭导致的γ射线在PET扫描仪中得以检测。由于其高敏感性和充分说明的定量法，PET本身已是最复杂的功能成像技术之一，其评价脑和其它器官中的区域吸收和配体亲和力或代谢性底物，从而提供基于代谢活性的成像手段。PET的适宜放射药剂可以基于金属同位素和与之组合的捕集金属(例如68Ga，64Cu，89Zr)的螯合剂，或基于共价连接的同位素，一般是发射正电子的短半衰期同位素比如11C(约20分钟)，13N(约10分钟)，15O(约2分钟)和18F(约110分钟)。
在过去几十年，许多基于螯合物的叶酸放射药剂，尤其是111In-，99mTc-和67/8Ga8Ga-衍生物已获合成和成功地作为用SPECT或PET成像叶酸受体阳性肿瘤的诊断试剂得以评价(参见例如Siegel et al.,J.Nucl. Med.2003,44:700；Müller et al.,J.Organomet.Chem.2004,689:4712； Mathias et al.,Nucl.Med.Biol.2003,30(7):725；WO 2008/125618； Müller et al.2011,Nucl.Med.&Biol.38,715)。
最近，携带共价连接的发射正电子的18F核素的叶酸放射药剂已有报告(参见例如Bettio et al.,J.Nucl.Med.,2006,47(7),1153；WO 2006/071754；WO 2008/098112；WO2008/125613；WO 2008/125615； WO 2008/125617；WO 2010/040854；Ross et al.2010,JNucl.Med.,51, 1756；Fischer et al.2012,Bioconjug.Chem.)，并且显示是最适于PET成像，原因是其优异的会实现全部上述考虑的成像特征。
但是，虽然已知的18F叶酸放射药剂显示有希望的结果，仍然需要化合物，其显示高FR-特异性和适于一般临床应用并且能以有效和多样的方式获得，具有高放射化学收率。
申请人现已发现叶酸衍生物，其中叶酸骨架的苯基已用杂环替换，能够以多样且有效的方式和高放射化学收率地用一个或多个18F核素取代。所获得的18F-叶酸/抗叶酸剂类似物化合物显示对FR-阳性组织的高选择性，从而能够得出结论：对叶酸骨架的所述修饰对叶酸受体结合亲和力并无负面效果。
从而，本发明涉及新的18F-叶酸/抗叶酸剂类似物放射药剂，其中叶酸结构中的将稠合嘧啶杂环经由适宜连接体(比如蝶啶杂环C6位置的 -CH2-NH-连接体)连接至氨基酸部分的苯基，已用18F-取代的5-或6-元杂环替换，它们的前体，它们的制备方法，以及它们在诊断表达叶酸受体的细胞或细胞群体和监测癌症和炎性疾病和自身免疫性疾病及其治疗中的用途。
发明概要
在第一方面，本发明涉及新的18F-叶酸/抗叶酸剂类似物放射药剂及其前体(此后也称为本发明化合物)，其中将稠合嘧啶杂环连接至氨基酸部分的苯基已用18F-取代的5-或6-元杂环替换。
更特别，本发明涉及式I化合物，
其中
A是氨基酸，
B是5-或6-元杂环，包含至少一个独立选自N、O和S的杂原子，
X1至X5相互独立地是N或C，
R1，R2相互独立地是H，Hal，-OR7，-NR8R9，C1-C12烷基， C1-C12烷氧基，C1-C12烷酰基，C2-C12烯基，C2-C12炔基，(C1-C12 烷氧基)羰基，和(C1-C12烷基氨基)羰基，其中R7是H或C1-C6烷基和 R8、R9相互独立地选自H，甲酰基，直链或支化的C1-C12烷基，其是未经取代的或被下述中至少一种取代：CN，Hal，或NO2，并且其中嵌入的、不相邻的CH2基团中的一个或多个可以独立地用下述替换：-O-， -CO-，-CO-O-，-CO-NR’-，-CH＝CH-，-C≡C-，其中R’是H，C1-C6 烷基，
R3，R4相互独立地是H，甲酰基，亚氨基甲基，亚硝基，C1-C12 烷基，C1-C12烷氧基，C1-C12烷酰基，卤代的C1-C12烷酰基，
p是0、1或2，
q具有1至7的值，和
r是0或1。
甚至更特别，本发明涉及式I化合物，其中5-或6-元杂环是具有至少一个氮、氧或硫原子的5-元杂环，如式Ia所代表；或其中5-或6-元杂环是具有至少一个氮、氧或硫原子的6-元杂环，如式Ib所代表。
从而，在特定的实施方式中，本发明涉及式Ia和Ib化合物
其中
A是氨基酸，
Z1至Z4相互独立地是N、O、S或C，条件是在式Ia中Z1和 Z4至少一个是N、O或S和在式Ib中Z1、Z2和Z3中至少一个是N、O 或S，
X1至X5相互独立地是N或C，
R1，R2相互独立地是H，Hal，-OR7，-NR8R9，C1-C12烷基， C1-C12烷氧基，C1-C12烷酰基，C2-C12烯基，C2-C12炔基，(C1-C12 烷氧基)羰基，和(C1-C12烷基氨基)羰基，其中R7是H或C1-C6烷基和 R8、R9相互独立地选自H，甲酰基，直链或支化的C1-C12烷基，其是未经取代的或被下述中至少一种取代：CN，Hal，或NO2，并且其中嵌入的、不相邻的CH2基团中的一个或多个可以独立地用下述替换：-O-， -CO-，-CO-O-，-CO-NR’-，-CH＝CH-，-C≡C-，其中R’是H，C1-C6 烷基，
R3，R4相互独立地是H，甲酰基，亚氨基甲基，亚硝基，C1-C12 烷基，C1-C12烷氧基，C1-C12烷酰基，卤代的C1-C12烷酰基，
p是0、1或2，
q具有1至7的值，和
r是0或1。
在某些实施方式中，本发明涉及式I化合物或更特别地式Ia，
其中5-元杂环是吡咯或吡咯烷，呋喃或四氢呋喃，或噻吩或四氢噻吩，也即其中(a)Z1是N、O或S和Z2、Z3是C或(b)Z2是N、O或S 和Z1、Z3是C；或(c)Z3是N、O或S和Z1、Z2是C；或
其中5-元杂环是咪唑或咪唑烷，或二氧杂环戊烷，或1,3-二硫杂环戊烷，也即其中(d)Z1、Z2均是N、O或S和Z3是C或(e)Z1、Z3均是N、 O或S和Z2是C；或
其中5-元杂环是吡唑或吡唑烷或1,2-二硫杂环戊烷，也即其中(f) Z2、Z3均是N或S和Z1是C；或
其中5-元杂环是噁唑或噁唑烷，或噻唑或噻唑烷，也即其中(g)Z1和Z2之一是N和Z1和Z2之一是O或S和Z3是C或(h)Z1和Z3之一是 N和Z1和Z3之一是O或S和Z2是C；或
其中5-元杂环是异噁唑或异噁唑烷，或异噻唑或异噻唑烷，也即其中(i)Z2和Z3之一是N和Z2和Z3之一是O或S和Z1是C；或
其中5-元杂环是三唑或噁二唑或噻二唑，也即其中(j)Z1、Z2、Z2全部是N，或(k)Z1是O或S和Z2、Z3均是N。
在其它实施方式中，本发明涉及式I化合物，其中5-或6-元杂环是具有至少一个氮原子的6-元环(本文也称为氮杂-杂环)，由式Ib代表，
其中
A是氨基酸，
Z1至Z4相互独立地是N或C，条件是Z1和Z4中至少一个是N，
X1至X5相互独立地是N或C，
R1，R2相互独立地是H，Hal，-OR7，-NR8R9，C1-C12烷基，C1-C12烷氧基，C1-C12烷酰基，C2-C12烯基，C2-C12炔基，(C1-C12 烷氧基)羰基，和(C1-C12烷基氨基)羰基，其中R7是H或C1-C6烷基和 R8、R9相互独立地选自H，甲酰基，直链或支化的C1-C12烷基，其是未经取代的或被下述中至少一种取代：CN，Hal，或NO2，并且其中嵌入的、不相邻的CH2基团中的一个或多个可以独立地用下述替换：-O-，-CO-，-CO-O-，-CO-NR’-，-CH＝CH-，-C≡C-，其中R’是H，C1-C6 烷基，
R3，R4相互独立地是H，甲酰基，亚氨基甲基，亚硝基，C1-C12 烷基，C1-C12烷氧基，C1-C12烷酰基，卤代的C1-C12烷酰基，
p是0、1或2，
q具有1至7的值，和
r是0或1。
对于本发明的应用，所述氮杂-杂环是吡啶、二嗪或三嗪。从而，在优选的实施方式中，本发明涉及式I化合物或更特别式Ib，其中(a)Z1是N和Z2、Z3、Z4是C或(b)Z4是N和Z1、Z2、Z3是C或(c)Z1、Z2是N和Z3、Z4是C或(d)Z1、Z3是N和Z2、Z4是C或(e)Z1、Z4是N 和Z2、Z3是C或(f)Z3、Z4是N和Z1、Z2是C或(g)Z1、Z2、Z3是N和 Z4是C或(h)Z1、Z3、Z4是N和Z2是C。
在又一方面中本发明涉及它们的制备方法。在优选的实施方式中，本发明的18F-叶酸/抗叶酸剂类似物放射药剂通过直接18F-放射性标记适宜前体(和随后的脱保护步骤)而获得。
在又一方面中，本发明涉及在诊断表达叶酸受体的细胞或细胞群体和在体外或在体内监测癌症和癌症疗法或监测炎性疾病和自身免疫性疾病比如类风湿性关节炎及其治疗中的用途。
在一种实施方式中，本发明涉及本发明的18F-叶酸/抗叶酸剂类似物放射药剂用于表达叶酸受体的细胞或细胞群体的诊断成像的用途。
更特别地，本发明包括用于表达叶酸受体的细胞或细胞群体的诊断成像的方法，其包括例如用于在组织样品中体外检测表达叶酸受体的细胞例如肿瘤细胞或活化的巨噬细胞的方法。上述方法还可以在体内进行。
从而，在又一实施方式中，本发明涉及本发明的18F-叶酸/抗叶酸剂类似物放射药剂的用途，用于方便且有效给药至需要诊断成像和/或监测癌症或炎性疾病和自身免疫性疾病治疗的受试者。本发明方法的受试者优选是哺乳动物，比如动物或人类，优选人类。
本发明的上述方法可以与诊断或治疗癌症或者炎性疾病和自身免疫病的任意其它方法组合进行，包括使用其它已经开发的诊断和/或治疗试剂以及运用X射线计算机断层摄影(CT)，磁共振成像(MRI)，功能磁共振成像(fMRI)，单光子发射计算机断层摄影(SPECT)，旋光成像，和超声的方法。
本发明的其它特征和优势通过下述详细说明和权利要求将变得明显。
附图说明
图1A，1B，1C.代表性合成方案，用于制备18F-取代的3’-氮杂- 叶酸，其中(X)n-取代的6-氨基烟酸作为杂环。(X)n代表用于引入18F的一个或多个吸电子取代基，例如CL，Br，NO2，F。
图1D.选择氮杂、二氮杂或三氮杂杂环用作图1A、1B、1C合成方案中的(X)n-取代的6-氨基烟酸的备择对象。(X)n代表一个或多个吸电子取代基，例如CL，Br，NO2，F。
图2. 3’-氮杂-2’-[18F]氟叶酸在A：人类血浆，4小时；B：人类谷胱甘肽，1小时；C：小鼠微粒体，1小时；D：人类微粒体，1小时的稳定性。
图3.在HPLC纯化之后的3’-氮杂-2’-[18F]氟叶酸品质控制。
图4. 3’-氮杂-2’-[18F]氟叶酸的代谢物研究，下述的放射性-UPLC 色谱图：A：品质控制，B：血液样品5分钟p.i.，C：血液样品30分钟 p.i.，D：肿瘤30分钟p.i.，E：尿30分钟p.i.，F：肝30分钟p.i.
