CN117327144A - 一种靶向程序性死亡配体1的pet显像剂及其前体化合物的研制及其应用 - Google Patents

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李中婧
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Shenzhen Hospital Cancer Hospital Chinese Academy Of Medical Sciences
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Abstract

本发明提供一种靶向程序性死亡配体1的PET显像剂及其前体化合物的研制及其应用，属于药物领域。所述PET显像剂或其前体的PD‑L1结合力高，体内外稳定性高，药物动力学特性好，制备简单效率高；所述PET显像剂在体内显像背景信号低，显像清晰度高，具有优异的技术效果和良好的应用前景。

Description

一种靶向程序性死亡配体1的PET显像剂及其前体化合物的研 制及其应用
技术领域
本发明属于药物领域，具体涉及一种靶向程序性死亡配体1的PET显像剂及其前体化合物的研制及其应用。
背景技术
近年来，免疫疗法已成为一种突破性的癌症治疗方法。它的主要目标是刺激病人的免疫系统来对抗癌症。针对程序性死亡配体1(Programmed Death-Ligand 1，PD-L1)/程序性细胞死亡蛋白1(programmed death-1，PD-1)途径，免疫疗法在治疗不同类型的癌症，如黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌和膀胱癌等方面显示出显著的效果。然而，只有不到30％的患者从靶向PD-L1/PD-1途径的免疫检查点阻断中获益。研究表明，肿瘤组织中PD-L1的表达与抗PD-1/PD-L1免疫治疗的有效性相关。PD-L1阳性肿瘤患者在免疫治疗期间接受靶向PD-L1的单克隆抗体治疗显示出实质性的临床益处。因此，精确检测肿瘤中PD-L1的表达对指导临床治疗决策具有重要意义。
传统的检测PD-L1表达的方法，如免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF)有明显的局限性。这些方法依赖于组织切片，因此仅提供来自特定采样区域的信息，而无法捕获整个肿瘤中全面的PD-L1表达。此外，它们缺乏捕捉PD-L1表达动态变化的能力，并提供有限的定量测量。
PET具有高灵敏度、靶特异性和体内成像能力，有助于在生理条件下实时可视化靶表达。通过标记靶向PD-L1的单克隆抗体、肽或小分子抑制剂的放射性示踪剂，可以制备高度特异性的PET显像剂。通过PET成像分析，可以实现肿瘤患者PD-L1表达的无创、实时、定量检测。最近的报道描述了针对PD-L1的PET靶向探针，包括基于抗体的探针、基于肽的探针和小分子抑制剂。这些探针已被用于评估PD-L1在不同类型实体瘤患者中的表达状况。
放射性标记单克隆抗体(mab)作为分子探针具有较大的分子量和较长的生物半衰期，通常需要数天才能获得高对比度的图像。单克隆抗体使用长半衰期放射性核素标签通常会增加患者的辐射暴露。基于肽的显像剂具有较低的靶标特异性，其大分子结构给化学修饰带来了挑战，从而使其体内分布和药代动力学性质的调节复杂化。随着免疫检查点分子研究的深入，靶向PD-L1结合位点的小分子抑制剂被进一步开发。小分子抑制剂具有分子量低、易于修饰、在肿瘤微环境中扩散快、分布均匀、穿透实体瘤能力强等显著优势。
PET示踪剂[18F]LP-F(Xu Liang,et al."Design,Synthesis,and BiologicalEvaluation of a Small-Molecule PET Agent for Imaging PD-L1Expression."Pharmaceuticals 16.2(2023).