图5. 3’-氮杂-2’-[18F]氟叶酸的细胞吸收研究的结果：总吸收(蓝色)，内化级分(黄色)和在阻断条件下的吸收(红色/不可视)。
图6.携带KB肿瘤的小鼠的PET-图像(最大密度投影)，在注射单独的3’-氮杂-2’-[18F]氟叶酸之后120-150分钟(A)和在注射过量叶酸和 [18F]-3’-氮杂-叶酸之后120-150分钟(B)。
图7.携带KB肿瘤的小鼠的PET-图像(最大密度投影)，在注射单独的3’-氮杂-2’-[18F]氟叶酸之后120-150分钟(A)和与预注射的培美曲塞组合之后120-150分钟(B)。
发明详述
在第一方面，本发明涉及新的18F-叶酸/抗叶酸剂类似物放射药剂 (此后也称为本发明化合物)及其前体，其中将稠合嘧啶杂环连接至氨基酸部分的苯基已用18F-取代的5-或6-元杂环替换。
用于本发明中的叶酸/抗叶酸剂类似物是叶酸/抗叶酸剂化合物，其中叶酸骨架的苯基，也即叶酸中将稠合嘧啶杂环连接至氨基酸(或谷氨酸) 部分的氨基苯甲酰基的苯基已用5-或6-元杂环替换，所述5-或6-元杂环包含至少一个独立地选自O、N和S的杂原子。
术语杂环如用于本文的叶酸/抗叶酸剂结构是指饱和的或(部分)不饱和的杂环，其携带一个或多个N、O或S原子，更特别1、2或3个N、 O或S-原子。从而，典型的N、O或S-杂环包括例如吡啶，二嗪或三嗪，更特别地吡啶，嘧啶，哒嗪，吡嗪或三嗪，四氢呋喃，呋喃，硫杂环戊烷，噻吩，吡咯烷，吡咯，噻唑烷，异噻唑烷，噻唑，异噻唑，噁唑烷，异噁唑烷，噁唑，异噁唑，吡唑烷，咪唑烷，吡唑，咪唑，二氧杂环戊烷，二噻唑，噻二唑，噁二唑，呋咱或三唑。N、O或S-杂环优选是在 6-元环情况下1,4-连接的(或对位)而在5-元环情况下是1,3-连接的，在6- 元杂环的情况下N-杂环即携带1、2或3个N-原子的饱和的或(部分)不饱和的杂环是优选的，和一般在对位通过氨基-连接体连接至稠合的嘧啶杂环单元(或其衍生物)和通过羰基基团连接至一个或多个氨基酸单元，获得根据本发明的氮杂-叶酸及其衍生物。如本文所用"稠合的嘧啶杂环" 包括与5-或6-元杂环稠合的嘧啶，比如蝶啶或吡咯并嘧啶双环。如本文所用术语"氨基酸"包括具有氨基基团(例如NH2或NH3 +)和羧酸基团(例如COOH或COO—)的化合物。在特定的实施方式中，氨基酸可以是α- 氨基酸，β-氨基酸，D-氨基酸或L-氨基酸。氨基酸可以是天然氨基酸(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，甲硫氨酸，甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，精氨酸，或组氨酸等)，或可以是它们的衍生物。衍生物的实例包括任选经取代的氨基酸，例如具有一个或多个选自CN，Hal，和/或NO2的取代基(例如氟谷氨酸)。氨基酸还可以包括任意其它非天然氨基酸，比如例如正亮氨酸，正缬氨酸，L-或 D-萘基丙氨酸(naphthalanine)，鸟氨酸，高精氨酸和肽领域所熟知的其它氨基酸(参见例如M.Bodanzsky,"Principles of Peptide Synthesis,"1st and 2nd revised ed.,Springer-Verlag,New York,NY,1984and 1993，和Stewart and Young,"Solid PhasePeptide Synthesis,"2nd ed.,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL,1984，均通过援引并入本文)。氨基酸和氨基酸类似物/衍生物能够商业购买(Sigma Chemical Co.；AdvancedChemtech)或用本领域已知的方法合成。在又一特定的实施方式中，氨基酸还可以是聚氨基酸(也称为多肽)的一部分，其中多个如上文所定义的相同或不同的氨基酸共价连接，也即通过常规肽键或其它键连接。优选的氨基酸包括例如谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，天冬氨酸，赖氨酸，精氨酸，半胱氨酸，及其衍生物和优选的聚氨基酸包括其各自的均聚物 (也即聚谷氨酸，聚天冬氨酸等)。最优选的是任选经取代的天冬氨酸和谷氨酸。
应理解本发明18F-叶酸/抗叶酸剂化合物的衍生物可以包括嘧啶杂环单元和/或一个或多个氨基酸性质的其它变化，包括蝶啶环(吡嗪杂环) 的不同的氧化状态，以获得更加还原的形成比如二氢-叶酸或四氢-叶酸，以及N5和/或N10位置的一个碳取代基的类型，缀合的氨基酸残余物的类型和数量，各种单元的取代形式，和其它衍生物。
如上文所指，在本发明的18F-叶酸/抗叶酸剂化合物携带6-元杂环的情况下，N-杂环(也称为氮杂-叶酸)是优选的。这种氮杂-叶酸的优选代表如本文所用基于氮杂-叶酸骨架，也即N-[4[[(2-氨基-1,4-二氢-4-氧代-6- 蝶啶基)甲基]氨基]-氮杂杂环基-]-谷氨酸，其中氮杂杂环基是指其2’-或 3’-吡啶基衍生物，和包括任选经取代的氮杂-叶酸，氮杂-亚叶酸，蝶酰聚-谷氨酸，和叶酸受体-结合的蝶啶比如四氢蝶呤，二氢-氮杂-叶酸，四氢-氮杂-叶酸，和它们的已知脱氮-和二脱氮-蝶酰基类似物。
类似地，包含如上文所定义杂环而不是氮杂杂环基的5-元杂环的 18F-叶酸/抗叶酸剂类似物的优选代表是2-噻吩基-，1,3,4-噻二唑-2-基-， 4-噻唑基-，2-噻唑基-，5-噻唑基-，1H-吡唑-3-基-，1H-咪唑-5-基，1H- 吡咯-2-基-，1H-吡咯-3-基-，和2-呋喃基-化合物。
氮杂-叶酸结构是用于本发明化合物的优选基本结构。措辞"脱氮和二脱氮-蝶酰基类似物"是指本领域已知的蝶酰基-类似物，其中蝶酰基 (pteroyl)中的四个氮原子中的一个或两个氮原子已被碳原子取代，取代一个或两个氮原子。例如，脱氮类似物包括1-脱氮，3-脱氮，5-脱氮， 8-脱氮，和10-脱氮类似物。二脱氮类似物包括，例如1,5-二脱氮，5,10- 二脱氮，8,10-二脱氮，和5,8-二脱氮类似物。已知和优选的脱氮类似物，其中苯基能够用氮杂-杂环取代以获得相应氮杂-叶酸衍生物，包括 N-[4-[2-[(6R)-2-氨基-1,4,5,6,7,8-六氢-4-氧代吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(洛美曲索)和N-[4-[1-[(2,4-二氨基-6-蝶啶基)甲基] 丙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(依达曲沙)。
在特别的实施方式中，新的叶酸/抗叶酸剂类似物放射药剂是式I 化合物，
其中
A是氨基酸，
B是5-或6-元杂环，包含至少一个独立选自N、O和S的杂原子，
X1至X5相互独立地是N或C，
R1，R2相互独立地是H，Hal，-OR7，-NR8R9，C1-C12烷基， C1-C12烷氧基，C1-C12烷酰基，C2-C12烯基，C2-C12炔基，(C1-C12 烷氧基)羰基，和(C1-C12烷基氨基)羰基，其中R7是H或C1-C6烷基和 R8、R9相互独立地选自H，甲酰基，直链或支化的C1-C12烷基，其是未经取代的或被下述中至少一种取代：CN，Hal，或NO2，并且其中嵌入的、不相邻的CH2基团中的一个或多个可以独立地用下述替换：-O-， -CO-，-CO-O-，-CO-NR’-，-CH＝CH-，-C≡C-，其中R’是H，C1-C6 烷基，
R3，R4相互独立地是H，甲酰基，亚氨基甲基，亚硝基，C1-C12 烷基，C1-C12烷氧基，C1-C12烷酰基，卤代的C1-C12烷酰基，
p是0、1或2，
q具有1至7的值，和
r是0或1。
在一种优选的实施方式中，本发明涉及式I化合物，其中5-或6- 元杂环是具有至少一个氮、氧或硫原子的5-元杂环，由式Ia代表，
其中
A是氨基酸，
Z1至Z3相互独立地是N、O、S或C，条件是Z1、Z2和Z3中至少一个是N、O或S，
X1至X5相互独立地是N或C，
R1，R2相互独立地是H，Hal，-OR7，-NR8R9，C1-C12烷基，C1-C12烷氧基，C1-C12烷酰基，C2-C12烯基，C2-C12炔基，(C1-C12 烷氧基)羰基，和(C1-C12烷基氨基)羰基，其中R7是H或C1-C6烷基和 R8、R9相互独立地选自H，甲酰基，直链或支化的C1-C12烷基，其是未经取代的或被下述中至少一种取代：CN，Hal，或NO2，并且其中嵌入的、不相邻的CH2基团中的一个或多个可以独立地用下述替换：-O-， -CO-，-CO-O-，-CO-NR’-，-CH＝CH-，-C≡C-，其中R’是H，C1-C6 烷基，
R3，R4相互独立地是H，甲酰基，亚氨基甲基，亚硝基，C1-C12 烷基，C1-C12烷氧基，C1-C12烷酰基，卤代的C1-C12烷酰基，
p是0、1或2，
q具有1至7的值，和
r是0或1。
在优选的实施方式中，5-元杂环是吡咯或吡咯烷，呋喃或四氢呋喃，或噻吩或四氢噻吩，也即其中(a)Z1是N、O或S和Z2、Z3是C或(b)Z2是N、O或S和Z1，Z3是C；或(c)Z3是N、O或S和Z1、Z2是C；或 5-元杂环是咪唑或咪唑烷，或二氧杂环戊烷，或1,3-二硫杂环戊烷，也即其中(d)Z1、Z2均是N、O或S和Z3是C或(e)Z1，Z3均是N、O或S 和Z2是C；或5-元杂环是吡唑或吡唑烷或1,2-二硫杂环戊烷，也即其中 (f)Z2、Z3均是N或S和Z1是C；或5-元杂环是噁唑或噁唑烷，或噻唑或噻唑烷，也即其中(g)Z1和Z2之一是N和Z1和Z2之一是O或S和 Z3是C或(h)Z1和Z3之一是N和Z1和Z3之一是O或S和Z2是C；或 5-元杂环是异噁唑或异噁唑烷，或异噻唑或异噻唑烷，也即其中(i)Z2和 Z3之一是N和Z2和Z3之一是O或S和Z1是C；或5-元杂环是三唑或噁二唑或噻二唑，也即其中(j)Z1、Z2、Z2全部是N，或(k)Z1是O或S 和Z2、Z3均是N。