doi:10.3390/PH16020213.)，一种靶向PD-L1的小分子抑制剂，能够有效地区分体内不同表达水平的肿瘤。然而，它的应用受到高亲脂性的双芳基甲基芳基醚支架的限制。高亲脂性降低了[18F]LP-F的代谢清除率，导致其在心脏、肺、肝脏、肾脏和胃肠道等多个器官的积累增加。
因此，针对小分子PET核素探针的开发还需进一步的研究。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供以下技术方案。
第一方面，本发明提供一种化合物。
一种化合物，其包括式(A)所示化合物或其酯或药学上可接受的盐，
其中，L1和L2分别独立为间臂基团；
X为亲水性官能团；
Y为螯合剂基团。
在一些实施例中，所述化合物中的L1为-NH-R1-C(＝O)-NH-(CH2)n1-NH-；
R1为C1-C10直链亚烷基(如：亚甲基，亚乙基，亚正丙基、亚正丁基、亚正戊基、亚正己基、亚正庚基、亚正辛基、亚正壬基或亚正癸基)或-(CH2CH2O)m1(CH2)m2-；
n1为1、2、3、4、5或6；
m1为1、2、3、4、5或6；
m2为1、2、3、4、5或6。
在一些实施例中，所述化合物中的L1为
在一些实施例中，所述化合物中的L2为-NH-R2-C(＝O)-NH-；
R2为C1-C10直链亚烷基(如：亚甲基，亚乙基，亚正丙基、亚正丁基、亚正戊基、亚正己基、亚
正庚基、亚正辛基、亚正壬基或亚正癸基)或-(CH2CH2O)m3(CH2)m4-；
m3为1、2、3、4、5或6；
m4为1、2、3、4、5或6。
在一些实施例中，所述化合物中的L2为
在一些实施例中，所述化合物中的X为含脱氧葡萄糖结构的亲水基团或含至少一个水溶性氨基酸结构的亲水基团；或者X为含脱氧葡萄糖结构和至少一个水溶性氨基酸结构的亲水基团。
在一些实施例中，所述化合物中的X为
在一些实施例中，所述化合物中的Y为
在一些实施例中，所述式(A)所示化合物为式(B)所示化合物或式(C)所示化合物，
式(B)所示化合物中，m1为1、2、3、4、5或6；m3为1、2、3、4、5或6。在一些实施例中，所述式(A)所示化合物为NOTA-BMSH所示化合物，
第二方面，本发明提供第一方面所述化合物的用途。
第一方面所述化合物在用于制备放射性标记化合物上的用途。
第三方面，本发明提供一种金属络合物。
一种金属络合物，其由放射性核素和第一方面所述化合物中的螯合剂基团络合而成。
在一些实施例中，所述放射性核素包括177Lu、68Ga、86Y、90Y、64Cu、67Cu、213Bi、225Ac或89Y。
在一些实施例中，所述金属络合物选自化合物[68Ga]BMSH或其酯或药学上可接受的盐，
第四方面，本发明提供一种组合物。
一种组合物，其包括：(1)第一方面所述化合物或第三方面所述金属络合物；和(2)药学上可接受的辅料。
在一些实施例中，所述药学上可接受的辅料包括药学上可接受的载体、药学上可接受的稀释剂或药学上可接受的赋形剂。
第五方面，本发明提供一种试剂盒。
一种试剂盒，其包括第一方面所述化合物或第三方面所述金属络合物。
在一些实施例中，所述试剂盒包括第一方面所述化合物和用于将第一方面所述化合物制备为第三方面所述金属络合物的试剂和/或耗材。
在一些实施例中，所述试剂包括盐酸水溶液、醋酸钠缓冲水溶液、水、C18纯化柱、乙醇水溶液、生理盐水中的至少一种。
在一些实施例中，所述水为去离子水、纯化水或超纯水。
在一些实施例中，所述盐酸水溶液中盐酸的浓度为0.01mol/L-0.10mol/L或者0.05mol/L。
在一些实施例中，所述醋酸钠缓冲水溶液中醋酸钠的浓度为0.10mol/L-0.30mol/L或0.25mol/L。
在一些实施例中，所述乙醇水溶液中乙醇和水的体积比为1:2-2:1或1:1。
在一些实施例中，所述耗材包括无菌滤膜、无菌真空瓶、C18柱中的至少一种。
在一些实施例中，所述无菌真空瓶的个数为2-5个。
在一些实施例中，所述C18柱为Sep-PakTm Light C18Cartridges(Waters公司)。
第六方面，本发明提供一种第一方面所述化合物或第三方面所述金属络合物的应用。
第一方面所述化合物或第三方面所述金属络合物在制备诊断示踪剂或治疗药物上的应用。
在一些实施例中，所述诊断示踪剂为用于诊断具有程序性死亡配体1(PD-L1)和/或程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的肿瘤或其转移的药剂。
在一些实施例中，所述治疗药物为用于治疗具有程序性死亡配体1(PD-L1)和/或程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的肿瘤的药剂中的应用。
在一些实施例中，所述具有程序性死亡配体1(PD-L1)或程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的肿瘤包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、膀胱癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、食管癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、膀胱癌、皮肤癌、乳腺癌或脑癌。
有益效果
本发明的一个实施例至少包括以下其中一个有益效果：
(1)相比现有技术中的示踪剂，例如[18F]LP-F，本发明所提供的[68Ga]BMSH体内药物动力学好，非特异性组织摄取低，作为示踪剂体内显像背景信号低，显像清晰度高。
(2)本发明BMSH及BMSH络合放射性核素后的金属络合物的结构新颖，具有体内外稳定性高、药物动力学特性好、制备简单效率高等优点，更重要的是对PD-L1具有高特异性和灵敏度，在标记放射性核素后可用于PD-L1表达显像和/或对具有PD-L1的肿瘤进行治疗。
(3)采用本发明所提供的放射性标记方法，制备[68Ga]BMSH所得产物产率高、速度快、纯度高。(4)相比其他示踪剂，BMSH及BMSH络合放射性核素后的金属络合物具有更高的PD-L1结合力和PD-L1表达肿瘤摄取值，体内非特异性组织摄取低。提高了PD-L1检出的灵敏度和肿瘤显像的清晰度。
附图说明
图1为实施例1中化合物1的质谱图。
图2为实施例1中化合物6的质谱图。
图3为实施例1中化合物NOTA-BMSH的质谱图。
图4为实施例3的体内外稳定性测试HPLC谱图。
图5为实施例4中细胞摄取研究结果图和阻断研究结果图；其中A图为细胞摄取研究的结果图和NOTA-BMSH阻断后的A549-hPDL1细胞对[68Ga]BMSH的摄取在60min的摄取值结果图，其中A图中的“60min Block”为经NOTA-BMSH阻断后的A549-hPDL1细胞对[68Ga]BMSH的摄取在60min的摄取值；B图为[68Ga]BMSH在A549-hPDL1细胞和A549细胞中60min的摄取值对比结果图。
图6为实施例4中[68Ga]BMSH对A549-hPDL1细胞的抑制曲线图；其中横坐标为药物摩尔浓度的以10为底数的对数值，纵坐标为放射性摄取的百分数。
图7为实施例6中A549-hPDL1摄取组中A549-hPDL1荷瘤小鼠PET/CT扫描的横向图像和MIP图像以及[68Ga]BMSH摄取的时间-活性曲线图；其中A图中的“Transversal”为A549-hPDL1摄取组中A549-hPDL1荷瘤小鼠的横向图像，“MIP”为A549-hPDL1摄取组中A549-hPDL1荷瘤小鼠的MIP图像；B图为A549-hPDL1摄取组中[68Ga]BMSH摄取的时间-活性曲线图。
图8为实施例6中A549-hPDL1和A549肿瘤小鼠的[68Ga]BMSH的肿瘤摄取和阻断实验结果图；其中A图分别为摄取实验中给药后第120minA549-hPDL1摄取组(A549-hPDL1uptake)、A549摄取组(A549uptake)的MIP图像和阻断实验中给药后120minA549-hPDL1阻断组(A549-hPDL1block)的MIP图像；B图分别为摄取实验中给药后第120minA549-hPDL1摄取组(A549-hPDL1)、A549摄取组(A549)的摄取值和阻断实验中给药后第120minA549-hPDL1阻断组(A549-hPDL1block)的摄取值对比统计图。
术语说明
本发明中，室温表示环境温度，在10℃-45℃，或者10℃-30℃，或者20℃-28℃。
本发明中，68Ga表示镓-68；177Lu表示镥-177；86Y表示钇-86；90Y表示钇-90；64Cu表示铜-64；67Cu表示铜-67；213Bi表示铋-213；225Ac表示锕-225；89Y表示钇-89。pH表示酸碱度；nmol/ml表示纳摩尔每毫升；mg表示毫克；PBS表示磷酸缓冲盐溶液；min表示分钟；％ID/g表示每克组织所摄取的量占注射剂量的百分比；％ID/1mio cells表示每1百万细胞所摄取的量占注射剂量的百分比；μM表示微摩尔每升；mmol表示毫摩尔；GBq/μmol表示109贝克每微摩尔；MBq表示兆贝克(106贝克)；μCi表示放射性活度单位微居里；mio cells/well表示百万个细胞每孔；SDS表示十二烷基硫酸钠；NaOH表示氢氧化钠；终浓度表示加样和加试剂操作结束时，该物质在加入后的溶液中的浓度；Radio-HPLC表示放射性高效液相色谱法。“A549-hPDL1”、“A549-hPDL1细胞”或“A549-hPDL1癌细胞”表示使用miRNA过表达慢病毒转染人非小细胞肺癌细胞后所得细胞(A549-hPDL1中PD-L1高表达)；“A549”、“A549细胞”或“A549癌细胞”表示人非小细胞肺癌细胞(A549中PD-L1低表达)。
“wt％”表示质量百分比。
“％vol”表示体积百分比。
术语“MIP”是指最大密度投影。