在又一优选的实施方式中，本发明涉及式I化合物，其中5-或6- 元杂环是6-元杂环，其具有至少一个氮、氧或硫原子，优选至少一个氮原子，由式Ib代表，
其中
A是氨基酸，
Z1至Z4相互独立地是N或C，条件是中至少一个Z1和Z4是N，
X1至X5相互独立地是N或C，
R1，R2相互独立地是H，Hal，-OR7，-NR8R9，C1-C12烷基，C1-C12烷氧基，C1-C12烷酰基，C2-C12烯基，C2-C12炔基，(C1-C12 烷氧基)羰基，和(C1-C12烷基氨基)羰基，其中R7是H或C1-C6烷基和 R8、R9相互独立地选自H，甲酰基，直链或支化的C1-C12烷基，其是未经取代的或被下述中至少一种取代：CN，Hal，或NO2，并且其中嵌入的、不相邻的CH2基团中的一个或多个可以独立地用下述替换：-O-，-CO-，-CO-O-，-CO-NR’-，-CH＝CH-，-C≡C-，其中R’是H，C1-C6 烷基，
R3，R4相互独立地是H，甲酰基，亚氨基甲基，亚硝基，C1-C12 烷基，C1-C12烷氧基，C1-C12烷酰基，卤代的C1-C12烷酰基，
p是0、1或2，
q具有1至7的值，和
r是0或1。
如上文定义，这种氮杂-杂环是吡啶，二嗪或三嗪。从而，在特定的实施方式中，本发明涉及式I化合物，其中(a)Z1是N和Z2、Z3、Z4是C或(b)Z4是N和Z1、Z2、Z3是C或(c)Z1、Z2是N和Z3、Z4是C 或(d)Z1、Z3是N和Z2、Z4是C或(e)Z1、Z4是N和Z2、Z3是C或(f)Z3、 Z4是N和Z1、Z2是C或(g)Z1、Z2、Z3是N和Z4是C或(h)Z1、Z3、 Z4是N和Z2是C。
从而，本发明尤其涉及具有吡啶基团作为氮杂-杂环的式I化合物，也即其中Z1是N，由式II代表，或者其中Z4是N，由式III代表
其中
A是氨基酸，
Z1至Z4相互独立地是N或C，
X1至X5相互独立地是N或C，
R1，R2相互独立地是H，Hal，-OR7，-NR8R9，C1-C12烷基， C1-C12烷氧基，C1-C12烷酰基，C2-C12烯基，C2-C12炔基，(C1-C12 烷氧基)羰基，和(C1-C12烷基氨基)羰基，其中R7是H或C1-C6烷基和 R8、R9相互独立地选自H，甲酰基，直链或支化的C1-C12烷基，其是未经取代的或被下述中至少一种取代：CN，Hal，或NO2，并且其中嵌入的、不相邻的CH2基团中的一个或多个可以独立地用下述替换：-O-， -CO-，-CO-O-，-CO-NR’-，-CH＝CH-，-C≡C-，其中R’是H，C1-C6 烷基，
R3，R4相互独立地是H，甲酰基，亚氨基甲基，亚硝基，C1-C12 烷基，C1-C12烷氧基，C1-C12烷酰基，卤代的C1-C12烷酰基，
p是0、1或2，
q具有1至7的值，和
r是0或1。
更特别，本发明还涉及式I至III化合物，其中A是例如谷氨酸残余物，由式IVa或Ivb代表，
其中
X1至X5相互独立地是N或C，
X6，X7相互独立地是C、N或O，
R1，R2相互独立地是H，Hal，-OR7，-NR8R9，C1-C12烷基， C1-C12烷氧基，C1-C12烷酰基，C2-C12烯基，C2-C12炔基，(C1-C12 烷氧基)羰基，和(C1-C12烷基氨基)羰基，其中R7是H或C1-C6烷基和 R8、R9相互独立地选自H，甲酰基，直链或支化的C1-C12烷基，其是未经取代的或被下述中至少一种取代：CN，Hal，或NO2，并且其中嵌入的、不相邻的CH2基团中的一个或多个可以独立地用下述替换：-O-， -CO-，-CO-O-，-CO-NR’-，-CH＝CH-，-C≡C-，其中R’是H，C1-C6 烷基，
R3，R4相互独立地是H，甲酰基，亚氨基甲基，亚硝基，C1-C12 烷基，C1-C12烷氧基，C1-C12烷酰基，卤代的C1-C12烷酰基，
R5，R6相互独立地选自H，直链或支化的C1-C12烷基，其是未经取代的或被至少一个CN、Hal或NO2取代而其中嵌入的非相邻CH2基团中的一个或多个可以独立地用-O-、-CO-、-CO-O-、-CO-NR’-、 -CH＝CH-、-C≡C-替换，其中R’是H，C1-C6烷基，
p是0、1或2，
q具有1至7的值，和
r是0或1。
式IVa和IVb化合物的优选实施方式包括式IVc，IVd和Ive的化合物，
其中
X1至X7，R1至R9，R’，n，p，q和r如上文定义。
式Iva至IVe化合物的特别优选的实施方式包括化合物，其中例如 X1至X5是N，R1是NH2，R2是O，R3和R4都是H，p是0和q是1。
从而，在又一特定的实施方式中，本发明涉及式IVf和Ivg的化合物
其中
R5，R6相互独立地选自H，直链或支化的C1-C12烷基，其是未经取代的或被至少一个CN、Hal或NO2取代而其中嵌入的非相邻CH2基团中的一个或多个可以独立地用-O-、-CO-、-CO-O-、-CO-NR’-、 -CH＝CH-、-C≡C-替换，其中R’是H或C1-C6烷基。
式I至III的化合物的进一步实施方式包括化合物，其中氮杂-杂环是具有式Va，Vb，Vc，Vd的二嗪，
其中
X1至X5相互独立地是N或C，
X6，X7相互独立地是C、N或O，
Ra，Rb，Rc，Rd相互独立地是H或18F，条件是Ra、Rb、Rc、Rd之一是18F，
R1，R2相互独立地是H，Hal，-OR7，-NR8R9，C1-C12烷基， C1-C12烷氧基，C1-C12烷酰基，C2-C12烯基，C2-C12炔基，(C1-C12 烷氧基)羰基，和(C1-C12烷基氨基)羰基，其中R7是H或C1-C6烷基和 R8、R9相互独立地选自H，甲酰基，直链或支化的C1-C12烷基，其是未经取代的或被下述中至少一种取代：CN，Hal，或NO2，并且其中嵌入的、不相邻的CH2基团中的一个或多个可以独立地用下述替换：-O-， -CO-，-CO-O-，-CO-NR’-，-CH＝CH-，-C≡C-，其中R’是H，C1-C6 烷基，
R3，R4相互独立地是H，甲酰基，亚氨基甲基，亚硝基，C1-C12 烷基，C1-C12烷氧基，C1-C12烷酰基，卤代的C1-C12烷酰基，
R5，R6相互独立地选自H，直链或支化的C1-C12烷基，其是未经取代的或被至少一个CN、Hal或NO2取代而其中嵌入的非相邻CH2基团中的一个或多个可以独立地用-O-、-CO-、-CO-O-、-CO-NR’-、 -CH＝CH-、-C≡C-替换，其中R’是H，C1-C6烷基，
p是0、1或2，
q具有1至7的值，和
r是0或1。
式I至III化合物的进一步实施方式包括化合物，其中氮杂-杂环是三嗪具有式VIa，VIb，
其中
X1至X5相互独立地是N或C，
X6，X7相互独立地是C、N或O，
R1，R2相互独立地是H，Hal，-OR7，-NR8R9，C1-C12烷基， C1-C12烷氧基，C1-C12烷酰基，C2-C12烯基，C2-C12炔基，(C1-C12 烷氧基)羰基，和(C1-C12烷基氨基)羰基，其中R7是H或C1-C6烷基和 R8、R9相互独立地选自H，甲酰基，直链或支化的C1-C12烷基，其是未经取代的或被下述中至少一种取代：CN，Hal，或NO2，并且其中嵌入的、不相邻的CH2基团中的一个或多个可以独立地用下述替换：-O-，-CO-，-CO-O-，-CO-NR’-，-CH＝CH-，-C≡C-，其中R’是H，C1-C6 烷基，
R3，R4相互独立地是H，甲酰基，亚氨基甲基，亚硝基，C1-C12 烷基，C1-C12烷氧基，C1-C12烷酰基，卤代的C1-C12烷酰基，
R5，R6相互独立地选自H，直链或支化的C1-C12烷基，其是未经取代的或被至少一个CN、Hal或NO2取代而其中嵌入的非相邻CH2基团中的一个或多个可以独立地用-O-、-CO-、-CO-O-、-CO-NR’-、 -CH＝CH-、-C≡C-替换，其中R’是H，C1-C6烷基，
p是0、1或2，
q具有1至7的值，和
r是0或1。
在又一特定的实施方式中，基团R3、R4在本发明全部化合物显得优选相互独立地是H，甲酰基，亚氨基甲基，亚硝基，C1-C12烷基， C1-C12烷氧基，C1-C12烷酰基，卤代的C1-C12烷酰基。更优选，基团R3，R4相互独立地是H，甲基或甲酰基。
在又一特定的实施方式中，基团R5、R6在本发明全部化合物显得优选相互独立地是H或直链或支化的C1-C12烷基，其是未经取代的或被下述中至少一种取代：CN，Hal，或NO2，并且其中嵌入的、不相邻的 CH2基团中的一个或多个可以独立地用下述替换：-O-，-CO-，-CO-O-， -CO-NR’-，-CH＝CH-，-C≡C-，其中R’是H，C1-C6烷基。更优选，基团R5、R6相互独立地是H，甲基，乙基或叔丁基。
应理解，缩写"N"和"C"代表全部可能的饱和度，也即N包括-NH- 和-N＝连接而C包括-CH2-和-CH＝连接。
还应理解，(H)q代表所指环上(也即X3，C6，C7和X4上)的全部H 取代基。例如对于完全饱和的未经取代的类似物(X3＝X4＝N，p＝0)来说q＝5，或者对于完全饱和的未经取代的5,8-二脱氮类似物(X3＝X4＝C， p＝0)来说q＝7而对于完全不饱和的类似物(X3＝X4＝N，p＝0)来说q＝ 1。
式I至III化合物的优选实施方式包括化合物，其中例如X1至X5是N，R1是NY1Y2，R2是O，p是1和q是3。
从而，在又一特定的实施方式中，本发明涉及式VII和VIII化合物，
其中
A是氨基酸，
Z1至Z4相互独立地是N或C，