术语“直链亚烷基”表示从饱和的直链烃基中去掉两个氢原子所得到的饱和的二价烃基基团。除非另外详细说明，直链亚烷基基团含有1-12个碳原子。在一实施方案中，直链亚烷基基团含有1-10个碳原子；在一实施方案中，直链亚烷基基团含有1-6个碳原子；在另一实施方案中，直链亚烷基基团含有1-4个碳原子；在又一实施方案中，直链亚烷基基团含有1-3个碳原子；还在一实施方案中，直链亚烷基基团含有1-2个碳原子。这样的实例包括亚甲基(-CH2-)，亚乙基(-CH2CH2-)，亚正丙基(-CH2CH2CH2-)、亚正丁基(-CH2CH2CH2CH2-)、亚正戊基(-CH2CH2CH2CH2CH2-)、亚正己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-)、亚正庚基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-)、亚正辛基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-)、亚正壬基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-)或亚正癸基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-)，等等。所述直链亚烷基基团任选地被一个或多个本发明所描述的取代基所取代。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
本发明中，“药学可接受的”的意思为：在充分的医学判断范围内，适于与人和低等动物组织接触而不存在不适宜的毒性、刺激性、过敏反应及类似反应、而且具有相当的合理获益/风险比率的物质或化合物。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
本发明中，如“式(1)化合物”和“式(1)所示的化合物”的表述，表示的是同一个化合物；如“NOTA-BMSH”、“化合物NOTA-BMSH”和“NOTA-BMSH化合物”的表述，表示的是同一个化合物。
本发明中，各化合物简称的结构如下：
/>
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例，对本发明作进一步的详细说明。
本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。
本发明中，DIPEA表示N,N-二异丙基乙胺；DMF表示N,N-二甲基甲酰胺；HOBt表示1-羟基苯并三唑；DIC表示N,N'-二异丙基碳二亚胺；TFA表示三氟乙酸；“HATU”表示2-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N'，N'-四甲基脲铵六氟磷酸。“M”表示mol/L。Boc-eda表示N-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺；
BMS1001表示CAS号为2113650-03-4的化合物。
实施例1：[68Ga]BMSH的合成
合成步骤一，Fmoc-Glu-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-葡萄糖胺的制备：
将Boc-谷氨酸-Foc(1.5mmol)、胺糖(1.5mmol)与HATU(2mmol)，DIPEA(2mmol)混合，在DMF(20mL)中室温搅拌2h，然后用TFA(3mL)去除Boc基团，得到化合物Fmoc-Glu-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-葡萄糖胺。通过质谱确定为产物(572.3[M+H]+)。
合成步骤二，化合物1采用固相平台合成：
CTC树脂(471mL，0.5mmol,Sub＝1.06)浸泡在二氯甲烷(20毫升)中24h，然后排干。随后加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH(1.5mmol)和DIPEA(2mmol)室温搅拌3小时后，向反应液中加甲醇(0.5mL)继续搅拌30分钟后，移除反应溶剂并用DMF洗涤CTC树脂三遍，得到洗涤后的CTC树脂1。向洗涤后的CTC树脂1中加入含20％vol哌啶的DFM溶液(20mL)室温搅拌30分钟后，移除溶剂。然后依次用DMF(3×5mL)、MeOH(2×5Ml)、DCM(1×5mL)进行洗涤，风干15分钟。