R3，R4相互独立地是H，甲酰基，亚氨基甲基，亚硝基，C1-C12 烷基，C1-C12烷氧基，C1-C12烷酰基，卤代的C1-C12烷酰基，和
Y1，Y2相互独立地选自H，甲酰基，直链或支化的C1-C12烷基，其是未经取代的或被至少一个CN、Hal或NO2取代而其中嵌入的非相邻CH2基团中的一个或多个可以独立地用-O-、-CO-、-CO-O-、 -CO-NR’-、-CH＝CH-、-C≡C-替换，其中R’是H或C1-C6烷基。
化合物VII和VIII的特定实施方式包括式IXa，IXb，IXc，IXd， IXe，IXf化合物
其中
Ra，Rb，Rc，Rd相互独立地是18F或H，条件是Ra、Rb、Rc、 Rd之一是18F，
R3，R4相互独立地是H，甲酰基，亚氨基甲基，亚硝基，C1-C12 烷基，C1-C12烷氧基，C1-C12烷酰基，卤代的C1-C12烷酰基，
R5，R6相互独立地是H，直链或支化的C1-C12烷基，其是未经取代的或被至少一个CN、Hal或NO2取代而其中嵌入的非相邻CH2基团中的一个或多个可以独立地用-O-、-CO-、-CO-O-、-CO-NR’-、-CH＝CH-、 -C≡C-替换，其中R’是H或C1-C6烷基，和
Y1，Y2相互独立地选自H，甲酰基，直链或支化的C1-C12烷基，其是未经取代的或被至少一个CN、Hal或NO2取代而其中嵌入的非相邻CH2基团中的一个或多个可以独立地用-O-、-CO-、-CO-O-、 -CO-NR’-、-CH＝CH-、-C≡C-替换，其中R’是H或C1-C6烷基。
式I至III化合物的优选实施方式也包括化合物，其中例如X1至 X5是N，R1是NY1Y2，R2是O，p是0和q是1。
从而，在又一特定的实施方式中，本发明涉及式X和XI化合物，
其中
A是氨基酸，
Z1至Z4相互独立地是N或C，
R4是H，甲酰基，亚氨基甲基，亚硝基，C1-C12烷基，C1-C12烷氧基，C1-C12烷酰基，卤代的C1-C12烷酰基，和
Y1，Y2相互独立地选自H，甲酰基，直链或支化的C1-C12烷基，其是未经取代的或被至少一个CN、Hal或NO2取代而其中嵌入的非相邻CH2基团中的一个或多个可以独立地用-O-、-CO-、-CO-O-、 -CO-NR’-、-CH＝CH-、-C≡C-替换，其中R’是H或C1-C6烷基。
化合物X和XI的特定实施方式包括式XIIa，XIIb，XIIc，XIId， XIIe，XIIf化合物
其中
Ra，Rb，Rc，Rd相互独立地是18F或H，条件是Ra、Rb、Rc、 Rd之一是18F，
R3，R4相互独立地是H，甲酰基，亚氨基甲基，亚硝基，C1-C12 烷基，C1-C12烷氧基，C1-C12烷酰基，卤代的C1-C12烷酰基，
R5，R6相互独立地是H，直链或支化的C1-C12烷基，其是未经取代的或被至少一个CN、Hal或NO2取代而其中嵌入的非相邻CH2基团中的一个或多个可以独立地用-O-、-CO-、-CO-O-、-CO-NR’-、-CH＝CH-、 -C≡C-替换，其中R’是H或C1-C6烷基，和
Y1，Y2相互独立地选自H，甲酰基，直链或支化的C1-C12烷基，其是未经取代的或被至少一个CN、Hal或NO2取代而其中嵌入的非相邻CH2基团中的一个或多个可以独立地用-O-、-CO-、-CO-O-、 -CO-NR’-、-CH＝CH-、-C≡C-替换，其中R’是H或C1-C6烷基。
其它实施方式是式I至III化合物，其中X1至X5是N，R1和R2是NH2，R3是H，R4是CH3，p是0，和q是1。
从而，在又一特定的实施方式中，本发明涉及式XIII和IVX化合物，
其中
A是氨基酸，和
Z1至Z4相互独立地是N或C，
化合物XIII和IVX的特定实施方式包括式XVa，XVb，XVc，XVd， XVe，XVf化合物
其中
Ra，Rb，Rc，Rd相互独立地是18F或H，条件是Ra、Rb、Rc、 Rd之一是18F，和
R5，R6相互独立地是H或者直链或支化的C1-C12烷基，其是未经取代的或被至少一个CN、Hal或NO2取代而其中嵌入的非相邻CH2基团中的一个或多个可以独立地用-O-、-CO-、-CO-O-、-CO-NR’-、 -CH＝CH-、-C≡C-替换，其中R’是H或C1-C6烷基。
其它实施方式是式I至III化合物，其中X1至X5和R1和R2是N， R4＝R5＝R6是H，R3是CH3或甲酰基，p是1和q是4。
从而，在又一特定的实施方式中，本发明涉及式XVI和XVII化合物，
其中
A是氨基酸，
Z1至Z4相互独立地是N或C，和
R3是H，甲基-或甲酰基-。
化合物XVI和XVII的特定实施方式包括式XVIIIa，XVIIIb， XVIIIc，XVIIId，XVIIIe，XVIIIf的化合物
其中
Ra，Rb，Rc，Rd相互独立地是18F或H，条件是Ra、Rb、Rc、 Rd之一是18F，
R3是H，甲基-或甲酰基-，和
R5，R6相互独立地是H或者直链或支化的C1-C12烷基，其是未经取代的或被至少一个CN、Hal或NO2取代而其中嵌入的非相邻CH2基团中的一个或多个可以独立地用-O-、-CO-、-CO-O-、-CO-NR’-、 -CH＝CH-、-C≡C-替换，其中R’是H或C1-C6烷基。
术语"烷基"，在单独或组合使用的情况下，是指含有所指数量的 C-原子的直链或支化的烷基，一般含有1至12，优选1至8，更优选1 至4个碳原子，比如甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，仲丁基，异丁基，叔丁基，戊基，异戊基，新戊基，己基等。
如本文所用，术语"烯基"(也即具有至少一个双键的如前文所定义的烷基)，单独或与其它基团组合，是指含有2至12个碳原子的直链或支化的烯基，比如甲烯基(methylene)，乙烯基，丙烯基，异丙烯基，丁烯基，叔丁烯基，仲丁烯基，异丁烯基，戊烯基，异戊烯基(isoamylene)，戊烯基，异戊烯基(isopentylene)，己烯基等。优选的烯基含有2至8个碳原子。
术语"炔基"(也即具有至少一个三键的如前文所定义的烷基)如本文所用是指线性或支化的碳原子链，具有一个或多个碳-碳三键。优选的炔基含有2至12个，更优选2至8个碳原子。
术语"烷氧基"如本文所用是指用氧取代的如前文所定义的烷基，比如甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，丁氧基，叔丁氧基等。
术语"烷酰基"如本文所用是指甲酰基或末端用羰基取代的如前文所定义的烷基，比如乙酰基，丙酰基，丁酰基，戊酰基等。
术语"烷基氨基"如本文所用是指用氮取代的如前文所定义的烷基，包括一烷基氨基比如甲基氨基，乙基氨基，丙基氨基，叔丁基氨基等，和二烷基氨基比如二甲基氨基，二乙基氨基，甲基丙基氨基等。
术语"卤代"如本文所用是指任意17族元素，包括氟，氯，溴，碘，和砹。
措辞"任选经取代的"优选包括用羟基，烷氧基，(二)烷基氨基，烷基磺酰基，烷基羰基，烷基羰氧基，烷氧羰基，羧基，Hal，CN，NO2取代。
在优选的实施方式中，R1和R2相互独立地是H，-OR”，-NHR”，其中R”是H，C1-C6烷基，C1-C4烷氧基，C1-C4烷酰基，(C1-C4烷氧基)羰基，和(C1-C6烷基氨基)羰基，更优选R1和R2相互独立地是-OH， NH2。
在优选的实施方式中，R3和R4相互独立地是H，甲基或甲酰基。
在优选的实施方式中，R5和R6相互独立地是H，甲基，乙基或叔丁基。
在优选的实施方式中，R’是H，甲基或乙基。
在优选的实施方式中，R7是H，甲基或乙基。
在优选的实施方式中，R8是H，甲基或乙基。
在优选的实施方式中，Y1和Y2相互独立地是H，甲基或乙基。
在又一方面本发明提供合成本发明化合物的方法。申请人已发现，本发明的叶酸放射药剂可以通过用[18F]氟化物直接放射性标记获得。
18F核素通常可以以亲电的[18F]F2获得，并且如本文一般所用，以亲核的[18F]氟化物获得。在[18F]氟化物形式中，氟-18可更有效地产生。此外，这是充分制备无载体添加的放射性示踪剂的仅有可能性。
从而，在特定的实施方式中，本发明制备方法包括下述步骤：提供前体，其是携带适于由[18F]氟化物取代的取代基的氮杂叶酸，并且将所述前体与[18F]氟化物反应，所述氟化物通过相转移催化剂比如四丁基碳酸铵或氨基聚醚(例如)和与之组合的碳酸钾或草酸钾活化，以形成本发明化合物。
一般地，适于由[18F]氟化物取代的取代基是吸电子基团，其充当离去基团和从而能够被进入的[18F]氟化物交换或者可以充当用于引入[18F] 氟化物的活化剂。适宜的吸电子基团包括-NO2，-CN，-SO3R’，-COOR’， -COR’，-F，-Cl，-Br。措辞"包含五、六或十元环系等的碳环和杂环基团"优选包括苯基，萘基，氮杂环丁烷基，吡咯烷基，咪唑基，吲哚基，噁二唑基，噻二唑基，三唑基，四唑基，噁三唑基，硫杂三唑基，哒嗪基，吗啉基，嘧啶基，吡嗪基，吡啶基，喹啉基，异喹啉基，哌啶基，吡唑基，咪唑并吡啶基和哌嗪基；更优选苯基，萘基，吡咯烷基，咪唑基，三唑基，嘧啶基，吡啶基，哌啶基，和吡唑基；最优选苯基，吡啶基和萘基。
从而，在优选的实施方式中，叶酸放射药剂以直接标记方法基于18F-替换-硝基-或18F-替换-氯的交换而获得。
在典型反应中，将溶于适宜有机溶剂的前体加至无水18F-氟化物- 穴状化合物。将所得混合物加热至适当温度和持续适宜的反应时间，例如约160℃持续10分钟。在短柱纯化之后，在碱性或酸性条件下进行脱保护和温和加热10分钟。中和粗制产品溶液和注射至半制备型HPLC 系统。收集放射性产品和通过又一固相萃取或通过氮气流除去HPLC溶剂，减压和温和加热。对于配制剂，将无水产品再溶解于生理学溶液和用无菌滤器转移至无菌小瓶。