随后，加入Fmoc-Glu(OtBu)-OH(1.5mmol)、DIC(1.5mmol)、HOBt(2mmol)和DMF(20mL)室温下摇匀1.5小时，随后移除DMF，并用DMF洗涤三遍，再加入含20％vol哌啶的DFM溶液(20mL)室温搅拌30分钟后，移除溶剂并依次用DMF(3×5mL)、MeOH(2×5mL)、DCM(1×5mL)进行洗涤，得到洗涤后的CTC树脂2，然后在洗涤后的CTC树脂2中加入Fmoc-Glu-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-葡萄糖胺(1.5mmol)、DIC(1.5mmol)、HOBt(2mmol)和DMF(20mL)室温下摇匀1.5小时，随后移除DMF，并用DMF洗涤三遍，再加入含20％vol哌啶的DFM溶液(20mL)室温搅拌30分钟后，移除溶剂并依次用DMF(3×5mL)、MeOH(2×5mL)、DCM(1×5mL)洗涤，得到洗涤后的CTC树脂3；然后在洗涤后的CTC树脂3中加入Fmoc-NH-PEG2-COOH(1.5mmol)、DIC(1.5mmol)、HOBt(2mmol)和DMF(20mL)室温下摇匀1.5小时，随后移除DMF，并用DMF洗涤三遍，再加入含20％vol哌啶的DFM溶液(20mL)室温搅拌30分钟后，移除溶剂并依次用DMF(3×5mL)、MeOH(2×5mL)、DCM(1×5mL)洗涤，得到洗涤后的CTC树脂4。
向洗涤后的CTC树脂4中加入NOTA(1.5mmol)，HOBt(1.5mmol)，DIC(1.5mmol)和DMF(20mL)室温搅拌1.5小时后移除DMF，并用DMF洗涤三遍。随后，使用含1％vol三氟乙酸(TFA)的DCM溶液(20mL)将树脂与化合物分离，过滤后滤液在真空下浓缩，得到化合物1。化合物1(C56H97N9O22)的LC-MS计算得到的理论质量为1248.43，而实际观测到的质量为1249.5[M+H]+。
合成步骤三，化合物6的合成：
将Boc-eda(1.5mmol)、BMS1001(1.5mmol)与HATU(2mmol)，DIPEA(2mmol)混合，在DMF(20mL)中室温搅拌2h，然后用TFA(3mL)去除Boc基团，得到化合物4。随后将化合物4与化合物5(Fmoc-NH-PEG2-COOH)、HATU和DIPEA溶液在DMF中反应2h，反应完后用含25wt％的EDA(二乙胺)的THF溶液去除Fmoc基团，得到化合物6。LC-MS calcd检测化合物6(C43H51N5O9)，理论质量为781.91,实际观测到的质量为782.9[M+H]+。
合成步骤四，NOTA-BMSH的合成：
将化合物1(0.5mmol)和、化合物6(0.5mmol)、HATU(2mmol)和DIPEA(2mmol)在DMF(20mL)中混合，室温搅拌2h，然后用TFA(3mL)去除Boc基团，得到NOTA-BMSH粗产品。NOTA-BMSH粗产品通过加入过量的冷冻乙醚进行析出。然后除去溶剂，用乙醚对固体产物进行三次结晶。采用Phenomenex C18色谱柱(10mm×250mm,5μm)，流速为3ml/min，进行反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，得到化合物NOTA-BMSH。取所得化合物NOTA-BMSH进行LC-MS calcd检测:理论质量为1787.89，实际检测到的为895.3[M/2+H]+.
洗脱程序为：
合成步骤五，[68Ga]BMSH的合成：
68Ga标记过程包括：以NOTA-BMSH化合物为前体，用锗镓发生器获得68GaCl3手动标记进行[68Ga]BMSH的制备，其步骤包括：
1)反应瓶中加入NOTA-BMSH水溶液(50μg,50μL去离子水)，并用0.25M醋酸钠(1mL)缓冲；
2)用0.05M的盐酸水溶液(4mL)淋洗锗镓发生器，淋洗68Ga-至反应瓶中，在55℃下孵育10分钟，以完全完成放射性标记反应；得到混合液；
3)将混合液放入冰浴中冷却并用5ml水稀释，得稀释后的反应液；
4)稀释后的反应液经C18柱(Sep-PakTm Light C18Cartridges(Waters公司))将产物吸附在C18柱上；
5)再用30mL水淋洗C18柱(Sep-PakTm Light C18Cartridges(Waters公司))，除去C18柱中残留的68Ga-离子；
6)用1ml乙醇和水的混合物(1:1,v/v)进行洗脱C18柱中的产物到中转瓶中，得到洗脱液；
7)将中转瓶中产物经无菌滤膜后得到化合物[68Ga]BMSH。
使用高效液相色谱柱(Phenomenex C18)评估[68Ga]BMSH的放射化学纯度。
根据上述方案，通过NOTA螯合剂络合68Ga，成功地对BMSH进行了放射性标记。得到了放射性产物[68Ga]BMSH，未经衰变校正的放射化学产率为60.5％±7.0％(n>10)。经放射性高效液相色谱分析，其放射化学纯度>98％，保留时间为12.5min。根据放射性测定，其比活性为2-8GBq/μmol(n>10)。放射性合成的总时间约为20分钟，包括放射性标记和纯化过程。
实施例2：[68Ga]BMSH的脂水分配系数测定