在又一方面本发明提供本发明的叶酸放射药剂用于方便且有效地给药至有需要的受试者以进行诊断成像的用途。
因此，本发明提供表达叶酸受体的细胞或细胞群体的诊断成像的方法，所述方法包括以诊断成像量给予至少一种本发明的叶酸放射药剂，并获得所述细胞或细胞群体的诊断图像的步骤。
上述成像可以对表达叶酸受体的细胞或细胞群体在体外或在体内进行。
因此，本发明提供体外检测组织样品中的表达叶酸受体的细胞的方法，其包括在足以允许结合发生的时间和条件下将所述组织样品与有效量的至少一种本发明的叶酸放射药剂接触，并通过比如放射自显影术等的技术检测该结合。
在又一方面本发明提供本发明的叶酸放射药剂用于方便且有效地给药至有需要的受试者以进行诊断成像或监测癌症和炎性疾病和自身免疫病的治疗的用途。
在又一方面本发明提供同时诊断和治疗的方法，包括以诊断有效量向有此需要的受试者给予与治疗活性剂组合的至少一种本发明的叶酸放射药剂，并获得所述组织的诊断图像以跟踪治疗步骤的过程。
本发明方法的受试者优选是哺乳动物，比如动物或人类，优选人类。
剂量取决于所希望效果的性质，比如诊断或治疗的形式，治疗的类型和频率，诊断仪器设备，制剂应用形式，和接受者的年龄、体重、营养和病况，同时治疗的类型(如果存在)。
然而，最优选的剂量能够根据单独受试者定制，对此本领域技术人员可以理解并且不加过度试验即可确定。这一般牵涉标准剂量的调整，例如，如果患者具有低体重则降低剂量。
治疗能够以在最佳量以下的较小量开始，可以将其增加以便实现最佳效果。
本发明的叶酸放射药剂可以作为重复给药给予或优选作为单次给药给予。例如，本发明的叶酸放射药剂可以通过静脉内弹丸注射(bolus injection)给予受试者。用于注射的适宜形式包括本发明的上述叶酸放射药剂的无菌水溶液或分散液。
对于待注射的溶液，优选的单元剂量是约0.01ml至约10ml。在例如静脉内给药之后，如果希望，在放射标记的试剂已给予受试者之后 30分钟至4小时，能够发生器官或肿瘤的体内成像。一般地，足量的给药剂量将蓄积在靶标区域。
叶酸放射药剂优选通过HPLC纯化。在除去HPLC纯化的溶剂之后，产物优选溶于生理学溶液比如0.9％NaCl或0.15M磷酸缓冲溶液，在施用之前，将配制的放射药剂经由无菌滤器转移至无菌小瓶。
本发明的叶酸放射药剂还可以用于体外检测取自受试者的组织活检中的表达叶酸受体的细胞。因此，在又一实施方式中本发明提供体外检测组织样品中的表达叶酸受体的细胞例如肿瘤细胞或者激活的巨噬细胞的方法，其包括在足以允许结合发生的时间和条件下将所述组织样品与有效量的本发明的叶酸放射药剂接触，并通过成像技术检测上述结合。
样品能够通过技术人员已知的程序来收集，例如通过收集组织活检或体液，通过抽吸气管或肺样品等。
待测试的组织样品包括怀疑含有表达叶酸受体的细胞的任意组织比如肿瘤细胞、上皮细胞、肾、胃肠道或肝胆管系统，激活的巨噬细胞，单核细胞等。样品能够例如用切片机进行切片以使得便于进行微观检查和观察。还能够在与本发明的叶酸放射药剂之一温育之前或在其之后用适当固定剂固定样品以改善样品组织的组织学品质。
足以将本发明的叶酸放射药剂结合至细胞上的叶酸受体的时间和条件包括标准组织培养条件，也即能够在体外培养样品并与本发明化合物或组合物之一在生理学培养基中进行温育。该条件是技术人员所熟知的。另选地，能够固定样品，然后在等渗缓冲剂或生理学缓冲剂中与本发明的叶酸放射药剂温育。
对于全部应用方便的是，在将要使用它们的场所或其附近制备本发明化合物或组合物。本文公开和要求保护的全部化合物和/或方法在本发明公开的前提下能够不加过度实验地制备和进行。本领域技术人员所明了的是在不背离本发明范围的前提下可以对本发明进行变化。本文提供的实施例期望是示例性而非穷举的；因此举例说明的实施例不应视为以任何方式限制本发明(也参见Betzel et al.Bioconj.Chem.2013,24: 205-214)。
实施例
如果并未提及其它，一般来说：试剂和溶剂购自Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Acros Organics或VWR International AG。全部化学品以供给状态使用。人类和小鼠(雌性CD-1)微粒体和NADPH再生系统购自BD biosciences。
分析型放射性-HPLC：分析型放射性-高效液相色谱(HPLC)进行如下：在Agilent1100系列HPLC系统上，配有GabiStar(Raytest)无线电探测器，用RP-18柱，Luna PFP(2)C18，(5μm，250×4.6mm， Phenomenex)，溶剂系统和梯度如下：洗脱液A是NaH2PO4/Na2HPO4缓冲剂(0.05M，pH 7.4)和洗脱液B是MeOH。以流速1ml/min使用0- 30分钟100％-70％A的梯度。从校准曲线确定比放射性，而所述曲线得自不同浓度的冷参比(cold reference)化合物。为了确定氯化前体(3’-氮杂-2’-氯-叶酸)的量，使用得自不同浓度的3’-氮杂-2’-氯-叶酸的标准曲线。
半制备型放射性-HPLC：为了纯化，放射性-HPLC进行如下：在半制备型HPLC系统上，配有Smartline Pump 1000，Smartline Manager 5000，Smartline UV检测器2500(Knauer)和GabiStar无线电探测器 (Raytest)。[18F]-3’-氮杂-2’-氟叶酸纯化如下：在RP-18柱上，Luna PFP(2) C18，(5μm，250×10mm，Phenomenex)，溶剂系统如下：洗脱液A是0.1％EtOH的NaH2PO4/Na2HPO4缓冲剂(0.05M，pH 7.4)溶液和洗脱液B是40％的EtOH的NaH2PO4/Na2HPO4缓冲剂(0.05M，pH 7.4)溶液。以流速4ml/min使用0-10分钟100％-85％A，10-25分钟等度85％A 的梯度。
放射性-UPLC：为了稳定性研究，使用超高效液相色谱法(UPLCTM， Waters)系统，配有Acquity UPLC BEH C18柱(1.7μm，2.1×50mm， Waters)和重合检测器(FlowStar LB513，Berthold)，其采用下述溶剂系统：洗脱液A是NaH2PO4/Na2HPO4缓冲剂(0.05M，pH 7.4)和洗脱液B 是乙腈。以流速0.6ml/min使用0-4.0分钟100％-40％A的梯度。
制备无载体添加的[18F]氟化物：无载体添加的[18F]氟化物经由 Cyclone 18/9回旋加速器(IBA)的18O(p,n)18F核反应而制备。用2.1-ml 的靶，通过18MeV质子束辐射同位素97％富集的18O-水。用氦流将靶标体积(1.95ml)转移至热池。在阴离子交换柱(Sep-PakLight Accell Plus QMA，Waters)上捕集无载体添加的[18F]氟化物(40-80GBq)，所述柱是用碳酸钾水溶液(0.5M，5ml)和水(10ml)预调理的。
LogD的确定：用振摇-烧瓶-方法进行logD值的确定，其中放射性示踪剂在正辛醇与磷酸缓冲盐水(PBS)之间的分配系数得以(Wilson等人 2001Applied Radiation andIsotopes)。将正辛醇(0.5ml)和PBS(0.5ml) 在含有放射性样品(5-10μl)的离心管中混合。在室温下在高架摇动器中振摇管15分钟，之后离心(3分钟，5000rpm)。从各离心管，将50μl各相转移至小瓶，用于在γ-计数器中计数。log D值根据下述公式计算：log D7.4＝log[活性(辛醇相)/活性(PBS相)]。
细胞培养：KB细胞(人类宫颈癌细胞系，HeLa亚克隆；ACC-136) 购自GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures(DSMZ, Braunschweig,Germany)。在37℃在含有5％CO2的加湿气氛中，将细胞培养为单层。重要地，细胞在不含叶酸的细胞培养基FFRPMI(修饰的RPMI，不含叶酸、维生素B12和酚磺酞；Cell Culture TechnologiesGmbH，Gravesano/Lugano，瑞士)中培养。FFRPMI培养基用下述补充： 10％热灭活的胎牛血清(FCS，作为叶酸的唯一来源)，L-谷氨酰胺和抗生素(青霉素/链霉素/两性霉素B洗剂)。每周用PBS中的乙二胺四乙酸(2.5 mmol/l)进行两次常规培养处理。
实施例1：合成前体N2-乙酰基-3’-氮杂-2’-硝基叶酸二-叔丁基酯
(a)合成N-(6-氨基-2-氯烟酰基)-L-谷氨酸二-叔丁基酯
在室温下，将6-氨基-2-氯烟酸(6g，34.8mmol，购自Anichem Inc.) 溶于N,N-二甲基甲酰胺(232ml)。将溶液冷却至0℃和加入三乙胺(11ml， 7.39g，73.0mmol)。在加入HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六-氟磷酸盐，14.5g，38.2mmol)之后，搅拌混合物5分钟。然后，在0℃加入二叔丁基-L-谷氨酸酯盐酸盐(10.8g，36.5mmol)。除去冷却浴，搅拌混合物18小时。冷却至-20℃之后，移除固体，用DMF(20ml) 洗涤。滤液减压蒸发至干，将残余物溶于乙酸乙酯(400g)和甲基-叔丁基醚(200g)的混合物。洗涤溶液：三次用水(总共150ml)，三次用1M NaHCO3水溶液(总共150ml)和三次用饱和NaCl水溶液(总共150ml)。有机层在硫酸镁上干燥(10g)和减压蒸发至干。残余物通过柱色谱法在硅胶上纯化(正己烷/乙酸乙酯7:3至5:5)，提供N-(6-氨基-2-氯烟酰基)-谷氨酸-二叔丁基酯，是淡黄色固体。收率：6.8g(36.5mmol，47.3％)。
HR-MS(ESI，样品溶于CH2Cl2)：C19H29ClN3O5的m/z[MH]+计算值：414.1790；实测值：414.1789
1H-NMR(200MHz，DMSO-d6)：δ＝1.39(s，9H，OtBu)，1.41(s， 9H，OtBu)，1.71-2.07(m，2H，C(β)H2)，2.33(t，2H，C(γ)H2)，4.18-4.29 (m，1H，CαH)，6.40(d，1H，4'Harom，J2＝8.3Hz)，6.69(s，2H，NH2)， 7.47(d，1H，5'Harom，J2＝8.3Hz)，8.36(d，1H，NH，J3＝7.6Hz)。
13C-NMR(200MHz，DMSO-d6)：26.6，28.2，31.6，52.9，80.2， 81.1，106.3，118.9，140.1，146.2，160.6，166.2，171.2，172.0。
(b)合成N2-乙酰基-3’-氮杂-2’-氯叶酸二-叔丁基酯
将N-(6-氨基-2-氯烟酰基)-谷氨酸-二叔丁基酯(0.5g，1.27mmol) 和N2-乙酰基-6-甲酰基蝶呤(0.3g，1.21mmol)溶于乙酸(30ml)。在加入原硅酸四乙酯(0.54ml，1.27mmol)之后，在55℃搅拌混合物6小时。在冷却至室温过夜后，加入三乙酰氧基硼氢化钠(0.27g，2.42mmol)，在室温下搅拌混合物1小时。在加入正己烷(18g)和水(8g)之后，分离有机层，水层减压蒸发至干。将残余物悬浮于水(9g)和乙腈(1g)的混合物。移除固体，用水(总共10g)洗涤2次，提供粗制的N2-乙酰基-3‘-氮杂-2‘- 氯叶酸二叔丁基酯(0.77g)。粗制产品纯化如下：在水和乙腈中用10％至 25％的增加百分比的乙腈混合物中反复消化，提供N2-乙酰基-3‘-氮杂-2‘- 氯叶酸二叔丁基酯，是橙固体。收率：0.61g(0.911mmol，75％)。
HR-MS(ESI，样品溶于MeOH/CH2Cl2/1:1)：C28H35ClN8NaO7的 m/z[MH]+计算值：653.2209；实测值：653.2211
1H-NMR(200MHz，DMSO-d6)：δ＝1.37(s，9H，OtBu)，1.39(s， 9H，OtBu)，1.75-1.82(m，1H，C(β)H)，1.92-1.99(m，1H，C(β)H')， 2.20(s，3H，CH3)，2.28-2.32(m，2H，C(γ)H2)，4.21(m，1H，C(α)H)， 4.72(d，2H，C(6)CH2，J＝5.8Hz)，6.71(s，1H，4'Harom)，8.00(bt， 1H，NH)，8.04(s，1H，5'Harom)，8.50(d，1H，NH(Glu)，J＝7.5Hz)， 8.83(s，1H，C(7)H)，11.9(bs，1H，NH)，12.3(bs，1H，NH)。
13C-NMR(200MHz，DMSO-d6)：24.4，26.5，28.1，28.2，31.5， 44.5，52.8，80.3，81.1，107.1，119.6，130.9，139.7，145.9，149.7， 150.2，152.4，154.9，158.6，159.7，166.1，171.1，171.9，174.6。
(c)合成N-(6-氨基-2-硝基烟酰基)-L-谷氨酸二叔丁基酯
合成按照描述于实施例1a)的程序实现，但是用6-氨基-2-硝基烟酸而不是6-氨基-2-氯-烟酸。
(d)合成N2-乙酰基-3’-氮杂-2’-硝基叶酸二-叔丁基酯
合成按照描述于实施例1b)的程序实现，但是用N-(6-氨基-2-硝基烟酰基)-L-谷氨酸二叔丁基酯而不是N-(6-氨基-2-氯烟酰基)-谷氨酸-二叔丁基酯。
实施例2：合成无载体添加的3'-氮杂-2’-[18F]氟叶酸
用碳酸铯(2.8mg)和Kryptofix 2.2.2(5mg)在乙腈(1.4ml)和水(0.6 ml)混合物中的溶液，将捕集在阴离子交换柱上的无载体添加的[18F]氟化物直接洗脱入5ml密封的反应容器。在90℃减压和氮气流除去溶剂。随后，加入无水乙腈(3×1ml)和蒸发至干。然后，在90℃仅施加真空10分钟。
将前体，N2-乙酰基-3’-氮杂-2’-氯叶酸二-叔丁基酯(2.50mg， 3.96μmol)或另选地N2-乙酰基-3’-氮杂-2’-硝基-叶酸二-叔丁基酯，加至二甲亚砜(300μl)中的无水[18F]氟化物-穴状化合物复合物。将混合物加热至160℃10分钟。在冷却10分钟之后，加水(5ml)，将混合物通过反相柱(Sep-Pak C18Plus；Waters)，该柱是用甲醇(5ml)预调理和用水(10ml)冲洗的。已加载的柱用水洗涤(3×8ml)。用乙腈(2ml)将18F-标记的保护的中间体，N2-乙酰基-3’-氮杂2’-氟叶酸二-叔丁基酯，洗脱入又一5ml 密封的反应容器。在90℃减压和氮气流，将乙腈体积浓缩至大约0.1ml。为了水解，将氯化氢溶液(4M，1.25ml)加入，在60℃加热混合物10分钟。在冷却5分钟之后，混合物用加入的氢氧化钠溶液(5M，1.0ml)中和，用NaH2PO4/Na2HPO4缓冲剂(0.05M，pH 7.4，2.5ml)稀释至总体积5ml。将溶液注射入半制备型放射性-HPLC系统。将含有6％EtOH 的所收集的产品级分(tR＝21分钟)通过无菌滤器移至无菌、无热原小瓶，以备进一步实验(体外和体内)。
衰变-校正的放射化学收率的范围是5-15％(0.5-2.75GBq)。品质控制在分析型放射性-HPLC(图2)上进行。放射化学纯度大于98％和比放射性的范围是45-126.8GBq/μmol。
氯化副产物的量是小于17μg/mL的配制产品溶液(1-16.3μmol/ml 范围)。总合成时间是约85分钟和[18F]-3’-氮杂-2’-氟叶酸的鉴定由与参比化合物3’-氮杂-2'-[19F]氟叶酸共注射来确认。放射性标记条件的概要示于表1。
表1合成3'-氮杂-2'-[18F]氟叶酸的条件：
Log D7.4测量：为了评价亲脂性，[18F]-3’-氮杂-2’-氟--叶酸在正辛醇/PBS中的分配系数经测定是-4.2±0.1(n＝10)，这指出[18F]-3’-氮杂-2’- 氟--叶酸很亲水的特性。
实施例3：3’-氮杂-2’-[18F]氟-叶酸的模块GMP-放射性合成
放射性示踪剂3’-氮杂-2’-[18F]氟-叶酸的GMP制备在自动化合成组件上进行。将无载体添加的[18F]氟化物捕集在阴离子交换柱上，通过使用碳酸铯(2.8mg，在0.35ml H2O中)和Kryptofix 2.2.2(6.5mg，在 0.35ml乙腈中)的混合物直接洗脱入反应器中。在120℃减压和氮气流除去溶剂。加入乙腈(0.1ml)和蒸发至干。
将N2-乙酰基-3’-氮杂-2’-氯叶酸二-叔丁基酯(2.50mg，3.96μmol) 的DMSO(400μL)前体溶液加至无水[18F]氟化物-穴状化合物复合物。将混合物加热至150℃持续17分钟。然后，将4M HCl(1.0ml)直接加至反应器，在60℃实现水解10分钟。反应混合物用H2O(9ml)稀释和加载于活化的MCX柱上和用H2O(5ml)洗涤。通过用10％MeOH在50 mM磷酸缓冲剂pH7.4(4ml)中构成的溶液冲洗柱，洗脱放射性示踪剂。将洗脱液注射入半制备型放射性-HPLC系统。收集的产品级分(tR＝21.1 分钟)用4M HCl(0.5ml)酸化和加载于又一MCX柱。在用H2O(5ml) 冲洗柱之后，用10％EtOH/50mM磷酸缓冲剂pH 7.4(5mL)洗脱放射性示踪剂，用0.9％NaCl水溶液(9mL)稀释。
合成终点的衰变-校正的放射化学收率的范围是7-16％(2.4-6.0 GBq)。品质控制在分析型放射性-HPLC上进行。放射化学纯度大于99％和比放射性的范围是47-62GBq/μmol。
氯化副产物的量是小于0.1μg/ml的配制的产品溶液。总合成时间是约75分钟。放射性标记条件的概要示于表2。
表2：在自动化组件上合成3’-氮杂-2’-[18F]氟-叶酸的条件。
实施例4：合成无载体添加的[18F]-3’,5’-二氮杂-2’-氟叶酸
合成类似于实施例1至3地进行，但是用2-氨基-4-氯-5-嘧啶羧酸(购自AbbyPharmatech，LLC)而不是6-氨基-2-氯烟酸。
实施例5：合成[19F]-参比化合物
(a)合成N-(6-氨基-2-氟烟酰基)-L-谷氨酸-二叔丁基酯
向6-氨基-2-氟烟酸的盐酸盐(5.72g，29.7mmol，购自Anichem Inc.) 的N,N-二甲基甲酰胺(50ml)溶液加入N-羟基琥珀酰亚胺(6.83g，59.3 mmol)。冷却至0℃之后，在10分钟内滴加三乙胺(15.01g，148.3mmol)。将混合物温热高至室温和在5分钟内加入N,N-二异丙基碳二亚胺(6.9 ml，44.5mmol)。在29小时之后，在5分钟内滴加谷氨酸二叔丁基酯盐酸盐(17.6g，59.3mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(114ml)溶液。在21小时之后，移除固体，用N,N-二甲基甲酰胺(总共40ml)洗涤2次。合并滤液和洗涤液，用乙酸乙酯(500ml)和二异丙基醚(500ml)稀释。溶液用水(总共1000ml)洗涤5次。有机层在硫酸镁(60g)上和在氧化铝(10g)上干燥，减压蒸发至干。将乙腈(57.9g)加至残余物，移除固体，用乙腈(总共20g) 洗涤。合并洗涤液和滤液，在40℃减压蒸发至干。残余物通过柱色谱法在硅胶上纯化(正己烷/乙酸乙酯7:3至0:1，Rf＝0.46，正己烷/乙酸乙酯 7:3)，在蒸发产品级分之后提供N-(6-氨基-2-氟烟酰基)-L-谷氨酸-二叔丁基酯，是结晶的固体。收率：2.27g(5.7mmol，19％)。