[68Ga]BMSH(10μCi)加入由5.0mL pH为7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)和5.0mL 1-辛醇组成的混合物中，放入15ml离心管中，剧烈的涡旋5分钟，随后以10,000rpm离心5分钟。每相提取100μL样品，用γ-计数器测定放射性。分配系数计算为Log10D＝Log10(1-辛醇的计数/PBS的计数)(n＝3)。
测定[68Ga]BMSH的logD值为-2.02±0.09，表明其具有较高的亲水性。
实施例3：体内外稳定性测试
1)体外稳定性实验：
取[68Ga]BMSH(20μL，60-120μCi)的生理盐水溶液分别与1mL生理盐水和1mL小鼠血清混合，置于37℃下，孵育120min后，用Radio-HPLC测定其放射化学纯度。
结果：示踪剂[68Ga]BMSH在体外生理盐水和小鼠血清中37℃下120min，仍然基本保持原型不变(图4)。
2)体内稳定性实验：
将正常裸鼠小鼠分别尾静脉注射示踪剂[68Ga]BMSH(0.2mL,100-300μCi)的生理盐水溶液，注射60分钟后处死取血，血液中加入0.5mL乙腈混合后，离心，将离心后的上清液注入HPLC中检测。
结果：示踪剂[68Ga]BMSH在体内小鼠血液中60min，仍然基本保持原型不变(原型降解率≤5％)(图4)。
实施例4：体外细胞结合和摄取实验
细胞摄取研究：A549-hPDL1细胞和A549细胞分别在烧瓶中培养至80％-90％的细胞密度，得到培养后的A549-hPDL1细胞和培养后的A549细胞，用于细胞摄取研究。分别在培养后的A549-hPDL1细胞和培养后的A549细胞加入[68Ga]BMSH(1.85kBq)，用[68Ga]BMSH(1.85kBq)在37℃下分别孵育5min、30min、60min和120min，每组的每个时间点做4个孔，每个孔含有1×105细胞。在孵育至设定的时间点时，取出培养基，然后用pH 7.4的冰PBS(1ml×2次)洗涤细胞。再用1M NaOH(1ml)水溶液在37℃下裂解10分钟。收集裂解液，用γ-计数器测量裂解液放射性计数。
阻断研究：在A549-hPDL1进行了阻断研究。
阻断组：按“细胞摄取研究”操作制备培养后的A549-hPDL1细胞，将培养后的A549-hPDL1细胞于37℃用[68Ga]BMSH(1.85kBq)和NOTA-BMSH(10μg/孔)孵育60min，得到阻断组。除去培养基后，用用pH 7.4的冰PBS(1ml×2次)洗涤细胞。并用1M NaOH水溶液在37℃下裂解10分钟。用γ-计数器测量裂解液的放射性计数。结果以％ID/1mio细胞表示。
不阻断组：直接采用“细胞摄取研究”中A549-hPDL1细胞用[68Ga]BMSH(1.85kBq)在37℃下孵育60min的时间点的结果。
NOTA-BMSH对A549-hPDL1细胞的半抑制浓度(IC50)通过同时暴露于未标记(10-5M至10-11M)和放射性标记的化合物60分钟来测量。
结果：
(1)通过细胞摄取研究来验证[68Ga]BMSH对表达pdl1的肿瘤细胞的特异性结合能力。[68Ga]BMSH在A549-hPDL1(PD-L1+)细胞中的积累在5min时迅速达到0.67±0.08ID％/1mio细胞，在120min时稳定在0.65±0.06ID％/1mio细胞，最大摄取值为0.74±0.07ID％/1mio细胞，如图5中A图所示。
(2)经NOTA-BMSH阻断后，A549-hPDL1细胞对[68Ga]BMSH的摄取在60min时明显降低至0.17±0.01ID％/1mio细胞(图5中A图中的“60min block”)。
(3)对于A549(PD-L1)细胞，[68Ga]BMSH的摄取处于较低水平。60分钟摄取值为0.21±0.02ID％/1mio细胞，表明本发明的[68Ga]BMSH对PD-L1具有高特异性(图5中B图)。通过竞争性细胞结合实验测得[68Ga]BMSH对A549-hPDL1细胞的半最大抑制浓度(IC50)值为448.9nM(图6)。表明[68Ga]BMSH具有较高的PD-L1特异性。
实施例:5：体内生物分布实验
将[68Ga]BMSH(148～222kBq)通过尾静脉注射到A549-hPDL1模型荷瘤裸鼠体内，于注射后0.5h、1h、2h处死小鼠(每个时间点3只)；将[68Ga]BMSH(148～222kBq)通过尾静脉注射到A549模型荷瘤裸鼠体内，于注射后2h处死小鼠(3只)，取脏器和肿瘤，称重，用γ-计数器计算放射性。每个器官的放射性归一化为每克组织注射剂量的百分比(％ID/g)。
结果：表1总结了[68Ga]BMSH在注射30min、60min和120min后的生物分布情况。注射后30min、60min和120min，[68Ga]BMSH探针对A549-hPDL1的肿瘤摄取值分别为4.61±0.16％ID/g、4.40±0.36％ID/g和4.22±0.65％ID/g。这些观察结果表明，[68Ga]BMSH在A549-hPDL1肿瘤中的快速摄取和良好的保留。虽然其他组织在注射后30分钟对[68Ga]BMSH的摄取值相对较高，但随着时间的推移，它们的摄取明显下降。以肺为例，注射后30分钟摄取值为8.38±0.54％ID/g，注射后120分钟逐渐降低至3.01±0.53。同时，肿瘤与肌肉的药物摄取比由3.49±0.21增加到5.78±0.60。阴性对照结果显示，注射后2h，A549-hPDL1肿瘤对[68Ga]BMSH的摄取是A549-hPDL1肿瘤的1.9倍(4.22±0.65vs.2.23±0.41％ID/g,P<0.01)，而在A549-hPDL1和A549荷瘤小鼠正常器官中的生物分布相似。
表1：[68Ga]BMSH在不同小鼠30min，60min和120min pi(pi表示尾静脉注射后)中的生物分布(数值表示为平均值±SD(％ID/g)(n＝3))
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实施例6：小动物PET-CT显像
采用Madiclab PSA146PET/CT/FMT仪器(中国山东)对荷瘤裸鼠(A549-hPDL1和A549，每组n＝3)进行动态微PET成像研究。使用三维有序子集期望最大值(OSEM)算法重建图像，并将其转换为每克组织注射剂量百分比(％ID/g)图像。荷瘤小鼠分别静脉注射[68Ga]BMSH(7.4MBq/只)。阻断实验中，给A549-hPDL1荷瘤小鼠联合注射NOTA-BMSH(100μg/只)和[68Ga]BMSH(7.4MBq/只)。为了进行数据分析，使用PMOD软件(版本4.3,PMOD TechnologiesLtd.，Zurich,Switzerland)在衰减校正的全身冠状图像上手动绘制肿瘤和主要器官的兴趣区域(roi)。
(1)摄取实验
A549-hPDL1摄取组(A549-hPDL1uptake)：取[68Ga]BMSH(7.4MBq/只)，经尾静脉注射到A549-hPDL1模型荷瘤裸鼠体内(3只)；用小动物PET-CT(Madiclab PSA146PET/CT/FMT仪器)动态扫描注射后120min内不同时间点的图像。
A549摄取组(A549uptake)：取[68Ga]BMSH(7.4MBq/只)，经尾静脉注射到A549模型荷瘤裸鼠体内(3只)；用小动物PET-CT(Madiclab PSA146PET/CT/FMT仪器)动态扫描注射后120min内不同时间点的图像。
(2)阻断实验
A549-hPDL1阻断组(A549-hPDL1block)：取[68Ga]BMSH(7.4MBq/只)和NOTA-BMSH(100μg/只)，经尾静脉注射到A549-hPDL1模型荷瘤裸鼠体内(3只)；用小动物PET-CT(Madiclab PSA146PET/CT/FMT仪器)动态扫描注射后120min内不同时间点的图像。
结果：对A549-hPDL1摄取组中A549-hPDL1荷瘤小鼠的小动物PET/CT扫描，获得了横向和MIP图像以及[68Ga]BMSH摄取的时间-活性曲线如图7所示。图像显示肿瘤、肺、肝和肾对[68Ga]BMSH的快速摄取，并在肿瘤区域内观察到较长的滞留时间。同时，肺和肾脏中的[68Ga]BMSH被迅速清除，这与生物分布研究一致。值得注意的是，A549-hPDL1肿瘤的[68Ga]BMSH摄取在10分钟达到峰值，并保持稳定至120分钟。在120分钟时，肿瘤/肌肉和肿瘤/肺的比值分别为7.88和1.49，其对比度足够高，可以进行PD-L1成像。
为了进一步验证体内PD-L1表达的诊断，我们对A549-hPDL1和A549肿瘤小鼠进行了[68Ga]BMSH的肿瘤摄取和阻断实验的比较(图8)。2小时静态测量显示，与A549hPDL1肿瘤相比，A549-hPDL1肿瘤中[68Ga]BMSH的摄取明显高于A549肿瘤(P<0.05)。在携带A549-hPDL1肿瘤的小鼠中进行的阻断研究显示，肿瘤和肝脏对A549-hPDL1的摄取显著减少。
综上所述，[68Ga]BMSH具有高的PD-L1亲和力(IC50＝448.9nM)，体内外稳定性好，对PD-L1表达的肿瘤摄取值高，灵敏度高，示踪剂的体内药物动力学好通过肾脏快速代谢背景摄取低，非特异性组织摄取低，具有高的肿瘤与背景比值，肿瘤显像清晰。
实施例7：试剂盒
一种试剂盒，其包括：NOTA-BMSH化合物(50μg-200μg)。
在一些实施例中，所述试剂盒还包括用于制备[68Ga]BMSH的试剂，所述试剂包括盐酸水溶液(4mL-100mL，盐酸水溶液中盐酸的浓度为0.05mol/L)、醋酸钠缓冲水溶液(1mL-100mL，醋酸钠浓度为0.25mol/L)、去离子水(30mL-100mL)和乙醇水溶液(乙醇和水的体积比为1:1，1mL-50mL)中的至少一种。
在一些实施例中，所述试剂还可以包括生理盐水(10mL-200mL)。