HR-MS(ESI，样品溶于水/CH3CN/1:1)：C19H29FN3O5的m/z [MH]+计算值：398.2086；实测值：398.2083
1H-NMR(200MHz，DMSO-d6)：δ＝1.37(s，9H，OtBu)，1.41(s， 9H，OtBu)，1.79-1.98(m，2H，C(β)H2)，2.29(t，2H，C(γ)H2)，4.33(m， 1H，C(α)H)，6.36(dd，1H，4'Harom，3JHH＝8.4Hz，5JFH＝2.2Hz)， 6.91(bs，2H，NH2)，7.78-7.87(m，2H，NH，5'Harom)。
13C-NMR(400MHz，DMSO-d6)：26.1，27.6，27.7，31.1，52.3， 79.7，80.7，101.6(d，2JCF＝27.4Hz)，104.7(d，4JCF＝2.8Hz)，142.1(d，3JCF＝3.0Hz)，160.0(d，1JCF＝237.0Hz)，160.7(d，3JCF＝19.3Hz)， 162.9(d，3JCF＝6.5Hz)，170.8，171.5。
(b)合成N2-乙酰基-3‘-氮杂-2‘-氟叶酸二叔丁基酯
在室温下将N2-乙酰基-6-甲酰基蝶呤(1.17g，5.03mmol)悬浮于乙酸(25ml)。在30分钟内，将N-(6-氨基-2-氟烟酰基)-L-谷氨酸-二叔丁基酯(1.00g，2.52mmol)的乙酸(35ml)溶液滴加至悬浮液。在室温下2小时之后，已形成透明溶液，加入分子筛4A(10g)。再过2.5小时之后，加入第二部分的分子筛4A(10g)。在2小时之后加入三乙酰氧基硼氢化钠(0.5g，2.39mmol)和在又1小时之后加入第二部分的三乙酰氧基硼氢化钠(0.5g，2.39mmol)。在室温下16小时之后，加入第三部分的三乙酰氧基硼氢化钠(0.53g，2.52mmol)。在又2.5小时之后，从反应混合物移除固体，用乙酸(30ml)洗涤。将滤液滴加至水(150ml)和乙腈(30ml)的混合物。然后滴加水(100ml)。将混合物冷却至4℃持续2小时，移除沉淀的产品。产品悬浮于水(总共40g)4次，然后在P2O5上减压干燥，提供N2-乙酰基-3‘-氮杂-2‘-氟叶酸二叔丁基酯，是灰白色粉末。收率：1.10 g(1.79mmol，71％)。
HR-MS(ESI，样品溶于水/CH3CN/1:1)：C28H36FN8O7的m/z [MH]+计算值：615.2685；实测值：615.2677
1H-NMR(200MHz，DMSO-d6)：δ＝1.37(s，9H，OtBu)，1.40(s， 9H，OtBu)，1.80-2.07(m，2H，C(β)H2)，2.21-2.32(t，2H，C(γ)H2)， 4.29(m，1H，C(α)H)，4.71(d，2H，C(6)CH2)；6.56(dd，1H，4'Harom，3JHH＝8.4Hz，5JFH＝2.2Hz)，7.83(dd，1H，4'Harom，3JHH＝8.4Hz，4JFH＝10.0Hz)，7.91(dd，1H，NH(Glu)，3JHH＝7.4Hz，4JHH＝4.5Hz)， 8.29(t，1H，3JHH＝5.7Hz)，8.88(s，1H，C(7)H)，11.94(bs，1H，N(3)H)， 12.28(bs，1H，NHAc)。
13C-NMR(400MHz，DMSO-d6)：23.9，26.1，27.7，27.6，31.1， 44.1，52.3，79.7，80.7，102.5(d，2JCF＝28.3Hz)，105.4，130.5，141.7， 149.3，149.4，151.7，154.5，158.9(d，3JCF＝17.8Hz)，159.3，159.8(d，1JCF＝237.6Hz)，162.9(d，3JCF＝6.5Hz)，170.7，171.5，174.1。
(c)合成3‘-氮杂-2‘-氟叶酸
将N2-乙酰基-3‘-氮杂-2‘-氟叶酸二叔丁基酯(0.6g，1mmol)悬浮于 1M盐酸水溶液(16ml)和乙腈(1.6ml)的混合物。将悬浮液加热至60℃持续2小时。冷却至4℃之后，移除沉淀产品，用水(总共10ml)洗涤，在 P2O5上减压干燥，提供粗制3‘-氮杂-2‘-氟叶酸，是浅黄色粉末。收率： 0.4g(0.9mmol，88％)。将粗制的3‘-氮杂-2‘-氟叶酸(0.27g，0.59mmol) 溶于水(2ml)和1M氢氧化钠水溶液(1.2ml)的混合物。溶液用炭(0.027g) 在70℃处理15分钟。移除炭，滤液冷却至0℃。加入2M盐酸水溶液(0.59 ml)沉淀产品。离心分离沉淀。从固体倾析母液，固体用水洗涤3次(总量：14.2ml)。固体残余物在20℃减压干燥，提供3‘-氮杂-2‘-氟叶酸，是黄色粉末。收率：78mg，(0.17mmol，29％)。
HR-MS(ESI，样品溶于CH2Cl2，用3-羟基皮考啉酸作为基质)： C18H18FN8O6的m/z[MH]+计算值：461.1328；实测值：461.1328。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ＝1.88-1.96(m，1H，C(β)H)，2.03-2.10 (m，1H，C(β)H')，2.14-2.24(m，2H，C(γ)H2)，4.24-4.26(m，1H，C(α)H)，4.57(s，2H，C(6)CH2)，6.47(dd，1H，5'Harom，3JHH＝8.6Hz，5JFH＝1.8Hz)，7.85(dd，1H，4'Harom，3JHH＝10.1Hz，4JFH＝8.6Hz)， 8.5(s，1H，C(7)H)。
13C-NMR(500MHz，D2O)：23.4，28.7，34.1，44.3，55.8，101.7，101.9，105.9，128.2，142.2，146.6，147.4，155.7，159.4，159.8，164.2， 165.2，165.3，173.2，178.8，181.5，182.3。
(d)合成N-(2-氨基-4-氟嘧啶-5-羰基)-L-谷氨酸-二叔丁基酯
合成按照描述于实施例5a)的程序实现，但是用2-氨基-4-氟-5-嘧啶羧酸(购自Abby Pharmatech，LLC)而不是6-氨基-2-氟烟酸。
(e)合成N2-乙酰基-3',5'-二氮杂-2‘-氟叶酸二叔丁基酯
合成按照描述于实施例5b)的程序实现，但是用N-(2-氨基-4-氟嘧啶-5-羰基)-L-谷氨酸二-叔丁基酯而不是N-(6-氨基-2-氟烟酰基)-L-谷氨酸-二叔丁基酯。
(f)合成3',5'-二氮杂-2‘-氟叶酸
合成按照描述于实施例5c)的程序实现，但是用N2-乙酰基-3',5'-二氮杂-2‘-氟叶酸二叔丁基酯而不是N2-乙酰基-3‘-氮杂-2‘-氟叶酸二叔丁基酯。
实施例6：分配系数
为了log D7.4确定而制备磷酸缓冲剂：制备KH2PO4(1.743g，12.81 mmol)和Na2HPO4·2H2O(9.596g，53.91mmol)的水(1000ml)溶液。制备磷酸缓冲剂在正辛醇中的饱和溶液和正辛醇在磷酸缓冲剂中的饱和溶液。将PBS溶液(500μl)和正辛醇溶液(500μl)移入离心管和加入放射性示踪剂(5-10μl)。在室温下在高架摇动器中振摇离心管15分钟。于5000rpm 离心分离两相3分钟。将各相(50μl)的等分试样转移入空离心管中，用于在γ-计数器(Wizard，PerkinElmer)中计数。通过计算正辛醇和PBS相中的计数比的对数，确定logD7.4值。各值代表来自两个独立实验的10 次测定的平均值。
logD7.4确定揭示[18F]-2’-氟-3’-氮杂-叶酸的亲水特性，所得值为 -4.2±0.1。
实施例7：稳定性实验
(a)人血浆稳定性
在人类血浆中在4小时期间在37℃测试放射性示踪剂的稳定性。配制产品(200μL)用磷酸钠缓冲剂(100μl)稀释，将等分试样(60μl，15MBq) 加至人血浆(500μL)，在37℃预温育。在Thermomixer compact (Eppendorf)上在37℃和500rpm振摇混合物。在数个时间点(0，30，60， 120，150和240分钟)之后，在示踪剂加入之后取用等分试样。将各等分试样(70μl)加至冰冷的MeOH(150μl)以沉淀蛋白。为了从沉淀分离上清液，于13400rpm(EppendorfMiniSpin)在室温下离心悬浮液10分钟。将上清液通过微过滤器(Sartorius StedimBiotech GmbH，Minisart RC 25，0.45μm)和在放射性-UPLC系统上分析。
(b)用肝微粒体的稳定性实验
向KH2PO4/K2HPO4缓冲剂(pH 7.4，0.5M，200μl)，NADPH再生系统A(50μl)，NADPH再生系统B(10μl)的混合物，加入[18F]-3’-氮杂-2’- 氟叶酸的等分试样(38μl，大约15MBq)，用水(677μl)充至975μl体积，在37℃预温育。然后，加入小鼠或人类肝微粒体(20mg/ml，25μl)和在37℃温育。在数个时间点(0，20，40和60分钟)之后，取用等分试样(100μl)，酶促反应通过将溶液冲入冰冷的甲醇(200μl)停止。各样品用 NaH2PO4/Na2HPO4缓冲剂(pH 7.4，0.05M，600μl)稀释。每个时间点进行三次重复，在放射性-UPLC系统上分析。作为阴性对照，不加微粒体或不加NADPH再生系统地温育样品。
作为阳性对照实验，将睾酮而不是放射性示踪剂与反应混合物一起温育。