在一些实施例中，所述试剂盒还可以包括耗材，所述耗材包括无菌滤膜、C18柱(Sep-PakTm Light C18Cartridges(Waters公司))和10mL无菌真空瓶(2个)中的至少一种。
本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。

Claims (10)

1.一种化合物，其包括式(A)所示化合物或其酯或药学上可接受的盐，
其中，L1和L2分别独立为间臂基团；
X为亲水性官能团；
Y为螯合剂基团。
2.根据权利要求1所述的化合物，
L1为-NH-R1-C(＝O)-NH-(CH2)n1-NH-；
R1为C1-C10直链亚烷基(如：亚甲基，亚乙基，亚正丙基、亚正丁基、亚正戊基、亚正己基、亚正庚基、亚正辛基、亚正壬基或亚正癸基)或-(CH2CH2O)m1(CH2)m2-；
n1为1、2、3、4、5或6；
m1为1、2、3、4、5或6；
m2为1、2、3、4、5或6；
优选地，L1为
和/或
L2为-NH-R2-C(＝O)-NH-；
R2为C1-C10直链亚烷基(如：亚甲基，亚乙基，亚正丙基、亚正丁基、亚正戊基、亚正己基、亚正庚基、亚正辛基、亚正壬基或亚正癸基)或-(CH2CH2O)m3(CH2)m4-；
m3为1、2、3、4、5或6；
m4为1、2、3、4、5或6；
优选地，L2为
和/或
X为含脱氧葡萄糖结构的亲水基团或含至少一个水溶性氨基酸结构的亲水基团；或者X为含脱氧葡萄糖结构和至少一个水溶性氨基酸结构的亲水基团；
优选地，X为
和/或
Y为
3.根据权利要求1-2任一项所述的化合物，所述式(A)所示化合物为式(B)所示化合物或式(C)所示化合物，
式(B)所示化合物中，m1为1、2、3、4、5或6；m3为1、2、3、4、5或6。
4.根据权利要求1-3任一项所述的化合物，所述式(A)所示化合物为NOTA-BMSH所示化合物，
5.权利要求1-4任一项所述化合物在用于制备放射性标记化合物上的用途。
6.一种金属络合物，其特征在于，由放射性核素和权利要求1-4任一项所述化合物中的螯合剂基团络合而成；
任选地，所述放射性核素包括177Lu、68Ga、86Y、90Y、64Cu、67Cu、213Bi、225Ac或89Y。
7.根据权利要求6所述的金属络合物，所述金属络合物选自化合物[68Ga]BMSH或其酯或药学上可接受的盐，
8.一种组合物，其包括：(1)权利要求1-4任一项所述化合物或权利要求6-7任一项所述金属络合物；
和(2)药学上可接受的辅料；
任选地，所述药学上可接受的辅料包括药学上可接受的载体、药学上可接受的稀释剂或药学上可接受的赋形剂。
9.一种试剂盒，其包括权利要求1-4任一项所述化合物或权利要求6-7任一项所述金属络合物；
任选地，所述试剂盒包括权利要求1-4任一项所述化合物和用于将权利要求1-4任一项所述化合物制备为权利要求6-7任一项所述金属络合物的试剂和/或耗材；
任选地，所述试剂包括盐酸水溶液、醋酸钠缓冲水溶液、水、C18纯化柱、乙醇水溶液、生理盐水中的至少一种；
任选地，所述水为去离子水、纯化水或超纯水；
任选地，所述盐酸水溶液中盐酸的浓度为0.01mol/L-0.10mol/L或者0.05mol/L；
任选地，所述醋酸钠缓冲水溶液中醋酸钠的浓度为0.10mol/L-0.30mol/L或0.25mol/L；
任选地，所述乙醇水溶液中乙醇和水的体积比为1:2-2:1或1:1；
任选地，所述耗材包括无菌滤膜、无菌真空瓶、C18柱中的至少一种；
任选地，所述无菌真空瓶的个数为2-5个；
任选地，所述C18柱为Sep-PakTmLight C18 Cartridges。
10.权利要求1-4任一项所述化合物或权利要求6-7任一项所述金属络合物在制备诊断示踪剂或治疗药物上的应用；
任选地，所述诊断示踪剂为用于诊断具有程序性死亡配体1(PD-L1)和/或程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的肿瘤或其转移的药剂；
任选地，所述治疗药物为用于治疗具有程序性死亡配体1(PD-L1)和/或程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的肿瘤的药剂中的应用；
任选地，所述具有程序性死亡配体1(PD-L1)或程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的肿瘤包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、膀胱癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、食管癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、膀胱癌、皮肤癌、乳腺癌或脑癌。
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