(c)用肝谷胱甘肽的稳定性实验
将谷胱甘肽(0.1M，100μl)，S9-级分(20mg/ml，50μl)和 KH2PO4/K2HPO4缓冲剂(pH7.4，0.5M，200μl)用水稀释(612μl)至体积 772μl，加入[18F]-3’-氮杂-2’-氟叶酸(38μl，大约15MBq)。在37℃温育混合物。在数个时间点，取用等分试样(100μl)，反应通过将样品冲入冰冷的甲醇(200μl)停止。各样品用NaH2PO4/Na2HPO4缓冲剂(pH 7.4，0.05 M，600μl)稀释。每个时间点进行两次重复，在放射性-UPLC系统上分析。
总体来说，在调查(在1小时的时间间隔内)的全部时间点HPLC分析仅检测到未变化的产物，这指出不发生放射性-脱氟或代谢过程，和3’- 氮杂-2’-[18F]氟叶酸在调查的整个时间段是完全稳定的(图2)。
实施例8：体外的内化研究
将KB细胞接种于12-孔板中，生长过夜(～700,000细胞，在2ml FFRPMI培养基/孔中)。向各孔加入[18F]-3’-氮杂-2’-氟叶酸(25μL，170 kBq)。在某些情况下，将细胞与过量叶酸(100μM)温育以阻断KB细胞表面上的FRs。在37℃温育1小时或2小时之后，将细胞用PBS洗涤3 次，以确定3’-氮杂-2’-[18F]氟叶酸的总细胞吸收。为了评价内化的3’- 氮杂-2’-[18F]氟叶酸的级分，将KB细胞用反萃取缓冲剂(0.1M乙酸和 0.15M NaCl的水溶液，pH 3)洗涤，以从细胞表面释放FR-结合的放射性示踪剂。将1ml NaOH 1N加入各孔，实现细胞裂解。将细胞悬浮液转移至4ml管，在γ-计数器中计数样品。在涡旋器匀化之后，通过Micro BCA蛋白质测试试剂盒测定各样品的蛋白质浓度，以便将所测的放射性标准化为单个孔中的0.3mg蛋白质的平均含量。放射性产物的细胞吸收研究显示特异性的吸收和内化，原因是其可被过量叶酸阻断。在2小时温育之后，吸收是约78.17％的总细胞吸收和内化级分占18.56％。过量叶酸的共温育引起0.03％的放射性示踪剂吸收的抑制(图5)。
实施例9：离体代谢物研究
为了确定体内的放射性代谢物，将3’-氮杂-2’-[18F]氟叶酸(60-70 MBq)经静脉内注射入携带KB肿瘤的小鼠中(n＝2)。在5分钟之后，从对侧静脉吸取血液样品，在放射性示踪剂注射之后30分钟处死动物。收集全血，肝，肿瘤和尿。在4℃于5000g离心血液样品5分钟。血浆样品的蛋白通过加入等体积冰冷的甲醇来沉淀，随后离心。血浆的上清液和尿样品用PBS缓冲剂稀释，通过放射性-UPLC分析。肝和肿瘤组织分别在等体积PBS中用PT 1200C组织匀浆器(Kinematica AG)匀化。在加入等体积冰冷的MeOH之后，在4℃于5000g离心混合物5分钟。通过加入冰冷甲醇、随后离心清洁上清液的剩余蛋白。所得上清液级分用 PBS缓冲剂稀释，通过放射性-UPLC分析。
血浆样品(5分钟和30分钟)以及尿和肿瘤的样品的分析揭示不存在可检测量的代谢物。与之相对，肝样品的分析显示代谢征兆(图4)。
实施例10：叶酸受体结合亲和力
采用非放射性参比化合物3’-氮杂-2’-氟叶酸的结合测试用悬浮于 PBS pH 7.4的KB肿瘤细胞(7’000细胞/240μL每离心管)进行。温育细胞如下重复三次：用3H-叶酸(10μL，0.84nM)和增加浓度的3’-氮杂-2’-氟叶酸(5.0x 10-7至5.0x 10-12M，在250μL PBS pH7.4中)，在摇动器上在 4℃，持续30分钟。在过量叶酸(10-4M)存在下测得非特异性结合。在温育之后，含有细胞悬浮液的离心管在4℃离心5分钟，除去上清液。通过加入0.5ml NaOH1M，溶解细胞离心丸，转移入含有5ml闪烁混合物(Ultima Gold；Perkin Elmer)的闪烁管。放射性用液体闪烁分析仪测量(Tri-Carb 1900TR，Packard)和从置换曲线(displacementcurve)用 GraphPad Prism(版本5.01)软件测得50％的抑制性浓度。
非放射性参比化合物3’-氮杂-2’-氟叶酸的FR-结合亲和力的确定得到0.81±0.18nM的IC50值。该值与由天然叶酸(～0.9nM)测得的IC50-值范围相同，这指出叶酸衍生物3’-氮杂-2’-氟叶酸的基本保留的结合亲和力。
实施例11：生物分布研究
体内实验由当地兽医部门批准，并按照瑞士动物保护法进行。6至 8周龄的雌性无胸腺裸鼠(CD-1Foxn-1/nu)购自Charles河流实验室 (Sulzfeld，德国)。在肿瘤细胞接种之前5天开始，给动物喂食叶酸缺乏的啮齿动物膳食。用KB细胞(5x 106细胞，在100μL PBS中)接种入小鼠的双肩皮下组织。在肿瘤细胞接种之后大约14天进行动物实验。生物分布研究重复三次进行。将[18F]-3’-氮杂-2’-氟叶酸稀释于PBS pH 7.4中至所希望的放射性浓度(～5MBq每小鼠)，用于经由侧尾静脉快速给药。阻断研究进行如下：在临给药3’-氮杂-2’-[18F]氟叶酸之前，注射过量叶酸(100μg，在100μL PBS中)。
在给药放射性叶酸3’-氮杂-2’-[18F]氟叶酸之后30分钟、60分钟和 190分钟处死动物。收集挑选的组织和器官，称量，和在γ-计数器中计数放射性。结果表示为注射剂量/克组织重量的百分比[％ID/g]，用同时计数的初始注射物的定义样品作为参比计数。
所获结果概括于表2中，表示为注射剂量/克组织的百分比[％ID/g]，是3或4只动物的平均值(表2)。
表2[18F]-3’-氮杂-2’-氟叶酸([18F]-3)在携带KB肿瘤异种移植物的裸鼠中的生物分布数据
实施例12：PET成像研究
PET实验用eXplore VISTA PET/CT X线断层摄影机(GE)进行。用10-18MBq的3’-氮杂-2’-[18F]氟叶酸(100-150μl每注射)经由侧尾静脉注射携带小鼠的肿瘤。为了阻断研究，在放射性示踪剂注射之前10分钟，动物经由静脉内注射接受过量叶酸(100μg/100μl)。动物用空气/氧混合物中的异氟烷麻醉。120-150分钟p.i.进行PET扫描。在采集之后，以用户定义的时间框架重建PET数据。用PMOD(版本3.2)软件分析组合的 PET和CT数据组。
1.5-90分钟p.i.3’-氮杂-2’-[18F]氟叶酸和于60-150分钟p.i.进行小鼠的动力学PET扫描。[18F]-2’3’-氮杂-叶酸的静态PET扫描一般用 120-150分钟p.i.的扫描时间进行。示范性结果示于图6A/B和7。静态基线扫描(120-150分钟p.i.)显示在KB肿瘤异种移植物中的高(SUV 1.9) 和特异性的吸收(12.6±1.8％ID/g)(图6A和7A)。在其它非靶标器官中的吸收是可忽略的，仅有的例外是肝、肾和唾腺。用共注射叶酸(120-150 分钟p.i.)进行的研究显示在肿瘤组织和在肾中的减少的放射性示踪剂吸收(图6B)。
预注射PBS(100μl)中的培美曲塞(400μg，在放射性示踪剂之前60 分钟)显示放射性示踪剂的减少的肾吸收和肝蓄积的很强的减少，保持高的肿瘤吸收(图7B)。

Claims (11)

1.化合物，具有式IVf，
其中
R5，R6相互独立地是H，直链或支化的C1-C12烷基，其是未经取代的或被至少一个CN、Hal或NO2取代而其中嵌入的非相邻CH2基团中的一个或多个可以独立地用-O-、-CO-、-CO-O-、-CO-NR’-、-CH＝CH-、-C≡C-替换，其中R’是H，C1-C6烷基，
或其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1的化合物的制备方法，包括用[18F]氟化物直接放射性标记如权利要求1所定义的吡啶环的步骤。
3.根据权利要求1的化合物用于制备药物的用途，所述药物用于在体外或在体内的表达叶酸受体的细胞或细胞群体的诊断成像。
4.根据权利要求1的化合物用于制备药物的用途，所述药物用于方便且有效地给药至需要诊断成像的受试者。
5.根据权利要求1的化合物用于制备药物的用途，所述药物用于表达叶酸受体的细胞或细胞群体的诊断成像，其包括以诊断成像量给予至少一种根据权利要求1的化合物，并且获得所述细胞或细胞群体的诊断图像的步骤。
6.根据权利要求5的用途，其中对在体外或在体内表达叶酸受体的细胞或细胞群体进行所述诊断成像。
7.根据权利要求1的化合物用于制备药物的用途，所述药物用于体外检测在组织样品中表达叶酸受体的细胞，其包括在足够的时间和条件下将所述组织样品与有效量的根据权利要求1化合物接触以允许结合发生，并通过放射自显影术等的技术来检测上述结合。
8.根据权利要求1的化合物用于制备药物的用途，所述药物用于诊断成像或检测受试者，其包括以下步骤：(i)以诊断成像量给予至少一种根据权利要求1的化合物，和(ii)通过检测来自所述至少一种化合物的信号用PET进行诊断成像。
9.根据权利要求1的化合物用于制备药物的用途，所述药物用于在受试者中监测癌症或炎性疾病和自身免疫病的治疗，其包括以下步骤：(i)向有此需要的受试者给予与治疗活性剂组合的诊断成像量的至少一种根据权利要求1的化合物，和(ii)通过检测来自所述至少一种化合物的信号用PET进行诊断成像以跟踪癌症或炎性疾病和自身免疫病的治疗过程。
10.权利要求8的用途，其中所述的诊断成像或检测受试者与诊断或治疗癌症或者炎性疾病和自身免疫病的任何其它方法组合应用。
11.权利要求9的用途，其中所述的在受试者中监测癌症或炎性疾病和自身免疫病的治疗与诊断或治疗癌症或者炎性疾病和自身免疫病的任何其它方法组合应用。
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